# 해양환경공정시험기준 고시
(행정규칙구분=고시, 공포일자=20231211, 시행일자=20231211, 소관부처=국립수산과학원)
행정규칙번호: 2023-5
출처: 국가법령정보센터

행정규칙명: 해양환경공정시험기준 고시
행정규칙종류: 고시
발령일자: 20231211
발령번호: 2023-5
시행일자: 20231211
소관부처: 국립수산과학원
담당부서기관: 국립수산과학원(해양환경연구과)
현행여부: Y

조문내용:
['제1장 총칙', '제1조(목적) 이 고시는 「해양환경관리법」 제10조에 따라 「해양환경공정시험기준」을 정하고, 제정ㆍ개정 및 운영 등에 관하여 필요한 사항을 정하는 것을 목적으로 한다.', '제2조(적용범위) ① 「해양환경관리법」, 「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」, 「해양폐기물 및 해양오염퇴적물 관리법」 및 그 밖의 해양환경분야 법령에서 해수, 해저퇴적물 등의 해양환경 상태를 조사ㆍ평가할 때 다음 각 호의 「해양환경공정시험기준」(이하 "공정시험기준"이라 한다)을 따른다.1. 해수 공정시험기준2. 해저퇴적물 공정시험기준3. 해양생물 공정시험기준4. 해양폐기물 공정시험기준② 제1항 각 호의 매체별 공정시험기준은 별표 1부터 별표 4와 같다.', '제2장 공정시험기준 제정ㆍ개정', '제3조(제정ㆍ개정의 필요성) 공정시험기준 제정ㆍ개정(이하 "제정ㆍ개정"이라 한다)이 필요한 경우는 다음 각 호와 같다.1. 새로운 시험방법이 개발된 경우2. 선진 외국의 시험방법이 도입된 경우3. 관련 규정의 제정 또는 개정에 따른 보완이 필요한 경우4. 그 밖에 해양수산부장관이 필요하다고 인정하는 경우', '제4조(제정ㆍ개정안의 작성 등) ① 국립수산과학원장(이하 "원장"이라 한다)은 제정ㆍ개정안을 작성할 때 다음 각 호의 사항을 검토해야 한다.1. 제정ㆍ개정의 필요성 및 근거2. 일반적으로 공인된 이론 및 체계가 충족되었는지3. 현행 공정시험기준 및 한국산업규격과 중복되지 않는지4. 제정ㆍ개정안의 체계 및 용어의 통일성과 일관성② 원장은 제정ㆍ개정안의 검토ㆍ심의를 위하여 공정시험기준 심의위원회(이하 "심의위원회"라 한다)를 둘 수 있다.', '제5조(제정ㆍ개정의 검토 등) ① 각 항목별 공정시험기준은 필요에 따라 수시로 제정ㆍ개정하되, 검토 주기는 최대 5년으로 한다.② 공정시험기준은 별표 5의 해양환경공정시험기준 제정체계 표준화 지침에 준하여 작성되어야 하며, 기존 공정시험기준의 개정인 경우에는 별지 제1호서식의 공정시험기준 개정(안) 전ㆍ후 대비표를 첨부해야 한다.③ 공정시험기준 제안(제정, 개정, 폐지)하려는 자는 별지 제2호서식의 공정시험기준 제정(개정, 폐지) 신청서를 작성하여 국립수산과학원으로 제출한다.', '제3장 심의위원회의 구성ㆍ운영', '제6조(심의위원회의 구성ㆍ운영) ① 심의위원회는 위원장 1명을 포함하여 10명 이내의 당연직 위원과 위촉위원으로 구성하고, 위원장은 원장으로 하고 당연직 위원은 기후환경연구부장 및 해양환경연구과장이 되며, 위촉위원은 해양환경연구과의 추천을 받아 원장이 위촉한다.② 심의위원회는 기술적인 자문이 필요한 경우 공정시험기준을 검토ㆍ심의하기 위한 해수, 퇴적물, 해양생물, 해양폐기물 소위원회를 둘 수 있다.③ 소위원회는 소위원장을 포함하여 10명 이내로 구성하고 소위원장은 소위원회 위원 중에서 호선(互選)에 의해 선출한다. 위원은 내부위원과 외부위원으로 구성하되, 내외부위원은 공정시험기준 담당부서인 해양환경연구과에서 심의안건에 따라 추천한 관련 분야 전문가 중 원장이 선정한다.④ 심의위원회 및 소위원회의 임기는 2년으로 하며, 연임할 수 있다. 다만, 보궐 위촉위원의 임기는 임기의 남은 기간으로 한다.⑤ 심의위원회 및 소위원회의 업무를 보조하기 위하여 해양환경연구과장 공정시험기준 관련 업무 담당 연구관을 간사로 한다.⑥ 심의위원회 및 소위원회 위원에게 수당 및 여비를 지급할 수 있다.', '제7조(심의위원회 및 소위원회의 기능) ① 심의위원회는 다음 각 호의 사항을 심의한다.1. 제정ㆍ개정의 필요성 및 근거2. 제정ㆍ개정안의 표준화 지침을 준수했는지3. 그 밖에 공정시험기준에 관련된 사항② 소위원회는 다음 각 호의 사항을 심의한다.1. 제정ㆍ개정안의 공인된 이론과의 적합성2. 제정ㆍ개정안의 체계 및 용어의 통일성과 일관성3. 제정ㆍ개정안과 다른 공정시험기준과의 중복성4. 그 밖에 공정시험기준에 관련된 사항', '제8조(위원장의 직무) ① 심의위원장 및 소위원장은 심의위원회 및 소위원회를 대표하고 회의와 관련한 여러 가지 사무를 관장한다.② 위원장이 특별한 사정이나 사고로 인하여 직무 수행이 어려운 경우에는 위원장이 지명하는 위원이 그 직무를 대행한다.', '제9조(회의 운영) ① 심의위원회의 회의는 위원장이 필요하다고 인정할 때에 소집하고, 소위원회에서 심의ㆍ의결된 공정시험기준 제정ㆍ개정안을 심의한다.② 소위원회의 회의는 소위원장이 필요하다고 인정할 떄에 소집하고 경미한 개정인 경우 서면 심의한다.③ 심의위원회 및 소위원회는 위원장 및 소위원장을 포함하여 내부위원이 2명이상이 포함된 7명 이상 출석으로 개최하고 출석위원 과반수 이상 찬성으로 심의사항을 의결한다. 다만, 찬반 동수인 경우에는 위원장 및 소위원장이 결정한다.④ 심의위원회 및 소위원회는 필요시 상정된 공정시험기준 제정ㆍ개정 심의를 위하여 작성자의 설명을 들을 수 있다.⑤ 공정시험기준 제정ㆍ개정안에 대한 심의위원회와 소위원회 의견서는 별지 제3호서식의 심의위원회 심의의견서와 별지 제4호서식의 소위원회 심의의견서 양식에 따라 작성한다.⑥ 분석결과에 영향을 미치지 않는 오류 수정 등 경미한 개정인 경우에는 소위원회에서 서면 심의하고 심의위원회의 심의는 생략할 수 있다.', '제10조(보고) ① 소위원장은 공정시험기준 제정ㆍ개정안의 심의 결과를 즉시 심의위원회에 송부한다.② 해양환경연구과장은 심의위원회에서 심의ㆍ의결된 공정시험기준 제정ㆍ개정안의 심의 결과를 통보받는 즉시 행정적 조치를 한다.', '제11조(위원수당 등) 심의위원회 위촉위원 및 소위원회 외부위원에게 회의 및 서면심사에 참여한 경우 예산의 범위에서 국립수산과학원 「강사수당 등 자체 지급기준」 및 「공무원 여비 규정」에 준하여 위원회 참석수당 및 여비를 지급한다.', '제4장 그 밖의 사항', '제12조(협의 등) 원장은 제4조에 따라 작성한 제정ㆍ개정안에 대하여 이해관계인의 의견을 수렴해야 한다.', '제13조(고시 등) 원장은 제정ㆍ개정안을 확정한 때에는 지체 없이 홈페이지에 게재 및 유관 기관에 통보해야 한다.', '제14조(재검토기한) 원장은 「행정규제기본법」 및 「훈령ㆍ예규 등의 발령 및 관리에 관한 규정」에 따라 이 고시에 대하여 2023년 12월 11일 기준으로 매 3년이 되는 시점(매 3년째의 12월 10일까지를 말한다)마다 그 타당성을 검토하여 개선 등의 조치를 해야 한다.']


별표

별표 0001: 해수공정시험기준

[별표1] 해수공정시험기준

2023. 12.

해양수산부 국립수산과학원

목   차

제1장 총칙1

제1항 개요1

제2항 시험관련 표시방법2

제3항 시험관련 기구 및 기기5

제2장 시료의 채취 및 보관7

제1항 일반항목, 영양염류, 유출유 시료채취 방법7

제2항 해수 용존성 중금속 분석을 위한 시료채취 및 전처리14

제3항 시료의 보관 및 보존 방법23

제3장 분석자료의 통계처리와 표현27

제1항 분석자료의 기초통계27

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)29

제4장 항목별 시험방법44

제1항 염분(Salinity)44

제2항 수온(Water Temperature)47

제3항 수소이온농도(Hydrogen Ion Concentration, pH)49

제4항 투명도(Transparency)53

제5항 부유입자물질(Suspended Particulate Matter, SPM)54

제6항 용존산소(Dissolved Oxygen, DO)58

제7항 황화수소(Hydrogen Sulfide)68

제8항 화학적 산소요구량(Chemical Oxygen Demand, COD)71

제9항 용존유기탄소(Dissolved Organic Carbon, DOC)79

제10항 아질산성질소(Nitrite Nitrogen, NO2-N)82

제11항 질산성질소(Nitrate Nitrogen, NO3-N)90

제12항 암모니아성질소(Ammonium Nitrogen, NH4-N)100

제13항 총질소(Total Nitrogen, TN)109

제14항 용존 총질소(Dissolved Total Nitrogen, DTN)118

제15항 인산염인(Phosphate Phosphorus, PO4-P)120

제16항 총인(Total Phosphorus, TP)125

제17항 용존 총인(Dissolved Total Phosphorus, DTP)130

제18항 규산염(Reactive Silicate, Si(OH)4)132

제19항 영양염 자동분석법(Nutrient Autoanalysis)138

제20항 시안(Cyanides, CN)141

제21항 불소(Fluoride, F)144

제22항 구리(Copper, Cu)148

제23항 납(Lead, Pb)153

제24항 니켈(Nickel, Ni)155

제25항 아연(Zinc, Zn)157

제26항 카드뮴(Cadmium, Cd) 159

제27항 코발트(Cobalt, Co)161

제28항 6가크롬(Hexavalent Chromium, Cr6+)163

제29항 총크롬(Total Chromium, Cr) 165

제30항 미량금속 동시분석법(Metals)167

제31항 비소(Arsenic, As)177

제32항 수은(Mercury, Hg)-냉증기원자흡광광도법181

제33항 수은(Mercury, Hg)-냉증기원자형광분석법186

제34항 알킬수은(Alkyl Mercury)193

제35항 페놀류(Phenols)197

제36항 유기인계 농약류(Organophosphorus Pesticides)201

제37항 폴리클로리네니티드비페닐(Polychlorinated Biphenyls, PCBs)210

제38항 유기주석 화합물(Butyltins, BTs) 217

제39항 음이온계면활성제(Anionic Surfactants)-자외선/가시선 분광법223

제40항 휘발성유기화합물(Volatile Organic Compounds, VOCs)226

제41항 용매추출유분(Oil)235

제42항 기체 크로마토그래프/불꽃이온화 검출기(GC/FID)에 의한 유출유 식별238

제43항 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)에 의한 유출유 식별242

제44항 유출유 중 다환방향족탄화수소류(PAHs) 식별246

제45항 유출유의 적외선 분광스펙트럼 식별248

제46항 유출유 중 황화합물251

제47항 유출유 중 니켈253

제48항 유출유 중 바나듐257

제49항 유출유 중 포화분, 방향족분, 레진분259

제50항 폴리브롬화 디페닐에테르(Polybrominated Diphenyl Ethers, PBDEs)262

제51항 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl Substances, PFASs)277

제52항 헥사브로모사이클로도데칸류(Hexabromocyclododecanes, HBCDs)288

제1장 총칙

제1항 개요

1. 목적

이 시험기준은 「해양환경관리법」 제10조의 규정에 의한 오염 물질의 측정에 있어서 측정 결과의 정확도, 정밀도 및 분석 방법의 일관성 유지에 필요한 사항을 규정하는 데 목적이 있다.

2. 적용범위

2.1  「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」 제13조에 의한 해양환경기준의 적합한지는 별도의 규정이 없는 한 해양환경공정시험기준의 규정에 의하여 시험ㆍ판정한다.

2.2  「해양환경관리법」 제9조 제1항의 규정에 의한 "해양환경측정망", 「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」 제18조 제1항에 따른 "해양환경종합조사", 같은 법 제39조 "잔류성 유기오염물질 조사", 동법 제77조의 "해양오염영향조사", 그 외 「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」에서 정하는 해양환경에 대한 조사는 별도의 규정이 없는 한 공정시험기준(해수공정시험기준)의 규정에 따른다.

2.3  이 공정시험기준에 규정되어 있지 아니한 항목에 대해서는 시료의 특성을 고려하여 먹는물수질공정시험방법, KS I 3206 공업용수의 시험방법, KS M 3217 공장 폐수시험방법 및 외국의 공인된 시험방법 중 가장 적합하다고 판단되는 시험방법에 따라 시험할 수 있다.

3. 일반사항

3.1  이 공정시험기준의 내용은 제1장 총칙, 제2장 시료 채취 및 보관, 제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법 그리고 제4장 항목별 시험방법으로 구분한다.

3.2  이 공정시험기준에서 필요한 어원, 기호, 화학명 등은(  ) 속에 기재한다.

제2항 시험관련 표시방법

1. 온도

1.1  온도의 표시는 셀시우스(Celsius) 법에 따라 아라비아 숫자의 오른쪽에 °C를 붙인다.

1.2  표준온도는 0 °C, 상온은 15 ∼ 25 °C, 실온은 1 ∼ 35 °C로 하며, 찬 곳은 따로 규정이 없는 한 0 ∼ 15 °C인 곳을 뜻한다. 온수는 60 ∼ 70 °C, 열수는 약 100 °C, 냉수는 15 °C이하로 한다. "수욕상 또는 수욕중에서 가열한다"라 함은 따로 규정이 없는 한 수온 100 °C에서 가열함을 뜻하고 약 100 °C의 증기욕을 쓸 수도 있다.

1.3  제반 시험 조작은 따로 규정이 없는 한 상온에서 실시하고 조작 직후 그 결과를 관찰하는 것으로 한다. 다만, 온도의 영향이 있는 것의 판정은 표준온도를 기준으로 한다.

2. 농도 및 단위 표시

2.1  기본사항

주요 단위는 KS A ISO 80000-1 국제단위계(SI) 및 이에 따른 규정에 따른다.

2.2  농도 및 단위

2.2.1  액의 농도를(1 → 10), (1 → 100) 또는(1 → 1,000) 등으로 표시하는 것은 고체 성분에 있어서는 1 g, 액체 성분에 있어서는 1 mL를 용매에 녹여 전체량을 10 mL, 100 mL 또는 1,000 mL의 비율로 표시한 것이다.

2.2.2  액체 시약의 농도에 있어서 예를 들어 염산(1 + 2) 이라고 되어 있을 때에는 염산 1 mL와 초순수 또는 증류수 2 mL를 혼합하여 조제한 것을 말한다.

2.2.3  용액의 앞에 몇 %란 일반적으로 세 가지 방법으로 표현하고 있다. 첫째, 무게/부피 백분율로 나타내는 방법으로 용질이 고체 성분일 경우(예: 5 % 수산화나트륨용액)에는 수산화나트륨 5 g을 초순수에 녹인 후 전체 용액이 100 mL 되도록 묽힌 용액을 말한다. 둘째, 무게백분율은 상업용 수용액 시약의 농도를 나타낼 때 자주 사용하는 방법으로 용질이 농축된 산이나 염기와 같은 액체 성분일 경우(예: 70     % 질산용액)에는 용액 100 g 안에 70 g의 질산을 포함하는 것을 나타낸다. 셋째, 부피백분율은 순수액체 화합물을 다른 액체로 묽혀 만든 용액의 농도를 나타낼 때 사용한다. 예를 들어, 5 % 메탄올 수용액은 5 mL 순수한 메탄올을 100 mL 되게 물로 묽혀 만든 용액을 말한다.

2.2.4  mg/L 단위와 μMol/L 단위 간에는 다음 식으로 변환하여 이용할 수 있으며, μMol/L는 μM으로 표시한다(1 μMol/L = 1몰 원자량 × 10-3 mg/L).

2.2.5  백분율(parts per hundred) 농도는 용액 100 g 중 용질의 무게(g)를 표시할 때 % (w/w)로 나타내고, 용액 100 mL 중 용질의 무게(g)를 표시할 때는 % (w/v)로 표시한다. 또한, 용액 100 mL 중의 성분 분량(mL) 또는 혼합기체 100 mL 중의 성분 분량(mL)을 표시할 때는 % (v/v)를 쓴다.

2.2.6  천분율(parts per thousand)을 표시할 때는 g/L, g/kg, mL/L 또는 ‰의 기호를 쓴다.

2.2.7  백만분율(parts per million)을 표시할 때는 mg/L, mg/kg, mL/kL 및 ppm의 기호를 쓴다.

2.2.8  십억분율(parts per billion)을 표시할 때는 μg/L, μg/kg 또는 ppb의 기호를 쓰며, 1 ppm의 1/1,000이다.

2.2.9  일조분율(parts per trillion)을 표시할 때는 ng/L 또는 ppt의 기호를 쓰며, 1 ppb의 1/1,000이다.

2.2.10  기체의 농도는 표준상태(0 °C, 1기압, 비교습도 0 %)로 환산 표시한다.

2.2.11  부피(mL/L)로 표현된 기체의 농도는 부피를 22.4 (L)로 나눈 후 분자량 또는 원자량을 곱하여 mg/L의 단위인 농도로 변환시킬 수 있다.

3. 시험관련 용어의 정의

3.1  "항량으로 될 때까지 건조한다" 또는 "항량으로 될 때까지 가열한다"라 함은 조건에서 1시간 더 건조하거나 또는 강열할 때 전후 무게 차이가 g당 0.3 mg 이하일 때를 말한다.

3.2  진공 또는 감압이라 함은 다른 규정이 없는 한 "15 mmHg 이하"를 말한다.

3.3  시험에 사용하는 초순수는 다른 규정이 없는 한 증류장치 또는 역삼투 장치를 통하여 얻어진 물을 이온교환수지를 거쳐 탈이온하고 유기물과 입자가 제거된 18 ㏁/cm 이상의 시약급 초순수를 말한다.

3.4  액체의 산성, 알카리성 또는 중성을 검사할 때는 다른 규정이 없는 한 유리전극에 의한 pH 미터로 측정하고 액성을 구체적으로 표시할 때는 pH 값을 쓴다.

3.5  "약"이라 함은 기재된 양에 대하여 ±10 % 이상의 차이가 없는 것을 뜻한다.

3.6  "이상"과 "초과", "이하", "미만"이라고 기재하였을 때는 "이상"과 "이하"는 기산점 또는 기준점인 숫자를 포함하며, "초과"와 "미만"은 가산점 또는 기준점인 숫자를 포함하지 않는 것을 뜻한다.

3.7  "정확히 단다"라 함은 규정된 양의 시료를 취하여 분석용 전자저울로 0.1 mg까지 측정하는 것을 말한다.

3.8  "정확히 취하여"라 함은 규정한 양의 시료 또는 시약을 홀피펫으로 눈금까지 취하거나 디지털식 자동 피펫으로 취하는 것을 말한다.

3.9  "냄새가 없다"라 함은 냄새가 없거나 또는 거의 없는 것을 말한다.

3.10  여과용 기구 및 기기를 기재하지 아니하고 "여과한다"라고 하는 것은 KSM 7602 거름종이 5종 A 또는 이와 동등한 여과지를 사용하여 여과함을 말한다.

3.11  시험에 사용하는 시약은 다른 규정이 없는 한 특급 또는 동등 이상 규격의 시약을 말한다.

제3항 시험관련 기구 및 기기

1. 용기

1.1  "용기"라 함은 "시약 또는 시료"를 넣어 두는 기구를 말하며 "시약 또는 시료"와 직접 접촉하는 것을 뜻한다. 용기를 막는 데에 사용되는 마개도 용기의 일부로 간주하며 특별한 설명이 없는 한 동일한 재질을 뜻한다.

1.2  "밀봉용기"라 함은 취급 또는 저장하는 동안에 내용물과 용기 외부환경과의 물질교환을 차폐시키는 기체, 이물질 또는 미생물이 침입되지 아니하도록 내용물을 보호하는 용기를 말한다.

1.3  "차광용기"라 함은 취급 또는 저장하는 동안에 용기 내의 내용물이 투과광선에 의해 광화학적 변화를 일으키지 않도록 빛의 투과를 방지할 수 있는 암갈색 용기 또는 포장된 용기를 말한다.

2. 기구 및 기기의 적합성

2.1  공정시험기준에서 사용하는 모든 유리 기구는 KS L 2302 이화학용 유리 기구의 형상 및 치수에 적합한 것 또는 이와 동등 이상의 규격에 적합한 것으로 국가에서 지정하는 기관에서 검정을 필한 것을 사용해야 한다.

2.2  공정시험기준에서 사용하는 모든 기구 및 기기는 측정 결과에 대하여 허용오차 범위를 벗어나지 않는 것을 사용해야 한다.

2.3  "분석용 전자저울"은 최소한 0.1 mg까지 달 수 있는 것이어야 하며, 분석용 전자저울은 국가검정을 필한 것을 사용해야 한다.

2.4  연속 측정 또는 현장 측정의 목적으로 사용하는 측정기기는 공정시험기준에 의한 측정치와의 정확한 보정을 행한 후 사용할 수 있다.

2.5  "측정범위"라 함은 이 공정시험기준에 따라 시험할 경우, 표준편차율 10 % 이하에서 측정할 수 있는 측정 하한과 측정 상한의 범위를 말하며 측정기기의 성능 및 조작조건에 따라 변할 수 있다.

2.6  공정시험기준에 규정되어 있지 아니한 방법 또는 기기는 해당 공정시험기준의 검정자료와 비교하여 검출한계와 정밀도가 공정시험기준과 같거나 그 이상일 경우, 이를 명기하고 사용할 수 있다. 그 이외에 방법이나 기기라도 국내외의 관련 전문학술기관 또는 공인기관에 의하여 측정 결과가 같거나 그 이상의 검출한계, 정확도ㆍ정밀도가 있다고 인정되고 있는 방법이나 기기는 해당 공정시험항목에 사용할 수 있다.

제2장 시료의 채취 및 보관

제1항 일반항목, 영양염류, 유출유 시료채취 방법

1. 시료채취 일반사항

1.1  시료채취시 주의사항

1.1.1  해수 중 일반 항목과 영양염류 농도의 차이를 보이는 가장 큰 요인 중 하나는 시료 채취이다. 이는 육상의 환경조사와는 달리 해양환경조사는 해상조건과 조사 작업환경 등이 열악하기 때문에 시료의 채취 단계에서 많은 오류를 범할 수 있기 때문이다. 따라서, 시료병과 채수기 오염 또는 채수 과정에서의 교차오염을 최소화해야 한다.

1.1.2  시료 채취시 표층수 중 영양염의 농도가 낮은 시기와 지역에서는 시료 채취나 보관 과정에서 오염 및 변질의 가능성이 매우 높기 때문에 각별한 주의가 필요하다. 특히, 미생물로 인한 막들이 시료 채수기나 시료병의 벽에 단시간 내(수시간 ∼ 수일)에 형성되어 영양염을 쉽게 흡수하거나 방출할 가능성이 높다. 따라서, 시료를 채취한 직후부터 분석 완료시까지의 시간이 많이 지체되지 않아야 한다. 영양염의 경우, 생지화학적 또는 체외 반응성이 영양염 성분의 특성에 따라 변하므로 주의가 필요하다. 예를 들어, 질산염과 인산염들은 빠르게 분해가 되는 반면 규산염의 분해 속도는 느리다. 해수와 표준용액의 아질산염 농도는 일상적인 보관 조건에서 수시간 내에 뚜렷한 변화가 자주 일어난다. 그러나, 규산염의 시료와 표준용액은 상온의 암실에서 변화없이 며칠간 보관할 수 있다.

1.1.3  조사를 시작하기 전 시료 채수기(5리터 니스킨 등)들의 내벽, 밸브 또는 뚜껑 등에 생물학적인 막이나 무기물의 막이 형성되어 있는지를 강한 플래시 불빛을 이용하여 검사해야 한다. 특히, 시료 채수기의 손잡이 근처 벽이나 용수철의 보호막이 오염될 수 있음에 주의해야 한다. 용수철 부식이 일어나기 쉬운 뚜껑 등에 녹이 있는지 살펴야 하고, 만약 녹자국이 발견되면 8M 이상의 강한 염산으로 녹을 제거해야 한다. 보호막이 벗겨진 용수철은 반드시 교체하며, 미생물막은 적절한 솔, 연마용액, 세제 등으로 제거해야 한다. 사용되는 연마용액이나 세제는 영양염 성분들이 포함되어 있지 않아야 한다.

1.1.4  해양환경자료는 시료 채취, 보관, 실험실 분석 및 통계 처리 등 여러 단계를 거쳐 획득되는데 이러한 단계별로 정도가 다른 오차가 항시 존재한다. 이러한 오차는 단계에 따라 연계적으로 축적될 경우, 최종자료의 오차는 크게 증폭되어 부정확한 자료를 나타내기 때문에 분석자는 항상 각 단계별로 오차를 최소화할 수 있도록 노력해야 한다.

1.1.5 해수시료 채수의 질을 평가하려면 몇 차례에 걸친 반복 시료채취가 장려된다. 같은 채수기에서 두 번 시료를 따르는 방법이 있는데 그보다는 가능하면 같은 깊이에서 닫은 두 개의 채수기에서 시료를 받아 분석하도록 한다. 가능하다면 시료는 선상에서 바로 분석하는 것이 바람직하다. 특히, 용존 산소와 영양염 자료는 선상에서 분석한 것이 자료의 질이 높다. 시료의 보관과 운송시 발생하는 문제를 피할 수 있기 때문이다.

1.2  시료채취 순서

해수시료 채수기가 선상으로 옮겨지고 안전이 확보되면 즉시 해수시료를 채취한다. 해수시료를 채취하는 동안 비, 바람, 연기 등 시료를 변질시킬 수 있는 요인을 피하도록 주의해야 한다. 자료의 품질을 높이기 위해서 채수 순서를 반드시 지켜야 한다. 채수 순서는 제일 먼저 기체 분석용 시료를 프레온(헬륨), 용존산소, 이산화탄소 순으로 받아낸다. 그리고 입자 분석용 시료를 받은 후, 알칼리니티와 염분 시료 등을 받는다. 마지막으로 영양염 시료, 엽록소 시료 등의 순서를 따른다.

1.3  시료채수기

해수 수질 일반항목과 영양염류를 위한 해수시료는 일반적으로 플라스틱과 고무 재질의 반돈 채수기(Van Dorn Water Sampler) 혹은 PVC 재질의 니스킨 채수기(Niskin Sampler) 등을 사용하여 채수한다. 특별히 언급하지 않는 한 채수기는 니스킨 채수기를 기본으로 사용한다.

2. 일반항목 및 영양염류의 해역별(하구 및 연안역) 시료채취

2.1  개요

2.1.1  하구역(estuary)은 강물과 바닷물이 만나는 장소로 환경의 변화가 급격한 곳이다. 염분 외에도 탁도나 부유사, 영양염, 용존산소, 유기물 등이 눈에 띄게 변한다. 하구역은 조석 주기에 따라 물질교환이 일어나는 곳으로 육지에서 공급되는 물질의 관문이자 활발한 수층 혼합으로 인한 생물 생산력이 아주 높다. 또한, 수중 환경과 바닥에 다양한 생물이 서식하고 있으며, 인간의 경제 활동의 결과로 수질과 퇴적물의 오염으로 인한 생물 영향의 피해가 큰 취약 환경이기도 하다.

2.1.2  단시간에 급격한 환경 변화로 인하여 하구역 조사는 매우 까다롭다. 특히, 조석 현상 때문에 염분, pH, 용존산소, 영양염, 탁도, 유기물 등의 변화 기울기가 매우 크게 관찰된다. 실제 하구역이 아니더라도 해안에서 가까운 곳에서의 시료 채취는  하구역에서의 대략적인 시료 채취 방식을 따라도 무리가 없다. 따라서, 아래의 지침은 하구역과 연안역 시료 채집에 공통적으로 적용될 수 있다.

2.2  채취 정점과 시기

2.2.1  채취 정점과 시기는 기존 자료를 바탕으로 선정하는 것이 필수적이다. 그러나, 이런 정보가 없을 경우에는 예비 조사를 해야 한다. 특히, 해수의 유동은 가장 중요하게 다루어져야 할 사항이다. 연안과 하구역에서는 조석표와 인근 하천의 유출량에 대한 시기 정보가 필수적이며, 염분은 연속 단면자료를 획득하는 것이 필수적이다. 비록 자료는 표층과 저층으로 두 곳만을 보고하더라도 원자료(raw data)는 연속적으로 관측되어야 한다. 수온, 염분, 수심에 대한 동시 측정을 위해 Conductivity Temperature Depth(이하 CTD)를 반드시 사용해야 한다.

2.2.2  시료 채취와 측정은 대략 수심 0.5 m에서 시작해서 바닥까지 측정한다. CTD가 바닥에 닿아 훼손되는 것을 방지하기 위해 일반 고정틀에 0.3 m 길이의 스테인레스스틸 보호틀을 씌우고 초당 1 m 이하로 천천히 바닥까지 내린다. CTD가 바닥에 닿는 것을 확인하고 같은 속도로 선상으로 끌어 올리도록 한다.

2.2.3  시료 채취 지역이 집중 감시 대상 해역이면 여러 선박을 동원하여 최대한 동시 관측을 할 필요가 있다. 최대한 동시 관측이 되면 같은 조석 주기에서 여러 변수와 인자들의 영향을 파악할 수 있다. 한편, 강에 인접한 정점이라면 조사는 유수량이 최대일 때와 최소인 시기를 반드시 포함해야 한다.

2.3  조석효과를 고려한 시료채취 전략

2.3.1  조석에 따른 해류의 속도는 조석이 최대치에 가장 빠르고 조석이 바뀔 무렵에 가장 느리다. 조석은 퇴적물의 퇴적과 재부유에 결정적인 영향을 미치고 부유생물의 이동에도 관여한다. 조석의 영향을 받는 곳에서 각종 인자들은 사인 곡선 모양을 나타낸다. 따라서, 조석을 고려하지 않고 정점 간 부유물질 농도나 엽록소 농도를 비교하는 것은 의미가 없다. 하루의 관점에서는 주기가 12.5 시간인 반일 주조 리듬이 우세하므로, 하루에 두 번씩 밀물과 썰물이 일어난다.

2.3.2  생물 시료의 경우, 낮과 밤 주기가 겹쳐지므로 시료 채집 전략이 더욱 복잡해진다. 장소에 따라서는 대조와 소조의 영향이 커서 시료의 채집 시기 결정에 중요하게 고려되어야 한다. 가장 이상적인 시료 채집은 동시 채집이지만 실제로 가능한 경우가 흔치 않다. 채집 장소의 조석이 조석표에 기재되어 있지않는 경우에는 인근 지역의 조석을 보고 결정하거나 조석 모델에 의한 값을 사용한다. 시료 채취는 조석 중간에 하는 것이 권장된다. 그 이유는 조석이 바뀔 때의 상황은 조석 중간에 비해 극단적인 자료를 제공하기 때문이다. 그리고, 밀물과 썰물의 유속이 동일하지는 않지만 심한 불균형이 아닌 경우라면 같은 것으로 간주하며 같은 취지에서 정기적인 조사라면 대조나 소조 때보다는 그 중간 시기에 시료를 채집해야 한다. 즉, 평균적인 상황에 대한 시료 채집이 권장된다. 집중 감시역이 조석의 영향권에 있다면 최소한 하루 두 차례 대조기와 소조기 시료를 추가로 취득하는 것을 권장한다.

2.4  체류시간의 고려

2.4.1  체류시간은 어떤 물질이 임의의 해역에서 머무르는 시간을 의미하며 해역에 존재하는 양을 유입량 혹은 유출량으로 나누어 평균 체류시간으로 나타낸다. 연안역이나 하구역에서 물질의 체류시간은 대체로 하루에서 며칠 사이로 짧다. 따라서, 시료는 동시 채집이 선호되며, 체류시간이 짧은 물질을 여러 날에 걸쳐서 채집하는 전략은 바람직하지 않다. 채집은 가능한 짧은 시간에 완료할수록 좋기 때문에 길어도 2일 이내에는 마치는 것을 권장한다.

2.4.2  물질의 체류시간은 계절 변동성을 가지고 있다. 하구역은 강의 유수량이 계절 변동을 보이므로 유수량이 가장 중요한 요소로 작용한다. 그러나, 계절 내에서도 변동이 큰 경우가 많아 연안역에서 장기자료의 평균값은 대체로 큰 의미가 없다. 특히, 다른 장소와 비교할 때 장기자료의 평균값을 가지고 해석하는 것을 주의해야 한다.

2.5  채취 빈도

2.5.1  시료채취 빈도는 해당 해역의 변화 속도에 따라 다르다. 큰 변화가 없거나 양호한 상태로 알려진 곳은 1년이나 2년에 한번 채집해도 되지만, 수시간 간격 혹은 연속적으로 감시해야 하는 경우도 있다.

2.5.2  CTD에 장착한 센서로 측정하는 경우 (염분, 온도, 용존 산소, pH, 형광 등), 초당 2회 (또는 1 m에 2회 측정)를 기준으로 한다. 이를 기준으로 변화가 빠를 것으로 예상되면 측정 빈도를 늘려 잡으면 된다.

2.5.3  조석 주기에 따른 변화를 보고자 한다면 최소한 1시간마다 1회씩 조석 주기 전체를 13시간에 걸쳐 조사해야 한다. 또한, 밤낮 변화를 추가로 보고자 한다면 최소한 2번의 조석 주기를 포함하도록 25시간 관측을 수행해야 한다. 대조와 소조의 영향을 파악하고자 한다면 최소한 대조시와 소조시 각 1회 한번의 조석 주기에 걸쳐 관측해야 한다. 계절 변화는 최대와 최소를 보이는 시기에 맞추어 2회 수행하도록 한다.

2.6  조사정점 선정

2.6.1  환경에 크게 부담을 주는 오염원 및 수송 매체가 있을 경우, 예를 들어 강이 있다면 염분의 변화에 맞추어 시료를 채집하는 것이 권장된다. 염분의 변화가 있는 경우에는 대부분의 물질순환 과정이 염분에 맞추어 변하기 때문이다. 염분의 변화는 거리에 맞추어 일어나지 않기 때문에 등거리 (매 5 km 혹은 10 km 마다) 로 시료를 채집하는 전략은 좋지 않다.

2.6.2  실제로 같은 염분대에서 시료를 여러 개 채집하고 다른 염분대에 대한 시료를 빼먹는 일이 자주 발생해서 중요한 수질변화 요인을 놓치는 경우가 발생하기 쉽다. 따라서, 일단 강상류로 향하게 되면 염분 변화가 적어서 등거리 시료 채집만이 유일한 선택이 되기도 한다.

2.6.3  하구역간의 자료 비교는 등염분 구간 자료만이 상호 비교 대상이 될 수 있다는 점을 명심해 두도록 한다. 염분에 따른 시료 채취 구간은 약 3 간격 (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33) 으로 하는 것을 추천한다.

2.7  시료채취시 수심 간격

2.7.1  시료채취의 수심 간격을 결정할 때 가장 기본적으로 고려되어야 할 사항은 시료채취 정점에서 수층의 수직적인 온도와 염분 분포를 측정하여 밀도약층의 위치를 파악하는 것이 중요하다. 수심이 얕고 수층 전체가 혼합이 잘 되어 있으면 표층, 중층, 저층에서 시료를 채취하는 것을 권장한다. 하지만, 수층의 수직 구조를 알 수 없을 경우에는 표층 시료를 포함하여 매 10 m 간격으로 시료를 채취하고 바닥 근처에서 저층 시료를 채취하는 것을 권장한다.

2.7.2  수층 구조를 알고 있는 경우, 밀도약층을 중심으로 표층과 저층의 조사 항목의 변화 정도가 뚜렷하게 나타날 수 있도록 수직 간격을 보다 조밀한 간격으로 결정해야 한다. 일반적으로 300 m 이하의 연안역에서는 표층, 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 300 m 간격으로 시료를 채취하는 것이 적절하다. 바닥 수심이 앞서 언급한 수심보다 얕을 경우에는 바닥 시료를 채취한다. 또한, 표층에서 클로로필 최대값이 나타나면 이를 중심으로 시료채취 수심 간격을 조정할 수 있다.

2.8  일반항목 분석을 위한 해수시료 용기

조사항목에 따라 마개가 있는 경질 유리 용기 또는 플라스틱 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기를 선택하여 사용한다. 시료 용기는 사용 전에 미리 10 % (v/v) 염산

 질산 용액으로 세척할 경우, NO3-의 오염이 발생할 수 있음.

용액으로 세척한 후 초순수로 세척하여 사용해야 하며 시료를 용기에 넣기 전에 동일 채취 시료로 3회 이상 충분히 헹구어낸 뒤 시료를 담아야 한다.

2.9  영양염 분석을 위한 시료의 용기 선택

2.9.1  영양염 분석을 위한 시료는 플라스틱 용기에 넣어 보관한다. 유리용기는 용해가 쉬워 규산에 의한 오염 가능성이 있어 유리 용기는 영양염 시료를 보관하는 데 사용하지 않도록 한다.

2.9.2  영양염 자동분석기를 이용하여 영양염을 분석할 경우에는 사용되는 시료량이 적기 때문에 주로 30 mL(1 oz)의 입구가 좁은 고밀도 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 용기를 사용한다. 또한, 50 mL의 원심분리용 플라스틱 튜브(tube)도 많이 사용되지만 그 중 몇몇 플라스틱은 해수로부터 인산염의 흡착과 같은 방해 가능성이 있음에 주의해야 한다.

2.9.3  영양염 자동분석기를 이용하지 않는 경우에는 영양염 성분별로 분석하기 때문에 많은 양의 해수시료가 필요하다. 따라서 영양염 분석을 위한 시료는 최소한 300 ∼ 500 mL의 입구가 좁은 고밀도 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 용기를 사용해야 한다.

2.10  영양염 분석용 시료채취 용기 및 기구 세척

2.10.1  영양염 분석용 시료채취 용기를 포함한 기타 실험기구들은 깨끗하게 유지되어야 하며, 특히 유리의 용해에 의한 규산염의 오염에 주의해야 한다. 용기의 세척은 아세톤 또는 10 % (v/v) 염산을 이용하는 것이 효과적이다.

2.10.2  아세톤을 이용하는 방법은 먼저 증류수로 시료병을 1 ∼ 2회 헹군 후에 아세톤으로 한번 헹구고 증류수로 2회 이상 헹군 후 흔들어 건조시킨 후에 뚜껑을 닫아서 보관한다.

2.10.3  10 % (v/v) 염산을 이용하는 경우, 바로 10 % (v/v) 염산을 이용하여 헹군 다음에 증류수로 2 ∼ 3회 헹구어 건조하여 뚜껑을 닫아 보관한다. 10 % (v/v) 염산을 사용하면 아세톤을 사용할 때 발생할 수 있는 화재 또는 독성위험을 피할 수 있다.

3. 유출유 시료의 채취

3.1  상황별 채취방법

3.1.1  기름에 의한 오염사고는 수표면, 해안 또는 지질로부터 유출된 기름의 성상, 지역의 특성 및 자연 조건의 변동 등을 고려하여 오염 현장을 대표할 수 있는 시료를 채취해야 한다.

3.1.2  기름에 의한 오염사고는 선박 운항 중 고의적 또는 불의의 사고로 발생되고 있으며, 육상의 공장이나 해양시설 등에서도 유출이 가능하므로 유출원으로 추정되는 오염 현장 주위의 기름 시료는 모두 채취해야 한다.

3.1.3  선박의 경우, 기름이 유출될 가능성이 있는 모든 곳(연료 탱크, 화물유 탱크, 선저 폐수 탱크, 스롭탱크 등)에서 시료를 채취해야 한다.

3.1.4  유출유 시료는 타르 상태의 수분혼합유류, 유화된 시료, 이미 수거된 유류 등 여러 가지 형태가 있을 수 있으므로, 시료 상태에 맞게 채취 용기와 기구 등을 선택적으로 사용해야 한다.

3.1.5  시료가 미량이어서 직접 채취가 어려운 경우에는 유분이 함유되어 있지 않은 펄프 섬유 같은 것에 흡착시켜 채취해야 한다.

3.2  시료용기 세척

유리병을 미리 10 % (v/v) 염산용액으로 씻은 후 증류수로 3회, 아세톤 등으로 1회 씻어서 건조시킨다.

제2항 해수 용존성 중금속 분석을 위한 시료채취 및 전처리

1. 적용 및 범위

1.1  본 방법은 해수 중 용존 중금속에 대한 신뢰성 있는 자료를 얻을 수 있도록 해수시료의 전처리, 보관 및 현장 정도관리 과정에 관하여 기술한다. 해수 중 용존 중금속은 시료 채취 및 전처리 과정에서 주변으로부터 분석 대상 중금속의 오염이 쉽게 일어난다. 이를 예방하고 각 중금속의 분석 방법으로 정확한 측정이 될 수 있도록 전처리 절차를 규정하고 있다. 본 방법에 적용될 수 있는 금속들은 미량(낮은 ppb 수준) 혹은 극미량(ppt 수준) 농도로 해수에 존재하는 금속들이며 적용대상 금속을 아래에 표 1에 요약하였다.

표 1. 적용대상 중금속 종류

┌───────────────────────────────┐

│Arsenic (As), Cadmium (Cd), Cobalt (Co), Chromium(IV) (Cr6+), │

│Copper (Cu),  Lead (Pb), Mercury (Hg), Nickel (Ni), Zinc (Zn) │

└───────────────────────────────┘

1.2  연안과 외양에서 해수 채취시 사용하는 선박의 규모가 다르므로 각각에 적절한 해수 채취방법이 제시되어 있고 채수방법에 따라 여과방법도 달리한다.

1.3  용존성 중금속을 측정하기 위해서는 반드시 미리 산세척한 0.45 μm 멤브레인 여과지로만 여과하고, 중금속별로 적절한 보관 과정을 거쳐야 한다(3.1 시료보관병 준비).

2. 시료채취

2.1  준비 및 주의사항

2.1.1  해수를 채취하기 전에 실험실에서 모든 시료 채취 및 처리 기구, 시료 보관 용기들은 세제, 산 및 초순수로 세척되어야 한다. 하지만 비닐 글러브, 보관 비닐백, 플라스틱 랩은 공시료에서 오염이 되었다는 증거가 없다면 세척 없이 새 물품을 사용한다.

2.1.2  모든 기구들의 재질은 비금속 재질이어야 하며, 금속을 함유하는 재질이 전혀 없어야 한다. 가능한 재질은 저밀도 및 고밀도 폴리에틸렌(LDPE, HDPE), 폴리카보네이트(PC), 혹은 폴리프로필렌(PP) 등이며 불화폴리머(FEP, PFA 혹은 PTFE)도 가능하다.

2.1.3  시료 보관용기는 산세척 후 약산(0.1 % HCl 혹은 0.1 % HNO3 (Ultrapure 급)) 용액으로 채우고 개별적으로 지퍼백을 사용하여 두 번 이상 밀봉하며 플라스틱 박스에 담아 현장으로 이동한다. 다른 기구들도 산세척 후 개별적으로 두 번이상 비닐백 포장을 하여 현장으로 이동한다.

2.1.4  중금속용 해수 채취는 두 명(Clean Hands, Dirty Hands)이 한 조가 되어 진행된다. Clean Hands는 시료병, 해수 채수기에서 시료병으로 이동 등 시료와 직접 관련된 작업을 하며, Dirty Hands는 해수 채수기 준비, 펌프 가동, 폴 작동 등 해수시료와 직접 접촉이 없는 모든 과정을 다루는 절차를 수행한다.

2.1.5  시료를 채취하기 전에 해당 해역 특성, 사용하는 선박의 규모, 필요한 시료량 등을 고려하여 해수 채취방법을 결정하고 현장의 정도관리 시료까지 포함할 수 있도록 충분한 시료량을 확보한다.

2.1.6  해수 채취방법은 표층수 채취를 위한 "Pole sampler를 사용한 방법"이 있으며, 외해역 표층수의 채수는 "연속흐름 펌프를 사용한 방법"이 있으며 저층수를 위해서는 특수 해수 채수기(내부가 테프론 코팅된 Go-Flo 및 Niskin-X sampler)를 폴리머 재질 와이어와 테프론 코팅된 메신저를 사용하여 채수할 수 있다. 이들 방법들을 사용하는 선박과 수심에 따라 적절히 사용한다.

2.1.7  시료 채취는 두 사람이 한 팀이 되어 이루어지며 선박에서 선수 부분에 플라스틱 판으로 깨끗한 작업 공간을 마련하거나 실험실이 있는 경우는 청정벤치를 설치하고 깨끗한 작업 공간을 확보한다. 시료의 직접적인 처리는 모두 "Clean Hands"가 하고 채수기, 펌프 등 직접적으로 시료와 접촉하지 않는 과정은 "Dirty Hands"가 수행한다. 예를 들면, 플라스틱 박스를 열고 시료 보관병을 잡고 바깥쪽 지퍼백을 여는 것은 "Dirty Hands"가 하고 내부 지퍼백을 열고 시료병에 해수를 넣으며 다시 내부 지퍼백에 시료병을 넣는 것은 "Clean Hands"의 역할이 된다. 이와 같은 방법으로 역할을 나누어서 모든 과정을 함께 수행하면 가장 깨끗하게 시료를 채취할 수 있다.

2.1.8  시료채취 동안 시료를 사람, 대기 혹은 다른 오염원에 노출되지 않도록 최대한 노력을 하며 특히 함께 승선한 다른 작업팀의 적극적인 도움을 받아야 한다. 그리고 선박의 배기가스 배출 방향에 대해서도 고려해야 하며 시료에 사람의 호흡이 직접적으로 접촉되지 않도록 한다.

2.1.9  시료채취 후 여과과정 및 현장에서 산처리 과정은 금속 및 대기오염이 최대한 차단되는 청정벤치 또는 동등 시설에서 이루어져야 한다.

2.2  Pole Sampler를 이용한 연안역 표층해수 채취

2.2.1  Dirty Hands가 Pole Sampler와 시료 보관병의 바깥 지퍼백을 열며, Clean Hands가 내부 지퍼백을 벗겨내고 시료 보관병을 잡고 Dirty Hands가 벌려준 고무줄 사이로 시료병을 장착한다. Clean Hand는 시료병의 뚜껑을 열고 뚜껑을 비닐백에 잠시 보관하고 장갑을 교체한다.

2.2.2  Dirty Hands가 선박이 진행(2 ∼ 4 knot)하는 동안 선수에서 Pole Sampler를 수면 아래로 시료병의 입구가 밑으로 가게끔 수면 아래로 넣고 해수를 채취하며, 처음 두 번은 시료병 세척에 사용하고 세 번째 해수를 채취한다. 채취된 해수가 선상으로 올라오면 Clean Hands는 시료병의 뚜껑을 빠른 시간 내에 닫고 지퍼백에 넣어 Dirty Hands가 잡고 있는 바깥쪽 지퍼백에 넣는다.

2.2.3  Pole sampler의 끝 쪽 아크릴판은 초순수로 헹구고 지퍼백에 넣어 다음 사용 때까지 보관한다. 시료에 대한 표시를 내부 지퍼백과 조사기록부에 기입하고 주변 상황에 대해서도 기입해둔다.

2.2.4  소형 선박이라서 현장에서 여과를 하지 못할 경우, 아이스박스에 넣고 낮은 온도에서 보관한다. 하선 후 즉시 조용한 장소에 이동식 청정 벤치를 설치하고 벤치 내부에서 진공 펌프 및 여과 방식으로 여과한다.

2.3  외해역 표층수 채취를 위한 연속흐름펌프 방법

2.3.1  펌프를 통한 연속 흐름 해수 채취 방법은 선박을 2 ∼ 4 knots로 운행하며, 튜빙이 선박의 흔적 밖에 놓이도록 선상 크레인을 사용하거나 배 옆에 수직대를 설치한다. 어뢰형의 플라스틱 몸체에 튜빙 끝이 선박 진행 방향으로 고정되게끔 옆 및 수직 날개를 장착하며, 운행 중 플라스틱 몸체가 부유하지 않고 5 m 정도에 유지하도록 무게추로 사용한다. 선상에서 튜빙은 펌프를 통과하여 이동형 청정벤치 내부에서 끝나게끔 설치하고 정점에 도착 5분 전부터 선박의 속도를 줄이고 튜빙 고정 플라스틱 몸체를 내린 후 해수 펌프를 시작한다.

2.3.2  현장에서 연동 펌프(혹은 다이아프램 펌프)를 조용하고 깨끗한 장소에 설치하고 이동식 청정벤치를 설치한 후 선상 튜빙 끝에 In-line filter 혹은 Capsule filter를 연결한 다음 벤치 내부에 고정한다.

2.3.3  작업자는 목이 긴 글러브를 착용한다. Dirty Hands는 시료 보관병 박스에서 여러 개의 시료병을 꺼내고 외부 지퍼백을 열어 주면 Clean Hands가 내부 지퍼백을 있는 상태로 청정벤치에 놓아둔다.

2.3.4  Dirty Hands가 펌프를 가동하며, 해수가 올라오고 여과되면 Clean Hands는 벤치 내부에서 처음 100 mL를 버리고 시료 보관병과 뚜껑을 여과한 시료로 헹군 후 시료를 채운다. 시료가 담긴 병은 내부 지퍼백에 넣고 정점 표시를 한 뒤 Dirty Hands가 준비하고 있는 외부 지퍼백에 넣고 플라스틱 통에 시료를 보관한다.

2.4  채수기(Go-Flo 혹은 Niskin-X  sampler)를 이용한 저층수 채취

2.4.1  채수기를 사용하여 저층수를 채취하는 경우, 채수기를 고정하는 wire가 폴리머 혹은 나일론 재질이어야 하며 테프론 코팅된 메신저를 사용한다. 따라서, 선박에 장착된 winch wire가 폴리머인 경우에는 선박 중간에서 시료 채취를 하고 winch가 없는 경우는 선수의 선박 영향이 최소인 장소에서 시료 채취를 한다.

2.4.2  작업자는 목이 긴 글러브를 착용한다. Dirty Hands가 채수기를 wire에 장착하고 일정 깊이까지 내려가게 한다. 일정 깊이에서 테프론 메신저를 내려 채수기 뚜껑을 닫고 선상으로 올린다.

2.4.3  채수기 지지대에 채수기를 고정하고 Dirty Hands는 글러브를 교체한다. In-line filter 혹은 Capsule filter를 채수기 배출 노즐에 연결하고, 압축 질소를 채수기 공기 주입구에 연결한다. Dirty Hands가 시료 보관병의 외부 지퍼백을 열어 주면 Clean Hands는 내부 지퍼백을 열고 시료 보관병을 준비한다.

2.4.4  Dirty Hands가 질소를 주입하면 Clean Hands는 여과된 시료를 처음 100 mL를 버리고 시료병을 헹군 다음 시료를 채운다. Clean Hands는 내부 지퍼백에 시료를 채운 시료병을 넣은 다음 정점 표시를 하고 Dirty Hands가 갖고 있는 외부 지퍼백에 넣고 이를 플라스틱 통에 넣어 보관한다.

2.4.5  현장에서 여과가 어려운 경우는 여과하지 않은 시료를 같은 방법으로 채취하여 아이스박스에서 저온으로 보관하고 하선 후 즉시 조용한 장소에서 청정벤치를 설치하고 진공여과기구를 이용하여 여과한다.

3. 전처리

3.1  시료보관병 준비

3.1.1  재질은 불화폴리머, 저밀도 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌이며 수은 분석을 위해서는 불화 폴리머나 유리용기가 사용된다. 부피는 500 mL나 1 L를 사용한다.

3.1.2  보관병의 세척은 알칼리성 세제를 넣은 수돗물을 새 용기에 채우고 뚜껑을 닫은 후 세제가 있는 물을 담고 있는 플라스틱통 안에 넣고 플라스틱통의 뚜껑을 닫아 2일 동안 먼지가 없는 장소에 방치한다. 세제를 1차 이온 교환수로 헹군 다음 초순수로 시료병의 내ㆍ외부를 헹구고 여기에 10 % HCl 또는 HNO3 용액(Supra pure급, Merck사 기준)을 가득 채운다. 10 % HCl 용액이 담겨져 있는 큰 플라스틱통에 시료병을 완전히 담근 후 상온에서 30일 동안 혹은 60 °C에서 7일 동안 산세척한다. 이후에 염산 또는 질산 용액을 비운 후 초순수로 5회 이상 헹군다.

3.1.3  위 재질이 아닌 다른 것으로 사용해야 하는 경우에는 공시료를 제조하여 반드시 문제가 없음을 먼저 확인해야 한다.

3.1.4  산세척된 시료병은 0.1 % HCl 혹은 0.1 % HNO3 (Ultrapure급) 용액으로 채우고 뚜껑을 닫은 후 지퍼백으로 이중 포장하여 플라스틱 박스에 보관한다. 현장으로 출발하기 바로 직전에 산용액을 제거하고 초순수로 세척한다.

3.2  시료여과

3.2.1  진공 여과기구와 펌프를 청정벤치 내부에 설치한다. 진공 여과기구는 여과된 해수를 받는 부분을 시료보관병에 직접 받을 수 있도록 아크릴로 제작된 원통과 받침판을 이용한다. 이때, 받침판에 실리콘 판을 부착하여 진공이 가해졌을 때 원통과 받침판이 밀착되게 한다.

3.2.2  진공 펌프와 원통 사이에는 빈 통(진공 buffer)을 두어 해수가 진공으로 역류하더라도 펌프에 들어가지 않도록 한다.

3.2.3  작업자는 모두 글러브를 착용한다. Dirty Hands가 플라스틱통에서 시료 보관병과 폐수통을 꺼내어 외부 지퍼백을 열어준다. Clean Hands는 내부 지퍼백을 열고 시료 보관병과 폐수병을 청정벤치에 넣는다. Clean Hands가 여과 기구에 산 세척된 멤브레인 여과지를 장착하고 원통 내부에 폐수통을 넣고 윗부분을 원통에 올려놓고 해수를 윗부분에 소량 부어 넣는다.

3.2.4  Dirty Hands가 펌프를 작동시키고 여과 장치에 약간의 진공이 걸리면 해수가 여과되면 진공 buffer통과 원통 사이의 밸브를 돌려 여과 기구에 진공을 깨뜨리고 Clean Hands는 폐수병을 시료 보관병으로 교체한다. 다시 여과 기구를 조립하고 여과하지 않은 해수를 부은 다음 밸브를 열어 진공 여과가 되게 한다.

3.2.5  여과가 완료된 후 Clean Hands는 시료보관병을 지퍼백에 넣고 정점 명칭을 기입한 후 Dirty Hands가 갖고 있는 외부 지퍼백에 넣어 보관한다.

3.3  오염방지 조치를 위한 도구

3.3.1  현장 이동형 청정벤치 혹은 현장 이동용 글러브 백은 조립식으로 제작한 청정벤치나 글러브백을 사용할 수 있으며, 현장에서 해수 자체가 대기에 노출되는 것을 방지하기 위한 것이고 HEPA filter로 정제된 공기가 내부에 충분히 양압이 잡히게 제작하면 된다.

3.3.2  비닐장갑은 폴리에틸렌, 비닐 혹은 PVC 재질로 새로운 것을 사용하며 산세척이 되지 않은 물건을 잡았을 때 교체하여 사용한다. 보통 주방에서 사용되는 1회용 장갑을 사용하면 별도의 산세척이 필요 없다. 그러나 시료에 직접 접촉해서는 안되며 일단 포장을 뜯게 되면 전체를 깨끗한 장소나 지퍼백에 넣어 보관한다.

3.3.3  보관 비닐백은 새로운 것이며, 다양한 크기의 짚백, 무색 폴리에틸렌백이 사용된다. 별도의 세척이 필요 없으나 시료에 직접 접촉은 없어야하며 시료병이나 기구의 포장에만 사용한다.

3.3.4  플라스틱 랩은 새로운 것이며, 다양한 기구의 일시적인 포장을 위해 사용하며 시료에 직접 접촉은 없어야 하며, 무색의 폴리에틸렌 재질을 사용한다.

3.4  여과기구

3.4.1  여과 기구는 In-line filter 또는 Capsule filter를 이용하고 진공펌프와 진공여과 기구를 이용할 수 있다.

3.4.2  In-line filter 또는 Capsule filter 사용은 연속흐름 펌프를 사용하는 경우, 튜빙 끝에 직접 In-line filter 또는 Capsule filter를 연결하여 직접 용존 중금속용 해수를 여과할 수 있다. 채수기를 이용하는 경우도 해수 배출구에 직접 연결하고 공기 주입구에 압축 질소를 주입하면 여과된 해수를 얻을 수 있다. 공극이 0.45 ㎛이고 47 mm 직경인 멤브레인 여과지를 사용하거나 0.45 ㎛인 Capsule형 여과지를 사용한다. 여과한 해수 중 처음 50 mL 이상은 버리고 그 후의 해수만을 시료 보관병에 채취한다.

3.4.3  Pole sampler 또는 채수기를 사용하는 경우, 진공펌프와 진공여과 장치를 이용할 수 있다. 이 때 여과된 해수는 각 시료 보관병에 직접 받을 수 있도록 여과장치를 직접 제작하여 사용한다. 처음 여과한 해수 50 mL 이상은 버리고 그 후에 여과된 해수만 시료 보관병에 받는다.

3.4.4  사용하는 여과지는 사용하기 전 반드시 0.1 M HCl 용액으로 60 °C에서 1일 동안 가열하고 식힌 후 초순수로 3회 헹군 후 초순수 상태에서 1일 동안 60 °C로 가열하여 남아있는 산을 완전히 제거하며 초순수에 담근 상태에서 여과에 사용한다. 입자상 중금속을 분석하는 경우, 여과지 낱장을 플라스틱 페트리디쉬에 넣고 청정벤치에서 일정 무게가 될 때까지 건조시켜 무게를 측정한 여과지를 사용하면 된다.

3.5  펌프 및 펌프 기구

3.5.1  연속흐름 펌프는 연동 펌프나 테프론 재질의 다이아프램 펌프를 사용한다. 튜빙을 선박에서 해수면 아래로 내려서 해수를 채취하기 때문에 선박의 크기에 따라 펌프의 성능을 결정하여 펌프를 선택하는데 높이에 대한 성능(3 m 이상), 해수 채취 속도(0.5 L/min 이상)를 고려해야 한다. 다이아프램 펌프는 압축공기가 필요하므로 공기 압축기를 사용한다.

3.5.2  연동 펌프는 별도의 세척이 필요 없으나 몸체가 보통 금속으로 되어 있으므로 접촉이 있었을 때는 비닐장갑을 교체한다. 다이아프램 펌프는 튜빙 세척과 함께 연결하여 세척한다.

3.5.3  시료 채취 튜빙은 두 가지 펌프 모두 불화폴리머 혹은 폴리에틸렌 재질이 사용된다.

3.5.4  튜빙 커넥터는 PVC, 무색 폴리에틸렌, 불화 폴리머 재질을 사용하며 튜빙 세척법과 같은 방법으로 세척한 후 사용한다.

3.6  기타 기구들

자동 피펫 및 무색 피펫팁(100 ∼ 1,000 μL), 테플론 혹은 폴리에틸렌 재질 wash bottle(시료보관병 세척과 같은 방법으로 세척 후 사용), 플라스틱 핀셋(10 % HCl 용액으로 세척 후 사용)

3.7  시약

3.7.1  초순수는 제조 장치에서 얻어진 18.2 MΩ 이상의 저항을 갖는 초순수이며, 다른 방법으로 얻어진 초순수도 사용 가능하나 해수 중금속농도를 기준으로 1 % 이하의 낮은 농도가 검증된 자료가 필요하다.

3.7.2  질산은 초기 세척용으로는 GR 등급이 사용되며 마지막 단계 세척 및 시료에 주입하는 질산은 Ultrapure급(Optima, AAA 등급)이거나 비등점하 산정제 시스템으로 정제한 산이 사용된다.

3.7.3  염산은 초기 세척용으로는 GR 등급이 사용되며 마지막 단계 세척 및 시료에 주입하는 염산은 Ultrapure급(Optima, AAA 등급)이거나 비등점하 산정제 시스템으로 정제한 산이 사용된다.

4. 주변오염원 방지

4.1  개요

4.1.1  해양에서 얻어진 많은 중금속 자료 중 1970년대 전의 것들은 시료 채취 및 분석 방법의 문제로 현재 사용할 수 없는 것으로 알려져 있으며 그 중 시료채취, 처리 및 분석과정 동안의 주변 오염 방지가 가장 중요한 점으로 파악된다. 따라서 중금속용 시료를 채취하고 처리하는 데 주변 오염을 방지하기 위한 각별한 주의가 요구된다.

4.1.2  중금속용 시료에 주변 오염이 영향을 주는 경로가 여러 가지 있을 수 있는데 부적절한 기구 및 시약, 부적절한 세척 방법, 주변 환경 및 실험자의 접촉으로 나뉠 수 있다. 기구 및 시약은 금속 재질이나 금속을 함유한 시료 채취 기구, 보관 용기, 실험실 부품(예를 들면, 활석 가루가 있는 글러브는 높은 아연 오염원), 시약 그리고 초순수가 해당된다. 용기나 기구의 세척도 사용하는 산이나 세척 시간에 의해 문제가 될 수 있으며, 주변 환경의 영향은 자동차 배기가스, 담배 연기, 주변 도로, 실험실 및 선박 바닥에서의 먼지나 지저분한 물질들이 해당된다. 실험자의 접촉도 문제가 되는데 글러브를 끼지 않은 손에 의해 높은 아연 오염, 최근에 수은 아말감 치과 치료를 한 경우, 호흡에 의해 수은 오염이 가능하다.

4.1.3  주변 오염 방지의 가장 중요한 원칙은 시료와 관련된 모든 물질들은 비금속이어야 하며 금속을 함유하지 말아야 한다는 점이다. 시료 채취, 처리 및 보관과 분석과정 동안 주변 오염 방지를 못하면 절대 올바른 자료를 얻을 수 없다. 또한 주변 오염 방지뿐만 아니라 실험자의 건강 및 안전도 고려해야 한다.

4.1.4  주변 오염 방지를 위한 최선의 방법은 시료와 기구들을 오염에 노출시키지 않는 것이므로 오염원을 파악하고 작업 지침을 엄격히 수행하는 것이 매우 중요하다.

4.2  일반적인 시료 채취시 주변오염 원인 및 주의사항

4.2.1  상호 교차에 의한 오염: 높은 농도를 갖는 지점에서 사용한 시료 채취 기구들에 의해 낮은 농도를 갖는 지점에서의 시료에 영향을 주는 것으로 해양에서 농도를 미리 예측하기 어려우므로 한 정점 채취 후 시료 채취 기구들을 약산과 초순수로 세척하거나 뚜껑을 닫고 밀폐된 장소에 보관한 후 다음 정점에서 시료 채취를 시행한다.

4.2.2  환경 중 입자 물질에 의한 오염: 선박의 엔진 배기 물질, 대기 분진, 선박 갑판 위의 먼지, 페인트 및 금속 조각, 담배 연기, 주변 사람 등 먼지 및 오탁 물질이 바람이나 진동에 의해 발생하여 시료에 영향을 줄 수 있으며 해수 채취 시 가장 중요한 오염원이 될 수 있다. 이를 회피하기 위해서는 먼지가 가장 적은 독자적 장소가 필요하며 여기에 이동식 청정벤치나 글러브백 같은 먼지 차단 장치를 설치하여 시료 처리를 장치 내부에서만 실시한다. 이것이 어려울 때는 시료가 공기 중에 노출되는 시간을 최소한으로 줄인다.

4.2.3  간접적 접촉에 의한 오염: 간접적인 방법에 의해서도 시료에 오염을 줄 수 있다. 예를 들면 세척된 튜빙을 지저분한 비닐백에 넣었을 경우, 튜빙 끝에 먼지가 묻어 결국 시료에 영향을 줄 수 있다. 따라서 시료 채취와 직간접적으로 관련된 모든 물품들은 사용하기 전에 세척되어야 한다.

4.3  중금속 분석용 시료의 교차오염 방지를 위한 조치사항

4.3.1  시료 및 시료를 담는 용기들은 청정 실험실, 청정벤치, 글러브백에서만 대기에 노출되도록 하여 주변 환경에서의 유입을 최소화한다. 이것이 어려울 때는 뚜껑을 항상 닫고 깨끗한 플라스틱 랩으로 싸거나 지퍼백에 이중으로 넣어 깨끗한 장소에 둔다. 세척과 분석 사이의 시간을 줄이는 것도 오염을 최소화하는 데 도움이 된다.

4.3.2  시료 처리를 맡은 실험자는 시료 처리와 관련된 전 과정에서 파우더가 없는 비닐 글러브를 반드시 착용한다. 만일 지저분한 용기를 만졌을 경우, 반드시 글러브를 교체해야 한다. 여러 겹의 글러브를 착용하고 한 장씩 벗어가면서 작업하면 쉽게 작업을 진행할 수 있다.

4.3.3  시료 채취, 처리 및 분석에 사용하는 모든 기구들은 비금속이어야 하며 금속을 함유하지 않은 재질로 되어 있어야 한다. 불가능할 때는 적어도 시료와 접촉하는 부분은 금속의 오염 영향이 없는 재질로 되어야 한다.

4.3.4  시료와 접촉 가능한 재질은 불화 폴리머(FEP, PTFE), 저밀도 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리프로필렌 혹은 고순도 석영이다. 불화폴리머나 유리 용기들은 수은 분석을 위해 사용된다. 이러한 재질을 갖는 모든 기구들도 사용하기 전에 충분히 산세척이 되어 시료를 접촉하였을 때 금속 오염이 없어야 한다. Pyrex, Kimax, 아크릴, PVC, 나일론, Vycor 재질과 색깔이 있는 플라스틱, 종이캡, 플라스틱에 부피를 나타내는 선을 그은 색소, 고무 등은 금속을 함유하기 때문에 시료와 접촉해서는 안되며 만일 사용할 경우, 금속 영향이 없음을 미리 확인해야 한다. 현장에서는 산세척한 용기들만 사용되도록 하며, 현장에서 시료 채취 후 다시 사용되는 용기들은 반드시 규정된 세척법을 사용한다.

제3항 시료의 보관 및 보존 방법

1. 해수시료의 보존방법

채취된 시료를 즉시 실험할 수 없을 때에는 따로 규정이 없는 한, 표 1의 보존 방법에 따라 보존하고 어떠한 경우에도 보존 기간 이내에 실험을 끝내야 한다.

표 1. 시료의 보존 방법

┌────────┬──┬────────────────────┬─────┐

│측정항목        │시료│보존방법                                │최대 보존 │

│                │용기│                                        │기간      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│염분            │P, G│15 ∼ 20 °C보관                        │10일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│수온            │P, G│-                                       │즉시 측정 │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│수소이온농도    │P, G│-                                       │즉시 측정 │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│부유입자물질    │P, G│4 °C 어두운 곳 보관                    │7일       │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│용존산소        │DO병│현장에서 용존산소 고정 후 어두운 곳 보  │8시간     │

│                │    │관                                      │          │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│황화수소        │DO병│4 °C 어두운 곳 보관                    │7일       │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│화학적산소요구량│P   │-20 °C, 냉동보관                       │28일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│용존유기탄소    │G   │4 °C 어두운 곳 보관                    │7일       │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│아질산성질소    │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │48시간    │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│질산성질소      │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │48시간    │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│암모니아성질소  │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │28일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│총질소          │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │28일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│용존총질소      │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │28일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│인산염인        │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │48시간    │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│총인            │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │28일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│용존총인        │P, G│-20 °C, 냉동보관                       │28일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│규산염          │P   │-20 °C, 냉동보관                       │48시간    │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│시안            │P, G│4 °C, NaOH로 pH 12 이상 냉장보관       │14일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│불소            │P   │-                                       │28일      │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│구리            │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│납              │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│니켈            │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│아연            │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│카드뮴          │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│코발트          │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│6가크롬         │P   │4 °C 시료 125 mL당 NaOH 1 mL 첨가후    │24시간    │

│                │    │냉장보관                                │          │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│총크롬          │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│비소            │P   │4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │6개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│수은            │P, G│4 °C, 시료 100 mL당 BrCl 0.2 mL 첨가후 │1개월     │

│                │    │냉장 보관 or HCl로 pH 2 이하 냉장보관   │          │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│알킬수은        │P, G│4 °C, HNO3로 pH 2 이하 냉장보관        │1개월     │

├────────┼──┼────────────────────┼─────┤

│페놀류          │G   │4 °C, H2SO4로 pH 2이하 어두운 곳 냉장  │28일      │

│                │    │보관                                    │          │

└────────┴──┴────────────────────┴─────┘

   P: polyethylene, G: glass

2. 영양염 분석용 해수시료의 보관

2.1  해양에서 큰 조사선을 이용하여 연구를 수행할 경우에 영양염 자동 분석기를 배에 장착하는 것이 관행이다. 자동 분석기가 제대로 작동이 되지 않는 경우를 제외하면 영양염 시료는 시료 채취와 동시에 현장에서 분석되어야 한다. 심지어 현장에서 분석할 때 시료를 1∼2시간 이상 보관하는 것은 효과적이지 못하다.

2.2  냉장 온도는 일반적으로 심층 온도인 1 ∼ 4 °C에서 잘 적응해서 살고 있는 해양 생물의 성장을 멈추기에 적합하지 않다. 이들은 저온에서 성장이 느려질 뿐 멈추지는 않는다. 그러나, 이러한 문제는 지역적인 특성 또는 영양염 시료병의 청결 정도에 따라서 문제가 될 수 있다. 따라서, 영양염 분석을 위한 시료는 채취와 동시에 보관한 후 나중에 분석하는 것을 기피한다.

2.3  만약 자동 영양염 분석기가 작동하지 않지만 8 ∼ 12 시간 이내에 수리할 수 있다면 4 °C 이하에서 냉장 보관 후 분석을 수행한다. 그리고 이러한 사항을 실험노트나 시료 기록부에 명시해야 한다. 오랫동안 보관을 해야 하는 경우는 시료를 채취한 후 바로 냉동 보관해야 한다.

2.4  냉동할 시료는 시료를 채취할 때 시료병의 3/4 정도만 채워서 뚜껑을 꼭 닫아 염분의 손실을 최소화하여 오차가 발생하지 않게 한다. 시료의 냉동 보관을 위해서는 온도가 -20 °C 이하인 급속 냉동고를 사용해야 한다. 냉동고 내에서 시료병 주위로 통풍이 잘되게 하기 위해서 그물 선반을 사용하고 시료 용기는 반드시 바로 세워 냉동 보관해야 한다.

2.5  저온의 급속 냉동고가 없을 경우에는 얼음과 소금 용액(Ice-salt bath)에 넣은 다음 시료를 보관 냉동고로 옮겨 넣어야 한다. 영양염 시료는 냉동 보관 중에도 계속적으로 분해되므로 냉동보관 이후 가능한 한 빨리 분석해야 한다(냉동보관은 시료 채취 후 8 ∼ 12 시간 이내에 분석할 수 없을 경우에 한해서만 최후의 수단으로 이용되어야 한다).

3. 유출유 시료의 보관

3.1  시료의 산화 방지를 위하여 차광하여 냉암소에 보관하며, 산소를 제거하기 위하여 질소 또는 탄산 기체를 주입하거나 드라이아이스 조각을 보관 용기에 넣고 마개로 밀폐시킨다.

3.2  기체크로마토그래피에 의한 유출유 분석 시료는 생물에 의한 변화를 방지하기 위하여 4 ～ 7 °C의 냉각 암소에 보관한다. 생물에 의한 변화는 노르말파라핀 성분이 이소파라핀 성분이나 나프텐계 성분보다 빠르므로 기체크로마토그래피 분석에는 많은 영향을 줄 수 있다. 또한, 생물에 의한 변화는 산소가 있을 때나 없을 때 모두 특수한 박테리아에 의해 일어날 수 있으며, 변화를 가장 받기 쉬운 시료는 유화된 시료, 물과 유류가 혼합된 시료, 유분이 물속에 녹아있는 시료, 해수 표면의 부유물과 같이 유류가 혼합된 시료들이 이에 속하고 타르볼과 같은 고형시료는 생물에 의한 변화는 비교적 적게 받는다.

3.3  시료 중 휘발성 물질의 손실을 방지하기 위하여 마개 입구를 밀봉하여 보관해야 한다. 시료 용기는 입구가 좁은 것을 사용하고, 마개가 완전히 밀폐되는 시료 용기를 사용하여 휘발성 물질의 손실을 막는 것이 중요하다. 용기 입구를 밀봉시키기 위해서 시료병 마개를 파손되지 않을 정도로 굳게 닫는다.

4. 중금속 시료의 보관

4.1  용존 중금속을 시료를 보관하기 위해서는 시료병에 흡착을 방지하기 위하여 시료 용액의 pH가 2 이하(해수 1 L에 10 % 질산 5 mL 첨가)가 되게끔 Ultrapure 급 질산 용액을 첨가한다.

4.2  현장에서 여과를 하더라도 시료를 실험실로 옮긴 후 청정하면서 환기가 잘되는 장소에서(클린룸) 산을 첨가한다. 실험실로 옮기는 동안에 시료병의 벽에 흡착된 금속들은 산 첨가에 의해 모두 용해가 가능하다.

4.3  산을 첨가한 시료의 중금속들은 6개월간 안전하다.

5. 냉동 시료의 해동

5.1  시료를 냉동 보관했을 경우, 실험실에서 시료를 분석하기 위해서 시료를 녹여야 한다. 시료를 녹일 때는 40 °C 정도의 미지근한 물에 냉동 시료병을 세워 15분 이내에 녹여야 하며, 해동시료는 한 번에 분석할 수 있는 개수만큼 한다.

5.2  자동 영양염 분석기를 사용하는 경우는 한 번에 40개 이상의 시료를 해동한다. 시료를 녹일 때 사용하는 물에 의해 시료가 오염되지 않게 주의를 해야 한다. 시료 용기의 뚜껑이 녹이는 물의 수위보다 위에 있도록 바로 세워야 한다. 녹인 후에는 상층의 담수와 하부에 있는 소금물을 완전히 혼합하여 분석한다.

5.3  규산염의 경우, 농도가 높은 시료는 냉동 과정에서 중합체를 형성했을 가능성이 높다. 이로 인해 시료의 규산염 농도가 실제 농도보다 낮게 측정될 수 있다. 따라서, 시료를 분석하였을 때 규산염의 농도가 40 μM 이상인 경우에는 일차로 분석된 시료를 24 시간 동안 상온의 암실에 보관한 후 다시 분석해야 한다. 시료를 상온의 암실에 보관하는 과정에서 규산 중합체가 단위체로 분해된다. 이때 시료를 흔들어서 완전히 혼합한 후 분석한다.

제3장 분석자료의 통계처리와 표현

제1항 분석자료의 기초통계

1. 표준편차와 신뢰구간

1.1  표준편차(s)는 복수시료 측정시 평균값(avg)을 중심으로한 분산 정도를 나타낸다. 표준편차율(정밀도)은 표준편차를 평균값으로 나누어 백분율로 표시한다.

표준편차율(정밀도)(%) = 표준편차(s)/평균값(avg) × 100         (식 1)

1.2  신뢰구간은 평균값(avg)에 ± 방법검출한계(tα,n-1 × s)를 합친 값으로 표현한다.

신뢰구간 = 평균값(avg) ± 방법검출한계(tα,n-1 × s)           (식 2)

예를 들어, 해수시료의 개수가 7(n = 7)일 때 자유도값(n-1 = 6)은 6이므로, 99 % 신뢰구간(α = 0.01)에서의 확률변수값 tα,n-1는 "t0.01,6 = 3.143"가 되고, 최종 신뢰구간은 "평균값(avg) ± 3.143 × 표준편차(s)" 로 표현된다.

표 1. 자유도에 따른 확률변수값

┌──────┬──┬──┬──┬──┬──┬──┬──┬──┐

│자유도(n-1) │2   │3   │4   │5   │6   │7   │8   │9   │

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│확률변수값  │6.96│4.54│3.75│3.36│3.14│3.00│2.90│2.82│

│(t-분포값)  │    │    │    │    │    │    │    │    │

└──────┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┘

2. 유효숫자

시료 분석결과, 농도는 반드시 유효숫자로 표현해야 한다. 유효숫자는 불확실할 수도 있는 마지막 자릿수의 숫자와 확실한 그 이상 자릿수의 숫자를 포함한다. 예를 들어, 분석결과 유효숫자 자릿수가 3자리로 표현된 23.7 mg/L의 경우, 23의 값은 확실한 값이고 0.7은 분석 과정상 존재할 수 있는 불확실한 오차를 내포하고 있다. 표준편차는 불확실한 오차의 숫자 개념을 갖고 있기 때문에 만일 반복 측정결과 이미 알고 있는 표준편차가 ± 2 mg/L이라면 분석자는 23.7 mg/L을 반올림하여 24 mg/L로 표현해야 한다.

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)

1. 개요

해양 환경의 오염 상태를 정확하게 파악하기 위해서는 정확한 측정 자료의 확보가 가장 중요하며, 이는 올바른 시료 채취와 분석을 필요로 한다. 따라서, 분석자는 시료의 채취, 보존, 전처리, 분석, 자료 해석 및 보고에 이르는 모든 과정에 대해 시험 결과의 객관성과 신뢰성을 보장할 수 있는 정도평가(Quality assurance, QA) 시스템을 수립해야 한다. 정도평가 시스템은 모든 시험결과가 과학적으로 타당하고 법적으로 변호받을 수 있을 것을 보장해야 하며, 정도평가 시스템하에서 실시되는 모든 분석결과는 충분히 정밀하고 참값에 근접한 측정값을 제시한다.

2. 정도보장(Quality  assurance)

정도보장은 정확한 측정과 분석결과의 신뢰성을 보장하기 위하여 수행되어지는 일련의 모든 활동들을 의미한다. 정도보장 시스템은 실험실에서 생산된 분석결과가 정밀하고 참값에 가까운, 그리고 법적으로 보호받을 수 있는 분석결과를 얻기 위한 수단이며, 이를 위해 객관적이고 추적 가능한 측정ㆍ분석값을 얻기 위한 모든 과정을 포함하고 있다. 이러한 정도보장에는 정도관리(quality control)와 정도평가(quality assessment) 과정이 포함된다.

2.1 정도관리(Quality control, QC)

정도관리는 측정시스템에 의한 측정 결과의 정밀도와 재현성을 유지하기 위하여 사용되는 모든 과정을 포괄하는 것이다. 측정 결과를 충분히 이해하고, 측정 목적에 따라 명확하게 명시된 요구사항에 기초하여 사전에 개발된 일련의 실험 방법을 사용한다. 따라서, 시료 채취 및 측정, 기기의 검교정, 결과처리 등에 대한 실험방법이 미리 확립되어 있어야 한다. 또한, 정도관리 시스템을 잘 운영하려면 주기적 또는 비주기적으로 정도관리의 확인을 위한 감시가 행해져야 한다. 정도관리는 정확한 결과의 도출과 이를 객관적으로 입증하기 위한 시료 채취 및 실험실 분석과정에서 이루어지는 정도평가 과정이며 정도보증을 이행하기 위해 정의된 과정과 준수 사항들로 구성되어 있다.

2.2  정도평가(Quality assessment, QA)

2.2.1 개요

정도평가는 실험실에서 생산되는 분석결과의 품질을 결정하기 위해 수행되는 평가 과정으로, 숙련도 평가시료의 분석과 평가결과에 대한 사후 관리를 포함한다. 측정 과정에서 측정 결과의 질을 추론할 수 있는 방법들로 구성된다. 이 방법을 통하여 통계적인 관리로 정도평가를 할 수 있으며, 측정자료의 정확도(accuracy)를 추정하고 유지할 수 있도록 한다. 정밀도(precision)는 농도를 알고 있는 시료(기지시료)와 농도를 알지 못하는 시료(미지시료)에 대한 반복 분석을 통해서 평가될 수 있으며 어떠한 시료에 대한 반복분석을 하여도 정밀도를 평가할 수 있으며, 편차(bias)는 기지 시료의 반복 측정을 통하여 평가할 수 있다. 이러한 측정 결과에 대한 정도평가는 실험실 내부의 자체평가와 외부기관에 의한 외부 평가로 구분된다.

2.2.2  내부정도평가

내부정도평가는 분석자의 교체, 분석장비의 수리 및 이동 등 주요 변동사항이 생길 경우에 내부정도관리를 위한 목적으로 반드시 실시하며, 장비의 청소 및 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인해야 한다. 내부기준물질(internal reference materials), 분할시료(split sample), 표준첨가시료(spiked sample), 혼합시료(mixed sample) 등을 이용하여 측정시스템의 반복측정 및 분석을 실시하고, 시료 채취과정뿐만 아니라 전반적인 분석 절차의 오류 가능성 및 재현성에 관한 유용한 정보를 확인ㆍ점검한다. 또한, 다른 분석자나 다른 측정기기에 의한 측정분석 결과를 서로 비교함으로써 실험 절차상의 안정성 검토가 가능하며, 다른 측정방법으로 동일 시료를 중복하여 측정함으로써 실험기준의 정밀도, 정확성에 대한 확신이나 시험기준상 편차의 존재를 확인할 수 있게 된다.

2.2.3  외부정도평가

외부정도평가 실시는 내부정도평가에 비해 노력을 줄일 수 있으며, 자체비교로 인한 오차를 줄일 수 있다. 또한, 내부정도평가에서는 확인하기 어려운 편차를 찾아낼 수 있어 측정의 정확도를 유지할 수 있다. 외부정도평가에는 공동시험분석의 참여, 다른 실험실과 시료의 교환 측정 및 외부에서 제공된 표준물질을 분석하는 방법 등이 있으며, 공동시험분석의 참여는 다른 분석자들과 측정 기술을 비교할 수 있다. 그리고, 실험실 간의 시료 교환 분석은 참값의 파악에 도움이 되며 적절한 표준시료의 활용은 전체 측정 과정을 평가할 수 있다.

2.3  정도보장 계획(Quality assurance plan)

분석 결과의 품질 목표를 달성하기 위해 작성하는 계획서로 과학적으로 타당한 자료와 법적으로 변호 받을 수 있는 자료를 보장하도록 분석을 수행하는 모든 실험자들이 사용할 수 있도록 마련된 것이다. 이 계획서에는 분석 방법들과 수집, 검토 및 분석된 결과를 보장할 수 있는 문서화 방법들이 분명하게 포함되어야 한다.

3. 정도평가/정도관리 관련용어

3.1  감도(Sensitivity), 감응 계수(Response factor)

감도 또는 감응 계수란 표준물질의 농도 변화에 따른 측정 세기의 변화의 비율로 나타내며, 일반적으로  검정곡선의 기울기로 표현된다.

3.2  검정곡선(Calibration curve)

분석 대상물의 측정 농도와 분석 기기의 측정 세기간의 상관관계를 나타내는 곡선으로 시료의 정량분석에 사용한다. 시료 분석에서 검정곡선의 관계식은 1차 함수의 형태로 나타나며, 이때 검정곡선의 직선성은 각 농도들의 직선성 결정계수(linearity determination coefficient, r2)로 나타나게 된다.  검정곡선은 작성 방법에 따라 절대검정곡선법(External Calibration Method), 상대검정곡선법(Internal Standard Calibration Method), 표준물질첨가법(Standard Addition Method)로 분류된다.

3.3  국제단위계(International System Unit, SI)

미터법을 근간으로 하여 국제적으로 규정된 단위계, 7개의 기본단위와 2개의 보조단위가 있으며 이들로부터 파생된 단위들이 사용된다.

3.4  검출한계(Detection limit)

분석 물질을 검출할 수 있는 최소한의 양 또는 농도이며, 시험방법 또는 분석기기의 성능을 결정하는 계수 중의 하나이다. 측정 방법에 따라 기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)와 방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)등으로 나뉜다.

3.5  대표값(Representative value)

반복하여 측정되어진 값으로 분석 대상물의 특성을 대표할 수 있는 값. 평균값(mean) 또는 중위수(median)를 사용한다.

3.6  매질첨가시료(Matrix Spike Sample, MS)

알고 있는 농도의 분석 물질을 분석하고자 하는 시료에 첨가한 시료, 분석 방법의 정확도, 회수율 등을 측정할 때 사용된다.

3.7  매질첨가 이중시료(Matrix Spike Duplicate Sample, MSD)

매질 첨가시료와 동일한 방법과 동일한 농도로 제조된 이중시료 시험방법의 정밀도 및 재현성 평가에 사용한다.

3.8  바탕시료(Blank sample)

측정분석을 하고자 하는 시료와 동일한 매질의 시료로서, 분석물질이 존재하지 않는 시료 용도에 따라 방법바탕시료(method blank sample), 시약바탕시료(reagent blank sample), 운반바탕시료(trip blank sample), 기기바탕시료(instrument blank sample) 등으로 구분한다.

3.9  반복성(Repeatability)

분석방법의 정밀도를 나타내는 인자로서, 일정 조건하에서 동일 시료에 대하여 반복하여 측정한 결과들간의 유사도, 이때 반복성을 측정하기 위하여 시험절차, 분석자, 시험기구, 환경조건, 시험실 등이 동일해야 하며 짧은 기간에 반복하여 측정된 값이어야 한다.

3.10  상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)

측정값의 표준편차를 측정 평균값으로 나누어 얻어진 값, 측정값의 크기에 관계없이 측정의 분산 정도를 알 수 있다.

3.11  내부표준법(Internal standard calibration)

시험방법 상의 회수율 또는 시료 주입에 따른 오차를 보정하기 위한 방법으로, 분석 시료와 검정곡선 작성용 시료에 분석물질과 다른 표준물질(내부표준물질)을 일정량 첨가하고 분석하는 방법.

3.12  소급성(Traceability)

측정 결과의 특성이나 기준값들이 국가표준기구 또는 국제표준기구로부터의 연계성이 입증되어지는 것, 이러한 연관성에는 틈이 있어서는 안 되며, 모든 불확도 값이 보고되어야 한다.

3.13  시료군(Batch)

시료군은 시료 채취, 측정ㆍ분석에 있어 동일한 공정과 동일한 분석자에 의해 수행되는 시료의 묶음이다.

3.14  실험실 정도관리 시료(Laboratory Control Samples)

실험실 관리시료는 각 분석 항목의 검정곡선 범위의 중간농도 정도로 증류수에 기지농도로 첨가한 시료로써 시험 진행과정에서의 기기 상태나 기타 분석조건의 변화 유ㆍ무를 측정하기 위한 것으로 전처리와 분석 모든 과정을 통해 측정된다.

3.15  완성도(Completeness)

완성도는 일련의 시료군들에 대해 유용한 결과 정도관리 목표값을 달성한 결과의 수를 가능한 모든 정도관리 분석 결과값의 총수로 나눈 것을 퍼센트로 표시한 것이다. 수질 시료에 대해 95 % 이상, 슬러지 시료에 대해서는 90 % 이상의 완성도가 일반적으로 요구된다.

          (식 1)

3.16  이상치(Out lier)

다른 값들과 비교하여 현저하게 동떨어진 값으로 동일한 그룹의 시료를 동일한 조건에서 측정하였다고 판정하기 어려운 결과값.

3.17  이중시료(Duplicate sample)

이중시료(duplicate)는 동일 시료를 처음부터 동일한 과정으로 분석하는 시료로 분석의 정밀도를 평가하기 위해 사용되며, 매질첨가/매질첨가 이중시료(Matrix Spike /Matrix Spike Duplicate, MS/MSD)는 임의로 선택한 한 시료에 기지 농도의 분석 물질을 첨가하여 사용한다.

3.18  재현성(Reproducibility)

동일한 시료에 대한 반복 측정 결과들간의 유사도를 측정함으로써 정밀도를 표시하는 지표 중 한 방법이다. 이때, 분석자, 시험 장비, 시험 일시 등 작업 조건 중 하나 이상의 인자들이 달라야 하며, 동일한 시험실에서 측정되어진 경우를 단일 시험실에서의 재현성이라 하고 시험실이 서로 다른 경우를 시험실간 재현성이라 한다.

3.19  정밀도(Precision)

정밀도는 분석방법의 성능을 평가하는 인자로 동일 조건하에서 동일 분석과정을 반복 적용한 결과의 상호 일치도로 정의된다. 이중 또는 다중 시료분석을 수행한 결과의 평가로 이중시료의 경우, 상대 퍼센트 오차(relative percent difference, RPD)로 다중 시료의 경우, 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 표현된다.

3.20  정량범위(Applicable concentration range)

주어진 시험방법 또는 시험기기를 사용하여 정량할 수 있는 농도 또는 양의 범위, 일반적으로 정량한계(limit of quantitation) ∼ 최대 직선성 응답구간(limit of linear reasponse)의 범위로 정의된다.

3.21  정량한계(Limit of Quantitation,  LOQ)

정량적으로 신뢰성있는 값을 구할 수 있는 최소한의 농도 및 양으로, 일반적으로 반복 시험에서 얻어진 결과들의 표준편차의 약 10배의 신호를 산출하는 농도로 정의된다. 시험 결과의 제출 시에는 정량한계 이상의 측정값을 보고한다.

3.22  정확도(Accuracy)

정확도는 분석의 재현성을 나타내는 정밀도와 참값과의 일치를 나타내는 편향의 조합으로, 일반적으로 정확한 분석은 양호한 정밀도와 편향을 갖고 신뢰성 있는 바람직한 분석이다.

3.23  직선성(Linearity)

표준물질의 측정값과 검정곡선과의 일치된 정도. 직선성 결정계수(r2)값으로 평가하며 상관계수가 1에 근접할수록 직선성이 우수하다.

3.24  표준물질(Standard material)

시료 중의 분석 대상물질의 농도 또는 양을 정량하기 위하여 기준이 되는 물질로 특성값이 알려져 있는 물질. 용도에 따라 몇 가지 종류의 표준물질이 있다.

3.25  내부표준물질(Internal standard)

내부표준법을 사용하기 위하여 시료와 표준용액에 첨가하는 표준물질.

3.26  대체표준물질(Surrogates)

대체표준물질은 분석대상물질과 물리, 화학적 성질이 유사하여 시료의 전처리 및 분석에 있어 대상물질과 비슷한 거동을 나타내는 물질로 환경 시료에서는 일반적으로 발견되지 않는 물질이다. 정확도, 추출효율 등을 평가하기 위해 사용된다.

3.27  인증표준물질(Certified reference material, CRM)

소급성을 확립한 절차에 따라 하나 또는 그 이상의 특성값이 인증되고 특성값에 불확도가 첨부된 표준물질.

3.28  표준물질첨가법(Standard addition method)

매질효과가 큰 시험분석방법에 대하여 분석대상 시료와 동일한 매질의 표준시료를 확보하지 못하여 정확성을 확인하기 어려운 경우에 매질효과를 보정하며 분석할 수 있는 방법이다. 이 방법은 검정곡선의 직선성이 유지되고, 바탕값을 보정할 수 있는 방법에 적용이 가능하다.

3.29  회수율(Recovery)

시료 중에 존재하고 있거나 첨가한 물질의 양에 대한 시료에서 얻어진 그 물질의 양의 비, 백분율 또는 시료 중에 존재하고 있는 분석대상물의 총량(A)과 시료로부터 다른 매질로 이동하여 나간 분석대상물의 총량(B)의 비율.

3.30  측정불확도

측정 및 분석결과에 관련하여 측정량을 합리적으로 추정한 값의 분산 특성을 나타내는 척도.

표 1. 정도관리와 관련된 통계

┌──────┬──┬───────┬─────────────┐

│통계        │표기│계산식        │정의 또는 사용 목적       │

├──────┼──┼───────┼─────────────┤

│            │    │              │중간 값 측정의 척도로     │

│평균        │    │              │측정의 평균을 계산한다    │

│            │    │              │                          │

├──────┼──┼───────┼─────────────┤

│표준편차    │S   │              │자료의 상대적 분포의      │

│            │    │              │척도로 측정의 분산을      │

│            │    │              │계산한다                  │

├──────┼──┼───────┼─────────────┤

│상대        │RSD │(S / ) × 100 │다중시료 분석의 정밀도를  │

│표준편차    │    │              │평가한다                  │

├──────┼──┼───────┼─────────────┤

│퍼센트 오차 │% D │              │두 측정값의 차이를        │

│            │    │              │측정하는 것으로           │

│            │    │              │정확도를 평가한다         │

├──────┼──┼───────┼─────────────┤

│상대        │RPD │              │이중시료 분석의 정밀도를  │

│퍼센트 오차 │    │              │평가한다                  │

├──────┼──┼───────┼─────────────┤

│절대 회수율 │% R │              │순수 매질에 첨가된 물질의 │

│            │    │              │회수율의 나타낸 것으로    │

│            │    │              │정확도를 평가한다         │

├──────┼──┼───────┼─────────────┤

│측정 회수율 │% R │              │시료 매질에 첨가된 물질의 │

│            │    │              │회수율을 나타낸 것으로    │

│            │    │              │정확도를 평가한다         │

└──────┴──┴───────┴─────────────┘

여기서,  = 각 개별 측정값 (농도),  = 측정 평균값, n = 측정 횟수

4. 세부 정도관리 절차

4.1  정도관리 목표값 설정

정도관리 목표값은 각 항목별 시험방법상에서 정도관리를 통해 도달해야 할 목표를 설정한 것이다. 이러한 목표에는 각 시험방법의 검출한계, 정량한계, 바탕시료 측정 결과, 검정곡선의 직선성, 정확도, 정밀도, 시험실 관리시료의 분석결과 등이 포함되며, 각 조사ㆍ연구 과제의 목적을 달성하기 위해 요구되는 수준과 각 실험실의 분석 능력을 고려하여 설정한다.

4.1.1  검출한계 및 정량한계

검출한계와 정량한계는 각 항목별로 과제 수행에 요구되는 수준 또는 시험방법에서 요구되는 수준을 충족해야 한다.

4.1.2  바탕시료 측정

바탕 시료는 각 항목별로 필요에 따라 "방법바탕시료", "시약바탕시료", "운반바탕시료", "기기바탕시료" 등에 대한 목표값을 설정한다.

 바탕 시료에 대한 목표값은 각 항목별로 방법검출한계 미만으로 설정하는 것이 이상적이나 시험환경 등에 의한 영향으로 부득이한 경우는 시험 결과에 영향을 주지 않고 보정이 가능한 범위에서 설정하도록 한다.

4.1.3  검정곡선의 직선성

각 항목별로 작성되어진 검정곡선의 직선성 결정계수(r2)를 바탕으로 하여 목표값을 설정한다. 이때, 결정계수가 1에 가까울수록 이상적이며 각 항목별 시험방법의 특성을 고려하여 목표값을 설정하되 기기분석의 경우는 0.99 이상, 습식분석의 경우는 0.98 이상이 권장된다.

4.1.4  정확도, 정밀도, 회수율 

각 항목별로 측정된 정확도와 정밀도 값을 바탕으로 하여 각 시험방법의 특성 및 과제 수행에서 요구되는 수준을 고려하여 설정하도록 한다.

4.1.5  실험실 관리시료(Laboratory control sample, LCS)

실험실 관리시료에 대한 목표값은 시료의 분석 중간에 측정된 시험실 관리시료에 대한 유효성을 검증하기 위하여 설정한다. 시험실 관리시료의 목표값은 한 개의 시료군에 대하여 동일한 조건으로 측정되었음이 인정되는 수준으로 설정해야 하며, 어떠한 경우에도 각 항목별로 설정된 정밀도 목표값을 초과하여서는 안 된다.

표 2. 정도관리 목표값 예시

┌─────────┬─────────────────────┐

│정도관리 항목     │정도관리 목표 (예시)                      │

├─────────┼─────────────────────┤

│바탕시료          │해당 항목의 방법검출한계 미만이어야 한다. │

│운반바탕시료      │각 항목별로 검출한계 이하로 존재해야 한다.│

│방법검출한계      │해당 항목 참조                            │

│정량한계          │해당 항목 참조                            │

│저농도 정밀도     │25 % 이내이어야 한다.                     │

│고농도 정밀도     │10 % 이내이어야 한다.                     │

│정확도            │80 ∼ 120 % 사이에 들어야 한다.           │

│현장중복시료      │상대편차가 ± 25 % 이내이어야 한다.       │

│시험실관리시료    │상대편차가 ± 25 % 이내이어야 한다.       │

│검정곡선의 직선성 │직선성 결정계수가 0.99 이상이어야 한다.   │

│회수율            │80 ∼ 120 % 사이에 들어야 한다.           │

└─────────┴─────────────────────┘

4.2  시료채취 과정에서의 정도관리

시료채취는 분석하고자 하는 대상의 조성 및 양을 대표할 수 있는 시료를 채취하여 그 성분의 변화없이 실험실에 인계하는 일련의 과정이며, 그 과정에 있어서 정도관리의 목적은 시료의 채취부터 운송 과정상에 일어날 수 있는 성분 및 조성의 변화, 시료의 오염 등 분석에 영향을 미칠 수 있는 요소들을 파악하고 그 발생 가능성을 최소화하여 분석 결과의 신뢰성을 확보하는 데 있다. 주요 정도관리 사항으로는 시료 채취에 관한 기록의 작성 및 유지, 적절한 시료채취 용기의 사용, 시료채취 및 운송과정에서의 오염 방지 등이 있다.

4.2.1  시료채취에 관한 기록의 작성 및 유지

시료채취에 관한 기록은 시료의 수집, 운반, 저장, 분석, 폐기 등 일련의 처리 과정에서 시료에 대한 추적성을 유지할 수 있어야 하며, 시료채취 위치, 현장상황, 채취 시기, 시료의 형태, 시료용기의 개수 및 부피 등 분석에 필요한 것들이 포함되어야 한다.

4.2.2  시료채취 과정의 정도관리 기준

시료채취시 정도관리의 기준은 각 항목별로 명시된 정도관리 목표값을 만족해야 하며, 완성도 검사 결과에서 목표치를 만족하지 못할 경우에는 시료채취 방법 및 시료채취 용기 등을 검토해야 한다.

4.2.3  분석자의 기술능력 입증

각 항목별로 분석자가 분석 결과를 생산하기 전에 분석 능력은 반드시 검증되어야 하며, 과제 책임자 또는 정도관리 책임자에 의해 확인되어야 한다. 분석자의 능력 검증은 해당 시험 항목에 대한 비교숙련도 참여 결과, 인증표준물질(CRM) 분석 결과 또는 동일 시료의 반복측정 결과 등을 이용하여 평가할 수 있다.

4.3  시약 및 시험기구에 관한 정도관리

항목별로 분석시 사용되는 시약 및 시험 기구들의 사용 규격 및 등급을 규정하여 방해물질에 의한 간섭 최소화 및 오염을 방지하고 정확한 부피 측정을 통한 분석 결과의 정밀도와 정확도를 확보해야 한다. 대상으로는 초순수(Purified water), 표준물질(Reference material), 산(Acid), 용매(Solvent), 부피측정기구, 저울 등이 포함된다.

4.3.1  초순수(Purified water)

초순수에 대한 사용 규격은 각 시험 항목별로 분석을 방해하는 방해물질이 없고, 분석 대상물이 검출한계 이하로 존재하는 것을 사용하도록 하며, 분석 방법에 초순수의 규격을 확인하는 절차를 추가해야 한다.

4.3.2  표준물질(Reference material)

인증표준물질(CRM) 또는 표준물질(RM)을 구입하여 사용하는 것이 권장된다. 표준물질의 구입시에는 표준물질의 제조농도에 대한 불확도 또는 제조 농도 범위가 명시되어 있는 제품을 사용하고 유효기간에 맞게 사용해야 한다. 표준물질을 제조하여 사용하는 경우는 사용 시약의 순도에 대한 불확도 또는 허용오차가 명시되어 있는 제품을 사용해야 한다.

4.3.3  시약(Reagent)

항목별 절차서에 따로 명시되지 않은 시약은 분석용 시약 등급 이상(GR등급)의 시약을 사용하며, 시약의 순도 및 불순물의 함량을 확인할 수 있는 것을 사용한다. 시약 및 표준물질은 분석 항목별로 분석을 방해하는 요소들이 없는 것을 사용해야 한다.

4.4  검출한계, 정량한계, 정밀도, 정확도 측정

각 항목별로 검출한계, 정량한계, 정밀도, 정확도를 측정하여 사용 중인 시험방법, 분석 장비 등이 요구되는 정도관리 목표값을 만족하고 있는지를 판단해야 하며, 목표값에 미달된 항목에 대하여는 시험방법 개선, 장비 보완 등의 개선방안을 마련해야 한다.

4.4.1  검출한계 측정

검출한계 측정을 위해서 각 항목별로 표준물질을 희석하여 검출한계 측정용 시료를 조제한다. 이때 제조하는 시료의 농도는 예상되는 검출한계의 5배 이내의 농도여야 한다. 만약 측정된 검출한계가 제조농도의 5배 이하라면 시료를 희석하여 다시 측정한다.

4.4.1.1  방법검출한계(Method detection limit, MDL)

7개의 서로 다른 시료로부터 얻어진 분석 결과로부터 표준편차를 구하여 다음 식에 따라 방법검출한계를 구한다.

     (식 2)

여기서, 

4.4.1.2  기기검출한계(Instrument detection limit, IDL)

1개의 시료로부터 반복 측정하여 얻어진 분석 결과로부터 표준편차를 구하여 다음 식에 따라 방법검출한계를 구한다.

             (식 3)

4.4.2  정량한계 측정

정량한계(Minimum quantitation limit, MQL)는 7회 반복 측정 결과의 표준편차에 10을 곱하여 구한다.

                    (식 4)

4.4.3  정밀도 측정

반복 측정한 결과의 상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)로 계산한다. 만약 여러 번 반복 측정하기 어려운 경우라면 동일한 시료를 2회 반복 분석하여 상대오차 백분율(Relative percent difference, RPD)로 평가한다. 저농도와 고농도 시료에 대해 각각 정밀도를 구한다.

                (식 5)

     (식 6)

4.4.4  정확도 측정

농도의 특성값이 알려진 인증표준물질(CRM)을 분석하거나 표준물질(RM)을 희석하여(저농도, 고농도) 반복 분석한 결과와 제조 농도 또는 인증값과의 일치도를 비교한다. 표준물질을 사용하여 희석하는 경우, 사용하는 표준물질은 반드시 검정곡선 제조에 사용된 표준물질과 다른 제조회사의 것을 사용한다.

                  (식 7)

초순수가 아닌 실시료에 표준물질을 첨가한 경우는 다음 식에 따라 정확도를 구한다.

             (식 8)

4.5  측정 분석시의 정도관리

4.5.1  바탕시료의 분석

사용 시약, 시료의 운반 과정, 실험실 주변 환경 등에 의한 오염을 확인하기 위하여 측정하며, 용도에 따라 방법바탕시료(method blank sample), 시약바탕시료(reagent blank sample), 운반바탕시료(trip blank sample), 기기바탕시료(instrument blank sample) 등으로 구분한다. 바탕 시료의 측정은 일반적으로 1개의 시료군

 시료군: 동일한 시간대(4시간 이내)에 동일한 분석자에 의해 동일한 시약, 절차 및 동일한 시험기기를 사용하여 분석되는 시료들의 집합으로 일반적으로 10 ∼ 20개 이내의 시료수를 가진다.

에 대하여 1개 이상을 분석하며, 분석 결과는 각 항목별 정도관리 목표값을 만족해야 한다. 만족하지 못할 경우, 각 단계별 오염 요인 파악 후 개선 방안을 마련해야 한다.

4.5.2  검정곡선의 직선성 평가

직선성은 표준용액의 농도변화에 따른 측정세기 변화의 일치도를 나타내 주는 요소이다. 직선성의 평가는 3 ∼ 5개의 표준용액 측정 결과로부터 얻어진 검정곡선 관계식의 직선성 결정계수(r2)로서 하게 되며, 이상적인 경우, 결정계수는 1을 나타내게 된다. 검정곡선의 직선성은 분석결과의 정확도와 정밀도를 평가하는 중요한 요소이며, 일반적으로 습식분석의 경우, 0.98, 기기분석일 경우, 0.99 이상의 직선성이 요구된다. 직선성의 평가는 매 검정곡선 작성시마다 실시하며, 평가 결과가 정도관리 목표값을 충족해야 한다.

4.5.3  정량범위(Quantitation Range) 측정

정량범위는 각 항목별 분석방법에서 측정 결과의 신뢰성을 보장할 수 있는 농도의 범위이다. 정량범위는 일반적으로 정량한계 ∼ 최대 직선성 유지 구간으로 정의되며, 시료 분석 결과가 정량범위를 초과하거나 정량하한 및 정량상한의 ± 25 % 이내일 경우, 시험 결과의 신뢰도가 저하되므로 시료를 희석 또는 농축하여 다시 측정해야 한다.

4.5.4  표준물질의 유효성 검증

이 과정은 검정곡선의 작성에 사용된 표준물질이 인증값에서 제시하는 규격을 만족하는지를 확인하기 위하여 실시한다. 비록 잘 알려지고 유효성이 입증된 제조회사의 표준물질이라 하더라도 제조 및 유통 과정에서의 예기치 못한 실수, 취급 및 관리의 부주의, 유효기간의 초과 등의 원인으로 표준물질의 유효성을 보장하지 못할 경우가 발생한다. 따라서, 검정곡선 작성 시에는 작성에 사용된 표준물질의 유효성을 확인하여 분석 결과의 신뢰성을 확보해야 한다. 유효성의 확보는 인증표준물질(CRM)을 사용하거나 검정곡선의 작성에 사용된 표준물질과 다른 제조회사(잘 알려지고 충분히 검증된)의 표준물질을 일정한 농도로 희석하여 측정함으로써 알 수 있다.

4.5.5  실험실 관리시료(Laboratory control sample) 분석

시험진행 도중의 시험실의 환경 변화, 시약의 반응 및 변질, 분석기기의 상태 변화에 따른 안정도의 변화 등 여러 가지 요인들에 의해 측정의 세기들이 변하고 이로 인해 작성된 검정곡선이 더 이상 유효하지 않게 될 수 있다. 이러한 상태 변화의 가능성은 분석해야 할 시료의 수가 많아지거나 분석 시간이 길어질수록 커지므로 시료 분석의 중간중간 또는 분석의 마지막에 실험실 관리시료를 분석하여 분석이 진행되는 도중에 측정 세기의 변화가 없음을 증명해야 한다.

4.5.6  관리차트(Control chart)의 작성

관리차트는 시험기기, 시험조건 및 시험실 환경 등이 장기적으로 어떻게 변화되고 있는지를 측정하기 위하여 사용한다. 관리차트는 시험실에서 실시되는 분석이 항상 동일한 조건에서 실시되고 있음을 입증하는 자료이며, 분석 기기의 성능 저하되었는지, 표준물질의 안정성 등을 확인할 수 있는 수단이 될 수도 있다. 분석자들은 이러한 관리차트를 활용, 시험기기의 점검, 교정주기 및 소모품 등의 교체 주기를 설정할 수 있다. 분석절차는 다음과 같다.

4.5.6.1  매 시험시마다 측정된 동일한 농도의 시험실 관리 시료(LCS)의 측정 결과를 20개 이상 수집하여 각 측정 세기들의 평균과 표준편차를 구한다.

                (식 9)

4.5.6.2  상기의 결과를 사용하여 관리차트에 사용할 경고 수준(warning level, WL)과 관리 수준(control level, CL)을 다음 식에 따라 구하고, 각 시료들의 측정 세기를 사용하여 그림 1과 같이 관리차트를 작성한다.

WL = ± 2 × s (표준편차)                      (식 10)

CL =  ± 3 × s (표준편차)                      (식 11)

그림 1. 관리 차트 작성의 예

4.5.6.3  매번 시험할 때마다 측정된 관리시료의 측정 결과를 그림 1의 관리차트에 추가하여 측정 세기의 분포 상태를 파악한다. 만약 경고 수준을 초과한 경우에는 시험 기기나 시험조건 등의 상태 변화 발생했는지를 점검해야 하며 관리 수준을 초과한 경우는 즉각적으로 원인을 규명하여 오류를 수정 후 재시험을 실시한다.

5. 정도관리 기록의 유지 및 결과보고

5.1  정도관리 결과의 기록

각 분석자는 매회 시험을 실시할 때마다 또는 필요 시 마다 수행한 정도관리 사항들에 대한 기록을 작성해야 하며, 필요시 제출할 수 있도록 준비한다. 또한 정도관리 책임자는 수행한 정도관리의 결과가 각 항목별로 정도관리 절차서에 규정하고 있는 사항들을 만족시키는 지를 수시로 점검해야 하며, 시험 결과의 신뢰성을 향상시키기 위한 자료로 활용해야 한다.

5.2  정도관리 결과보고

모든 정도관리 및 시험 결과에는 그 값이 산출되는데 사용한 원시자료(Raw data)들이 첨부되어 분석결과 보고 시, 함께 제출할 수 있도록 한다.

제4장 항목별 시험방법

제1항 염분(Salinity)

1. 측정원리

해수에는 주요 이온들이 존재하며 이들 대부분은 강전해질이기 때문에 전기전도도가 증가한다. 염분을 측정하는 방법과 기기는 실험실에서 질산은 적정법 또는 현장에서 염분, 수온 그리고 수심을 동시에 간편하게 측정할 수 있는 장비로서 CTD 등 여러 가지 장비가 있으나 본 규정에서는 해양환경조사에서 현실적으로 가장 많이 쓰이는 기기로 전기전도도 원리를 이용한 염분측정기(Salinometer)를 사용한다. 전기전도도는 용액이 전류를 운반할 수 있는 정도를 말한다. 측정원리는 용액에 담겨있는 2개의 전극에 일정한 전압을 가해주면 전류가 흐르게 되며, 이때 흐르는 전류의 크기는 용액의 전도도에 의존한다는 사실을 이용한다. 검정용 시료로는 국제해양물리과학협회(IAPSO)가 인증한 표준해수를 사용한다.

2. 기구 및 기기

전기전도도 원리를 이용한 다음의 염분측정기 중 하나를 선택하여 사용한다.

2.1  염분측정기(Salinometer): 실험실용 또는 현장 측정용

2.2  T-S bridge: 현장에서 염분과 수온을 동시에 측정한다.

2.3  CTD: 현장에서 염분과 수온 그리고 수심을 동시에 측정한다.

3. 시약 및 표준물질

표준해수: IAPSO 인증 검정용 표준해수

4. 시료의 채취 및 보관

현장에서 T-S bridge 또는 CTD를 사용하는 경우에 염분측정기(Salinometer)에 의한 간접적인 염분 보정 목적에 해당한다. 실험실에서 염분측정기(Salinometer)를 사용하는 경우, 해수시료를 채수기로 채취하여 시료를 시료병에 넣기 전에 동일 해수로 5회 이상 충분히 세척한 후 125 ∼ 250 mL 경질 유리 용기에 보관한다. 시료병은 플라스틱 마개로 단단히 봉하여 15 ∼ 20 °C가 유지되는 상태로 약 10일간 보관할 수 있다.

5. 시험방법

기기 제작 회사의 작동 요령에 따라 측정한다.

6. 정도평가/정도관리(QA/QC)

6.1  염분 검정은 항온 측정에 의해 정확도와 정밀도가 높은 실험실용 전기전도도 염분측정계인 염분측정기(Salinometer)와 IAPSO 인증 검정용 표준해수를 이용하여 실시한다.

6.2  시료를 염분측정기(Salinometer) 기기조작 요령에 따라 측정한다. 시료 측정 시 온도는 기기 내부에서 일정하게 유지된다. 기기의 검정은 IAPSO 인증 검정용 표준해수를 이용한다. 검정 시료를 측정하기 전에 반드시 두 개의 표준해수를 측정한 염분값이 ± 0.003 이내에서 일치되는 것을 확인한 후 시료를 측정한다.

6.3  시료 측정이 모두 완료되고 난 후 다시 두 개의 표준해수를 측정한 염분값이 ± 0.003 이내에서 일치되는 것을 확인한다.

6.4  측정된 전기전도도 비(RT)를 다음의 계산식에 따라 시료의 염분(S)을 계산한다. 검정이 완료된 후 정밀하게 측정된 시료를 준 표준시료로 하여 현장에서 사용하는 CTD 또는 T-S bridge의 염분 보정에 이용할 수 있다.

┌─────────────┐

│                          │

│     (식 1)               │

│                          │

│  a0= 0.0080  b0=0.0005   │

│                          │

│  a1=-0.1692  b1=-0.0056  │

│                          │

│  a2=25.3851  b2=-0.0066  │

│                          │

│  a3=14.0941  b3=-0.0375  │

│                          │

│  a4=-7.0261  b4=0.0636   │

│                          │

│  a5=0.0162   b5=-0.0144  │

│                          │

│  k=0.0162                │

│                          │

│                          │

│RT = 시료의 전기전도도비  │

│T = 염분측정계의 항온(°C)│

└─────────────┘

7. 참고사항

기기에 따라 다르지만 일반적으로 CTD의 전기전도도 센서의 감응 시간은 강하속도 2 m/s에서 0.2초 이내이다. 따라서 CTD를 이용하여 해수의 수직염분분포를 측정할 때에는 기기 제작사의 전기전도도 센서의 감응 시간을 고려하여 CTD 강하(down casting)와 상승(up casting) 속도를 조절해야 한다.

제2항 수온(Water  Temperature)

1. 측정원리

해양조사에서 수온의 측정은 일반적으로 목측식인 봉상 수은 온도계 또는 전도 온도계와 온도변화에 대하여 전기적인 저항 또는 전류가 달라지는 금속의 특성을 이용한 서미스터(Thermistor)와 서모커플(Thermocouple) 등의 전자 온도 센서를 이용한다. 전자 온도 센서 원리를 이용하여 수온을 측정하는 대표적인 기기는 T-S bridge 또는 CTD 등으로 수온 이외에 전기전도도(염분) 등을 동시에 측정할 수 있다.

2. 기구 및 기기

다음의 수온 측정계 중 하나를 선택하여 측정한다.

2.1  KSB 5316 유리제 수은 봉상 온도계 또는 전도 온도계

2.2  T-S bridge: 현장에서 수온과 염분을 동시에 측정한다.

2.3  CTD: 현장에서 수온과 염분 그리고 수심을 동시에 측정한다.

3. 시험방법

3.1  유리제 수은 봉상 온도계 또는 전도 온도계를 이용할 경우, 온도계를 측정하고자 하는 수중에 직접 담근 후 온도가 일정하게 유지되도록 시간이 경과한 다음 온도계의 눈금을 눈높이에서 직접 읽는다.

3.2  전자 온도 센서를 이용한 기기는 기기 제작회사의 작동 요령에 따른다.

4. 정도평가/정도관리(QA/QC)

전자 온도 센서에 의한 측정 방식은 센서의 성능이 저하되거나 또는 전자기기에 이상이 있으면 편차가 일어날 수 있기 때문에 직접측정방식의 표준온도계에 의해 점검과 보정이 반드시 이루어져야 한다. 이러한 보정용 표준온도계로서 KSB 5316 유리제 수은 봉상 온도계 또는 전도 온도계를 이용한다. 전자 온도 센서류의 온도 보정은 5 ～ 25 °C 범위의 온도 조절과 항온 유지가 가능한 수조에서 1분 이상 담근 후에 표준온도계와 함께 수온을 측정하여 실시한다.

5. 참고사항

기기에 따라 다르지만 일반적으로 전자 온도 센서의 감응 시간은 강하속도 1 m/s에서 0.1초 이내이다. 따라서, CTD를 이용하여 해수의 수직 온도 분포를 측정할 때에는 기기제작사의 온도센서의 감응시간을 고려하여 CTD 강하(down casting)와 상승(up casting) 속도를 조절해야 한다.

제3항 수소이온농도(Hydrogen  Ion  Concentration,  pH)

1. 측정원리

pH는 수소이온농도를 그 역수의 상용대수로 나타낸 값이다. pH는 보통 유리전극과 비교전극으로 된 pH 미터를 사용하여 측정하는데 양전극 간에 생성되는 기전력의 차를 이용하여 다음 식에 따라 얻은 값이다.

┌─────────────────────────────┐

│?pHX = pHS + F × (EX-ES) / (2.303RT)                    │

│?pHX : 시료의 pH 측정값                                  │

│?pHS : 표준용액의 pH                                     │

│?EX : 시료에서의 유리전극과 비교전극간의 전위차 (mV)     │

│?ES : 표준용액에서의 유리전극과 비교전극간의 전위차 (mV) │

│?F  : 패러데이 상수 (9.649×104 coulomb/mol)             │

│?R  : 기체상수 (8.314 joule/K mol)                       │

│?T  : 절대온도 (K)                                       │

└─────────────────────────────┘

2. 기구 및 기기

2.1  pH 미터: 보통 유리전극 및 비교전극으로 된 검출부와 검출된 pH를 지시하는 지시부로 구성되어 있다. 대부분의 pH 미터는 비대칭 전위조정(영점조정) 및 온도보상을 조절할 수 있는 기능이 있다. 온도보상용 감온부가 있는 pH 미터는 감온부에 의해 온도보상이 자동으로 조절된다.

3. 시약 및 표준물질

3.1  pH 표준액 조제에 사용하는 초순수: 15분 이상 끓여서 이산화탄소를 탈기시키고 산화칼슘 흡수관을 설치하여 상온으로 식힌 다음 사용한다. 조제한 pH 표준액은 경질 유리병 또는 폴리에틸렌병에 보관하며, 보통 산성 표준액은 3개월, 염기성 표준액은 산화칼슘 흡수관을 부착하여 1개월 정도 사용할 수 있다.

3.2  수산염 표준액(0.05 M): pH 측정용 테트라수산칼륨[KH3(C2O4)2ㆍ2H2O]을 가루로 하여 데시케이터에서 건조한 다음 12.71 g을 정확하게 달아 증류수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다.

3.2  탈산염 표준액(0.05 M): pH 측정용 프탈산수소칼륨[C6H4(COOK)(COOH)]을 가루로 하여 110 °C에서 항량이 될 때까지 건조한 후 데시케이터에서 방냉한 다음 10.21 g을 정확하게 달아 증류수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다.

3.3  산염 표준액(0.025 M): pH 측정용 인산이수소칼륨(KH2PO4) 및 무수인산일수소나트륨(Na2HPO4)을 가루로 하여 110 °C에서 항량이 될 때까지 건조한 후 데시케이터에서 방냉한 다음 인산이수소칼륨 3.40 g 및 무수인산일수소나트륨 3.55 g을 정확하게 달아 증류수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다.

3.4  산염 표준액(0.01 M): pH 측정용 붕산나트륨(Na2B4O7ㆍ10H2O)을 초순수로 적신 브롬화나트륨(NaBr)이 들어있는 데시케이터에서 항량으로 건조한 다음 3.81 g을 정확하게 달아 증류수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다.

3.5  산염 표준액(0.025 M): 데시케이터에서 항량이 될 때까지 건조한 pH 측정용 탄산수소나트륨(NaHCO3) 2.10 g과 500 ～ 650 °C에서 항량이 될 때까지 건조한 무수탄산나트륨(Na2CO3) 2.65 g을 정확하게 달아 증류수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다.

3.6  수산화칼슘 표준액(0.02 M, 25 °C 포화용액): pH 측정용 수산화칼슘[Ca(OH)2] 5 g을 플라스크에 넣고 증류수 1,000 mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 그 다음 23 ～ 27 °C에서 충분히 포화시켜 상층액을 여과한 후 투명한 여과액을 쓴다.

4. 시료의 채취 및 보관

해수의 pH 측정용 시료병은 시료의 일부로 2 ∼ 3회 충분히 세척한다. 특히, 시료를 시료병에 받을 때 기포가 발생하지 않도록 채수기에 0.2 m 정도의 고무관을 연결하고 시료병 바닥에 정치하여 바닥에서부터 천천히 시료를 받아 시료가 충분히 넘치도록 한다. 시료가 담긴 시료병은 기포가 포함되지 않도록 유리 마개를 닫은 후 측정시까지 시료 온도와 같거나 보다 다소 낮은 온도에서 보관한다. 해수의 pH 측정용 시료는 장시간 보관하여서는 안되며 1시간 이내에 측정되어야 한다.

5. 시험방법

5.1  pH 미터 검출부를 초순수로 잘 씻은 다음 5회 되풀이하여 pH 값을 측정하고 그 재현성이 ± 0.05 이내의 것을 pH 값으로 한다.

5.2  유리전극은 미리 해수에 수시간 이상 담가두며 pH 미터는 전원을 넣어 5분 이상 경과 후에 실험실용 무형광 휴지나 천으로 가볍게 닦아낸다.

5.3  온도보상 조절 기능이 있는 pH 미터는 pH 표준액의 온도와 같게 조절하고 검출부를 시료의 pH 값에 가까운 표준액에 담가 2분 이상이 지난 후 pH 미터의 지시가 온도에 있어서의 pH 표준액의 pH 값이 되도록 영점 조절을 한다. 두 점에서 영점조절을 할 경우에는 보통 인산염 pH 표준액과 시료의 pH 값에 가까운 pH 표준액을 써서 앞의 조작에 따라 조작한다.

5.4  다음에 전극을 실험실용 무형광 휴지나 천으로 가볍게 닦아낸 다음 시료에 담가 측정값을 읽는다.

6. 정도평가/정도관리(QA/QC)

6.1  pH 미터의 보정은 측정 당일 시료 측정 전에 행하여져야 한다.

6.2  위 3의 표준시약을 이용하여 2 ∼ 3점에서 기기 제작회사의 작동 요령에 따라 pH 미터의 검량선을 보정한다.

6.3  pH 표준액의 온도보정: pH 표준액에 대한 각 온도에서의 pH 값은 아래와 같다. 이 표에 없는 온도의 pH 값은 표의 값에서 내삽법으로 구한다.

표 1. pH 표준액의 온도보정

┌───┬───┬────┬───┬───┬───┬─────┐

│온도  │수산염│프탈산염│인산염│붕산염│탄산염│수산화칼슘│

│      │표준액│표준액  │표준액│표준액│표준액│표준액    │

├───┼───┼────┼───┼───┼───┼─────┤

│0°C  │1.67  │4.01    │6.98  │9.46  │10.32 │13.43     │

│5°C  │1.67  │4.01    │6.95  │9.39  │10.25 │13.21     │

│10°C │1.67  │4.00    │6.92  │9.33  │10.18 │13.00     │

│15°C │1.67  │4.00    │6.90  │9.27  │10.12 │12.81     │

│20°C │1.68  │4.00    │6.88  │9.22  │10.07 │12.63     │

│25°C │1.68  │4.01    │6.86  │9.18  │10.02 │12.45     │

│30°C │1.69  │4.01    │6.85  │9.14  │9.97  │12.30     │

│35°C │1.69  │4.02    │6.84  │9.10  │9.93  │12.14     │

│40°C │1.70  │4.03    │6.84  │9.07  │-     │11.99     │

│50°C │1.71  │4.06    │6.83  │9.01  │-     │11.70     │

│60°C │1.73  │4.10    │6.84  │8.96  │-     │11.45     │

└───┴───┴────┴───┴───┴───┴─────┘

7. 참고사항

7.1  pH 미터의 구조 및 조작법은 pH 미터에 따라 다르다. pH 11 이상의 시료는 측정시 오차가 커지므로 강염기 용액에서 오차가 적은 특수 전극을 사용하여 필요한 보정을 실시한 후 측정한다. 시료의 온도는 pH 표준액의 온도와 동일하게 하는 것이 좋다.

7.2  표준액은 현재 상용으로 제조되어 시판되고 있는 pH 완충용액(pH 4.0, 7.0, 10.0)으로 3회 이상 반복 보정하여 전극을 안정화시킨 후 사용한다.

제4항 투명도(Transparency)

1. 측정원리

추가 달린 지름 약 0.3 m의 백색 원판을 해수 표층에서 수직으로 하강시켜 원판이 보이지 않는 수심까지 내려보낸 다음 천천히 끌어올리면서 보이기 시작한 수심을 0.1 m 단위로 측정한다.

2. 기구 및 기기

투명도판(Secchi disk): 지름 약 0.3 m의 백색 원판에 약 3 kg의 추를 원판 하부에 부착한다.

3. 시험방법

날씨가 맑고 수면이 온화할 때 직사광을 피하여 선박의 그늘진 곳에서 투명도판을 조용히, 수중에서 보이지 않는 깊이까지 내린 다음 천천히 끌어올리면서 보이기 시작한 수심을 2회 반복해서 측정하고 0.1 m 단위로 그 평균값을 구하여 이를 투명도로 나타낸다.

4. 참고사항

4.1  투명도는 반드시 조사 선박이 완전히 정선하였을 때 측정해야 한다. 만일 측정 시 해류의 유속이 강하여 줄이 기울어질 경우에는 3 kg 정도의 추를 추가로 달아서 경사도를 낮춘 후 투명도 수심을 측정하도록 한다. 부득이 경사가 심한 경우에는 각도를 대략 측정해 투명도 수심을 보정해야 한다.

4.2  투명도는 일기, 시각, 개인차 등에 의해 약간의 차이가 생기므로 측정조건을 기록해 두는 것이 좋다.

4.3  비가 오거나 파도가 심할 때는 정확한 투명도를 얻을 수 없으므로 투명도를 측정하지 않는 것이 좋다.

4.4  현장 조사 시 투명도가 높아 투명도판이 해수면 바닥에 닿을 때는 현장 수심에 밑줄을 쳐서 표시한다(예 14.5 m).

제5항 부유입자물질( Suspended  Particulate  Matter,  SPM)

1. 측정원리

잘 혼합된 일정량의 해수시료를 미리 무게를 재어 둔 유리섬유여과지(GF/F filter paper, 공경 0.7 μm)에 여과한 후 105 ∼ 110 °C에서 항량으로 건조하여 여과지의 무게를 달아 증가한 무게를 부유물질의 양으로 한다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 건조 후 잔류하는 부유입자물질의 양이 5 ∼ 200 mg이며, 정밀도는 표준편차로 100 mg/L에서 약 ± 5 mg/L이다.

3. 기구 및 기기

3.1  여과기

3.2  유리섬유여과지(GF/F): 직경 47 mm

3.3  진공펌프

3.4  데시케이터

3.5  건조기: 105 ∼ 110 °C까지 가열이 가능해야 한다.

3.6  전자저울: 0.1 mg까지 측정이 가능해야 한다.

3.7  1,000 mL 메스실린더

3.8  핀셋

3.9  캡슐(capsule) 또는 배양접시(petridish)

4. 시약 및 표준물질

4.1  초순수: 시약 제조용 초순수를 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 채취된 해수시료로 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기를 3회 헹구어 준다. 

5.2  시료의 양은 건조 후의 부유입자물질의 무게가 10 mg 이상 되도록 채취한다(혼탁한 해수일 경우, 300 mL 정도가 적당하며, 매우 맑은 해수일 경우는 2,000 mL 정도가 최소한 필요함).

5.3  여과지 위에 잔류하는 부유입자물질의 양에 따라 포집률이 변화하므로 재현성 좋은 결과를 얻기 위해서는 건조 후 부유물질의 양이 20 ∼ 40 mg이 되도록 시료량을 결정하는 것이 좋다.

5.4  시료에 2 mm 이상의 고형물이 포함되어 있을 경우, 2 mm 망목의 체로 시료를 걸러낸 후 여과한다.

5.5  부유입자물질은 시료 용기의 내벽 또는 바닥 부분에 부착하기 쉬우므로 시료를 충분히 혼합하여 분산시킨 후 일정량을 채취하여 전량을 여과한다.

5.6  현장에서 채수기에 의해 채취된 시료는 미생물에 의한 입자의 분해를 방지하기 위해 냉장 상태에서 보관한다.

5.7  채수 후 가능한 빠른 시간(12시간 미만)에 여과를 마쳐야 한다.

6. 정도평가/정도관리(QA/QC)

현장 중복시료는 동일한 시료채취 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료를 의미하여 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 추가로 채취한다. 그리고, 그 이상의 시료를 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 20 % 이하이어야 한다.

┌───────────────────────────┐

│              B(%) =  × 100            (식 1)        │

│                                                      │

│    여기서    B : 편차 (Bias)                         │

│              S1, S2 : 중복시료 각각의 분석결과 (농도)│

└───────────────────────────┘

7. 시험방법

7.1  여과지를 진공으로 흡인되는 여과기에서 초순수 약 20 mL로 3회 정도 반복 통과시켜 여과지에 있는 염분을 완전히 제거한다.

7.2  건조기를 이용하여 105 ～ 110 °C에서 2시간 이상 건조시킨 후 데시케이터에 넣어 방냉한 다음 전자저울로 여과지의 무게(mg)를 측정한다.

7.3  캡슐 혹은 배양접시에 일련번호를 기록하고, 무게를 측정한 여과지를 넣은 다음 여과지 무게를 기록한 후 밀봉하여 현장으로 가져간다.

7.4  일련번호 및 건조한 여과지 무게를 기록하고 정점과 여과한 시료 부피를 기록할 수 있는 표가 작성되어 있는 야장을 현장에서 사용한다.

7.5  미리 무게가 측정된 여과지(7.3항)를 진공흡입 여과기에 장착하고, 일정 부피의 잘 혼합된 해수시료를 여과기로 여과한다.

7.6  시료가 완전히 통과한 후 여과지의 염분을 제거하기 위하여 약 10 mL의 초순수로 3회 반복하여 여과기와 여과지를 세척한다.

7.7  시료를 여과할 때는 여과지의 물기가 거의 제거되도록 추가로 1 ∼ 2분간 흡인하면서 여과한 다음, 처음 여과지의 무게가 기록된 캡슐 또는 배양접시에 넣어서 냉동 보관한 후 실험실로 옮긴다.

7.8  실험실에서 건조기를 이용 105 ∼ 110 °C에서 1시간 이상 시료 여과지를 건조시킨 후 데시케이터에 넣어 방냉한 다음 전자저울로 무게(mg)를 측정한다(단, 배양접시에 여과지를 보관하여 함께 건조할 경우, 고온에서 건조하면 배양접시가 변형되므로 약 60 °C에서 24시간 건조할 것을 권장한다).

7.9  전자저울은 처음에 빈 여과지의 무게를 측정할 때 사용한 것을 이용한다.

8. 결과

8.1  시료를 포함한 여과지의 무게를 야장에 기록하고, 부유입자물질의 양은 아래의 식으로 계산한다.

┌────────────────────────┐

│         부유입자물질의 양(mg/L) =        (식 2)│

│           A : 시료여과 후 여과지의 무게 (mg)   │

│           B : 시료여과 전 여과지의 무게 (mg)   │

│           V : 여과한 시료의 부피 (L)           │

└────────────────────────┘

8.2  결과는 농도계산에 사용된 자료로 제시한다.

9. 분석절차 흐름도

┌────────────┐                                              

│여과지를 여과기에 고정  │                                              

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│증류수 여과             │ 증류수로 여과지, 여과기 벽면 세척ㆍ여과      

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│여과지 건조             │ 건조기로 105 ∼ 110 °C에서 2시간 이상 건조  

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│방냉                    │ 데시케이터에서 방냉                          

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│무게 측정               │ 전자저울(0.1 mg까지 측정 가능) 이용          

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│무게를 측정한 여과지를  │                                              

│여과기에 고정           │                                              

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│시료 여과               │ 시료를 잘 혼합하여 적당량의 시료 여과        

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│증류수 여과             │ 증류수를 추가로 여과하여 잔류 염분 제거      

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│여과지 건조             │ 건조기로 105 ∼ 110 °C에서 2시간 이상 건조  

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│방냉                    │ 데시케이터에서 방냉                          

└────────────┘                                              

┌────────────┐                                              

│무게 측정               │ 전자저울(0.1 mg까지 측정 가능) 이용          

└────────────┘                                              

그림 2. 부유입자물질 분석절차

제6항 용존산소( Dissolved  Oxygen,  DO)

1. 윙클러-아지드화나트륨 변법

1.1  측정원리

화학적 적정법은 Winkler(1888)가 처음 제안한 방법을 Strickland와 Parsons(1968)가 수정한 것이다. 측정원리는 해수에 녹아 있는 산소로 하여금 아이오다이드 이온(I-)을 트리아이오다이드(I3-)로 정량적으로 산화시키도록 만들어 놓고 발생된 트리아이오다이드(I3-) 양을 티오황산염 표준용액으로 정량화시키는 것이다. 적정 종말점은 녹말을 지시약으로 넣고 티오황산염(S2O32-) 표준용액을 첨가하면서 푸른색이 무색으로 변하는 시점으로 한다.

시약 첨가에 따른 반응은 다음과 같다. 망간이온(Mn2+)은 강한 알칼리 용액 안에서 Mn(II)(OH)2를 형성하며(식 1), 이때 시료 속에 용존 산소가 존재할 경우, 갈색을 띠는 Mn(OH)2로 침전한다(식 2). 그 후 황산을 넣어 강한 산성 용액으로 만들어 주면 침전이 녹아서 망간이온(Mn3+)을 물로 내놓게 된다. 이 3가의 망간이온(Mn3+)은 미리 넣어둔 요오드이온(I-)을 아이오딘(I2)으로 산화시킨다(식 3). 아이오딘은 물에 과잉으로 존재하는 요오드이온(I-)와 결합하여 트리아이오다이드 착물(I3-)을 이룬다(식 4). 이 착물을 티오황산염과 반응시켜주면 트리아이오다이드 착물(I3-)은 요오드이온(I-)로 환원되고(식 5), 이러한 환원이 완벽하게 일어나기 전까지 트리아이오다이드 착물(I3-)은 녹말 지시약과 반응하여 짙은 푸른색을 띠게 된다(식 6). 이러한 트리아이오다이드 착물(I3-)의 환원 반응이 종결되어 더이상 트리아이오다이드 착물(I3-)이 존재하지 않게 되면 녹말지시약은 발색하지 않게 된다.

최종적으로 물속에 존재하는 O2 1몰은 티오황산염(S2O32-) 4몰과 반응하므로 이 상대적 비를 이용하여 산소농도를 계산한다.

┌──────────────────────┐

│                          (식 1)            │

│                  (식 2)                    │

│            (식 3)                          │

│                                      (식 4)│

│                          (식 5)            │

│                                 (식 6)     │

└──────────────────────┘

1.2  측정범위 및 정밀도

정량범위는 0.05 mg O2/L 이상이다. 일반적인 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.1 mg O2/L이며, 정밀도는 3.00 mg O2/L 이하에서 ± 0.03 mg O2/L, 3.00 mg O2/L 이상에서 ± 0.06 mg O2/L 정도이다.

1.3  방해요인

이 분석법은 황화수소가 포함되어 있는 해수에는 부적합하다. 또한, 용존산소 농도가 해수 중 미생물에 의해 변하므로 차광용 용기를 사용하고 시료채수 후에는 신속히 분석해야 한다.

1.4  기구 및 기기

1.4.1  DO병: 용량이 정확히 기재되어 있고 유리 마개가 있는 차광용 산소병을 이용하여 마개와 시료병에 식별번호를 붙인다. 100 mL 이하 부피로 시료를 별도로 옮겨담지 않고 적정까지 사용된다.

1.4.2  1,000 mL 매스플라스크, 100 mL 비이커 등 다양한 크기의 초자기구

1.4.3  데시케이터

1.4.4  유리/자동뷰렛: 정밀한 적정을 위해 가급적 유리뷰렛 대신 정밀한 자동뷰렛을 사용하도록 한다. 혹은 자동으로 흡광도를 측정하여 종말점을 찾는 자동적정기를 이용한다면 더욱 정밀한 값을 얻을 수 있다.

1.4.5  자석교반기와 교반 막대

1.4.6  고정시약 분주기 또는 피펫

1.4.7  투명 튜브(예; Tygonⓡ 관)

1.5  시약 및 표준물질

1.5.1  3 M 염화망간(MnCl2ㆍ4H2O) 600 g을 초순수에 녹여 1,000 mL로 한 다음 플라스틱용기에 넣어 보관한다. 염화망간 대신 황산망간(MnSO4ㆍ4H2O) 480 g을 초순수에 녹여 1,000 mL로 한 후 사용하여도 된다.

1.5.2  알칼리 요오드화나트륨 용액: 600 g의 요오드화나트륨(NaI)과 320 g의 수산화나트륨(NaOH)을 적당량의 증류수에 먼저 녹이고 방냉한다. 여기에 시료 중의 아질산성질소 방해를 제거하기 위해 아자이드화나트륨(NaN3) 10 g을 첨가하여 녹인 다음 초순수로 1,000 mL가 되게 한다. 수산화나트륨이 초순수에 용해될 때 상당한 열이 발생하므로 주의해야 한다. 이 시약은 GF/C로 여과한 후 차광용기에 보관한다.

1.5.3  50 % (v/v) 황산용액: 초순수 50 mL에 진한 황산 50 mL를 혼합한다. 초순수에 황산을 첨가할 때 발생하는 열을 식혀가며 혼합해야 한다. 이때, 황산과 초순수의 첨가순서가 바뀌거나 황산을 급하게 첨가할 경우, 폭발할 위험성이 있으므로 주의해야 한다.

1.5.4  1 % 녹말지시약: 수용성 녹말 1 g을 초순수 50 mL에 혼합한 다음 용액이 투명해질 때까지 가열한 후 초순수를 첨가하여 정확히 100 mL로 한다. 그리고, 이 용액은 상온으로 방냉하여 사용한다. 만약 장기간 보관해야 할 경우에는 방부제(Hg2I2)를 소량 첨가한다. 냉장 보관하더라도 1주일을 초과하지 말아야 한다. 녹말 수용액을 구매하여 할 수도 있다.

1.5.5  0.025 M 티오황산나트륨 표준용액(0.025 N): 티오황산나트륨(Na2S2O3ㆍ5H2O) 약 6.21 g을 증류수에 녹여 1,000 mL로 한다. 이 티오황산나트륨의 정확한 농도는 요오드산칼륨 표준용액을 이용하여 계산한다.

1.5.6  0.001667 M 요오드산칼륨 표준용액(0.0100 N) (티오황산나트륨 용액 표준화용): 요오드산칼륨(KIO3)을 120 °C에서 약 2시간 동안 건조시킨 후 데시케이터에서 방냉한다. 요오드산칼륨 0.3567 g을 정확히 취하여 초순수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다. 본 시약은 티오황산나트륨의 표준화에 사용되므로 정확히 0.3567 g을 취하지 못할 경우, 측정되어진 무게의 정확한 값으로부터 몰농도를 정확하게 구하여 티오황산나트륨 용액의 표준화에 사용하도록 한다.

M(몰농도) =                (식 7)

1.5.7  10 % (w/v) 요오드화칼륨 용액(티오황산나트륨 용액 표준화용): 요오드화칼륨(KI) 5 g을 초순수에 녹여 50 mL로 한다.

1.6  정도평가/정도관리(QA/QC)

1.6.1  자료의 정밀도를 향상시키기 위해 주기적으로 같은 채수기에서 5 ∼ 10개 시료를 받아 분석해 보는 것이 좋다. 이때, 정밀도는 0.014 mg/L 이하로 분석되어야 한다. 현장 정밀도는 바다 날씨에 따라 0.005 ∼ 0.03 mg/L 사이로 변할 수 있다. 용존산소 측정용 시료는 앞서 언급한 것과 같이 즉시 분석해야 정도관리에 도움이 된다.

1.6.2  용존산소 측정용 절대표준물질은 없다. 판매용 제품은 실험실에서 새로 만든 표준물질과 비교하는 데 유용하다. 표준물질은 상대적으로 안정하므로 값이 이상할 경우, 적정기의 이상으로 진단할 수 있다. 중복 시료간 값의 차이가 0.057 mg/L보다 크다면 자료를 면밀하게 검토해야 한다. 특히, 심층수 값이라면 이전의 자료와 대비시켜 보아야 한다. 적정 자료는 CTD 산소센서 자료와 비교해 볼 수 있다. CTD 산소 센서 자료는 연속 자료라는 장점이 있다.

1.7  시험방법

1.7.1  시약의 바탕값() 결정

1.7.1.1  용존산소의 분석에 사용되는 시약들은 그 속에 포함된 미량의 불순물에 의해 아이오다인(I2)을 생성하여 산소 농도에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로 이들 시약의 바탕값을 계산하여 각종 농도계산에 고려해 주어야 한다.

1.7.1.2  먼저 DO 병에 초순수 약 10 mL를 넣고 KIO3 용액 1 mL를 넣어준다.

1.7.1.3  50 % 황산용액 1 mL를 넣고 교반용 자석을 넣어 잘 섞어준다.

1.7.1.4  시료 채취시 산소 고정 방법의 역순으로 알칼리 요요드 용액(NaI/NaOH) 과 염화망간(MnCl2) 순으로 각각 1 mL를 넣고 잘 흔들어준 후 티오황산나트륨으로 적정을 실시하여 첫번째 적정값을 구한다.

1.7.1.5  적정이 끝난 후 KIO3 1 mL를 다시 넣고 잘 흔든 다음 다시 적정을 실시한다. 첫번째 적정에서 두번째 적정값을 뺀 값이 바탕값()이다.

1.7.1.6  이때 바탕값은 일반적으로 수 μL 수준이므로 μL 단위로 적정을 할 수 있는 정밀뷰렛을 사용하지 않고 일반뷰렛이나 1/100 mL 자동뷰렛을 사용하는 실험실에는 시약의 바탕값을 결정하는 단계를 생략하여도 무방하다. 하지만, 연안이 아닌 대양에서 용존산소의 미묘한 변화를 관찰하기 위해서는 바탕값이 결정되어야 정확한 측정을 할 수 있다.

1.7.2  티오황산나트륨 용액 농도의 표준화

1.7.2.1  100 mL 비이커에 정확히 10.0 mL 요오드산칼륨(0.00167 M)를 옮겨 넣어준다. 초순수 약 40 mL를 넣은 후 흔들어 잘 섞이도록 한다.

1.7.2.2  요오드화칼륨 용액을 1 mL 넣고 잘 흔든 후, 즉시 50 % 황산 용액 1 mL를 넣어준다. 이때, 요오드 이온(I-)은 요오드산(IO3-)에 의해 환원되어 트리아이오다이드 착물(I3-)을 형성한다(IO3- + 8I- + 6H+ → 3I3- + 3H2O).

1.7.2.3  티오황산나트륨으로 적정을 실시한다. 노란색이 거의 사라질 때 약 1 mL 녹말 지시액을 넣어준다. 이때, 용액은 반드시 진한 청색 또는 보라색을 띠어야 한다. 보라색이 사라질 때까지 적정을 한다(I3- + 2S2O32- → 3I- + S4O62-). 이 적정법에 대해서는 ± 0.03 mL 이내의 재현성을 확보해야 한다.

1.7.2.4  요오드산(IO3-) 1몰은 최종적으로 티오황산염(S2O32-) 6몰과 반응하게 된다. 그러므로, 아래 식에 의해 적정에 사용되어진 티오황산나트륨 용액의 부피로부터 정확한 티오황산나트륨 용액의 몰농도를 간단히 구할 수 있다. 최소 3개의 값을 구한 후 평균값을 사용하도록 한다.

┌─────────────────────────────────────────────────────────┐

│티오황산나트륨의 몰농도 계산식                                                                                    │

│ 표준화에 사용된 티오황산나트륨의 몰수는 요오드산칼륨의 몰(mol) 수의 6배에 해당한다 (제6항 1.7.2.3과 1.7.2.4항 참 │

│조).                                                                                                              │

│                                                                                                                  │

├─────────────────────────────────────────────────────────┤

│                                       (식 8)                                                                     │

│                                                                                                                  │

│                                                                                                                  │

│                                                                                                                  │

├─────────────────────────────────────────────────────────┤

│    ※                                                                                                            │

│                                                                                                                  │

│                                                                                                                  │

│                                 (식 9)                                                                           │

│                                                                                                                  │

└─────────────────────────────────────────────────────────┘

1.7.3  시료채취 및 산소 고정

1.7.3.1  현장에서 DO병에 산소가 해수 속으로 유입되지 않도록 매우 조심스럽게 투명 튜브를 통해 해수시료를 채운다. 이때 충분히 해수가 DO병 밖으로 넘쳐흐르면(overflow) 튜브를 천천히 꺼내준다.

1.7.3.2  DO병 내부에 공기방울의 유무를 확인하고, 가볍게 두드려 공기 방울을 제거한다. 염화망간과 요오드화나트륨 용액을 각각 1 mL씩 시료의 표층 아래에 첨가하고 격렬히 흔들어 산소를 고정시킨다. 이때, 첨가되는 시약은 DO병의 마개를 닫을 때 넘쳐흐르지 않도록 충분한 깊이에서 넣어준다. 시약 첨가 후 10 ∼ 12시간 정도까지 시료는 차광보관 가능하며 그 이상의 시간이 소요된다면 현장에서 가능한 적정 분석까지 하도록 한다.

1.7.4  시료분석

1.7.4.1  고정된 해수시료에 황산용액 50 % (v/v) 1 mL를 첨가한 다음 흔들어 침전된 수화물을 녹인다. 이때, 시료는 담황색을 띤다.

1.7.4.2  DO병에서 직접 표준화된 티오황산나트륨 용액으로 엷은 노란색이 될 때까지 적정한다.

1.7.4.3  녹말지시약 1 mL를 넣고 다시 티오황산나트륨 용액으로 푸른색이 없어질 때까지 조심스럽게 적정한다.

1.7.4.4  시료의 용존산소 농도는 아래 식 10에 의해 계산된다(1.1 측정원리 참조). 단, 시약의 바탕값 실험을 하지 않았거나 원해나 심해와 같이 용존산소의 변화량이 작은 해역을 제외한 연안 해수시료의 경우에는 시약과의 바탕값(Vreagents)과 고정 시약에 포함된 산소 보정값(DOreagents)이 포함되지 않은 식 11을 이용하여도 무방하다.

┌───────────────────────────────────────────┐

│O2 농도 계산식                                                                        │

├───────────────────────────────────────────┤

│   O2 농도 (mg /L)                                                                    │

│ 물 속에 존재하는 O2 1몰은 티오황산염(S2O32-) 4몰과 반응한다(제6항 1.1 측정원리 참조).│

│                                                                                      │

│        (식 10)                                                                       │

│                              (식 11)                                                 │

├───────────────────────────────────────────┤

│                                                                                      │

├───────────────────────────────────────────┤

│※                                                                                    │

│                                                                                      │

│(식 12)                                                                               │

│이 계산식에 시약의 바탕값(, 1.7.1 항 참고)과 고정시약 속에 존재하는 용존              │

│산소 양(0.0017mL/mL) 을 보정한다.                                                     │

└───────────────────────────────────────────┘

1.8  분석절차 흐름도

┌───┐                                              

│시료  │ 100 mL DO 병에 채취                          

└───┘                                              

┌───┐                                              

│DO 병 │                                              

└───┘                                              

           염화망간용액 1 mL                            

           알칼리 요오드화나트륨용액 1 mL               

┌───┐                                              

│혼합  │ 마개를 닫고 병을 상하로 여러 번 뒤집어 혼합  

└───┘                                              

┌───┐                                              

│정치  │ 정치하여 1/3 정도로 침전                     

└───┘                                              

           황산용액 50 % (v/v) 1 mL                     

┌───┐                                              

│혼합  │ 마개를 닫고 병을 회전하여 침전물 완전 용해   

└───┘                                              

┌───┐                                              

│적정  │ 표준화된 티오황산나트륨으로 적정             

└───┘                                              

           녹말지시약 1 mL                              

           (황색이 희미해지면 녹말지시약을 가한다)      

┌───┐                                              

│적정  │ 표준화된 티오황산나트륨                      

└───┘                                              

┌───┐                                              

│종말점│ 보라색 ⇒ 무색                               

└───┘                                              

그림 1. 용존산소 분석절차 

1.9  참고사항

해수 중의 용존산소는 염분과 수온에 따라 포화율이 변한다. 따라서 기수지역과 같이 염분 변화가 큰 해역에서의 용존산소 변화, 계절에 따른 해수의 용존산소변화, 또는 유기물 산화에 의한 용존산소 감소 등을 파악하기 위해서는 용존산소의 절대 농도 이외에 포화율의 변화를 파악하는 것이 중요하다. 주어진 염분과 수온에서의 용존산소 포화 농도(DS)는 다음의 식에 따라 계산된다.

┌────────────────────────────────────┐

│  ln(C) = -173.4292 + 249.6339(102 × T-1) + 143.3483 × ln(T × 10-2)  │

│          -21.8492 (T × 10-2) - S(0.033096-0.014259 × T × 10-2       │

│          + 0.0017 × T2 × 10-4)                                  (식  │

│13)                                                                     │

│                                                                        │

│        C    = 시료의 염분과 수온에서의 포화 용존산소량 (mL O2/L)       │

│        T(K) = 273.15 + 수온(°C)                                       │

│        S    = 염분                                                     │

│        DS (mg O2/L)= (C × 32) / 22.4                                  │

└────────────────────────────────────┘

표 1. 수온 및 염분농도에 따른 용존산소 포화농도 (DS, mg/L)

─────────────────────────────

  T(°C)  T(K)    염분(%)                                 

                ─────────────────────

                  10      20      30      32      33      

─────────────────────────────

  6       279.15  11.64   10.91   10.22   10.08   10.02   

  8       281.15  11.09   10.40   9.75    9.62    9.56    

  10      283.15  10.58   9.93    9.32    9.20    9.14    

  12      285.15  10.11   9.50    8.92    8.81    8.75    

  14      287.15  9.68    9.10    8.55    8.45    8.40    

  16      289.15  9.27    8.73    8.21    8.11    8.06    

  18      291.15  8.90    8.38    7.90    7.80    7.75    

  20      293.15  8.55    8.06    7.60    7.51    7.47    

  22      295.15  8.23    7.76    7.33    7.24    7.20    

  24      297.15  7.93    7.49    7.07    6.99    6.95    

  26      299.15  7.65    7.23    6.83    6.75    6.71    

  28      301.15  7.38    6.98    6.60    6.53    6.49    

─────────                                        

측정된 시료의 용존산소 농도가 DM일 때 포화율은 다음과 같다.

┌─────────────────────────────────┐

│       시료의 용존산소 포화율(%) = (DM / DS) × 100       (식 14) │

└─────────────────────────────────┘

2. 격막 전극법

2.1  측정원리

격막 전극법의 측정원리는 시료 중의 용존산소가 격막을 통과하여 전극의 표면에서 산화-환원 반응을 일으키고 산소의 농도에 비례하여 전류가 흐르게 되는데 이 전류량으로부터 용존산소량을 측정하는 방법이다. 단, 격막 전극법의 원리를 이용한 용존산소 측정기는 검정 과정이 현장에서의 임의의 포화수 검정 또는 포화 습도 대기 검정(air calibration)에 의존하므로 측정 자료의 편차가 발생할 수 있다. 따라서, 현장에서 용존산소 측정기로 용존산소를 측정하였을 경우에는 일부 시료를 적정법으로 검정하도록 한다.

2.2  측정범위 및 정밀도

유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하나 일반적으로 0.2 mg O2/L 이상이다. 일반적인 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.1 mg O2/L이며 정밀도는 7.00 mg O2/L에서 ± 0.1 mg O2/L 정도이다.

2.3  기구 및 기기

2.3.1  자석교반기

2.3.2  격막 전극센서를 이용한 용존산소 측정계(용존산소 측정기, CTD 부착 용존산소센서 등): 용존산소 측정기의 경우, 염분 보정용 조절 꼭지가 있어야 한다.

2.4  시약 및 표준물질

2.4.1  5 % (w/v) 아황산나트륨 용액: 무수아황산나트륨(Na2SO3) 5 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

2.4.2  용존산소 포화 증류수: 약 500 mL의 증류수를 비이커에 담고 실온에서 약 1시간 정도 자석교반기를 이용하여 교반한다.

2.5  시험방법

2.5.1  염분보정 조절꼭지로 염분을 맞춘다.

2.5.2  격막 전극센서가 시료에 완전히 잠기도록 한다.

2.5.3  측정하는 동안 센서 주변에 와류가 일어나도록 격막 전극센서를 천천히 저어주거나 자석교반기를 이용한다.

2.5.4  기기에 따라 센서의 감응시간이 다소 다르기 때문에 이를 고려하여 측정치가 일정하게 유지될 때까지 기다린 후 측정한다.

2.6  정도평가/정도관리(QA/QC)

2.6.1  5 % (w/v) 아황산나트륨 용액을 가득 채운 용기에 격막 전극을 용기에 넣고 용기 입구를 밀봉 필름으로 봉한 후 자석교반기로 천천히 교반하면서 측정값이 일정해지면 기기의 영점을 맞춘다.

2.6.2  격막 전극센서를 증류수로 세척한 후 용존산소가 포화된 증류수를 가득 채운 용기에 격막 전극을 넣는다. 전극이 든 용기를 자석교반기로 천천히 교반하면서 측정값이 일정해지면 기기의 지시값을 용존산소 포화 증류수의 온도에 해당되는 용존산소 포화농도(표 1)에 맞춘다. 이러한 격막 전극센서의 포화수 검정은 현장 조사 전에 매번 시행해야 한다.

2.6.3  이와 같은 기기 검정 이외에 현장에서 측정한 동일 지점의 시료를 채취하여 윙클러 적정법에 따라 분석한 후 격막 전극센서로 측정한 값과 비교 검정해야 한다.

2.7  참고사항

2.7.1  격막 전극센서는 격막이 건조하지 않도록 항상 증류수가 담긴 보관 용기에 보관해야 한다.

2.7.2  기름 등이 시료에 포함되어 있을 때는 격막 센서를 사용하여서는 안된다.

2.7.3  만일 관리 부주의로 격막 센서가 건조하여 센서 내에 기포가 들어있거나 이물질이 격막에 묻어있는 경우에는 센서를 분해한 후 센서 내의 용액을 다시 보충하고 새로운 격막을 씌워 사용해야 한다.

2.7.4  격막 전극센서를 활용하여 용존산소를 측정하는 방법 이외에 최근에 사용 중인 광학식(Optic)센서 등 동등 이상의 방법을 활용하여 용존산소를 측정할 수 있다.

제7항 황화수소(Hydrogen  Sulfide)

1. 측정원리

해수시료 중의 황화수소가 산성용액에서 염산디메틸페닐렌디아민과 촉매로 쓰이는 염화제이철의 혼합 용액과 반응한 후 생성되는 푸른색 반응물(메틸렌블루)의 흡광도를 670 nm에서 분광광도계로 측정한다.

2.  측정범위 및 정밀도

램버트-비어(Lambert-Beer)의 이론에 따르는 흡광도와 농도의 직선 관계는 1 cm 셀을 방법으로 할 때 유효측정범위는 검출한계에서 3.0 mg S/L까지이다. 일반적인 검출한계는 1 cm 셀 사용시 99 % 신뢰구간에서 0.1 mg S/L이며 정밀도는 2.0 mg S/L에서 ± 0.1 mg S/L 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  산소병: 유리 마개가 있는 50 mL 차광용 산소병

3.2  피펫

3.3  분광광도계(spectrophotometer)

4. 시약 및 표준물질

4.1  염산디메틸페닐렌디아민 용액: 염산디메틸페닐렌디아민[(CH3)2NC6H4NH2 ㆍ2HCl(1,4)]: N,N-dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 2 g을 6 N 염산 용액 500 mL에 녹인다. 이 시약은 수개월 간 안정하다.

4.2  염화제이철 용액: 염화제이철(FeCl3) 8 g을 6 N 염산용액 500 mL에 녹인다. 이 시약은 매우 안정하다.

4.3  디아민 혼합용액: 염산디메틸페닐렌디아민 용액과 염화제이철 용액을 1:1의 비율로 혼합한다. 이 시약은 차광용기에 보관하며 수개월간 안정하다.

4.4  아세트산아연 용액: 아세트산아연[Zn(CH3COOH)2ㆍ2H2O] 10.44 g을 무산소 증류수에 녹여 1,000 mL로 한다.

4.5  무산소 증류수: 증류수를 끓이면서 질소 기체를 약 30분간 불어넣어 산소를 탈기시킨 후 방냉하여 사용할 때까지 경질유리로 된 밀봉 용기에 보관한다. 무산소 증류수는 분석 당일 준비해야 한다.

4.6  황화수소 표준원액: 황화나트륨(NaSㆍ9H2O) 0.375 g을 정확히 취하여 무산소 증류수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다. 이때, 황화수소 표준원액의 농도는 50 mg S/L가 된다.

5. 시료의 채취 및 보관

황화수소는 휘발성이며 해수 중의 용존산소 또는 대기에 노출되었을 때 매우 쉽게 산화된다. 그러므로, 시료를 시료병에 받을 때 기포가 발생하지 않도록 채수기에 20 cm 정도의 고무관을 연결하고 시료병 바닥에 정치하여 바닥에서부터 천천히 시료를 받아 시료가 충분히 넘치도록 한다. 유리마개로 시료병을 봉할 때 기포가 남아있지 않도록 주의해야 한다. 현장에서 즉시 측정할 수 없을 경우, 1 mL의 아세트산아연 용액을 시료에 즉시 첨가한다. 이때, 시료 중의 황화수소 농도가 높을 경우 황화아연 침전물을 형성한다. 시료를 암냉소에 보관하면 수일간 안정하다.

6. 시험방법

6.1  시료 50 mL를 기포가 발생되지 않도록 주의해서 50 mL 산소병에 넣는다.

6.2  디아민 혼합용액(4.3항) 1 mL를 피펫으로 첨가한 후 마개를 봉하고 혼합한다.

6.3  약 20분 후 670 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정한다. 만일 흡광도가 1.0을 초과하면 증류수로 발색된 시료를 희석한 후 재측정 한다.

6.4  흡광도와 농도의 상관관계식을 이용하여 시료의 황화수소 농도를 결정한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  흡광도와 농도의 상관관계식을 구하기 위하여 무산소 증류수 바탕용액과 검정범위 내에서 4등분 농도의 황화수소 표준용액(예: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0  mg S/L)을 준비한다. 황화수소 표준용액은 반드시 분석 당일에 황화수소 표준원액(4.6항)을 무산소 증류수로 희석하여 만든다.

7.2  준비된 표준용액은 위 6.1 ∼ 6.3의 과정에 따라 분석한다. 다만, 바탕용액과 표준용액은 각 농도별로 2개 이상 복수로 분석해야 한다.

7.3  측정된 자료를 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 구한다.

7.4  검출한계는 바탕용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱한 값에(99 % 신뢰구간) 평균농도를 더한 후 유의숫자 첫자리로 표현한다.

7.5  정밀도는 정량범위의 중간 표준용액을 7개 복수 분석하여 표준편차를 구한 후 3.707을 곱하여(99 % 신뢰구간) ± 유의숫자 첫 자리로 표현한다.

7.6  결과보고서에 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도, 검출한계를 기재하도록 한다.

8. 참고사항

시료를 산소병에 넣고 조작할 때 공기의 접촉이 최소화되도록 신속히 처리해야 한다.

제8항 화학적 산소요구량( Chemical  Oxygen  Demand,  COD)

1. 측정원리

해수시료를 알칼리성으로 하여 산화제인 과망간산칼륨을 일정량 넣은 다음 60분간 가열 반응시켜 화학적으로 산화시킬 수 있는 물질을 산화시키며, 이때 소비되는 과망간산칼륨의 양으로부터 산소량을 유추하는 것으로 해수시료 중 유기물의 양을 간접적으로 표현할 수 있다.

그림 1. COD 분석의 개념 모식도

각 단계별로 살펴보면, 먼저 과망간산칼륨 용액을 첨가한 후 가열하여 유기물을 산화시킨다(식 1). 이때, 반응하고 남은 요오드화칼륨 용액은 황산 용액과 함께 첨가된 요오드이온(I-)을 아이오딘(I2)으로 산화시킨다(식 2).

형성된 아이오딘(I2)은 과잉의 요오드 이온(I-)과 반응하여 트리아이오다이드 착물(I3-)을 형성한다(식 3). 또한, 유리된 트리아이오다이드 착물(I3-)은 첨가되어진 티오황산나트륨에 의해 다시 요오드이온(I-)으로 환원된다(식 4). 이때, 트리아이오다이드 착물(I3-)은 티오황산나트륨에 의해 완전히 환원되기 전 넣어준 녹말 지시약과 반응하여 푸른색을 띈다(식 5). 그러므로, 푸른색이 사라질 때까지 첨가되어진 티오황산나트륨의 양으로부터 과잉으로 남은 과망간산칼륨의 양을 알 수 있으며, 바탕용액에서 동일한 실험으로부터 계산된어진 과망간산칼륨의 양과의 차이로부터 시료 속의 유기물을 산화하는 데 사용되어진 과망간산칼륨의 양을 알 수가 있다.

아래의 반응식에서 유기물을 분해하는데 소비되어진 과망간산칼륨의 양은 바로 같은 유기물을 분해하는데 요구되어지는 산소의 양과 같으므로 이를 화학적 산소요구량(chemical Oxygen Demand)이라고 하며, 이 반응에 참여한 과망간산칼륨의 당량은 산소의 당량과 같으므로 이 관계식으로부터 화학적 산소요구량을 계산할 수 있다.

┌────────────────────────┐

│     (식 1)                                     │

│              (식 2)                            │

│                                         (식 3) │

│                            (식 4)              │

│                                   (식 5)       │

└────────────────────────┘

2.  측정범위 및 정밀도

이 실험방법은 해수시료 중 과망간산칼륨에 의해 산화되는 유기물질과 무기물질(Fe2+, NH4+, H2S)의 총량을 측정하는 데 적용된다. 시료 중에 철(II) 이온, 아질산 이온, 황화수소 및 기타 환원성 물질도 과망간산칼륨 소모량에 포함된다. 60분간 가열하였을 때 최초에 첨가한 과망간산칼륨 용액의 약 1/2이 잔존할 수 있는 양을 시료의 양으로 한다. 단, 알칼리성 과망간산칼륨법에 의한 산소요구량이 8 mg O2/L 이하인 경우에는 시료양을 50 mL로 한다.

3. 방해요인

유기물의 난분해성 정도와 염분 등의 간섭조건에 따라 산화정도 차이가 크다. 자연 시료를 측정할 경우, 총유기탄소 측정에 근거한 이론적 산소요구량을 기준으로 대체로 30 ∼ 50 %의 산화효율을 보이고 있어 해수시료 중 유기물 농도의 간접적인 지표로 이용하기에 신뢰성이 낮다. 중크롬산칼륨은 과망간산칼륨보다 강력한 산화제로서 상대적으로 산화효율은 높으나, 해수시료에 적용할 경우 염소계 이온에 의한 간섭 효과가 큰 문제점이 된다.

4. 기구 및 기기

4.1  100 mL 비이커: 용액을 부을 때 사용하는 움푹 파인 부분이 없는 완전 원형 형태의 비이커

4.2  수욕조(water bath): 100 °C 이상 가열 가능한 것

4.3  시계접시: 100 mL 원형 비이커를 정확히 그리고 충분히 덮을 수 있는 크기

4.4  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫 팁을 사용하는 것이 좋다.

4.5  자동뷰렛: 정밀한 적정을 위해 가급적 유리뷰렛 대신 정밀한 자동뷰렛을 사용하도록 한다.

5. 시약 및 표준물질

5.1  20 % (w/v) 수산화나트륨 용액: 수산화나트륨(NaOH) 20 g을 초순수 100 mL에 녹인다.

5.2  10 % (w/v) 요오드화칼륨 용액: 요오드화칼륨(KI) 5 g을 초순수에 녹여 50  mL로 한다.

5.3  50 % (v/v) 황산 용액: 진한 황산(H2SO4) 50 mL를 초순수 약 40 mL에 천천히 첨가하여 혼합한다. 실온으로 방냉한 다음, 정용플라스크에서 100 mL 눈금까지 맞춘다.

5.4  1 % 녹말지시약: 수용성 녹말 1 g을 초순수 50 mL에 혼합한 다음 용액이 투명해질 때까지 가열하고 초순수를 첨가하여 정확히 100 mL로 한다. 이 용액은 상온으로 방냉하여 사용하며, 만약 장기간 보관해야 할 경우에는 방부제(Hg2I2)를 소량 첨가한다. 냉장 보관하더라도 1주일을 초과하지 말아야 한다.

5.5  0.025 N 과망간산칼륨 용액: 과망간산칼륨(KMnO4) 0.790 g을 초순수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다. 이 용액을 비이커에 옮긴 다음, 1 ∼ 2시간 조용히 끓인 후 하루 동안 암소에 방치한 다음 유리 여과기로 여과하여 갈색병에 넣어 암소에 보관한다.

5.6  0.01 N 티오황산나트륨 용액: 티오황산나트륨(Na2S2O3ㆍ5H2O) 약 2.48 g을 취하여 일정량의 초순수에 녹여 1,000 mL로 한다. 티오황산나트륨이 산화환원 반응에 참여할 때 변화된 산화수는 1

 티오황산나트륨(Na2S2O3ㆍ5H2O)에는 황(S)이 2개 존재하므로 총 변화된 산화수는 1(=0.5 × 2)이다.

  2S2O32- + I3-  →  S4O62- + 3I-  ; [S2+] → [S2.5+]   ; Δ산화수 = 0.5

이므로 티오황산나트륨의 몰농도는 노르말 농도와 같다. 그러므로 이 경우, 용액의 몰농도와 노르말 농도는 같게 된다.

I3- + 2S2O32- → 3I- + S4O62- 황(S)의 산화수 변화 ;(-2) → (-2.5)     (식 6)

5.7  0.001667 M 요오드산칼륨 표준용액(0.0100 N): 요오드산칼륨(KIO3)을 120 °C에서 약 2시간 동안 건조시킨 후 데시케이터에서 방냉한다. 요오드산칼륨 0.3567 g을 정확히 취하여 초순수에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다. 본 시약은 티오황산나트륨의 표준화에 사용되므로 정확히 0.3567 g을 취하지 못할 경우, 측정되어진 무게의 정확한 값으로부터 몰농도를 정확하게 구하여 티오황산나트륨 용액의 표준화에 사용하도록 한다.

M(몰농도) =             (식 7)

6. 시료의 채취 및 보관

시료를 채취한 후에는 즉시 시험하는 것이 가장 바람직하며, 즉시 시험하지 못할 경우에는 0 ∼ 10 °C의 냉암소(차갑고 어두운 곳)에 보관한 다음 가능한 한 빨리 분석한다.

7. 시험방법

7.1  티오황산나트륨 용액 농도의 표준화

7.1.1  100 mL 비이커에 정확히 10.0 mL 요오드산칼륨(0.00167 M)를 옮겨 넣어준다. 초순수 약 40 mL를 넣은 후 흔들어 잘 섞이도록 한다.

7.1.2  요오드화칼륨 용액을 1 mL 넣고 잘 흔든 후 즉시 50 % 황산 용액 1 mL을 넣어준다. 이때, 요오드 이온(I-)은 요오드산(IO3-)에 의해 환원되어 트리아이오다이드 착물(I3-)을 형성한다(IO3- + 8I- + 6H+ → 3I3- + 3H2O).

7.1.3  티오황산나트륨으로 적정을 실시한다. 노란색이 거의 사라질 때 약 1 mL 녹말 지시액을 넣어준다. 이때, 용액은 반드시 진한 청색 또는 보라색을 띠어야 한다. 보라색이 사라질 때까지 적정을 한다(I3- + 2S2O32- → 3I- + S4O62-). 이 적정법에 대해서는 ± 0.03 mL 이내의 재현성을 확보해야 한다.

7.1.4  요오드산(IO3-) 1몰은 최종적으로 티오황산염(S2O32-) 6몰과 반응하게 된다. 그러므로, 아래 식에 의해 적정에 사용되어진 티오황산나트륨 용액의 부피로부터 정확한 티오황산나트륨 용액의 몰농도를 간단히 구할 수 있다. 최소 3개의 값을 구한 후 평균값을 사용하도록 한다.

┌──────────────────────────────────────────────────────────┐

│티오황산나트륨의 몰농도 계산식                                                                                      │

│ 표준화에 사용된 티오황산나트륨의 몰 수는 요오드산 칼륨의 몰(mol) 수의 6배에 해당한다(제6항 1.7.2.3과 1.7.2.4 참조).│

│                                                                                                                    │

├──────────────────────────────────────────────────────────┤

│                                        (식 8)                                                                      │

│                                                                                                                    │

├──────────────────────────────────────────────────────────┤

│※                                                                                                                  │

│                                    (식 9)                                                                          │

│                                                                                                                    │

│                                                                                                                    │

└──────────────────────────────────────────────────────────┘

7.2  시료분석

7.2.1  100 mL 비이커에 시료 50 mL를 정확히 취하고, 20 % 수산화나트륨용액 1  mL를 넣어 알카리성으로 한다.

7.2.2  여기에 0.025 N 과망간산칼륨 용액 10.0 mL를 넣은 후 시계접시로 비이커를 덮고 수욕의 수면이 시료의 수면보다 높게 하여 끓는 수욕 중에서 60분간 가열한다.

7.2.3  가열 후 충분히 냉각시킨 다음, 10 % 요오드화칼륨용액 1 mL와 50 % 황산용액 1 mL를 넣어 유리된 요오드를 넣고 티오황산나트륨 용액으로 엷은 노란색이 될 때까지 적정한다.

7.2.4  녹말지시약 1 mL를 넣고 다시 티오황산나트륨 용액으로 푸른색이 없어질 때까지 조심스럽게 적정한다.

7.2.5  별도로 시료량과 같은 양의 증류수를 바탕용액으로 하여 같은 조건에서 바탕용액(blank) 시험을 행한다. 해수시료의 화학적 산소요구량은 다음과 같이 결정한다.

┌─────────────────────────────────────┐

│화학적 산소요구량 (mg/L)                                                  │

├─────────────────────────────────────┤

│             (식 10)                                                      │

│                                                                          │

├─────────────────────────────────────┤

│ ※                                                                       │

│                        (식 11)                                           │

├─────────────────────────────────────┤

│  (2) 유기물 분해에 소모된 산소의 당량                                    │

│   = 유기물 분해에 소모된 과망간산칼륨(KMnO4)의 당량                      │

│   = 초기 KMnO4의 당량-소비되어진 후 남은 KMnO4의 당량                    │

│   = 바탕용액에 첨가된 KMnO4의 당량-시료에 남은 KMnO4의 당량              │

│                                                                          │

│                                                                          │

│                                                                          │

│   = 바탕용액에 첨가된 Na2S2O3ㆍ5H2O의 당량 - 시료에 첨가된               │

│     Na2S2O3ㆍ5H2O의 당량                                         (식 12) │

└─────────────────────────────────────┘

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  시료군마다 1개의 바탕시료(blank)를 측정한다. 바탕시료는 초순수를 사용하여 시료분석(제8항 7.2 참고) 절차와 동일하게 측정하며, 이때 얻은 값이 검출한계 이하가 되어야 한다.

8.2  현장 중복시료(field duplicate)는 동일한 시료채취 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를, 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 20 % 이하이어야 한다.

B(%) =  × 100                   (식 13)

여기서,      B : 편차 (Bias),  S1, S2 : 중복시료 각각의 분석결과 (농도)

9. 분석절차 흐름도

┌──┐                                            

│시료│ 50 mL                                      

└──┘                                            

         20 % 수산나트륨용액 1 mL                   

         0.025 N 과망간산칼륨용액 10 mL             

┌──┐                                            

│혼합│                                            

└──┘                                            

┌──┐                                            

│가열│ 수욕의 수면이 시료의 수면보다 높게하여     

│    │ 수욕중에서 60분간 가열                     

└──┘                                            

┌──┐                                            

│냉각│                                            

└──┘                                            

         10 % 요오드화칼륨용액 1 mL                 

         50 % 황산용액 1 mL                         

┌──┐                                            

│적정│ 표준화된 티오황산나트륨                    

└──┘                                            

         녹말지시약 1 mL                            

         (황색이 희미해지면 녹말지시약을 가한다.)   

┌──┐                                            

│적정│ 표준화된 티오황산나트륨                    

└──┘                                            

┌──┐                                            

│종점│ 보라색     무색                            

└──┘                                            

그림 2. 화학적 산소요구량 분석절차

10. 참고사항

화학적 산소요구량(COD)을 정량하는 방법에는 산화제의 종류에 따라 중크롬산칼륨(K2Cr2O7)법, 과망간산칼륨법이 있고, 과망간산칼륨법은 다시 유기물 분해시 pH에 따라 산성 과망간산칼륨법과 알칼리성 과망간산칼륨법으로 나뉜다. 이중 중크롬산칼륨법과 산성 과망간산칼륨법은 산성하에서 염소이온과 산화제가 많이 반응하여 화학적 산소요구량(COD) 값이 실제보다 높게 나타나고, 산화된 염소는 유독가스로 발생된다. 따라서, 해수와 같이 염소이온이 많이 함유된 시료의 경우에는 산화력은 조금 떨어지지만 알칼리성 과망간산칼륨법이 많이 이용된다.

제9항 용존유기탄소(Dissolved  Organic  Carbon,  DOC)

1. 측정원리

용존유기탄소의 분석은 여과된 해수시료 중에 용존되어 있는 유기물을 금속 촉매를 이용한 고온 연소장치에 의해 완전히 산화시킨 후 발생되는 이산화탄소(CO2)의 양을 비분산형 적외선 감지기로 측정하여 용존유기탄소량으로 나타내는 원리이다. 이때, 시료 중의 용존무기탄소는 산처리 후 질소기체에 의해 제거된다.

2. 측정범위 및 정밀도

고온연소법을 이용한 용존유기탄소의 유효측정범위는 일반적으로 검출한계에서 100  mg C/L(8.33 mM)까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 초순수로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.05 mg C/L(4.16 μM)이며 정밀도는 5 mg C/L(416.2 μM)에서 ± 0.08 mg C/L(6.66 μM) 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구: 500 mL 용량의 유리 플라스크 등 분석에 사용되는 시료병을 포함한 모든 초자기구류는 반드시 0.1 N 염산 용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복세척 후 건조시킨 다음 450 ∼ 500 °C 사이의 회화로에서 24시간 이상 회화시킨 후 사용한다. 보관 또는 분석 반응시, 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 오염을 차단해야 한다.

3.2  여과기구

3.3  총유기탄소분석기(TOC analyzer): 금속촉매 컬럼, 고온연소로, 비분산 적외선 감지기를 포함한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  산소 기체: 순도 99.99 % 이상이어야 한다.

4.2  질소 기체: 순도 99.99 % 이상이어야 한다.

4.3  1.0 % (v/v) 염산 용액: 염산을 초순수로 희석하여 분석 당일 준비한다.

4.4  유기탄소 표준원액(100 mg C/L): 프탈산수소칼륨(KHC8H4O4) 0.213 g을 초순수에 녹인 후 정확히 1,000 mL로 하여 100 mg C/L의 유기탄소 표준원액을 만든다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 채취된 해수시료는 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 보관하되 4 °C 이하에서 냉장 보관이 불가할 때는 수시간 이내에 실험실로 옮겨져 분석되어야 한다. 분석에 필요한 시료량은 약 50 mL이면 충분하다. 대부분의 경우, 부유물질 등에 의한 혼탁도가 심한 시료는 GF/F 여과지를 이용하여 부유물질을 제거한다.

5.2  전처리 과정: 시료에 1.0 % (v/v) 염산 용액을 첨가하여 pH 2로 조절하고 질소 기체를 불어넣어 시료에 포함되어 있는 무기 CO2를 제거한다.

6. 시험방법

6.1  준비된 시료를 총유기탄소 분석기로 측정한다.

6.2  검정식을 이용하여 용존유기탄소의 농도(mgC/L)를 결정한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  검량선식을 구하기 위하여 바탕용액용 초순수와 2.5, 5, 7.5, 10 mgC/L 표준용액을 준비한다. 유기탄소 표준용액은 분석 당일, 유기탄소 표준원액(제9항 4.4 참고)을 초순수로 희석하여 만든다.

7.2  준비된 표준용액은 시료와 동일한 분석법(제9항 6.1 및 6.2)에 따라 분석한다. 다만, 바탕용액과 표준용액은 각 농도별로 2개 이상 복수로 분석되어야 한다.

7.3  측정된 자료를 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 구한다.

7.4  검출한계는 바탕용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.14를 곱한 값(99 % 신뢰구간)에 바탕용액 농도의 평균값을 더하여 유의숫자 첫자리로 표현한다.

7.5  정밀도는 정량범위의 중간 표준용액을 7개 이상 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱하여(99 % 신뢰구간) ± 유의숫자 첫 자리로 표현한다.

7.6  결과보고서에는 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도, 검출한계를 기재하도록 한다.

8. 참고사항

8.1  이 방법에서 쓰이는 바탕용액은 1,000 mL의 초순수에 1 g의 과황산칼륨과 1 mL의 인산 용액 85 % (v/v)를 첨가한 후 재증류하여 유기탄소의 농도가 0.05 mg C/L 이하가 되도록 한다.

8.2  시료병은 시료채취 후 즉시 마개로 봉하여 조사선박의 배기기체 등 주변으로부터의 유기물 오염을 방지해야 한다.

8.3  대부분의 상용 총유기탄소 분석기기는  전처리 과정(제9항 5.2)의 기능을 내장하고 있다.

8.4  이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우에 사용할 수 있다.

8.5  해수의 DOC 측정시, TOC 분석기의 금속촉매 컬럼에 염분의 침착으로 인한 막힘 현상이 발생하므로 시료 측정시마다 초순수로 5회 이상 세척해야 한다.

제10항 아질산성질소(Nitrite  Nitrogen,  NO2-N)

1. 측정원리

해수시료 중의 아질산성질소는 일차적으로 방향족 질소화합물인 술퍼닐아미드와 산성 조건하에서 반응하여 디아조늄 이온(디아조화합물)을 형성한 후 이차적으로 다른 방향족 질소화합물인 나프틸에틸렌디아미드와 반응하여 분홍색의 용액(아조화합물)을 생성하게 된다. 이때, 분광광도계 또는 자동분석기로 최대 흡수파장인 543 nm에서 최종 발색된 용액의 흡광도를 측정한다.

┌───────────┐

│                      │

││

│                      │

│   │

└───────────┘

그림 1. 아질산성질소의 화학반응식

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 0.003 ∼ 0.5 mg/L(0.214 μM ∼ 35.7 μM)이며, 정밀도는 변동계수로 3∼ 10 %이다. 이 방법의 검출한계는 1 cm셀 사용시 99 % 신뢰구간에서 0.003 mg N/L(0.214 μM)이며, 최종 발색된 용액의 흡광계수는 45,000 cm-1ㆍM-1 (3.21 cm-1ㆍ(mg/L)-1) ± 10 %이다.

3. 기구 및 기기

3.1  시험 및 시약 용기: 20 mL 경질 유리시험관 및 시약병 등 분석에 사용되는 모든 초자기구류 및 플라스틱 용기는 반드시 10 % (v/v) 염산 용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다.

3.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

3.3  와류혼합기(vortex mixer): 시료와 시약을 혼합할 때 사용한다.

3.4  분광광도계(spectrophotometer): 대상 시료의 특성에 적합한 cell(길이: 1 cm, 5 cm, 10 cm)을 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  술퍼닐아미드 용액 (Sulfanilamide): 술퍼닐아미드(C6H8O2ㆍN2S) 5 g을 500 mL 비이커에 넣고 초순수 300 mL를 첨가한 다음 진한 염산 50 mL를 첨가하여 잘 혼합한다. 혼압액을 실온으로 냉각시킨 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500 mL로 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 넣어 보관하며, 수개월간 안정하다.

4.2  염화나프틸에틸렌디아민용액 (N-(1-naphtyl)-ethylenediamine dihydrochloride): 염화나프틸 에틸렌디아민(C12H14N2ㆍ2HCl) 0.5 g을 100 mL 비이커에 옮긴 다음 초순수 약 50 mL에 녹인 후 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500 mL로 한다. 이 용액은 차광용기에 넣어 냉장 보관(8 °C 이하)하며, 유효기간은 1개월 이상이다. 그러나, 용액이 갈색으로 변색된 경우에는 1개월 이전이라도 새롭게 만들어야 한다.

4.3  아질산성질소 표준원액(5 mM): 아질산나트륨(NaNO2) 적당량을 105 ∼ 110 °C에서 1시간 동안 건조한 다음 데시케이터에서 방냉한다. 건조된 아질산나트륨 0.1725 g을 정확히 무게를 단 후 약 200 mL 정도의 초순수로 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500 mL로 한다.

4.4  아질산성질소 표준용액: 아질산성질소 표준원액(4.3항 5 mM) 1 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 정확히 100 mL를 맞춘다(50 μM). 이 용액에서 다시 각각 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 mL를 정확하게 취하여 시험관에 옮긴 후 초순수 9.8, 9.5, 9.0, 8.0 mL을 추가하여 최종 10 mL가 되도록 한다. 이 용액은 시험 직전에 조제하며 아질산성질소의 농도가 1.0, 2.5, 5.0, 10 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다.

4.5 정도관리용 표준인증물질(Certified Reference Material, CRM): National Research Counsil Canada에서 제공하는 moos 혹은 국내 정도관리 인정기관에서 제공하는 CRM.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서의 시료채취는 제2장에서 언급한 방법에 따라 채취하며, 채취된 해수시료는 유리 또는 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 보관한다.

5.2  시료를 채취할 때는 약 50 mL 정도의 시료수로 채취용기(유리 또는 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기)를 3회 헹군 다음 채취한다.

5.3  시료를 실험실로 운반한 후 바로 분석하지 못하거나 또는 선박에서 냉동 보관할 경우가 있으므로 이럴 경우, 시료병의 2/3 정도만 시료를 취한 후 마개를 닫는다(냉동 보관시 시료량이 시료병 용량의 3/4을 초과할 경우, 시료가 밖으로 누수된다).

5.4  시료분석은 채수 후 최소 8시간 이내에 수행해야 하며, 현장 사정 등 바로 분석할 수 없거나 장기간 보관해야 하는 경우는 시료 채취 후 급속 냉동(-20 °C) 해야 한다.

5.5  현장 분석을 수행하거나 냉동보관 후 분석할 경우, 모든 시료를 GF/F 여과지로 여과한 후 분석하거나 냉동보관 해야 한다.

5.6  여과할 때는 여과기에 여과지를 장착한 후 소량(약 20 ∼ 30 mL)의 초순수로 3회 정도 세척한 후 여액을 버린다. 시료 약 30 ∼ 50 mL로 여과하여 여액병을 세척한 다음 여액을 버리고 시료를 필요한 양만큼 여과한다.

5.7  동결 또는 보관 중인 시료병은 반드시 수직으로 세워져 있어야 한다.

5.8  냉동시료를 해동할 경우, 약 40 °C 정도 되는 수조에서 15분 이내에 해동해야 한다.

5.9  시료를 해동한 다음 분석하기 전에 시료병을 충분히 흔들어 완전히 혼합한 후 분석용 시료로 사용해야 한다.

6. 시험방법

6.1  검량선 작성

6.1.1  아질산성질소 표준용액을 이용하여 정량범위내 최소 4개 이상의 농도 구간에 대해 표준용액을 만든다.

6.1.2  표준용액으로 만든 용액을 시료분석과 동일한 조작(6.2항)으로 분석하여 아질산성질소의 농도와 흡광도의 검량선을 작성하고 상관관계식을 구한다.

6.2  분석절차

6.2.1  유리시험관(또는 플라스틱 시험관)에 시료 10 mL를 정확히 취하고, 술퍼닐아미드 용액 0.2 mL를 첨가하여 와류혼합기 등을 이용하여 충분히 혼합하고 약 2분 이상 방치한 후(8분 이내)에 염화나프틸에틸렌디아민 용액을 첨가한다.

6.2.2  염화나프틸에틸렌디아민 용액 0.2 mL를 첨가하고, 혼합한 후에 약 10분 이상 2시간 이내에 파장 543(혹은 540 nm)에서 흡광도를 측정한다.

6.2.3  흡광도와 농도의 상관관계식을 이용하여 시료의 아질산성질소 농도를 환산한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  검출한계 및 정량한계

7.1.1  검출한계(Detection Limit) 및 정량한계(Quantitation Limit)는 초순수에 정량한계 부근의 농도(0.5 μM)가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 6.2항의 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다.

7.1.2  위 7.1.1항에서 계산된 표준편차에 3.14를 곱한 값을 검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 정량한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하의 값이라야 한다.

7.2  바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 바탕시료(Method blank)를 측정한다. 바탕시료는 초순수를 사용하여 분석절차(6.2항)와 동일하게 측정하며, 이때 얻은 값이 검출한계 이해야 한다.

7.3  검량선 검증

7.3.1  검량선 작성은 6.1항과 같이 작성하고, 얻어진 검량선의 결정계수(R2)가 0.99 또는 반응계수(RF, Response Factor)의 변동계수가 20 % 이내이어야 하며, 결정계수나 변동계수가 허용범위를 벗어날 경우, 검량선을 재작성해야 한다.

7.3.2  반응계수(RF)는 검량선 작성을 위한 표준용액의 농도(C)에 대한 흡광도와 같은 반응(R, Response)으로 다음 식과 같이 구하며, 검량선의 기울기에 해당된다.

RF (반응계수) =                          (식 1)

7.3.3  검량선의 검증은 검량선의 직선성을 평가하여 검증한다. 각 시료군마다 1회의 검량선 검증을 실시하는 것이 바람직하다. 검량선의 중간 농도에 해당하는 표준용액을 측정한다. 측정값은 검량선 작성시의 값과 10 % 이내에서 일치해야 한다. 만약 이 범위를 넘을 경우, 검량선을 다시 작성해야 한다.

7.4  정확도(Accuracy) 및 정밀도(Precision)

7.4.1  정확도는 참값과 실험값과의 근접 정도를 나타내는 것으로서 검량선에 사용한 농도 범위에서 최소 3개의 농도에 해당하는 표준물질을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가하는 것으로 다음의 두 가지 방법을 이용한다.

7.4.1.1  표준용액을 이용하는 방법

① 정량한계의 1 ∼ 2배의 농도로 준비한 표준용액, ② 검량선에 사용한 농도범위의 중간 농도로 준비한 표준용액, ③ 검량선에 사용한 농도 범위 중 최대 농도로 준비한 표준용액 등 세 가지 방법에 대해 표준용액을 각각 4개씩 준비하고, 6.2항의 분석절차에 따라 시험한다.

정확도는 7.4.1.1항의 시험 결과에서 얻은 평균값과 제조한 이론값에 대한 회수율 (%)로 나타낸다.

정확도(%) = 회수율(%) =                  (식 2)

x' : 평균농도값,   x : 이론농도값

7.4.1.2  해수시료에 표준용액을 첨가하는 방법

① 검량선 농도범위의 중간 농도로 표준물질이 첨가된 해수시료(Mspiked), ② 표준물질을 첨가하지 않은 해수시료(Munspiked), ③ 검량선에 사용한 표준용액 농도범위 중 중간 농도값(Cspiked)에 대해 6.2항의 분석절차에 따라 시험한다.

정확도는 7.4.1.2항의 시험결과에서 얻은 측정값과 표준물질을 첨가하지 않은 해수의 측정값의 차이와 제조한 표준물질의 이론값에 대한 회수율(%)로 나타낸다.

정확도 (%)  =  회수율 (%)  =  × 100          (식 3)

               Mspiked: 표준물질을 첨가한 해수의 측정값

               Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 해수의 측정값

               Cspiked: 첨가한 표준물질의 이론 농도값

7.4.1.3  인증표준물질을 이용하는 방법

CRM을 분석하여 7.4.1.1항의 시험결과에서 얻은 평균값과 제조한 이론값에 대한 회수율(%)로 나타낸다.

정확도(%) = 회수율(%) =                  (식 4)

x' : 평균농도값,   x : 이론농도값

7.4.2  정밀도는 규정된 조건하에서 측정값들 간의 근접 정도를 나타내는 것으로 검량선에 사용한 농도 범위에서 최소 3개의 농도에 해당하는 표준물질을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다.

7.4.2.1  표준용액을 이용하는 방법으로 ① 정량한계의 1 ∼ 2배의 농도로 준비한 표준용액, ② 검량선에 사용한 농도 범위 중 중간 농도로 준비한 표준용액, ③ 검량선에 사용한 농도 범위 중 최대 농도로 준비한 표준용액 등 세 가지 방법에 대해 표준용액을 각각 4개씩 준비하고, 6.2항의 분석절차에 따라 시험한다.

7.4.2.2  표준용액을 이용하는 방법에서 얻은 평균값과 표준편차로 변동계수를 구하여 재현성을 확인하고, 이를 정밀도로 이용한다.

정밀도(%) = CV =                         (식 5)

                CV : 변동계수(Coefficient of variation)

                SD : 표준편차 (Standard Deviation)

                 : 평균값

8. 결과

8.1  계산

시료에서의 측정된 흡광도를 표준물질의 검량선으로부터 아질산성질소의 농도(μM)로 환산한다.

A =  m × Csample + b                         (식 6)

Csample =                            (식 7)

                  Csample : 시료에서의 아질산성질소 농도 (μM)

                  A : 흡광도

                  m : 흡광계수 (기울기)

                  b : 절편

아질산성질소의 농도 변환:  1 μM = 14 μg/L = 0.014 mg/L

8.2  결과보고

농도 계산에 사용된 검량선에 관련한 아래의 자료들을 제시한다.

① 표준물질 농도

② 흡광도

③ 검량선식

④ 흡광계수

⑤ 결정계수(R2)

⑥ 정확도

⑦ 정밀도

9. 분석절차 흐름도

┌──────┐                                    

│시료        │ 10 mL                              

└──────┘                                    

┌──────┐                                    

│시험관      │                                    

└──────┘                                    

                 술퍼닐아미드용액 0.2 mL            

┌──────┐                                    

│혼합        │                                    

└──────┘                                    

┌──────┐                                    

│방치        │ 약 2∼8분간 방치                   

└──────┘                                    

                 염화나프틸에틸렌디아민 0.2 mL      

┌──────┐                                    

│혼합        │                                    

└──────┘                                    

┌──────┐                                    

│방치        │ 약 10분 이상 방치 2시간 이내 측정  

└──────┘                                    

┌──────┐                                    

│흡광도 측정 │ 분광광도계 543 nm (혹은 540 nm)    

└──────┘                                    

그림 2. 아질산성질소 분석절차

10. 참고사항

10.1  이 방법에 따른 아질산성질소 측정은 시료 중에 높은 농도의 황화수소에 의해 간섭 받을 수 있으므로 무산소 환경에서 채취된 시료의 경우, 질소 기체로 황화수소를 탈기시킨 다음 분석하도록 한다.

10.2  다수의 시료분석이 필요하거나 또는 현장에서 직접 측정할 경우, 이 방법과 측정원리가 같은 영양염 자동분석기(nutrient autoanalyzer)를 이용하는 것이 효율적이다.

제11항 질산성질소(Nitrate  Nitrogen,  NO3-N)

1. 측정원리

질산성질소는 해수 중의 질소계 화합물 중 열역학적으로 비교적 안정하기 때문에 일반화학적 발색반응 방법은 적용하기가 어렵다. 따라서, 해수시료 중의 질산성질소는 구리 촉매로 처리된 카드뮴 환원관을 이용하여 아래 식 1의 반응에 따라 아질산성질소로 환원된 후 방향족 질소화합물인 술퍼닐아미드와 산성 조건하에서 반응하여 디아조늄 이온(디아조화합물)을 형성하고, 이차적으로 다른 방향족 질소화합물인 나프틸에틸렌디아미드와 반응하여 분홍색의 용액(아조화합물)을 생성하게 된다. 이때, 분광광도계 또는 자동분석기(autoanalyzer)로 최대 흡수파장인 543 nm에서 최종 발색된 용액의 흡광도를 측정한다.

NO3- + Me(s) + 2H+→ NO2- + Me2+ + H2O               (식 1)

위 반응식에서 나타낸 바와 같이 질산성질소의 환원 정도는 구리로 처리된 카드뮴 입자표면의 활성도와 반응용액의 pH에 의해 좌우된다.

예를 들어, 반응용액이 과도하게 염기성이거나 또는 구리로 처리된 카드뮴 입자표면의 활성이 불충분하면 질산성질소의 환원이 부분적으로 일어나며, 반대로 반응용액이 과도하게 산성이거나 또는 구리로 처리된 카드뮴 입자표면의 활성이 과도하면 질산성질소의 환원이 과도하게 일어나 아질산성질소보다 더욱 환원된 NO, N2O 등으로까지 이르게 될 수도 있다(식 2, 3, E0는 표준기전력).

NO3- + 3H+ + 2e-→ HNO2 + H2O(E0 = 0.94V)             (식 2)

NO3- + 4H+ + 3e-→ NO + 2H2O(E0 = 0.97V)              (식 3)

따라서, 질산성질소에서 아질산성질소로의 환원과정은 반드시 적정한 pH와 구리로 처리된 카드뮴 입자표면의 활성을 적절히 유지하도록 하면, 식 4와 같이 질산성질소가 아질산성질소로 환원이 일어나게 된다.

NO3- + H2O + 2e-→ NO2- + 2OH-(E0 = 0.015V)            (식 4)

그러므로, 카드뮴 환원관의 효율을 매실험마다 측정해야 한다. 아래 본문 중에 카드뮴 환원관의 과도한 환원 및 불완전한 환원을 측정하는 방법을 제시하였다(7.3 환원관의 효율검정 참고).

한편, 구리로 처리된 카드뮴 입자는 질산염의 환원에 적합하나 중성 또는 약알칼리성에서 질산이 환원되는 동안 카드뮴 이온이 수산화이온과 반응하여 침전을 형성할 수 있다. 질산에서 아질산으로의 환원은 pH에 의존하므로 완충용액을 이용하여 적절한 pH를 유지시켜 주어야 하며 또한 완충제로 첨가되어진 염화암모늄으로부터 해리되어진 암모니아는 질산이 환원되는 동안 형성된 카드뮴 이온과 착이온을 형성하므로 수산화 이온에 의한 카드뮴 이온의 침전을 방지하게 된다.

2NH4+ = 2NH3 + 2H+                         (식 5)

Cd2+ + 2NH3 → [Cd(NH3)2]2+                      (식 6)

2. 측정범위 및 정밀도

이 방법을 통한 질산성질소의 측정범위 및 정밀도는 아질산성질소의 경우와 같다. 정량범위는 질소(N)로서 0.003 ∼ 0.5 mg/L(0.214 μM ∼ 35.7 μM)이며, 정밀도는 변동계수로 3 ∼ 10 %이다. 이 방법의 검출한계는 1 cm셀 사용시 99 % 신뢰구간에서 0.003 mg N/L이다. 램버트-비어(Lambert-Beer)의 이론에 따르는 흡광도와 농도의 직선관계는 1 cm셀을 기준으로 할 때 0.500 mg N/L 이하에서 적용되므로 유효측정범위는 검출한계에서 0.500 mg N/L까지이며, 최종 발색된 용액의 흡광계수는 45,000 cm-1ㆍM-1 (3.21 cm-1ㆍ(mg/L)-1) ± 10 %이다.

3. 방해요인

아질산성질소로 환원시킨 후 측정하므로 아질산성질소와 마찬가지로 시료에 황화수소가 존재할 경우, 방해를 받을 수 있다.

4. 기구 및 기기

4.1  시험 및 시약 용기: 30 mL 혹은 50 mL 경질 유리시험관 및 시약병 등 분석에 사용되는 모든 초자기구류 및 플라스틱 용기는 반드시 10 % (v/v) 염산 용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다.

4.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

4.3  와류혼합기(vortex mixer): 시료와 시약을 혼합할 때 사용한다.

4.4  분광광도계(spectrophotometer): 대상 시료의 특성에 적합한 cell (길이: 1 cm, 5 cm, 10 cm)을 사용한다.

4.5  연동펌프(peristaltic pump): B형 환원관 이용시 사용한다.

4.6  환원관(reduction column): 경질유리로 다음의 그림과 같이 제작한다.

그림 1. 질소 환원관

5. 시약 및 표준물질

5.1  진한 염화암모늄 용액(Concentrated ammonium chloride solution): 염화암모늄(NH4Cl) 125 g을 500 mL 비이커에 옮기고 초순수 약 400 mL에 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 비이커를 소량의 초순수로 헹군 후 헹군 용액을 부피플라스크에 옮긴 다음(3회 반복) 초순수를 첨가하여 500 mL로 하며, 이 용액을 유리 또는 플라스틱 용기에 넣어 보관한다.

5.2  묽은 염화암모늄 용액(Dilute ammonium chloride solution): 진한 염화암모늄 용액 25 mL를 1,000 mL 부피플라스크에 옮긴 후 초순수를 첨가하여 1,000 mL로 맞춘 후 유리 또는 플라스틱 용기에 넣어 보관한다.

5.3  카드뮴 입자: 환원관에 충진할 카드뮴 입자의 크기는 대략 직경 1 mm 내외(A 유리컬럼) 혹은 400 ～ 800 μM(20 ～ 40 mesh)(B 유리컬럼)이어야 하며 직접 제작하거나 상업적으로 제작되어 있는 것을 이용한다. 준비된 카드뮴 입자는 불순 산화물을 제거하기 위해 2 N 염산 용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 세척하여 잔여 염산을 완전히 제거한다.

5.4  2 % (w/v) 황산구리 용액: 황산구리(CuSO4ㆍ5H2O) 10 g을 200 mL 비이커에 옮기고 초순수로 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴 후 비이커를 소량의 초순수로 세척하고(3회 반복) 세척액을 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수를 첨가하여 500 mL로 맞춘다. 이 용액은 실온에서 안정하다.

5.5  카드뮴-구리 충진물 제작(카드뮴 입자에 구리를 흡착시킨 후, 구리가 다시 환원되지 않도록 주의해야함): 200 mL 비이커에 황산구리 용액(5.4항) 100 mL를 첨가한 후 카드뮴 입자(5.3항) 약 50 g(A형 환원관 컬럼) 혹은 약 2 g(B형 환원관 컬럼)을 비이커에 넣은 다음 황산구리 용액의 옅은 푸른색이 없어질 때까지 약 3분간 천천히 젓는다. 이때, 촉매 역할을 하는 구리가 충분히 흡착되면 카드뮴 입자(5.3항)는 검은색을 띠게 된다. 완성된 카드뮴-구리 충진물이 담긴 비이커에 남은 황산구리 용액을 따라 버리고 초순수로 여러 번 세척하여 미세입자를 제거한 다음 묽은 염화암모늄 용액(5.2항) 약 100 mL를 첨가한다.

5.5.1  A형 환원관 컬럼 - 제작된 환원관(4.5항)의 하부에 가는 구리선을 이용하여 카드뮴 입자가 나가지 않도록 컬럼의 밑부분을 막은 다음 묽은 염화암모늄 용액(5.2항)을 채운다. 준비된 카드뮴-구리 충진물을 환원관의 약 20 cm 정도까지 채우는데, 이때 카드뮴 입자 사이의 빈 공간이 최소화되도록 연필 등으로 부드럽게 두드리며 집어넣는다. 최종적으로 충진된 환원관의 상부에 가는 구리선을 이용하여 윗마개를 만든다. 충진된 환원관의 정상 유속은 분당 약 10 mL 내외이다. 완성된 환원관은 항상 묽은 염화암모늄 용액으로 채워 놓는다.

5.5.2  B형 환원관 컬럼 - 카드뮴 입자가 실리콘 튜브로 새어나가지 않도록 유리관 한 쪽 끝을 깨끗이 세척된 거즈 2 ∼ 3장으로 덮은 후 실리콘 튜브로 유리관을 연결한다. 준비된 카드뮴-구리 충진물을 10 cm 유리관 입구까지 채우는데, 이때 카드뮴 입자 사이의 빈 공간이 최소화되도록 연필 등으로 부드럽게 두드리며 집어넣는다. 최종적으로 충진된 환원관의 반대편 끝도 같은 방식으로 거즈로 막은 후 실리콘 튜브로 연결한다. 충진된 환원관의 정상 유속은 분당 약 10 mL 내외이다. 완성된 환원관은 항상 묽은 염화암모늄 용액으로 채워 놓는다.

5.5.3  환원 능력이 떨어지면 카드뮴 충진제를 비이커로 옮긴 후 2 N 염산으로 카드뮴 입자를 여러 번 세척(카드뮴 입자의 색이 회색으로 변할 때까지)한 다음 초순수로 여러 번 세척하여 잔여 염산을 제거한다. 이후 5.5항에 따라 재생하여 사용한다. 여러 번 반복하여 재생할 경우, 입자 크기가 작아질 수 있으므로 주의해야 한다.

5.6  술퍼닐아미드 용액: 술퍼닐아미드(C6H8O2ㆍN2S) 5 g을 용량 500 mL 비이커에 넣고 초순수 300 mL를 첨가한 다음 진한 염산 50 mL를 첨가하여 혼합하여 녹인 후 실온으로 냉각한 다음 용량 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500 mL로 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 넣어 보관하며, 수개월간 안정하다.

5.7  염화나프틸에틸렌디아민 용액 (N-(1-naphtyl) -ethylenediamine dihydrochloride): 염화나프틸에틸렌디아민(C12H14N2ㆍ2HCl) 0.5 g을 100 mL 비이커에 옮긴 다음 초순수 약 50 mL에 녹인 후 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500 mL로 한다. 이 용액은 차광용기에 넣어 냉장 보관(8 °C 이하)하며, 유효기간은 1개월 이상이다. 그러나, 용액이 갈색으로 변색된 경우에는 1개월 이전이라도 사용하지 않고 다시 만들어야 한다.

5.8  질산성질소 표준원액(20 mM): 저울병에 적당량의 질산칼륨(KNO3)을 취한 후 105 ∼ 110 °C 에서 약 4시간 건조한 후 데시케이터에서 방냉한다. 질산칼륨(Potassium nitrate, KNO3) 1.011 g을 정확히 취하여 500 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척(3회)한 다음 세척액을 부피플라스크에 옮긴다. 초순수를 첨가하여 최종부피를 500 mL로 한다.

5.9  질산성질소 표준용액: 질산성질소 표준원액(5.8항 20 mM)에서 1 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 정확히 100 mL를 맞춘다.

5.9.1  A형 환원관 컬럼 - 이 용액에서 다시 각각 1, 2, 5, 10 mL를 정확하게 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 100 mL 되게 한다. 이 용액은 시험 직전에 조제하며 이 용액은 질산성질소 농도가 2, 4, 10, 20 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다.

5.9.2  B형 환원관 컬럼 - 이 용액에서 다시 각각 0.20, 0.50, 1.0, 2.0 mL를 정확하게 취하여 30 mL 시험관에 옮긴 후 초순수 19.8, 19.5, 19.0, 18.0 mL을 추가하여 최종 20.0 mL가 되도록 한다. 이 용액은 시험 직전에 조제하며 질산성질소의 농도가 2.0, 5.0, 10, 20 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다.

5.10  정도관리용 표준인증물질(Certified Reference Material, CRM): National Research Counsil Canada에서 제공하는 moos 혹은 국내 정도관리 인정기관에서 제공하는 CRM.

6. 시료의 채취 및 보관

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소의 5. 시료의 채취 및 보관을 따른다.

7. 시험방법

7.1  검량선 작성

7.1.1  해수시료와 동시에 분석되어진 질산성질소 표준용액을 이용하여 정량 범위 내에서 4개 이상 농도의 표준용액을 만든다.

7.1.2  7.2항의 분석절차에 따라 분석한 후 질산성질소의 농도와 흡광도와의 관계선(검량선)을 작성한다. 이때 시료와 동일한 환원관 컬럼을 이용해야 한다.

7.2  분석절차

7.2.1  분석하기 전에 시료를 상온(15 ∼ 30 °C)으로 유지하도록 한다.

7.2.2  A형 환원관 컬럼

7.2.2.1  시료 100 mL를 100 mL 메스실린더로 취한 후 200 mL 삼각플라스크에 옮긴 다음 진한 염화암모늄 완충용액(5.1항) 2 mL를 첨가하고 혼합한다.

7.2.2.2  시료 약 30 mL를 환원관에 통과시켜 흘려보낸다.

7.2.2.3  나머지 시료를 환원관에 모두 부어 통과시키며, 환원관을 통과한 시료를 60 mL 시험관에 받은 다음 이 시료 50 mL를 정확히 취하여 별도의 시험관에 옮긴다. 환원관 통과 시간은 시료당 약 10분 정도 소요된다.

7.2.2.4  시료에 술퍼닐아미드 용액(5.6항) 1 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 2분간 반응시킨다.

7.2.2.5  염화나프틸에틸렌디아민 용액 1 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 10분 동안 반응시킨다.

7.2.2.6  발색된 시료를 10분 이상 2시간 이내에 분광광도계의 셀에 넣고 543 nm(혹은 540 nm)의 파장에서 흡광도를 측정한다.

7.2.3  B형 환원형 컬럼

7.2.3.1  시료 20 mL를 30 mL 유리시험관에 취한 후 진한 염화암모늄 완충용액(5.1항) 0.4 mL를 첨가하고 혼합한다.

7.2.3.2  시료 약 6 mL를 환원관에 통과시켜 흘려보낸다.

7.2.3.3  나머지 시료를 환원관에 통과시키며 그 중 시료 10 mL를 시험관에 받는다. 나머지 시료는 흘려버린다. 환원관 통과 속도는 분당 10 mL로 조절하며 시료당 약 2분 정도 소요된다.

7.2.3.4  시료에 술퍼닐아미드 용액(5.6항) 0.2 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 2분간 반응시킨다.

7.2.3.5  염화나프틸에틸렌디아민 용액 0.2 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 10분 동안 반응시킨다.

7.2.3.6  발색된 시료를 10분 이상 2시간 이내에 분광광도계의 셀에 넣고 543 nm(혹은 540 nm)의 파장에서 흡광도를 측정한다.

7.2.4  이전 시료가 고농도일 경우, 잔류영향(carryover effect)을 없애기 위해 다음 시료를 환원관에 통과시키기 전에 매번 약 20 mL의 묽은 염화암모늄 완충용액을 미리 통과시켜 환원관을 세척한다.

7.3  환원관의 효율검정

7.3.1  10 μM의 아질산성질소 표준용액을 진한 염화암모늄을 첨가한 후 환원관 통과를 제외한 7.2항의 나머지 분석절차에 따라 시험한 후 흡광도를 측정하며, 이러한 과정을 3회 반복하여 평균값을 구한다(A1).

7.3.2  10 μM의 아질산성질소 표준용액을 7.2항의 분석절차에 따라 시험한 후 흡광도를 측정하며, 이러한 과정을 3회 반복하여 평균값을 구한다(A2).

7.3.3  10 μM의 질산성질소 표준용액을 7.2항의 분석절차에 따라 시험한 후 흡광도를 측정하며, 이러한 과정을 3회 반복하여 평균값을 구한다(A3).

7.3.4  환원관의 과도한 환원 효율(E1)은 다음 식을 사용하여 계산한다.

과도한 환원효율(E1) = 100 × (A2 / A1)                 (식 7)

만일 이 환원 효율이 95 % 이하일 경우에는 아질산이 보존되지 않고 더 환원된 형태로 변화하는 것을 의미한다. 그러므로 환원관으로부터 카드뮴-구리 충진물을 적절히 덜어내어 다시 7.3.2항 과정을 반복한다. 이는 카드뮴-구리 충진물의 활성을 줄여 과도한 환원을 교정하기 위해서이다.

7.3.5  환원관의 불충분한 환원 효율(E2)은 다음 식을 사용하여 계산한다.

불충분한 환원효율(E2) = 100 × (A3 / A1)                (식 8)

만일 이 환원 효율이 95 % 이하일 경우에는 질산이 아질산으로 충분한 환원이 일어나지 않은 것을 의미한다. 그러므로, 새로운 카드뮴-구리 충진물의 양을 증가시키거나 시료 통과 속도를 조절하면서 95 % 이상의 환원 효율을 얻을 수 있도록 한다. 만일 이 비율이 95 % 보다 같거나 클 경우에는 환원관이 적당한 환원 효율을 유지하는 것으로 판단되므로 실험에 사용할 수 있다.

7.3.6  환원관의 효율은 측정 당일에 매번 확인해야 한다. 만일 카드뮴-구리 충진물이 부주의에 의해 건조되어 충진물의 색깔이 붉은색으로 변하거나 장기간의 사용으로 환원 효율의 저하가 확인되면 충진물을 꺼내어 다시 재활성화시킨다. 그래도 환원 효율의 검정에 문제가 지속되면 카드뮴-구리 충진물을 새로 만들어 사용해야 한다.

7.3.7  시료의 개수가 많아 분석 도중 카드뮴 환원관 효율이 떨어질 경우가 있으므로 시료 20개당 질산성질소 10 μM 농도의 표준용액 한 개를 분석하여 환원관 효율(E2)로부터 시료의 흡광도(A, absorbance)를 보정(A/E2)하여 준 후 표준물질의 검량선(표준용액의 흡광도 또한 환원관 효율로 보정한 값 사용)으로부터 농도를 구하도록 한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소의 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)를 따른다.

9. 결과

9.1  측정된 시료의 흡광도를 검량선을 이용하여 질산성질소의 농도( μM)로 환산한 후 이미 측정된 아질산성질소의 농도를 뺀다.

┌───────────────────────────┐

│                  A =  m ×  + b               (식 9) │

│                      =                  (식 10)      │

└───────────────────────────┘

            ; 본 실험에서의 질산성 및 아질산성질소 농도 (μM)

           A : 흡광도

           m : 흡광계수 (기울기)

           b : 절편

┌─────────────────────────┐

│         질산성질소의 농도 (μM) =         (식 11)│

└─────────────────────────┘

            : 본 실험에서 구한 질산성 및 아질산성질소의 농도 (μM)

            : 미리 측정되어진 시료 중의 아질산성질소 농도 (μM)

           질산성질소의 농도 변환 :  1 μM = 14 μg/L = 0.014 mg/L 

9.2  농도 계산에 사용된 검량선에 관련한 모든 자료를 제시한다.

  ① 표준물질 농도

  ② 흡광도

  ③ 검량선식

  ④ 흡광계수

  ⑤ 결정계수(R2)

  ⑥ 정확도

  ⑦ 정밀도

  ⑧ 환원관의 효율

10. 분석절차 흐름도

┌─────────┐                                          

│시료              │ 100 mL (20 mL)                           

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│삼각플라스크      │                                          

└─────────┘                                          

                       진한 염화암모늄 용액 2 mL (0.4 mL)       

┌─────────┐                                          

│혼합              │                                          

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│환원관 통과       │ 먼저 30 mL(6 mL) 혼합시료 환원관 통과    

│                  │                                          

│                  │ 나머지 혼합시료 환원관 통과              

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│시료 수집         │ 나머지 시료를 원래 시료플라스크에 수집   

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│환원관 통과한 시료│ 50 mL (10 mL)                            

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│시험관            │                                          

└─────────┘                                          

                       술퍼닐아미드 용액 1 mL (0.2 mL)          

┌─────────┐                                          

│혼합              │                                          

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│방치              │ 약 2 ∼ 8분간 방치                       

└─────────┘                                          

                       염화나프틸에틸렌디아민 1 mL(0.2 mL)      

┌─────────┐                                          

│혼합              │                                          

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│방치              │ 약 10분 이상 방치, 2시간 이내 측정       

└─────────┘                                          

┌─────────┐                                          

│흡광도 측정       │ 분광광도계 543 nm (혹은 540 nm)          

└─────────┘                                          

A형 환원컬럼 (B형 환원컬럼)

그림 2. 질산성질소 분석절차

제12항 암모니아성질소(Ammonium  Nitrogen,  NH4-N)

1. 측정원리

┌────────────────────────────────────┐

│  NH3 + H2O = NH4+ + OH-    (Kb = 1.8 × 10-5)                   (식 1) │

│  CT = NH3 + NH4+                                               (식 2)  │

│  ?                                           (식 3)                   │

├────────────────────────────────────┤

│  NH3 + HOCl = NH2Cl + H2O                                    (식 4)    │

│  NH4+ + OCl- = NH2Cl + H2O                                    (식 5)   │

├────────────────────────────────────┤

│                (식 6)                                                  │

├────────────────────────────────────┤

│      (식 7)                                                            │

└────────────────────────────────────┘

암모니아성질소는 해수 중에서 식 1과 같이 수화상태인 용존 암모니아(NH3)와 암모늄 이온(NH4+)으로 존재한다. 일반적으로 염분이 35이고, 수온이 25 °C인 해수의 pH가 7.6 ∼ 8.2 정도에서 식 3에 의해 94 ∼ 98 %가 양이온인 암모늄 이온의 형태로 대부분 존재한다(그림 1).

그림 1.  pH에 따른 해수 중 NH3와 NH4+의 조성비율

해수 중의 암모니아(NH3 + NH4+)는 염기성 차아염소산 용액과 산화 반응하여 모노크롤아민을 생성한다(식 4, 5 참조). 모노크롤아민은 페놀과 촉매인 니트로프러시드 그리고 과량의 차아염소산에 의해 푸른색의 인도페놀을 생성하게 된다(식 6, 7 참조). 이때 분광광도계 또는 자동분석기(autoanalyzer)로 최대 흡수파장인 640 nm에서 최종 발색된 인도페놀의 흡광도를 측정한다.

모노크롤아민은 pH 8 ∼ 11.5 사이에서 형성된다. 더 높은 pH에서는 암모니아가 아질산으로 불완전하게 산화된다. pH 9.6 이상의 시료에서는 마그네슘과 칼슘 이온이 금속수화물 또는 탄산염으로 침전될 수 있기 때문에 이를 방지하기 위하여 산화 단계 전에 구연산나트륨을 첨가하여 착화합물을 형성시킨다. 완전한 인도페놀 형성 반응을 위해서 산화반응 단계의 pH는 10.8 부근을 유지해야 하는데 만일 pH가 11.0을 과도하게 초과할 경우, 황녹색의 색깔이 나타나 분석의 오차가 발생할 수 있다. 해수시료의 염분 변화는 인도페놀의 발색 반응을 저해하므로 염분에 대한 보정이 필요하다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 질소(N)로서 0.01 ∼ 1.0 mg/L (0.713 ∼ 71.4 μM)이며, 정밀도는 변동계수로 2 ∼ 10 %이다. 이 방법의 검출한계는 1 cm cell 사용시 99 % 신뢰구간에서 0.003 mg N/L이다. 최종 발색된 용액의 흡광계수는 20,000 cm-1ㆍM-1 (1.42 cm-1ㆍ(mg/L)-1) ± 10 %이다.

3. 방해요인

3.1  지방족 아민류는 방해하지 않으나 방향족 아민류의 일부는 차아염소산염에 의해 산화되어 착색물질을 발생하므로 방해를 한다.

3.2  p-아미노페놀과 같은 물질은 알칼리성 용액에서 페놀과 반응하여 인도페놀 청색을 생성하므로 방해한다.

3.3  히드록실아민류도 방해를 하지만 적당량의 과산화수소를 첨가하여 산화하면 방해를 제거할 수 있다.

3.4  높은 pH(pH > 11)에서 암모니아는 아질산으로 불완전하게 산화된다.

3.5  10 ∼ 200 μM(2 ∼ 40 mg/L)의 수은(Ⅱ)이온은 인도페놀이 청색으로 발색되는것을 약 20 %까지 감소시키므로 분석을 방해하는 요소로 작용한다.

3.6  60 μM(1.92 mg/L)이상의 황화이온을 포함하는 시료는 희석해야 한다.

3.7  같은 양의 암모니아에 의해 생성된 인도페놀은 순수한 물보다 바닷물에서 더 작게 형성된다. 이것은 마그네슘 이온과 해수의 완충용량에 의해 pH에 기인한 것으로 추정된다.

3.8  염분에 의한 간섭: 해수시료는 기수역과 외해역 등에 따라 다양한 염분 변화를 보인다. 자연 해수시료의 염분 증가는 마그네슘 이온과 산염기 완충능력을 증가시켜 결과적으로 분석 시 인도페놀의 산화 반응 단계에서 최종 반응액의 pH를 보다 낮게 하여 인도페놀의 발색을 저해한다. 따라서 초순수를 검정용으로 사용하였을 경우, 다양한 해수시료의 염분 변화에 따른 농도계산의 보정이 필요하다.

3.9  실험 과정으로부터의 오염: 실험에 사용되는 모든 초자기구는 가급적 실험 직전에 세척하여 사용한다. 대기 중에는 암모니아 가스가 상당량 존재하므로 시료가 공기와 접촉 시간을 최소화하도록 하며, 그리고 각종 시약 및 표준용액 제조에 이용되는 초순수 또한 실험 직전에 제조된 것으로 사용하도록 한다. 실험실이 밀폐되어 있거나 대기 중 암모니아의 오염이 의심되는 경우에는 깨끗한 공기가 유통되는 곳에서 실험을 시행하도록 한다.

4. 기구 및 기기

4.1  시험 및 시약 용기: 20 mL 용량의 경질 유리 시험관 및 시약병 등 분석에 사용되는 모든 초자기구류 및 플라스틱 용기는 반드시 10 % (v/v) 염산 용액으로 세척한 후 암모니아에 의해 오염되지 않은 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 보관하거나 분석 반응 시 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 실험실 대기 환경으로부터의 암모니아 오염을 차단해야 한다.

4.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫 팁을 사용하는 것이 좋다.

4.3  와류혼합기(vortex mixer): 시료와 시약을 혼합할 때 사용한다.

4.4  항온조: 발색 반응 대기 시간(1시간)의 균일화를 위해 가능한 35 °C를 유지할 수 있는 항온수조 이용을 권장한다.

4.5  분광광도계(spectrophotometer): 대상으로 하는 해수 특성에 맞추어 적절한 cell(1 cm cell, 5 cm cell, 또는 10 cm cell)을 사용한다. 일반적으로 농도가 낮은 시료일수록 cell의 길이가 길어진다.

5. 시약 및 표준물질

5.1  초순수: 암모니아성질소 분석용 시약을 조제하기 위해서는 반드시 시험 2 ～ 3 시간 이전에 얻은 초순수를 사용해야 한다.

5.2  페놀(phenol)용액: 무색의 페놀(C6H5OH) 20 g을 500 mL 비이커에 옮긴 다음 메스실린더로 에틸알코올(95 % (v/v)) 200 mL를 첨가하여 녹인다. 이 용액은 유리용기에 유리 마개로 단단히 봉하여 보관하며, 수개월간 사용할 수 있다. 페놀용액은 휘발성이 강하여 인체에 유해하므로 공기순환이 원활한 장소나 후드 내에서 이루어져야 한다.

5.3  니트로프러시드 용액(Sodium nitroprusside dihydrate): 니트로프러시드나트륨[Na2Fe(CN)5NOㆍ2H2O, 예; Merck 106541.0100)을 옮기고 초순수 200 mL로 녹인다. 이 용액은 반드시 빛을 차단할 수 있는 차광용기에 보관해야 한다. 이 용액의 유효기간은 2 ～ 3개월 정도이다.

5.4  염기성 용액: 구연산나트륨(Sodium citrate tribasic dihydrate, Na3C6H5O7ㆍ2H2Oㆍ2H2O, 예; Sigma Aldrich 71404-1KG) 100 g과 수산화나트륨(NaOH) 5 g을 1,000 mL 비이커에 옮긴 다음 초순수 500 mL를 첨가하여 녹인다. 이 용액은 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 보관하며 매우 안정적이다.

5.5  차아염소산 용액(Sodium hypochlorite): 차아염소산나트륨(NaOCl, 1.5 N 혹은 유효염소농도 6 ～ 14 %) 또는 일반적으로 상용의 표백제(예, Chlorox) 등을 이용할 수 있으나 시간의 경과에 따라 점차 차아염소산의 유효농도(0.1 M의 NaOH용액 중 3.5 %의 염소농도 이상)가 낮아지기 때문에 가능한 새로운 시약을 분석 직전 구입하여 사용하거나 다음과 같이 티오황산나트륨 적정 시험을 통하여 유효농도에 대한 점검을 수시로 해야 한다.

5.5.1  0.1 N 티오황산나트륨 용액: 티오황산나트륨(Na2S2O3ㆍ5H2O) 12.5 g을 100 mL 비이커에 옮긴 후 소량의 초순수로 녹여 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 비이커를 3회 세척하여 세척액을 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 500 mL 되게 한다.

5.5.2  요오드화칼륨(KI) 2 g을 50 mL의 초순수에 녹인다.

5.5.3  5.4.2항의 용액에 차아염소산 용액 1.0 mL를 첨가한 후 혼합한다.

5.5.4  5.4.1항의 0.1 N 티오황산나트륨 용액으로 5.4.2항의 용액을 노란색이 사라질 때까지 적정한다. 0.1 N 티오황산나트륨 용액 1 mL는 3.54 mg의 유효염소에 해당되므로 적정량이 9 mL 이하인 차아염소산 용액은 활성이 저하되었으므로 사용해서는 안된다(적정에 소요된 티오황산나트륨 용액이 10 mL 이상이어야 함).

5.6  산화 용액: 산화 용액은 앞에서 만든 염기성 용액(5.3항) 100 mL와 차아염소산용액(5.4항) 25 mL(4:1의 비율)로 혼합하여 만든다. 이 혼합용액은 분석 직전 매번 새롭게 준비하여 사용한다.

5.7  암모니아성질소 표준원액(5 mM): 염화암모늄(Ammonium chloride, NH4Cl, 예; Merck 101145) 적당량을 105 ～ 110 °C에서 1시간 건조한 후 데시케이터에서 방냉한 다음 0.1337 g을 정확히 취하여 500 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척(3회)한 다음 세척액을 부피플라스크에 옮긴다. 초순수를 첨가하여 최종 부피를 500 mL로 한다.

5.8  암모니아성질소 표준용액: 암모니아성질소 표준원액(5.7항 5 mM)에서 1 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 정확히 100 mL를 맞춘다. 이 용액에서 다시 각각 0.10, 0.20, 0.60, 1.0, 2.0 mL를 취하여 20 mL 시험관에 옮긴 다음 초순수로 9.9, 9.8, 9.4, 9.0, 8.0 mL를 첨가하여 최종 10 mL가 되게 한다. 이 용액은 암모니아성질소 농도가 0.5, 1.0, 3.0, 5.0, 10.0 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다. 검량선용 표준용액 제조 시에도 공기와의 접촉을 최소화한다.

6. 시료의 채취 및 보관

6.1  해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소의 5항. 시료의 채취 및 보관을 따르지만, 아래의 사항을 준수해야 한다.

6.2  암모니아 분석용 시료는 여과지의 암모니아 오염 가능성 때문에 여과해서는 안 된다. 부유물질 등에 의한 혼탁도가 심한 시료는 원심분리 후 상등액을 취하여 분석한다.

6.3  만일 수시간 내에 분석이 불가할 경우, 페놀 용액(4.2항)을 시료에 1 : 25의 비율 (예, 페놀 용액 4 mL : 해수시료 100 mL)로 넣거나 또는 급속 냉동 보관 (-20    °C이하)한다. 이 경우, 15일 정도 보관이 가능하다.

7. 시험방법

7.1  검량선 작성

7.1.1  암모니아성질소 표준용액을 이용하여 정량 범위 내에서 4개 이상 농도의 표준용액을 만든다.

7.1.2  6.2항의 분석절차에 따라 분석한 후 암모니아성질소의 농도와 흡광도와의 관계선(검량선)을 작성한다.

7.2  분석절차

7.2.1  용량 20 mL 시험관에 10 mL의 시료를 정확히 취하고, 0.4 mL의 페놀 용액을 첨가한 후 혼합한다.

7.2.2  니트로프러시드 용액 0.4 mL를 첨가한 후 혼합한다.

7.2.3  산화 용액을 1 mL를 첨가한 후 혼합한다.

7.2.4  이상의 모든 시약이 순차적으로 혼합되고 나면 시험관을 마개 또는 밀봉 필름으로 봉한 후 항온조(37 ～ 40 °C)에 넣고 30분간 동안 발색시킨다. 만약 항온조를 갖추지 못한 경우, 15 ～ 30 °C에서 4시간 이상 발색시키도록 한다. 일단 발색된 시료는 30시간 정도 안정하다.

7.2.5  분광광도계의 셀에 넣고 640 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과

9.1  검량선으로부터 측정된 흡광도를 암모니아성질소의 농도(μM)로 환산한다.

9.2  검량선에 이용된 표준용액이 해수 이외의 용매로 만들어졌다면 다음과 같이 염분에 대해서 보정을 해준다.

A =  m ×  + b                           (식 8)

 =                              (식 9)

              : 본 실험에서의 암모니아성질소 농도( μM)

              A: 흡광도

              m: 흡광계수(기울기)

              b: 절편

염분 조정된 암모니아성질소의 농도(μM) =  × [1 + 0.0073 × (Ss ? S0)]   (식 10)

              : 검량선에서 구한 농도( μM)

              Ss: 시료의 염분, S0 : 표준용액의 염분 (초순수일 경우 S0=0),

              암모니아성질소의 농도 변환: 1 μM = 14  μg/L = 0.014 mg/L

9.3  농도 계산에 사용된 검량선에 관련한 모든 자료를 제시한다.

    ① 표준물질 농도

    ② 흡광도

    ③ 검량선식

    ④ 결정계수(R2)

    ⑤ 정확도

    ⑥ 정밀도

10. 분석절차 흐름도

┌──────┐                                          

│시료        │  10 mL                                   

└──────┘                                          

┌──────┐                                          

│시험관      │                                          

└──────┘                                          

                  페놀용액 0.4 mL                         

┌──────┐                                          

│혼합        │                                          

└──────┘                                          

                  니트로프러시드용액 0.4 mL               

┌──────┐                                          

│혼합        │                                          

└──────┘                                          

                  산화용액 1.0 mL                         

┌──────┐                                          

│방치        │  항온조(35 °C)에서 1시간 동안 방치      

│            │  또는 15 ∼ 30 °C에서 4시간 이상 방치   

└──────┘                                          

┌──────┐                                          

│흡광도 측정 │  분광광도계 640 nm                       

└──────┘                                          

그림 2. 암모니아성질소 분석절차

11. 참고사항

11.1  시료채취 해역의 염분이 기수역 등과 달리 시료의 염분 변화가 크지 않고 비교적 일정한 외해역 시료에 한하여 현장의 해수를 검정용 바탕용액으로 이용할 수도 있다. 이때, 암모니아를 완전히 제거하기 위해서는 표층해수를 채수, 여과하여 수산화나트륨 용액으로 pH를 13까지 높이고 부피가 70 %로 줄어들 때까지 끓인다. 그다음 초순수로 증발된 30 %만큼 보충하고 0.1 N 염산 용액으로 적정하여 중화시킨다.

이렇게 만들어진 검정용 해수는 초순수 대신 검정 과정(7.1 ∼ 7.6항)에 필요한 바탕용액으로 사용될 수 있다. 이 경우에는 8.2항에 언급된 염분 변화에 따른 보정이 필요하지 않다.

11.2  휘발성인 페놀 용액은 인체에 위해한 관계로 암모니아 분석 시험은 공기의 유통이 원활한 장소나 후드 내에서 이루어져야 한다. 한편, 암모니아는 대기로부터 이전되어 오염될 수 있기 때문에 암모니아 시료분석시 주변에 암모니아수(NH4OH) 등을 이용한 기타의 시험이 병행되지 않도록 실험실 환경에 주의가 필요하다.

11.3  미량의 암모니아 시료를 분석고자 할 때는 1 cm 셀보다 긴 5 cm 또는 10 cm 길이의 셀을 사용할 수 있다. 이 경우, 대체로 검출한계와 정밀도가 향상될 수 있다.

11.4  다수의 시료분석이 필요하거나 또는 현장에서 직접 측정할 경우, 이 방법과 측정원리가 같은 영양염 자동분석기(nutrient autoanalyzer)를 이용하는 것이 효율적이다. 다만, 자동분석기로 해수시료 중의 암모니아성질소를 측정할 경우, 감지기의 흐름셀(flow cell) 내부에서 시료의 염분 변화에 의해 발생되는 굴절률 변화가 흡광도에 영향을 주지 않아야 한다.

제13항 총질소(Total  Nitrogen,  TN)

1. 측정원리

시료 중의 암모니아성질소, 아질산성질소, 질산성질소, 유기성 질소, 입자성 질소 등을 120 °C에서 알칼리성 과황산칼륨으로 분해시켜 아래의 식과 같이 질산성질소로 산화시킨 후 카드뮴-구리 환원 컬럼을 통과시켜 질산이온을 아질산 이온으로 환원하여 비색 정량한다.

┌───────────────────────────────────┐

│   NO2-N, NO3-N, NH3-N, organic-N, particulate form                   │

│  + Alkaline oxidizer (K2S2O8 + H3BO3 + NaOH) → NO3-N          (식 1)│

│  NO3- + Cd + H2O → NO2- + Cd(OH)2                             (식 2)│

└───────────────────────────────────┘

2. 측정범위 및 정밀도

정량 범위는 0.003 ∼ 0.5 mg N/L(0.214 ∼ 35.7 μM)이며, 정밀도는 변동계수로 3 ∼ 10 %이다. 최종 발색된 용액의 흡광계수는 37,500 cm-1ㆍM-1 (2.68 cm-1ㆍ(mg/L)-1) ± 10 %이다.

3. 방해요인

이 방법은 약간 오염된 해수에 대해서도 이온 또는 화합물에 의한 방해가 없는 것으로 알려져 있다. 산소결핍 해수에 존재하는 황화수소는 150 μM(5.1 mg/L)까지 방해를 일으키지 않으며, 흑해에서 발견되는 것처럼 500 μM(17 mg/L)이상의 고농도로 황화수소가 검출되는 경우에는 과황산의 첨가량을 증가시켜야 하지만 현재까지는 명확한 연구가 되어 있지 않다.

4. 기구 및 기기

4.1  시험 및 시약 용기: 30, 50 mL 경질유리 시험관 및 시약병 등 분석에 사용되는 모든 초자기구류 및 플라스틱 용기는 반드시 10 % (v/v) 염산 용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다.

4.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

4.3  와류혼합기(vortex mixer): 시료와 시약을 혼합할 때 사용한다.

4.4  분광광도계(spectrophotometer): 대상으로 하는 해수 특성에 맞추어 적절한 cell(1 cm cell, 5 cm cell, 또는 10 cm cell)을 사용한다.

4.5  고압증기멸균기: 약 120 °C에서 가열이 가능한 것을 사용한다.

4.6  분해병: 용량 약 30, 100 mL의 내압ㆍ내열의 유리병 또는 테프론제 원심분리관

4.7  연동펌프(peristaltic pump): B형 환원관 이용시 사용한다(예; EYELA RP-1,000).

4.8  환원관(reduction column): 경질유리로 그림 1(제4장 제 11항 질산성질소 4.6 참고)과 같이 제작한다.

4.9  기타 아질산성질소 정량에 필요한 장치 및 기구

5. 시약 및 표준물질

5.1  0.075 M 수산화나트륨 용액: 수산화나트륨(NaOH, 예; Fluka 71691) 3 g을 1,000 mL 부피플라스크에 옮기고, 초순수 1,000 mL로 녹인다.

5.2  알칼리성 산화제: 과황산칼륨(Potassium persulfate, K2S2O8, 예; Merck 105092) 10 g과 붕소산(Boric acid, H3BO3, 예; Merck 100165) 6 g을 5.1항의 0.075 M 수산화나트륨 용액에 첨가하여 녹인다. 이때, 과황산칼륨 중의 총질소의 농도가 반드시 0.001 % 이하로 들어있는 시약을 사용해야 한다. 총질소의 농도가 테스트되지 않은 시약은 반드시 재결정시켜 사용해야 한다(5.3 참고). 이 용액은 폴리에틸렌 병에 넣어 냉암소에 보관하면 수주일 동안 안정하다.

5.3  과황산칼륨의 재결정: 총질소 분석을 위한 모든 시약들은 질소 농도 함유량을 검정한 후 사용해야 하며, 질소성분 함유량이 0.001 % 이하의 시약을 사용해야 한다. 특히, 과황산칼륨의 경우, 총질소로서의 농도가 0.001 %의 이하의 시약을 사용해야만 한다. 만약, 총질소의 농도가 0.001 % 이상의 농도일 경우, 재결정 과정을 반복하여 사용한다. 재결정 과정은 과황산칼륨 16 g을 70 ∼ 80 °C의 초순수 100 mL에 녹인 후 0 °C까지 냉각시킨다. 그리고, 여과한 다음 재결정은 무수염화칼슘 데시케이터 내에서 건조시킨다. 이때, 회수율은 약 80 %이다(이를 2 ∼ 3회 반복하여 재결정 과정을 거치면 총질소의 농도가 0.001 % 이하로 된다).

5.4  진한 염화암모늄 완충용액(Concentrated ammonium chloride buffer solution): 염화암모늄(NH4Cl) 134 g을 500 mL 비이커에 옮긴 다음 초순수 400 mL에 녹인 후 pH를 9.6 ± 0.1로 맞추기 위해서 진한 암모니수(25 %) 2 mL를 첨가한다. 이 용액을 폴리에틸렌병에 넣어 보관하며, 이 시약은 안정하다.

5.5  묽은 염화암모늄 완충용액(Dilute ammonium chloride buffer solution): 5.4항의 진한 염화암모늄 완충용액 25 mL를 분취하여 1,000 mL 부피플라스크에 옮긴 후 초순수로 1,000 mL 되게 한다.

5.6  카드뮴 입자: 환원관에 충진할 카드뮴 입자의 크기는 대략 직경 1 mm 내외(A 유리컬럼) 혹은 400 ～ 800 μM(20 ～ 40 mesh)(B 유리컬럼)이어야 하며 직접 제작하거나 상업적으로 제작되어 있는 것을 이용한다. 준비된 카드뮴 입자는 불순 산화물을 제거하기 위해 2 N 염산용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 세척하여 잔여 염산을 완전히 제거한다.

5.7  2 % (w/v) 황산구리용액: 황산구리(CuSO4ㆍ5H2O) 10 g을 200 mL 비이커에 옮기고 초순수로 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴 후 비이커를 소량의 초순수로 세척하고(3회 반복) 세척액을 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수를 첨가하여 500 mL로 맞춘다. 이 용액은 실온에서 안정하다.

5.8  카드뮴-구리 충진물 제작(카드뮴 입자에 구리를 흡착시킨 후, 구리가 다시 환원되지 않도록 주의해야함): 200 mL 비이커에 황산구리용액(5.7항) 100 mL를 첨가한 후 카드뮴 입자(5.6항) 약 50 g(A형 환원관 컬럼) 혹은 약 2 g(B형 환원관 컬럼)을 비이커에 넣은 다음 황산구리용액의 옅은 푸른색이 없어질 때까지 약 3분간 천천히 젓는다. 이때, 촉매 역할을 하는 구리가 충분히 흡착되면 카드뮴 입자(5.6항)는 검은색을 띠게 된다. 완성된 카드뮴-구리 충진물이 담긴 비이커에 남은 황산구리용액을 따라 버리고 초순수로 여러 번 세척하여 미세입자를 제거한 다음 묽은 염화암모늄 용액(5.5항) 약 100 mL를 첨가한다.

5.8.1  A형 환원관 컬럼 - 제작된 환원관(4.8항)의 하부에 가는 구리선을 이용하여 카드뮴 입자가 나가지 않도록 컬럼의 밑부분을 막은 다음 묽은 염화암모늄 용액(5.5항)을 채운다. 준비된 카드뮴-구리 충진물을 환원관의 약 20 cm 정도까지 채우는데, 이때 카드뮴 입자 사이의 빈 공간이 최소화되도록 연필 등으로 부드럽게 두드리며 집어넣는다. 최종적으로 충진된 환원관의 상부에 가는 구리선을 이용하여 윗마개를 만든다. 충진된 환원관의 정상 유속은 분당 약 10 mL 내외이다. 완성된 환원관은 항상 묽은 염화암모늄 용액으로 채워 놓는다.

5.8.2  B형 환원관 컬럼 - 카드뮴 입자가 실리콘 튜브로 새어나가지 않도록 유리관 한쪽 끝을 깨끗이 세척된 거즈 2 ∼ 3장으로 덮은 후 실리콘 튜브로 유리관을 연결한다. 준비된 카드뮴-구리 충진물을 10 cm 유리관 입구까지 채우는데, 이때 카드뮴 입자 사이의 빈 공간이 최소화되도록 연필 등으로 부드럽게 두드리며 집어넣는다. 최종적으로 충진된 환원관의 반대편 끝도 같은 방식으로 거즈로 막은 후 실리콘 튜브로 연결한다. 충진된 환원관의 정상 유속은 분당 약 10 mL 내외이다. 완성된 환원관은 항상 묽은 염화암모늄 용액으로 채워 놓는다.

5.8.3  환원 능력이 떨어지면 카드뮴 충진제를 비이커로 옮긴 후 2 N 염산으로 카드뮴 입자를 여러 번 세척(카드뮴 입자의 색이 회색으로 변할 때까지)한 다음 초순수로 여러 번 세척하여 잔여 염산을 제거한다. 이후 5.7항과 5.8항에 따라 재생하여 사용한다. 여러 번 반복하여 재생할 경우, 입자 크기가 작아질 수 있으므로 주의해야 한다.

5.9  술퍼닐아미드 용액: 500 mL 비이커에 초순수 약 400 mL에 진한 염산(약 37  %) 72 mL를 서서히 첨가한 후 실온으로 냉각한 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴 후 초순수로 비이커를 세척하고, 세척액을 부피플라스크로 옮긴 다음 초순수로 500 mL 되게 한다. 이 용액을 500 mL 비이커에 옮긴 후 술퍼닐아미드(C6H8O2ㆍN2S) 5 g을 이 용액에 녹여 유리병에 넣고 냉암소에 보관하면 수개월 동안 안정하다.

5.10  염화나프틸에틸렌디아민 용액: 해수공정시험기준 제4장 제11항 5.7.에 따른다[염화나프틸에틸렌디아민(C12H14N2ㆍ2HCl) 0.5 g을 100 mL 비이커에 옮긴 다음 초순수 약 50 mL에 녹인 후 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500 mL로 한다. 이 용액은 차광용기에 넣어 냉장보관(8 °C 이하)하며, 유효기간은 1개월 이상이다. 그러나 용액이 갈색으로 변색된 경우에는 1개월 이전이라도 새롭게 만들어야 한다.

5.11  질산성질소 표준원액(20 mM): 105 ～ 110 °C에서 약 4시간 건조되어진 후 충분히 방냉된 질산칼륨(Potassium nitrate, KNO3, 예; Merck 105065) 1.011 g을 정확히 취한 다음 500 mL 부피플라스크에 옮기고 초순수로 비이커를 세척(3회)한 다음 세척액을 부피플라스크에 따라 담은 후 최종 500 mL로 맞춘다.

5.11.1  질산성질소 표준용액(200 μM): 질산성질소 표준원액(5.11항 20 mM)에서 1 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 정확히 100 mL를 맞춘다.

5.11.1.1  A형 환원관 컬럼- 이 용액에서 다시 각각 2, 5, 10, 15 mL를 정확하게 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 100 mL 되게 한다. 이 용액은 시험 직전에 조제하며 이 용액은 질산성질소 농도가 4, 10, 20, 30 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다.

5.11.1.2  B형 환원관 컬럼- 이 용액에서 다시 각각 0.40, 1.0, 2.0, 3.0 mL를 정확하게 취하여 30 mL 시험관에 옮긴 후 초순수 19.6, 19.0, 18.0, 17.0 mL을 추가하여 최종 20.0 mL가 되도록 한다. 이 용액은 시험 직전에 조제하며 질산성질소의 농도가 4.0, 10, 20, 30 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다.

5.12  정도관리용 표준인증물질(Certified Reference Material, CRM): National Research Counsil Canada에서 제공하는 MOOS 혹은 국내 정도관리 인정기관에서 제공하는 CRM.

6. 시료의 채취 및 보관

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소의 5. 시료의 채취 및 보관을 따른다.

7. 시험방법

7.1  검량선 작성

7.1.1  5.11항의 표준용액을 이용하여 정량범위 내에서 4개 이상 농도의 표준용액을 만든다.

7.1.2  표준용액은 시료와 동일한 분석절차(7.2항)에 따라 분석한 후 최종적으로 환원되어진 아질산성질소의 농도와 흡광도와의 검량선을 작성한다. 이때, 표준용액은 시료와 동일한 환원관 컬럼을 이용하여 환원관 컬럼의 효율에 따른 차이를 없애야 한다.

7.2  분석절차

7.2.1  A형 환원관 컬럼

7.2.1.1  시료의 전처리: 상온(15 ～ 30 °C)으로 유지되어진 시료(검량선용 표준용액과 유기질소분해 검정용 표준용액 그리고 정도관리용 표준인증물질 포함) 50 mL를 100 mL 분해병에 옮긴 후 알칼리성 산화 용액 10 mL을 넣어 마개를 닫고 흔들어 섞은 다음, 깨끗한 알루미늄 호일로 여러 겹 싼 다음 고압증기 멸균기에 넣고 가열한다. 120 °C, 2기압이 될 때부터 30분간 가열 분해하고 꺼내어 실온으로 방냉한다.

7.2.1.2  전처리한 시료를 100 mL 부피플라스크에 옮기고, 분해병의 기벽을 증류수로 수회 씻어서 부피플라스크에 합한 다음 진한 염화암모늄 완충용액 2 mL를 첨가한 후 초순수로 100 mL되게 한다.

7.2.1.3  시료 약 30 mL를 환원관에 통과시켜 흘려보낸다.

7.2.1.4  나머지 시료를 환원관에 모두 부어 통과시키며, 환원관을 통과한 시료를 60 mL 시험관에 받은 다음 이 시료 50 mL를 정확히 취하여 별도의 시험관에 옮긴다. 환원관 통과 시간은 시료당 약 10분 정도 소요된다.

7.2.1.5  시료에 술퍼닐아미드 용액(5.9항) 1 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 2분간 반응시킨다.

7.2.1.6  염화나프틸에틸렌디아민 용액 1 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 10분 동안 반응시킨다.

7.2.1.7  발색된 시료를 10분 이상 2시간 이내에 분광광도계의 셀에 넣고 543 nm(혹은 540 nm)의 파장에서 흡광도를 측정한다.

7.2.2  B형 환원형 컬럼

7.2.2.1  시료의 전처리: 상온(15 ～ 30 °C)으로 유지되어진 시료(검량선용 표준용액과 유기질소 분해 검정용 표준용액 그리고 정도관리용 표준인증물질 포함) 20 mL를 30 mL 분해병에 옮긴 후 알칼리성 산화용액 4 mL을 넣어 마개를 닫고 흔들어 섞은 다음, 깨끗한 알루미늄 호일로 여러 겹 싼 다음 고압증기 멸균기에 넣고 가열한다. 120 °C, 2기압이 될 때부터 30분간 가열 분해하고 꺼내어 실온으로 방냉한다.

7.2.2.2  전처리한 시료에 진한 염화암모늄 완충용액(5.4항) 0.4 mL를 첨가하고 혼합한다.

7.2.2.3  시료 약 6 mL를 환원관에 통과시켜 흘려버린다.

7.2.2.4  나머지 시료를 환원관에 통과시키며 그중 시료 10 mL를 시험관에 받는다. 나머지 시료는 흘려버린다. 환원관 통과 속도는 분당 10 mL로 조절하며 시료당 약 2분 정도 소요된다.

7.2.2.5  시료에 술퍼닐아미드 용액(5.9항) 0.2 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 2분간 반응시킨다.

7.2.2.6  염화나프틸에틸렌디아민 용액 0.2 mL를 첨가하고 혼합한 후 약 10분 동안 반응시킨다.

7.2.2.7  발색된 시료를 10분 이상 2시간 이내에 분광광도계의 셀에 넣고 543 nm(혹은 540 nm)의 파장에서 흡광도를 측정한다.

7.2.3  이전 시료가 고농도일 경우, 잔류 영향(carryover effect)을 없애기 위해 다음 시료를 환원관에 통과시키기 전에 매번 약 20 mL의 묽은 염화암모늄 완충용액을 미리 통과시켜 환원관을 세척한다.

7.3  환원관 효율검정

해수공정시험기준 제4장 제11항(질산성질소) 7.3항의 환원관 효율검정에 따른다.

7.3.1  10 μM의 아질산성질소 표준용액을 진한 염화암모늄을 첨가한 후 환원관 통과를 제외한 7.2항의 나머지 분석절차에 따라 시험한 후 흡광도를 측정하며, 이러한 과정을 3회 반복하여 평균값을 구한다(A1).

7.3.2  10 μM의 아질산성질소 표준용액을 7.2항의 분석절차에 따라 시험한 후 흡광도를 측정하며, 이러한 과정을 3회 반복하여 평균값을 구한다(A2).

7.3.3  10 μM의 질산성질소 표준용액을 7.2항의 분석절차에 따라 시험한 후 흡광도를 측정하며, 이러한 과정을 3회 반복하여 평균값을 구한다(A3).

7.3.4  환원관의 과도한 환원 효율(E1)은 다음 식을 사용하여 계산한다.

과도한 환원효율(E1) = 100 × (A2 / A1)                 (식 3)

만일, 이 환원 효율이 95 % 이하일 경우에는 아질산이 보존되지 않고 더 환원된 형태로 변화하는 것을 의미한다. 그러므로, 환원관으로부터 카드뮴-구리 충진물을 적절히 덜어내어 다시 7.3.2항 과정을 반복한다. 이는 카드뮴-구리 충진물의 활성을 줄여 과도한 환원으르 교정하기 위해서이다.

7.3.5  환원관의 불충분한 환원효율(E2)은 다음 식을 사용하여 계산한다.

불충분한 환원효율(E2) = 100 × (A3 / A1)               (식 4)

만일, 환원효율이 95 % 이하일 경우에는 질산이 아질산으로 충분한 환원이 일어나지 않은 것을 의미한다. 그러므로, 새로운 카드뮴-구리 충진물의 양을 증가시키거나 시료 통과 속도를 조절하면서 95 % 이상의 환원 효율을 얻을 수 있도록 한다. 환원효율이 95 % 보다 같거나 클 경우에는 환원관이 적당한 환원효율을 유지하는 것으로 판단되므로 실험에 사용할 수 있다.

7.3.6  환원관의 효율은 측정 당일에 매번 확인해야 한다. 카드뮴-구리 충진물이 부주의에 의해 건조되어 충진물의 색깔이 붉은색으로 변하거나 장기간의 사용으로 환원효율의 저하가 확인되면 충진물을 꺼내어 다시 재활성화시킨다. 그래도 환원효율의 검정에 문제가 지속되면 카드뮴-구리 충진물을 새로 만들어 사용해야 한다.

7.3.7  시료의 개수가 많아 분석 도중 카드뮴 환원관 효율이 떨어질 경우가 있으므로 시료 20개당 질산성질소 10 μM 농도의 표준용액 한 개를 분석하여 환원관 효율(E2)로부터 시료의 흡광도(A, absorbance)를 보정(A/E2)한 후 표준물질의 검량선(표준용액의 흡광도 또한 환원관 효율로 보정한 값 사용)으로부터 농도를 구하도록 한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소의 7. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과

9.1  검량선으로부터 측정된 흡광도를 총질소의 농도(μM)로 환산한다.

A =  m × CTN + b                          (식 5)

CTN =                             (식 6)

                  CTN : 시료에서의 총질소 농도 (μM)

                  A : 흡광도

                  m : 흡광계수 (기울기)

                  b : 절편

9.2  농도 계산에 사용된 검량선에 관련한 모든 자료를 제시한다.

① 표준물질 농도

② 흡광도

③ 검량선식

④ 결정계수(R2)

⑤ 정확도

⑥ 정밀도

⑦ 환원관의 효율

⑧ 유기질소의 분해효율

10. 분석절차 흐름도

A형 환원관 컬럼 (B형 환원관컬럼)

┌──────────┐                                              

│시료                │ 50 mL(20 mL)                                 

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│분해병              │                                              

└──────────┘                                              

                         알칼리성 산화용액 10 mL(4 mL)                

┌──────────┐                                              

│가열                │ 120 °C, 30분간 가열                         

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│방냉                │ 실온으로 방냉                                

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│전처리한 시료       │                                              

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│100 mL 부피플라스크 │                                              

└──────────┘                                              

                         진한 염화암모늄 완충용액 2 mL(0.4 mL)        

┌──────────┐                                              

│표선 채움           │ 100 mL까지 채움(전처리된 용액 그대로 사용)   

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                            │

│환원관 통과         │                                              

└──────────┘                                              

                         처음 30 mL(6 mL) 시료는 환원관 통과 후 제거  

┌──────────┐                                              

│시료 수집           │                                              

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│환원관 통과한 시료  │ 50 mL(10 mL)                                 

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│시험관              │                                              

└──────────┘                                              

                         술퍼닐아미드 용액 1 mL(0.2 mL)               

┌──────────┐                                              

│혼합                │                                              

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│방치                │ 약 2 ∼ 8분간 방치                           

└──────────┘                                              

                         염화나프틸에틸렌디아민 1 mL(0.2 mL)          

┌──────────┐                                              

│혼합                │                                              

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│방치                │ 약 10분 이상 방치, 2시간 이내 측정           

└──────────┘                                              

┌──────────┐                                              

│흡광도 측정         │ 분광광도계 543 nm 혹은 540 nm                

└──────────┘                                              

그림 1. 총질소 분석절차

제14항 용존 총질소(Dissolved  Total  Nitrogen,  DTN)

1. 측정원리

해수시료 중 용존질소화합물(용존무기질소 및 용존유기질소)을 고온에서 알카리성 용액에서 과황산칼륨으로 분해하여 질산성질소로 산화시킨 다음 카드뮴-구리 환원컬럼을 통과시켜 질산이온을 아질산이온으로 환원하여 비색 정량한다. 이 방법은 비교적 분해되기 쉬운 유기물을 함유하고 있는 시료에 적용된다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 0.003 ∼ 0.5 mg N/L(0.214 ∼ 35.7 μM), 표준편차는 3 ∼ 10 % 이다.

3. 기구 및 기기

3.1  분광광도계

3.2  고압증기멸균기: 약 120 °C에서 가열이 가능한 것

3.3  분해병: 용량 약 30, 100 mL의 내압ㆍ내열의 유리병 또는 마개 있는 테프론제 원심분리관

3.4  카드뮴-구리 환원 컬럼: 해수공정시험기준, 제4장 제11항 4.5에 따라 환원컬럼을 준비한다

3.5  기타 아질산성질소 정량에 필요한 장치 및 기구

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 제13항 총질소의 시약과 동일하다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  해수공정시험기준 제10항 아질산성질소의 5항(시료의 채취, 보관 및 전처리)를 따르며, 여과 및 전처리 방법은 아래와 같다.

5.2  시료는 채수 즉시 현장에서 유리섬유 여과지(GF/F)로 여과하여 여액 약 200 mL를 유리 또는 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 넣어 마개를 단단히 하고, 4 °C의 냉암소 혹은 급속동결하여 보관하고 가능한 빠른 시간내에 분석한다. 특히, 대기 중으로부터 암모니아가 녹아들어가지 않도록 주의한다. 현장에서 여과하지 못할 경우, 4시간 이내에 냉장상태에서 실험실로 옮겨 여과한 후 동결 보관한다.

5.3  시료의 전처리: 시료를 제13항 총질소의 전처리방법(7.2항)에 따라 시험한다.

6. 시험방법

위의 5.3항에서 전처리한 용액을 이용하여 제13항 총질소와 동일하게 검량선 작성, 환원관 효율검정 및 분석절차 등에 따라 시험한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리를 따른다.

8. 결과

결과보고는 제13항 총질소와 동일한 방법으로 한다.

제15항 인산염인(Phosphate  Phosphorus,  PO4-P)

1. 측정원리

해수시료 중의 인산이온은 산성 조건에서 몰리브덴산 암모늄과 타타르산안티모닐칼륨과 반응하여 안티모닐-인산몰리브덴 착화합물(antimony-phosphomolybdate compl-ex)을 형성한다. 이 착화합물은 아스코르브산에 의해 환원되어 짙은 청색을 띠게 된다.

이 용액을 분광광도계 또는 자동분석기(autoanalyzer)로 최대 흡수파장인 885 nm에서 최종 발색된 용액의 흡광도를 측정한다. 신속한 발색과 규산염의 방해를 감소시키기 위해 최종 반응과정에서의 pH는 반드시 ≤ 1이어야 한다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 인(P)으로서 0.001 ∼ 0.8 mg P/L(0.01 ∼ 28 μM)이며, 정밀도는 변동계수로 2 ∼ 10 % 이다. 최종 발색된 용액의 흡광계수는 22,000 cm-1ㆍM-1 (0.71 cm-1ㆍ(mg/L)-1) ± 10 % 이다.

3. 방해요인

3.1  해수시료에 동시에 존재하는 구리, 철, 그리고 규산염은 자연 해수에서 보고되어진 것보다 몇 배 높은 농도에서도 간섭을 보이지 않는다. 극단적으로 높은 철은 인산의 침전을 일으켜 방해를 일으킬 수 있다.

3.2  염분에 의한 오차는 1 % 이내로 알려져 있다.

3.3  해수에서의 비소(+5가) 농도는 0.01 ∼ 0.1 μM(0.7 ∼ 7 μg/L) 수준이다. 시료 중에 존재하는 비소(As)는 인산이온과 같이 발색되어지나 일반적인 해수에서의 비소 농도로는 인산 분석에 있어서 간섭을 일으키지 않는다.

3.4  시료 중에 비소(As)의 농도가 최대 200 μg/L 정도 존재하면 티오황산나트륨을 첨가하여 환원제로 사용한다. 하지만, 이러한 방법은 해양환경공정시험법에 게재된 실험법과는 다른 발색법

 Method of Seawater Analysis (1983) 제9.1.3항, 131페이지 Johnson (1971), Environ.. Sci. Technol., 5:411-414

을 이용하므로 별도의 실험 조건을 따라야 하며, 또한 발색이 10 % 정도 저해되므로 보정을 해야 한다.

3.5  높은 탁도는 방해를 일으키므로 꼭 여과하여 분석하도록 한다.

4. 기구 및 기기

4.1  시험 및 시약 용기: 20, 50 mL 경질유리 시험관 및 시약병 등 분석에 사용되는 모든 초자기구류 및 플라스틱 용기는 반드시 10 % (v/v) 염산 용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 세척시 상업용 세제는 절대 사용하지 않는다.

4.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

4.3  와류혼합기(vortex mixer): 시료와 시약을 혼합하기 위하여 사용한다.

4.4  분광광도계(spectrophotometer): 적어도 분광범위가 근적외선인 900 nm까지 가능해야 한다.

5. 시약 및 표준물질

5.1  몰리브덴산암모늄 용액(Ammonium heptamolybdate tetrahydrate): 몰리브덴산암모늄 [(NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 예; Sigma-Aldrich A7302] 3 g을 일정량의 초순수로 녹인 다음 최종부피를 100 mL로 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 넣어 암소에서 보관하면 수개월간 사용할 수 있다.

5.2  황산 용액(Sulfuric acid): 500 mL 비이커에 초순수 200 mL를 넣고, 진한 황산(H2SO4) 50 mL를 천천히 첨가하면서 유리막대로 저어 준 다음 냉각시킨 후 유리용기에 보관한다.

5.3  아스코르브산 용액(Ascorbic acid): 아스코르브산(C6H8O6, 예; Calbiochem, 1831)

5.4 g을 100 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 최종부피를 100 mL로 한다. 이 용액은 유리 또는 플라스틱 용기에 넣어 냉장보관하며, 유효기간은 일주일 이내이다. 실온에서 보관할 경우, 일주일 정도 사용할 수 있으며, 냉동보관할 경우, 수개월 사용할 수 있다.

그림 1. 아스코르브산의 산화환원 반응

5.4  타르타르산안티모닐칼륨 용액(Potassium antimonyl tartrate sesquihydrate): 타르타르산안티모닐칼륨([K(SbO)C4H4O6]ㆍ1/2H2O, 예; Merck 108092) 0.34 g을 300 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 최종 부피를 250 mL로 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 보관하며 유효기간은 수개월이다.

5.5  혼합용액: 몰리브덴산암모늄 용액(5.1항) 100 mL와 황산용액(5.2항) 250 mL, 아스코르브산 용액(5.3항) 100 mL, 주석산안티모닐칼륨 용액(5.4항) 50 mL를 메스실린더를 이용하여 순차적으로 첨가하면서 충분히 혼합한 후 다음 시약을 섞는다. 이 혼합용액은 분석 직전에 매번 새롭게 준비하여 사용하며, 분석 시료의 수에 따라 상기의 비율로 혼합하면 된다. 이 용액은 6시간 이상 보관할 수 없다.

5.6  인산염인 표준원액(5 mM): 저울병에 적당량의 인산이수소칼륨(Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 예; Showa Chemicals 1645-6150)을 취한 후 105 ∼ 110 °C에서 약 4시간 건조한 후 데시케이터에서 방냉한다. 건조한 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.3402 g을 정확히 취하여 500 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척(3회)한 다음 세척액을 부피플라스크에 옮긴다. 초순수를 첨가하여 최종 부피를 500 mL로 한다.

5.7  인산염인 표준용액: 인산염인 표준원액(5.6항 5 mM)에서 1 mL를 취하여 100  mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 정확히 100 mL를 맞춘다. 이 용액에서 0.20, 0.60, 1.0, 2.0 mL를 취하여 20 mL 시험관에 옮긴 다음 초순수로 각각 9.8, 9.4, 9.0, 8.0 mL를 추가하여 최종 10.0 mL가 되게 한다. 용액은 인산염인 농도가 1.0, 3.0, 5.0, 10.0 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다. 그러나, 지역특성상 표준용액의 농도는 조절할 수 있다.

5.8  정도관리용 표준인증물질(Certified Reference Material, CRM): National Resear-ch Counsil Canada에서 제공하는 MOOS 혹은 국내 정도관리 인정기관에서 제공하는 CRM.

6. 시료의 채취 및 보관

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 5. 시료의 채취 및 보관의 내용을 따른다. 이 경우, 15일 정도 보관이 가능하다.

7. 시험방법

7.1  검량선 작성

7.1.1  인산염인 표준용액을 이용하여 정량범위 내에서 4개 이상의 표준용액(5.7항)을 만든다.

7.1.2  표준용액은 시료와 동일한 분석절차(7.2항)에 따라 분석한 후 인산염인 농도와 흡광도의 검량선을 작성한다.

7.2  분석절차

7.2.1  20 mL 시험관에 시료 10 mL를 정확히 취하고 혼합용액 1.0 mL를 첨가한 후 발색시킨다.

7.2.2  실온(20 ∼ 30 °C)에서 반응 후 10분 이상 2시간 이내에 분광광도계의 셀에 넣고 885 nm(혹은 880 nm)의 파장에서 흡광도를 측정한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과

9.1  검량선으로부터 측정된 흡광도를 인산염인의 농도(μM)로 환산한다.

A =  m ×  + b                          (식 1)

 =                             (식 2)

                  : 본 실험에서의 인산인 농도 (μM)

                 A : 흡광도

                 m : 흡광계수 (기울기)

                 b : 절편

9.2  농도계산에 사용된 검량선에 관련한 모든 자료를 제시한다.

① 표준물질 농도

② 흡광도

③ 검량선식

④ 결정계수(R2)

⑤ 정확도

⑥ 정밀도

10. 분석절차 흐름도

┌───────┐                                                    

│적당량의 시료 │ 10 mL                                              

└───────┘                                                    

┌───────┐                                                    

│시험관        │                                                    

└───────┘                                                    

                   혼합용액 1.0 mL                                    

┌───────┐                                                    

│혼합          │                                                    

└───────┘                                                    

┌───────┐                                                    

│방치          │ 20 ∼ 40 °C, 약 10분 이상 방치, 2시간 이내 측정   

└───────┘                                                    

┌───────┐                                                    

│흡광도 측정   │ 분광광도계 885 nm(혹은 880 nm)                     

└───────┘                                                    

그림 2. 인산염인 분석절차

제16항 총인(Total  Phosphorus,  TP)

1. 측정원리

시료 중의 용존, 입자형태, 무기 또는 유기형태의 모든 인화합물을 과황산칼륨(K2S2O8)으로 산화분해하여 인산인(PO4-P)형태로 변화시킨다. 해수시료 중의 인산 이온은 산성조건에서 몰리브덴산암모늄과 타타르산안티모닐칼륨과 반응하여 안티모닐-인산몰리브덴 착화합물(antimony-phosphomolybdate complex)을 형성한다. 이 착화합물은 아스코르브산에 의해 환원되어 짙은 청색을 띠게 된다. 이 색은 용액 중의 인산염인 농도에 비례하여 진하고, 색이 진할수록 빛을 많이 흡수한다. 빛이 흡수된 정도를 이용하여 총인의 농도를 구한다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 인(P)으로서 0.001 ∼ 0.8 mg P/L(0.01 ∼ 28 μM)이며, 정밀도는 변동계수로 2 ∼ 10 % 이다. 최종 발색된 용액의 흡광계수는 18,000 cm-1ㆍM-1 (0.58 cm-1ㆍ(mg/L)-1) ± 10 % 이다.

3. 방해요인

해수공정시험기준 제4장 제15항(인산염인) 3항의 방해 요인과 동일하다.

4. 기구 및 기기

4.1  초자기구 및 분석 용기: 시료 보관 및 분석에 이용하는 모든 용기는 희석염산으로 세척하여 증류수로 수차례 초순수로 헹구어 사용하고 세척시 인을 함유한 상업용 세제는 사용하여서는 안 된다.

4.2  분광광도계: 분광범위가 근적외선인 900 nm까지 가능한 것.

4.3  고압증기멸균기: 약 120 °C에서 가열이 가능한 것.

4.4  분해병: 용량 약 30 mL의 내압ㆍ내열의 마개가 있는 테프론제 원심분리관.

4.5  기타 인산염인 정량에 필요한 장치 및 기구.

5. 시약 및 표준물질 

5.1  4 % (w/v) 과황산칼륨 용액(Potassium persulfate): 과황산칼륨(K2S2O8, 예; Merck 105092) 4 g을 100 mL 비이커에 옮긴 다음 초순수에 녹인 후 100 mL 부피플라스크에 옮긴다. 비이커를 3회 세척 하여 부피플라스크에 옮긴 후 초순수로 100 mL 되게 한다. 단, 시약을 녹일 때는 60～ 70 °C의 열수에서 녹인다.

5.2  몰리브덴산암모늄 용액(Ammonium heptamolybdate tetrahydrate): 몰리브덴산암모늄 [(NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 예; Sigma-Aldrich A7302] 3 g을 일정량의 초순수로 녹인 다음 최종부피를 100 mL로 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 넣어 암소에서 보관하면 수개월간 사용할 수 있다.

5.3  황산용액(Sulfuric acid): 500 mL 비이커에 초순수 200 mL를 넣고, 진한 황산(H2SO4) 50 mL를 천천히 첨가하면서 유리막대로 저어 준 다음 냉각시킨 후 유리용기에 보관한다.

5.4  아스코르브산 용액(Ascorbic acid): 아스코르브산(C6H8O6, 예; Calbiochem, 1831) 5.4 g을 100 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 최종 부피를 100 mL로 한다. 이 용액은 유리용기 또는 플라스틱 용기에 넣어 냉장보관하며, 유효기간은 일주일 이내이다. 실온에서 보관할 경우, 일주일 정도 사용할 수 있으며, 냉동보관할 경우, 수개월 사용할 수 있다.

5.5  타타르산안티모닐칼륨 용액(Potassium antimonyl tartrate sesquihydrate, CASRN 28300-74-5): 타타르산안티모닐칼륨(K(SbO)C4H4O6]ㆍ1/2H2O, 예; Merck 108092) 0.34 g을 300 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 최종 부피를 250 mL로 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 보관하며 유효기간은 수개월이다.

5.6  혼합용액: 몰리브덴산암모늄 용액(5.1항) 100 mL와 황산 용액(5.2항) 250 mL, 아스코르브산 용액(5.3항) 100 mL, 주석산안티모닐칼륨 용액(5.4항) 50 mL를 메스실린더를 이용하여 순차적으로 첨가하면서 충분히 혼합한 후 다음 시약을 섞는다. 이 혼합용액은 분석 직전에 매번 새롭게 준비하여 사용하며, 분석시료의 수에 따라 상기의 비율로 혼합하면 된다. 이 용액은 6시간 이상 보관할 수 없다.

5.7  인산염인 표준원액(5 mM): 저울병에 적당량의 인산이수소칼륨(Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 예; Showa Chemicals 1645-6150)을 취한 후 105   ～ 110 °C에서 약 4시간 건조한 후 데시케이터에서 방냉한다. 건조한 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.3402 g을 정확히 취하여 500 mL 비이커에 옮기고 일정량의 초순수로 녹인 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척(3회)한 다음 세척액을 부피플라스크에 옮긴다. 초순수를 첨가하여 최종 부피를 500 mL로 한다.

5.8  인산염인 표준용액: 인산염인 표준원액(5.7항 5 mM)에서 1 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 정확히 100 mL를 맞춘다. 이 용액에서 0.20, 0.60, 1.0, 2.0 mL를 취하여 20 mL 시험관에 옮긴 다음 초순수로 각각 9.8, 9.4, 9.0, 8.0 mL를 추가하여 최종 10.0 mL가 되게 한다. 용액은 인 농도가 1.0, 3.0, 5.0, 10.0 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다. 그러나, 조사 해역의 특성을 고려하여 표준용액의 농도범위는 조절할 수 있다.

6. 시료의 채취 및 보관

6.1  시료채취 및 보존방법은 해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 5.시료의 채취 및 보관을 따른다. 이 경우, 15일 정도 보관이 가능하다.

6.2  전처리: 시료 10 mL를 30 mL 분해병에 취하고, 4 % 과황산칼륨용액 2 mL를 가한 후 은박지로 봉하여 고압증기멸균기에서 가열한다. 약 120 °C가 될 때부터 30분간 가열 분해하고 분해병을 꺼내 방냉한다.

7. 시험방법

7.1  검량선 작성

7.1.1  인산염인 표준용액을 이용하여 정량범위 내에서 4개 이상의 표준용액(5.8항)을 만든다.

7.1.2  표준용액은 시료와 동일한 분석절차(7.2항)에 따라 분석한 후 최종 산화된 인산염인 농도와 흡광도의 검량선을 작성한다.

7.2  분석절차

7.2.1  전처리한 시료의 pH를 점검하여 pH가 5 ∼ 9를 벗어날 경우에는 10 % (v/v) 황산 용액 또는 10 % (v/v) 수산화나트륨 용액으로 시료의 pH를 7.0 ± 0.2로 조절한다.

7.2.2  시료가 투명하지 않을 경우, 원심분리(혹은 여과)한 다음 상등액 10 mL를 정확히 취하여 시험관에 옮기고, 혼합용액(5.6항) 1.0 mL를 첨가한 다음 혼합하여 발색시킨다(반응온도: 20 ∼ 40 °C).

7.2.3  발색된 시료를 15분간 방치한 다음 2시간 이내에 분광광도계의 흡수셀을 이용하여 885 nm(또는 880 nm)에서 흡광도를 측정한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소의 7. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과

9.1  검량선으로부터 측정된 흡광도를 총인의 농도(μM)로 환산한다.

A =  m ×  + b                          (식 1)

 =                               (식 2)

여기서,           : 본 실험에서의 인산 인 농도 (μM)

                 A : 흡광도

                 m : 흡광계수 (기울기)

                 b : 절편

9.2  농도계산에 사용된 검량선과 관련된 모든 자료를 제시한다.

① 표준물질 농도

② 흡광도

③ 검량선식

④ 결정계수(R2)

⑤ 정확도

⑥ 정밀도

10. 분석절차 흐름도

┌───────┐                                                    

│시료          │ 10 mL                                              

└───────┘                                                    

┌───────┐                        ┌────────────┐

│분해병        │                        │  전처리                │

└───────┘                        │  인화합물     인산염인 │

                   4 % 과황산칼륨용액 2 mL│                        │

┌───────┐                        └────────────┘

│가열          │ 120 °C가 될 때부터                                

│              │ 고압증기멸균기에서 30분간 가열                     

└───────┘                                                    

┌───────┐                                                    

│방냉          │ 실온으로 방냉                                      

└───────┘                                                    

┌───────┐                                                    

│전처리한 시료 │ 혼탁한 경우, 상등액 10 mL                          

└───────┘                                                    

┌───────┐                                                    

│시험관        │                                                    

└───────┘                                                    

                   혼합용액 1 mL                                      

┌───────┐                        ┌────────────┐

│혼합          │                        │  인산염인 정량         │

└───────┘                        │       총인으로 환산    │

                                          │                        │

┌───────┐                        └────────────┘

│방치          │ 20 ∼ 40 °C, 약 10분 이상 방치,                   

│              │ 2시간 이내 측정                                    

└───────┘                                                    

┌───────┐                                                    

│흡광도 측정   │ 분광광도계 885 nm(혹은 880 nm)                     

└───────┘                                                    

그림 1. 총인 분석절차

11. 참고사항

11.1  전처리한 시료의 상등액이 탁할 경우에는 유리섬유 여과지(GF/F)로 여과하여 여액을 사용한다.

11.2  시료를 5.2에서와 같이 전처리한 후 영양염류 자동분석기를 이용하여 인산염 인 분석과 동일한 방법으로 분석하거나 혹은 총인 자동분석기를 이용할 수 있다.

11.3  과황산칼륨 분해법은 Menzel 등(1965)의 방법으로 다수의 시료를 동시에 간편하게 분석 가능한 이점이 있다. 이 방법은 다른 방법보다 산화력이 약하지만 일반 하천, 호소 및 해수를 대상으로 하는 경우, 대부분의 인을 정량할 수 있다.

11.4  고압증기멸균기는 세균 시험에 일반적으로 이용하는 것을 사용해도 좋다.

11.5  시료를 신속히 분해할 수 없을 경우에는 황산 또는 염산으로 대략 pH 2 정도로 조정하고 냉동보관하는 것이 좋다.

제17항 용존 총인(Dissolved  Total  Phosphorus,  DTP)

1. 측정원리

시료 중의 유기물을 과황산칼륨으로 산화 분해하여 용존 인화합물을 인산염(PO4) 형태로 변화시킨 다음 인산염인을 아스코르브산환원 흡광광도법으로 정량하여 총인의 농도를 구하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 인(P)으로서 0.001 ∼ 0.025 mg P/L(0.032 ∼ 0.807 μM)이며, 정밀도는 변동계수로 2 ∼ 10 % 이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구 및 분석 용기: 제16항 참조

3.2  분광광도계

3.3  고압증기멸균기: 제16항 4.3과 같은 것

3.4  분해병: 제16항 4.4와 같은 것

3.5  기타 인산염인 정량에 필요한 장치 및 기구

4. 시약 및 표준물질

제16항 총인의 5. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료의 보존

시료는 채수 즉시 유리섬유 여과지(GF/F)로 여과하여 여액 약 200 mL를 유리 또는 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 넣은 후 시료수 1 L당 진한 염산 1 mL를 첨가하거나 혹은 첨가하지 않고 마개를 단단히 한 다음 4 °C의 냉암소 혹은 급속 동결하여 보관하고 가능한 빠른 시간내에 분석한다. 특히 낮은 농도의 시료를 냉동하지 않고, 플라스틱 용기에 보존할 경우, 용기벽에 흡착할 우려가 있으므로 주의를 요한다. 현장에서 여과하지 못할 경우, 4시간 이내에 냉장상태에서 실험실로 옮겨 여과한 후 동결 보관한다.

5.2  시료의 전처리

위와 같이 전처리한 시료 10 mL를 제16항 총인의 시료 전처리 방법에 따라 시험한다.

6. 시험방법

위의 전처리액을 가지고 제16항 총인의 시험방법에 따라 시험한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제16항 총인의 8. 정도평가/정도관리을 따른다.

8. 참고사항

제16항 총인의 참고사항 참조

제18항 규산염(Reactive  Silicate,  Si(OH)4)

1. 측정원리

해수시료 중의 규산염은 일차적으로 몰리브덴산과 반응하여 몰리브덴산 착화합물을 형성한다. 이때, 시료 중에 포함되어 있는 인산염도 몰리브덴산과 반응하여 몰리브덴산 착화합물을 형성할 수 있다. 시료에 몰리브덴산 착화합물이 형성된 후 이차적으로 메톨과 옥살산으로 조성된 환원 용액을 첨가하면 규소몰리브덴산은 환원되어 푸른색의 규소몰리브덴산 착화합물을 생성하게 된다. 한편, 환원 용액에 함유되어 있는 옥살산은 잉여 몰리브덴산의 환원을 방지하고 시료 중에 포함될 수도 있는 인산과 비소(As)의 몰리브덴산 착화합물들을 분해하여 간섭 효과를 제거하는 역할을 한다. 최종적으로 발색된 용액의 흡광도를 분광광도계 또는 자동분석기(autoanalyzer)로 최대흡수파장인 810 nm에서 측정한다. 이 방법에 있어서 염분 변화는 푸른색의 규소몰리브덴산 착화합물 형성을 저해하여 푸른색의 발색을 감소시켜 몰흡광계수가 낮아진다. 따라서, 염분 변화가 심한 해수시료의 경우, 염분에 대한 보정이 필요하다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 검량선의 직선성 영역의 140 μM 이하에서 적용되므로 유효측정범위는 1 cm cell 사용시 규소(Si)로서 0.003 ∼ 3.932 mg Si/L(0.1 ∼ 140.0 μM)이며, 정밀도는 7.2 μM에서 ± 0.1 μM이다. 용액의 흡광계수는 11,000 cm-1ㆍM-1 (0.39 cm-1ㆍ(mg/L)-1) ± 10 % 이다.

3. 방해요인

3.1  반응온도는 18 ∼ 25 °C 사이를 유지해야 한다. 25 °C 이상에서는 규소몰리브덴 착화합물이 분해되므로 주의해야 된다.

3.2  환원시약 첨가전에 규소와 몰리브덴산이 결합해야 하며(10분이면 반응하기에 충분한 시간임), 30분 이상 반응시킬 경우, 규소-몰리브덴 착화합물이 이성체를 형성하므로 반응시간은 30분을 초과하지 말아야 한다.

3.3  하구역과 같이 염분 변화가 심한 곳에서는 염분에 대한 오차가 발생한다. 이러한 시료에 대해서는 아래의 식으로 염분을 보정해 줘야 한다. 염분(S)과 흡광도(D) 사이의 관계(D = 1 - 0.0044 S)를 이용하여 보정해 준다.

4. 기구 및 기기

4.1  시험 및 시약 용기: 30 mL 플라스틱 시험관 및 시약병 등은 반드시 0.1 N 염산용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다.

4.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫 팁을 사용하는 것이 좋다.

4.3  와류혼합기(vortex mixer): 시료와 시약을 혼합하기 위하여 사용한다.

4.4  분광광도계(spectrophotometer): 적어도 분광범위가 근적외선인 900 nm까지 가능해야 한다.

5. 시약 및 표준물질

5.1  몰리브덴산 용액: 파라몰리브덴산암모늄(Ammonium heptamolybdate tetrahydrate, (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 예; Sigma-Aldrich A7302) 4 g을 500 mL 플라스틱 비이커에 옮긴 후 초순수 약 300 mL에 녹인 다음 진한 염산(12 N, 비중 1.18) 12 mL 첨가하고 혼합한 다음 500 mL 부피플라스크에 옮긴 후 비이커를 3회 세척하여 세척액을 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 500 mL 되게 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 넣어 암소에서 보관하면 수개월간 사용할 수 있다.

5.2  메톨-무수아황산나트륨 용액(Metol anhydrous sodium sulphite solution): 무수아황산나트륨(Na2SO3, 예; Merck 106657) 6 g을 600 mL 플라스틱 비이커에 옮긴 다음 초순수 500 mL를 500 mL 플라스틱 메스실린더로 첨가하여 녹인다. 여기에 메톨(metol: p-methylaminophenol sulfate, 예; Junsei 83600-1201) 10 g을 첨가한 후 혼합한 다음 여과지(5C, 110 mm)로 걸러 플라스틱 용기에 보관한다. 이 용액은 분석 직전 매번 새롭게 만든다.

5.3  옥살산 용액(Oxalic acid solution): 옥살산[(COOH)2ㆍ2H2O, 예; Merck 100495)] 50 g을 200 mL 플라스틱 비이커에 옮긴 다음 초순수에 녹여 500 mL 플라스틱 부피플라스크에 옮긴다. 초순수로 비이커를 세척(3회)한 후 세척액을 부피플라스크에 옮긴 후 초순수로 500 mL 되게 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 넣어 실온에서 보관하며, 매우 안정하다.

5.4  50 % (v/v) 황산 용액: 600 mL 플라스틱 비이커에 초순수 250 mL를 플라스틱 메스실린더를 이용하여 첨가하고, 진한 황산(H2SO4) 250 mL를 플라스틱 메스실린더를 이용하여 서서히 첨가하면서 플라스틱 막대로 저어준다. 용액을 실온으로 식힌 후 플라스틱 용기에 보관한다.

5.5  환원 용액: 100 mL 플라스틱 메스실린더를 이용하여 메톨-무수아황산나트륨 용액(5.2항) 100 mL와 옥살산 용액(5.3항) 60 mL를 500 mL 플라스틱 비이커에 옮겨 혼합한다. 여기에 50 % (v/v) 황산 용액(5.4항) 60 mL를 서서히 첨가하여 혼합한 다음 실온으로 냉각시킨다. 이 용액을 500 mL 플라스틱 메스실린더에 옮긴 다음 소량의 초순수로 비이커를 세척(3회)한다. 세척액을 플라스틱 부피플라스크에 넣고, 초순수로 최종용액이 300 mL가 되도록 혼합한다. 이 혼합용액은 분석 직전 매번 새롭게 준비하여 사용한다.

5.6  규산염 표준원액(5 mM): 불화규소나트륨(Sodium hexafluorosilicate, NaSiF6, 예; Fluka 71595) 적당량을 저울병에 취한 후 105 ∼ 110 °C에서 미리 건조하여 데시케이터에서 방냉한다. 건조된 불화규소나트륨(NaSiF6) 0.9403 g을 정확히 취하여 1,000 mL 플라스틱 비이커에 옮긴 다음 적당량의 초순수로 녹인다. 이 용액을 1,000 mL 플라스틱 부피플라스크에 옮긴 후 비이커를 초순수로 세척(3회)하여 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 최종 부피를 1,000 mL되게 한다. 갈색의 플라스틱 용기에 보관한다.

5.7  규산염 표준용액: 규산염 표준원액(5.6항 5 mM)에서 1 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴 다음 초순수로 정확히 100 mL를 맞춘다. 이 용액에서 0.4, 1.0, 2.0, 4.0 mL를 취하여 20 mL 시험관에 옮긴 다음 초순수로 각각 9.6, 9.4, 9.0, 8.0, 6.0 mL를 추가하여 최종 10.0 mL가 되게 한다. 용액은 규산염 규소 농도가 2.0, 5.0, 10.0, 20.0 μM인 표준용액이 되며 검량선 작성에 사용한다. 그러나, 지역특성상 표준용액의 농도는 조절할 수 있다.

5.8  정도관리용 표준인증물질(Certified Reference Material, CRM): National Research Counsil Canada에서 제공하는 MOOS 혹은 국내 정도관리인정기관에서 제공하는 CRM.

6. 시료의 채취 및 보관

6.1  시료채취 및 보존방법은 해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 5. 시료의 채취 및 보관을 따른다. 이 경우, 15일 정도 보관이 가능하다.

6.2  저염분(15 이하) 혹은 규산염의 농도가 매우 높은(120 μM 이상) 시료는 급속냉동시 중합반응을 일으키므로 24시간 이상 정치한 후 냉동보관해야 한다. 따라서,이러한 시료의 경우는 규산염 분석용 시료를 별도로 채취하여 보관해야 한다.

6.3  염분이 18이상인 연안 시료를 냉동한 후 해동하여 시료를 실온에서 하룻밤 방치하면 아래의 표 1과 같이 98.86 ∼ 103.92 %의 회수율을 얻을 수 있으므로 아래의 방법 중 가장 안정한 방법으로 해동하여 시료로 사용한다. 단, 염분이 약 3 정도인 시료를 해동 후 아래의 표 1과 같이 다양한 환경에서 방치할 경우, 79.10 ∼ 93.81 %를 보여 하천수의 영향을 받는 기수역 시료는 가능한 당일 분석하는 것을 원칙으로 해야 한다. 그러나 기수역의 경우, 규소의 농도가 매우 높기 때문에 이러한 과소 평가 부분에 대해서는 별도의 검정이 필요할 것이다.

6.4  유리용기로부터 미량의 규산염이 용출될 수 있으므로 규산염 분석을 위한 모든 시료병과 시약병 등 사용 용기는 반드시 플라스틱 재질이어야 한다.

표 1. 경과일에 따른 시료의 해동과 그 회수율

┌───┬─────────────┬──┐

│경과일│회수율 (%)                │비고│

│      ├─────────────┤    │

│      │S=35.85   S=18.07   S=2.86│    │

├───┼─────────────┼──┤

│0     │100.00    100.00    100.00│    │

│      │                          │    │

│7     │102.44    102.65    89.37 │a   │

│      │                          │    │

│14    │98.59     101.06    86.49 │a   │

│      │                          │    │

│21    │99.51     99.30     83.49 │a   │

│      │                          │    │

│27    │98.86                     │a   │

│      │                          │    │

│      │          98.86     91.43 │b   │

│      │                          │    │

│35    │98.70                     │b   │

│      │                          │    │

│      │          98.66     92.98 │b   │

│      │                          │    │

│42    │100.87                    │b   │

│      │                          │    │

│49    │          102.44    79.12 │c   │

│      │                          │    │

│      │          103.92    79.10 │d   │

│      │                          │    │

│      │          99.92     89.68 │e   │

│      │                          │    │

│56    │103.47                    │c   │

│      │                          │    │

│      │104.12                    │d   │

│      │                          │    │

│      │99.35                     │e   │

│      │                          │    │

│84    │          100.80    91.71 │f   │

│      │                          │    │

│      │          99.90     93.81 │g   │

│      │                          │    │

│91    │100.65                    │f   │

│      │                          │    │

│      │100.22                    │g   │

└───┴─────────────┴──┘

   S = 염분

   a ; 실온에서 하룻밤 방치,    b ; 실온에서 20시간 방치

   c ; 실온에서 24시간 방치,    d ; 16시간 동안 80 °C로 가열 후 실온에서 8시간 방치

   e ; 실온 암소에서 24시간 방치,    f ; 실온 암소에서 4일간 방치

   g ; 암소의 냉장고(4 °C)에서 4일간 방치

7. 시험방법

7.1  검량선 작성

7.1.1  규산염 표준용액을 이용하여 정량 범위 내에서 4개 이상의 농도에 대해 표준용액을 만든다.

7.1.2  표준용액은 시료와 동일한 분석절차(7.2항)에 따라 분석한 후 규산염 농도와 흡광도의 검량선을 작성한다.

7.2  분석과정

7.2.1  30 mL 시험관에 시료 10 mL를 첨가한 후 몰리브덴산 용액(4.1항) 4 mL를 첨가 혼합하고 약 10분간 반응시킨다.

7.2.2  환원 용액(4.5항) 6 mL를 첨가한 후 즉시 혼합하여 약 2 ～ 3시간 동안 반응시킨다.

7.2.3  분광광도계의 셀에 넣고 810 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과

9.1  검량선으로부터 측정된 흡광도를 규산염의 농도(μM)로 환산한다.

A =  m ×  + b                            (식 1)

 =                                (식 2)

           : 본 실험에서의 규산 규소 농도 (μM)

          A : 흡광도

          m : 흡광계수 (기울기)

          b : 절편

염분 보정되어진 규산염의 농도 (μM) =  × (1 + 0.0033 × 염분)     (식 3)

여기서     : 검량선에서 구한 농도 (μM)

9.2  농도계산에 사용된 검량선과 관련한 모든 자료를 제시한다.

① 표준물질 농도

② 흡광도

③ 검량선식

④ 결정계수(R2)

⑤ 정확도

⑥ 정밀도

10.  분석절차 흐름도

┌──────┐                        

│시료        │ 10 mL                  

└──────┘                        

┌──────┐                        

│시험관      │                        

└──────┘                        

                 몰리브덴산 용액 4 mL   

┌──────┐                        

│혼합        │                        

└──────┘                        

┌──────┐                        

│방치        │ 약 10분간 방치         

└──────┘                        

                 환원 용액 6 mL         

┌──────┐                        

│혼합        │                        

└──────┘                        

┌──────┐                        

│방치        │ 2 ∼ 3시간 동안 방치   

└──────┘                        

┌──────┐                        

│흡광도 측정 │ 분광광도계 810 nm      

└──────┘                        

그림 1. 규산염 분석절차

제19항 영양염 자동분석법(Nutrient  Autoanalysis)

1. 측정원리

연속흐름분석법(Continous Flow Analysis, CFA)은 분석 항목별 발색시약을 관 내부에 흘려 넣고 공기에 의해 규칙적으로 분절한 후 시료를 순차적으로 넣어 혼합코일을 통과하면서 혼합반응시켜 발색되어진 것을 검량용액의 색과 비교하여 시료의 농도를 결정하는 것이다. 이 방법은 해양공정시험기준에 분석항목 중 일반 분석항목인 NH4+-N, NO2--N, NO3--N, PO43--P, Si(OH)4-Si, 총질소, 그리고 총인에 대해 이용되어질 수 있다.

연속흐름분석법에는 용액의 흐름 사이에 공기를 주입하여 시료의 분산 및 연속흐름에 따른 시료간의 상호 오염을 방지하는 분할흐름분석기(Segmented Flow Analyzer, SLA)과 공기를 주입하기 않아 분석 시간이 빠르고 기계장치가 상대적으로 단순한 흐름주입분석기(Flow Injection Analyzer, FIA)가 이용되어질 수 있다. 특정 해역에서는 농도 변화가 클 경우, 해수시료간 상호 오염의 영향이 있을 수 있으므로 이 영향을 제거하기 위해 해수시료의 경우, 분할흐름분석기(SFA)가 권고된다.

2. 측정범위 및 정밀도

연속흐름분석법(CFA)에서는 관을 통과하면서 시간의 지연효과가 있으나, 충분한 시간이 확보되지 않아 불완전한 발색이 되기는 하나 농도에 비례하는 발색을 보이므로 농도계산은 가능하다.

분석기기에 따라서는 발색된 최종 시료의 흡광도를 잴 때 사용되는 셀(cell)의 너비, 불충분한 발색시간 등의 요인에 따라 관측 가능한 농도범위가 변하게 된다. 그러므로, 실험실에 세팅된 특정 회사의 분석장비에 대해 각 분석 항목별로 분석장비 회사에서 제공된 매뉴얼에 따라 최소 5회 이상의 정도관리 실험을 수행하여 동일 실험 조건에서의 측정 가능한 농도범위, CRM 혹은 RM을 이용한 정확도, 정밀도, 검출한계, 및 정량한계 등의 값을 확보하도록 한다. 이러한 초기 정도관리 작업이 끝나면 시료 분석에 들어가도록 하며, 시료를 분석할 때마다 표준용액을 이용하여 검량선의 기울기나 중간농도 표준용액의 흡광도가 기존 값의 10 % 변동 범위 내에 들어야 하며, 만약 이 범위 내에 들지 않을 경우, 그 원인을 파악하도록 한다.

3. 기구 및 기기

3.1  영양염 자동분석기(Nutrient autoanalyzer)

4. 시약 및 표준물질

분석장비의 제조사에서는 장비와 함께 각 분석 항목별로 시약의 제조 방법과 운영방법에 대해 상세한 매뉴얼을 제공하고 있으며, 이에 따라 시약과 표준용액을 제조하도록 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

모든 시료의 채취 보존 및 전처리는 각 분석항목별로 수작업으로 하는 분석법(10항 ∼ 18항)과 동일하게 수행한다.

6. 시험방법

위의 4. 시약 및 표준물질과 같이 제조된 시약을 기기에 세팅하고 표준용액과 시료를 자동시료주입기(autosampler)에 삽입한 후 작동을 시작한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리를 따른다.

8. 결과

결과보고는 제10항 아질산성 질소와 동일한 방법으로 한다.

9. 참고사항

9.1  기기관리

분석 전후에도 분석장비 회사가 제공하는 매뉴얼에 따라 기기 관리를 적절히 수행해야 하며, 최소한 다음과 같은 사항은 꼭 검토 및 확인하도록 한다.

9.1.1  분석 전 관리

(1) 본체와 sampler가 정상 작동 확인

(2) 초순수를 이용한 세척

(3) 공기 방울의 간격 확인

(4) 램프가 정상 작동 확인

(5) 동일 농도에서의 baseline 및 gain값 확인

9.1.2  분석 후 관리

(1) 탈 이온수로 20분간 세척

(2) 1주일에 한 번 1 N HCl로 20분간 세척

(3) 본체에서 액체를 완전히 제거

9.2  이 방법 이외의 분석 방법으로 분석하고자 할 경우, 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제20항 시안(Cyanides,  CN)

1. 측정원리

pH 2 이하의 산성에서 에틸렌디아민테트라초산나트륨을 넣고 가열 증류하여 시안화물 및 시안착화합물의 대부분을 시안화수소로 유출시키고 수산화나트륨 용액에 포집한다. 포집된 시안이온을 중화하고 클로라민 T를 넣어 염화시안으로 만든 후 피리딘-피라졸론 혼합 용액을 넣어 나타나는 청색을 620 nm에서 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 방법의 유효측정범위는 검출한계에서 0.50 mg CN/L까지이다. 일반적인 검출한계는 1 cm 셀 사용시 99 % 신뢰구간에서 0.01 mg CN/L이며 표준편차율은 약 2 ∼ 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  분광광도계(spectrophotometer)

3.2  증류장치

┌┬────────────────────┐

││                                        │

││  A : 1 L 증류플라스크  B : 연결관      │

││                                        │

││  C : 콕크              D : 안전깔때기  │

││                                        │

││  E : 분리관            F : 냉각관      │

││                                        │

││  G : 역류방지          H : 수기        │

││                                        │

││  I : 접합부            J : 볼접합부    │

││                                        │

││  K : 집게                              │

││                                        │

└┴────────────────────┘

그림 1. 시안분석 증류장치

4. 시약 및 표준물질

4.1  0.5 % 페놀프탈레인 에틸알코올 용액: 페놀프탈레인(C20H14O4) 0.5 g을 95 % (v/v) 에틸알코올 50 mL에 녹인 후 증류수를 넣어 100 mL로 한다.

4.2  10 % 술퍼민산암모늄 용액: 술퍼민산암모늄(NH2SO3NH4) 10 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.3  에틸렌디아민테트라초산이나트륨(EDTA) 용액: 에틸렌디아민테트라초산이나트륨(2수화물)[(CH2COO)2NCH2CH2N(CH2COO)ㆍH2Na2ㆍ2H2O] 10 g을 80 mL 정도의 증류수에 가열하며 녹인 후 100 mL로 만든다.

4.4  1 % 클로라민 T 용액: 클로라민 T(3수화물) [CH3C6H4SO2NCLNaㆍ3H2O] 1.25  g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다. 이 용액은 측정 당일 매번 새롭게 만든다.

4.5  피리딘-피라졸론 혼합 용액: 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론(C10H10N2) 0.25 g을 75 °C의 증류수 100 mL에 녹이고 방냉한 다음 Bis[1-페닐-3-메틸-5 피라졸론(C20H18O2N4)] 0.02 g을 피리딘(C5H5N)에 녹인 용액 20 mL와 혼합한다. 이 용액은 측정 당일 매번 새롭게 만든다.

4.6  시안이온 표준용액(0.001 mg CN-/ mL): 시안화칼륨(KCN) 2.51 g을 정확히 취해 적량의 증류수로 녹여 정확히 1,000 mL로 한다. 이 용액을 정확히 1 mL 취하여 증류수로 정확히 1,000 mL로 한다.

4.7  인산염 완충액(pH 6.8): 인산이수소칼륨(KH2PO4) 3.4 g 과 무수인산일수소나트륨(Na2HPO4) 3.55 g을 증류수에 녹여 1,000 mL로 한다.

4.8  2 % 수산화나트륨 용액: 수산화나트륨(NaOH) 2 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료 100 mL(시안으로서 0.05 mg 이하)를 취하여 500 mL 증류플라스크에 넣고 증류수를 넣어 약 250 mL로 한다.

5.2  지시약으로 페놀프탈레인 에틸알코올 용액(0.5 % (w/v)) 2 ～ 3방울을 넣고 인산 또는 2 % 수산화나트륨 용액을 사용하여 중화한 후 증류장치를 조립한다.

5.3  시안 증류장치의 주입깔때기를 통하여 술퍼민산암모늄 용액(10 % (w/v)) 1 mL와 인산 10 mL 및 에틸렌디아민테트라초산이나트륨 용액 10 mL를 넣고 수분간 방치한 다음 증류플라스크를 가열하여 매분 2 ～ 3 mL의 유출 속도로 증류를 행한다.

5.4  수기는 미리 2 % 수산화나트륨 용액 20 mL를 넣어둔 마개 있는 100 mL 매스실린더를 사용하여 수기 중의 액량이 90 mL가 되었을 때 증류를 끝내고, 냉각기를 떼어내어 냉각기의 안쪽을 소량의 증류수로 세척한 후 증류수를 넣어 정확히 100 mL로 한다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료 20 mL를 정확히 취하여 50 mL 용량 플라스크에 넣고 지시약으로 페놀프탈레인 에틸알코올 용액(0.5 % (w/v) 한 방울을 넣어 조용히 흔들어 주면서 용액의 적색이 없어질 때까지 초산용액(1 + 8)을 넣는다(약 1 mL 소요).

6.2  인산완충액(pH 6.8) 10 mL, 클로라민 T 용액(1 % (w/v)) 0.25 mL를 넣고 마개를 막아 조용히 섞는다. 약 5분간 방치하고 피리딘-피라졸론 혼합 용액 15 mL를 넣고 증류수를 넣어 표선을 채운 다음 조용히 섞고 25 °C의 수욕 중에서 30분간 방치한다.

6.3  위 용액의 일부를 1 cm 셀에 옮겨 620 nm에서 흡광도를 측정하고 시안의 농도와 흡광도의 검정관계식으로부터 시안의 농도(mg CN/L)를 산출한다.

7. 결과

증류수 20 mL를 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕용액으로 한다. 시안이온 표준용액(0.001 mg CN/mL) 1 ～ 10 mL를 단계적으로 취하여 50 mL 용량 플라스크에 넣고 증류수를 넣어 20 mL로 한 다음, 시료의 시험방법에 따라 시험하여 시안의 농도와 흡광도의 검량선식을 결정한다.

8. 참고사항

8.1  다량의 유지류가 함유된 시료는 초산 또는 수산화나트륨 용액으로 pH 6 ～ 7로 조절하고 시료의 2 %에 해당되는 노말-헥산 또는 클로로포름을 넣어 짧은 시간 동안 흔들어 섞고 수층을 분리하여 시료로 취한다.

8.2  황화물이 함유된 시료는 초산아연 용액(10 % (w/v) 2 mL를 넣어 제거한다. 이 용액 1 mL는 황화물 약 14 mg에 대응한다.

8.3  이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은, 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제21항 불소(Fluoride,  F)

1. 측정원리

란탄과 알리자린 콤플렉손의 착화합물이 불소 이온과 반응하여 생성하는 청색의 복합 착화합물의 흡광도를 620 nm의 파장에서 측정하는 방법이다. 알루미늄 및 철의 방해가 크나 증류하면 영향이 없다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 방법의 유효측정범위는 검출한계에서 2.0 mg F/L까지이다. 일반적인 검출한계는 1 cm 셀 사용시 99 % 신뢰구간에서 0.1 mg F/L이며, 표준편차율은 약 3 ∼ 10     % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  분광광도계(spectrophotometer)

3.2  증류장치

그림 1. 불소 증류장치

3.3  백금접시

3.4  데시케이터

4. 시약 및 표준물질

4.1  0.5 % 페놀프탈레인 에틸알코올 용액: 페놀프탈레인(C20H14O4) 0.5 g을 에틸알코올 50 mL에 녹인 후 증류수를 넣어 100 mL로 한다.

4.2  10 % 수산화나트륨 용액: 수산화나트륨(NaOH) 10 g을 증류수 50 mL에 녹여 100 mL로 한다. 녹인 후 증류수를 넣어 100 mL의 용액을 만든다.

4.3  란탄 용액: 산화란탄(La2O3) 0.163 g을 2 N 염산(HCl)용액 10 mL에 녹인다.

4.4  란탄-알리자린 콤플렉손 용액: 3,4-디히드록시안트라키노닐-2-메틸이민-이초산(C19H15NO8) 0.192 g을 암모니아수(NH4OH)(1+10) 4 mL와 20 % 초산암모늄 용액 4 mL에 녹이고 초산나트륨(CH3COONaㆍ3H2O) 41 g을 증류수 400 mL에 녹여 초산(CH3COOH) 24 mL와 순차적으로 혼합한다. 이 용액에 아세톤 400 mL를 혼합한 후 란탄 용액 10 mL를 천천히 가하여 혼합하고 방냉한다. 초산 또는 암모니아수로 이 용액의 pH를 4.7로 조절한 후 증류수로 1,000 mL로 한다.

4.5  황산은 용액: 황산은(Ag2SO4) 11 g을 황산(H2SO4)에 녹여 정확히 1,000 mL로 한다.

4.6  불소이온 표준원액(1,000 mg F/L): 불화나트륨(NaF)을 백금접시에 넣어 500 ～ 550   °C에서 40 ～ 50분간 가열하고 황산 데시케이터 안에서 방냉한 다음 불화나트륨 2.21 g을 정확히 취하여 증류수에 녹여 1,000 mL로 한다.

4.7  불소이온 표준액(2 mg F/L): 1 mL의 불소이온 표준원액(1,000 mg F/L)을 증류수로 채워 500 mL가 되게 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  1,000 mL 증류플라스크에 증류수 400 mL를 넣고 플라스크 벽을 따라 황산 200 mL를 조심스럽게 가한 다음 흔들어 섞고 유리구 10여 개를 넣은 후 증류장치를 연결한다. 증류플라스크를 가열하여 180 °C가 될 때까지 증류하고 유출액은 버린다(8.1항).

5.2  증류플라스크를 100 °C 이하로 냉각한 다음 시료 300 mL를 서서히 넣어 흔들어 섞고 다시 증류장치에 연결하여 위와 같은 방법으로 증류한다(8.2항).

5.3  유출액은 500 mL 매스플라스크에 받아 증류수를 넣어 일정한 용량으로 맞추고 농도계산시 시료 용량을 보정해 준다. 증류플라스크에 들어 있는 황산은 오염이 축적되어 불소 측정에 방해를 주지 않는 한 계속해서 사용할 수 있다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료 적당량(30 mL 이하로서 불소 0.05 mg 이하 함유)을 50 mL 용량 플라스크에 취하여 란탄-알리자린 콤플렉손 용액 20 mL를 넣고 증류수를 넣어 표선까지 채우고 흔들어 섞은 다음 약 1시간 방치한다.

6.2  이 용액의 일부를 1 cm 셀에 옮겨 시료로 하고, 따로 증류수 30 mL를 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕용액으로 한다. 바탕용액으로 영점을 조정하여 620 nm에서 시료의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검정관계식을 이용하여 불소 이온의 농도(mg F/L)를 산출한다.

7. 결과

불소이온 표준액(2 mg F/L) 2 ∼ 25 mL를 단계적으로 취하여 50 mL 용량플라스크에 넣고 시료의 시험방법에 따라 시험하여 불소이온의 농도와 흡광도와의 검량선식을 작성한다.

8. 참고사항

8.1  180 °C 이상이 되면 황산이 분해되어 유출되므로 약 178 °C에서 가열을 중지한다.

8.2  증류하기 전에 시료에 황산은 용액을 사용하여 황산은을 5 mg/mg Cl의 비율로 넣어준다: 대략적인 시료 중의 염소 이온의 양(mg Cl) = 시료의 염분 ÷ 1.8 × 시료의 부피(L)

8.3  시료 중 불소함량이 측정범위를 초과할 경우, 탈색 현상이 나타날 수도 있다. 이러한 경우에는 취하는 시료량을 감량하거나 희석한 다음 다시 시험한다.

8.4  이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은, 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제22항 구리(Copper,  Cu)

1. 측정원리

해수시료 중의 구리는 전처리 과정으로써 pH 4 ∼ 5에서 유기 착화제(킬레이트: APDC/DDDC 혼합 용액)에 의해 비극성 유기금속착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3),메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trichloro- 1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매로 추출한다. 유기용매에 의해 추출된 시료는 청정상태에서 열판을 이용 휘발ㆍ건조시킨 후 잔유물을 1 N 질산 용액에 재용해한 다음 흑연로를 이용한 원자흡광광도계(GF-AAS) 또는 유도결합 플라즈마 질량분석기(ICP-MS)로 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

흑연로 원자흡광광도법을 이용한 구리의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Cu/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Cu/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

분석에 사용되는 모든 초자기구류는 반드시 1 N 질산, 염산 또는 왕수에 하룻밤 이상 산용출시키고, 1 % 디에틸암모니움디에틸디티오카바메이트(diethyl ammonium diethyl dithiocarbamate: DDDC) 또는 1 % 암모니움 피롤리딘 디티오카바메이트(ammonium pyrrolidine dithiocarbamate: APDC)용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복세척하여 사용한다. 보관이나 분석 반응시 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 오염을 차단해야 한다.

3.1.1  1,000 mL 용량의 경질 매스플라스크

3.1.2  50 mL 용량의 테프론 가열 용기

3.1.3  500 mL 용량의 테프론 분액깔때기

3.2  피펫

시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

3.3  와류혼합기(vortex mixer)

시료와 시약을 혼합할 때 사용한다.

3.4  교반기(shaker)

3.5  열판(hot plate)

3.6  청정시설

고효율 입자여과(HEPA) 시설과 수평기류(laminar flow) 장치를 포함한다(참고사항 8.1항).

3.7  Membrane 여과지

1 N 질산 용액에서 하룻밤 정도 산세척 후 초순수로 3회 이상 반복하여 세척하여 사용

3.8  분석기기: 원자흡광광도계 또는 ICP-MS

3.8.1  원자흡광광도계

3.8.1.1  램프: 구리 중공음극램프

3.8.1.2  원자화 장치: 전열 흑연로(electrothermal graphite furnace)

3.8.2  ICP-MS

아르곤의 순도는 99.999 % 이상이어야 한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기착화제(킬레이트) 혼합용액: 1 g의 암모니움피롤리딘디티오카바메이트(am-monium pyrrolidine dithiocarbamate: APDC)와 1 g의 디에틸암모니움디에틸디티오카바메이트(diethyl ammonium diethyl dithiocarbamate: DDDC)를 100 mL의 초순수에 녹여 APDC/DDDC 혼합용액을 만든다. 이 용액을 프레온이나 클로로포름으로 정제(용매 5 mL 두 번 용매 추출)하여 사용하며 4 °C에 보관한다. 만든 용액은 3일간 유효하다.

 유기착화제 혼합용액을 필요한 양만큼 소량 분취한후 냉동보관하여 사용할 경우 장기간(6개월) 유효하게 사용할 수 있다.

4.2  클로로포름(CHCl3): 유리 증류장치를 이용 재증류하여 사용한다.

4.3  질산: 진한 질산(비중 1.41)이며 세척용은 시약급(GR)을 사용하고 시료에 첨가하는 것은 Ultrapure(Optima 혹은 AAA 등급)급을 사용하거나 시약급을 정제하여 사용한다.

4.4  1 N 질산 용액: 71 mL의 질산을 초순수로 희석하여 1,000 mL로 만든다.

4.5  구리 표준원액(1,000 mg Cu/L): 원자흡광광도계를 사용할 경우, 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 구리 표준액을 사용한다. ICP-MS를 사용할 경우, 다원소 분석용(plasma grade 또는 ICP-MS grade) 표준원액을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  해수시료의 전처리 및 보관은 제2장 제2항을 따른다.

5.2  용매 추출

5.2.1  500 mL 용량 테프론 분액깔때기에 500 mL의 해수시료를 넣고 질산을 이용하여 pH 4로 조절한다.

5.2.2  유기착화제(APDC/DDDC) 혼합용액(4.1항) 5 mL을 20초간 강하게 교반한다.

5.2.3  위의 시료가 담긴 분액깔때기에 20 mL의 클로로포름을 넣고 교반기를 이용하여 약 2 ～ 3분간 흔들어 준다.

5.2.4  분액깔때기를 15분간 시료용액과 클로로포름층이 완전히 분리되도록 정치한 후 하부의 클로로포름만을 테프론 가열 용기(3.1.2항)에 받는다. 이때, 시료용액이 포함되지 않도록 주의해야 한다.

5.2.5  재추출을 위하여 5.2.3항과 5.2.4항의 과정을 반복하고 이때 얻어진 클로로포름을 앞서의 테프론 용기에 취합한다.

5.2.6  테프론 용기를 열판에서 80 °C로 가열하여 클로로포름을 휘발시킨 다음 질산 5 mL를 추출시료에 넣고 열판에서 가열하여 완전히 분해ㆍ건조시킨다. 이때의 과정은 반드시 청정시설이 갖추어진 후드에서 실시되어야 한다(참고사항 8.1항).

5.2.7  농축배수를 결정하여 적당량의 1 N 질산 용액으로 추출시료를 재용해시킨다.

5.2.8  초순수 500 mL를 5.2.1 ∼ 5.2.7 과정와 동일하게 처리하여 공시료로 한다.

6. 시험방법

6.1  준비된 용액을 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수파장은 324.7 nm 그리고 슬릿너비는 0.5 nm로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 구리 농도를 결정한다.

 농축배수는 5.2.7.에서 재용해 시킨 용액의 배수(최소 농축에 사용한 해수의 양(mL) 대비 재용해후 남은 용액의(mL) 비율)

     (식 1)

6.3  회수율: 시료 개수의 10 %에 해당하는 개수의 바탕용액과 같은 수의 표준물질(미국의 NIST, 캐나다의 NRC 등 외국의 공인기관에서 구입)을 시료와 동일한 방법으로 처리하고, 그 결과와 제시된 농도 값을 비교한 후 회수율(recovery ratio)을 계산하여 분석된 시료의 결과와 함께 제시한다.

회수율(%)=(시료로 분석된 표준물질의 농도/표준물질의 농도)×100     (식 2)

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  원자흡광광도계 또는 ICP-MS용 표준용액을 이용하여 5개 이상의 표준용액(1  % 질산 용액으로 희석시킴)을 만든 후 검량선을 작성한다.

7.2  결과보고시에는 검량선식, 상관계수(r²), 정밀도 및 검출한계를 기재하도록 한다.

7.3  측정된 자료를 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 구한다.

7.4  검출한계는 바탕용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱한 값(99 % 신뢰구간)에 평균값을 더하여 유의숫자 첫 자리로 표현한다.

7.5  정밀도는 검정범위의 중간 표준용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱하여(99 % 신뢰구간) ± 유의숫자 첫 자리로 표현한다.

8. 참고사항

8.1  해수 중의 미량금속의 농도는 매우 미량이기 때문에 실험실 환경에서 분진에 의한 오염 가능성이 상존한다. 따라서, 미량금속의 분석환경은 HEPA 여과시설 및 수평 기류가 가능한 청정 시설의 구비가 필요하다.

8.2  만일, 시료를 상당기간동안 보관해야할 때는 시료를 여과한 다음 질산으로 pH를 1.5 ～ 2.0의 범위로 조절한 후 냉장보관한다. 이 경우, 최대 6개월까지 보관이 가능하다.

8.3  미량금속 분석에 사용되는 대부분의 시약과 용제는 이미 미량의 금속이 함유되어 있는 경우가 많다. 따라서, 낮은 농도의 미량금속 시료를 분석하는 경우에는 유리로 된 증류장치를 이용하여 시약과 용제를 재증류하거나 재결정하는 등의 정제과정이 필요하다.

8.4  해수 중 휴믹산(humic acid)과 같은 유기물의 농도가 높을 경우, 해수 중의 미량금속은 안정된 유기금속 착화합물의 형태로 존재할 가능성이 있다. 이 경우에는 시료를 자외선을 조사하거나 산화제로 처리하여 착화합물을 분해시킨 후 분석하는 것이 좋다.

8.5  용매추출 전처리가 완료된 시료를 분석할 때 분석기기는 원자흡광광도계 또는 ICP-MS중 하나를 선택한다. 그러나, ICP-MS가 원자흡광광도계보다 효율성과 정밀도면에서 우월하기 때문에 가능한 ICP-MS를 권장한다. ICP-MS를 사용할 경우, 표준용액 외에 내부 표준용액으로 이트륨(Y-89)과 인듐(In-115)을 사용한다.

8.6  이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은, 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제23항 납(Lead,  Pb)

1. 측정원리

해수시료 중의 납은 pH 4 ∼ 5에서 유기착화제(킬레이트)에 의해 비극성 유기금속착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매로 추출한다. 유기용매에 의해 추출된 시료는 청정 상태에서 열판을 이용 휘발ㆍ건조시킨 후 잔유물을 질산 용액에 재용해한 다음 전열 흑연로를 이용한 원자흡광광도계 또는 ICP-MS에 의해 측정한다. ICP-MS의 측정원리는 제22항 구리 1. 측정원리와 같다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 납의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Pb/L 까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Pb/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

위의 제22항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다. 다만, 원자흡광광도계의 램프는 납 중공음극램프를 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

위의 제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다. 다만, 원자흡광광도계를 사용할 경우, 납 표준원액(1,000 mg Pb/L)은 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 납 표준액을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

위의 제22항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  준비된 용액을 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수파장은 283.3 nm 그리고 슬릿너비는 0.5 nm로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 제22항 구리 6.2와 같이 시료의 납 농도를 결정한다.

6.3  회수율 제22항 구리 시험방법 6.3의 회수율에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제22항 구리 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준용액은 납 표준원액을 1 % 질산 용액으로 희석하여 만든다.

8. 참고사항

제22항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제24항 니켈(Nickel,  Ni)

1. 측정원리

해수시료 중의 니켈은 pH 4 ∼ 5에서 유기착화제(킬레이트)에 의해 비극성 유기금속착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매로 추출한다. 유기용매에 의해 추출된 시료는 청정상태에서 열판을 이용 휘발ㆍ건조시킨 후 잔유물을 질산 용액에 재용해한 다음 전열 흑연로를 이용한 원자흡광광도계 또는 ICP-MS에 의해 측정한다. ICP-MS의 측정원리는 제22항 구리 1. 측정원리와 같다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 니켈의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Ni/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Ni/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

위의 제22항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다. 다만, 원자흡광광도계의 램프는 니켈 중공음극램프를 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

위의 제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다. 원자흡광광도계를 사용할 경우, 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 납 표준액(1,000 mg Ni/L)을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

위의 제22항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  준비된 용액을 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수파장은 232.0 nm 그리고 슬릿너비는 0.2 nm로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 제22항 구리 6.2와 같이 시료의 니켈 농도를 결정한다.

6.3  회수율 제22항 구리 시험법 6.3의 회수율에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

위의 제22항 구리 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준용액은 니켈 표준원액을 1 % 질산 용액으로 희석하여 만든다.

8. 참고사항

위의 제22항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제25항 아연(Zinc,  Zn)

1. 측정원리

해수시료 중 아연은 pH 4 ∼ 5에서 유기착화제(킬레이트)에 의해 비극성 유기금속착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매로 추출한다. 유기용매에 의해 추출된 시료는 청정상태에서 열판을 이용 휘발ㆍ건조시킨 후 잔유물을 질산 용액에 재용해한 다음 전열 흑연로를 이용한 원자흡광광도계 또는 ICP-MS에 의해 측정한다. ICP-MS의 측정원리는 제22항 구리 1. 측정원리와 같다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 아연의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 10 μg Zn/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.1 μg Zn/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제22항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다. 다만, 원자흡광광도계의 램프는 아연 중공음극램프를 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다. 다만, 원자흡광광도계를 사용할 경우, 아연 표준원액(1,000 mg Zn/L)은 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 아연 표준액을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제22항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  준비된 용액을 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수파장은 213.9 nm 그리고 슬릿너비는 1.0 nm로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 제22항 구리 6.2와 같이 시료의 아연 농도를 결정한다.

6.3  회수율 제22항 구리 시험법 6.3의 회수율에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제22항 구리 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준용액은 아연 표준원액을 1 % 질산 용액으로 희석하여 만든다.

8. 참고사항

제22항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제26항 카드뮴(Cadmium,  Cd)

1. 측정원리

해수시료 중의 카드뮴은 전처리 과정으로서 pH 4 ∼ 5에서 유기착화제(킬레이트)에 의해 비극성 유기금속착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매에 의해 추출된다. 유기용매로 추출한 시료는 청정상태에서 열판을 이용 휘발ㆍ건조시킨 후 잔유물을 질산 용액에 재용해한 다음 전열 흑연로를 이용한 원자흡광광도계 또는 ICP-MS에 의해 측정한다. ICP-MS의 측정원리는 제22항 구리 1. 측정원리와 같다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 카드뮴의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 10 μg Cd/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.1 μg Cd/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제22항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다. 단, 원자흡광광도계의 램프는 카드뮴 중공음극램프를 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다. 원자흡광광도계를 사용할 경우, 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 카드뮴 표준액(1,000 mg Cd/L)을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제22항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  준비된 용액을 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수파장은 228.8 nm 그리고 슬릿너비는 0.5 nm로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 제22항 구리 6.2와 같이 시료의 카드뮴 농도를 결정한다.

6.3  회수율 제22항 구리 시험법 6.3의 회수율에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제22항 구리 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준용액은 크롬 표준원액을 1 % 질산 용액으로 희석하여 만든다.

8. 참고사항

제22항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제27항 코발트(Cobalt,  Co)

1. 측정원리

해수시료 중의 코발트는 전처리 과정으로서 pH 4 ∼ 5에서 유기착화제(킬레이트)에 의해 비극성 유기금속착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매에 의해 추출된다. 유기용매로 추출한 시료는 청정상태에서 열판을 이용 휘발ㆍ건조시킨 후 잔유물을 질산 용액에 재용해한 다음 전열 흑연로를 이용한 원자흡광광도계 또는 ICP-MS에 의해 측정한다. ICP-MS의 측정원리는 제22항 구리 1. 측정원리와 같다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 코발트의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Co/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Co/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제22항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다. 다만, 원자흡광광도계의 램프는 코발트 중공음극램프를 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다. 다만, 원자흡광광도계를 사용할 경우, 코발트 표준원액(1,000 mg Co/L)은 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 코발트 표준액을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제22항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  준비된 용액을 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수파장은 242.5 nm 그리고 슬릿너비는 0.2 nm로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 제22항 구리 6.2와 같이 시료의 코발트 농도를 결정한다.

6.3  회수율 제22항 구리 시험법 6.3의 회수율에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제22항 구리 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준용액은 코발트 표준원액을 1 % 질산 용액으로 희석하여 만든다.

8. 참고사항

제22항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제28항 6가크롬(Hexavalent  Chromium,  Cr6+)

1. 측정원리

해수시료 중의 6가크롬은 전처리 과정으로서 pH 4 ∼ 5에서 유기착화제(킬레이트)에 의해 비극성 유기금속착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매로 추출한다. 유기용매에 의해 추출된 시료는 청정상태에서 열판을 이용 휘발ㆍ건조시킨 후 잔유물을 질산 용액에 재용해한 다음 전열 흑연로를 이용한 원자흡광광도계 또는 ICP-MS에 의해 측정한다. ICP-MS의 측정원리는 제22항 구리 1. 측정원리와 같다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 크롬의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Cr/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 2 μg Cr/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제22항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다. 다만, 원자흡광광도계의 램프는 크롬 중공음극램프를 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다. 원자흡광광도계를 사용할 경우, 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 크롬 표준액(1,000 mg Cr/L)을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제22항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  준비된 용액을 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수파장은 357.9 nm 그리고 슬릿너비는 0.2 nm로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 제22항 구리 6.2와 같이 시료의 크롬 농도를 결정한다.

6.3  회수율 제22항 구리 시험법 6.3의 회수율에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제22항 구리 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다. 단 표준용액은 크롬 표준원액을 1 % 질산 용액으로 희석하여 만든다.

8. 참고사항

제22항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제29항 총크롬(Total  Chromium,  Cr)

1. 측정원리

제28항 6가크롬 1. 측정원리에 따른다. 단, 총크롬은 전처리 과정에서 해수시료에 과망간산칼륨을 넣고 가열하여 시료 중 3가크롬을 6가크롬으로 산화시킨 후 용매추출한다.

2. 측정범위 및 정밀도

제28항 6가크롬 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

제28항 6가크롬 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

4.1 ∼ 4.5 제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

4.6  5 % 과망간산칼륨(KMnO4) 용액: 10 g의 과망간산칼륨을 초순수에 녹여 200 mL가 되게 한다.

4.7  10 % 염산하이드록실아민(NH2OHㆍHCl) 용액: 염산하이드록실아민 20 g을 초순수에 녹인 후 200 mL가 되게한다. 단, 산화제인 과망간산칼륨 용액 및 염산하이드록실아민 용액에는 크롬이 미량으로 존재할 수 있으므로 유기착화제로서 비극성유기화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 메틸이소부틸케톤(MIBK), 또는 프레온(1,1,2-trifluoroethane) 등의 유기용매로 2 ～ 3회 추출 후 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제28항 6가크롬 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다. 단, 총크롬을 분석하기 위해서는 용매추출 전의 전처리 과정으로 다음과 같이 해수시료 중의 3가크롬을 6가크롬으로 산화시켜야 한다.

5.1  해수시료 500 mL를 1,000 mL 용량의 매스플라스크에 넣고 열판을 이용하여 끓인 상태에서 분홍색이 나타날 때까지 과량의 5 % (w/v) 과망간산칼륨(KMnO4)용액을 스포이드로 적정한다.

5.2  끓고 있는 상태에서 과량의 과망간산칼륨을 분해하기 위하여 10 % (w/v) 염산하이드록실아민(NH2OHㆍHCl)용액을 분홍색이 사라질 때까지 스포이드로 30초 간격에 한 방울씩 천천히 적정한다.

5.3  분홍색이 완전히 사라지면 방냉한 후 제28항 6가크롬 5. 시료의 채취 및 보관 중 5.2항 용매추출의 단계를 시작한다.

6. 시험방법

제28항 6가크롬 6. 시험방법에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제28항 6가크롬 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

제28항 6가크롬 8. 참고사항에 따른다.

제30항 미량금속 동시분석법(Metals)

1. 측정원리

본 분석법은 해수시료 중의 중금속을 pH 4 ∼ 5에서 유기착화제(킬레이트: APDC/DDDC 혼합용액)에 의해 비극성 유기금속 착화합물을 형성한 후 클로로포름(CHCl3), 또는 프레온(1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) 등의 유기용매로 추출한 후 진한 질산으로 금속유기착화합물을 분해하고 묽은 질산으로 중금속을 용출한 후 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

ICP-MS법은 전처리한 시료를 pneumatic nebulizer를 통해 고온(약 8,000 K)의 아르곤 플라즈마에 주입하면 금속들은 기화, 원자화 및 이온화된다. 이온들은 단계별로 진공도가 다른 Interface, 집중 렌즈 부분을 통과하면서 가지런한 에너지 분포를 갖게 되고 사극자 질량분석기(5 % 피크 높이에서 적어도 1 amu 분해능 성능) 내에서 질량수/전하 비율로 분리된 후 전자 증폭기나 파라데이 검출기로 신호 전달이 된다. 이 신호들을 자료처리 소프트웨어에서 처리한다. 이 측정방법은 동질량 간섭, 플라즈마 가스, 시약, 시료 매트릭스 이온들에 의한 다원자 분자 간섭들이 있어 이들을 보정해야 하며, 또한 매트릭스에 의한 기기 신호 변화에 대해서도 보정해야 한다.

2. 측정범위 및 정밀도

ICP-MS를 이용한 해수 중 중금속 동시분석법은 Cd(Cadmium), Co(Cobalt), Cr+6(Hexavalent Chromium), Cu(Copper), Ni(Nickel), Pb(Lead), Zn(Zinc)에 해당하며 유효측정범위는 금속 종류에 따라 다르지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg/L까지이다. ICP-MS 기기의 검출한계는 1 ng/L 이하지만 용매추출 등 시료 전처리 단계에서의 공시료 수준에 의해 결정된다. 정밀도는 농도 수준에 따라 다르지만 일반적인 해수 농도 수준에서 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  용매 추출법 - 테프론 용기는 마개 부분의 고무링을 제거하고 왕수에 4시간, 1 : 1 질산에 6시간 이상 가열 후 초순수로 세척하여 사용하며 일반 플라스틱 용기는 10 % 염산 혹은 질산 용액에 6시간 이상 가열한 후 초순수로 세척하여 사용한다.

3.1.1  플라스틱 기구: 분액깔때기(500 mL, 1 L, 테프론 혹은 FEP), 30 mL 테프론 바이알, 125 mL LDPE 병, drop-dispenser 병 30 mL LDPE

3.1.2  가열판(hot plate)

3.1.3  자동 피펫: 1 ∼ 5 mL 부피 조절형, 유기착화제와 완충용액 주입용으로 사용하며 피펫 팁은 10 % 염산 혹은 질산 용액으로 3회, 초순수로 3회 이상 세척 후 사용

3.1.4  pH meter: ± 0.1 pH 분해능을 가진 장비

3.1.5  분액깔때기 교반기(shaker): 최대 400 rpm 가능

3.1.6  전자저울: ± 0.01 g 정확도

3.1.7  청정벤치: 고효율 입자여과(HEPA)시설과 수평 기류(laminar flow) 장치를 포함한다.

3.1.8  용매 증발장치: 바이알을 가열시키면서 고효율 입자여과 시설로 깨끗한 공기로 용액을 증발시키는 장치

3.1.9  유기용매 정제장치: 유기용매를 낮은 온도에서 증발 및 냉각시켜 정제하는 장치

3.1.10  석영 대용량 주입기(유기용매용: Bottle-top dispenser): 1 ∼ 20 mL 부피 조절 가능

3.2  ICP-MS 분석법

3.2.1  5 ∼ 250 amu 범위의 질량 범위를 측정할 수 있으며 5 % 피크 높이에서 적어도 1 amu의 분해능을 갖고 있는 질량분석기이며 검출기는 전자 증폭기를 사용하는 시스템

3.2.2  아르곤은 99.999 % 이상의 순도를 갖거나 액체를 기화해서 사용한다.

3.2.3  분무기 가스는 정밀 유량조절기(Mass Flow Controller)로 조절한다.

3.2.4  기기 종류가 매우 다양하기 때문에 각 기기의 사용법은 기기 회사 사용자 매뉴얼을 따른다.

3.3  실험실 용기 및 기구들

해수의 중금속 분석을 위해서는 주변 오염에 관하여 각별히 주의해야 한다. 청정벤치와 같은 고효율 입자여과 시설(HEPA)이 갖추어져야 하며 이 환경 아래서 시료를 처리해야 한다. 사용 용기들은 반드시 산세척을 한 플라스틱 제품을 사용하며 유리용기 사용은 배제한다. 일반적인 용기들(플라스틱 비이커, 메스실린더, 부피 정량 플라스크 등)은 10 % 염산 혹은 질산 용액에 담그고 80 °C로 6시간 이상 가열한 후 초순수로 세척하여 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  초순수: 전기저항 18.2 ㏁ 이상의 초순수

4.2  유기착화제(킬레이트) 혼합 용액: 1 g의 암모니움 피롤리딘 디티오카바메이트(ammonium pyrrolidine dithiocarbamate: APDC)와 1 g의 디에틸암모니움디에틸디티오카바메이트(diethylammoniumdiethyldithiocarbamate: DDDC)를 100 mL의 초순수에 녹여 APDC/DDDC 혼합 용액을 만든다. 이 용액을 프레온이나 클로로포름으로 정제(용매 5 mL 두 번 용매 추출)하여 사용하며 4 °C에 보관한다. 만든 용액은 3일간 유효하다.

4.3  프레온(HCFC-141b): 유리 증류장치를 이용, 재증류하여 사용한다.

4.4  클로로포름(CHCl3): 유리 증류장치를 이용, 재증류하여 사용한다.

4.5  암모늄에세테이트 완충용액: 20 % 암모늄아세테이트(CH3COONH4: 4 °C에 보관) 용액을 만들고 유기착화제 및 유기용매로 정제하여 사용한다(예를 들면, 완충용액 100 mL에 1 % APDC/DDDC 0.5 mL를 넣고 프레온이나 클로로포름 5 mL씩 세 번 용매 추출한다).

4.6  질산: 진한 질산(비중 1.41)이며 세척용은 시약급(GR)을 사용하고 시료에 첨가하는 것은 Ultrapure(Optima 혹은 AAA 등급)급을 사용하거나 시약급을 정제하여 사용한다.

4.7  단일 원소 표준원액(1,000  mg/L): 상용으로 제조되는 플라즈마급 표준액을 구입하거나, 순수 금속(99.99 % 이상)을 구입하여 고순도 질산이나 염산에 용해시켜 사용한다.

4.8  다원소 표준원액(10 mg/L): 같은 종류의 산용액에 용해되어 있는 여러 개의 단일 원소 표준원액을 1 % (v/v) 질산 용액으로 혼합하여 제조하거나 혼합하여 상용으로 제조되는 다원소 분석용(ICP-MS용) 표준원액을 사용한다.

4.8.1  검량선 작성용 표준용액 제조: 다원소 표준용액을 1 % (v/v) 질산 용액으로 희석하여 각각의 원소 농도가 0.0, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 50.0 ㎍/L가 되게끔 한다. 이 용액은 1주일 시간 규모에서 새로이 제조한다.

4.8.2  1 % (v/v) 질산 용액: 10 mL의 진한 질산을 초순수로 희석하여 1,000 mL로 만든다.

4.9  공시료: 본 분석 방법을 위해 3가지의 공시료가 있다.

4.9.1  검량선 공시료: 1 % (v/v) 질산 용액을 사용하고 검량선 작성용 표준용액을 제조할 때 사용한 용액이다.

4.9.2  실험실 시약 공시료: 시료를 처리하는 과정과 같은 방법으로 제조하는데 시료에 첨가하는 모든 시약을 포함해야 한다.

4.9.3  세척용 공시료: 1 % (v/v) 질산 용액이며 기기 측정 동안의 세척 용액으로 사용된다.

4.10  기기 최적화 용액(Tuning solution): 시료 분석 전에 기기 조건을 최적화하기 위해 사용되는 용액으로 mg, Co, Y, In, La, Bi, U 표준원액을 혼합하여 10 ㎍/L가 되게끔 1 % (v/v) 질산 용액으로 희석하여 제조한다.

4.11  정도관리 시료: 기기 측정의 신뢰도를 점검하기 위하여 검량선 작성과 다른 경로로 제조된 표준용액을 1 % 질산 용액으로 적절히 희석하여 시료와 함께 측정한다.

4.12  내부표준용액: Sc, In, Bi 표준원액을 혼합하고 1 % 질산 용액으로 각 금속의 농도가 1 mg/L가 되게끔 희석한다. 검량선 공시료, 검량선용 표준용액, 공시료, 시료에 모두 같은 농도로 첨가한다. 연동펌프로 시료와 함께 주입하여 혼합하고자 할 때는 10 ㎍/L 용액으로 만든다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  500 mL 용량 테프론 분액깔때기에 400 g의 해수시료를 넣고 아세테이트 완충용액을 이용하여 pH 4.5 부근으로 조절한다(미리 해수시료 50 g으로 pH 조절 실험을 하여 완충용액의 부피를 결정한다).

5.2  유기착화제(APDC/DDDC) 혼합용액 1 mL를 첨가하고 10초간 강하게 교반한다.

5.3  위의 시료가 담긴 분액깔때기에 10 mL의 프레온 혹은 클로로포름을 넣고 분액 깔때기 교반기에서 300 rpm으로 5분간 교반시킨다.

5.4  분액깔때기를 10분간 시료 용액과 유기용매 층이 완전히 분리되도록 정치한 후 하부의 유기용매만을 테프론 비이커에 받는다. 이때, 시료 용액이 포함되지 않도록 주의해야 한다.

5.5  재추출을 위하여 5.3항과 5.4항의 과정을 반복하고 이때 얻어진 유기용매를 앞서의 테프론 용기에 취합한다.

5.6  테프론 용기를 가열판에서 80 °C로 가열하여 유기용매를 휘발시킨 다음 금속 카바메이트를 진한 질산 0.1 mL로 2회 첨가하고 가열하여 완전히 분해, 건조시킨다. 이때의 과정은 반드시 청정시설이 갖추어진 후드에서 실시되어야 한다.

5.7  1 % (v/v) 질산 용액 1 ∼ 2 mL를 첨가하고 따뜻한 상태에서 금속을 용출한다. 이 용액을 4 g으로 만들면 된다.

5.8  초순수 10 mL를 5.1항 ∼ 5.7항의 과정과 똑같이 조작하여 공시료로 한다. 초순수 부피는 모든 시약이 유기용매와 층을 분리할 수 있는 최소량으로 한다.

5.9  해수 중 휴믹산(humic acid)과 같은 유기물의 농도가 높을 경우, 해수 중의 미량금속은 안정된 유기금속 착화합물의 형태로 존재할 가능성이 있다. 이 경우에는 시료를 자외선을 혹은 산화제로 처리하여 착화합물을 분해시킨 후 분석하는 것이 좋다.

6. 시험방법

6.1  ICP-MS를 기기 사용 매뉴얼에 따라 작동시키고 기기 최적화 용액을 사용하여 감도, 정밀도, 배경 노이즈, 산화물 생성 비율 등을 최적화한다.

6.2  기기 프로그램에서 분석 원소의 동위원소 선택(이때, 간섭 보정 동위원소도 선택), 시료 측정순서 등록, 정도관리 시료 등록 등 정량분석 과정을 만든다.

6.3  검량선용 표준용액, 공시료, 정도관리 시료, 시료를 분석한다.

6.4  검량선 작성 전에 세척용 공시료에서 분석하고자 하는 금속을 측정하여 시료 도입 부분이 충분히 세척되었음을 확인한다.

6.5  처음 검량선을 작성 후 표준용액 농도에 대한 신호세기의 회귀선식을 구하고 상관계수가 0.99 이상일 때 시료 분석을 시작한다.

6.6  시료분석 도중에 기기 감도가 유지되는지를 확인하기 위하여 시료 20개당 1 개씩의 검량선 검증 표준용액(검량선 범위의 중간 농도)을 측정하여 ± 10 % 이상이 변화하면 시료 분석을 멈추고 문제점을 해결하고 검량선을 재작성한다.

6.7  기기측정 신호의 변화나 시료 매트릭스 차이에 의한 신호 변화는 내부 표준 용액으로 첨가된 금속을 기준으로 보정한다. 보정하는 방법은 기기 프로그램에 제시된 방법을 따른다.

7. 방해요인

ICP-MS를 사용하는 데 여러 가지 간섭 현상이 있으며 적절한 보정 및 처리가 필요하다.

7.1  동질량 동위원소 간섭 - 다른 원소인데도 질량수/전하 비율이 같은 동위원소에 의해 발생하는 간섭 현상이다. 본 분석 방법이 적용되는 원소들에 대해서는 적어도 하나 이상의 동질량 간섭이 없는 동위원소가 존재하므로 이를 선택한다.

7.2  다원자 이온 동질량 간섭 - 여러 개의 원자가 합쳐진 이온의 질량수/전하 비율이 분석하는 동위원소와 겹쳐 발생하는 간섭현상으로 사극자 질량분석기의 분해능으로는 극복되지 않는다. 이 간섭물질들은 플라즈마 내부나 플라즈마와 시료콘 사이에서 플라즈마 가스, 시료 매트릭스에 있는 원소들에 의해 형성된다. 이 간섭물질들을 회피할 수 없을 때는 적절한 보정이 이루어져야 하는데 측정할 때 함께 포함된 다른 원소들의 영향을 반드시 고려해야 되고 간섭물질에 해당되는 금속을 함께 측정해야 한다.

7.3  물리적인 간섭 - 표준용액과 분석 시료 사이에 물리적인 성질이 다른 경우,(예를 들면 점성도, 산도, 매트릭스 이온 농도 등) nebulizer에서 분무 효율, 플라즈마에서의 변화 과정, 플라즈마에서 질량분석기로의 이동 등에 변화가 발생하여 같은 농도에서 신호가 다르게 된다. 이 경우, 내부 표준용액을 표준용액과 분석 시료에 모두 첨가하여 보정할 수 있다. 또한 용존 고체의 농도가 높은 시료를 주입하면 염들이 침전되어 시료콘의 구멍을 막음으로 인해 신호가 감소될 수 있다.

7.4  기억효과 - 시료 도입 장치 및 Sampler cone 과 Skimmer cone에 이물질이 침전되면 다른 시료 분석에 영향을 주게 되며 영향 정도는 금속 종류에 따라 다르기 때문에 콘 및 시료 도입 장치를 세척해 주어야 한다.

7.5  용매 추출법에 의해 해수시료의 매트릭스 원소 대부분이 분리되어 위 간섭물질들의 영향이 적을 수 있으나 분리 정도에 따라 영향을 줄 수 있기 때문에 반드시 점검해야 한다. 또한, 해수에 미량으로 존재하는 Mo(Molybdenum)이 산화물을 형성하여 111Cd에 영향을 줄 수 있으므로 다음 식을 이용하여 보정한다. 즉, 시료를 분석하기 전에 Mo 100 ppb 용액을 사용하여 5Mo16O/95Mo 비율을 측정한 다음 이를 시료에 적용하여 111Cd 신호를 계산해 낸다.

                          (식 1)

                          (식 2)

여기서, 아래 첨자 s는 분석 시료이고 oxide는 Mo 100 ppb 용액, 공시료는 1 % 질산 용액을 나타내며 f는 Mo 산화물과 Mo 신호 사이의 비율이다. M은 그 질량수에서의 총 카운트 수이다.

8. 결과

8.1  모든 자료는 내부 표준용액으로 보정한 후 사용한다.

8.2  다원자 간섭이 있는 금속의 경우, 7.5항에서와 같은 식을 이용하여 보정한 자료를 사용한다. 보정에 필요한 f를 측정하여 기기 프로그램을 이용하면 보정이 가능하다.

8.3  보고되는 자료는 ㎍/L 단위로 표시하며 해수 중 금속농도는 다음과 같은 식에서 계산한다.

     (식 3)

8.4  분석과정 동안 얻은 정도관리용 자료는 시료분석 자료의 질을 나타내기 때문에 시료와 함께 보고한다.

9. 정도평가/정도관리(QA/QC)

9.1  해당 분석방법의 정도관리를 위해 필요한 최소한의 정도관리용 자료는 검량선, 시약 공시료에서의 금속농도, 검출한계, 반복시료 정밀도, 표준용액 첨가 회수율, 해수표준물질에서의 금속농도가 있다.

9.2  검량선: 4.8.1에 제시된 검량선용 표준용액을 분석한 다음 측정된 자료를 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 구한다. 검량선식과 상관계수(r2)를 보고한다.

9.3  실험실 시약 공시료에서의 금속농도: 5.8항과 같이 제조된 공시료를 분석한 금속농도 자료이다.

9.4  분석방법 검출한계: 실험실 시약 공시료를 7개 제조하여 이를 분석하고 농도의 표준편차를 구한 후 3.14를 곱한 값(99 % 신뢰구간)을 농축배수(해수 무게/농축후 금속용출 용액 무게)로 나누어 준 값이다. 만일, 7개 시료에서 금속농도의 상대표준편차(Relative standard deviation)가 15 % 이내면 계산한 검출한계가 너무 낮게 평가될 수 있으므로 같은 과정을 3번 정도 반복하여 평균값으로 보고한다.

9.5  반복시료 정밀도: 실제 시료를 5개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 1.96을 곱하여(95 % 신뢰구간) 평균값 ± 유의수준으로 표시한다.

9.6  표준용액 첨가 회수율: 해수시료 20개당 1개에 분석 금속의 농도가 1 ㎍/L가 되게끔 첨가하고 시료와 함께 분석 후 아래와 같이 계산한다. 만일, 시료에서 금속 농도가 4 ㎍/L 이상이면 첨가한 금속농도가 너무 작아 회수율을 산정하지 않는다.

회수율(%) =(표준용액 첨가한 시료농도- 첨가하지 않은 시료농도) × 100  (식 4)

이때, 회수율이 75 ∼ 125 % 범위에 있어야 한다.

9.7  금속인증 해수시료 분석: 캐나다 NRC의 NASS(대양수), CASS(연안수), SLEW(기수) 같은 금속농도가 인증된 해수를 시료 수의 10 %에 해당하는 수만큼 시료와 같은 방법으로 분석하여 인증값과 비교한다.

10. 분석절차 흐름도

┌─────────────────┐                                        

│해수 400 g을 테플론 분액 깔때기   │                                        

└─────────────────┘                                        

                                      ? 청정벤치, 각 재질별 적절한 산 세척   

                                      후 실험,   판형 저울 사용               

                                      ? 시료 50 g과 pH미터 사용해 완충용액   

                                      부피 확정                               

┌─────────────────┐                                        

│아세테이트 완충용액으로 pH 4.5로  │                                        

│조절                              │                                        

└─────────────────┘                                        

┌─────────────────┐                                        

│1 % APDC/DDDC 용액 1 mL 첨가      │                                        

└─────────────────┘                                        

                                      ? 1% 질산 세척 (파이펫 팁 사용)        

                                      ? 유기 착화제 첨가 후 충분히 혼합      

┌─────────────────┐                                        

│유기용매 10 mL 첨가 후 교반       │                                        

└─────────────────┘                                        

                                      ? 300 rpm 5분 (발생 가스 최소화)       

                                      ? 층 분리 10분 이상하여 해수 포함 되   

                                      지 않도록 함 (산 세척 비이커)           

┌─────────────────┐                                        

│유기용매 테플론 비이커로 분리     │                                        

└─────────────────┘                                        

┌─────────────────┐                                        

│추출한 유기용매를 가열판으로 증발 │                                        

└─────────────────┘                                        

                                      ? 가열판 온도 80 °C                   

                                      ? 청정 후드 내부에서 증발              

┌─────────────────┐                                        

│진한 질산 200 μL 2회 첨가 및 증발│                                        

└─────────────────┘                                        

                                      ? 금속 카바메이트로 유기물 분해        

                                        (Ultrapure급 질산 사용)               

┌─────────────────┐                                        

│1 % 질산 용액 1 ∼ 2 mL로         │                                        

│따뜻한 상태에서 용출              │                                        

└─────────────────┘                                        

                                      ? 건조 후 짙은 색이 존재하면 진한 질   

                                      산 추가 첨가 후 용출                    

┌─────────────────┐                                        

│1 % 질산용액 4 g까지 희석         │                                        

└─────────────────┘                                        

                                      ? 상온으로 냉각된 후 저울 사용         

                                      ? 기기자동 주입기 용기에 직접 희석     

┌─────────────────┐                                        

│기기  측정                        │                                        

└─────────────────┘                                        

그림 1. 해수중금속 분석절차

11. 참고사항

11.1  해수시료 중의 용존 중금속은 매우 낮은 농도로 존재하므로 사용하는 기구 및 용기의 산세척, 깨끗한 시약 사용, HEPA 필터를 통과한 공기 아래에서 시료 노출 등 Clean Techniques이 사용되어야 한다.

11.2  플라스틱 용기들의 산세척, 용매 추출 등은 강한 휘발성의 유독 물질이므로 반드시 Fume Hood 내부에서 이루어져야 하고, 실험자는 Clean Techniques과 화학 물질 관리에 대해 정확히 숙지한 후 실험에 임해야 한다.

11.3  ICP-MS의 플라즈마는 라디오 주파수의 빛뿐만 아니라 강한 자외선을 방사하기 때문에 보호안경을 착용하기 전에는 시야를 노출해서는 안된다.

11.4  중금속 농축 및 처리에 필요한 산용액과 유기용매들의 폐기물은 분리하여 폐수통에 보관하였다가 해당 기관의 지침에 따라 처리한다.

11.5  폐기물 처리는 처리 시설을 갖춘 업체에 위탁한다.

11.6  발생하는 폐액의 대부분은 산폐액이다. 따라서, 산폐액 보관용기에 폐액을 모으고 산폐액통은 그늘지고 서늘한 장소에서 보관한다.

제31항 비소(Arsenic,  As)

1. 측정원리

해수시료 중의 비소는 pH 2로 산처리하여 보관한 후 소디움보로하이드라이드(NaBH4)를 가하여 반응시킨 다음 헬륨 기체를 흘려주어 유리된 비소 증기를 액체질소 하에서 석영구슬 트랩에 잡은 후 냉증기-원자흡광광도계를 이용하여 193.7 nm 흡광도를 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 비소의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 50.00 μg As/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대 측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.02 μg As/L이며 표준편차율 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구: 분석에 사용되는 모든 초자기구류는 반드시 1 N 질산, 염산 또는 왕수에 하룻밤 이상 산용출시키고, 1 % DDDC 또는 1 % APDC용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 보관 혹은 분석 시 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 오염을 차단해야 한다.

3.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

3.3  환원기화장치: 경질 유리로 제작된 환원기화용기로서 25 ～ 100 ㎤의 용량을 사용한다.

3.4  냉트랩(cold trap): 경질 유리로 된 외경 6 mm의 U자관으로서 약 30 cm 길이로 제작한다. U자관의 앞부분 8 ㎝까지는 아무것도 채우지 않고 나머지 부분에 크로마토그래피 충진물질(15 % ov-3, Chromosorb W-AW-DWCS 60/80)이나 석영 구슬 트랩을 충진한다. U자관의 양 끝은 유리섬유로 막는다. U자관은 약 3 Ω 정도의 열선으로 감아 가열할 수 있게 한다.

그림 1. 비소 환원기화장치

3.5  청정시설: 고효율입자여과(HEPA) 시설과 수평기류(laminar flow) 장치를 포함한다(8.1항 참고).

3.6  원자흡광광도계

3.6.1  램프: 비소 중공음극램프

3.6.2  석영셀 연소장치(quartz cuvette burner): 헬륨과 공기가 흐르는 내경 9 mm, 길이 7 cm의 석영셀 연소장치를 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  고순도 염산(HCI, 비등점하 증류장치로 정제하거나 Merck Suprapur, Optima, AAA 등급)

4.2  트리스 완충용액[tris(hydroxy-methyl)aminomethane, TRIS-HCl]

4.3  고순도 질산(HNO3, 비등점하 증류장치로 정제하거나 Merck Suprapur, Optima, AAA 등급)

4.4  4 % 소디움보로하이드라이드(NaBH4) 용액: 소디움보로하이드라이드 4 g을 초순수에 녹여 100 mL로 만든다(8.5항 참고).

4.5  액체 질소

4.6  헬륨 가스: 99.999 %이상의 고순도이어야 한다.

4.7  비소 표준원액(1,000 mg As/L): 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 비소 표준액을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  채취된 해수시료는 산으로 세척한 폴리에틸렌병에 저장하고 1 L당 4 mL의 염산을 첨가하여 산성화한다. 산처리된 시료는 수개월 동안 안정하다.

5.2  pH 2로 산처리하여 보관한 해수시료 50 mL를 환원기화장치에 넣고 트리스 완충용액 1 mL을 가한 후 헬륨을 3분간 흘려주어 시료 중의 공기를 제거한다.

5.3  냉트랩용 컬럼을 액체 질소에 담근다. 액체 질소는 시험 과정 중에 일정한 높이를 유지할 수 있도록 보충한다.

5.4  아르곤가스를 흘려주면서 소디움보로하이드라이드 용액 1 mL을 첨가한 후 6분간 반응시킨다.

5.5  액체 질소에서 냉트랩을 꺼내어 열선에 12 V 전원을 공급하여 가열한다.

6. 시험방법

6.1  환원기화장치에서 발생한 기체는 원자흡광광도계에 연결된 석영 셀 연소장치로 보내진다. 분석을 하기 전에 미리 검량용 표준용액을 이용하여 수소와 공기의 유속을 조정하면서 방법선이 안정되는 최적 조건을 설정한다.

6.2  원자흡광광도계에서 193.7 nm에서 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검량선으로부터 비소의 양을 구하고 농도를 산출한다.

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

7.1  원자흡광광도계 또는 ICP-MS용 표준용액을 이용하여 5개 이상의 표준용액(0.2 % 질산 용액으로 희석시킴)을 만든 후 검량선을 작성한다.

7.2  결과보고시에는 검량선식, 상관계수(r²), 정밀도 및 검출한계를 기재하도록 한다.

7.3  결과 자료를 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 이용하여 다음과 같이 시료중의 비소 농도를 구한다.

┌─────────────────────────────────┐

│비소 농도(μg/L)  =  (검량선에서 구한 시료 중의 비소 농도)        │

│                   - (검량선에서 구한 공시료의 비소 농도)   (식 1)│

└─────────────────────────────────┘

7.4  회수율 제22항 구리 시험법 6.3의 회수율에 따른다.

7.5  검출한계는 바탕용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱한 값(99 % 신뢰구간)에 바탕용액 농도의 평균값을 더하여 유의숫자 첫자리로 표현한다.

7.6  정밀도는 검정 범위의 중간 표준용액을 7개 이상 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱하여(99 % 신뢰구간) ± 유의숫자 첫자리로 표현한다.

8. 참고사항

8.1  해수 중 미량금속의 농도는 매우 미량이기 때문에 실험실 환경에서 분진에 의한 오염 가능성이 상존한다. 따라서, 미량금속의 분석환경은 HEPA 여과시설 및 수평기류가 가능한 청정시설의 구비가 필수적이다.

8.2  시료의 보관이 상당기간 동안 필요할 때에는 시료를 여과한 다음 질산으로 pH를 1.5 ～ 2.0의 범위로 조절한 후 냉장 보관한다. 이 경우, 최대 2년까지 보관이 가능하다.

8.3  미량금속 분석에 사용되는 대부분의 시약과 용제는 이미 미량의 금속이 함유되어 있는 경우가 많다. 따라서, 농도가 낮은 시료를 측정하는 경우에는 유리 혹은 테프론 재질의 증류장치를 이용하여 시약과 용제를 재증류하거나 재결정하는 등의 정제과정이 필요하다.

8.4  이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우, 사용할 수 있으며, ICP-MS를 이용하여 측정할 수도 있다.

8.5  소디움보로하이드라이드는 공기와 접하면 인화성이 매우 강하므로 매우 주의를 요한다.

제32항 수은(Hg) -냉증기원자흡광광도법                      (Mercury- Cold Vapor Atomic  Absorption  Spectrometry)                                                

1. 측정원리

해수시료 중의 무기수은을 염화제일주석으로 환원시켜 금속 수은으로 만든 다음 아르곤 기체를 불어넣어 수은포집장치에 포집한 후 냉증기-원자흡광광도계에 의해 253.7 nm에서 흡광도를 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 수은의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 10.00 μg Hg/L까지이다. 일반적인 기기검출한계는 99  % 신뢰구간에서 0.01 μg Hg/L이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구: 분석에 사용되는 모든 초자기구류는 반드시 1 N 질산, 염산 또는 왕수에 하룻밤 이상 산용출시키고, 1 % DDDC 또는 1 % APDC용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 보관 혹은 분석 반응시 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 오염을 차단해야 한다.

3.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

3.3  환원기화장치: 병 입구가 24 / 29이고 용량이 500 mL인 경질 유리병과 기포발생장치가 달린 뚜껑을 사용한다.

3.4  수은포집장치(mercury collector): 내경 6 mm, 길이가 각각 60, 120 mm인 관이 양쪽에 달리고 중앙부는 내경이 10 mm이고 길이가 120 mm인 규소 관을 제작한다. 포집관의 중앙부 120 mm에는 두께가 0.2 mm인 24 ct인 금으로 만든 호일 20 g을 채운다. 각 호일 조각의 크기는 15 × 1.5 mm 정도로서 굴곡진 모양이나 U자로 구부려서 질산에 씻고 120 °C에 말려서 사용한다. 포집관은 약 5 Ω 정도의 열선으로 감아 가열할 수 있게 한다.

3.5  테프론 튜브(내경 6 mm)

3.6  수욕조(water bath)

3.7  청정시설: 고효율입자여과(HEPA) 시설과 수평기류(laminar flow) 장치를 포함한다(8.1항 참고).

3.8  원자흡광광도계

3.8.1  램프: 수은 중공음극램프

3.8.2  석영으로 만들어진 측정 셀(길이 200 mm, 내경 13 mm)

1 : 알곤                6 : 가변전원 및전류계

2 : 유량계              7 : 테프론 튜브

3 : 스톱콕              8 : T-스톱콕 

4 : 환원기화장치        9 : 석영 측정셀(원자흡광광도계)

5 : 수은포집장치        10 : 배기

그림 1. 수은 냉증기원자흡광광도법

4. 시약 및 표준물질

4.1  질산(HNO3): 유해중금속 분석용 또는 Ultra-, Supra grade를 사용

4.2  황산(H2SO4) 용액(1 + 1)

4.3  아르곤 기체: 99.999 % 이상의 고순도이어야 한다.

4.4  20 % 염화제일주석 용액: 수욕조 상에서 따뜻하게 하면서 염화제일주석(SnCl2) 100 g 염산 86 mL에 녹인 후 초순수 500 mL로 희석하고 아르곤기체를 1 mL/분으로 1시간 동안 통과시켜 불순물로 들어있는 수은을 제거한다.

4.5  5 % 과망간산칼륨 용액: 과망간산칼륨(KMnO4) 10 g을 초순수에 녹여 200 mL가 되게 한다.

4.6  5 % 과황산칼륨 용액: 과황산칼륨(K2S2O8)용액 10 g을 초순수에 녹여 200 mL가 되게 한다.

4.7  10 % 염산하이드록실아민(NH2OHㆍHCl) 용액: 염산하이드록실아민 20 g을 초순수에 녹여 200 mL가 되게 한다.

4.8  수은 표준원액(100 mg Hg/L): 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 수은 표준액(1,000 mg Hg/L)을 1 N 질산 용액으로 희석하여 100 mg Hg/L 표준원액을 만든다. 저장용 표준용액은 1개월간 사용할 수 있으며, 검정용 표준원액은 1주일이 지나면 다시 만들어야 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  채취된 해수시료 400 mL를 산으로 세척한 경질의 유리병에 넣고 5 mL의 진한 질산을 첨가하여 산성화한 후 실험실로 옮긴다. 시작하기 전에 시료와 병무게를 측정하고 실험 후 빈병의 무게를 측정하여 시료의 양을 측정한다.

5.2  시료에 황산 용액(1 + 1) 20 mL와 5 % 과망간산칼륨 용액 10 mL을 넣어 혼합하고 약 15분간 색이 지속될 때까지 반복한다.

5.3  5 % 과황산칼륨 용액 10 mL을 첨가하고 95 °C 수욕조에서 2시간 동안 가열한 후 실온에서 방냉하고 염산히드록실아민 용액(10 % (w/v)) 8 mL를 첨가한다. 해수 중에는 수은이 극미량 들어있기 때문에 시료 중의 농도보다 시약 속에 포함된 수은 농도가 높을 수 있으므로 사전에 반드시 점검을 해야 한다. 시약 및 표준물질의 바탕 농도가 높을 경우, 5.2항 ∼ 5.3항의 과정은 생략해야 한다.

6. 시험방법

6.1  시료병에 기포발생장치를 넣은 후 20 % 염화제일주석 용액 10 mL을 신속히 첨가한다.

6.2  이 시료에 아르곤 기체를 80 mL/min의 유속으로 45분간 흘려보낸다. 이때, 기포발생장치에 의해 습기가 금에 응결되지 않도록 열선에 0.1 암페어를 흘려준다. 아르곤 기체의 흐름을 측정셀 쪽으로 전환하고 열선에 3.6 암페어를 흘려준다.

6.3  환원기화장치에서 발생한 기체는 수은포집장치에 포획되었다가 일시에 원자흡광광도계에 연결된 셀로 보내진다.

6.4  원자흡광광도계에서 253.7 nm의 흡광도를 측정하고 검정관계식을 이용하여 수은의 양을 구하고 농도를 산출한다.

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

7.1  원자흡광광도계용 표준용액을 이용하여 5개 정도의 표준용액(0.2 % 질산 용액으로 희석시킴)을 만든 후 검량선을 작성한다.

7.2  결과보고시에는 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도 및 검출한계를 기재하도록 한다.

7.3  결과 자료를 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 구한다.

┌────────────────────────────────┐

│수은의 농도(μg/L)  =  (검량선에서 구한 수은의 농도)            │

│                   - (검량선에서 구한 공시료의 농도)     (식 1) │

└────────────────────────────────┘

7.4  검출한계는 바탕용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱한 값(99 % 신뢰구간)에 바탕용액 농도의 평균값을 더하여 유의숫자 첫자리로 표현한다.

7.5  정밀도는 검정범위의 중간 표준용액을 7개 이상 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱하여(99 % 신뢰구간) ± 유의숫자 첫자리로 표현한다.

8. 참고사항

8.1  해수 중의 미량금속의 농도는 매우 미량이기 때문에 실험실 환경에서 분진에 의한 오염 가능성이 상존한다. 따라서, 미량금속의 분석환경은 HEPA 여과시설 및 수평기류가 가능한 청정시설의 구비가 필수적이다.

8.2  만일, 시료의 보관이 상당기간 동안 필요할 때에는 시료를 여과한 다음 질산으로 pH 1.5 ～ 2.0의 범위로 조절한 후 냉장 보관한다. 이 경우, 최대 2년까지 보관이 가능하다.

8.3  미량금속 분석에 사용되는 대부분의 시약과 용제는 이미 미량의 금속이 함유되어 있는 경우가 많다. 따라서, 농도가 낮은 시료를 측정하는 경우에는 유리 혹은 테프론 재질의 증류장치를 이용하여 시약과 용제를 재증류하거나 재결정하는 등의 정제과정이 필요하다.

8.4. 이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우, 사용할 수 있다.

제33항 수은(Hg) -냉증기원자형광분석법                       (Mercury- Cold  Vapor  Atomic  Fluorescence  Spectrometry)

1. 측정원리

여과하고 염산으로 처리된 해수시료에 염화 브롬액을 첨가하여 모든 수은 형태를 Hg(II)로 산화시키고 NH2OHㆍHCl(Hydroxylamine hydrochloride)으로 남아 있는 잔류 염소를 없애고, 염화 제2주석(SnCl2)으로 Hg(II)를 휘발성인 Hg(0)로 환원시킨 후, 아르곤 가스와 가스/액체 분리기로 휘발시켜 금-트랩에 아말감을 만든다. 이에 열을 가하여 수은을 휘발시키고 두 번째 금-트랩에 아말감이 되게 하고 마찬가지로 열을 가하여 원자형광분석기로 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 분석방법의 유효측정범위는 0.5 ∼ 100 ng/L 범위이고 청정작업환경에서 최고의 기기성능을 보유할 때 검출한계는 0.2 ng/L이고 시료량을 증가시키고 BrCl 양(0.2 %)을 최소화하며 주변 오염을 최소화하면 0.05 ng/L까지 향상시킬 수 있으며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  해수시료 보관병: 불화폴리머 재질의 병 또는 보로실리케이트 재질 유리병을 사용하고 미리 4 N 염산 혹은 진한 질산으로 12시간 동안 가열하여(70 °C) 산세척하고 초순수로 3번 이상 헹구며 0.4 % 염산 용액으로 채워 비닐백으로 이중 포장하여 보관한다. 이를 현장에 보낼 때는 약산(0.04 % 염산)이나 초순수를 채워 이동한다.

3.2  자동피펫 및 일회용 팁: 200 ㎕, 1 mL, 5 mL 피펫 및 피펫팁. 시약 주입시 사용한다.

3.3  분석기기: 냉증기 원자흡광광도계

4. 시약 및 표준물질

4.1  초순수: 전기 저항이 18 ㏁ 이상이 되는 물이다.

4.2  염산(Hydrochloric acid, 35 % (w/v)): 수은 함량이 5 ng/L 이하인 미량금속 분석용을 이용한다.

4.3  하이드록실아민 염화수소(Hydroxylamine hydrochloride, NH2OHㆍHCl) 용액: Hydroxylamine hydrochloride(시약급) 300 g을 초순수에 용해시키고 최종 부피를 1 L에 맞춘다. 이 용액에 20 % 염화제이주석 용액 1 mL를 넣고 수은이 없는 질소 가스로 4시간 이상 500 mL/min 속도로 폭기하여 수은을 제거한다.

4.4  염화제이주석 용액: 염화제이주석(SnCl2ㆍ2H2O) 200 g을 100 mL 진한 염산에 넣고 가열하면서 용해시킨다. 초순수로 최종부피 1 L가 되도록 한다. 수은이 없는 질소 가스로 4시간 이상 500 mL/min 속도로 폭기하여 수은을 제거하고 뚜껑을 잘 닫아 보관한다. 시약 및 표준물질을 제조하면서 열과 흄이 발생하므로 보호장구를 착용하고 흄 후드 안에서 작업한다.

4.5  염화브롬(BrCl) 용액: 브롬화칼륨(KBr) 27 g을 진한 염산 2.5 L에 녹인다. 이때, 테프론 코팅된 magnetic bar로 1시간 이상 교반한다.  여기에 시약급 브롬산칼륨(KBrO3) 38 g을 천천히 넣는다(주의: 격렬한 반응이 일어나 많은 양의 할로겐 가스를 방출하므로 반드시 소량씩 넣어준다). 소량씩 넣으면 용액의 색깔이 노란색에서 빨간색으로 최종적으로는 오렌지색으로 변한다. 병뚜껑을 살짝 닫고 1시간 정도 더 교반하고 뚜껑을 잘 닫는다. 이 시약 제조는 절대 흄후드 내부에서 이루어져야 한다.

4.6  수은 표준원액: 상용하는 1,000 mg/L 혹은 10,000 mg/L(NIST-3133) 용액을 사용한다.

4.7  수은 표준용액(1,000 ㎍/L): 초순수 0.5 L에 염화브롬 5 mL를 넣고 수은 표준원액 1.00 mL(1,000 mg/L) 혹은 0.10 mL(10,000 mg/L)를 첨가한 후 초순수로 최종 부피를 1 L가 되게 한다. 불화 폴리머 병에 보관하면 표준원액의 보존기간까지 안전하다.

4.8  검량선 수은 표준용액: 수은 표준용액을 초순수로 100배, 10,000배 희석하고 염화브롬 용액을 부피 비율로 0.5 %만큼 첨가한다(5 mL/L). 이 용액은 10 ng/mL 및 0.1 ng/mL가 되며 10 ng/mL 용액을 초순수로 희석하여 5 ng/L까지 만들면 된다. 이때에도 염화브롬 용액을 부피 비율로 0.5 %가 되게끔 첨가한다. 검량선용 표준용액은 분석할 때마다 새롭게 만든다.

4.9  질소 및 아르곤 가스(순도 99.999 %): 질소 및 아르곤 가스는 고순도를 사용하며 금이 코팅된 모래 트랩을 사용하여 수은을 정제하여 사용한다.

5. 시험방법

5.1  해수시료의 채취 및 보관 방법은 제2장 제2항 및 제3항을 따른다.

5.2  해수시료 분석준비

5.2.1  시료 분석 24시간 전에 해수 100 mL에 염화브롬 용액을 0.5 mL 첨가하여 노란색이 나타나도록 한다.

5.2.2  만약 노란색이 지속되지 않으면 염화브롬 용액을 추가로 0.5 mL 첨가하며 유기물이나 황화물이 많은 시료에 대해서는 노란색이 지속되도록(적어도 12시간 동안) 더 많은 염화브롬 용액을 첨가한다.

5.2.3  해수시료별로 첨가한 염화브롬 용액이 다를 경우, 실험방법 공시료를 달리 제조한다.

5.2.4  매질첨가 및 매질첨가 반복시료를 제조한다.

5.2.5  염화브롬 용액으로 산화시킨 시료에 하이드록실아민염화수소 용액 0.2 ∼ 0.25 mL를 첨가하고 뚜껑을 닫고 흔들어 주면 노란색이 없어지면 수은 분석 준비가 완료된다.

5.3  수은 분석

5.3.1  본 방법은 흐름 주입(Flow Injection) 방법을 기준으로 작성되었으므로 동일 성능의 다른 기기의 경우, 해당 매뉴얼을 참고한다.

5.3.2  분석 1시간 전에 수은분석기를 가동시킨다.

5.3.3  염화제이주석 용액, 초순수를 연속주입장치에 연결하고 유로에 남아있을 수 있는 수은을 제거하며 시약 공시료를 사용하여 자동 시료 주입기를 포함하는 유로를 세척한다.

5.3.4  EPA 1631법에 해당하는 소프트웨어를 작동시키고 검량선부터 시료를 분석한다.

6. 결과

6.1  최종농도 계산: 용존 수은은 희석하지 않고 직접 분석하기 때문에 희석 배율이 필요하지 않다. 염화브롬 용액 및 하이드록실아민염화수소는 검량선용 표준용액에도 같은 부피로 첨가되므로 결과에 영향을 주지 않는다. 해수시료의 수은 농도는 다음 식을 사용한다.

      (식 1)

6.2  정도관리 자료 보고: 7.0에서 제시한 정도관리 내용을 보고한다.

6.2.1  검량선의 기울기, Y-절편, 결정계수(R2)

6.2.2  실험방법 공시료의 평균 농도

6.2.3  검출한계

6.2.4  매질첨가 회수율(%) 및 매질첨가 반복시료간 상대차율

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

본 분석법에서는 다음과 같은 정도관리 항목을 포함시키며 필요한 경우, 다른 정도관리 프로그램을 첨가할 수 있다.

7.1  검량선

7.1.1  검량선 작성을 위해 준비된 표준용액을 3번 반복하여 측정하며 표준용액은 검량선 공시료를 포함하여 5개 농도구배 이상을 포함해야 한다.

7.1.2  각 표준용액에 대한 신호세기 평균값에서 검량선 공시료의 평균 신호세기를 뺀다.

7.1.3  각 표준용액 수은 농도에 해당되는 보정된 신호세기를 이용하여 검량선을 최소자승법으로 작성하고 검량선의 기울기, Y-절편 및 결정계수 값을 기록한다.

7.1.4  검량선 인자(Calibration Factor)를 계산하여 검량선이 이용 가능한지를 판단한다.

              (식 2)

7.1.5 CF 값의 평균과 표준편차를 구하여 상대표준편차가 15 % 이내이면 검량선을 이용하고 15 %를 벗어나면 검량선을 재작성한다.

7.2  공시료

해수시료의 총 수은 분석은 공시료 값을 얼마만큼 낮추는가가 절대적인 요소이다. 따라서, 시료 이외에 수은으로 오염될 가능성이 있는 것에 대해 점검해야 하며 공시료는 다음 사항이 최소 요건이며 필요에 따라 다른 공시료를 추가할 수 있다.

7.2.1  시약 공시료: 사용하는 시약의 수은 농도를 확인하는 것으로 0.5 % (v/v) 염화브롬 용액 및 0.2 % (v/v) 하이드록실아민염화수소 용액에서의 수은 농도를 분석한다. 이 값이 검량선 표준용액 중 가장 낮은 수은 농도의 반응세기보다 낮아야 한다.

7.2.2  실험방법 공시료: 시료와 같은 처리(용기, 기구, 시약, 분석 과정)를 하여 제조하고 분석한다. 한 실험구당 최소 3개 이상을 만들고 분석하며 시료 중 수은 농도 계산시 반영한다.

7.3  표준용액 첨가 및 반복시료: 분석 방법이 해당 시료의 매질에 문제가 없는지를 확인하기 위하여 현장시료 개수의 10 %에 해당되는 수만큼의 표준용액 첨가시료와 표준용액 첨가반복시료를 만든다. 즉, 20개 시료이면 2개의 표준용액 첨가시료와 2개의 첨가반복시료를 제조한다.

7.3.1  첨가하는 표준용액의 농도는 해수에서의 최저 농도의 5배로 한다.

7.3.2  회수율은 다음과 같이 계산하고 80 ∼ 120 % 이내가 되어야 한다.

        (식 3)

7.3.3 표준용액 첨가반복시료의 경우, 상대차율을 다음과 같이 계산하며 30 % 이내가 되어야 한다.

                (식 4)

7.4  검출한계: 실험방법 공시료 7개를 분석하여 농도의 평균값과 표준편차를 계산하고 표준편차에 3.14를 곱한 농도 값을 검출한계로 정한다.

8. 분석절차 흐름도

┌──────────┐                                                  

│여과하고 산 처리한  │100 mL                                            

│  해수시료          │                                                  

└──────────┘                                                  

┌──────────┐                                                  

│ 24시간 전 BrCl     │0.5 mL                                            

└──────────┘                                                  

                        ? 유기물 또는 황하물이 많은 해수에는 BrCl 0.5    

                        mL 추가 주입                                      

                        ? 노란색이 유지되도록 BrCl 추가                  

┌──────────┐                                                  

│정도관리시료 제조   │                                                  

└──────────┘                                                  

                        ? 검량선용 표준용액 (공시료 포함 5개 농도)       

                        ? 실험방법 공시료                                

                        ? 매질 첨가 시료                                 

                        ? 매질 첨가 반복시료                             

┌──────────┐                                                  

│ NH2OH : HCL        │0.25 mL 첨가                                      

└──────────┘                                                  

                        ? 염소 제거로 노란색이 무색화 됨                 

┌──────────┐                                                  

│기기측정 및 검량선  │                                                  

└──────────┘                                                  

그림 1. 수은 냉증기원자형광분석법

9. 참고사항

9.1  주변 오염원 및 오염방지 방법은 제2장 제2항 및 제3항을 따른다.

9.2  금-트랩이 잔류 염소가 투입되거나 500 °C 이상으로 과열되었을 때 파손될 수 있다.

9.3  수증기가 금-트랩에 잡혀 원자형광셀에 영향을 줄 수 있다.

9.4. 형광 세기는 운반기체에 있는 분자들에 의해 영향받을 수 있으므로 고순도의 가스를 사용해야 한다.

9.5  강한 염산과 염화브롬액을 사용하기 때문에 시약 제조와 시료 처리시에 피부 접촉이나 흄을 마시지 않도록 각별히 주의해야 한다.

9.6  실험복을 자주 세탁할 것을 권장한다.

9.7  실험 후에는 비누 등을 이용해서 손과 얼굴 등을 씻는다.

9.8  시약에 대한 자세한 안전지침은 개별 물질의 안전지침을 따른다.

9.9  실험 중 발생한 유해 폐액과 폐기물은 해당 기관의 지침을 우선으로 한다.

9.10  폐기물 처리는 처리 시설을 갖춘 업체에 위탁한다.

9.11  본 지침서에서 발생하는 폐액의 대부분은 산폐액이다. 따라서, 산폐액 보관 용기에 폐액을 모으고 산폐액통은 그늘지고 서늘한 장소에서 보관한다.

제34항 알킬수은(Alkyl  Mercury)

1. 측정원리

알킬수은 화합물을 벤젠으로 추출하여 L-시스테인 용액에 선택적으로 역추출하고 다시 벤젠으로 추출하여 기체크로마토그래프법으로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래프를 이용한 해수 중 알킬수은의 기기 유효측정범위는 일반적으로 0.5 μg Hg/L 이상이다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.5 μg Hg/L 정도이며 표준편차율은 0.3 ∼ 9.0 %의 범위이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

3.1.1  분석에 사용되는 모든 초자기구류는 반드시 0.1 N 염산 용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 보관 혹은 분석 반응시에 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 오염을 차단해야 한다.

3.1.2  분액깔때기: 25 mL, 500 mL 경질 유리재질 분액깔때기

3.2  기체크로마토그래프

3.2.1  분리관(column): 유리제, 안지름 3 mm, 길이 40 ～ 150 cm

3.2.2  컬럼 충진물질(packing material): 크로마토그래피용 크로모솔브 W(알킬 수은 시험용)나 이와 동등한 규격의 충진제에 크로마토그래프용 DEGS를 5 ～ 25 % 침윤시킨 것.

3.2.3  검출기(detector): 전자포획형 검출기(electron capture detector : ECD).

3.2.4  헬륨기체: 99.999 % 이상의 고순도이어야 한다.

3.2.5  운반기체 유속: 30 ∼ 80 mL/min

3.2.6. 시료도입부 온도: 140 ∼ 240 °C

3.2.7  오븐온도: 130 ∼ 180 °C

3.2.8  검출기 온도: 140 ∼ 200 °C

4. 시약 및 표준물질

4.1  산 및 유기용매

4.1.1  염산(HCl)

4.1.2  벤젠(C6H6)

4.2  20 % 염화나트륨 용액: 염화나트륨 20 g을 초순수에 녹여 100 mL가 되게 한다.

4.3  L-시스테인-초산나트륨혼합액: L-시스테인염산염(1수화물) [HSCH2CH(NH2)COOHHClC3H7ㆍH2O] 1 g, 초산나트륨(3수화물) (CH3COONaㆍ3H2O) 0.8 g 및 무수황산나트륨 12.8 g을 초순수에 녹여 100 mL로 한다.

4.4  무수황산나트륨(Na2SO4): 잔류농약 분석용

4.5  알킬수은 표준원액(1,000 mg Hg/L): 염화메틸수은(CH3HgCl) 0.125 g을 벤젠에 녹여 100 mL로 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 채수된 해수시료 200 mL를 500 mL 분액깔때기에 넣고 암모니아수 또는 염산으로 중화한 다음 염산을 넣어 약 2 N 산성으로 만든다.

5.2  벤젠 50 mL를 넣고 2분간 흔들어 섞고 정치한 다음, 수층을 다른 50 mL 분액깔때기에 옮기고 벤젠층을 보존한다.

5.3  다시 수층에 벤젠 50 mL를 넣고 2분간 흔들어 섞고 정치하여 수층은 버리고 전체 벤젠층을 합한다.

5.4  분액깔때기에 20 % 염화나트륨 용액 20 mL를 넣어 1분간 세게 흔들어 섞어서 벤젠층을 씻어주고 정치한 다음 수층을 버린다.

5.5  벤젠층에 L-시스테인-초산나트륨 혼합액 8 mL를 넣어 2분간 흔들어 섞고 정치하여 수층을 25 mL 분액깔때기에 옮긴다.

5.6  분액깔때기에 염산 2 mL와 벤젠 5 mL를 넣어 2분간 흔들어 섞고 정치하여 수층을 버린다. 벤젠층은 5 ～ 10 mL 공전시험관에 옮기고 무수황산나트륨을 넣어 탈수시킨다.

6. 시험방법

6.1  마이크로 실린지를 사용하여 추출액 일정량을 기체크로마토그래프에 주입한다.

6.2  얻어진 크로마토그램에서 각 알킬수은에 대하여 검정용 표준용액의 머무름 시간(retention time)을 기록한다.

6.3  검정용 표준용액의 체류시간과 시료 중 각 피크의 체류시간을 비교하여 성분을 확인한다.

6.4  크로마토그램에서 얻은 각 피크의 면적과 각 성분의 농도별 검량선식을 이용하여 시료 중의 농도를 계산한다.

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

7.1  크로마토그램의 피크면적과 농도의 검량선식을 구하기 위하여 적당한 농도범위에서 적어도 4가지 농도(예: 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 μg Hg/L)로 검정용 표준용액을 제조한다. 표준용액은 표준원액을 벤젠으로 희석하여 만든다.

7.2  검정용 표준용액을 위 6.1 ～ 6.2항의 과정에 따라 분석한 후 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 구한다.

7.3  얻어진 검량선식은 측정 당일에 한 개 이상의 검정용 표준용액을 분석하여 검증해야 한다. 검증의 빈도는 검출기의 종류에 따라 다르다. 검증 결과, 분석되는 성분의 결과값 차이가 ± 15 % 이상일 경우에는 검정관계식을 새로 구해야 한다.

7.4  바탕용액과 검정용 표준용액은 각 농도별로 2개 이상 복수로 분석되어야 한다.

7.5  검출한계는 바탕용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱한 값(99 % 신뢰구간)에 바탕용액 농도의 평균값을 더하여 유의숫자 첫자리로 표시한다.

7.6  정밀도는 검정 범위의 중간 표준용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.707을 곱하여(99 % 신뢰구간) ± 유의숫자 첫 자리로 표시한다.

7.7  결과보고시에는 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도, 검출한계를 기재하도록 한다.

8. 참고사항

이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우, 사용할 수 있다.

제35항 페놀류(Phenols)

1. 측정원리

증류한 시료에 염화암모늄-암모니아 완충액을 넣어 pH 10으로 조절한 다음, 4-아미노안티피린과 페리시안화칼륨을 넣어 생성된 적색의 안티피린계 색소의 흡광도를 측정하는 방법으로 수용액에서는 510 nm, 클로로포름 용액에서는 460 nm에서 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 시험기준

 이 시험 기준으로는 시료 중의 페놀 종류별로 구분하여 측정할 수 없다.

은 해수 및 해양심층수에 적용할 수 있으며, 정량한계는 추출법: 0.092 mg/L, 직접법: 0.5 mg/L 이다.

3. 기구 및 기기

3.1  분광광도계(spectrophotometer)

3.2  증류장치

그림 1. 페놀 증류장치

4. 시약 및 표준물질

4.1  메틸오렌지 용액(0.1 % (w/v)): 0.1 g의 메틸오렌지를 100 mL의 뜨거운 증류수(약 80 °C)에 녹인 후 방냉한다.

4.2  염화암모늄-암모니아 완충용액(pH 10): 염화암모늄 67.6 g을 암모니아수 570 mL에 녹인 후 초순수를 넣어 1 L로 한다. 유리 마개 병에 넣어 냉소에 보관한다.

4.3  2 % 4-아미노안티피린 용액: 4-아미노안티피린(C11H13N3O) 2 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다. 이 용액은 분석 당일 매번 새롭게 만든다.

4.4  페리시안화칼륨 용액: 페리시안화칼륨 [K3Fe(CN)6] 9 g을 증류수에 녹여 100  mL로 만든다. 24시간 안에 사용한다.

4.5  클로로포름(CHCl3)

4.6  무수황산나트륨

4.7  페놀 표준원액(1,000 mg C6H5OH/L): 페놀 1 g을 증류수에 녹여 정확히 1,000  mL로 하고 차광용기에 보관한다.

4.8  페놀 표준용액(10 mg C6H5OH/L): 페놀 10 mg에 대응하는 페놀 표준원액의 부피(약 10 mL)를 정확히 취하고 초순수를 넣어 1 L로 한다. 사용할 때마다 조제한다.

4.9  페놀 표준용액(1 mg C6H5OH/L): 페놀 표준원액 1 mL를 증류수에 넣어 정확히 1,000 mL로 한다. 이 시약은 분석 당일 조제해야 한다.

4.10  황산구리 용액(10 %): 황산구리ㆍ5수화물(cupric sulfate pentahydrate, CuSO4ㆍ5H2O, 분자량: 250.00) 100 g을 초순수 녹여 1 L로 한다.

4.11  헥사시안화철(Ⅲ)산칼륨 용액(9 %): 헥사시안화철(Ⅲ)산칼륨(potassium ferricyanide, K3Fe(CN)6, 분자량: 329.24) 약 9 g을 소량의 초순수를 사용하여 표면을 씻고 초순수에 녹여 100 mL로 한다. 필요하면 여과하고 24시간 안에 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료 250 mL를 500 mL 증류플라스크에 넣고 메틸오렌지용액 0.1 % 수방울을 넣은 다음, 10 % 인산용액을 넣어 pH 4로 조절한 후 황산구리 용액 2.5 mL를 넣는다.

5.2  증류플라스크를 증류장치의 냉각관과 연결하고 250 mL 매스실린더를 수기로 사용한다.

5.3  증류시 유리섬유 등을 사용하여 시료가 튀어서 수기에 들어가지 않게 주의하며, 증류액이 225 mL가 되었을  때 가열을 중지하고 증류플라스크에 증류수 25 mL를 넣어 다시 증류를 시작하고 전 증류액이 250 mL가 되었을 때 증류를 끝낸다. 증류액이 혼탁할 때에는 증류 조작을 반복하여 재증류한다.

6. 시험방법

6.1  추출법

6.1.1  시료 100 mL를 정확히 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣고 염화암모늄-암모니아 완충액(pH 10.0) 3.0 mL를 넣어 섞고 pH를 9.8 ∼ 10.2로 조절한다.

6.1.2  2 % 4-아미노안티피린 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞고 페리시안화칼륨 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞은 다음 3분간 방치한다.

6.1.3  클로로포름 10 mL를 정확히 넣어 1분 이상 세게 흔들어 섞어 정치하고 클로로포름층에 무수황산나트륨 약 1 g을 넣어 탈수시킨 다음 일부를 1 cm 셀에 옮겨 시료로 한다. 따로 증류수 100 mL를 사용하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕용액으로 한다.

6.1.4  바탕용액으로 영점을 조정하여 460 nm에서 시료의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검정관계식을 이용하여 페놀의 농도(mg/L)를 산출한다.

6.2  직접측정법

6.2.1  시료 100 mL를 정확히 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣고 염화암모늄?암모니아 완충액(pH 10.0) 3.0 mL를 넣어 섞고 pH를 9.8 ∼ 10.2로 조절한다.

6.2.2  2 % 4-아미노안티피린 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞고 페리시안화칼륨 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞은 다음 3분간 방치한다.

6.2.3  이 용액의 일부를 1 cm 셀에 옮겨 시료로 한다. 따로 증류수 100 mL를 사용하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕용액으로 한다.

6.2.4  바탕용액으로 영점을 조정하여 510 nm에서 시료의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검정관계식을 이용하여 페놀의 농도(mg/L)를 산출한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  정확도 및 정밀도의 측정은 제3장 제3항 정도평가/정도관리에 따른다. 초순수에 정량한계의 1 ∼ 10배와 같은 농도가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하여, 분석절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

7.2  정확도는 첨가한 표준물질의 농도에 대한 측정 평균값의 상대 백분율로써 나타내며 그 값이 75 ∼ 125 % 이내이어야 한다.

7.3  정밀도는 측정값의 % 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

8. 결과

검정곡선은 농도에 대한 흡광도로 작성한다. 시료의 농도는 표준용액의 흡광도에 대한 시료의 흡광도를 비교하여 계산한다.

페놀류(mg/L) = (y-b)/a × I                        (식 1)

여기서,               y : 시료의 흡광도

                     b : 검정곡선의 절편

                     a : 검정곡선의 기울기

                     I : 시료의 희석배수

제36항 유기인계 농약류(Organophosphorus Pesticides)

1. 측정원리

해수 중의 유기인계 농약(Organophosphorus Pesticides)은 디클로로메탄으로 추출하고 수분 제거를 위하여 무수황산나트륨에 추출 용액을 통과시킨 후 농축하고 질소-인 검출기(Nitrogen Phosphorus Detector, NPD), 불꽃광도 검출기(Flame Photometric Detector, FPD) 혹은 질량분석기(Mass Spectrometer Detector, MSD)가 부착된 기체크로마토그래피를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래프를 이용한 해수 중 유기인계 농약의 기기 유효측정범위는 일반적으로 검출한계에서 200 μg/L까지이다. 일반적인 기기 검출한계는 각 성분의 측정감도와 검출기의 종류에 따라 차이가 있는데 99 % 신뢰구간에서 질소-인 검출기가 0.5 μg/L이고, 불꽃광도검출기가 0.04 μg/L이며, 표준편차율은 0.3 ∼ 9.0 %의 범위이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료 채취용 유리병: 테프론 덮개가 있는 뚜껑이 달린 2.0 L 용량

3.1.2  분액깔때기: 테프론 혹은 유리 마개가 부착된 2 L 용량

3.1.3  매스실린더: 50, 100 mL 용량과 1 L 용량

3.1.4  페어플라스크(Pear-type flask) 혹은 둥근바닥 플라스크: 회전 증발기에 사용되는 100 mL와 250 mL 용량

3.1.5  유리컬럼: 길이 30 cm, 내경 1 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브, pH 페이퍼

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도 조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도 조절이 가능한 기기

3.2.3  질소농축기

3.2.4  기체크로마토그래피: 표 1과 같은 조건으로 분석이 가능한 기기

표 1. 유기인 기체크로마토그래프 분석조건의 예

┌────────────────────┬──────────────────────┐

│검출기                                  │질소-인 검출기(NPD),                        │

│                                        │불꽃 광도 검출기(FPD, 인 필터 부착)         │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│컬 럼                                   │모세관 컬럼                                 │

│                                        │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μM, 길이 30 m)│

├────────────────────┼──────────────────────┤

│충전제                                  │5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane        │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│운반기체                                │헬륨(99.999 %)                              │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│운반기체 유속                           │1.5 mL/분(등속)                             │

│ 유속은 기기 사양에 따라 달라질 수 있다.│                                            │

│                                        │                                            │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│검출기 기체                             │수소(99.999 %)와 공기(99.999 %)             │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│시료주입구 온도                         │280 °C                                     │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│검출기 온도                             │300 °C                                     │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│오븐 초기온도                           │120 °C에서 3분간 유지                      │

├────────────────────┼──────────────────────┤

│오븐 온도 승온속도                      │분당 5 °C로 270 °C까지 승온 후 5분간 유지 │

└────────────────────┴──────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.2  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 120 °C에서 보관하고 사용 직전 상온에서 식혀 사용

4.3  유리섬유: 400 °C에서 4시간 동안 구운 매트형 유리섬유를 사용 전에 가위로 적절한 크기로 절단하여 사용

4.4  표준용액

4.4.1  표준용액(standard solution, STD): 분석하고자 하는 유기인계 농약(메틸디메톤, 다이아지논, 파라티온, 펜토에이트, 이피엔 등) 10 mg을 정확히 정량하여 10 mL의 매스플라스크에 넣고 노말-헥산에 녹여 10 mL이 되도록 한다. 상용으로 제조된 표준용액을 구입하여 사용할 수도 있다. 표준용액은 빛이 들어가지 않도록 차광용기에 4 °C에서 보관하고 저장용 표준용액은 1년이 지나면 새로 제조해야 하며 만약 이상이 있을 때는 새롭게 준비한다.

4.4.2  대체표준물질(surrogate, SU): 해수시료로부터 분석 대상인 유기인계 농약의 회수율을 검정하기 위하여 대체표준물질로 트리부틸인산(tributyl phosphate)을 사용하며 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다. 크로마토그램에서 피크가 겹칠 경우, 질소-인검출기에서는 클로로니트로벤조트리플루오라이(4-chloro-3-nitrobenzo-trifluoride)를 사용할 수도 있다.

4.4.3  GC 내부표준물질:(Internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위하여 사용되는 표준물질로 트리페닐인산(triphenyl phosphate)를 사용하며 그 농도는 200 ng/mL이 되도록 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

현장에서 채수된 해수시료는 사전에 세척된 2.0 L 차광 유리용기에 담아 냉장 보관하여 실험실로 옮겨 즉시 추출하거나 현장에서 추출한 후 추출액을 냉장하여 실험실로 운반해야 한다. 추출액은 냉장 상태에서 보관할 경우, 40일 내에 분석해야 한다. 일부 유기인계 농약들은 염화수은을 첨가하고 냉장 보관하더라도 분해되므로 채취 즉시 용매 추출과 농축의 전처리 과정을 실시해야 한다.

6. 시험방법

6.1  용매추출과 농축

6.1.1  해수시료 1 L를 2 L용 분액깔때기에 옮기고 시료에 대체표준물질 트리부틸 인산(tributyl phosphate)을 100  ng 첨가하여 혼합한다. 해수시료에 pH 검출지를 이용하여 시료의 pH가 5 ∼ 9의 범위에 있는지 확인한다.

6.1.2  분액깔때기에 디클로로메탄 50 mL을 넣은 후 10분간 격렬히 흔들어 추출한다. 분액깔때기를 30분간 방치하여 시료와 용매의 층이 완전히 분리되게 한다 (주의: 분액깔때기로 추출할 때 1분 동안 2 ∼ 3회 흔들고 난 후 반드시 분액깔때기의 콕크를 위로 향하게 한 후 콕크를 열어 내부 압력을 빼주어야 한다).

6.1.3  분리되는 과정에서 일부 두 층이 함께 섞어 거품 형태의 에멀젼이 생기면 얇고 긴 유리막대로 저어서 이 에멀젼을 깨뜨리고 육안으로 섞이지 않은 두 층이 분배가 일어나도록 한다.

6.1.4  분액깔때기의 윗마개를 연 상태에서 아랫부분에 있는 디클로로메탄층을 분액깔때기 코크를 조심스레 열어 100 mL 메스실린더로 흘러준다. 회수된 디클로로메탄의 부피가 적어도 85 % 이상이 되어야 하며 100 %가 넘으면 디클로로메탄에 수층이 포함되어 있으므로 다시 추출 분배 과정을 거친다 (주의: 디클로로메탄층이 수층과 함께 섞어 들어오지 않도록 주의해야 한다).

6.1.5  재추출을 위하여 6.1.2항의 과정을 반복하고 하부의 디클로로메탄층은 6.1.4항에서 얻어진 디클로로메탄층과 합친다.

6.1.6  합쳐진 디클로로메탄층을 무수황산나트륨 컬럼을 통과시켜 수분을 제거한다. 컬럼에 통과된 추출액을 250 mL 플라스크에 받는다.

6.1.7  회전증발기를 이용하여 추출 용액이 2 ∼ 3 mL 정도로 농축한다. 사용된 100 mL 메스실린더는 노말-헥산 용액 30 mL로 충분히 헹구고 이 용액은 다시 회전증발기 플라스크에 옮긴 후 2 ∼ 3 mL가 되도록 농축한다 (주의: 회전증발기로 농축과정에서 분석물질의 손실을 막기 위하여 회전증발기 플라스크의 온도를 30 °C 정도로 하고 150 hPa정도의 약한 압력하에서 감압하며 특히 플라스크가 완전 건조되지 않도록 한다).

6.1.8  농축된 시료는 차광용 기체크로마토크래피 바이알에 옮겨 고순도 질소 기체를 이용하여 측정용 시료의 부피가 1 mL가 되도록 하며 GC 내부표준물질 트페닐인산(triphenyl phosphate)을 20 ng을 첨가한다.

6.2  기체크로마토그래피 분석

6.2.1  6.1.8.에서 제조된 측정용 시료 2 μL를 기체크로마토크래피 주입부에 주입한다.

6.2.2  얻어진 크로마토그램에서 각 유기인계 농약의 표준물질의 머무름 시간을 비교하여 성분을 확인하고 각 성분의 피크 면적을 측정한다.

6.2.3  유기인계 표준물질에 대하여 농도별 관계식을 사용하여 해수시료 중의 각 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

┌──────┐                                            

│해수시료 1L │                                            

└──────┘┌────────────────────┐

                │대체 표준 물질 (tributyl phosphate)     │

┌──────┐└────────────────────┘

│추출        │  (분액 깔때기; 디클로로메탄; 0.5 시간)     

└──────┘                                            

┌──────┐                                            

│농축        │                                            

└──────┘                                            

┌──────┐                                            

│용매 치환   │  (디클로로메탄 → 노말-헥산)               

└──────┘                                            

┌──────┐                                            

│정제        │  (무수 황산나트륨)                         

└──────┘┌────────────────────┐

                │GC 내부 표준 물질 (triphenyl phosphate) │

┌──────┐└────────────────────┘

│GC 분석     │                                            

└──────┘                                            

그림 1. 유기인 분석절차

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  검출한계

증류수 1 L에 표준용액을 정량한계(1 ng/L)만큼 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료에 대하여 분석절차를 거쳐 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 검출한계로 한다.

8.2  검량선 작성 및 검증

8.2.1  검량선 작성 및 감응계수 계산: 각 유기인계 농약의 표준용액을 노말-헥산으로 희석하여 적당한 농도 범위에서 적어도 4가지 농도로 검정용 표준용액(예: 5, 10, 15, 20 μg/L)을 제조한다. 검량선 x축은 내부표준물질(IS)의 양에 대한 표준물질(S)의 양을 나타내고 y축은 내부표준물질과 표준물질에서 기체크로마토그램에서 얻어진 면적의 비로 나타낸다. 두 축의 그래프에서 얻어진 기울기를 감응계수(response factor, RF)라 하며 분석 대상인 유기인계 농약의 표준물질에 대하여 각각의 RF 값을 얻는다.

그림 2. 표준물질의 검량선

                              (식 1)

     여기서.  AS: 표준물질에 대한 GC 신호의 면적

              AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

              IS: 표준물질에 대한 양(ng)

              IIS: 내부표준물질에 대한 양(ng)

8.2.2  검량선 검증: 얻어진 검량선식은 측정 당일에 한 개 이상의 검정용 표준용액을 분석하여 검증해야 한다. 검증의 빈도는 검출기의 종류에 따라 다르다. 만약 검증 결과 분석되는 성분의 농도가 ± 15 % 이상일 경우, 검정관계식을 새로 구해야 한다.

8.3  정확도

8.3.1  대체표준물질의 회수율

8.3.1.1  6.2.3항에서 측정된 값으로부터 대체표준물질에 대한 감응계수(RFSU)를 8.2.1항과 같은 방법으로 각각 얻는다.

8.3.1.2  실제 시료 속에 첨가된 대체표준물질(SU)과 GC 내부표준물질(IS)의 기체 크로마토그램의 신호 면적과 첨가된 GC 내부표준물질의 양으로부터 회수된 대체 표준물질의 양(ISU, ng)을 아래와 같은 식으로부터 계산한다.

                               (식 2)

여기서,            RFSU: 각 검증대체 물질에 대한 감응계수

                   AIS: 내부 표준물질에 대한 GC 신호의 면적

                   IIS: 내부 표준물질에 대한 양(ng)

                   ASU: 대체 표준물질에 대한 GC 신호의 면적

                   ISU: 대체 표준물질에 대한 양(ng)

8.3.1.3  회수율은 실제 시료에 첨가된 대체표준물질의 양에 대한 GC 분석결과 계산된 양의 비율로 나타낸다.

             (식 3)

8.3.2  시료에 첨가된 표준물질의 회수율

낮은 유기인계 농약을 가진 해수시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후 8.3.1 항과 동일한 방법으로 실험을 수행한 후 회수된 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

          (식 4)

8.3.3  회수율이 60 ∼ 130 % 이내에 들어오지 않을 경우, 계산과정과 분석과정의 문제점을 점검해야 한다. 특히 회수율 검정을 위한 내부표준물질이 분해되었거나 오염 정도와 기기의 상태를 점검해 보아야 한다. 문제가 있는 시료에 대해서는 재분석을 실시한다.

8.4  정밀도

정밀도는 규정된 조건하에서 측정값들 간의 근접 정도를 나타내는 것으로 검량선에 사용되는 농도 범위에서 중간 농도에 해당되는 표준용액을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다. 이 실험으로부터 얻은 평균값과 표준편차로부터 변동계수를 구하고 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

                        (식 5)

          CV: 변동계수(Coefficient of variation)

          SD: 표준편차(Standard Deviation)

          x‘: 평균값

9. 결과

9.1  농도계산

분석 대상의 각 유기인계 농약의 농도는 아래 식을 사용하여 구한다.

                         (식 6)

            RF: 각 유기인계 농약 표준물질에 대한 감응계수

            AIS : GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

            IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

            AOPP : 각 유기인계 농약에 대한 GC 신호의 면적

            v: 분석에 사용된 해수의 양(l)

            C: 해수 1L에 들어있는 유기인계 농약의 농도(ng/L)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각각의 유기인계의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  각 유기인계 농약의 연안 해수 중의 농도는 극히 낮아서 검출한계 이하에서 수 μL/L 수준이 검출된다. 일부의 유기인계 농약은 초음파 추출과정에서 파괴될 수 있으므로 초음파를 이용한 해수 추출방법은 사용하지 않는 것이 좋다.

10.2  유기인계 농약의 검출에 전자포획검출기(ECD)를 사용할 수도 있으나 질소-인 검출기(NPD)나 불꽃 광도 검출기(FPD)보다 선택성이 떨어지므로 방해 물질의 영향을 크게 받게 된다. 전자포획검출기를 사용할 경우에는 방해물질이 정량분석에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한 후에 사용해야 한다.

10.3  이 방법 이외의 분석 방법으로 분석하고자 할 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우, 사용할 수 있다.

제37항 폴리클로리네니티드비페닐(Polychlorinated  Biphenyls,  PCBs)

1. 측정원리

해수 중의 Polychlorinated Biphenyls(PCBs)은 디클로로메탄으로 추출하여 농축한 후 알루미나-실리카겔-무수황산나트륨 컬럼을 통과시켜 분석 방해물질 및 수분을 제거하고 전자포획검출기(Electron Capture Detector, ECD)가 부착된 기체크로마토그래피로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 기체크로마토그래프의 시료 주입량을 늘림으로써 유효측정범위를 조정할 수 있는데, 1 L의 시료를 사용하였을 경우, 각 화합물에 대한 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 10 ng/L 정도이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료 채취용 유리병: 테프론 덮개가 있는 뚜껑이 달린 2.0 L 용량

3.1.2  분액깔때기: 테프론 혹은 유리마개가 부착된 2 L 용량

3.1.3  매스실린더: 50, 100 mL 용량과 1 L 용량

3.1.4  페어플라스크(pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL와 250 mL 용량

3.1.5  유리컬럼: 길이 30 cm, 내경 1 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브, pH 페이퍼

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도 조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도 조절이 가능한 기기

3.2.3  질소 농축기

3.2.4  기체크로마토그래피

표 1.  PCBs 기체크로마토그래프 분석조건의 예

┌───────────┬───────────────────────┐

│검출기                │전자포획검출기(Electron Capture Detector)     │

├───────────┼───────────────────────┤

│컬  럼                │모세관 컬럼                                   │

│                      │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μM, 길이 30 m)  │

├───────────┼───────────────────────┤

│충전제                │5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane          │

├───────────┼───────────────────────┤

│운반기체              │헬륨(99.999 %)                                │

├───────────┼───────────────────────┤

│운반기체 유속         │1.2 mL/분(등속)                               │

├───────────┼───────────────────────┤

│검출기 기체           │질소(99.999 %), 30 mL/분                      │

├───────────┼───────────────────────┤

│시료 주입구 온도      │280 °C                                       │

├───────────┼───────────────────────┤

│검출기 온도           │300 °C                                       │

├───────────┼───────────────────────┤

│오븐 초기온도         │100 °C에서 1분간 유지                        │

├───────────┼───────────────────────┤

│오븐 온도 1차 승온속도│분당 5 °C로 140 °C까지 승온 후 1분간 유지   │

├───────────┼───────────────────────┤

│오븐 온도 2차 승온속도│분당 1.5 °C로 250 °C까지 승온 후 1분간 유지 │

├───────────┼───────────────────────┤

│오븐 온도 3차 승온속도│분당 10 °C로 300 °C까지 승온 후 5분간 유지  │

└───────────┴───────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1 노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2 디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.2  1 % 함수 알루미나: 컬럼 크로마토그래피용 알루미나를 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후 99 g을 차광용기에 넣고 실온까지 냉각한다. 차광용기에 유리 피펫을 이용하여 증류수 1 mL를 넣어 첨가하고 마개를 막고 충분히 혼합한다.

4.3  5 % 함수 실리카겔: 컬럼크로마토그래프용 실리카겔을 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후 95 g을 갈색 삼각플라스크에 달아 넣고 실온까지 냉각한다. 실리카겔을 교반하면서 피펫을 사용하여 초순수 5 mL를 넣어 함수시키고 마개를 막고 발열이 종료할 때까지 조용하게 혼합한다. 경우에 따라 진탕기로 30분간 진탕시킨 후 데시케이터(건조제: 실리카겔)내에 마개를 막고 15시간 이상 보관한 후에 사용한다.

4.4  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 120 °C에서 보관하고 사용 직전 상온에서 식혀 사용

4.5  유리섬유: 400 °C에서 4시간 동안 구운 매트형 유리섬유를 사용 전에 가위로 적절한 크기로 절단하여 사용

4.6  표준용액

4.6.1  표준용액(standard solution, STD): 분석하고자 하는 22종의 고순도의 PCBs를 말하며 각 PCBs에 대한 검량선 작성에 사용된다.

PCB8, PCB18, PCB28, PCB29, PCB44, PCB52, PCB66, PCB87, PCB101, PCB105, PCB110, PCB118, PCB128, PCB138, PCB153, PCB170, PCB180, PCB187, PCB195, PCB200, PCB206, PCB209 검량선 작성을 위하여 22종 PCBs가 들어 있는 혼합 표준용액을 3개 이상의 서로 다른 농도로 만든다.

4.6.2  대체표준물질(surrogate, SU): 해수시료로부터 분석 대상인 PCBs의 회수 정도를 검정하기 위하여 사용된다. 3종류의 내부표준물질[DBOFB(Dibromo-octafluro- biphenyl), PCB103, PCB198]이 사용되며 노말-헥산 용매에 녹여 각각의 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.6.3  내부표준물질:(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위하여 사용되는 표준물질로 Tetrachloro-m-xylene(TCMX)가 사용되며 그 농도는 200 ng/mL이 되도록 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

미리 세척한 1 L 시료 용기에 해수시료를 채수한 후 염산을 첨가하여 pH를 2 이하로 만들어 실험실로 옮긴다. 즉시 분석이 수행되지 않을 때는 4 °C 이하에서 보관한다.

6. 시험방법

6.1  용매추출과 농축

6.1.1  해수시료 1 L를 2 L 분액깔때기에 옮기고 대체 표준물질인 DBOFB(Dibromo -octafluoro-biphenyl), PCB103, PCB198을 각각 10 ng씩 첨가하여 혼합한다. 해수시료에 pH 검출지를 이용하여 시료의 pH가 5 ∼ 9의 범위에 있는지 확인한다.

6.1.2  분액깔때기에 디클로로메탄 100 mL을 넣고 제33항 유기인의 시험방법과 동일하게 추출한다.

6.1.3  재추출을 위하여 6.1.2항의 과정을 반복하고 두 디클로로메탄층을 합친다.

6.1.4  제33항 유기인에서와 같은 방법으로 회전증발기를 이용하여 추출 용액이 2 ∼ 3 mL 정도로 되게 농축한다.

6.2  정제

6.2.1  정제과정에서 사용되는 용매는 노말-헥산이 되어야 한다.

6.2.2  미리 세척된 유리관 컬럼에 노말-헥산 40 mL을 채운 후 1 % 함수 알루미나 3 g과 그 위에 다시 5 % 함수 실리카겔 5 g을 습식 충진하고 최상단에 무수황산 나트륨을 3 cm 정도를 다시 습식 충진한 후, 노말-헥산 20 mL를 컬럼 상부로부터 흘려주어 알루미나/실리카겔과 무수황산나트륨을 세척한다(주의: 모든 충진물이 항상 노말-헥산에 잠겨 있어야 한다).

6.2.3  노말-헥산을 무수황산나트륨층 바로 위 1 mm 정도까지 내린 후 컬럼 콕크를 잠그고 농축된 시료를 파스테르 피펫을 사용하여 컬럼 상부에 옮기고 또 소량의 노말-헥산으로 시료 플라스크를 세척하고 이 세척 용매도 함께 컬럼에 옮긴다.

6.2.4  컬럼 아래 250 mL 플라스크를 위치하고 콕크를 열어 노말-헥산 용매를 초당 한방울의 속도로 위와 같이 무수황산나트륨층 위까지 내린다.

6.2.5  노말-헥산 100 mL를 컬럼 위에 넣고 10분간 초당 한방울씩 흘러주고 난 후 5 mL/min 속도로 컬럼을 통과시킨다.

6.2.6  컬럼을 통과한 노말-헥산층을 회전증발농축기를 이용하여 약 2 ∼ 3 mL 부피로 농축하고 GC 바이알에 옮긴 후 최종 고순도 질소기체로 측정용 시료의 부피가 1 mL이 되도록 하며 GC 내부표준물질 TCMX를 100 μl(20 ng)을 첨가한 후 GC 분석을 진행한다.

6.3  기체크로마토그래피 분석

6.3.1  표 1에 주어진 기체크로마토그래피 조건에서 제조된 측정용 시료 2 μL를 기체크로마토크래피의 주입부에 주입한다.

6.3.2  얻어진 크로마토그램에서 각 PCBs의 표준물질의 체류시간을 비교하여 성분을 확인하고 각 성분의 피크 면적을 측정한다.

6.3.3  PCBs 표준물질에 대하여 농도별 관계식을 사용하여 해수시료 중의 각 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

┌──────┐                                          

│해수시료 1L │                                          

└──────┘┌───────────────────┐

                │대체 표준 물질 (DBOFB, PCB103, PCB198)│

┌──────┐└───────────────────┘

│추출        │  (분액 깔때기; 디클로로메탄; 0.5 시간)   

└──────┘                                          

┌──────┐                                          

│농축        │                                          

└──────┘                                          

┌──────┐                                          

│용매 치환   │  (디클로로메탄 → 노말-헥산)             

└──────┘                                          

┌──────┐                                          

│정제        │  (알루미나-실리카겔- 무수 황산나트륨)    

└──────┘┌───────────────────┐

                │GC 내부 표준 물질 (TCMX)              │

┌──────┐└───────────────────┘

│GC 분석     │                                          

└──────┘                                          

그림 1.  PCBs 분석절차

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제33항 유기인 8. 정도평가/정도관리에 따른다.

9. 결과

9.1  농도계산

분석 대상의 각 PCB의 농도는 아래 식을 사용하여 구한다.

                        (식 1)

          RF: 각 유기인계 농약 표준물질에 대한 감응계수

          AIS : GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

          IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

          APCBs : 각 PCB에 대한 GC 신호의 면적

          v: 분석에 사용된 해수의 양(L)

          C: 해수 1L에 들어 있는 PCBs의 농도(ng/L)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각 PCB의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  6.2.2항의 5 % 실리카겔의 용출량은 컬럼 상태에 따라 달라질 수 있으므로 사전에 표준용액을 사용하여 용출패턴에 따른 용출량을 확인해 두어야 한다.

10.2  PCB는 입자물질에 흡착되는 성질을 가지고 있고 해수 중의 농도는 극히 낮아서 ng/L에서 수 μg/L 수준이므로 오염에 주의를 요하며 필요시 시료량을 증가시켜 분석해야 한다.

10.3  이 방법 이외의 분석방법으로 분석하였을 때, 검출한계와 정밀도가 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제38항 유기주석 화합물( Butyltins,  BTs)

1. 측정원리

해수 중의 BTs(butyltins)은 0.1 % 트로폴론이 함유된 디클로로메탄으로 추출하고 프로필마그네슘 브로마이드(propylmagnesium bromide)를 가하여 그리그나드(Grignard)반응으로 유도체를 만든 후 플로리실 컬럼으로 정제하고 불꽃광도검출기(Flame Photometric Detector, FPD)가 부착된 기체크로마토그래피로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래프 불꽃광도검출기를 이용한 유기주석화합물의 기기검출한계는 95 % 신뢰구간에서 10 ng/L 미만이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후, 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료 채취용 유리병: 테프론 덮개가 있는 뚜껑이 달린 2.0 L 용량

3.1.2  분액깔때기: 테프론 혹은 유리 마개가 부착된 2 L 용량

3.1.3  매스실린더: 50, 100 mL 용량과 1 L 용량

3.1.4  페어플라스크(pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL와 250 mL 용량

3.1.5  유리컬럼: 길이 30 cm, 내경 1 cm 의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도 조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도 조절이 가능한 기기

3.2.3  질소 농축기

3.2.4  수욕조(water bath): ± 5 °C 이내로 온도 조절이 가능한 기기

3.2.5  와류 혼합기

3.2.6  기체크로마토그래피

표 1. 유기주석 화합물 기체크로마토그래프 분석조건의 예

┌────────────────────┬──────────────────────────┐

│검출기                                  │불꽃 광도 검출기(Flame Photometric Detector, FPD),  │

│                                        │주석 필터 부착                                      │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│컬  럼                                  │모세관 컬럼                                         │

│                                        │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μM, 길이 30 m)        │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│충전제                                  │100 % methyl polysiloxane                           │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│운반기체                                │헬륨(99.999 %)                                      │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│운반기체 유속                           │1.5 mL/분(등속)                                     │

│ 유속은 기기 사양에 따라 달라질 수 있다.│                                                    │

│                                        │                                                    │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│검출기 기체                             │수소(99.999 %), 공기(99,999 %)                      │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│시료주입구 온도                         │225 °C                                             │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│검출기 온도                             │250 °C                                             │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│오븐 초기 온도                          │50 °C에서 5분간 유지                               │

├────────────────────┼──────────────────────────┤

│오븐 승온 온도                          │분당 20 °C로 240 °C까지 승온 후 10분간 유지       │

└────────────────────┴──────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.2  0.1 % 트로폴론(tropolone; C7H6O2)-디클로로메탄: 트로폴론 1 g을 1 L의 디클로로메탄에 녹여 만들고, 유리용기에 보관하여 사용한다.

4.3  1 M 프로필마그네슘 브로마이드(propylmagnesium bromide)용액: 상용의 1  M 프로필마그네슘 브로마이드 용액으로 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)에 용해된 것을 반드시 냉장 보관하여 사용한다.

4.4  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 120 °C에서 보관하고 사용 직전 상온에서 식혀 사용한다.

4.5  플로리실: 80 ∼ 100 메쉬 플로리실(florisil)을 450 °C에서 4시간 이상 활성화시킨 후 120 °C 건조기에 보관하고, 컬럼을 만들기 직전에 꺼내 상온으로 식힌 후에 사용한다.

4.6  1 N 염산용액: 염산 85 mL를 초순수 1 L로 정용하여 유리용기에 넣어 보관하여 사용한다.

4.7  1 N 황산용액: 황산 30 mL를 초순수로 1 L로 정용하여 유리용기에 넣어 보관하여 사용한다.

4.8  표준용액

4.8.1  표준용액(standard solution, STD): 분석하고자 하는 트리부틸틴 클로라이드(tributyltin chloride, C12H27Sn+Cl-), 디부틸틴 클로라이드(dibutyltin chloride, C8H19Sn+Cl-), 모노부틸틴 클로라이드(monobutyltin chloride, C4H11Sn+Cl-) 각각 10  mg을 노말-헥산 100 mL에 녹인 후 이 용액을 다시 노말-헥산으로 100배 희석시켜 최종농도 1 ppm의 표준용액을 만든다. 이 표준용액을 냉동 보관하여 사용하며 유효기간은 3개월이다.

4.8.2  대체표준물질(surrogate, SU): 해수시료로부터 분석 대상인 BT의 추출과정 및 시험 과정에서의 회수율을 검정하기 위하여 대체표준물질인 트리펜틸틴 클로라이드(tripentyltin chloride, C15H33Sn+Cl-)을 200 ng/mL농도로 만든다. 이 표준용액을 냉동 보관하여 사용하며 유효기간은 3개월이다.

4.8.3  내부표준물질:(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위하여 사용되는 내부표준물질인 테트라부틸틴(tetrabuytltin, C16H36Sn)을 200 ng/mL 농도로 만든다. 이 표준용액을 냉동 보관하여 사용하며 유효기간은 3개월이다.

5. 시료의 채취 및 보관

미리 세척한 1 L 시료 용기에 해수시료를 채수한 후 염산을 첨가하여 pH를 2 이하로 만들어 실험실로 옮긴다. 즉시 분석이 수행되지 않을 때는 4 °C 이하에서 보관한다.

6. 시험방법

6.1  용매추출과 농축

6.1.1  해수시료 1 L를 2 L용 분액깔때기에 옮기고 대체표준물질 트리펜틸틴 클로라이드(tripentyltin chloride) 100 ng과 1 N 염산 용액 10 mL을 가한 후, 0.1 % 트로폴론이 첨가된 디클로로메탄 100 mL로 20분간 진탕하며 추출한다. 추출과정은 제33항 유기인에서와 동일하게 추출한다.

6.1.2  재추출을 위하여 0.1 % 트로폴론-디클로로메탄 50 mL 가하고 추출 후 두 디클로로메탄층을 합친다.

6.1.3  합쳐진 디클로로메탄층을 수분을 제거하기 위하여 무수황산나트륨 컬럼을 통과시킨다. 컬럼에 통과된 추출액을 250 mL 플라스크에 받는다.

6.1.4  회전증발기를 이용하여 추출 용액이 2 ∼ 3 mL 정도로 농축한다. 사용된 100 mL 메스실린더는 노말-헥산 용액 30 mL로 충분히 헹구고 이 용액은 다시 회전증발기 플라스크에 옮긴 후 5 mL가 되도록 농축한다.

6.2  유도체화 반응

6.2.1  농축액에 1 M 프로필마그네슘 브로마이드 0.5 mL를 가해 30초간 교반 후 30분간 35 °C의 항온 수조에서 유도체화 한다.

6.2.2  반응 종료 후 0.4 N 황산 용액 4 mL를 가하여 중화시킨 후, 30초간 교반하여 유기용매층을 분취한다.

6.2.3  남은 층에 다시 노말-헥산 5 mL을 가하여 10분간 진탕해서 앞에서 얻어진 유기층과 합친 후 플로리실 컬럼을 통과시켜 정제한다.

6.2.4  컬럼을 세척하기 위하여 추가로 노말-헥산 10 mL을 컬럼에 통과시킨 후 얻어진 용출액은 고순도 질소가스로 농축하여 측정용 시료의 부피가 1 mL가 되도록 하며 GC 내부표준물질 테트라부틸틴(tetrabutyltin)을 20 ng을 첨가한다.

6.3  기체크로마토그래피 분석

6.3.1  표 1에 주어진 기체크로마토그래피 조건에서 제조된 측정용 시료 2 μL를 기체크로마토크래피의 주입부에 주입한다.

6.3.2  얻어진 크로마토그램에서 각 BTs의 표준물질의 유도체의 체류시간을 비교하여 성분을 확인하고 각 성분의 피크 면적을 측정한다.

6.3.3  BTs 표준물질의 유도체에 대하여 농도별 관계식을 사용하여 해수시료 중의 각 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

┌──────┐                                              

│해수시료 1L │                                              

└──────┘┌─────────────────────┐

                │대체 표준 물질 (tripentyltin chloride)    │

┌──────┐└─────────────────────┘

│추출        │  (분액 깔때기; 0.1% 트로폴론-디클로로메탄;   

│            │   0.5 시간)                                  

└──────┘                                              

┌──────┐                                              

│수분제거    │  (무수황산나트륨 컬럼)                       

└──────┘                                              

┌──────┐                                              

│농축        │                                              

└──────┘                                              

┌──────┐                                              

│용매 치환   │  (디클로로메탄 → 노말-헥산)                 

└──────┘                                              

┌──────┐                                              

│유도체 반응 │  (프로필마그네슘 브로마이드,                 

│            │  0.1 N 황산 용액)                            

└──────┘                                              

┌──────┐                                              

│정제        │  (플로리실 컬럼)                             

└──────┘┌─────────────────────┐

                │GC 내부 표준 물질 (Tetrabutyltin)         │

┌──────┐└─────────────────────┘

│GC 분석     │                                              

└──────┘                                              

그림 1. 유기주석 화합물 분석절차

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제33항 유기인 8. 정도평가/정도관리에 따른다.

9. 결과

9.1  농도계산

분석 대상의 각 BTs의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                          (식 1)

          RF: 각 BT 표준물질에 대한 감응계수

          AIS : GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

          IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

          APCBs : 각 BT에 대한 GC 신호의 면적

          v: 분석에 사용된 해수의 양(L)

          C: 해수 1L에 들어 있는 BTs의 농도(ng/L)

9.2  결과보고

시료에 들어 있는 각 BT의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  유기주석화합물은 광분해되거나 생분해될 우려가 있으므로 되도록 차광용기를 사용하여 빠른 시간 안에 분석을 하도록 한다.

10.2  이 방법 이외의 분석 방법으로 분석하였을 때 검출한계와 정밀도가 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우, 사용할 수 있다.

제39항 음이온계면활성제-자외선/가시선 분광법                (Anionic  Surfactants  UV/Visible  Spectrometry)

1. 측정원리

이 시험기준은 물속에 존재하는 음이온계면활성제를 측정하기 위하여 메틸렌블루와 반응시켜 생성된 청색의 착화합물을 클로로포름으로 추출하여 흡광도를 650 nm에서 측정하는 방법이다.

2. 측정범위

 이 시험기준으로는 시료중의 계면활성제를 종류별로 구분하여 측정할 수 없다.

 및 정밀도

이 시험기준은 해수 및 해양심층수에 적용할 수 있으며, 정량한계는 0.02 mg/L이다.

3. 기구 및 기기

분광광도계, 분별깔때기, 비이커 등 초자 도구

4. 시약 및 표준물질

4.1  메틸렌블루 용액(0.03 %): 메틸렌블루(methylene blue, C16H18N3SCIㆍ3H2O, 분자량: 444.34) 100 mg을 100 mL 초순수에 녹인다. 이 용액 30 mL, 초순수 500 mL, 황산용액(3 M) 41 mL, 50 g의 인산이수소나트륨ㆍ1수화물(sodium dihydrogen phosphate monohydrate, NaH2PO4ㆍH2O, 분자량: 137.98)을 1 L 부피플라스크에 넣고 잘 녹인 후 초순수를 표선까지 채운다.

4.2  수산화나트륨 용액(0.4 %): 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH, 분자량: 40.00) 0.4 g을 초순수에 녹여 100 mL로 한다.

4.3  알칼리성 붕산나트륨 용액: 붕산나트륨ㆍ10수화물(sodium borate decahydrate, Na2B4O7ㆍ10H2O, 분자량: 381.22) 9.54 g을 초순수에 녹여 최종 500 mL로 만든 다음 수산화나트륨 용액(0.4 %) 500 mL와 혼합한다.

4.4  클로로포름(chloroform, CH3Cl, 분자량: 50.49): 순도 98 % 이상의 고순도 시약을 사용한다.

4.5  페놀프탈레인ㆍ에탄올 용액(0.5 %): 페놀프탈레인(phenolphthalein, C20H14O4, 분자량: 318.32) 0.5 g을 에탄올(ethanol, C2H5OH, 분자량: 46.07, 함량: 95 %) 90 mL에 녹이고 초순수를 넣어 100 mL로 한다.

4.6  황산 용액(1 M): 황산(sulfuric acid, H2SO4, 비중: 1.84, 분자량: 98.08, 함량: 95 % 이상) 60 mL를 초순수로 희석하여 1L로 한다.

4.7  황산 용액(3 M): 황산 180 mL를 초순수로 희석하여 1 L로 한다.

4.8  표준원액(500mg/L): 라우릴황산나트륨(lauryl sodium sulfate, CH3(CH2)11OSO3Na, 분자량: 288.38)을 순도 100 %로 환산한 0.500 g을 초순수에 녹여 1 L로 한다.

4.9  표준용액(10 mg/L): 표준원액(500 mg/L) 10 mL를 정확히 취하여 초순수에 넣어 정확히 500 mL로 만든다.

5.  시료의 채취 및 보관

5.1  두 개의 250 mL 분별깔때기(A, B)를 준비하여 분별깔때기(A)에는 초순수 50 mL, 분별깔때기(B)에는 초순수 100 mL를 넣고 알칼리성 붕산나트륨 용액 10 mL, 메틸렌블루 용액(0.025 %) 5 mL 및 클로로포름 10 mL씩을 넣은 다음, 흔들어 섞고 정치하여 클로로포름층을 버린다.

5.2  클로로포름층이 무색으로 될 때까지 반복 조작을 한다. 분별깔때기(B)에는 황산(1 + 35) 3 mL를 넣어 둔다.

6. 시험방법

6.1  시료 적당량(음이온계면활성제로서 0.002 ∼ 0.05 mg 함유)을 취하여 분별깔때기(A)에 넣고 클로로포름 10 mL를 넣어 1분간 흔들어 섞은 다음 정치하고 클로로포폼층을 취하여 분별깔때기(B)에 옮겨 1분간 흔들어 섞고 정치한다.

6.2  클로로포름층을 미리 클로로포름으로 씻어 둔 탈지면을 사용하여 여과하고 여과용액을 25 mL 부피플라스크에 옮긴다.

6.3  다시 분별깔때기(A)에 클로로포름 10 mL를 넣고 위와 같은 방법으로 시험하여 앞의 25 mL 부피플라스크에 합하고 클로로포름을 넣어 표선까지 채워 이 용액의 일부를 층장 10 mm 흡수셀에 넣어 시료용액으로 한다.

6.4  따로 초순수 50 mL를 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험용액으로 한다.

6.5  바탕시험용액을 대조액으로 하여 650 nm에서 시료용액의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검정곡선으로부터 음이온계면활성제의 양을 구하고 농도(mg/L)를 산출한다.

7. 결과

검정곡선은 농도에 대한 흡광도로 작성한다. 시료의 농도는 표준용액의 흡광도에 대한 시료의 흡광도를 비교하여 계산한다.

음이온계면활성제(mg/L) = (y-b)/a × I                   (식 1)

여기서,                  y : 시료의 흡광도

                        b : 검정곡선의 절편

                        a : 검정곡선의 기울

                        I : 시료의 희석배수

8. 참고사항

8.1  참고문헌  Longwell, J.H., & Maniece, W.D.(1955). Determination of anionic detergents in sewage, sewage effluents and river waters. Analyst, 80, 167-171.

8.2  정도관리 목표값

표 1. 음이온계면활성제 정도관리 목표값

┌───────┬───────────────────────────────┐

│정도관리 항목 │정도관리 목표                                                 │

├───────┼───────────────────────────────┤

│정량한계      │0.02 mg/L                                                     │

│검정곡선      │결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % │

│정밀도        │상대표준편차가 ± 25 % 이내                                   │

│정확도        │75 % ∼ 125 %                                                 │

└───────┴───────────────────────────────┘

제40항 휘발성유기화합물(Volatile  Organic  Compounds,  VOCs)

1. 측정원리

1.1  목적

이 시험기준은 해수 중에 존재하는 휘발성유기화합물(Volatile organic compounds, VOCs)을 측정하기 위한 것이다.

1.2  적용범위

이 시험기준은 해수시료에 적용할 수 있는 방법으로 성분별 정량한계는 약 0.005  mg/L이다.

1.3  간섭 물질

1.3.1  용매, 시약, 유리기구류 및 실험 도구에 간섭 물질이 존재할 수 있으므로 사용 전에 점검해야 한다.

1.3.2  실험실 공기 중에 기화된 용매로 인해 오염이 발생할 수 있으므로, 바탕시료를 확인하여 점검해야 한다.

1.3.3  디클로로메탄은 보관이나 운반 중에 격막(septum)을 통해 확산되어 시료에 영향을 주며, 공기로부터 직접 오염되거나 옷에 흡착하였다가 오염될 수 있으므로, 바탕시료를 사용하여 점검해야 한다.

2. 기구 및 기기

2.1  기체크로마토그래피(Gas  Chromatography)

2.1.1  컬럼은 안지름 0.20 ∼ 0.35 mm, 필름두께 0.1 ∼ 1.5 μm, 길이 15 ∼ 60 m의 100 % 메틸폴리실록산(100 % methyl-polysiloxane) 또는 5 % 페닐메틸폴리실록산([5 % phenyl]-methylpoly siloxane)의 고정상을 가진 DB-1, DB-5 및 DB-624 등의 모세관이나 동등한 분리 성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

2.1.2  운반 기체는 순도 99.999 % 이상의 헬륨으로 유량은 0.5 ∼ 2 mL/min, 시료 도입부 온도는 150 ∼ 250 °C, 오븐 온도는 35 ∼ 250 °C, 검출기 온도는 250 ∼ 280 °C로 사용한다.

2.2  질량분석 검출기(Mass  Spectrometer  Detector)

2.2.1  이온화 방식은 전자충격(EI, electron impact)을 사용하여 이온화 에너지는 35∼ 70 eV을 사용한다.

2.2.2  질량분석기는 자기장형(Magnetic sector), 사중극자형(Quardrupole) 및 이온트랩형(Ion trap) 또는 이와 동등 이상의 성능을 가진 것을 사용한다.

2.2.3  검출방법은 선택적 이온검출법(SIM, selected ion monitoring) 또는 스캔 모드(Scan mode)를 이용한다.

2.3  헤드스페이스(Headspace)

2.3.1  시료 분석을 위한 바이알은 10 ∼ 100 mL의 유리제로서 가열하여도 밀폐성이 높은 것을 사용하며, 사용 전 메탄올로 세정하고 충분히 건조한 후 사용한다.

2.3.2  격막(Septum)은 한쪽 면이 두께 0.05 mm 이상의 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE, polytetrafluoroethylene)의 재질로 코팅된 실리콘 마개를 사용한다.

2.3.3  시료 보온부는 온도를 약 40 ∼ 90 °C 범위 내에서 1시간 정도 일정하게 보온 유지할 수 있는 것을 사용한다.

2.3.4  시료 주입용 장치

2.3.4.1  압력조절방식은 시료 주입량을 조절할 수 있어야 하고, 주사기 바늘은 시료와 반응성을 최소화하기 위해 백금-이리듐(Pt-Ir) 재질 또는 이와 동등한 재질을 사용한다. 연결부는 비활성화된 모세관을 사용한다.

2.3.4.2  기밀주사기는 부피가 0.1 ∼ 5 mL의 것으로 기체크로마토그래피에 접속할 수 있는 것 또는 자동 주입기로 스테인레스강 또는 이것과 동등 이상의 재질을 사용한다.

3. 시약 및 표준물질

3.1  용매

메탄올(Methanol, CH3OH, 분자량: 32.04): 바탕시험을 수행할 때 분석 대상물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

3.2  표준용액

3.2.1  표준원액(1,000  mg/L)

3.2.1.1  휘발성유기화합물(VOCs)은 아래와 같이 고순도(순도 98 % 이상 사용)의 시약을 구매하여 제조하여 사용하거나, 국제적으로 잘 알려진 표준물질 제조회사로부터 구입하여 사용할 수 있다.

3.2.1.2  25 mL 부피플라스크에 메탄올 20 mL를 넣고 휘발성유기화합물을 일정량 주입한 후, 정확하게 무게 증가량을 잰다. 마지막으로 메탄올로 표선까지 채워 정확한 원액의 농도를 구한다. 휘발성유기화합물의 빠른 소실로 본 조작은 가능한 한 빠른 시간 내에 수행하도록 한다.

3.2.1.3  각각의 표준물질의 첨가량을 구하여 표준원액의 농도(mg/L)를 구한다. 이 용액은 가능한 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 않도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고(4 °C이하)에서 보관하고, 4주일 이내에 사용한다.

3.2.2  혼합표준용액

10 mL 부피플라스크에 메탄올 약 5 mL를 넣은 후, 상기에 제조한 각각의 표준원액(1,000 mg/L) 일정액을 정확히 취하여 넣고 메탄올을 첨가하여 표선을 채운다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 않도록 나누어 넣은 다음 밀봉하고 매 분석 시 제조하여 사용한다. 필요시 이 용액을 단계적으로 희석하여 사용한다.

3.2.3  내부표준물질

3.2.3.1  내부표준물질은 대상물질을 분석할 때 실험의 전 과정에서 발생하는 소실에 대한 효율성의 검증을 위한 물질로 사용한다.

3.2.3.2  사용되는 내부표준물질은 플루오로벤젠(fluorobenzene) 또는 1,2-다이클로로벤젠-d4(1,2-dichlorobenzene-d4) 고순도 시약을 사용하여 아래와 같이 제조하여 사용하거나, 국제적으로 잘 알려진 표준물질 제조회사로부터 구입하여 사용할 수 있다.

3.2.3.3  25 mL 부피플라스크에 메탄올 20 mL를 넣고 내부표준물질 고순도 시약을 일정량 주입한 후, 정확하게 무게 증가량을 잰다. 마지막으로 메탄올로 표선까지 채워 정확한 원액의 농도를 구한다.

3.2.3.4  내부표준물질의 첨가량을 구하여 내부표준물질 원액의 농도(mg/L)를 구한다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 않도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고(4 °C 이하)에서 보관하고, 4주일 이내에 사용한다.

3.2.4  혼합내부표준용액

10 mL 부피플라스크에 메탄올 약 5 mL를 넣은 후, 상기에 제조한 각각의 내부표준원액 일정액을 정확히 취하여 넣고 메탄올을 첨가하여 표선을 채운다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 않도록 나누어 넣은 다음 밀봉하고 매 분석 시 제조하여 사용한다. 필요시 이용액을 단계적으로 희석하여 사용한다.

4. 시료의 채취 및 보관

운반 중 공기와의 접촉이 없도록 기포가 생기지 않게 시료 용기에 가득 채운 후 빠르게 뚜껑을 닫는다. 병을 뒤집어 공기 방울이 확인되면 다시 채취해야 한다. 또한 뚜껑의 격막을 만지지 않도록 주의해야 하며 즉시 분석이 어려울 때에는 밀봉 후 냉ㆍ암소에 보관하고 7일 이내에 분석한다.

5. 정도평가/정도관리(QA/QC)

5.1  방법검출한계 및 정량한계

5.1.1  초순수에 정량한계 근처의 농도가 되도록 분석 물질을 첨가한 시료를 7개 준비하여 각 시료를 본 실험법과 동일하게 추출하여 표준편차를 구한다.

5.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 정량한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하의 값이어야 한다.

5.2  방법바탕시료의 측정

바탕시료는 초순수를 사용하여 실험 절차와 동일하게 측정하며, 측정값은 방법검출한계 이해야 한다.

5.3  검량곡선의 작성 및 검증

5.3.1  검량곡선의 작성 및 검증은 정량범위 내의 3개 이상 농도에 대해 검량곡선을 작성하고, 얻어진 검량곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성하도록 한다.

5.3.2  검량곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검량곡선의 중간 농도값을 갖는 표준용액의 농도를 측정하여 감응계수(RF)를 구한다. 측정된 농도값과 표준용액의 농도값 간의 차이가 25 % 이내에서 일치해야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검량곡선을 재작성한다.

5.4  정확도 및 정밀도

5.4.1  초순수에 정량한계 농도의 2 ∼ 10배가 되도록 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하여, 7.0 분석절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

5.4.2  정확도(Accuracy)는 첨가한 표준물질의 농도에 대한 측정 평균값의 상대백분율로 나타내며 그 값이 80 ∼ 120 % 이내이어야 한다.

5.4.3  정밀도는 측정값의 % 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

5.5  내부정도관리 주기 및 목표

5.5.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 측정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 점검 및 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인해야 한다.

5.5.2  검량곡선 검증 및 방법바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 방법바탕시료를 측정하여 오염되었는지를 점검한다.

5.5.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표값은 표 1과 같다.

6. 시험방법

6.1  분석방법

6.1.1  검량곡선법

6.1.1.1  시료는 대상 물질의 예측 농도에 따라 증감이 가능하지만, 일반적으로 10 mL를 채취하는 것을 원칙으로 한다.

6.1.1.2  시료 10 mL를 정량용 피펫을 이용하여 정확히 취하여 22 mL 헤드스페이스용 바이알에 주입한 다음, 오븐 온도를 100 °C로 설정하여 50분 동안 가열한다.

6.1.1.3  상부 기상의 일정량 0.5 ∼ 2 mL를 채취하여 기체크로마토그래프-질량분석기(GC/MSD)로 분석한다.

6.1.1.4  기체크로마토그래프-질량분석기(GC/MSD)로부터 얻은 크로마토그램에서 각 분석성분의 체류시간에 해당하는 위치의 피크들로부터 피크 면적을 구한다.

6.1.2  내부표준법

6.1.2.1  채취한 시료 10 mL를 22 mL의 헤드스페이스용 바이알에 옮기고, 내부표준용액(1.0 mg/L)을 일정량 취하여 헤드스페이스용 바이알 내의 시료에 첨가한다.

6.1.2.2  이 용액을 흔들어 섞은 후, 일정한 온도의 항온조에서 일정시간 동안 가열한다.

6.1.2.3  상부 기상의 일정량을 채취하여 기체크로마토그래프-질량분석기(GC/MSD)로 분석한다.

6.1.2.4  기체크로마토그래프-질량분석기(GC/MSD)로부터 얻은 크로마토그램에서 각 분석성분 및 내부표준물질의 체류시간에 해당하는 위치의 피크들로부터 피크면적을 측정하여 휘발성유기화합물(VOCs)의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 구한다. 두 개의 내부표준물질 중에 분석성분과 체류시간이 가까운 것으로 선택한다.

6.2  검량곡선의 작성

6.2.1  검량곡선법

6.2.1.1  초순수10 mL를 정량용 피펫을 이용하여 정확히 취하여 헤드스페이스용 바이알에 주입한 다음, 휘발성유기화합물(VOCs) 혼합 표준용액(1.0 mg/L)을 3개 농도 이상으로 단계적으로 취하여 첨가한다. 필요에 따라 사용하는 표준용액의 양과 개수를 달리 할 수 있다. 시료 분석 결과 이 검량곡선 농도 범위를 벗어나면 시료를 희석하여 재분석해야 한다.

6.2.1.2  오븐 온도를 100 °C로 설정하여 50분에 가열하여 기화된 휘발성유기화합물(VOCs)을 기체크로마토그래프로 주입한다.

6.2.1.3  휘발성유기화합물(VOCs)의 농도(mg/L)를 가로축(x 축)에, 각 휘발성유기화합물(VOCs)에 해당하는 피크 면적을 세로축(y 축)에 취하여 검량곡선을 작성한다.

6.2.2  내부표준법

6.2.2.1  초순수 10 mL(경우에 따라 시료의 양을 증감시킬 수 있다)를 정확히 취한 후, 휘발성유기화합물 혼합표준용액(10 mg/L 등)을 3개 농도 이상 단계적으로 취하여 넣고, 혼합내부표준용액을 일정량 취하여 시료에 첨가한다. 필요에 따라 사용하는 표준용액의 양과 개수를 달리 할 수 있다

6.2.2.2  일정 온도와 시간에서 휘발성유기화합물(VOCs)을 가열시켜 기화된 휘발성유기화합물(VOCs)을 기체크로마토그래프로 주입한다.

6.2.2.3  휘발성유기화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 크로마토그램으로부터 휘발성유기화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크 면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다. 두 개의 내부표준물질 중에 분석성분과 체류시간이 가까운 것으로 선택한다.

7. 결과

7.1  검량곡선법

각 분석물질별 피크의 면적(Ax)을 구한 다음 검량곡선식의 y(i)값에 대입하여 (i)값을 계산하면 분석 물질의 농도(mg/L)를 구할 수 있다.

농도                          (식 1)

여기서,           a: 검량곡선의 기울기

                 b: 검량곡선의 절편 값

7.2  내부표준법

각 분석 물질별로 내부표준물질에 대한 면적비(Ax/Ai)를 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석 물질의 농도(mg/L)를 구할 수 있다.

농도                         (식 2)

여기서,           a: 검정곡선의 기울기

                 b: 검정곡선의 절편 값

8. 참고사항

표 1. 휘발성유기화합물 분석 정도관리 목표값

┌───────┬───────────────────────────────┐

│정도관리 항목 │정도관리 목표                                                 │

├───────┼───────────────────────────────┤

│정량한계      │0.005 mg/L                                                    │

│검량곡선      │결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % │

│정밀도        │상대편차가 ± 25 % 이내                                       │

│정확도        │80 ∼ 120 %                                                   │

└───────┴───────────────────────────────┘

표 2. 휘발성유기화합물 기체크로마토그래프 분석조건의 예

┌─────┬───────────────────────┐

│컬럼      │DB-624 (60 m × 0.25 mm × 1.4 μm)           │

├─────┼───────────────────────┤

│운반기체  │Helium, 1.5 mL/min (31 cm/sec)                │

├─────┼───────────────────────┤

│분획비    │Split (10 : 1)                                │

├─────┼───────────────────────┤

│주입구온도│110 °C                                       │

├─────┼───────────────────────┤

│전달선온도│235 °C                                       │

├─────┼───────────────────────┤

│승온조건  │45 °C (3 min) → 90 °C (8 °C/min, 4 min) →│

│          │ 130 °C (6 °C/min) : 20 min                 │

└─────┴───────────────────────┘

표 3. 휘발성유기화합물 대상물질별 정량이온

┌──────────┬───────────┬───────┐

│구분                │대상물질              │정량이온      │

├──────────┼───────────┼───────┤

│표준물질            │디클로로메탄          │84, 86, 49    │

│(Native standard)   ├───────────┼───────┤

│                    │1,1,1-트리클로로에탄  │97, 99, 61    │

│                    ├───────────┼───────┤

│                    │벤젠                  │78, 77        │

│                    ├───────────┼───────┤

│                    │트리클로로에틸렌      │95, 130, 132  │

│                    ├───────────┼───────┤

│                    │테트라클로로에틸렌    │166, 129, 168 │

├──────────┼───────────┼───────┤

│내부표준물질        │플루오로벤젠          │96, 77        │

│(Internal standard) ├───────────┼───────┤

│                    │1,2-다이클로로벤젠-d4 │152, 115, 150 │

└──────────┴───────────┴───────┘

         1. 디클로로메탄: 7.521             2. 1,1,1-트리클로로에탄: 10.459

         3. 벤젠: 11.174                    4. 트리클로로에틸렌: 12.528

         5. 테트라클로로에틸렌: 17.178

그림 1. 휘발성유기화합물 표준물질의 GC-MS 크로마토그램 예(SIM mode)

제41항 용매추출유분(Oil)

1. 측정원리

해수시료 중의 미량유분을 디클로로메탄을 또는 사염화탄소 등의 유기용매로 추출한 다음 회전식 증발기를 이용하여 감압상태에서 유기용매를 증발시킨 후 10 mL의 노말-헥산에 재용해시킨다. 그 다음 형광분광광도계를 이용하여 여기파장 310 nm와 형광파장 360 nm에서 형광세기를 측정하여 유분을 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효측정범위는 검출한계에서 1 μg/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 초과할 때에는 시클로-헥산으로 희석하여 측정하도록 한다. 일반적인 검출한계는 99  % 신뢰구간에서 0.01 μg/L이며 정밀도는 0.5 μg/L에서 ± 0.01 μg/L 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

분석에 사용되는 모든 초자기구류는 반드시 0.1 N 염산 용액으로 세척한 다음 초순수로 3회 이상 반복 세척하고 아세톤과 디클로로메탄으로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 갈색병

3.1.2  200, 1,000 mL 유리 분액깔때기

3.1.3  100 mL 유리 플라스크

3.2  회전식 증발기(rotary evaporator)

3.3  교반기(shaker)

3.4  형광분광광도계(spectrofluorometer)

4. 시약 및 표준물질

4.1  사염화탄소(CCl4): 무형광용 혹은 유분 분석용

4.2  시클로-헥산, 노말-헥산, 디클로로메탄: 형광용 혹은 유분 분석용

4.3  유분 표준원액(1,000 mg/L): 유분 표준원액은 시료와 성분이 같은 유류 또는 원유 0.1 g을 사염화탄소에 녹여 100 mL로 한다. 단 경질원유를 180 °C에서 증류하여 저비점의 성분을 제거한 잔유물로 표준원액을 만든다.

4.4  유분 표준용액(10 mg/L): 유분 표준원액(1,000 mg/L) 1 mL를 정확히 취하여 사염화탄소를 넣어 정확히 100 mL로 한다. 시료와 성분이 같은 유류 또는 원유를 검정용으로 구하지 못한 경우는 크리센(C18H12) 0.1 g을 사염화탄소에 녹여 100 mL로 한 다음, 이 액 1 mL를 정확히 취하여 사염화탄소를 넣어 정확히 100 mL로 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

현장에서 채수기에 의해 채취된 유분 시료는 갈색병에 담아 실험실에 즉시 운반하여 분석하거나 즉시 분석이 어려울 때는 자외선의 작용과 박테리아의 번식을 피하기 위해 황산 또는 염산으로 pH 2 이하로 조절한 뒤 4 °C에 냉장 보관한다.

6. 시험방법

6.1  시료병의 시료 전량을 유리 분액깔대기에 넣고, 시료병에 사염화탄소 50 mL를 넣어 100회 이상 흔들어 분액깔대기에 합한 후, 분액깔대기의 시료를 10분간 추출한다.

6.2  분리된 사염화탄소를 회전증발기의 증류플라스크에 담고, 다시 사염화탄소 25 mL로 시료를 2회에 걸쳐 재추출한 후 사염화탄소층을 증류플라스크에 모아서 회전증발기로 30 °C, 감압상태에서 농축한 후 청정 시설 안에서 12시간 동안 방치하여 사염화탄소를 완전히 증발시킨 다음 시클로-헥산 10 mL에 용해시킨다. 추출이 끝난 시료의 양을 측정하여 기록한다.

6.3  형광분광광도계로 여기파장 310 nm와 파장 360 nm에서 유분의 형광 세기를 측정한다.

6.4  형광 세기와 농도의 검량선식을 이용하여 다음과 같이 시료의 유분 농도를 결정한다.

유분농도(μg/L) = 검량선식을 이용하여 구한 농도 ÷ 농축 배수      (식 1)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

7.1  형광 세기와 유분 농도의 검량선식을 구하기 위하여 초순수 중의 유분 농도를 단계적으로 증가시켜(0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 μg/L) 준비한다. 표준용액은 유분 표준원액(4.4항)을 사염화탄소로 희석하여 만든다.

7.2  준비된 표준용액의 용액은 해수 추출과정에 따라 분석한다. 단 바탕용액은 2개 이상 복수로 분석되어야 한다.

7.3  측정된 자료를 회귀직선법으로 해석하여 검량선식을 구한다.

7.4  검출한계는 바탕용액을 7개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 3.14를 한 값(99 % 신뢰구간)에 바탕용액 농도의 평균값을 더하여 유의숫자 첫 자리로 표현한다.

7.5  정밀도는 검정범위의 중간 표준용액을 7개 복수 분석하여 표준편차를 구한 후 3.707을 곱하여(99 % 신뢰구간) ± 유의숫자 첫 자리로 표현한다.

7.6  결과보고시에는 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도, 검출한계를 기재하도록 한다.

8. 참고사항

8.1  이 방법은 추출된 유류에 함유되어 있는 방향족탄화수소의 형광 특성을 측정하므로 간접적인 유분농도 측정방법이다. 또한, 유기용매에 추출된 시료에는 해수 중의 생물체로부터의 유기형광물질도 포함될 수 있으므로 생물량이 많은 해수의 추출시료는 실리카겔 컬럼을 통과시켜 극성을 갖는 생물기원 유기형광물질을 제거해야 한다.

8.2  이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우, 사용할 수 있다.

제42항 기체 크로마토그래프/불꽃이온화 검출기(GC/FID)에 의한   유출유 식별

1. 측정원리

해양에 유출된 유류시료 중의 노말 포화탄화수소화합물을 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector)가 부착된 기체크로마토그래프의 크로마토그램 육안 비교, 풍화도 그래프 및 이소프레노이드비

 유류속에 포함되어 있는 안정한 화합물인 이소프렌구조를 가지고 있는 화합물의 높이비(C17/Pri, C18/Phy, Pri/Phy 등)를 의미함.

(Isoprenoids Ratios) 등을 비교하여 식별한다. 기체크로마토그래프/불꽃이온화 검출기의 분석조건은 표 1과 같다.

2. 기구 및 기기

2.1  원심분리기

2.2  분액깔때기

2.3  회전식 진공증발기(rotary vacuum evaporator)

2.4  기체크로마토그래프/불꽃이온화 검출기

표 1. 유출유 기체크로마토그래프/불꽃이온화검출기 분석조건의 예

┌─────────┬─────────────────────────┐

│검 출 기          │불꽃이온화검출기(FID)                             │

├─────────┼─────────────────────────┤

│컬    럼          │모세관 컬럼                                       │

│                  │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μM, 길이15 m)       │

├─────────┼─────────────────────────┤

│충 진 제          │100 % dimethyl polysiloxane                       │

├─────────┼─────────────────────────┤

│운반기체 및 유속  │순도 99.999 % 이상의 질소(N2), 헬륨(He) 또는 수소 │

│                  │(H2)                                              │

│                  │1.0 ∼ 2.0 mL/분                                  │

├─────────┼─────────────────────────┤

│오븐 승온조건     │40 °C(1 ∼ 2분) → 325 °C(10분)                 │

├─────────┼─────────────────────────┤

│오븐온도 승온속도 │10 °C/분                                         │

├─────────┼─────────────────────────┤

│시료주입구 온도   │325 °C                                           │

├─────────┼─────────────────────────┤

│검출기 온도       │375 °C                                           │

├─────────┼─────────────────────────┤

│시료 주입량       │1.0 ∼ 2.0 ㎕                                     │

└─────────┴─────────────────────────┘

3. 시약 및 표준물질

3.1  디클로로메탄: 크로마토그래피용

3.2  노말-헥산: 크로마토그래피용

3.3  무수황산나트륨

4. 시료의 채취 및 보관

4.1  직접 용매추출방법

흡착지 또는 테프론 재질을 이용하여 채취한 시료를 약 2 ～ 4배의 디클로로메탄 또는 노말-헥산에 녹인 후 수분간 정치한 후 디클로로메탄 또는 노말-헥산층을 취하여 무수황산나트륨 15 ～ 20 g을 채운 여과지로 여과하여 수분을 제거한다. 수분이 제거된 여과액을 30 ～ 50 °C의 수욕상에서 회전식 진공증발기를 이용하여 용매를 제거한 후 검액으로 사용한다. 여과액 중 중질유의 잔사유와 같은 입자가 있을 경우, 실리카겔/알루미나 컬럼 정제를 통해 제거한다.

4.2  원심분리에 의한 용매추출방법

유출유 시료 수 그램(g)을 같은 양의 디클로로메탄 또는 노말-헥산에 녹여 시료의 유형에 따라 500 ～ 14,000 rpm까지 회전속도 조절이 가능한 원심분리기로 10 ～ 20분간 원심분리하여 수분과 고형물 및 찌꺼기 등을 제거한다. 잔존하는 수층은 흡인(suction) 제거하고 고형물이나 찌꺼기 등은 디클로로메탄 또는 노말-헥산으로 미리 씻은 유리섬유로 여과하여 제거한 다음 여과액을 검액으로 한다.

4.3  분액깔때기를 이용한 용매추출방법

적당한 용량의 분액깔때기에 시료 10 mL 정도를 취하여 약 4배의 디클로로메탄 또는 노말-헥산을 넣고 약 30초간 흔들어 섞어 유분을 디클로로메탄 또는 노말-헥산에 완전히 녹인 다음, 수 분간 정치하고 디클로로메탄 또는 노말-헥산층을 취하여 무수황산나트륨 15 ～ 20 g을 채운 여과지로 여과하여 수분을 제거한다. 수분이 제거된 여과액을 30 ～ 50 °C의 수욕상에서 회전식 진공증발기를 이용하여 용매를 제거한 후 검액으로 사용한다.

5. 시험방법

5.1  검액의 일정량(1.0 ～ 2.0 ㎕)을 기체크로마토그래프/불꽃이온화검출기에 주입하여 얻어지는 포화탄화수소 크로마토그램의 육안 비교, 풍화도 그래프 및 이소프레노이드비(Isoprenoids Ratios)등을 고려하여 비교 식별한다. 검액의 농도가 높을 경우, 용매로 순차적으로 희석하여 유출유와 비교 대상 유류와의 농도를 유사한 수준으로 조정한 후 분석을 실시한다.

5.2  크로마토그램 육안 비교(Visual comparison)

5.2.1  크로마토그램의 포화탄화수소 분포비를 확인하여 원유, 중질유, 경질유 및 윤활유 등의 유종(oil type)을 확인한다. 유출유가 풍화를 받았거나 비교 대상 유류의 유종을 확인할 수 없을 경우, 기체크로마토그래프/질량분석기에 의한 유출유 식별법에 의해 유종을 확인한다.

5.2.2  크로마토그램 세기(Intensity)의 증가 및 감소 등 전체적인 피크 패턴의 형태 및 UCM(Unresolved Complex Mixture) 분포 등의 육안 비교(Visual comparison)를 통해 유출유와 비교대상 유류를 식별한다.

5.2.3  선저폐수(Bilge)는 선박의 밑바닥에 고인 액상 유성 혼합물로서, 선저폐수에 포함된 윤활유와 연료유의 혼합비가 일정하지 않아, 때로는 연료유 및 윤활유 각각의 크로마토그램처럼 나타날 경우도 있다.

5.3  풍화도 그래프

 저분자량의 포화탄화수소 증발을 고려하여, 포화탄화수소화합물 중 안정한 5개의 탄화수소화합물 면적의 평균값에 검출된 탄화수소 각각의 면적에 대해 표준화비로 구해진 그래프

(GC-PW-Plot, Percentage Weathering Plot) 비교: 유출유가 풍화(Weathering)에 의해 저분자량의 포화탄화수소가 증발되었을 경우, 풍화도 그래프를 분석하여 비교 대상 유류와 식별한다.

5.4  이소프레노이드비(Isopenoids Ratios) 비교: 유류 속에 포함되어 있는 비교적 안정한 화합물인 이소프레노이드의 높이비(C17/Pri, C18/Phy, Pri/Phy 등)를 비교하여 비교 대상 유류와 식별한다.

6. 참고사항

6.1  이 방법은 주로 해상에 유출된 유류와 비교대상 유류의 육안 비교를 통해 식별하는 방법으로 해상 유출유의 증발 등 풍화(Weathering)의 영향을 많이 받았거나 식별하기 어려울 경우, 기체크로마토그래프/질량분석기법을 이용하여 더 정밀하게 비교 분석해야 한다.

6.2  이 방법 이외의 분석 방법은 검출한계 및 재현성 등을 비교하였을 때 동등 이상일 경우, 사용할 수 있다.

제43항 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)에 의한 유출유 식별

1. 측정원리

해양에 유출된 유류시료 중의 탄화수소 화합물을 기체크로마토그래프에서 분리되어 나오는 탄화수소 이온을 질량분석기(Mass Spectrometer)를 사용하여 선택이온 모니터링(SIM, Selected Ion Monitoring)법으로 검출된 다환방향족 탄화수소, 바이오마커

 지질학적으로 오랜 시간을 거쳐 생성된 탄화수소로, 원유생성에 대한 다양한 정보를 제공하며, 풍화가 진행되어도 안정된 상태를 유지하는 가장 안정한 화합물

 등을 비교하여 비교대상 유류와 식별한다. 기체크로마토그래프/질량분석기의 분석조건은 표 1과 같다.

2. 기구 및 기기

2.1  원심분리기

2.2  분액깔때기

2.3  회전식 진공증발기(rotary vacuum evaporator)

2.4  기체크로마토그래프/질량분석기

표 1. 유출유 기체크로마토그래프/질량분석기 분석조건의 예

┌─────────┬──────────────────────┐

│검 출 기          │질량분석기(Mass Spectrometer)               │

├─────────┼──────────────────────┤

│칼    럼          │모세관 컬럼                                 │

│                  │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μM, 길이 30 m)│

├─────────┼──────────────────────┤

│충 진 제          │5 % diphenyl 95 % dimethypolsiloxane        │

├─────────┼──────────────────────┤

│운반기체 및 유속  │순도 99.999 % 이상의 질소(N2),              │

│                  │헬륨(He) 또는 수소(H2) 1.0 ∼ 2.0 mL/분     │

├─────────┼──────────────────────┤

│오븐 승온조건     │42 °C(1분∼2분) → 330 °C/분(10분)        │

├─────────┼──────────────────────┤

│오븐온도 승온속도 │5.0 ∼ 6.0 °C/분                           │

├─────────┼──────────────────────┤

│시료주입구 온도   │325 °C                                     │

├─────────┼──────────────────────┤

│트랜스퍼라인 온도 │230 °C                                     │

├─────────┼──────────────────────┤

│이온소스 온도     │230 °C                                     │

├─────────┼──────────────────────┤

│시료 주입량       │1.0 ∼ 2.0 ㎕                               │

└─────────┴──────────────────────┘

3. 시약 및 표준물질

3.1  디클로로메탄: 크로마토그래피용

3.2  노말-헥산: 크로마토그래피용

3.3  무수황산나트륨

4. 시료의 채취 및 보관

4.1  직접 용매추출방법

흡착지 또는 테프론 재질을 이용하여 채취한 시료를 약 2 ～ 4배의 디클로로메탄 또는 노말-헥산에 녹인 후 수 분간 정치한 후 디클로로메탄 또는 노말-헥산층을 취하여 무수황산나트륨 15 ～ 20 g을 채운 여과지로 여과하여 수분을 제거한다. 수분이 제거된 여과액을 30 ～ 50 °C의 수욕상에서 회전식 진공증발기를 이용하여 용매를 제거한 후 검액으로 사용한다. 여과액 중 중질유의 잔사유와 같은 입자가 있을 경우, 실리카겔/알루미나 컬럼 정제를 통해 제거한다.

4.2  원심분리에 의한 용매추출방법

유출유 시료 수 그램(g)을 같은 양의 디클로로메탄 또는 노말-헥산에 녹여 시료의 유형에 따라 500 ～ 14,000 rpm까지 회전속도 조절이 가능한 원심분리기로 10 ～ 20분간 원심분리하여 수분과 고형물 및 찌꺼기 등을 제거한다. 잔존하는 수층은 흡인(suction) 제거하고 고형물이나 찌꺼기 등은 디클로로메탄 또는 노말-헥산으로 미리 씻은 유리섬유로 여과하여 제거한 다음 여과액을 검액으로 한다.

4.3  분액깔때기를 이용한 용매추출방법

적당한 용량의 분액깔때기에 시료 10 mL 정도를 취하여 약 4배의 디클로로메탄 또는 노말-헥산을 넣고 약 30초간 흔들어 섞어 유분을 디클로로메탄 또는 노말-헥산에 완전히 녹인 다음 수 분간 정치하고 디클로로메탄 또는 노말-헥산층을 취하여 무수황산나트륨 15 ～ 20 g을 채운 여과지로 여과하여 수분을 제거한다. 수분이 제거된 여과액을 30 ～ 50 °C의 수욕상에서 회전식 진공증발기를 이용하여 용매를 제거한 후 검액으로 사용한다.

5. 시험방법

5.1  검액의 일정량(1.0 ～ 2.0 ㎕)을 기체 크로마토그래프/질량분석기에 주입하여 선택이온모니터링에 의해 얻어지는 크로마토그램의 육안 비교, 풍화도 그래프 비교 또는 판별지수비

 기체크로마토그래프/질량분석기에서 검출되는 특징적인 알킬레이트 다환방향족탄화수소 및 바이오마커 화합물에 대한 면적비를 의미한다.

(Diagnostic Ratio)등의 비교에 의해 비교 대상 유류를 식별한다. 분석 대상의 선택이온 분자량은 표 2와 같다.

표 2. 유출유 분석대상의 선택이온 분자량

┌───────────┬───────┬───────────┬───────┐

│물질명                │선택이온분자량│물질명                │선택이온분자량│

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│n-alkanes             │85            │C2-phenanthrenes      │206           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│Sesquiterpanes        │123           │C2-dibenzothiophenes  │212           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│Naphthalene           │128           │C1-fluoranthenes      │216           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│C1-naphthalenes       │142           │Steranes, Diasteranes │217,218       │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│C2-naphthalenes       │156           │C3-phenanthrenes      │220           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│C2-benzo(b)thiophenes │162           │C3-dibenzothiophenes  │226           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│C1-fluorenes          │180           │Chrysene              │228           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│Triterpanes(Hopanes)  │191           │C2-fluoranthenes      │230           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│C1-phenanthrenes      │192           │Triaromatic steranes  │231           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│C2-fluorenes          │194           │Retene                │234           │

├───────────┼───────┼───────────┼───────┤

│C1-dibenzothiophenes  │198           │C1-chrysenes          │242           │

└───────────┴───────┴───────────┴───────┘

5.2  크로마토그램 육안 비교(Visual  comparison)

5.2.1  선택이온의 질량 대 전하비(m/z)가 85, 192, 228, 231 및 234 등의 이온별 크로마토그램에서 검출되는 피크를 확인하여 원유, 중질유, 경질유 및 윤활유 등의 유종(oil type)을 확인한다.

5.2.2  선택이온의 질량 대 전하비(m/z)가 191, 192, 217, 218, 231 등의 이온별 크로마토그램에서 검출되는 피크의 형태 및 세기 등의 육안 비교(Visual comparison)를 통해 유출유와 비교 대상 유류를 식별한다.

5.3  풍화도 그래프 저분자량의 포화탄화수소 증발을 고려하여, 기체크로마토그래프/질량분석기에서 검출되는 바이오마커인 호판(Hopanes, Triterpanes)에 대해 유출유와 비교대상 유류의 높이 및 면적에 대한 비를 그래프로 나타낸 것

(MS-PW-Plot, Percentage Weathering Plot) 비교

유출유가 풍화(Weathering)에 의해 저분자량의 포화탄화수소가 증발되었을 경우, 풍화도 그래프를 분석하여 비교대상 유류와 식별한다. 이 풍화도 곡선을 분석하여 유출유의 증발, 용해 등 풍화의 요인 및 유사성을 식별한다.

5.4  판별지수비(Diagnostic Ratios) 비교: 기체크로마토그래프/질량분석기에서 검출되는 이소프레노이드, 알킬레이트 다환방향족탄화수소 및 바이오마커 등에 대한 판별지수비를 비교하여 유출유와 비교 대상 유류를 식별한다. 분석 대상의 판별지수비는 표 3과 같다.

표 3. 유출유 분석대상의 판별지수비

┌───────┬───────┬───────┬───────┐

│선택이온분자량│판별지수      │선택이온분자량│판별지수      │

├───────┼───────┼───────┼───────┤

│85            │C17/Pri       │191           │27Ts/30ab     │

│              ├───────┤              ├───────┤

│              │C18/Phy       │              │27Tm/30ab     │

│              ├───────┤              ├───────┤

│              │Pri/Phy       │              │28ab/30ab     │

├───────┼───────┤              ├───────┤

│192           │2-MP/1-MP     │              │29ab/30ab     │

├───────┼───────┤              ├───────┤

│198           │4-MDBT/1-MDBT │              │30O/30ab      │

├───────┼───────┤              ├───────┤

│216           │2-MFL/4-MPy   │              │31abS/30ab    │

│              ├───────┤              ├───────┤

│              │B(a)F/4-MPy   │              │30G/30ab      │

│              ├───────┼───────┼───────┤

│              │2-MPy/4-MPy   │217           │27dbR/27dbS   │

│              ├───────┼───────┼───────┤

│              │1-MPy/4-MPy   │218           │27bb/29bb     │

├───────┼───────┼───────┼───────┤

│234           │Retene/T-M-Phe│206,212       │C2-DBT/C2-Phe │

│              ├───────┼───────┼───────┤

│              │BNT/T-M-Phe   │220,226       │C3-DBT/C3-Phe │

└───────┴───────┴───────┴───────┘

6. 참고사항

6.1  저분자량의 탄화수소화합물의 증발이나 분산 등 유류의 풍화작용에 의해 식별이 어려울 경우, 표 2와 표 3 이외의 선택이온이나 판별지수 등을 이용하여 더 정밀하게 유출유와 비교 대상 유류와 식별할 수 있다.

6.2  이 방법 이외의 분석 방법은 검출한계 및 재현성 등을 비교하였을 때 동등 이상일 경우, 사용할 수 있다.

제44항 유출유 중 다환방향족탄화수소류 식별                    (Polycyclic  Aromatic  Hydrocarbons,  PAHs)

1. 측정원리

유출유 중에 함유되어 있는 다환방향족탄화수소류가 나타내는 형광을 흥분 파장 254 nm에서 형광 파장 280 ∼ 500 nm까지의 형광스펙트럼을 측정하여 세기와 패턴을 비교하여 확인하는 방법이다.

2. 기구 및 기기

2.1  형광분광광도계(spectroflorometer)

2.2  석영셀: 사면투명

2.3  원심분리기: 2000rpm 이상

2.4  원심분리관

3. 시약 및 표준물질

3.1  시클로-헥산: 형광분석용

3.2  메틸알코올: 시약특급

3.3  무수황산나트륨

4. 시료의 채취 및 보관

4.1  유출유 시료 중에 육안으로 확인할 수 있는 수분을 제거하고 정량병에 300 mg을 취하고 시클로-헥산 30 mL을 주의하면서 혼합한다.

4.2  시료를 원심분리관에 옮기고 무수황산나트륨 3 g을 넣고 10분간 원심분리한다.

4.3  상등액이 투명한가를 확인한 다음 투명한 부분에서 1 mL을 취하여, 100 mL 용량 플라스크에 넣고 시클로-헥산을 넣어 정확히 표선까지 채우고 1 : 10,000 (w/v) 시료로 한다.

4.4  1 : 10,000 (w/v) 시료 50 mL을 정확히 취하여 100 mL 매스플라스크에 넣어 시클로-헥산을 넣어 정확히 표선까지 채우고 1 : 20,000 (w/v) 시료로 한다.

4.5  1 : 20,000 (w/v) 시료 10 mL을 정확히 취하여 50 mL 매스플라스크에 넣고 시클로-헥산을 넣어 정확히 표선까지 채우고 1 : 10,000 (w/v) 시료로 한다.

5. 시험방법

5.1  각 농도의 시료를 사면투명의 석영셀에 흥분파장 254 nm에서 형광파장 280    ～ 500 nm까지의 형광스펙트럼을 측정한다.

5.2  시료의 형광스펙트럼 패턴과 비교대상 유류의 형광스펙트럼의 패턴을 비교 확인한다.

6. 참고사항

6.1  셀은 시료측정 사이에 메틸알코올로 3회 이상 반복하여 깨끗이 씻는다.

6.2  시료가 셀에 넘쳐흐르는 것은 메틸알코올을 무형광 티슈에 묻혀 깨끗이 닦고, 셀은 핀셋트로 집어 지문과 유류 등이 묻지 않도록 주의해야 한다.

제45항 유출유의 적외선 분광스펙트럼 식별

1. 측정원리

해양에 유출된 미확인 유류시료를 적외선 셀에 넣고 적외선 분광광도계에 의해 4,000에서 600 cm-1 의 범위에서 적외선 스펙트럼을 측정한 다음, 미확인 유류시료의 비교대상 유류의 적외선 스펙트럼을 상호 비교하여 스펙트럼의 일치 정도를 식별한다. 해양에 유출된 유류는 시간이 경과함에 따라 광화학적 분해, 증발, 용해, 유화(emulsification), 미생물에 의한 분해 등에 이해 풍화(weathering)가 일어난다. 이 방법은 풍화가 일어난 유출유에도 적용할 수 있으며 보조적인 유출유 비교식별 방법 중의 하나이다.

2. 측정범위 및 정밀도

2.1  분광정확도: 4,000 ～ 2,000 cm-1 범위에서 ± 5 cm-1 이내 ; 2,000 ～ 6,000 cm-1 범위에서 ± 3 cm-1 이내

2.2  분광재현성: 4,000 ～ 2,000 cm-1 범위에서 2.5 cm-1 이내 ; 2,000 ～ 600 cm-1 범위에서 1.5 cm-1 이내

2.3  흡광정확도: 최대 흡광도의 ± 1 %

2.4  흡광재현성: 최대 흡광도의 1 % 이하

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구: 분석에 사용되는 유리 시료병을 포함한 모든 초자기구류는 반드시 묽은 산용액(염산 0.1 N)으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 보관시나 분석 반응시 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 오염을 차단해야 한다.

3.2  일회용 파스테르 피벳 또는 주사기

3.3  열판(hot plate)

3.4  원심분리기

3.5  적외선 분광광도계(IR spectrophotometer): 적외선 창은 브롬화칼륨 또는 염화나트륨 재질이다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  시클로-헥산: 분광분석용

4.2  노말-헥산: 분광분석용

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 채취된 유류시료는 시클로-헥산으로 미리 세척 건조된 경질 유리용기에 보관하고 안감이 테프론으로 처리된 마개로 봉한다. 분석에 필요한 시료량은 수 그램(g)이면 충분하다.

5.2  시료에 가능한 해수나 잡물질이 포함되지 않도록 한다. 만일 유류시료가 수용액면에 막을 형성하거나 유류시료에 퇴적물 등이 섞여 있으면 노말-헥산으로 용매추출한 후 열판에서 용매만을 증발시킨다. 유류시료가 유화 상태일 경우에는 노말-헥산을 첨가하고 원심분리에 의해 분리ㆍ추출한 후 용매만을 증발시킨다.

6. 시험방법

6.1  유류시료를 파스테르 피펫 또는 주사기로 적외선 분광광도계의 적외선 셀에 넣고 (1,975 ± 20)cm-1 에서 흡광도가 0.02가 되도록 방법선(baseline)을 조절한다.

6.2  적외선 스펙트럼을 4,000부터 600 cm-1 까지 측정한다.

6.3  미확인 유류시료와 비교 대상의 유류시료의 적외선 스펙트럼 및 피크 위치의 전체적인 유사성을 비교한다.

6.4  유사성이 인정되면 1,770부터 1,685 cm-1 까지의 범위에서 특히 1,708 cm-1 를 중심으로 풍화 정도를 파악한다.

6.5  풍화 정도를 고려하여 1,350부터 900 cm-1 까지의 범위에서 특히 1,304와 1,165 그리고 1,032 cm-1 의 피크 크기와 모양의 일치 정도를 비교한다.

6.6  유사성이 인정되면 875 cm-1 를 방법으로 두 비교 스펙트럼을 겹쳐놓고 특히 900부터 700 cm-1 까지의 범위를 세밀히 비교하여 일치 정도를 최종적으로 식별한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  분석 당일 매번 검정용 폴리스틸렌 필름(0.05 mm 두께)의 적외선 스펙트럼을 측정하여 기기의 성능 및 이상 유무를 확인한다.

7.2  폴리스틸렌의 스펙트럼에서 285.7과 1,583.1 cm-1 의 곁가지 피크의 분해능을 점검한다. 곁가지 피크는 두 파수에서 뚜렷하게 나타나야 한다.

8. 참고사항

8.1  이 방법은 대부분의 유출유 비교식별에 이용될 수 있으나 이미 유류에 의해 오염된 해역에서는 유출유가 기존의 유류와 혼합되기 때문에 비교ㆍ식별이 어려울 수도 있다.

8.2  적외선 스펙트럼 측정시 수분이 시료에 포함되어 있을 경우, 적외선 창이 습기에 의해 혼탁해지므로 스펙트럼 결과가 나빠질 수 있다.

8.3  미확인 유류시료와 비교대상 유류시료는 항상 동일한 분석조건과 시기에 분석되어야 한다. 만일, 측정시료가 불가피하게 용매에 의해 희석되어 있을 경우에는 비교대상 시료 또한 동일한 용매에 의해 희석된 후 동일한 조건에서 분석되어야 한다.

제46항 유출유 중 황화합물

1. 측정원리

유출유 중에 함유되어 있는 황화합물을 불꽃광도 검출기(flamephotomeric detector)가 부착된 기체크로마토그래피법 따라 황화합물이 연소할 때 발생하는 빛의 스펙트럼 중 파장 394 nm에서 측정되는 크로마토그래프의 패턴으로 비교 확인한다.

2. 기구 및 기기

2.1  기체크로마토그래프

표 1. 유출유 중 황화합물의 기체크로마토그래프 분석조건

┌─────────┬──────────────────────┐

│검 출 기          │불꽃광도검출기(FPD)                         │

├─────────┼──────────────────────┤

│칼    럼          │모세관 컬럼                                 │

│                  │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μM, 길이 30 m)│

├─────────┼──────────────────────┤

│충 진 제          │5 % phenyl 95 % methylsiloxane              │

├─────────┼──────────────────────┤

│운반기체 및 유속  │순도 99.999 % 이상의 질소(N2)               │

│                  │또는 헬륨(He) 1.2 mL/분                     │

├─────────┼──────────────────────┤

│보조기체 유속     │300 mL/분                                   │

├─────────┼──────────────────────┤

│오븐 승온조건     │60 °C (0.5분) → 300 °C                   │

├─────────┼──────────────────────┤

│오븐온도 승온속도 │6.0 °C/분                                  │

├─────────┼──────────────────────┤

│시료주입구 온도   │300 °C                                     │

├─────────┼──────────────────────┤

│검출기 온도       │320 °C                                     │

└─────────┴──────────────────────┘

3. 시약 및 표준물질

3.1  클로로포름: 크로마토그래피용

3.2  노말-헥산: 크로마토그래피용

3.3  무수황산나트륨

4. 시료의 채취 및 보관

제42항 유출유 중 포화탄화수소류 식별, 시료의 전처리 중 4.3 분액깔때기에 의한 용매 추출에 따른다.

5. 시험방법

5.1  시료 일정량을 기체크로마토그래프에 주입하여 얻어지는 황화합물 크로마토그램 피크 패턴과 비교대상 유류의 크로마토그램 피크 패턴을 비교ㆍ확인한다.

5.2  크로마토그램 식별방법은 제42항 유출유 중 포화탄화수소류 식별, 시험방법 중 5.2 크로마토그램 육안비교 식별시 유의사항에 따른다.

제47항 유출유 중 니켈

1. 측정원리

유출유 중에 함유되어 있는 니켈을 전기로와 산을 이용하여 분해시킨 후 최종 1    % 질산으로 용해하여 원자흡광광도계(이하 GF-AAS), 유도결합플라즈마 분광분석기(이하 ICP-OES), 질량분석기(이하 ICP-MS)를 이용하여 정량한다.

2. 측정범위 및 정밀도

제22항 구리의 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

3.1  도가니(20 ∼ 50 mL)

3.2  전기로(온도 조절이 되는 것)

이하 기구 및 기기는 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제8항 구리 3. 기구 및 기기를 참조한다.

4. 시약 및 표준물질

시약은 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제8항 구리 4. 시약 및 표준물질을 참조한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  유출유 시료 0.1 g을 깨끗한 도가니에 넣고 뚜껑을 닫는다.

5.2  뚜껑을 닫은 자기 도가니를 550 °C로 가열시킨 가열로 안에 넣고 6시간 동안 반응시킨다.

5.3  반응시킨 도가니에 질산 5 mL를 첨가하여 130 ∼ 150 °C에서 반응시킨다. 이때, 시료가 완전히 마르지 않도록 주의한다.

5.4  반응이 끝난 시료를 1 % 질산 10 mL로 용해시킨 후 정량시료로 한다.

6. 시험방법

시험방법은 해양퇴적물공정시험기준 제8항 구리 6. 시험방법을 참조한다.

7. 분석절차 흐름도

┌─────────┐                                        

│0.100 g을 정확히  │시료                                    

│취하여 사용       │                                        

└─────────┘                                        

┌─────────┐                                        

│자기 도가니       │                                        

└─────────┘                                        

                      ① 진한 질산 5 mL                       

┌─────────┐                                        

│혼합              │                                        

└─────────┘                                        

┌─────────┐                                        

│가열              │130 °C ∼ 150 °C에서 6시간 가열       

└─────────┘                                        

┌─────────┐                                        

│증발              │시료가 완전히 마르지 않도록 주의        

└─────────┘                                        

┌─────────┐                                        

│방냉              │상온에 도달할 때까지 방냉               

└─────────┘                                        

                      ② 1 % 질산 10 mL로 정용                

┌─────────┐                                        

│정량용 시료       │                                        

│                  │1 % 질산용액 10 mL를 정확히 가하여      

│                  │밀봉한 후 정량용 시료 용액으로 사용     

└─────────┘                                        

┌─────────┐                                        

│정량              │이 용액을 GF-AAS 혹은 ICP-MS로 정량     

└─────────┘                                        

그림 1. 유출유 중 니켈 분석절차

8. 결과

8.1  농도계산

보고자료는 μg/g 단위로 표시하며 유출유 중금속농도는 다음과 같은 식에서 계산한다.

유출류 중금속(mg/kg) = ((a-b)×((V/S))*희석배수           (식 1)

                   a: 시료(mg/L),    V: 10 mL(시료량) 

                   b: 바탕(mg/L),    S: 0.1 g(유츌류 시료량)

8.2  유출유 중금속에 대한 결과는 공시료, 표준물질, 시료에서의 중금속농도 측정치를 보고한다.

8.3  정량결과 예시

시료의 채취 및 보관 방법, 전처리 방법, 정량 결과, 검량선을 포함하여 상세하게 제시한다.

표 1. 시료 채취 및 보관, 전처리 정보(작성예시)

┌─────────────┐

│시료 채취 및 보관, 전처리 │

├──────┬──────┤

│시료명      │            │

├──────┼──────┤

│시료채취    │            │

├──────┼──────┤

│시료운반    │            │

├──────┼──────┤

│시료보관    │            │

├──────┼──────┤

│시료 전처리 │            │

└──────┴──────┘

표 2. 정량결과(작성예시)

┌──────────┐

│정량 결과           │

├─────────┬┤

│분석항목          ││

├─────────┼┤

│정량 기기         ││

├─────────┼┤

│CRM 농도          ││

├─────────┼┤

│정량 평균         ││

├─────────┼┤

│표준편차          ││

├─────────┼┤

│정밀도(상대표준편 ││

│차)               ││

├─────────┼┤

│정확도(회수율)    ││

├─────────┼┤

│정량한계(검출한계)││

├─────────┼┤

│시료개수          ││

├─────────┼┤

│시료 중량         ││

├─────────┼┤

│희석 배율         ││

└─────────┴┘

그림 1. 검량선

표 3. 검량선(작성예시)

┌───────┬───┬────────┐

│표준물질 농도 │흡광도│흡광도 - 공실험 │

├───────┼───┼────────┤

│공시료 농도   │      │                │

├───────┼───┼────────┤

│1             │      │                │

├───────┼───┼────────┤

│2             │      │                │

├───────┼───┼────────┤

│3             │      │                │

├───────┼───┼────────┤

│4             │      │                │

└───────┴───┴────────┘

표 4. 검량선 예시

┌────────┬───┬───┐

│Standard(μg/L) │ABS   │ABS-BK│

├────────┼───┼───┤

│0               │0.010 │0.000 │

├────────┼───┼───┤

│5               │0.051 │0.041 │

├────────┼───┼───┤

│10              │0.095 │0.085 │

└────────┴───┴───┘

제48항 유출유 중 바나듐

1. 측정원리

유출유 중에 함유되어 있는 바나듐을 전기로와 산을 이용하여 분해시킨 후 최종 1  % 질산으로 용해하여 유도결합플라즈마 분광분석기(이하 ICP-OES) 혹은 ICP-MS를 이용하여 정량한다.

2. 측정범위 및 정밀도

제22항 구리의 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

제47항 유출유 중 니켈 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제47항 유출유 중 니켈 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제47항 유출유 중 니켈 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  바나듐 중공음극램프를 점등하여서 안정시킨다. 적정범위의 바나듐 표준용액 농도구간에서 흡광도값(318.4 nm)을 이용하여 검량선식을 산출한다. 바탕시료 및 전처리한 시료에 대하여 동일한 방법으로 흡광도값를 측정한다.

6.2  산출된 검량선식에 의하여 시료를 정량한다.

7. 분석절차 흐름도

제47항 유출유 중 니켈 분석법 7. 분석절차 흐름도를 참고한다.

8. 결과

제47항 유출유 중 니켈 8. 결과에 따른다.

제49항 유출유 중 포화분, 방향족분, 레진분

1. 측정원리

시료를 특정 용매에 녹이고 활성실리카겔층을 통과시켜 실리카겔의 흡착력과 각종 용출력의 차이를 이용하여 시료 중의 특정 물질을 3회 분별 분리하고 용매를 가열하여 제거한 다음 각 성분량을 중량비로 계산한다.

2. 기구 및 기기

2.1  흡착 액체크로마토관 

2.1.1  실리카겔(등급 12)와 실리카겔(등급 923)을 80 : 20으로 잘 혼합하여 백색 자기도가니에 적당량을 취하고, 또 다른 백색 자기도가니에 실리카겔(등급 950) 적당량을 취하여 180 °C에서 4시간 동안 활성화시킨 다음 데시케이터 안에서 냉각한다.

2.1.2  흡착 액체크로마토관의 밑부분에 탈지면을 10 mm의 높이까지 채우고 혼합 실리카겔(등급 12. 등급 923) 5 g을 균일하게 충전한다. 흡착관을 흔들어가면서 계속해서 실리카겔(등급 950) 5 g을 균일하게 충전시킨 다음, 석유에테르 10 mL을 통과시켜 실리카겔을 습윤시킨다.

2.2  회전식 증발기(rotary evaporator)

3. 시약 및 표준물질

3.1  클로로포름: 크로마토그래피용

3.2  노말-헥산: 크로마토그래피용

3.3  무수황산나트륨

3.4  석유에테르: 크로마토그래피용

3.5  벤젠: 크로마토그래피용

3.6  메틸알코올: 크로마토그래피용

4. 시료의 채취 및 보관

제42항 유출유 중 포화탄화수소류 식별, 시료의 전처리 중 4.3 분액깔때기에 의한 용매 추출에 따른다.

5. 시험방법

5.1  미리 항량으로 하여 무게를 정밀히 단 100 mL 비이커에 유출유 약 0.5 g을 넣고 정밀히 무게를 단 후에 석유에테르 5 mL을 넣어 유출유를 완전히 녹인 다음, 흡착 액체크로마토관을 통과시킨다. 미리 무게를 정밀히 단 삼각플라스크를 흡착 액체 크로마토관 밑에 놓아둔다.

5.2  석유에테르 용출분: 시료 용액이 흡착 액체크로마토관 중에 전부 흡입되었을 때 다시 석유에테르 10 mL로 비이커 안의 잔류유분을 녹여 흡착 액체크로마토관에 넣은 다음 석유에테르가 전부 흡입되면 계속해서 벤젠 10 mL를 주입한다.

5.3  벤젠 용출분: 흑갈색 띠가 흡착 액체크로마토관 하단 탈지면 부근 2 ～ 3 cm 위치에 도달할 때까지 석유에테르 용출분을 받는다. 다음에 미리 무게를 정밀히 단 다른 삼각플라스크로 교환하여 벤젠 용출분을 받으면서 벤젠 40 mL를 계속해서 주입시킨 다음 벤젠이 흡착관 안에 전부 흡입되면 메틸알코올 10 mL를 주입시킨다.

5.4  메틸알코올 용출분: 다갈색 띠가 흡착 액체크로마토관 하단 탈지면 부근 2 ～ 3 cm 위치에 도달할 때까지 벤젠 용출분을 받는다. 다음에 미리 무게를 정밀히 단 다른 삼각플라스크로 교환하여 메틸알코올 40 mL을 계속해서 주입시켜 메틸알코올 용출분을 받는다.

5.5  각 성분의 용출분을 회전식 증발기를 사용하여 85 ～ 90 °C 수욕상에서 용매를 제거한 다음, 깨끗한 헝겊으로 삼각플라스크의 외벽을 잘 씻고 100 ～ 105 °C 건조기에서 30분간 건조한다. 시료를 데시케이터 안에서 방냉한 후 삼각플라스크의 무게를 0.1 mg까지 정밀히 단다.

5.6  각 성분에 대한 정량 후 회수율, 포화분, 방향족분, 레진분 그리고 포화탄화수소/방향족탄화수소의 성분비를 산출한다.

5.6.1  회수율(%) = [( S + A + R ) / M] × 100                          (식 1)

5.6.2  포화분(%) = [S /( S + A + R )] × 100                           (식 2)

5.6.3  방향족분(%) = [A /( S + A + R )] × 100                         (식 3)

5.6.4  레진분(%) = [R /( S + A + R )] × 100A                         (식 4)

5.6.5  포화탄화수소/방향족탄화수소의 성분비 = S / A                   (식 5)

여기서,     M: 시료 유황(g)       S: 석유에테르 용출량(g)

            A: 벤젠 용출량(g)     R: 메틸알코올 용출량(g)

제50항 폴리브롬화 디페닐에테르                         (Polybrominated  Diphenyl  Ethers,  PBDEs)

1. 측정원리

고상 추출법(Solid Phase Extraction, SPE)을 이용하여 해수 중의 폴리브롬화 디페닐에테르(Polybrominated  Diphenyl  Ethers,  PBDEs)를 포집한 후, 속실렛 추출법을 이용하여 추출한다. 추출액은 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 황 등의 분석 방해물질을 제거한 뒤 기체크로마토그래프-질량분석기(Gas Chromatograph/Mass Spectrometer, GC/MS)의 전자포획 화학 음이온화(Electron Capture Negative Ionization, ECNI) 방식을 사용하여 선택적 이온모니터링(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래프-질량분석기를 이용한 분석방법 검출한계는 다음과 같다.

표 1.  PBDEs 분석방법 검출한계(MDL)

┌─────────────────┬────────────┐

│성        분                      │분석방법 검출한계 (ng/L)│

├─────────────────┼────────────┤

│T3BDE, T4BDE, P5BDE, H6BDE, H7BDE │0.07                    │

├─────────────────┼────────────┤

│O8BDE, N9BDE                      │0.33                    │

├─────────────────┼────────────┤

│D10BDE                            │3.33                    │

└─────────────────┴────────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 폴리브롬화 디페닐에테르의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용 전 확인시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다.

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시켜 사용하기 전에 아세톤으로 닦아 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  고상 추출장치: GF/F 필터지, SPE 카트리지(Envi-Disk 및 동급 이상), 여과 장치, 진공펌프

3.1.2  속실렛 추출장치: 냉각장치, 사이폰, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.3  250, 500 mL 갈색 유리병

3.1.4  250, 500 mL 가지형 플라스크

3.1.5  1 ∼ 2 mL 유리 바이알

3.1.6  10 mL 시험관

3.1.7  액체 컬럼크로마토관: 다층 실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm)의 유리제 컬럼크로마토관

3.1.8  탈지면: 노말-헥산 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  농축장치

3.2.1  회전증발농축기(Rotary Evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정 온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인장치(Aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환장치(Cooling Circulator)

3.3  기체크로마토그래피/질량분석기 (Gas Chromatograph / Mass Spectrometer,   GC/MS)

3.3.1  컬럼오븐

컬럼오븐의 온도 제어범위가 50 ∼ 350 °C이고, 측정대상 물질의 최적 분리조건을 설정ㆍ제어가 가능하도록 승온 프로그래밍이 가능한 것.

3.3.2  모세관 컬럼

폴리브롬화 디페닐에테르 분석을 위한 모세관 컬럼으로 분리가 양호한 극성 컬럼의 사용을 원칙으로 한다. 길이 15 m, 내경 0.25 mm, 막두께 0.1 μm 또는 이와 동등한 컬럼으로 분석 목적에 따라 알맞게 선정한다.

3.3.3  검출기(MS)

3.3.3.1  이온원은 온도를 160 ∼ 300 °C로 유지할 수 있을 것.

3.3.3.2  전자포획 화학 음이온화(Electron Capture Negative Ionization, ECNI법)이 가능한 것.

3.3.3.3  선택이온 검출법(Selected Ion Monitoring: 이후 SIM법)이 가능하고, 필요한 측정 질량수의 채널 수와 감도의 관계를 고려하여 SIM법의 주기를 최대 1초 이하로 가능한 것.

3.3.4  시료 도입부: splitless 등 시료의 전량을 분리 컬럼 내에 도입 가능한 것.

3.3.5  운반기체: 고순도 헬륨(순도 99.999 % 이상)

3.3.6  시약 기체: 고순도 메탄(순도 99.95 % 이상)

4. 시약 및 표준물질

전체의 시약류에는 폴리브롬화디페닐에테르의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약

4.1.1  아세톤

4.1.2  노말-헥산

4.1.3  디클로로메탄

4.1.4  노난

4.2  세정수: 노말-헥산으로 세정한 것

4.3  무수황산나트륨: 잔류농약 시험용 혹은 그와 동등 이상의 것

4.4  황산, 수산화칼륨, 질산은: 시약특급 혹은 이것과 동등 이상의 것

4.5  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.6  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 1 mol/L 수산화칼륨 용액을 위 4.5항의 실리카겔에 수산화칼륨이 실리카겔에 대해 2 % (w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한 후, 진공감압 농축기로 농축하고, 밀폐 가능한 용기에 넣고, 진공데시케이터 내에 보관한다.

4.7  22 % 및 44 % 황산함유 실리카겔: 4.6항의 2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔에 황산이 실리카겔에 대해 22 % (w/w) 및 44 % (w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합하고, 밀폐 가능한 용기에 넣고, 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.8  표준용액과 내부표준용액

4.8.1  표준용액(표 2): 표준용액은 노말-헥산 혹은 노난 등을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

표 2.  PBDEs 분석에 사용하는 표준물질

┌──────┬────────────────┬─────┐

│대상 화합물 │PBDEs 화합물                    │IUPAC  No.│

├──────┼────────────────┼─────┤

│3브롬화물   │2,2',4-T3BDE                    │17        │

│            │2,4,4'-T3BDE                    │28        │

├──────┼────────────────┼─────┤

│4브롬화물   │2,2',4,4'-T4BDE                 │47        │

│            │2,3',4,4'-T4BDE                 │66        │

│            │2,3',4',6-T4BDE                 │71        │

├──────┼────────────────┼─────┤

│5브롬화물   │2,2',3,4,4'-P5BDE               │85        │

│            │2,2',4,4',5-P5BDE               │99        │

│            │2,2',4,4',6-P5BDE               │100       │

│            │2,3',4,4',6-P5BDE               │119       │

│            │3,3',4,4',5-P5BDE               │126       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│6브롬화물   │2,2',3,4,4',5'-H6BDE            │138       │

│            │2,2',4,4',5,5'-H6BDE            │153       │

│            │2,2',4,4',5,6'-H6BDE            │154       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│7브롬화물   │2,2',3,4,4',5',6-H7BDE          │183       │

│            │2,2',3,4,4',6,6'-H7BDE          │184       │

│            │2,2,3',4,4',5',6-H7BDE          │190       │

│            │2,3,3',4,4',5,6-H7BDE           │191       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│8브롬화물   │2,2',3,3',4,4',5,6'-O8BDE       │196       │

│            │2,2',3,3',4,4',6,6'-O8BDE       │197       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│9브롬화물   │2,2',3,3',4,4',5,5',6-N9BDE     │206       │

│            │2,2',3,3',4,4',5,6,6'-N9BDE     │207       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│10브롬화물  │2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-D10BDE │209       │

└──────┴────────────────┴─────┘

4.8.2  내부표준용액(표 3): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업농도범위로 희석하여 사용한다.

표 3.  PBDEs 분석에 사용하는 내부표준물질

┌───────────────────┬─────┐

│PBDEs 화합물                          │IUPAC  No.│

├───────────────────┼─────┤

│2,2',4,4',5-P5BDE                     │77        │

├───────────────────┼─────┤

│2,2',4,4',5,6-H6BDE                   │139       │

├───────────────────┼─────┤

│13C12-2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-D10BDE │209       │

└───────────────────┴─────┘

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  해수시료는 미리 세척된 스테인레스 혹은 유리병을 이용하여 표층수(수심 0 ∼50 cm 이내)를 취해서 20 L 용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 시료를 해동시킨다.

5.3  전처리(고상추출법)

5.3.1  여과장치에 GF/F 필터지를 장착 후 해수시료를 여과한다. 여과된 해수는 미리 세척된 용기에 따로 모아둔다.

5.3.2  GF/F 필터지를 통과한 해수시료를 SPE 카트리지(Envi-Disk 등)를 이용하여 다시 여과한다.

5.4  추출(속실렛 추출방법)

5.4.1  균질화된 건시료 10 g을 칭량하여 팀블 여과지에 넣고 내부표준물질을 주입한다.

5.4.2  팀블 여과지를 사이폰에 넣은 후, 디클로로메탄:노말-헥산 혼합용액(3 : 1, v/v) 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

5.4.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속실렛 장치를 분리한다.

5.4.4  추출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

5.4.5  황 용출에 의한 기기분석의 방해가 염려될 경우에는 환원구리를 이용하여 황을 제거한 후 다음 과정을 진행한다.

5.5  다층실리카겔 컬럼 크로마토그래피 정제

5.5.1  컬럼 크로마토관의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

5.5.2  노말-헥산을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

5.5.3  조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

5.5.4  실리카겔 1 g을 충진한다.

5.5.5  44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

5.5.6  실리카겔 1 g을 충진한다.

5.5.7  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

5.5.8  얻어진 시료 용액을 조심스럽게 이입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

5.5.9  15 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 150 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

5.5.10  얻어진 용출액을 회전증발농축기로 농축하고, 질소 가스로 농축하여 노난 20 ∼ 300 μL로 용매를 치환하여 GC/MS-ECNI로 분석한다.

6. 시험방법

6.1  분석조건

GC/MS의 분석조건은 다음과 같다.

표 4.  PBDEs 분석을 위한 GC/MS의 분석조건

┌────────────────────────────────────────┐

│기체크로마토그래프 조건                                                         │

├──────┬─────────────────────────────────┤

│컬럼        │용융 실리카겔 모세관 컬럼                                         │

│            │내경 0.25 mm, 필름두께 0.1 μm, 길이 15 m                         │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│컬럼 온도   │70 °C(1.5분) → 200 °C(20 °C/분, 3분) → 310 °C(5 °C/분, 5분)│

├──────┼─────────────────────────────────┤

│주입구 온도 │280 °C                                                           │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│주입 방법   │splitless (split 유지 시간: 60 ∼ 90초)                           │

├──────┴─────────────────────────────────┤

│질량분석기 조건                                                                 │

├──────┬─────────────────────────────────┤

│이온화 방법 │전자포획 화학음이온화(ECNI)법                                     │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│반응 가스   │메탄(CH4)                                                         │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│이온화 전류 │500 ∼ 1,000 μA                                                  │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│이온원 온도 │280 ∼ 300 °C                                                    │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│운반기체    │헬륨(25 psi)                                                      │

└──────┴─────────────────────────────────┘

6.2  시료의 측정

6.2.1  각 브롬화물의 모니터 이온을 1개의 브롬화물에 대하여 2개 이상 설정한다.

6.2.2  각 브롬화물의 정량용 질량수와 확인용 질량수에 대하여 크로마토그램을 기록하고, 2개 이상의 모니터 이온의 피크 면적비를 계산한다.

6.2.3  각 브롬화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적을 구한다.

7. 분석절차 흐름도

┌────────┐                            

│해수 약 20 L    │                            

└────────┘                            

┌────────┐                            

│고상 추출법     │                            

└────────┘                            

                    ① 내부표준물질 첨가        

┌────────┐                            

│속실렛 추출     │                            

└────────┘                            

┌────────┐                            

│농축            │                            

└────────┘                            

┌────────┐                            

│정제            │                            

└────────┘                            

                    ② 다층실리카겔 컬럼 정제   

┌────────┐                            

│농축            │                            

└────────┘                            

┌────────┐                            

│GC/MS-ECNI 분석 │                            

└────────┘                            

그림 1.  PBDEs 분석절차

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  검출한계 

8.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

8.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양으로 시료 처리를 위한 화학분석과정에서는 나타날 수 있는 오차를 나타내는 방법검출한계와는 다르다. 기기검출한계는 분석 신호와 바탕 신호의 비(signal to noise ratio)에 3배(혹은 5배)로 정의한다.

8.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석절차하에 측정하며, 이때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

8.3  검량선의 작성 및 검증

8.3.1  검량선의 작성

브롬화난연제(PBDEs) 분석전 검량선 작성용 표준용액을 3개 이상의 농도구배로 하여 검량선을 작성한다. x축은 GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질량의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 GC 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 분석하고자 하는 검량선 작성용 표준물질의 양을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

그림 2. 표준물질의 검량선

                       (식 1)

여기서,   RFs-is: GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질의 감응계수,

                표준용액의 검량곡선의 기울기에 해당함

         Is: GC 바이알에 첨가된 검량선 작성용 표준물질의 양(ng)

         Iis: GC 바이알에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

         As: GC 바이알에 첨가된 검량선 작성용 표준물질의 면적

         Ais: GC 바이알에 첨가된 GC 내부표준물질의 면적

8.3.2  검량선의 검증

검량선의 직선성을 평가하여 검증한다.

                                (식 2)

                         (식 3)

여기서,    A: 추세선의 기울기              Aa: 분석 대상화합물의 면적

           B: 추세선의 절편 값             Ais: GC 내부표준물질의 면적

           Ia: 분석 대상화합물의 양 (ng)    Ais: GC 내부표준물질의 면적

           Iis: GC 내부표준물질의 양(ng)

각 시료군마다 1회의 검량선 검증을 실시하는 것이 바람직하며, 검량선의 중간 농도에 해당하는 표준용액을 측정한다. 측정값은 검량선 작성 당시의 값과 20 % 이내에서 일치해야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검량선의 재작성이 요구된다.

8.4  정확도(Accuracy)

8.4.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석전 시료에 첨가된 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 GC 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 GC 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 GC 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

그림 3. 내부표준물질의 검량선

            (식 4)

     (식 5)

여기서,   RFsu-is: GC 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질의 감응계수

         Asu: 시료 첨가용 내부표준물질의 면적

         Ais: GC 내부표준물질의 면적

         Isu: 시료에 첨가된 시료 첨가용 내부표준물질의 양(ng)

         Iis: 시료의 최종추출액에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

8.4.2  시료에 첨가된 표준물질의 회수율

낮은 브롬화난연제(PBDEs) 농도를 가지는 해수시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후 동일한 실험을 수행하여 회수된 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

        (식 6)

여기서,    M: 첨가한 표준물질의 양

           Mspiked: 표준물질을 첨가한 해수시료에서의 측정값

           Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 해수시료에서의 측정값

Mspiked 와 Munspiked 은 위 8.1항으로부터 계산되어진다.

8.5  정밀도(Precision)

정밀도는 규정된 조건하에서의 측정값들간의 근접 정도를 나타내는 것으로써 검량곡선에 사용한 농도 범위에서 최소 3개의 농도에 해당하는 표준물질을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다.

실험에서 얻은 평균값과 표준편차로 변동계수를 구하여 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

정밀도(%) = CV =                       (식 7)

여기서,             CV: 변동계수(Coefficient of variation)

                   SD: 표준편차(Standard Deviation)

                   : 평균값

9. 결과

9.1  농도계산

브롬화난연제(PBDEs)의 농도는 다음의 식에 의해 구해진다.

그림 4. 내부표준물질의 검량선

                   (식 8)

                      (식 9)

여기서,      CS: 시료(sample)의 농도(ng/g)

            AS: 분석대상물질(PBDEs)의 면적

            AiS: GC 내부표준물질의 면적

            RFS-iS: GC 내부표준물질에 대한 분석대상물질의 감응계수,

                   표준용액의 검량곡선의 기울기에 해당함

            IiS: 시료 최종추출액에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

            IS: 시료에서의 분석대상물질(PBDEs)의 양(ng)

            W: 여과된 시료의 양(L)

이때, 시료 중에서의 내부표준물질 회수율이 많은 변동을 가진다면, 위 식에서 사용된 표준물질의 면적(As)은 위 8.4.1항에서 계산된 내부표준물질 회수율에 의한 보정된 값()을 이용해야 한다.

9.2  결과보고

시료에서의 농도와 함께 농도 계산에 사용된 검량선과 관련된 검량식 및 결정계수 그리고 자료질 검정을 위한 자료들을 함께 제시한다.

①  검량식

②  결정계수(R2)

③  표준물질 농도

④  검출한계

⑤  정확도

⑥  정밀도

제51항 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl Substances,  PFASs)

1. 측정원리

고상추출법(SPE)을 이용하여 해수 중의 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs)을 추출 및 정제한 뒤 액체크로마토그래프-삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)의 전자분무식이온화(ElectroSpray Ionization, ESI) 방식을 사용하여 다중반응검지법(Multiple reaction monitoring, MRM)로 분석한다.

2. 정량범위 및 정밀도

유효 정량 범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 분석기기에 대한 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있다. 0.25 L의 시료 기준 액체크로마토그래프-삼중질량분석기를 이용한 과불화화합물(PFASs)의 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 99 % 신뢰구간에서 0.10 ∼ 1.00 ng/L 정도이며, 성분별 정량한계를 표 1에 나타내었다.

표 1. PFASs의 정량한계(LOQ)

┌───┬───────┬───┬───────┐

│성분  │정량한계(ng/L)│성분  │정량한계(ng/L)│

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFBS  │1.00          │PFNA  │0.20          │

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFHS  │0.20          │PFDA  │0.20          │

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFOS  │0.40          │PFUnDA│0.20          │

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFDS  │0.20          │PFDoDA│0.20          │

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFPeA │0.20          │PFTrDA│0.20          │

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFHxA │0.20          │PFTeDA│0.10          │

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFHpA │0.10          │PFHxDA│0.20          │

├───┼───────┼───┼───────┤

│PFOA  │0.20          │PFOcDA│0.40          │

└───┴───────┴───┴───────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 기기는 과불화화합물의 측정 및 분석과정에서 발생할 수 있는 방해 요인을 최소화 하여 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮추어야한다. 실험 전 확인 시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염 유무를 반드시 확인해야 하고, 실험 전과정에 과불화화합물이 포함 될 수 있는 재질의 사용을 금해야 한다. 분석대상물질이 유리 표면에 흡착될 수 있으므로 과불화화합물 표준물질, 추출액과 시료 등은 유리재질의 용기나 피펫 등을 이용하지 말아야 한다. 구입한 표준용액이나 내부표준용액 등이 담겨 있는 유리용기(앰플)는 허용되지만 희석할 때에는 폴리프로필렌 재질의 용기를 이용해야 한다.

방해물질들은 용매에 포함된 오염물질, 시약(HPLC급 증류수 포함), 시료 용기와 뚜껑, 다른 시료처리 기구에서 비롯할 수 있으며 이들이 크로마토그램의 바탕선을 상승시킨다. 이 방법에 의한 분석대상물질은 일반적인 실험실 용품이나 장비, 예를 들면, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 제품, 액체크로마토그래프(LC) 용매 라인, 메탄올, 알루미늄 호일, 고체상추출(SPE) 시료 이송 라인 등에서도 발견될 수 있다. 이와 같이 오염 가능성이 있는 모든 용기나 기구는 정기적으로 검사하여 방해물질이 실험실 공시료 수준 이하로 존재하도록 해야 한다.

3.1  초자기구

3.1.1  시료용기: 폴리프로필렌(PP) 재질의 스크류뚜껑이 있는 50 mL 폴리프로필렌 일회용 용기, 15 mL 폴리프로필렌 용기, 원심분리관, 또는 폴리프로필렌 재질의 스크류뚜껑이 있는 폴리프로필렌 자동시료주입기 용기를 사용한다.

3.1.2  15, 50 mL 폴리프로필렌 튜브

3.1.3  250, 500 mL 폴리프로필렌 부피플라스크

3.2  기기

3.2.1  고체상 추출장치: 폴리머 또는 코폴리머 재질의 카트리지(HLB, 150 mg/6 cc 또는 동등 이상)를 이용한다.

3.2.2  진공 추출용 매니폴더: 많은 양의 시료를 전처리할 수 있는 진공추출용 매니폴더(Supelco 57030, 57275 또는 동급)를 사용한다.

3.2.3  질소농축기: 99.995 % 이상의 고순도 질소 사용

3.2.4. 액체크로마토그래피/삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)

3.2.4.1  LC 시스템: 5 ∼ 10 μL 용량의 시료를 반복적으로 주입할 수 있어야 하며, 농도 기울기 조절이 가능하고 분석 유량(0.3 mL/min)을 일정하게 유지할 수 있는 이성분(binary) 펌프가 있는 시스템이 요구된다. 액체크로마토그래프 시스템은 오염의 원인이 될 수 있는 기포제거장치(degasser)가 없이도 용매를 일정하게 조절할 수 있어야 한다.

3.2.4.2  권장 컬럼: 적절한 분해능, 피크 모양, 정확도 및 정밀도를 가지는 역상 C18 액체크로마토그래프 컬럼(2.0 × 150 mm, 5 μm 또는 동급 이상)을 사용한다.

3.2.4.3  검출기(MS/MS):　액체크로마토그래프(LC)에서 분석하는 유량(0.3 mL/min) 근처에서 음이온 전자분사 이온화(ESI)가 가능한 장비이어야 한다. 적절한 정밀도를 유지하기 위해서 크로마토그램 상의 피크당 10번 이상의 스캔을 할 수 있어야 한다.

3.2.4.4  이동상: 이동상은 과불화화합물 분리에 적절하도록 선택한다. 이동상 A는 5 mM 암모늄아세테이트가 포함된 증류수, 이동상 B는 메탄올을 이용하여 분리하고 방해물질과 분석대상물질의 피크가 최대한 겹치지 않는 경사용매조성법(gradient mode)을 이용한다. 또한 이동상의 유량은 컬럼의 분리효율이 최대로 되는 300 μL/min으로 하고 시료 주입량은 10 μL로 한다.

4. 시약 및 표준용액

전체의 시약류에는 과불화화합물의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인 시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약

4.1.1  메탄올

4.1.2  아세토니트릴

4.1.3  암모늄아세테이트

4.2  증류수: HPLC급 이상의 증류수를 이용해야 한다. 분석대상물질의 피크가 검출한계의 1/3 이상 발견되지 않아야 한다. 실험실에서 제조된 3차 증류수의 경우 제조시 18 ΜΩ 이상의 저항값을 유지하도록 관리해야 하며, 공시료 및 시료의 전처리 및 분석에 이용하기 전에 고체상추출용 카트리지를 통과시켜야 한다.

4.3  표준용액과 내부표준용액

4.3.1  표준용액(표 2): 표준용액은 메탄올을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석 물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.3.2  내부표준용액(표 2): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업 농도범위로 희석하여 사용한다.

표 2. 측정에 사용하는 PFASs 표준물질

┌─────────┬─────────────┬───┬──────┐

│대상 화합물       │PFASs 화합물              │약어  │내부표준물질│

├─────────┼─────────────┼───┼──────┤

│PFSAs             │Perflurobutane sulfonate  │PFBS  │13C12-PFBS  │

│(Perfluoroalkane  │Perflurohexane sulfonate  │PFHS  │13C12-PFHS  │

│sulfonic acids)   │Perflurooctane sulfonate  │PFOS  │13C12-PFOS  │

│                  │Perflurodecane sulfonate  │PFDS  │13C12-PFOS  │

├─────────┼─────────────┼───┼──────┤

│PFCAs             │Perfluropentanoic acid    │PFPeA │13C12-PFHxA │

│(Perfluoroalkyl   │Perflurohexanoic acid     │PFHxA │13C12-PFHxA │

│carboxylic acids) │Perfluroheptanoic acid    │PFHpA │13C12-PFOA  │

│                  │Perflurooctanoic acid     │PFOA  │13C12-PFOA  │

│                  │Perflurononanoic acid     │PFNA  │13C12-PFNA  │

│                  │Perflurodecanoic acid     │PFDA  │13C12-PFDA  │

│                  │Perfluroundecanoic acid   │PFUnDA│13C12-PFUnDA│

│                  │Perflurododecanoic acid   │PFDoDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurotridecanoic acid  │PFTrDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurotetradecanoic acid│PFTeDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurohexadecanoic acid │PFHxDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurooctadecanoic acid │PFOcDA│13C12-PFDoDA│

└─────────┴─────────────┴───┴──────┘

5. 시료보관 및 전처리

해수 시료는 미리 세척된 PP병을 이용하여 표층수(수심 0 ∼ 50cm 이내)를 취해서 1 L PP 용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 ?20 °C 이하에서 보관한다.

6. 시험 방법

6.1  추출(고상추출방법) 및 정제

6.1.1  해수 시료 250 mL을 칭량하여 준비한다.

6.1.2  카트리지의 추출, 정제 및 활성화를 위해 메탄올 6 mL, 증류수 6 mL로 씻어 내린다.

6.1.3  준비된 해수 시료에 내부표준물질 5 ng을 첨가하고 조심스럽게 카트리지에 주입하여 통과시킨다.

6.1.4  진공펌프를 이용해서 시료가 흡착된 카트리지를 건조시킨다.

6.1.5  건조된 카트리지를 메탄올 12 mL을 이용하여 용출시킨다.

6.1.6  얻어진 용출액을 질소농축기로 1 mL까지 농축하고 0.22 μm 공경의 나일론 재질 필터(Nylon filter)를 이용해 여과 후, LC/MS/MS로 분석한다.

6.2  액체 크로마토그래피 분석

6.2.1  표 3에 주어진 액체 크로마토그래피 조건을 적용하여 제조된 측정용 시료 10 μL를 액체 크로마토그래피의 주입부에 주입한다.

6.2.2  액체크로마토그래프- 삼중질량분석기의 전자분사 이온화 방식을 이용하여 과불화화합물을 검출한다. 표 4와 표 5에 주어진 분석대상물질 별 정량 및 정성을 위한 모분자이온(Q1)과 생성이온(Q3) 조건을 적용하여 다중반응검지법(MRM)으로 분석한다. 정량 및 정성이온의 머무름 시간과 면적비를 검사하여 각 물질들을 확인한 다음 내부표준법으로 정량한다.

표 3. PFASs 분석을 위한 LC/MS/MS의 기기조건

┌───────────────────────────┐

│액체크로마토그래프(LC) 조건                           │

├─────────┬─────────────────┤

│Column            │C18, 2.1 × 150 mm, 5.0 μm       │

├─────────┼─────────────────┤

│Mobile phase      │A: 5 mM Ammonium acetate in water │

│                  │B: Methanol                       │

├─────────┼──┬─┬──┬──┬──┬───┤

│Gradient mode     │Time│0 │5   │10  │10.1│22    │

│                  ├──┼─┼──┼──┼──┼───┤

│                  │A(%)│70│0   │0   │70  │70    │

│                  ├──┼─┼──┼──┼──┼───┤

│                  │B(%)│30│100 │100 │30  │30    │

├─────────┼──┴─┴──┴──┴──┴───┤

│Flow rate         │300 μL/min                       │

├─────────┼─────────────────┤

│Injection volume  │10 μL                            │

├─────────┴─────────────────┤

│삼중질량분석기(MS/MS) 조건                            │

├─────────┬─────────────────┤

│Ionization mode   │ESI negative mode                 │

├─────────┼─────────────────┤

│Curtain gas       │25 psi                            │

├─────────┼─────────────────┤

│Gas temperature   │400 °C                           │

├─────────┼─────────────────┤

│Ion spray voltage │?4500 V                          │

├─────────┼─────────────────┤

│Ion source gas 1  │40 psi                            │

│Ion source gas 2  │60 psi                            │

├─────────┼─────────────────┤

│Collision gas(CAD)│6                                 │

└─────────┴─────────────────┘

표 4. PFASs 분석을 위한 표준물질(17종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질│정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│        ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │        │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │        │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │        │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│PFSAs │PFBS    │298.9 │99.9  │36        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHS    │398.9 │80.0  │48        │398.9 │99.0  │40        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOS    │498.9 │79.9  │60        │498.9 │99.0  │48        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDS    │598.9 │80.0  │60        │598.9 │99.0  │66        │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│PFCAs │PFPeA   │262.9 │218.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHxA   │312.9 │268.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHpA   │362.9 │318.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOA    │412.9 │368.9 │8         │412.9 │168.8 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFNA    │462.8 │418.9 │8         │462.8 │218.8 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDA    │513.0 │469.0 │8         │513.0 │269.0 │20        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFUnDA  │563.0 │518.8 │8         │563.0 │269.0 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDoDA  │613.0 │569.0 │8         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFTrDA  │663.0 │618.8 │8         │663.0 │268.9 │23        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFTeDA  │712.9 │668.8 │12        │712.9 │368.5 │20        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHxDA  │812.9 │768.8 │12        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOcDA  │912.9 │868.8 │12        │912.9 │369.0 │28        │

└───┴────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

표 5. PFASs 분석을 위한 내부표준물질(9종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬──────┬──────────────┬──────────────┐

│대상  │대상물질    │정량이온                    │정성이온                    │

│화합물│            ├────┬───┬─────┼────┬───┬─────┤

│      │            │Q1      │Q3    │Collision │Q1      │Q3    │Collision │

│      │            │(m/z)   │(m/z) │energy    │(m/z)   │(m/z) │energy    │

│      │            │        │      │(CE)      │        │      │(CE)      │

├───┼──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│PFSAs │13C12-PFBS  │301.9   │79.7  │62        │-       │-     │-         │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFHS  │402.9   │83.7  │60        │402.9   │102.8 │50        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFOS  │502.9   │79.9  │100       │502.9   │98.7  │50        │

├───┼──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│PFCAs │13C12-PFHxA │314.7   │269.9 │4         │-       │-     │-         │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFOA  │416.9   │371.9 │8         │416.9   │168.8 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFNA  │467.8   │422.9 │8         │467.8   │219.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFDA  │514.9   │469.9 │8         │514.9   │219.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFUnDA│564.9   │519.9 │8         │564.9   │269.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFDoDA│614.9   │569.9 │8         │614.9   │269.0 │20        │

└───┴──────┴────┴───┴─────┴────┴───┴─────┘

7. 정도평가/정도관리

7.1. 검출한계

7.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

7.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 기기검출한계는 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 3배(혹은 5배)로 정의한다.

7.1.3  정량한계(Limit of Quantification, LOQ)

측정장치에서 분석 물질의 정밀성과 정확성을 가지는 정량값을 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 정량한계는 일반적으로 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 10배로 정의한다.

7.1.4  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석절차 하에 측정하며, 이 때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

7.2  정확도(Accuracy)

7.2.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석 전 시료에 첨가되어진 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

7.2.2  표준시료(Certified reference material, CRM)의 회수율

공인되어진 표준시료를 분석하여 얻어진 값과 공인값을 비교하여 시료 분석의 정확도를 검증한다.

            (식 1)

기기분석에서 관측되어진 값은 제 6.2.2항으로부터 계산되어진다. 공인된 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 자료질관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 측정된 농도는 표준물질의 공인값에 만족하는 결과를 나타내어야 한다. 국제원자력기구(IAEA) 및 미국 표준기술원(NIST) 등에서 생산된 다양한 CRM을 구입하여 사용할 수 있다.

7.2.3  시료에 첨가되어진 표준물질의 회수율

해수 시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후, 동일한 실험을 수행하고 회수되어진 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

            (식 2)

M: 첨가한 표준물질의 양 

Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값 

Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

7.3  검량선

7.3.1  분석대상 과불화화합물의 표준물질용액에 대하여 0.05 ∼ 1000 ng/mL 농도 범위에서 0을 포함한 5단계 이상의 표준농도 계열을 만들고, 내부표준물질이 일정 농도가 되도록 혼합 조제한다.

7.3.2  7.3.1항에서 조제한 농도별 표준물질혼합액 10 μL를 LC/MS/MS에 주입하고, 각 과불화화합물의 크로마토그램을 기록한다.

7.3.3  내부표준물질 및 농도별로 측정된 개별 과불화화합물의 크로마토그램을 확인 후, 머무름시간 및 설정된 다중반응검지법(MRM) 조건으로 정성ㆍ확정한다.

7.3.4  각각의 과불화화합물별로 검출된 피크(정량 이온) 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 표준용액 중의 각 과불화화합물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

7.3.5  분석대상 물질의 상대반응계수(RRF)를 구한다. RRF는 다음 식에 의해 산출한다.

                            (식 3)

As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

Cs: 표준용액 중의 분석 대상 물질의 농도

CIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도

8. 결과

8.1  농도 계산

분석 대상의 각 과불화화합물의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                           (식 4)

     C: 분석대상물질의 농도

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(ng)

     RRF: 상대반응계수

     W: 시료량(L)

9. 분석 절차 흐름도

┌─────────────────┐        

│해수 (250 mL)                     │        

└┬────────────────┘        

  │                                          

┌┴────────────────┐        

│고상 추출 (Solid Phase Extraction)│        

└┬────────────────┘        

  │　                                        

  │                                          

  │←  HLB 카트리지 활성화                   

  │    (Methanol 6 mL, 증류수 6 mL)          

  │                                          

  │←  해수 시료에 내부표준물질 5 ng 첨가    

  │                                          

  │←  활성화된 HLB 카트리지에 여과 후 건조  

  │                                          

  │　                                        

┌┴────────────────┐        

│용출 (Methanol 12 mL)             │        

└┬────────────────┘        

  │　                                        

┌┴────────────────┐        

│농축 (Evaporation)                │        

└┬────────────────┘        

  │                                          

  │                                          

  │←  Nylon filter (0.22μm) 여과           

  │                                          

  │                                          

┌┴────────────────┐        

│LC/MS/MS 분석                     │        

└─────────────────┘        

그림 1. 해수 중 과불화화합물(PFASs) 분석절차 흐름도

제52항 헥사브로모사이클로도데칸류(Hexabromocyclododecanes; HBCDs)

1. 측정원리

고상 추출법(Solid Phase Extraction, SPE)을 이용하여 해수 중의 헥사브로모사이클로도데칸(Hexabromocyclododecanes; HBCDs)를 포집한 후, 속슬렛 추출법을 이용하여 추출한다. 추출액은 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 황 등의 분석 방해물질을 제거한 뒤 액체크로마토그래프-삼중질량분석기(Liquid Chromatograph /Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)의 전자분무식이온화(ElectroSpray Ionization, ESI) 방식을 사용하여 다중반응검지법(Multiple Reaction Monitoring, MRM)로 분석한다.

2. 정량범위 및 정밀도

유효 정량 범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 분석기기에 대한 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있다. 8 L의 시료 기준 액체크로마토그래프-삼중질량분석기를 이용한 헥사브로모사이클로도데칸(HBCDs)의 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 99 % 신뢰구간에서 0.03 ng/L 정도이며, 성분별 정량한계를 표 1에 나타내었다.

표 1. HBCDs의 정량한계(LOQ)

┌────┬───────┐

│성분    │정량한계(ng/L)│

├────┼───────┤

│α-HBCD │0.03          │

├────┼───────┤

│β-HBCD │0.03          │

├────┼───────┤

│γ-HBCD │0.03          │

└────┴───────┘

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 HBCDs의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용 전 확인 시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다. 실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시켜 사용하기 전에 아세톤으로 닦아 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  속슬렛 추출장치: 냉각장치, 속슬렛 추출장치, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.2  250, 500 mL 갈색유리병 

3.1.3  250, 500 mL 가지형 플라스크

3.1.4  1 ∼ 2 mL 유리바이알

3.1.5  10 mL 시험관

3.1.6  액체 컬럼크로마토관: 다층 실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm)의 유리제 컬럼크로마토관

3.1.7  탈지면: 헥세인 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  기기

3.2.1  회전증발농축기(Rotary Evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인장치(Aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환장치(Cooling Circulator)

3.2.4  액체크로마토그래피/삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)

3.2.4.1  LC 시스템: 5 ∼ 10 μL 용량의 시료를 반복적으로 주입할 수 있어야 하며, 농도 기울기 조절이 가능하고 분석 유량(0.4 mL/min)을 일정하게 유지할 수 있는 이성분(binary) 펌프가 있는 시스템이 요구된다. 액체크로마토그래프 시스템은 오염의 원인이 될 수 있는 기포제거장치(degasser)가 없이도 용매를 일정하게 조절할 수 있어야 한다.

3.2.4.2  권장 컬럼: 적절한 분해능, 피크 모양, 정확도 및 정밀도를 가지는 역상 C18 액체크로마토그래프 컬럼(2.1 × 150 mm, 3.5 μm 또는 동급 이상)을 사용한다.

3.2.4.3  검출기(MS/MS):　액체크로마토그래프(LC)에서 분석하는 유량(0.4 mL/min) 근처에서 음이온 전자분사 이온화(ESI)가 가능한 장비이어야 한다. 적절한 정밀도를 유지하기 위해서 크로마토그램 상의 피크당 10번 이상의 스캔을 할 수 있어야 한다.

3.2.4.4  이동상: 이동상은 HBCDs 분리에 적절하도록 선택한다. 이동상 A는 25 % 메탄올이 포함된 증류수, 이동상 B는 30 % 메탄올이 포함된 아세트나이트릴을 이용하여 분리하고 방해물질과 분석대상물질의 피크가 최대한 겹치지 않는 경사용매조성법(gradient mode)을 이용한다. 또한 이동상의 유량은 컬럼의 분리효율이 최대로 되는 400 μL/min으로 하고 시료 주입량은 10 μL로 한다.

4. 시약 및 표준용액

전체의 시약류에는 HBCDs의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인 시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약

4.1.1  아세톤

4.1.2  헥세인

4.1.3  디클로로메탄

4.1.4  메탄올

4.1.5  아세트나이트릴

4.2  세정수: 헥세인으로 세정한 것

4.3  무수황산나트륨: 잔류농약시험용 혹은 그와 동등 이상의 것

4.4  황산, 수산화칼륨, 질산은: 시약특급 혹은 이것과 동등 이상의 것

4.5  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.5.1  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 1 mol/L 수산화칼륨 용액을 4.5의 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 혼합 후 밀폐 가능한 용기에 넣어 진공데시케이터 내에 보관한다.

4.5.2  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 4.5의 실리카겔에 황산이 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 혼합 후 밀폐 가능한 용기에 넣어 진공데시케이터 내에 보관한다.

4.6  표준용액과 내부표준용액

4.6.1  표준용액(표 2): 표준용액은 메탄올을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석 물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.6.2  내부표준용액(표 2): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업 농도범위로 희석하여 사용한다.

표 2. HBCDs의 표준물질 및 내부표준물질

┌──────┬─────────────┬────┬───────┐

│대상 화합물 │HBCDs 화합물              │약어    │내부표준물질  │

├──────┼─────────────┼────┼───────┤

│HBCDs       │α-Hexabromocyclododecane │α-HBCD │13C12-α-HBCD │

│            ├─────────────┼────┼───────┤

│            │β-Hexabromocyclododecane │β-HBCD │13C12-β-HBCD │

│            ├─────────────┼────┼───────┤

│            │γ-Hexabromocyclododecane │γ-HBCD │13C12-γ-HBCD │

└──────┴─────────────┴────┴───────┘

5. 시료보관 및 전처리

5.1  해수 시료는 미리 세척된 스테인레스 혹은 유리병을 이용하여 표층수(수심 0 ∼ 50 cm 이내)를 취해서 20 L 용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 ?20 °C 이하에서 보관한다.

6. 시험방법

6.1  전처리(고상추출법)

6.1.1  여과장치에 47mm GF/F 필터지를 장착 후 해수 시료를 여과한다. 이때 여과된 해수는 미리 세척된 용기에 따로 모아둔다.

6.1.2  GF/F 필터지를 통과한 해수 시료를 47mm SPE 디스크 (역상 C18 실리카 입자 내장)를 이용하여 다시 여과한다.

6.1.3  여과가 끝난 GF/F 필터지와 SPE 디스크를 암실 실온에서 건조한다.

6.2  추출(속슬렛 추출방법)

6.2.1  건조가 완료된 GF/F 필터지와 SPE 디스크를 잘라서 팀블 여과지에 넣고 내부표준물질 20ng을 첨가한다.

6.2.2  팀블 여과지를 속슬렛 추출장치에 넣은 후, 디클로로메탄:헥세인 혼합용액(3:1, v/v) 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

6.2.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속슬렛 장치를 분리한다.

6.2.4  추출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL까지 농축한다.

6.3  다층실리카겔 컬럼 크로마토그래피 정제

6.3.1  컬럼 크로마토관의 액면을 헥세인으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.3.2  헥세인을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.3  4.5.1항에서 조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.3.4  4.5항의 실리카겔 1 g을 충진한다.

6.3.5  4.5.2항의 44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

6.3.6  4.5항의 실리카겔 1 g을 충진한다.

6.3.7  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.8  6.2.4항에서 얻어진 시료 용액을 조심스럽게 주입하고, 소량의 헥세인으로 세정한다.

6.3.9  50 % 디클로로메탄이 함유된 헥세인 용액 100 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.3.10  얻어진 용출액을 회전증발농축기로 1 mL까지 농축하고, 메탄올을 100 ∼ 1000 μL 첨가해 용매 치환 후 질소가스로 0.5 mL까지 농축하여 LC/MS/MS로 분석한다.

6.4  액체 크로마토그래프 분석

6.4.1  표 3에 주어진 액체 크로마토그래프 조건을 적용하여 제조된 측정용 시료 10 μL를 액체 크로마토그래프의 주입부에 주입한다.

6.4.2  액체크로마토그래프- 삼중질량분석기의 전자분사 이온화 방식을 이용하여 브롬화난연제를 검출한다. 표 4와 표 5에 주어진 분석대상물질 별 정량 및 정성을 위한 모분자이온(Q1)과 생성이온(Q3) 조건을 적용하여 다중반응검지법(MRM)으로 분석한다. 정량 및 정성이온의 머무름 시간과 면적비를 검사하여 각 물질들을 확인한 다음 내부표준법으로 정량한다.

표 3. HBCDs 분석을 위한 LC/MS/MS의 기기조건

┌──────────────────────────┐

│액체크로마토그래프(LC) 조건                         │

├─────────┬────────────────┤

│Column            │C18, 2.1 × 150 mm, 3.5 μm     │

├─────────┼────────────────┤

│Mobile phase      │A: 25 % Methanol in water       │

│                  │B: 30 % Methanol in Acetonitrile│

├─────────┼──┬─┬─┬──┬──┬─┬─┤

│Gradient mode     │Time│0 │1 │2   │10  │11│15│

│                  ├──┼─┼─┼──┼──┼─┼─┤

│                  │A(%)│90│90│0   │0   │90│90│

│                  ├──┼─┼─┼──┼──┼─┼─┤

│                  │B(%)│10│10│100 │100 │10│10│

├─────────┼──┴─┴─┴──┴──┴─┴─┤

│Flow rate         │400 μL/min                     │

├─────────┼────────────────┤

│Injection volume  │10 μL                          │

├─────────┴────────────────┤

│삼중질량분석기(MS/MS) 조건                          │

├─────────┬────────────────┤

│Ionization mode   │ESI negative mode               │

├─────────┼────────────────┤

│Curtain gas       │25 psi                          │

├─────────┼────────────────┤

│Gas temperature   │400 °C                         │

├─────────┼────────────────┤

│Ion spray voltage │?4500 V                        │

├─────────┼────────────────┤

│Ion source gas 1  │40 psi                          │

│Ion source gas 2  │60 psi                          │

├─────────┼────────────────┤

│Collision gas(CAD)│6                               │

└─────────┴────────────────┘

표 4. HBCDs 분석을 위한 표준물질(3종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질│정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│        ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │        │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │        │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │        │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│HBCDs │α-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │β-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │γ-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

└───┴────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

표 5. HBCDs 분석을 위한 내부표준물질(3종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬───────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질      │정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│              ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │              │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │              │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │              │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│HBCDs │13C12-α-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

│      ├───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │13C12-β-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

│      ├───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │13C12-γ-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

└───┴───────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

7. 정도평가/정도관리

7.1  검출한계

7.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

7.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 기기검출한계는 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 3배(혹은 5배)로 정의한다.

7.1.3  정량한계(Limit of Quantification, LOQ)

측정장치에서 분석 물질의 정밀성과 정확성을 가지는 정량값을 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 정량한계는 일반적으로 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 10배로 정의한다.

7.1.4  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석절차 하에 측정하며, 이 때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

7.2  정확도(Accuracy)

7.2.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석 전 시료에 첨가된 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

7.2.2  표준시료(Certified reference material, CRM)의 회수율

공인되어진 표준시료를 분석하여 얻어진 값과 공인값을 비교하여 시료 분석의 정확도를 검증한다.

                (식 1)

기기분석에서 관측되어진 값은 제 6.2.2항으로부터 계산되어진다. 공인된 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 자료질관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 측정된 농도는 표준물질의 공인값에 만족하는 결과를 나타내어야 한다. 국제원자력기구(IAEA) 및 미국 표준기술원(NIST) 등에서 생산된 다양한 CRM을 구입하여 사용할 수 있다.

7.2.3  시료에 첨가된 표준물질의 회수율

해수 시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가하여 동일한 실험을 수행한 후 회수된 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

             (식 2)

     M: 첨가한 표준물질의 양 

     Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값 

     Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

7.3  검량선

7.3.1  분석대상 브롬화난연제의 표준물질 용액에 대하여 1 ∼ 500 ng/mL 농도 범위에서 5단계 이상의 표준농도 계열을 만들고, 일정 농도의 내부표준물질을 첨가한 후 혼합 조제한다.

7.3.2  7.3.1에서 조제한 표준 농도 계열의 10 μL를 LC/MS/MS에 주입하고, 각 브롬화화합물의 크로마토그램을 기록한다.

7.3.3  내부표준물질 및 농도별로 측정된 개별 브롬화화합물의 크로마토그램을 확인 후, 머무름시간 및 설정된 다중반응검지법(MRM) 조건으로 정성ㆍ확정한다.

7.3.4  각각의 브롬화화합물별로 검출된 피크(정량 이온) 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 표준용액 중의 각 브롬화화합물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

7.3.5  분석대상 물질의 상대반응계수(RRF)를 구한다. RRF는 다음 식에 의해 산출한다.

                            (식 3)

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Cs: 표준용액 중의 분석 대상 물질의 농도

     CIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도

8. 결과

8.1  농도 계산

분석 대상의 각 브롬화화합물의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                            (식 4)

     C: 분석대상물질의 농도

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(ng)

     RRF: 상대반응계수

     W: 시료량(g)

9. 분석절차 흐름도

┌─────────────────┐      

│해수 (8 L)                        │      

└┬────────────────┘      

  │                                        

┌┴────────────────┐      

│고상 추출(Solid Phase Extraction) │      

└┬────────────────┘      

  │　                                      

  │                                        

  │←  47mm GF/F 여과 후 건조              

  │                                        

  │←  47mm SPE 디스크 (C18) 여과 후 건조  

  │                                        

  │←  내부표준물질 20ng 첨가              

  │                                        

  │                                        

┌┴────────────────┐      

│속슬렛 추출(Soxhlet Extraction)   │      

└┬────────────────┘      

  │                                        

  │                                        

  │←  75 % DCM in Hexane (200 mL, 16 hr)  

  │                                        

  │                                        

┌┴────────────────┐      

│다층실리카겔칼럼 정제 (Clean-up)  │      

└┬────────────────┘      

  │　                                      

  │                                        

  │←  50 % DCM in Hexane (100 mL)         

  │                                        

  │                                        

┌┴────────────────┐      

│농축 (Evaporation)                │      

└┬────────────────┘      

  │                                        

  │                                        

  │←  Methanol 치환                       

  │                                        

  │                                        

┌┴────────────────┐      

│LC/MS/MS 분석                     │      

└─────────────────┘      

그림 1. 해수 중 브롬화난연제(HBCDs) 분석절차 흐름도

별표 0002: 해양퇴적물공정시험기준

[별표2] 해양퇴적물공정시험기준

2023. 12.

해양수산부 국립수산과학원

목   차

제1장 총칙1

제1항 개요1

제2장 시료의 채취 및 보관2

제1항 시료채취시 고려사항2

제2항 시료 채취ㆍ보관 및 전처리 방법5

제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법16

제1항 분석자료의 기초통계16

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)16

제4장 항목별 시험방법17

제1항 입도(Gravel, Sand, Silt & Clay Percent)17

제2항 함수율(Water Content)26

제3항 강열감량(Ignition Loss)28

제4항 총 황(Total Sulfur)30

제5항 산 휘발성 황화물 (Acid Volatile Sulfide, AVS)33

제6항 화학적 산소요구량(COD)39

제7항 유기탄소량(Organic Carbon)44

제8항 구리(Copper, Cu)48

제9항 납(Lead, Pb)56

제10항 니켈(Nickel, Ni)58

제11항 망간(Manganese, Mn)60

제12항 아연(Zinc, Zn)62

제13항 알루미늄(Aluminium, Al)64

제14항 철(Iron, Fe)66

제15항 카드뮴(Cadmium, Cd)68

제16항 코발트(Cobalt, Co)70

제17항 크롬(Chromium, Cr)72

제18항 비소(Arsenic, As)74

제19항 리튬(Lithium, Li)76

제20항 총 수은(Total Mercury, Hg)78

제21항 유기염소계 농약(Organochlorine Pesticides, OCPs)85

제22항 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)96

제23항 폴리클로리네이티드비페닐(Polychlorinated Biphenyls, PCBs) 105

제24항 유기주석화합물(Butyltins, BTs)113

제25항 공극수 수소이온농도(Hydrogen Ion Concentration, pH) 121

제26항 공극수 황화수소(Hydrogen Sulfide)122

제27항 공극수 아질산성질소(Nitrite Nitrogen, NO2-N)124

제28항 공극수 질산성질소(Nitrate Nitrogen, NO3-N)126

제29항 공극수 암모니아성질소(Ammonium Nitrogen, NH4-N)128

제30항 공극수 구리(Copper, Cu)130

제31항 공극수 납(Lead, Pb)132

제32항 공극수 니켈(Nickel, Ni)134

제33항 공극수 아연(Zinc, Zn)136

제34항 공극수 카드뮴(Cadmium, Cd)138

제35항 폴리브롬화 디페닐에테르(Polybrominated Diphenyl Ethers, PBDEs)140

제36항 다이옥신 및 퓨란(Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins and Furans, PCDD/Fs)153

제37항 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐(Dioxin-like PCBs, DL-PCBs)166

제38항 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl Substances, PFASs)178

제39항 헥사브로모사이클로도데칸류(Hexabromocyclododecanes, HBCDs)190

제1장 총칙

제1항 개요

1. 목적

이 시험방법은 「해양환경관리법」 제10조의 규정에 의거 해저퇴적물에 관련된 오염물질을 측정함에 있어서 측정결과의 정확도 및 정밀도 그리고 분석방법의 일관성을 유지하기 위하여 필요한 제반사항을 규정하는데 그 목적을 둔다.

2. 적용범위

2.1  「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」 제13조에 의한 해양환경기준의 적합한지는 별도의 규정이 없는 한 해양환경공정시험기준의 규정에 의하여 시험ㆍ판정한다.

2.2  「해양환경관리법」 제9조 제1항의 규정에 의한 "해양환경측정망", 「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」 제18조 제1항에 따른 "해양환경종합조사", 같은 법 제39조 "잔류성 유기오염물질 조사", 같은 법 제77조의 "해양오염영향조사", 그 외 「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」에서 정하는 해양환경에 대한 조사는 별도의 규정이 없는 한 공정시험기준(해저퇴적물편)의 규정에 따른다.

2.3  본 시험에서 규정하는 해저퇴적물이란 해수와 항상 접촉하거나, 주기적으로 접촉하는 퇴적물과 퇴적물에 포함된 공극수를 일컫는다. 즉, 연근해 및 원양의 모든 해저퇴적물을 해저퇴적물 시험 대상으로 하되, 이에는 항만 및 포구의 해저퇴적물, 연안의 해저퇴적물, 조간대 퇴적물 및 염하구의 저층 퇴적물을 모두 포함하는 것으로 한다.

3. 일반사항

 해수공정시험기준 제1장 총칙 중 제1항 3. 일반사항 및 제2항 시험관련 표시방법에 따른다.

제2장 시료의 채취 및 보관

제1항 시료채취시 고려사항

1. 시료채취 계획

1.1  해저지형 조사자료

해저지형에 대한 조사자료는 퇴적물의 시료채취 정점을 결정하는 데 사용된다.

1.2  채취지점의 수평적 간격

해저퇴적물의 수평분포 변화가 잘 나타날 수 있도록 채취지점의 간격과 수를 정한다.

1.3  시료채취의 시간 간격

해저퇴적물의 특성은 대부분 단기간 내에 크게 변화하지 않기 때문에 시간에 따른 변화를 측정하기 위해서는 계절 간격의 시료로써 충분한 경우가 많다. 하지만 조사의 목적이나 특성에 따라서는 시간 간격을 조정할 수 있다.

2. 시료채취 현장에서 주의사항

채취과정에서 오염 방지를 위해 금속 재질과 접촉한 부분에서는 시료를 채취하지 않도록 하며, 플라스틱 재질의 도구를 사용하여 충분한 양의 시료를 폴리에틸렌 병에 담아 냉장(또는 냉동)보관한다. 금속원소 함량 분석을 위한 시료는 미리 산으로 세척된 폴리에틸렌 병에 담아 지퍼백에 넣어 냉동 보관한다.

해저퇴적물은 비록 동일한 한 지점의 시료를 채취하더라도 여러 가지 크기의 다양한 입자들이 모여 있기 때문에 보조시료를 반드시 채취 및 보관하고 시료를 분석하는 과정에서 시료의 동질성(homogeneity)이 유지되도록 잘 혼합하여 사용한다. 혹시 시료의 정량결과가 너무 분산되어 있거나, 자료의 신뢰성이 떨어진다고 판단되면 보조시료를 추가적으로 분석할 수 있어야 한다. 모든 시료에 관한 채취과정의 정보는 다른 연구자들이 충분히 이해할 수 있도록 아래의 양식에 따라 기재하여 보관한다.

2.1  시료의 균질성 확보

시료채취 후 보조시료를 채취하고 보관, 분석하는 과정에서 해저퇴적물 시료의 동질성을 유지하기 위하여 시료를 채취하고 균질하게 혼합시킨 후 보조시료를 취한다.

2.2  금속원소 분석용 시료의 오염방지

금속원소 분석용 보조시료를 채취할 때에는 기기의 금속재질과 직접 접촉한 부분에서는 보조시료를 채취하지 않도록 조심한다. 시료를 옮기는 과정에서도 금속재질의 물질을 사용하지 않는다.

2.3  손실 및 오염방지

시료는 극소량을 취하여 분석할지라도 전체를 대표할 수 있어야만 한다. 그러므로 시료의 종류, 상태 및 분석방법 등 모든 사항을 고려함으로써 소량으로도 전체를 대표할 수 있도록 하고, 시료의 상태가 손실이 없어야 한다.

2.4  시료 필요 채취량

각 조사항목에 필요한 시료의 양은 분석용량 대비 수십 배 정도 충분한 양을 채취한다.

2.5  시료의 반복 개수

시료는 각 조사항목에 따라 필요할 경우 동일 채취지점에서 시료를 반복하여 채취한다. 퇴적물이 고르지 않게 분포되어 있거나, 오염원(항구, 천해 등)에 가까운 지역에서는 많은 개수의 반복 시료를 채취한다. 통상적으로 최소한 동일한 장소에서 필요한 양의 3배 이상 채취한다.

2.6  시료 채취시 시료에 관찰되는 사항은 규정된 양식에 따라 기재한다(별지 제1호서식).

[별지 제1호서식]

시료기재양식

┌──────────────────────────┐

│조사지역:정점번호:                                  │

├─────┬────────────────────┤

│위    치: │정점수심:          m                    │

├─────┴────────────────────┤

│조사일시:        년      월       일      시    분  │

├──────────────────────────┤

│특이사항:                                           │

├──────────────────────────┤

│작 성 자:                                           │

├──────────────────────────┤

│시료에 대한 일반적인 사항                           │

├─────┬────────────────────┤

│시료의 색 │퇴적상: (암반, 자갈, 니질 등)           │

├─────┴────────────────────┤

│시료의 냄새 1)                                      │

├──────────────────────────┤

│패각편       많다 (     )적다 (     )  없다 (      )│

├──────────────────────────┤

│자갈함량     많다 (     )적다 (     )  없다 (      )│

├──────────────────────────┤

│모래함량     많다 (    )적다 (     )  없다 (      ) │

├──────────────────────────┤

│니질함량     많다 (     )적다 (     )  없다 (      )│

└──────────────────────────┘

       1) 시료에서 특이한 냄새, 즉 황화수소나 유기물이 썩는 냄새 등이 날 경우 표시한다.

      33674-00511일                                                 210㎜ x 297㎜

제2항 시료 채취ㆍ보관 및 전처리 방법

1. 표층퇴적물 시료

각 채취지점에서 그랩형 시료채취기(grab sampler)를 이용하여 채취한 후, 플라스틱 재질의 주걱으로 교란되지 않은 부분의 표층에서 2 cm 깊이까지를 표층 퇴적물로 취하여 입구가 넓은 고밀도 폴리에틸렌병(wide mouth HDPE bottle)에 가득 담는다. 이때, 채취기의 금속재질과 접촉한 부분의 시료를 채취하지 않도록 주의한다. 한편, 그랩형 시료채취기로서는 반빈 채취기(Van Veen grab sampler), 스미스-맥킨타이어 채취기(Smith-McIntyre grab sampler), 라퐁드 채취기(la Fond  grab) 혹은 이들과 유사한 규격의 채취기를 이용한다.

표 1. 퇴적물 시료채취기 비교

┌──────────────────┬────────────────────┐

│스미스-맥킨타이어 채취기            │반빈 채취기                             │

├──────────────────┴────────────────────┤

│장 점                                                                         │

├──────────────────┬────────────────────┤

│퇴적물이 쉽게 교란되지 않고 안정된  │장비가 가벼움                           │

│상태로 채취 가능                    │사용법이 간단함                         │

│자갈(모래)이 많거나, 수심이 깊은 지 │                                        │

│역의 퇴적물을 채집하는데 용이함     │                                        │

├──────────────────┴────────────────────┤

│단 점                                                                         │

├──────────────────┬────────────────────┤

│장비가 무거움                       │연안에서 사용되고, 모래나 자갈이 포함된 │

│사용법이 어려움                     │퇴적물을 퍼 올리기 어려움, 주로 오니질  │

│                                    │(뻘)로 구성된 퇴적물에 사용)            │

│                                    │조류가 강한 곳에서 사용이 어려움        │

└──────────────────┴────────────────────┘

그림 1. 해양퇴적물 채취 장비

(a; 반빈 채취기, b;스미스-맥킨타이어 채취기)

2. 주상시료

시료채취는 퇴적물의 표층뿐만 아니라 수직적인 오염도를 평가하기 위하여 시도된다. 주상 시료는 퇴적물의 오염 정도가 가장 높을 것으로 예상되는 구역(오염원에서 가까운 지점, 지반이 함몰된 곳, 분지 등)에 위치할 것을 권고한다.

주상퇴적물 시료는 퇴적물 내 공극수의 채취, 분석 시 필요하다. 주상 퇴적물 시료의 채취는 상자형 채취기(box corer) 혹은 중력식 주상시료채취기(gravity corer), 피스톤식 채취기(piston corer), 바이브로코어 등을 이용한다.

채취된 주상시료로부터 공극수 추출물을 위한 시료를 채취할 때에는 질소로 충진된 장갑상자(glove box) 안에서 실시하며, 보조 시료의 채취 간격은 조사하고자 하는 항목의 깊이에 따른 변화가 충분히 나타날 수 있도록 결정해야 한다.

한편, 주상퇴적물 시료를 정해진 깊이에서 절단하여 시료를 취할 때에는 주상시료가 담긴 라이너(liner)가 수직으로 유지되도록 조심해야 하며, 플라스틱 재질의 주걱이나 칼을 이용하여 절단한다. 절단된 시료는 밀봉이 가능한 비닐백에 담은 후, 잘 혼합하여 원심관이나 압력 추출기에 옮겨 담은 후, 공극수 추출 방법(2.6.)에 따라 공극수를 추출한다. 한편, 장갑상자는 안이 들여다보이는 아크릴이나 두꺼운 비닐 등으로 만들되 공기나 기체가 새지 않도록 잘 밀봉해야 한다. 장갑상자는 가급적 직육면체의 모양을 가지는 것이 좋으며, 질소를 넣는 코크와 상자 안의 공기를 빼낼 수 있는 코크가 달려 있는 것이 좋다. 또한, 장갑이 달려있는 부분은 특히 밀봉에 신경을 써야 한다.

2.1  퇴적물의 시료채취 위치기록

채집위치에 대한 확인방법은 DGPS(Differential Global Positioning system)를 이용하여 조사 위치의 좌표를 제시한다. DGPS에 의한 위치정보의 오차범위는 통상 1 ∼ 10 m 이내이다.

2.2  시료채취 정점선정

해저퇴적물의 수평분포 변화가 잘 나타날 수 있도록 채취지점의 간격과 시료수를 결정한다. 특히 연안에서는 퇴적물의 공간 변화가 지역적으로 크게 변화할 수 있으며, 이들 변화가 관찰될 수 있도록 시료채취 간격을 충분히 고려한다. 조사정점의 위도 및 경도는 DGPS를 이용하여 정확하게 기록한다.

오염원 등 조사지역에 대한 참고자료가 없을 경우, 격자법에 의한 등간격의 정점배치가 바람직하며, 그 외 오염원, 과거 조사자료 등 참조할 자료가 있을 경우, 구역을 구분한 후 구역에 따라 시료 채취 정점의 밀도를 조정하는 계층 임의 시료채취법에 따라 정점을 배치하는 것이 바람직하다.

2.2.1  격자법

체계적인 시료채취(그림 3)는 전형적으로 정량적인 시ㆍ공간적 차원에서 오염 퇴적물의 범위를 확인하는데 사용된다.2.2.2  임의적 시료채취법

임의적 시료채취(그림 4)는 동일 크기로 구성된 격자 유형을 시료 채취 대상 지역의 지도 위에 놓는 방식이다.2.2.3  계층임의 시료채취법

계층임의 시료채취(그림 5)는 조사 장소의 구획내 시료 빈도수를 다르게 적용하는 임의적 시료 채취와 동일하다.

2.3  대조정점 선정

물리, 화학, 또는 독성 시험이 필요하거나, 퇴적물의 오염정도를 지역적으로 비교할 필요가 있다면, 대조정점들은 오염원에서 비교적 멀리 벗어난 지역으로 선정해야 한다.

2.4  시료채취밀도 결정방법

2.4.1  시료채취밀도 조정

표층퇴적물의 경우, 조사 대상 해역의 오염이 우려되는 면적이 10,000 m2 미만일 경우에는 기본 2개 정점에 대조 퇴적물 1개 정점을 선정하여 총 3개 지점에서 시료를 채취하고, 10,000 m2 초과할 경우에는 50,000 m2 까지는 20,000 m2 초과시마다 1개 정점씩 추가하되, 대상지역의 오염면적 및 상황에 따라 시료채취 밀도를 조정한다.

2.4.2  주상퇴적물 밀도 선정

가능한 오염원에서 가장 가까운 정점을 포함하여 조사 해역의 퇴적물오염에 대한 3차원적인 지리정보를 제공할 수 있도록 정점을 선정하고 오염 물질의 농도구배가 배경농도로 보이는 깊이까지 채취한다.

3. 공극수 추출방법

공극수란 퇴적물 입자 사이의 빈 공간, 즉 공극 안에 포함된 해수를 말한다. 공극수는 여러가지 방법으로 분리할 수 있는데, 크게 퇴적물에 외부의 압력을 가하여 공극수를 짜내는 방법과 퇴적물을 원심분리하여 공극수를 분리해내는 방법 등으로 나눌 수 있다.

3.1  원심분리추출법

3.1.1  시험원리

공극수를 포함한 퇴적물을 원심분리함으로써, 공극수와 퇴적물 입자를 분리시키는 방법이다. 이 방법은 공기와의 접촉을 최소화할 수 있으며, 시험방법이 비교적 쉽다는 장점이 있는 반면, 추출하여 얻을 수 있는 공극수의 부피에 제한이 있는 단점이 있다.

3.1.2  기구 및 기기

3.1.2.1  원심분리기: 250 mL 혹은 500 mL 원심분리용 병을 원심분리할 수 있는 로터가 달린 기기로 2,000 g (중력단위) 이상의 원심력을 낼 수 있는 것으로 한다.

3.1.2.2  250 mL PPCO(polypropylene copolymer) 재질의 원심분리병

3.1.2.3  여과장치: 직경 47 mm의 멤브레인 여과지를 사용하여 여과할 수 있는 여과장치로 여과수기(sample receiver)가 250 mL 이상인 것으로 한다.

이상의 시험 용기는 모두 제4장 항목별 시험방법 제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.2항과 같이 세척하여 사용한다.

3.1.3  시료의 보관 및 전처리

공극수 시료의 경우, 금속원소 측정을 위한 시료는 시료 10 mL당 질산을 10 μL 더해 pH 2로 산성화하여 보관하고, 그 밖의 용존성분 분석을 위한 시료는 장기간 보관할 경우 냉동한다.

3.1.4  시험방법

3.1.4.1  질소로 충진된 장갑상자 안에서 퇴적물 주상시료로부터 공극수 추출을 위한 부시료를 채취하여 250 mL 용량 PPCO 재질의 병에 넣는다.

3.1.4.2  원심분리병을 장갑상자에서 꺼낸 후 바로 원심분리한다. 원심분리는 1500 g (중력단위) 이상의 원심력으로 하되, 10분 이상 원심분리하도록 한다.

3.1.4.3  원심분리가 끝난 후 상등액으로 분리된 공극수는 황화수소 분석을 위한 일정액의 시료를 먼저 분리하여 채취한 후, 나머지를 직경 47 mm, 여과 공극 0.45 μm인 멤브레인 재질 여과지에 여과한다. 단, 여과지는 미리 산으로 세척하여 건조된 상태로 준비되어야 한다.

3.2  기체압력 추출법

3.2.1  실험원리

퇴적물 내 공극에 있는 공극수를 질소 기체압력으로 밀어냄으로써 퇴적물로부터 공극수를 분리하는 방법으로, 공극수를 추출하는 용기가 클 때는 공극수를 원하는 양만큼 추출할 수 있는 장점이 있는 반면, 이 장치나 실험 방법 원심분리법에 비해 복잡하고 불편한 단점이 있다.

3.2.2  기구 및 기기

3.2.2.1  질소 가스: 순도 99.999% 이상의 가스를 사용한다.

3.2.2.2  질소 압력조정기

3.2.2.3  공극수 추출용기: 추출용기는 압력에 견딜 수 있도록 두께 5 mm 이상, 직경 5 cm 이상의 PVC 혹은 그에 상응하는 재질로 다음(그림 6)과 같이 만들어야 한다.

┌─┐

│  │

└─┘

그림 6. 공극수 추출 용기

3.2.2.4  여과장치: 3.1.2.3항과 같은 기구를 사용한다.

3.2.3  시료 전처리 및 보관

위 3.1항 원심분리추출법의 3.1.3항과 동일한 방법으로 처리, 보관한다.

3.2.4  실험방법

3.2.4.1  원심분리추출법 3.1.4.1항과 같은 방법으로 추출용기에 시료를 담는다.

3.2.4.2  추출용기를 장갑상자에서 꺼내 질소를 불어넣을 수 있도록 기체관을 연결하고, 단단하게 조인다.

3.2.4.3  추출용기 아랫부분에 여과된 공극수를 받을 수 있도록 준비된 250 mL 용량의 고밀도 폴리에틸렌병을 둔다.

3.2.4.4  서서히 기체의 압력을 올리며 공극수를 추출한다. 이때, 기체의 압력을 갑자기 세게 올리거나 지나치게 높이 올리면, 여과지가 찢어지므로 주의한다.

3.2.4.5  원하는 양의 공극수가 추출되었으면, 기체 압력을 0으로 줄이고 용기 안의 기체가 모두 나올 때까지 기다린다.

3.2.4.6  추출된 공극수는 3.1.4.3항과 같은 방법으로 여과한다.

4. 해저퇴적물 시료의 운반 및 보관 방법

4.1  시료의 운반 및 보관용기

시료용기는 퇴적물 시료를 오탁시킬 가능성이나, 퇴적물의 물리적 또는 화학적 특성을 변화시킬 가능성이 없는 것으로 선정한다. 동일한 유형의 용기는 동일한 항목 분석용 시료들에 대해 사용한다. 모든 시료의 포장은 불안정한 화합물의 증발과 기체 또는 물의 누출을 막기 위해 밀봉한다. 용기는 이동과 보관에 적합하다. 일반적으로, 금속원소를 분석하기 위한 시료들은 금속과의 접촉을 피하고, 유기화합물에 분석될 시료들은 플라스틱과의 접촉을 피한다.

4.1.1  입도분석용 시료 보관용기

입도분석용 시료용기는 고밀도 플라스틱 봉지나 폴리에텔렌병 등 시료의 누출을 방지할 수 있는 용기를 사용한다.

4.1.2  금속과 유기탄소용 시료용기

광구의 고밀도 플라스틱 봉지 또는 병(폴리에틸렌)이 전체퇴적물의 보관에 적당하다. 금속원소 분석용 시료들은 PVC, 나일론, 나트륨 또는 경질유리, 또는 스테인레스 강철을 포함하여 금속물질과 접촉되지 말아야 한다.

4.1.3  유기화학물질 시료 보관용기

알루미늄 박막-내피가 있는 뚜껑을 가진 황색 유리나 스테인레스 강철용기는 유기 화학물질의 보관에 적합하다. 황색 유리는 빛에 노출되면 분해되는 방향족 화합물의 분해를 피하는데 적합하다. 투명한 유리는 빛을 차단하고, 우발적인 파손을 감소하기 위하여 암실에 보관하거나, 알루미늄 박막 등으로 감싸둘 수 있다. 테프론 또는 테프론-내피 용기는 관심 오염물의 유형에 상관없이 모든 시료채취 계획에서 퇴적물 저장에 추천된다.

4.2   시료 보관 및 취급방법

4.2.1  적합한 개인보호장비(장갑, 보안경 등)는 시료에 노출되거나 오염을 막기 위해  항상 착용한다.

4.2.2  퇴적물은 위험한 물질, 박테리아 혹은 바이러스 병원체의 혼합물을 포함할 수 있으므로 피부 접촉은 가능한 한 피해야 한다.

4.2.3  시료의 취급은 환기가 잘되는 장소에서 수행되어야 한다.

4.2.4  시료 취급을 위한 장소는 깨끗하고, 오염물질을 흡수하지 않아야 한다.

4.2.5  시료의 취급은 최소한도로 하고, 퇴적물의 지화학적, 생화학적 과정에 영향을 줄 수 있는 온도와 산소 상태의 변화를 막기 위해 시료 취급을 가능한 한 빨리 수행해야 한다.

4.2.6  일반적으로, 시료채취기로부터 오염을 최소화하기 위해 시료를 취할 때 시료채취기의 측면과 접촉은 피한다 (이것은 강철이나 철 재질의 금속원소 분석시 중요하다. 또한, 페인트칠을 한 시료 채취기는 역시 페인트 조각으로 인해 시료를 오염시킨다).

4.2.7  선박의 갑판 오염으로부터 시료를 보호한다 (선박의 배출 가스, 윈치의 그리스).

4.2.8  시료는 채취즉시 시료 채취일, 정점명 등 시료의 정보가 기록된 용기에 공간이 최소한으로 남게 옮겨야 한다. 만일, 시료를 냉동시켜야 한다면 부피가 확장될 수 있는 만큼의 대기공간만 허용되어야 한다.

4.2.9  휘발성 물질을 분석하고자 한다면, 시료 용기에 빈 공간이 남지 않게 가득 채워져야 한다. 이러한 시료들은 냉동하면 용기가 깨질 수 있다.

4.2.10  현장에서 시료의 일시저장은 선박 위의 냉동고에 보관하는 것이 원칙이나, 이런 시설이 없는 소형 선박의 경우에는, 얼음 또는 얼음 팩을 사용하거나 가능하면 미리 준비한 dry-ice로 채운 단열용기(ice-box)를 이용한다.

4.2.11  채취된 주상시료는 똑바로 세워 손상되지 않게 유지한다.

4.2.12  새로운 정점에 도착하기 전에 전 채취과정에서 발생한 물질을 모두 해수를 이용하여 깨끗하게 제거한다.

4.3  시료의 보관

시료를 보관하는 동안 시료의 물리, 화학, 생물학적 정보가 변화하지 않도록 해야한다. 특히, 화학분석을 위한 시료는 ?20 °C에서 냉동시킨다. 냉동시설이 없는 경우라도, 미리 준비한 드라이아이스를 사용하여 실험실로 운반하는 동안의 변화를 최소화한다. 공극수 내 영양염, 특히 암모니아는 실험실 도착 즉시 분석해야 하며 냉동 보관한 시료라 할지라도 2주일 이내에 분석해야 한다.

5. 해저퇴적물 시료의 전처리 방법

5.1  전처리 종류 및 방법

분석 원소의 손실이나 오염 없이 시료를 전처리하는 기술은 분석기기를 작동시키는 기술보다 훨씬 중요한 일로서 풍부한 경험이 있어야 하며, 고도의 기술이 필요하다.

아무리 성능이 우수한 정량기기를 이용하여 분석하더라도 시료의 전처리가 잘못되면 정확한 분석 결과를 얻을 수 없으며 정밀성조차 기대할 수 없다.

5.2  시료의 전처리 과정

5.2.1  시료의 예비분해 실험

5.2.1.1  시료를 AAS나 ICP로 정량분석하기 위해서는 분해시켜 투명용액으로 만들어야 한다. 퇴적물의 종류나 특성을 충분히 알고 있는 경우에는 일반적인 시료의 분해 방법을 따른다. 그러나, 미지의 시료인 경우 예비실험이 반드시 필요하다. 특히, 시료량이 극소량이면서 특성을 알 수 없는 경우 반드시 수행해야 한다. 예비실험은 시료의 일부분을 떼어내어 예비적으로 분해 실험을 해 보는 것이다. 장점은 실수를 예방할 수 있고, 분석 시간을 단축시킬 수 있으며, 시약을 절약할 수 있어서 오염 및 손실을 최소화할 수 있다. 따라서, 정량분석 결과는 높은 정확도와 정밀도를 얻을 수 있다.

5.2.1.2  예비실험 순서: 시료가 무기물이라고 판단되는 때에는 물에 용해시켜 보기도 하고, 단일 산으로도 처리해 본다. 혼합산도 사용하고 불산도 사용해 본다. 이와 같은 산 처리로도 분해가 되지 않으면 수산화나트륨 용액과 같은 알칼리 용액으로도 분해를 시도한다. 그래도 분해되지 않으면 산성 융제나 알칼리성 융제를 가하고 700 °C 이상의 전기로나 불꽃에서 가열하여 용융을 시도한다. 대부분의 무기물은 위의 네 가지 방법에 의하여 용해된다.

5.2.2  습식분해법 (wet digestion method)

5.2.2.1  시료가 물에 녹지 않는 경우 산을 이용하여 용해시킨다. 시료의 종류에 따라 분석 성분이나 정량 방법 등에 따라 적당한 산류를 선택한다.

5.2.2.2  전처리에 사용되는 산은 염산, 질산, 불산, 황산, 과염소산 등이 있는데 염산과 질산이 가장 많이 사용된다.

5.2.2.3  산에 의한 분해방법은 가장 흔하게 사용되고 있다. 이 방법은 다양한 시약이 싼 가격에 상품화되어 있어 다량의 시료를 동시에 처리할 수 있고, 반응과정을 쉽게 지켜볼 수 있는 것이 가장 큰 장점이다. 그러나 극미량의 중금속 분석에 사용되는 높은 순도의 산 종류는 가격이 매우 비싸다.

5.2.2.4  습식분해시 주의사항: 질산과 과염소산의 강한 산화력 때문에 가끔 안전 문제를 유발한다. 또한, 불산도 피부에 접촉하는 경우 심한 화상을 수반하므로 주의해야만 한다.

5.2.3  가압 산분해법

5.2.3.1  이 방법은 Steel chamber 내의 테프론 용기에 시료와 산을 가하고 마개를 한 후 전기 오븐에 넣어 일정 온도로 가열하여 소량의 산으로도 고압하에서 전처리가 가능하다.

5.2.3.2  이 방법의 장점은 약 250 °C 정도에서 가열되지만 밀폐조건(closed system)이므로 산 증기의 증발이 없고, 시간 경과에 따라 산의 세기가 거의 감소하지 않으며, 용기 밖으로 산 증기가 유출되지도 않는다. 또한, 휘발성 원소의 손실이 없으며 외부로부터의 오염도 없다. 전기 오븐 속에 들어 있으므로 가까이서 지켜볼 필요도 없고 용기 내부가 테프론 재질이므로 미량금속들이 용출되지 않는 장점이 있다.

5.2.3.3  단점은 시료의 양이 제한되어 있으며(유기물 0.1 ∼ 0.2 g, 무기물 0.5 ∼ 1 g), 시료를 분해하는 데 시간이 많이 걸린다. 일단 가열이 되면 압력이 걸리기 때문에 실온까지 완전히 식혀야만 용기를 열 수 있다. 또한, 값이 다소 비싸다.

5.2.3.4  그러나 이 방법은 다른 방법에 비해 고압에서 이용할 수 있으므로 대기압하에서 처리하기 어려운 시료의 전처리에 적합하다. 특히, AAS나 ICP용 시료의 전처리 방법으로는 매우 적합하므로 권장한다.

5.3  시료분해 과정의 주의사항

5.3.1  해저퇴적물 시료분해시 주의사항

시료분해방법은 다음과 같은 주의사항을 따라야 한다.

5.3.1.1  가능한 소량의 산류를 사용하는 것이 좋다. 아무리 고도로 정제된 산이라 해도 불순물이 축적되어 분석 결과의 정확도에 영향을 주게 된다. 따라서 공시험값이 상승하는 단점이 있다. 산 사용량을 최소화하기 위해 가장 효과적인 방법은 서두르지 말고, 시료가 산류와 반응할 시간을 충분히 주는 것이다. 시료에 산을 가하고, 즉시 가열하지 말고, 반응을 지켜보다가, 반응이 중지할 때마다 가열해 주는 것이다. 유기물 함량이 풍부한 시료의 경우 질산 투입 초기에 반응이 격렬하게 일어나기 때문에 가열해 줄 필요가 거의 없다.

5.3.1.2  산 처리시 분석대상 항목이 침전되거나 휘산되지 않도록 해야 하며 잔류물이 남아서는 안된다. 모든 방법을 동원해 시료를 분해 시켜야 하지만 분석대상 항목의 손실이나 오염을 최소로 해야 한다.

5.3.1.3  시료의 특성으로 인해 첨가한 산류와 반응하여 휘발성 물질로 증발이 일어나는 경우도 있다. 이와 같이 시료의 전처리에는 예상하지 못한 오염이나 손실이 발생하여 정확도와 정밀도에 악영향을 줄 수 있다.

5.3.1.4  목적 성분의 특성에 따라 전처리 방법을 달리해야만 한다. 한 개의 시료를 한 가지의 방법으로 전처리하여 모든 성분을 분석할 경우에는 시간과 시약이 많이 소모된다. 예를 들면, 규산질을 포함하는 시료에서 Pb와 K 및 Si, Na, Ca, Mg, Al, Ti 등을 분석하고자 하는 경우 Pb와 Ca을 분석하기 위해서는 불산-염소산 처리를 하는 것이 가장 좋고 K와 Na, Mg, Al, Ti 등을 분석하기 위해서는 불산 - 황산 처리를 하는 것이 가장 좋으며 Si를 분석하기 위해서 탄산나트륨-탄산칼륨 용융 후 분석하는 것이 가장 좋다. 원소마다 전처리 방법을 달리해야만 하는 경우도 있으므로 소량의 시료인 경우 충분한 사전연구가 필요하다.

5.3.1.5  시료는 시약과 격렬한 반응이 일어나면, 큰 피해를 볼 수 있으므로 예비분해 실험이 반드시 필요하다. 시료에 대한 사전 지식은 분석결과의 정확도와 정밀도 뿐 아니라 실험자의 안전을 위해 반드시 필요하다.

제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법

제1항 분석자료의 기초통계

기본적인 통계처리와 의미는 해수공정시험기준 제3장 분석자료의 통계처리와 표현 방법 제1항 분석자료의 기초통계에 따른다.

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)

시험절차와 결과에 대한 정도보증을 위해 해수공정시험기준 제3장 분석자료의 통계처리와 표현 방법 제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)의 내용을 준용한다.

제4장 항목별 시험방법

제1항 입도(Gravel, Sand, Silt & Clay Percent)

1. 측정원리

입자의 크기는 길이로 표시되는 척도이다. 일반적으로 입자 크기는 입자가 통과할 수 있는 가장 작은 체의 눈금으로 표시하거나, 입자의 침강속도와 같은 침강속도를 갖는 구의 지름, 혹은 입자의 장축으로 나타낼 수 있다. 그러므로, 입자의 크기를 직접 측정할 수 없는 세립한 입자의 경우, 입자들을 일정한 크기별로 분리하여 질량을 측정한 다음 각 크기별 퇴적물 입자의 분포 비율을 이용하여 입자의 크기를 구하는 방법이 해저퇴적물 입자 크기를 구하는 기본적인 방법이다. 입자 크기를 측정하는 원리는 입자의 크기에 따라 다르다. 입자의 크기는 자갈과 모래, 그리고 뻘로 크게 나눌 수 있다. 이를 나누는 방법은 표 1과 같다.

자갈 이상의 크기를 가지는 퇴적물 입자는 버어니어 캘리퍼스를 이용하여 그 장축과 단축을 측정하며, 모래 크기의 입자는 건식 체질로, 그리고 모래와 뻘은 습식 체질로 분리한다. 건식체질법은 입자가 통과하는 가장 작은 체의 간격을 입자의 크기로 하여, 각 체의 간격에 따른 입자들의 무게를 측정하여 무게 비율로 입자의 평균 입도를 계산한다. 피펫팅법은 입자의 침강속도가 입자 크기에 비례한다는 이론(Stock 법칙)에 근거하여 퇴적물 입자를 측정하는 간접방법이다. 이 방법은 매질의 밀도, 입자의 비중, 입자의 크기에 따라 계산된 입자의 침강속도에 의해 일정한 시간에 시료의 일부분을 계속 뽑아낸 다음, 입자의 무게를 측정하여 역시 무게 비율로 평균 입도를 계산한다.

대부분의 시료에서는 모래와 뻘이 혼합되어 있다. 따라서, 건식 체질과 습식 체질을 한 시료에 대해 동시에 실시해야 하는 경우가 대부분이며 이때, 입자크기 측정방법의 순서는 다음과 같다.

                         ?? 자갈 - 장축을 측정

                   시료 전처리 ???? 습식체질 ???????? 모래 - 건식체질

                         ?? 뻘 - 피펫팅 혹은 기기로 측정

하지만, 시료에 자갈만 있을 경우는 시료 전처리와 습식 체질이 필요 없고, 모래만 있을 경우는 시료 전처리는 해야 하지만 습식 체질이 필요없다.

표 1. 퇴적물 입도 등급

┌─────────────────┬──────┬──┬───────────────────────────────────────────────┐

│입자구분 (Size class)             │입자직경    │메쉬│파이(φ) 파이는 -log2(입자직경)과 같이 구한다. 메쉬는 길이 1인치에 들어가는 눈의 수를 말한다. │

│                                  │            │    │                                                                                              │

├───────┬─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│자갈          │거 력             │256 mm이상  │    │-8                                                                                            │

│(GRAVEL)      │(boulder)         │            │    │                                                                                              │

│              ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│              │왕자갈            │64 mm이상   │    │-6                                                                                            │

│              │(cobble)          │            │    │                                                                                              │

│              ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│              │자 갈             │4 mm이상    │5   │-2                                                                                            │

│              │(pebble)          │            │    │                                                                                              │

│              ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│              │왕모래            │2 mm이상    │10  │-1                                                                                            │

│              │(granule)         │            │    │                                                                                              │

├───────┼─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│모래          │극조립사          │1 mm이상    │18  │0                                                                                             │

│(SAND)        │(very coarse sand)│            │    │                                                                                              │

│              ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│              │조립사            │1/2 mm이상  │35  │1                                                                                             │

│              │(coarse sand)     │(0.5 mm)    │    │                                                                                              │

│              ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│              │중립사            │1/4 mm이상  │60  │2                                                                                             │

│              │(medium sand)     │(0.25 mm)   │    │                                                                                              │

│              ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│              │세립사            │1/8 mm이상  │120 │3                                                                                             │

│              │(fine sand)       │(0.125 mm)  │    │                                                                                              │

│              ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│              │극세립사          │1/16 mm이상 │230 │4                                                                                             │

│              │(very fine sand)  │(0.063 mm)  │    │                                                                                              │

├───┬───┼─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│펄    │실트  │극조립실트        │1/32 mm이상 │    │5                                                                                             │

│(MUD) │(SILT)│(very coarse silt)│(0.031 mm)  │    │                                                                                              │

│      │      ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│      │      │조립실트          │1/64 mm이상 │    │6                                                                                             │

│      │      │(coarse silt)     │(0.016 mm)  │    │                                                                                              │

│      │      ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│      │      │중립실트          │1/128 mm이상│    │7                                                                                             │

│      │      │(medium silt)     │(0.008 mm)  │    │                                                                                              │

│      │      ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│      │      │세립실트          │1/256 mm이상│    │8                                                                                             │

│      │      │(fine silt)       │(0.004 mm)  │    │                                                                                              │

│      ├───┼─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│      │점토  │극세립실트        │1/512 mm이상│    │9                                                                                             │

│      │(CLAY)│(very fine silt)  │(0.002 mm)  │    │                                                                                              │

│      │      ├─────────┼──────┼──┼───────────────────────────────────────────────┤

│      │      │점토(clay)        │1/512 mm이하│    │9 이하                                                                                        │

│      │      │                  │(0.002 mm)  │    │                                                                                              │

└───┴───┴─────────┴──────┴──┴───────────────────────────────────────────────┘

2. 측정범위 및 정밀도

이론적으로 입도분석 후 얻어지는 평균 입도와 분급도는 건식 체질법에서 사용하는 각기 다른 크기의 눈금을 가지는 체의 수와 피펫팅하는 횟수에 관련이 있다. 예를 들어, ?4 φ에서 4 φ까지의 체를 사용한다면 더욱 넓은 범위의 평균 입도를 계산할 수 있다. 그리고, 습식 체질법에서도 피펫팅하는 횟수를 7회 이상으로 늘린다면 더욱 넓은 범위의 자료를 포함하는 평균 입도가 계산될 수 있다. 하지만, 이와 같이 넓은 범위의 자료는 본 방법에서 제시하는 자료 분석법에서 계산되는 평균 입도와 분급도에 큰 영향을 미치지 않는다. 이 분석 방법의 표준편차율은 5 % 이하이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

솔을 이용하여 수돗물로 깨끗이 세척한 다음 증류수로 한 번 헹구어 사용한다.

3.1.1  1000 mL 매스실린더

3.1.2  50, 100, 500 mL 비이커

3.1.3  50 mL 홀피펫

3.1.4  50 mL 경질 유리의 삼각플라스크

3.2  증류수병: 폴리에틸렌 재질의 하얀색 증류수병을 사용한다.

3.3  가열판: 500 mL 비이커를 올려놓고 가열해야 하므로 넓을수록 좋으며, 50 ∼120 °C의 범위에서 온도 조절이 가능해야 한다. 

3.4  표준체 세트: 표준체는 1 φ 간격으로, 4 φ에서 ?2φ 까지 순서대로 구비되어 있는 체 세트를 사용한다. 체의 재질은 2 φ보다 큰 체는 스텐레스 재질, 3 φ와 4 φ는 나일론질로 만들어진 체를 사용한다. 체의 지름은 25.4 cm인 표준체를 사용한다.

3.5  깔때기: 지름이 25.4 cm로 표준체와 같은 크기의 것을 사용하고, PVC 재질로 만들어진 것을 사용한다. 깔때기의 높이는 30 cm를 넘지 않아야 한다.

3.6  건조기: 건조기 내의 온도가 60 ∼ 150 °C의 범위에서 온도조절이 가능해야 한다.

3.7  전자저울: 무게가 디지털로 표시되며, 0.001 g까지 측정 가능한 것을 사용한다.

3.8  젓개: 머리 부분이 고무로 되어 있으며, 자루는 PVC로 만든 것을 사용한다. 젓개의 모양은 다음 그림 1과 같다.

3.9  진탕기

그림 1. 입도 분석용 젓개

4. 시약 및 표준물질

4.1  과산화수소수 (H2O2)

4.2  2 % 칼곤용액 : 인산나트륨(NaPO3)6 20 g을 500 mL 유리 비이커에 넣고 증류수 300 mL을 붓는다. 가열판 위에서 인산나트륨이 다 녹을 때까지 90 ° C로 가열하며 이때, 용액이 끓어 넘치지 않도록 주의한다. 인산나트륨이 다 녹으면 방냉하여 식히고, 실온으로 식으면 1000 mL 용량 플라스크에 넣어 증류수로 표선까지 채워 만든다.

5. 시료의 채취 및 보관

현장에서 채취한 시료는 별다른 전처리가 필요없다. 그리고 되도록 빨리 실험실로 옮겨 분석한다. 하지만, 보관기간이 길어질 경우 냉장보관한다.

6. 시험방법

6.1  시료처리 방법

6.1.1  채취한 시료를 젖은 상태 그대로 약 20 ∼ 30 g을 취하여 500 mL 비이커에 담는다.

6.1.2  시료를 담은 후 유기물을 분해하여 입자가 분산되도록 과산화수소 약간을 가한다. 이때, 과산화수소수를 가하면 유기물이 분해되며 흰 연기와 거품이 난다. 유기물이 많을수록 거품이 많이 나는데, 거품이 비이커를 넘지 않도록 과산화수소를 천천히, 그리고 조금씩 넣어준다.

6.1.3  유기물 분해 반응이 완전히 끝나 시료에서 거품이 올라오지 않을 때까지 반응을 시킨다. 실온에서 유기물 분해 반응이 완전히 끝나면, 과산화수소를 가해도 더이상 반응이 일어나지 않는다.

6.1.4  실온에서의 반응이 끝나면, 가열판 위에서 시료가 끓지 않을 정도인 90 °C로 가열한다. 반응이 더이상 일어나지 않을 때까지 가열하며, 이때 거품이 가열판을 넘지 않도록 해야하고, 시료가 가열되어 마르지 않도록 주의해야 한다.

6.1.5  반응이 끝나면 가열판에서 내려놓고 방냉한다. 실온으로 식은 후 상등액을 주의해서 따라버리고, 증류수로 다시 채운다. 상등액을 따라낼 때 퇴적물이 부유되어 흘러나가지 않도록 조심해야 한다.

6.1.6  증류수를 채워 시료를 가라앉힌 후 상등액을 따라내는 과정을 3회 반복한다. 상등액을 따라낼 때 퇴적물이 부유되어 흘러나가지 않도록 조심해야 한다.

6.2  습식체질법: 모래만 있는 경우 습식체질법을 생략한다.

6.2.1  표준체를 깔때기 위에 끼우고 이를 매스실린더 위에 걸쳐 놓는다.

6.2.2  시료전처리가 끝난 시료를 500 mL 비이커로부터 표준체 위로 조심해서 붓는다. 이때, 비이커의 벽면에 붙어 있는 입자를 증류수와 붓으로 모두 씻어 내어 표준체 위로 부어야 한다.

6.2.3  붓과 증류수를 이용하여 체에 손상이 가지 않도록 조심하며 체질한다. 체질할 때는 증류수를 증류수병으로 살살 뿌리면서 붓을 대각선 방향으로 움직이며 부드럽게 표준체 표면에 문지른다. 체질하면서 큰 입자나 패각에 의해 표준체가 찢어지는 일이 없도록 해야한다.

6.2.4  체질을 하면서 깔때기 밑으로 나오는 용액의 혼탁도를 관찰하여, 더이상 혼탁액이 나오지 않을 정도까지 체질한다. 체질하고 난 후의 부피가 950 mL을 넘지 않도록 해야한다.

6.2.5  체질이 끝나면 표준체와 깔때기를 분리하고 깔때기에 묻은 입자를 실린더로 씻어 내린다.

6.2.6  표준체에 남아있는 4 φ (0.062 mm)보다 큰 입자는 표준체를 500 mL 유리비이커에 대고 증류수병으로 위에서 아래로 씻어내리면서 옮겨 담는다. 이때, 비이커 밖으로 시료가 나가지 않도록 한다.

6.2.7  500 mL 비이커에 담긴 4 φ (0.062 mm)보다 큰 입자(모래)는 아래 6.3항의 분석방법을 따른다.

6.2.8  1,000 mL 매스실린더에 담긴 시료는 6.4항의 분석방법을 따른다.

6.3  건식체질법

6.3.1  우선 500 mL 비이커에 넣어 건조기에 넣고, 잘 말려 아래와 같이 체질을 한다.

6.3.2  체의 간격은 1 φ로 -2 φ ～ 4 φ까지 모두 7개이다. 체를 끼울 때에는 위에서부터 아래로 표준체의 눈금 간격이 작아지도록 차례로 끼운다. 진탕기에 체를 끼운 다음 10분간 체질한다.

6.3.3  체질이 끝나면 표준체를 각각 분리한다. 체를 분리할 때 체 위에 걸린 시료가 체 밖으로 나가지 않도록 주의한다.

6.3.4  표준체에 담긴 시료는 표준체보다 넓은 정사각형의 종이(30 × 30 cm 이상)를 깔고 그 위에 체를 비운다. 체를 잘 비우기 위해 체의 가장자리를 손바닥으로 두들기거나 솔로 체눈에 솔질을 한다. 체를 비운 후 종이에 체의 눈금 크기를 표시한다.

6.3.5  각 종이에 모은 시료의 무게를 0.01 g까지 잰다.

6.3.6  시료의 무게는 체눈금 크기별로 입도분석지(별지 서식2)에 잘 기록한다.

6.4  피펫팅방법: 4 φ 체를 통과하여 1,000 mL 실린더에 담긴 시료(뻘시료)는 다음과 같이 처리한다.

6.4.1  우선 담긴 시료의 부피를 증류수로 950 mL까지 정확히 맞춘다.

6.4.2  2 % 칼곤 용액을 100 mL 매스실린더에 조심스럽게 부어 1,000 mL로 맞춘다.

6.4.3  실린더 안의 시료를 잘 저어준다. 이때, 젓개를 사용하여 위ㆍ 아래로 잘 섞어야 한다. 너무 세게 저어 시료가 밖으로 튀어나가지 않도록 한다.

6.4.4  저은 후 24시간 실온에서 방치한다.

6.4.5  50 mL 홀피펫을 준비한다. 아울러 한 시료당 7개의 100 mL 비이커를 준비해 미리 무게를 측정해 놓는다. 비이커 무게는 0.001 g까지 측정한다.

6.4.6  실린더 내 시료의 응결이나 침전이 없음을 확인한 다음, 젓개를 사용하여 1분간 잘 젓고, 50 mL 홀피펫을 사용하여 다음(표 2)에서 제시된 시간과 깊이에서 50 mL씩 빨아올린 다음 미리 무게를 측정한 100 mL 유리비이커에 담는다.

표 2. 피펫팅 시간 및 홀피펫 깊이

┌──┬───┬───┬───┬───┬────┬─────┬───┐

│횟수│1회   │2회   │3회   │4회   │5회     │6회       │7회   │

│    │      │      │      │      │        │          │      │

│구분│      │      │      │      │        │          │      │

├──┼───┼───┼───┼───┼────┼─────┼───┤

│시간│0 초  │2 분  │8 분  │32 분 │2시간8분│5시간 58분│24시간│

├──┼───┼───┼───┼───┼────┼─────┼───┤

│φ  │4∼5  │5∼6  │6∼7  │7∼8  │8∼9    │9∼10     │10∼11│

├──┼───┼───┼───┼───┼────┼─────┼───┤

│깊이│25 ㎝ │10 ㎝ │10 ㎝ │10 ㎝ │10 ㎝   │7 ㎝      │7 ㎝  │

└──┴───┴───┴───┴───┴────┴─────┴───┘

6.4.7  피펫팅이 모두 끝나면 비이커를 건조기에 넣어 잘 말린다.

6.4.8  잘 말린 후 무게를 측정한다. 무게는 0.001 g까지 측정하며, 한 실린더당 7개의 비이커를 피펫팅한 순서에 따라 비이커 무게를 측정하여 잘 기록해야 한다.

6.4.9  측정한 무게는 입도분석지에 잘 기록한다.

6.5  자료분석방법: 4 φ 체에 걸린 사질 시료를 체질하여 무게를 측정한 자료와 피펫팅 한 후 100 mL 비이커의 무게를 측정한 자료를 다음에 제시된 표에 적은 다음 각 입자의 크기별 무게를 계산한다.

6.5.1  건식체질한 자료와 피펫팅한 자료로 입도분석지를 작성한다. 입도분석지(별지 제2호서식)에 기록방법이 제시되어 있다.

6.5.2  첨부된 입도분석그래프에 가로축은 각 입자의 크기, 세로축은 입도분석지에서 계산된 누적비율로 점을 찍고, 각 점을 부드러운 곡선으로 연결한다. 10 φ보다 작은 입자크기는 14 φ까지 직선으로 연장하여 직선을 그린다.

6.5.3  곡선을 완성한 후 각각 5, 16, 25, 50, 75, 84, 95 퍼센타일에 해당하는 입자의 크기를 그래프에서 읽어 기록한다. 각 퍼센타일에 해당하는 입자의 크기를 이용하여 평균입도와 분급도를 다음과 같이 구한다.

                      (식 1)

                   (식 2)

(φ5, φ16, φ50, φ84, φ95: 각 퍼센타일에 해당하는 입자의 크기)

[별지 제2호서식]

입 도 분 석 지

시료번호:                  실린더번호:             

500 mL 비이커번호:                    

┌───┐                                            ┌────┬──┬──┐

│입자  │                                            │시료    │무게│누적│

│크기  │                                            │무게    │비율│비율│

│      │                                            │⑥      │⑦  │⑧  │

├───┤                                            ├────┼──┼──┤

│-2    │                                            │a       │    │    │

├───┤                                            ├────┼──┼──┤

│-1    │                                            │b       │    │    │

├───┤                                            ├────┼──┼──┤

│0     │                                            │c       │    │    │

├───┤                                            ├────┼──┼──┤

│1     │                                            │d       │    │    │

├───┤                                            ├────┼──┼──┤

│2     │                                            │e       │    │    │

├───┤                                            ├────┼──┼──┤

│3     │                                            │f       │    │    │

├───┤                                            ├────┼──┼──┤

│4     │                                            │g       │    │    │

├───┼───┬───┬──────┬──┬────┼────┼──┼──┤

│      │비이커│비이커│비이커+시료 │시료│시료무게│크기별  │    │    │

│      │번호  │무게  │무게        │무게│× 20   │무게    │    │    │

│      │①    │      │            │②  │③      │④      │    │    │

├───┼───┼───┼──────┼──┼────┼────┼──┼──┤

│5(1회)│      │      │            │    │h       │h-i     │    │    │

├───┼───┼───┼──────┼──┼────┼────┼──┼──┤

│6(2회)│      │      │            │    │i       │i-j     │    │    │

├───┼───┼───┼──────┼──┼────┼────┼──┼──┤

│7(3회)│      │      │            │    │j       │j-k     │    │    │

├───┼───┼───┼──────┼──┼────┼────┼──┼──┤

│8(4회)│      │      │            │    │k       │k-l     │    │    │

├───┼───┼───┼──────┼──┼────┼────┼──┼──┤

│9(5회)│      │      │            │    │l       │l-m     │    │    │

├───┼───┼───┼──────┼──┼────┼────┼──┼──┤

│10(6회│      │      │            │    │m       │m-n     │    │    │

│)     │      │      │            │    │        │        │    │    │

├───┼───┼───┼──────┼──┼────┼────┼──┼──┤

│11(7회│      │      │            │    │n       │n-1 ⑤  │    │    │

│)     │      │      │            │    │        │        │    │    │

└───┴───┴───┴──────┴──┴────┴────┴──┴──┘

   33674-00611일                  210㎜ x 297㎜

   '98. 1. 22 승인                      일반용지 60g/㎥(재활용품)

입도분석지 기록방법

① 사용되는 100 mL 유리 비이커는 실린더의 순서와, 피펫팅하는 순서에 따라 잘 기록해야 한다.

② 시료무게는 (비이커 + 시료무게) - (비이커의 무게)의 식으로 구한다.

③ 1,000 mL의 시료에서 50 mL만 뽑아냈으므로 20을 곱한다.

④ 중력에 의해 무거운 입자가 먼저 떨어지므로, 각 피펫팅 횟수에 따라 가라앉은 입자들의 무게를 빼주기 위해 1회 피펫팅 시료에서 2회 피펫팅 시료를 빼고, 2회에서 3회 시료를 빼는 식으로 계산한다.

⑤ 2 % 칼곤용액이 들어가므로 50 mL 중의 2 %에 해당하는 1 g을 빼준다.

⑥ 건식체질에 의해 얻은 자료를 크기별로 기록한다.

⑦ 각 입자크기의 무게를 모두 더한 다음 각 크기의 입자무게에서 총 무게를 나누어 계산한다.

()                     (식 3)

⑧ 누적비율은 무게비율을 점차 더해가며 계산한다. 따라서, 맨 마지막의 누적 비율은 100이 된다.

입도분석 그래프

┌┐

││

└┘

                                                     입자직경 (ψ)

제2항 함수율(Water Content)

1. 측정원리

해저퇴적물은 항상 해수와 접촉하고 있으므로 퇴적물을 구성하는 입자 사이의 빈 공간, 즉 공극은 해수로 채워져 있다. 따라서, 퇴적물 내에 포함된 해수의 비율인 함수율(water content)은 퇴적물의 공극률과 함수관계를 가진다. 함수율의 측정은 해저퇴적물의 건조 전 무게와 건조 후 무게 차이에 의해 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

함수율의 측정범위 및 정밀도는 사용하는 저울의 성능과 퇴적물이 완전 건조되었는지에 따라 달라진다.

3. 기구 및 기기

3.1  전자저울: 눈금이 디지털로 표시되며, 0.001 g에서 300 g까지 무게를 측정할 수 있는 것으로 사용한다.

3.2  건조용 광구병(wide mouth bottle): 125 mL PMP(poly-methyl-pentane) 재질의 입구가 넓은 병을 사용한다. 사용 전에는 이물질이 남아 있지 않도록 깨끗이 씻은 후 잘 건조시켜 사용한다. 건조기를 사용하여 건조시킬 때 퇴적물 건조 온도인 110 °C에서 항량으로 될 때까지 건조한다. 건조 후 병의 무게를 측정할 때는 반드시 실온으로 식힌 후에 측정하도록 한다.

3.3  건조기(oven): 150 °C까지 가열할 수 있는 것으로 온도조절이 가능한 것으로 한다.

4. 시험방법

4.1  125 mL 건조병을 3.2항과 같은 방법으로 준비하여 무게를 정확히 측정한다. 무게는 0.001 g까지 측정한다.

4.2  현장에서 시료병에 시료를 약 20 ∼ 30 g 담는다. 시료를 담은 후 뚜껑을 꼭 닫아 시료의 운반과 이동 도중 수분이 증발하지 않도록 한다.

4.3  실험실로 옮긴 후 병 주위에 묻어 있는 이물질을 깨끗이 제거한다. 병 주위에 수분이 묻으면 완전히 닦아내도록 한다.

4.4  시료가 들어 있는 병의 무게를 0.001 g까지 측정한다.

4.5  시료가 담긴 병을 건조기 안에 넣고 110 °C의 온도로 24시간 동안 건조시킨다.

4.6  1차 건조가 끝나면 무게를 측정하고 다시 12시간 이상 건조시킨 후 항량으로 될 때까지 건조하여 무게를 측정한다.

4.7  항량 건조 후의 무게를 ‘건조 후 무게’로 하여 함수율을 다음과 같이 구한다.

┌───────────────────────────┐

│  (식 1)                                              │

│(건조 전 시료 무게=건조 전 시료가 담긴 병 무게-병 무게│

│건조 후 시료 무게=건조 후 시료가 담긴 병 무게-병 무게)│

└───────────────────────────┘

제3항 강열감량(Ignition Loss)

1. 측정원리

퇴적물 중 유기물량을 측정하는데 있어서는 유기물질 중 가장 많은 양을 차지하며 비교적 그 측정이 간편한 탄소를 이용하는 것이 간편하면서도 정밀한 값을 얻을 수 있다. 퇴적물 중 탄소량을 측정하는 방법은 퇴적물을 고온으로 가열하여 무게 차이를 측정하는 방법, 강한 산화제를 이용하여 탄소화합물을 선택적으로 산화시켜 그 무게를 알아내는 방법, 특정 시약과 반응시킨 후 퇴적물로부터 나오는 이산화탄소를 측정하는 방법 등 여러 가지가 있다. 이 중 퇴적물을 고온으로 가열한 후 그 무게 차이를 알아내는 방법을 강열감량법이라 한다. 이 방법은 시험방법이 비교적 간편하며, 다양한 종류의 퇴적물에 대해 일반적으로 적용할 수 있는 장점이 있다. 반면, 광물격자 안의 수분과 약한 화합물들이 고온에서 없어져 오차를 유발하는 단점이 있다.

2. 측정범위 및 정밀도

강열감량법의 측정한계는 0.05 % 이며 시험의 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  전자저울: 눈금이 디지털로 표시되며, 0.001 g까지 무게를 측정할 수 있는 것으로 사용한다.

3.2  초자기구: 초자기구는 반드시 세제로 세척한 후, 증류수로 3회 이상 잘 씻어 사용한다.

3.3  자기도가니 (porcelain crucibles): 25 mL 용량의, 뚜껑을 닫을 수 있는 것으로 한다.

3.4  전기로(furnace): 600 °C까지 가열할 수 있는 것으로 한다.

3.5  건조기(oven): 150 °C까지 가열할 수 있는 것으로 한다.

3.6  동결건조기(freeze dryer): 시료를 영하 40 °C 이하에서 동결 건조시킬 수 있는 것으로 한다.

3.7  데시케이터

4. 시료의 채취 및 보관

젖은 시료 약 50 g을 플라스틱 숟가락으로 시료용기에서 덜어내 125 mL 광구 플라스틱병에 넣는다. 플라스틱병에 담긴 시료를 냉동고에서 완전히 얼린다. 냉동된 시료를 동결건조기에 넣고 완전히 건조시킨다. 건조된 시료는 막자사발을 사용하여 곱게 분마한 다음, 230 메쉬(0.063 mm) 크기의 체를 모두 통과시킨다. 이러한 과정으로 준비된 시료는 다시 플라스틱병에 보관한다. 단, 동결건조기가 준비되지 못한 경우 시료를 건조기(dry oven)에서 건조할 수 있으나 이 경우 건조기의 온도가 65 °C 이상 올라가지 않도록 주의해야 한다.

5. 시험방법

5.1  25 mL 도가니의 무게를 0.001 g까지 측정한다. 이 도가니를 건조기에서 110 °C로 말려 항량으로 될 때까지 건조한 후 시험에 사용한다.

5.2  시료 약 5 g의 무게를 정확히 측정하여 25 mL 도가니에 담는다. 시료가 담긴 도가니를 역시 110 °C에서 항량으로 될 때까지 건조한다.

5.3  전기로에 시료를 넣고, 550 °C의 온도로 2시간 동안 가열한다.

5.4  가열이 끝나면 전기로의 온도가 100 °C정도 내려간 후 전기로의 문을 열고, 도가니를 꺼낸다. 도가니는 데시케이터 안에서 실온으로 식힌다.

5.5  다 식으면 시료가 담긴 도가니의 무게를 측정한다. 실온으로 완전히 식지 않으면 무게를 측정하는 도중에 무게가 달라질 수 있다.

5.6  위의 결과를 이용하여 강열감량은 다음과 같이 구한다.

┌──────────────────────────────────┐

│     (식 1)                                                         │

│(가열 후 시료 무게 = 가열 후 시료가 담긴 도가니 무게 - 도가니 무게) │

└──────────────────────────────────┘

제4항 총 황(Total Sulfur)

1. 측정원리

해저퇴적물내 황은 공극수 중의 황산염, 황화수소, 황화물, 황산염 광물 및 유기황화물 등 아주 다양한 형태로 존재하고 있다. 이 중 해저퇴적물내 유기물 오염이 심해지면 퇴적물내 황화합물량이 증가하게 된다. 하지만, 증가하는 황화합물량을 선택적으로 측정하는 것은 어렵기때문에, 총 황량으로 황화물의 증가를 측정하는 원리를 이용한다. 총 황은 모든 형태의 황화합물을 강산으로 황산염으로 산화시킨 후, 황산염에 포함된 황량을 알아냄으로써 측정된다. 이는 황산염이 바륨과 화합물을 잘 만드는 성질을 이용하여, 황산염을 황산바륨으로 침전시킨 후 이 침전물의 무게를 측정하고, 이 중 포함된 황의 무게를 계산하여 총황량을 구하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

측정범위는 해저퇴적물내 포함된 황량에 따라 다르다. 하지만, 유기물 오염이 심하지 않은 해저퇴적물이라 하더라도 건시료당 약 0.1 ∼ 0.2 %의 황은 포함되어 있다. 그 이하의 총황화합물량도 정밀한 전자저울을 사용할 경우 측정이 가능하다. 유기물 오염이 심하여 황화합물량이 많은 경우도 측정이 가능하다. 이때, 정밀한 시험을 위해서는 여과지의 무게와 황산바륨 침전물의 무게를 정확히 측정할 수 있는 전자저울이 필요하다.

3. 기구 및 기기

3.1  전자저울: 눈금이 디지털로 표시되며, 0.001 g까지 무게를 측정할 수 있는 것으로 사용한다.

3.2  초자기구: 초자기구는 반드시 세제로 세척한 후, 증류수로 3회 이상 잘 씻어 사용한다.

3.2.1  100 mL 유리 비이커

3.2.2  지름이 10 ㎝인 시계접시(watch glass)

3.2.3  지름 25 mm의 여과지를 사용할 수 있는, 플라스틱 재질의 여과장치

3.2.4  지름 45 mm의 여과지를 사용할 수 있는, 경질 유리의 여과장치

3.2.5  25 mm 여과지를 보관할 수 있는 페트리접시(petri dish)

3.2.6  50 mL 매스실린더

3.2.7  100 mL 매스플라스크

3.3  열판: 온도조절이 가능하며, 150 °C까지 가열할 수 있어야 한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  질산

4.2  염산

4.3  왕수: 왕수는 염산 : 질산의 부피 비율이 3 : 1로 되도록 혼합하여 만든다. 왕수를 만들고 난 후 반드시 차광용기에 보관해야 한다.

4.4  5 % 염화바륨용액: 염화바륨(BaCl2) 5 g을 100 mL 매스플라스크에 넣고, 증류수 20 mL을 넣어 잘 흔들면서 완전히 녹인다. 다음 증류수로 표선까지 채워 100 mL이 되도록 만든다.

4.5  0.4 N 염산용액: 34.4 mL의 염산을 1,000 mL의 증류수로 희석한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제3항 강열감량 4. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  습시료 2 g의 무게를 정확히 측정하여 100 mL 비이커에 담는다.

6.2  비이커에 왕수 10 mL을 가한다.

6.3  비이커에 시계접시를 덮은 후, 시료가 왕수와 충분히 혼합되도록 잘 흔들어 주고, 열판 위에 올려 놓는다.

6.4  150 °C의 온도로 2시간 가열한다.

6.5  가열이 끝나면 시계접시를 열고 왕수를 날려 보낸다. 시료가 약간 젖어 있을 정도까지 시료를 말린다. 왕수를 날려 보내는 동안에 시료가 완전히 마르지 않도록 해야한다.

6.6  여기에 증류수 30 mL을 가한 후 시료가 증류수와 완전히 혼합되도록 잘 흔들며 섞는다.

6.7  지름 45 mm, 공경 1.2 μm인 유리섬유 여과지(GF/C)와 여과장치를 이용하여 저질시료와 용액을 여과분리한다. 여과가 끝난 후 저질시료를 증류수로 충분히 세척하여, 시료에 남아 있을지도 모를 황산염 이온을 모두 여과지에 통과시킨다.

6.8  여과가 끝난 용액은 다시 100 mL 유리 비이커에 담는다.

6.9  비이커에 5 % 염화바륨용액 5 mL을 가한 후 잘 흔들어 준다.

6.10 이때 흰색의 침전이 생기기 시작하는데, 완전히 침전물이 생기기 위해서는 20분을 기다려야 한다.

6.11 지름 25 mm, 공극이 0.45 μm인 멤브레인 여과지의 무게를 측정한다. 무게를 측정해 놓은 여과지에 침전이 생긴 용액을 여과하여, 흰색 황산바륨 침전을 따로 모은다. 여과하는 동안 여과장치 깔때기의 내벽과 침전물을 0.4 N 염산 10 mL로 세척하고, 다시 증류수 30 mL로 세척한다.

6.12  침전이 담긴 여과지를 조심스럽게 페트리접시에 옮기고, 가열건조기에서 60 °C의 온도로 1시간 정도 말린다. 건조가 끝난 후 침전물과 여과지의 무게를 측정한다. 여과지의 무게는 미리 측정하였으므로, 여과지 무게와 침전물이 있는 여과지의 무게 차이가 황산바륨의 무게가 된다.

6.13  위의 결과를 이용하여 총 황량은 다음과 같이 구한다.

┌─────────────────────────────┐

│                                                          │

│(* : 황의 원자량, ** : 황산바륨의 분자량)           (식 1)│

└─────────────────────────────┘

제5항 산 휘발성 황화물 (Acid Volatile Sulfide, AVS)

1. 요오드적정법

1.1  측정원리

해저퇴적물 내 산 휘발성 황화물(이하 황화물)이 높다는 것은 퇴적물 내 산소의 고갈 및 결핍을 의미하며, 이는 저층수질 및 저서생태계에 나쁜 영향을 줄 뿐 아니라 환경을 평가하는 데 있어서 중요한 의미를 가진다. 황화물은 대기 중 산소와 접촉하게 되면 아주 빨리 산화되어 황산염으로 바뀐다. 따라서, 시료를 처리하는 전 과정에서 공기와 접촉하지 않도록 해야 한다. 황화물의 정량은 적당량의 산을 가하여 퇴적물 내의 황화물을 황화수소 형태로 바꾼 후 발생하는 황화수소를 측정하는 방법을 사용한다. 즉, 발생하는 황화수소를 침전물(황화아연)로 포집하여 요오드적정법(iodometry)으로 정량한다.

1.2  측정범위 및 정밀도

요오드적정법으로 정량할 때 측정한계는 0.01 mg/g.dry이며 시험표준편차율은 10 % 정도이다.

1.3  기구 및 기기

1.3.1  전자저울: 눈금이 디지털로 표시되며, 0.001 g에서 300 g까지 무게를 측정할 수 있는 것으로 사용한다.

1.3.2  500 mL 시료 보관 용기(wide mouth bottle): 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 재질의 입구가 넓은 병을 사용한다. 사용 전에는 이 물질이 남아있지 않도록 깨끗이 씻은 후 잘 건조시켜 사용한다.

1.3.3  초자기구

1.3.3.1  100 mL 가지가 달린 삼각플라스크(filter flask): 사용 전에 모두 산으로 깨끗이 씻은 후 잘 말려 사용한다.

1.3.3.2  바닥이 넓은 250 mL 가지가 달린 삼각플라스크(filter flask): 미리 무게를 측정해야 한다.

1.3.3.3  50 mL 뷰렛 (눈금이 0.1 mL 단위로 있어야 함)

1.3.3.4  500 mL 가지가 달린 삼각플라스크(filter flask)

1.3.4  교반기

1.3.5  황화수소 발생장치: 황화수소는 다음과 같이 장치된 기구에서 발생시켜 포집한다.

1 : 시료가 들어 있는 플라스크 2: 냉각관

3, 4 : 아세트산 아연이 들어 있는 플라스크

그림 1. 황화수소 발생장치

1.4  시약 및 표준물질

1.4.1  6 N 염산 용액: 36 % 염산 516 mL를 초순수에 천천히 가하여 혼합하여 실온으로 식힌 후 1,000 mL가 되게 한다.

1.4.2  1 N 염산 용액: 36 % 염산 86 mL을 적량의 초순수에 천천히 가하여 혼합하여 실온으로 식힌 후 1,000 mL가 되게 한다.

1.4.3  질소 기체: 순도 99.999 %의 질소를 사용한다.

1.4.4  아세트산아연 용액(10 % (w/v)): 아세트산아연[Zn(COOH)2] 100 g을 초순수 300 mL를 가해 완전히 녹인 후 전체 액량을 1,000 mL 한다.

1.4.5  요오드화칼륨(KI)

1.4.6  0.025 N 요오드 용액: 요오드 (I2) 0.434 g을 정확히 취하여 비이커에 넣고 여기에 요오드화칼륨 4.13 g을 더한다. 증류수 400 mL 가해 완전히 녹인 후 정확히 1,000 mL로 한다.

1.4.7  1 % 녹말지시약: 수용성 녹말 2 g을 초순수 20 mL에 혼합하여 열수 200 mL 중에 넣고 액이 투명해질 때까지 끓인 후 상온으로 방냉하여 사용한다.

1.4.8  0.025 N 티오황산나트륨 용액: 티오황산나트륨(Na2S2O3ㆍ5H2O) 6.204 g을 정확히 달아 초순수로 녹여 정확히 1,000 mL로 한다.

1.5  시료의 채취 및 보관

현장에서 시료를 500 mL 용량의 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 광구병에 담는다. 이 때 병에 시료가 꽉 차게 담아 뚜껑을 닫았을 때 공기가 차 있는 공간을 최소로 해야 한다. 시료는 4 °C 이하로 냉장 보관하되 즉시 실험실로 옮겨 분석을 실시한다. 하지만 이 온도 이하로 유지할 때는 1주일간 안정하다.

1.6  시험방법

1.6.1  시료와 산을 반응시킬 250 mL 플라스크의 무게를 0.001 g까지 정확히 측정한다.

1.6.2  현장에서 가지고 온 500 mL 고밀도 폴리에틸렌병과 반응시킬 250 mL 플라스크, 그리고 플라스크를 꼭 닫은 마개를 장갑상자(glove box) 안에 넣고 질소로 장갑상자를 채운다. 이때, 장갑상자를 질소로 완전히 채우기 위해서 질소를 불어넣고, 안의 공기를 빼내는 환기 작업을 3 ∼ 4회 반복한다.

1.6.3  장갑상자 내에서 시료병의 뚜껑을 열고, 적어도 위에서 3 ∼ 4 cm의 퇴적물을 긁어낸다. 그 아래의 퇴적물을 3 ∼ 4 g 정도 조심스럽게 떠서 250 mL 삼각플라스크에 담고 마개를 꼭 닫는다.

1.6.4  장갑상자 안에서 삼각플라스크를 꺼낸 후 무게를 다시 0.001 g까지 정확히 측정하고, 황화수소 발생 및 포집 장치에 신속히 연결한다. 이때, 공기와의 접촉을 최소화하도록 해야 한다.

1.6.5  6 N 염산 용액 10 mL을 넣는다. 넣은 후 마개가 열리지 않도록 주의하면서 잘 흔들어 준 후 교반기를 작동시켜 계속 저어준다.

1.6.6  한 시간 정도 반응시킨 후 황화수소가 황화아연(ZnS) 형태로 포집된 플라스크를 분리하고 플라스크 안의 시료를 다음과 같이 적정한다.

1.6.7  시료에 0.025 N 요오드 용액 10 mL을 넣고, 1 N 염산 용액 5 mL을 더한다.

1.6.8  위 1.6.7과 같이 준비된 시료를 0.025 N 티오황산나트륨으로 적정을 진행하면 용액의 색이 갈색에서 점차 노란색으로 바뀐다. 옅은 노란색이 나올 때까지 적정을 진행한 후, 녹말지시약을 넣으면 보라색을 띠게 된다. 여기에서부터 용액의 색이 무색이 될 때까지 적정하면 된다. 한 시료에 포집하는 플라스크가 2개 연결되므로, 이 2개의 플라스크에서 적정되는 황화수소의 양을 더해야 한다.

1.6.9  적정된 시료에서 황화물량은 다음과 같이 구한다.

┌────────────────────────────────────┐

│                                                                        │

│(시료의 무게 = 플라스크와 시료의 무게 - 플라스크의 무게)         (식 1) │

│                                                                        │

└────────────────────────────────────┘

1.7  정도평가/정도관리(QA/QC)

1.7.1  검정은 황화나트륨(Na2SㆍxH2O)을 이용하여 실시한다. 황화나트륨은 공기와 접촉하면 아주 빠른 속도로 산화가 이루어지기 때문에 시약을 만들 때 무산소 초순수(oxygen free deionized water)를 만들어 사용해야 한다. 황화나트륨 0.780 g을 측정하여 1,000 mL 메스플라스크에 넣고 무산소 초순수 약간을 가한 후 완전히 녹인다. 시약이 다 녹았으면, 표선까지 무산소 초순수를 채워 만든다.

1.7.2  황화나트륨용액의 표정법

100 mL 유리 삼각플라스크에 10 % 아세트산아연 5 mL을 넣는다. 여기에 1.7.1항과 같이 만든 황화나트륨용액 5 mL를 넣고 침전이 완전히 생길 때까지 기다린다. 이 용액을 이용하여 1.6.7항에서 1.6.8항까지의 과정으로 시험하여 황화나트륨용액의 농도를 결정한다. 농도를 결정할 때의 식은 다음과 같다.

┌─────┐

│          │

│   (식 2) │

└─────┘

1.7.3  500 mL 유리 삼각플라스크에 10 % 아세트산아연 5 mL을 넣는다. 여기에1.7.1항과 같이 만든 황화나트륨용액 5 mL를 넣고 침전이 완전히 생길 때까지 기다린다. 플라스크를 황화수소 발생기 및 포집기에 연결하고 1.6.5 ∼ 1.6.8항의 과정으로 시험하여 황량을 구한다. 황량은 1.7.2항과 같이 구할 수 있다. 이렇게 구한 황량과 1.7.2항에서 구한 황화나트륨용액 중의 황량을 비교하여 시험의 정확도를 다음과 같이 구한다.

2. 황 검지관법

2.1  측정원리

황 검지관을 사용하여 검지관에 흡수되는 황의 양을 읽어 정량하는 방법을 황화물 정량법으로 한다.

2.2  측정범위 및 정밀도

황 검지관법으로 정량할 때 측정한계는 0.01 mg/dry.g이며 시험 표준편차율은 10 % 정도이다.

2.3  기구 및 기기

2.3.1  전자저울: 눈금이 디지털로 표시되며, 0.001 g에서 300 g까지 무게를 측정할 수 있는 것으로 사용한다.

2.3.2  시료 보관용 광구병(wide mouth bottle): 125 mL 용량의 PMP(poly-methyl- pentane) 재질의 입구가 넓은 병을 사용한다. 사용 전에는 이물질이 남아있지 않도록 깨끗이 씻은 후 잘 건조시켜 사용한다.

2.3.3  황 검지관

2.4  시약 및 표준물질

2.4.1  황산

2.5  시료의 채취 및 보관

요오드적정법 1.5항 시료의 채취 및 보관에 따른다.

2.6  시험방법

2.6.1  습시료 약 2 g의 무게를 정확히 측정하여 검지관의 시료 주입구에 넣는다.

2.6.2  시료를 넣은 후 증류수 약간을 더하고, 뚜껑을 꼭 닫아 기체가 새지 않도록 한다.

2.6.3  기체 발생관에 황산 2 mL을 넣고, 2 ∼ 3초 기다린 후 펌프를 서서히 당겨 발생하는 황화수소가 검지관에 흡수되도록 한다.

2.6.4  펌프를 잡아당기며, 검지관의 색 변화를 유심히 관찰하여, 색이 더이상 변하지 않을 때, 그 지점의 눈금을 읽는다.

2.6.5  발생한 황화수소의 양과 검지관의 눈금으로부터, 황화물량은 다음과 같이 계산한다.

┌──────┐

│     (식 3) │

└──────┘

제6항 화학적 산소요구량(Chemical Oxygen Demand, COD)

1. 측정원리

해저퇴적물 중 유기물량은 퇴적물의 환경을 평가하는 데 중요한 척도 중의 하나로 사용된다. 일반적으로 유기물량의 측정은 강열감량법이나 유기탄소량 측정법 등을 이용하여 직접 정량하는 방법이 주로 사용된다. 반면, 유기물이 산화될 때 환경에 미치는 영향을 알아내기 위해 유기물이 산화될 때 소비되는 산소량을 측정하는 방법이 있는데, 이를 화학적 산소요구량(COD: Chemical Oxygen Demand)이라 한다. 화학적 산소요구량은 퇴적물 내 유기물을 강한 산화제로 산화시킬 때 소모되는 산소량으로 정의한다. 산화제로는 과망간산칼륨 혹은 중크롬산칼륨 등을 이용하나, 측정범위가 넓은 과망간산칼륨법을 보다 많이 이용한다. 이 방법은 생물학적 산소요구량, 유기탄소량 혹은 유기물량과 상관관계가 좋은 것으로 알려져 있으며, 퇴적물 오염의 지표로 많이 사용된다.

2. 측정범위 및 정밀도

화학적 산소요구량의 측정범위는 시험할 때 사용하는 시료의 양과 사용하는 산화제의 농도에 따라 달라진다. 검출한계는 0.1 N 산화제를 사용할 경우 5 mg/L이며, 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

3.1.1  250, 500 mL 경질유리 삼각플라스크(Erle㎚eyer flask)

3.1.2  50 mL 유리 재질 뷰렛

3.1.3  100, 1000 mL 경질유리 용량 플라스크

3.2  지름 47 mm의 여과지를 사용할 수 있는 여과 기구

3.3  수욕조(water bath)

3.4  자석교반기

3.5  유리섬유 여과지(GF/C)

3.6  피펫

4. 시약 및 표준물질

4.1  0.1 N 과망간산칼륨용액: 과망간산칼륨(KMnO4) 3.16 g을 정확히 취해 증류수에 녹여 1 ∼ 2시간 조용히 끓인 다음, 하루 동안 암소에 방치하고 유리섬유 여과지(GF/C)로 여과하여 전체 액량을 정확히 1,000 mL로 한다. 갈색병에 넣어 암소에 보관한다.

4.2  0.1 N 티오황산나트륨용액: 티오황산나트륨(Na2S2O3ㆍ5H2O) 24.8 g을 증류수에 완전히 녹인 후 정확히 1,000 mL로 맞춘다. 이 용액은 7항과 같이 표정하여 사용한다.

4.3  10 % 수산화나트륨용액: 수산화나트륨(NaOH) 10 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.4  10 % 요오드화칼륨용액: 요오드화칼륨(KI) 10 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다. 이 용액은 갈색병에 보관하거나 알루미늄호일로 싸서 빛과의 접촉이 없도록 한다.

4.5  4 % 아지드나트륨용액: 아지드나트륨(NaN3) 4 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.6  1 % 녹말용액: 수용성 녹말 2 g을 초순수 200 mL에 혼합하여 열수 200 mL 중에 넣고 액이 투명해질 때까지 끓인 후 상온으로 방냉하여 사용한다.

4.7  30 % (v/v) 황산 용액: 증류수 약 50 mL을 100 mL 비이커에 넣고, 진한 황산 30 mL를 아주 조심스럽게 가하여 혼합한 후 이 용액을 실온으로 식혀 100 mL로 한다.

4.8  10 % (v/v) 황산 용액: 증류수 약 50 mL를 100 mL 비이커에 넣고, 진한 황산 10 mL를 아주 조심스럽게 가하여 혼합한 후 이 용액을 실온으로 식혀 100 mL로 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 황화물 1.5 시료의 보관 및 전처리에 따르되, 되도록 빠른 시간안에 시험해야 한다.

6. 시험방법

6.1  습시료 약 1 g의 무게를 정확히 취하여 250 mL 삼각플라스크에 담는다.

6.2  0.1 N 과망간산칼륨용액 100 mL을 넣는다.

6.3  여기에 10 % 수산화나트륨용액 5 mL을 넣은 후 잘 흔들어 준다.

6.4  시료와 시약이 담긴 플라스크를 수욕에 넣고 물을 끓이며 1시간 동안 중탕한다.

6.5  중탕이 끝나면 플라스크를 꺼내 실온으로 식힌다.

6.6  삼각플라스크 안의 용액에 10 % 요오드화칼륨용액 10 mL과 4 % 아지드나트륨용액 한 방울을 넣는다.

6.7  증류수를 가해 500 mL로 만든다.

6.8  이 용액과 퇴적물을 잘 흔들어 섞은 후 유리섬유 여과지를 사용하여 여과한다.

6.9  여과한 용액 100 mL을 250 mL 삼각플라스크에 옮긴다.

6.10  30 % 황산 용액 2 mL을 넣고 잘 흔들어 준다.

6.11  0.1 N 티오황산나트륨용액을 50 mL 뷰렛에 채운 후 이 용액으로 적정한다. 이때, 지시약은 녹말 용액을 사용한다.

6.12  화학적 산소요구량은 다음과 같은 식으로 계산한다.

┌─────────────────────────┐

│     화학적산소요구량(COD, ㎎ O2/㎏.dry)          │

│              =             (식 1)                │

│                                                  │

│A: 공시료 적정시 소요된 양(mL),                   │

│    (6.2항 ∼ 6.11항의 시험과정을 실시하여 구한다)│

│B: 시료 적정시 소요된 양(mL)                      │

│M: 시료의 무게(g)                                 │

│W: 함수율                                         │

│f : 역가 f는 7항의 표정에 따른다.                 │

└─────────────────────────┘

6.13  바탕시험값은 시료 없이 6.2 ∼ 6.11항의 시험과정을 실시하여 적정시 소요된 양으로 한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

티오황산나트륨용액의 표정은 다음과 같이 실시한다.

7.1  요오드산칼륨 표준용액(16.67 mM) 20.0 mL을 정확히 취하여 용량 100 mL 삼각플라스크에 첨가한 다음 초순수 약 30 mL를 더하여 50 mL가 되게 한다. 이 용액에 요오드화칼륨용액 (KI) 2 mL를 첨가하고 잘 혼합한 다음 50 % 황산용액 1 mL를 첨가하여 혼합한다.

7.2  유리되어 나온 요오드(위 7.1항의 용액)를 0.1 N 티오황산나트륨 표준용액으로 엷은 노란색이 될 때까지 적정한다.

7.3  표정시료에 녹말지시약 1 mL를 넣고 푸른색이 없어질 때까지 계속 적정한다.

7.4  검정시료 적정에 사용한 0.1 N 티오황산나트륨의 양을 Vf (mL)라 할 때 티오황산나트륨의 표준용액의 농도계수 F는 다음과 같다. 이때, 평균값은 5개의 자료를 이용하며, 적정량은 ± 0.03 mL 이내의 재현성을 확보해야 한다.

┌─────────────────────────────────────┐

│F = ( 0.1 × 20 × fKIO3 ) / ( 0.1 × Vf )                         (식 2) │

│f KIO3 ; KIO3의 표준시약의 factor에서 취한 KIO3의 g 수/ 3.567             │

│Vf; 0.1 N 티오황산나트륨 표준용액 적가량 (mL)                             │

└─────────────────────────────────────┘

제7항 유기탄소량(Organic Carbon)

1. 측정원리

퇴적물 내 유기물의 함량은 저서환경의 질을 평가하는 척도의 하나로 널리 사용되고 있다. 하지만, 퇴적물 내의 유기물은 해저퇴적물 내에서 다양한 형태와 종류로 존재하며 그 공급원 또한 매우 다양하다. 이러한 이유로 인해 퇴적물의 유기물량을 정량적으로 측정하는 일은 매우 난해하지만, 일반적인 유기물을 대표하고 비교적 측정이 용이한 유기탄소량에 의해 유기물 양을 판단한다. 유기탄소량 측정에는 여러 가지 방법이 이용된다. 하지만, 이 방법들의 공통된 원리는 유기탄소를 시약이나 고온 등으로 산화시켜 분해된 유기물 속의 탄소량을 알아내는 것이다. 한편, 역적정법은 산화제를 사용하여 유기물을 산화시킨 후, 소모된 산화제의 양을 알아내어 유기탄소량으로 환산하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

유기탄소량의 측정범위는 시험할 때 사용하는 시료의 양과 사용하는 산화제의 농도에 따라 달라진다. 검출한계는 0.1 N 산화제를 사용할 경우 0.02 %이며, 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

3.1.1  100 mL 경질유리 삼각플라스크

3.1.2  50 mL 유리재질 뷰렛

3.1.3  100, 1,000 mL 경질유리 용량플라스크

3.1.4  10 mL 메스피펫

3.2  열판: 50 ∼ 120 °C의 범위에서 온도조절이 가능해야 한다.

3.3  자석교반기 및 교반용 자석

3.4  피펫

4. 시약 및 표준물질

4.1  황산

4.2  인산

4.3  0.1 N 중크롬산칼륨용액: 중크롬산칼륨(K2Cr2O7)을 4.904 g을 초순수에 녹이고 여기에 황산 10 mL을 가한 다음 정확히 1,000 mL로 한다.

4.4  0.1 N 황산암모늄제1철용액: 황산암모늄제1철[(NH4)2Fe(SO4)2ㆍ6H2O] 39.2 g을 정확히 취하여 초순수 200 mL에 녹이고 여기에 진한 황산 10 mL을 가하여 완전히 녹인 다음 정확히 1,000 mL로 한다. 이 시약은 수화되어 있기 때문에 정확한 농도를 알기 위해서는 아래 7.2항(7. 표정)과 같이 중크롬산칼륨용액에 대해 검정을 실시해야 한다.

4.5  0.3 % 글루코오즈용액: 글루코오즈(C6H12O6) 0.3 g을 초순수로 녹인 후 100 mL로 한다.

4.6  페로인 지시약

5. 시료의 채취 및 보관

제3항 강열감량 중 4. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  건조하여 분마한 시료 약 0.1 g을 정확히 측정하여 100 mL 삼각플라스크에 담는다.

6.2  0.1 N 중크롬산칼륨용액 10 mL를 넣는다.

6.3  메스피펫으로 황산 5 mL를 넣은 후 잘 흔들어준다. 이때, 황산은 플라스크의 벽을 따라 천천히 넣어주어야 한다.

6.4  시료와 시약이 담긴 플라스크를 열판 위에 올리고 90 ∼ 100 °C의 온도로 30분간 가열한다.

6.5  가열이 끝나면 플라스크를 실온으로 식힌다.

6.6  실온으로 식힌 후 인산 1 mL를 넣는다.

6.7  여기에 초순수 10 mL를 넣는다. 이때, 초순수를 플라스크의 입구와 벽면을 세척하면서 넣어준다.

6.8  플라스크에 페로인 지시약을 2 ∼ 3 방울 정도 넣는다.

6.9  0.1 N 황산암모늄제1철 용액을 50 mL 용량의 뷰렛에 채운 후, 이 용액으로 적정한다. 적정시 종말점은 밝은 파란색에서 진한 갈색으로 바뀌는 점으로 한다.

6.10  유기탄소량은 다음과 같은 식으로 계산한다.

┌───────────────────────────────┐

│                         (식 1)                               │

│C: 황산암모늄용액 농도(N)                                     │

│A: 공시료 적정시 소요된 양(mL)                                │

│   (6.2항 ∼ 6.9항의 시험과정을 실시하여 구한다.)             │

│B: 시료 적정시 소요된 양(mL)                                  │

│F: 글루코오즈용액을 이용하여 구하는 시험계수(7.3항에 따른다.) │

│M: 시료의 무게(g)                                             │

└───────────────────────────────┘

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  이 방법에서 검정은 두 가지 검정을 시행한다. 첫째는 황산암모늄제1철 용액의 농도를 위한 검정이며, 둘째는 위 식에서 F를 구하기 위한 글루코오즈 용액에 대한 검정이다.

7.2  황산암모늄용액의 농도를 구하기 위한 시험방법은 위 내용 중 6.2항에서 6.9항의 과정과 동일하다. 다만, 가열은 하지 않는다. 시험이 끝난 후 황산암모늄의 농도는 다음과 같이 구한다.

┌────────┐

│         (식 2) │

└────────┘

7.3  F를 구하기 위한 글루코오즈 용액에 대한 검정은 위 내용 중 6.1항에서 6.9항의 시험방법과 동일하다. 다만, 해저퇴적물 시료 대신 글루코오즈 용액 0.5 mL을 넣어준다. 시험이 끝난 후 시험계수 F는 다음과 같은 식으로 구한다.

┌───────────────────────────────┐

│                (식 3)                                        │

│           C: 황산암모늄용액 농도(N)                          │

│           A: 공시료 적정시 소요된 양(mL)                     │

│              (6.2항에서 6.9항의 시험과정을 실시하여 구한다.) │

│           B: 시료 적정시 소요된 양(mL)                       │

└───────────────────────────────┘

8. 참고사항

8.1  해저퇴적물에 유기탄소량이 많아 적정이 되지 않을 경우, 다음 표에 따라 시약의 농도와 넣어주는 양을 달리하여 시험한다. 단, 시험방법은 모두 동일하다. 이때, 계산은 위의 6.10항과 동일하다.

표 1. 유기탄소량에 따른 적정 시약의 농도

┌────────────┬────────┬─────────┐

│해저퇴적물 내 유기탄소량│적정 시약의 농도│중크롬산용액의 양 │

├────────────┼────────┼─────────┤

│3 % 이하                │0.1 노르말      │10 mL             │

├────────────┼────────┼─────────┤

│3 ∼ 6 %                │0.2 노르말      │10 mL             │

├────────────┼────────┼─────────┤

│6 ∼ 9 %                │0.3 노르말      │10 mL             │

├────────────┼────────┼─────────┤

│9 % 이상                │0.4 노르말      │10 mL             │

└────────────┴────────┴─────────┘

8.2  해저퇴적물 내 유기탄소량 측정은 정밀도와 정확도가 더 좋은 방법, 즉 원소분석기(CHN analyzer) 등으로 분석할 수 있다.

제8항 구리(Copper, Cu)

1. 측정원리

해저퇴적물 내에서 구리는 다양한 화학적 형태를 가질 수 있다. 해저퇴적물 중 구리의 총량을 분석하기 위해서는 질산, 과염소산 및 불산을 이용하여 완전분해한 후, 희석질산용액으로 재용해한 다음 흑연로 원자흡광분석기(이하 GF-AAS) 혹은 유도결합플라즈마 분광분석기(이하 ICP-OES), 유도결합플라즈마 질량분석기(이하 ICP-MS)로 정량한다. GF-AAS 사용시 구리분석용 중공관 램프는 파장 324.7 nm의 빛을 발하므로 이 파장에서 용액 속의 구리 농도에 따라 흡광도가 증가하는 원리를 이용하여 시료의 흡광되는 빛을 측정하여 정량한다. ICP-OES 사용시 유도결합플라즈마를 이용하여 시료의 발광 혹은 흡광되는 양을 측정하여 정량한다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 구리의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Cu/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Cu/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기 

3.1  실험기구: 희석 질산에 24시간 이상 담가둔 후 산을 제거하고 초순수로 3 ∼ 6회 이상 헹구어 사용한다. 사용하지 않을 경우 클린벤치 내에서 뒤집어서 건조시킨 후, 밀봉하여 비닐 지퍼백 등에 넣어 보관한다.

3.1.1  테프론 비이커 혹은 테프론 가압형 산분해용기: 125 mL 비이커, 60 mL 가압형 산분해용기

3.1.2  100 mL 플라스틱 병

3.1.3  피펫: 일회용 자동 피펫을 사용할 수 있다.

3.1.4  플라스틱 핀셋

3.2  볼밀 혹은 막자사발

3.3  전자저울: 0.001 g 또는 0.0001 g까지 정확히 측정할 수 있는 저울을 사용

3.4  화학분석용 후드: 후드 바닥을 테프론 혹은 비닐로 코팅하여 사용

3.5  가열판 (온도가 정확히 조절되는 것)

3.6  건조기 또는 동결건조기

3.7  흑연로 원자흡광분석기(GF-AAS), 유도결합 플라즈마 분광분석기(ICP-OES), 유도결합 플라즈마 질량분석기(ICP-MS)

4. 시약 및 표준물질

4.1  산: 중금속 분석에 사용하는 시약의 등급은 불순물로 인해 시료에 영향을 주지 않는 등급을 사용하고 시료 정량 후 시약 공시료의 농도가 시료 측정농도의 25 % 미만인 것을 확인하여 사용한다.

4.1.1  진한 질산 (60 ∼ 70 % HNO3)

4.1.2  진한 과염소산 (60 ∼ 70 % HClO4)

4.1.3  진한 불산 (48 ∼ 51 % HF)

4.1.4  희석질산용액: 초순수 900 mL에 진한 질산 100 mL를 넣어 혼합하여 식힌 다음 1,000 mL로 맞추어 사용한다.

4.2  구리 표준원액: 상용으로 제조되는 GF-AAS, ICP-OES 혹은 ICP-MS 구리 표준원액을 사용한다.

4.3  인증 해저퇴적물 표준물질(Certified reference materials CRM) 퇴적물 표준물질 : 퇴적물 중금속 분석 자료의 정확도를 평가하기 위한 퇴적물 표준시료로는 캐나다 NRC의 HISS, MESS, PACS, IAEA의356, 미국 USGS의 MAG 등이 있다.

: 국내ㆍ외의 공인된 해저퇴적물 표준물질을 구입하고 시료와 똑같은 절차를 거쳐 회수율을 측정한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 폴리에틸렌 병이나 비닐백에 담겨 얼려진 시료를 해동시킨다.

5.2  플라스틱 주걱으로 시료를 균질화한다.

5.3  균질한 시료 5 ∼ 10 g을 동결건조 또는 60 °C 건조기에서 건조시킨다. 화학종 분석이나 Hg 분석을 위해서는 반드시 동결건조 시킨다. 건조기에서 건조할 경우 별도의 페트리디쉬를 사용한다.

5.4  건조된 시료를 마노 분쇄기(agate mortar)를 사용하여 곱게 분말화한다. 200 메시 체를 이용하여 통과된 분말만 별도의 시료병(산 세척 후 건조된 시료병)에 보관한다. 별도의 체질을 하지 않는 경우 손가락으로 만져보았을 때 입자가 만져지지 않아야 한다.

5.5  분말화된 시료는 수분이 조절되는 장소에 보관한다.

6. 시험방법

6.1  전처리가 완료된 시료 0.1 g을 취하여 60 mL 테프론 용기에 넣는다.

6.2  테프론 가압용 용기에 진한 불산 2 mL, 진한 질산 1 mL를 가하여 2시간 이상 실온에서 반응시킨 후 진한 과염소산 1 mL를 첨가 후 뚜껑을 닫아 밀봉한다.

6.3  밀봉된 테프론 용기를 가열판 위에 놓고 가열판 온도를 130 °C ∼ 150 °C까지 서서히 증가시켜 약 24시간 반응 후 서서히 방냉하여 상온에 도달한 다음, 마개를 열어 시료와 산이 완전히 건조될 때까지 재가열한다. 만약, 용액이 전부 휘발되어도 퇴적물이 완전히 분해되지 않을 경우에는 위 6.2항 과정부터 재시행한다.

6.4  완전히 분해된 시료에 희석질산 용액 10 mL를 정확하게 넣고 뚜껑을 닫아 밀봉한 후 온도를 80 °C까지 증가시켜 약 2시간 반응 후 정량용 시료용액으로 한다.

6.5  이 용액을 GF-AAS 혹은 ICP-OES, ICP-MS 정량한다. 각 기기로 정량할 때의 조건은 사용하는 기기의 매뉴얼을 따른다.

6.6  검량선 작성

6.6.1  GF-AAS 혹은 ICP-OES, ICP-MS 표준용액을 이용하여 정량범위 내 5개 이상의 농도구간에 대해 표준용액을 만든다. 

6.6.2  만들어진 표준용액을 시료정량과 동일한 절차(6.5항)로 정량하여 구리(Cu)의 농도와 흡광도의 관계선인 검량선을 작성한다.

6.6.3  흡광도와 농도의 상관관계식을 이용하여 시료의 구리(Cu)의 농도를 환산한다.

6.7  공시료 및 인증 해저퇴적물 표준물질 (CRM)도 시료와 동일한 조작을 행하여 시료 20개당 1개씩 준비한다.

6.8  회수율: 해저퇴적물 표준물질(CRM) 측정 결과와 제시된 농도값을 비교한 후 회수율을 계산하여 분석된 시료의 결과와 함께 제시한다.

회수율(%) = (측정결과로 정량된 표준물질의 농도/인증된 표준물질의 농도)× 100 (식 1)

6.9  이 용액을 기기 측정시에 사용하며 이 용액의 희석배수는 100에 해당된다. 금속의 농도 수준에 따라 추가적인 희석을 하면 된다. 이 용액을 사용하면 ICP로 Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb, As, Li이 측정 가능하며 10배를 추가 희석한 용액으로는 Al, Fe, Mn, M g, Ca 등이 측정 가능하다. ICP-MS의 경우 1,000배 희석한 용액으로 Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb, As, Mn, Li, Cs이 측정 가능하며 Al, M g, Ca은 100배 이상의 추가적인 희석이 필요하다.

6.10  정량하고자 하는 시료의 농도가 매우 낮거나 다른 항목의 간섭효과 등에 의해 정량이 어려울 경우에는 표준물질 첨가법을 이용하여 정량하고자 하는 항목을 정량할 수 있다. 표준물질 첨가법의 방법은 다음과 같다.

6.10.1  표준물질을 이용하여 3개 정도의 농도를 알고 있는 표준용액 3개를 만든다.

6.10.2  정량하고자 하는 시료에 표준물질을 첨가하여 3개 이상의 표준물질을 첨가한 용액을 만든다. 이때, 표준물질을 첨가했을 때의 농도를 예측할 수 있도록 부피비율을 정하여 첨가한다(예: 정량용액의 부피가 1 mL일 경우 농도가 X μg/L인 미지시료 0.9 mL와 농도가 10 μg/L인 표준용액 0.1 mL를 첨가하면 표준용액을 첨가한 시료의 농도는 (X + 1) μg/L로 예상할 수 있다.

6.10.3  표준물질을 첨가한 시료를 분석 장비를 이용하여 정량한다.

6.10.4  정량값을 이용하여 검량선을 그린다.

6.10.5  검량선을 이용하여 미지농도 X값을 정량한다.

7. 방해요인

7.1  여러 가지 원소들간의 방해가 있을 수 있으며 이는 각 분석기기 사용 방법에서 설명된다.

7.2  간섭을 제거하는 방법으로 원자흡광법을 사용하는 경우 매질변경시약 (matrix modifier)으로 CsCl을 사용하고, matrix match 표준용액을 검정선 표준용액으로 사용하며 배경선(background) 보정이 있다. ICP의 경우 희석 배수를 50배 이상, ICP-MS는 500배 이상이면 간섭을 줄일 수 있다.

7.3  ICP-MS의 경우 간섭을 제거할 수 없는 경우(예를 들면 As) 수식을 이용하여 다원자 분자를 보정하는 방법이 있다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  본 분석방법의 정도관리를 위해 필요한 최소한의 정도관리용 자료는 시약 공시료에서의 금속 농도, 반복시료 정밀도, 퇴적물 표준물질에서의 금속농도가 있다.

8.2  실험실 시약에 의한 공시료에서의 금속 농도: 공시료를 분석한 금속농도 자료이다.

8.3  반복시료 정밀도: 실제 시료를 5개 복수분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 1.96(95 % 신뢰구간)을 곱하여 평균값 ± 유의수준으로 표시한다.

8.4  금속인증 퇴적물시료 분석: 시료 수의 10 %에 해당하는 수만큼 시료와 같은 방법으로 분석하여 인증값과 비교한다.

9. 결과

9.1  농도계산

보고되는 자료는 μg/g 또는 mg/kg 단위로 표시하며 (Al, Fe의 경우 % 단위로 표현가능) 퇴적물 중금속 농도는 다음과 같은 식에서 계산한다.

  (식 2)

9.2  퇴적물 중금속에 대한 결과는 공시료, 표준물질, 시료에서의 중금속농도 측정값을 보고한다.

10. 분석절차 흐름도

┌─────────┐                                                                          

│시료              │ 0.1 g 을 정확히 취하여 사용                                              

└─────────┘                                                                          

┌─────────┐                                                                          

│테프론 가압용 용기│                                                                          

└─────────┘                                                                          

                       ① 진한 불산 2 mL, 진한 질산 1 mL                                        

┌─────────┐                                                                          

│밀봉 후 2시간 반응│                                                                          

└─────────┘                                                                          

                       진한 과염소산 취급 시 주의, 특수 후드가 없을 시에는 사용 불가(폭발위험)  

                       1 mL                                                                     

┌─────────┐                                                                          

│혼합              │                                                                          

└─────────┘                                                                          

┌─────────┐                                                                          

│가열              │ 130 ∼ 150°C까지 서서히 온도를 올린 후 24시간 가열                      

└─────────┘                                                                          

┌─────────┐                                                                          

│방냉              │ 가열 후 뚜껑을 닫은 상태로 상온에서 방냉                                 

└─────────┘                                                                          

┌─────────┐                                                                          

│재 가열 및 건조   │ 상온에 도달한 후 뚜껑을 열고 재가열                                      

│                  │ 산이 모두 건조될 때까지 가열                                             

└─────────┘                                                                          

                       시료가 완전히 분해되지 않았을 경우                                       

                       ① 과정부터 재실행                                                       

┌─────────┐                                                                          

│정량용 시료       │ 희석 질산용액 10 mL를 정확히 가하여 밀봉한 후,                           

│                  │ 온도를 80°C까지 서서히 증가시켜 2시간 반응                              

└─────────┘                                                                          

┌─────────┐                                                                          

│정량              │ 이 용액을 GF-AAS 혹은 ICP-OES, ICP-MS로 정량                             

└─────────┘                                                                          

그림 1. 구리 분석절차

11. 참고사항

11.1  본 분석법으로 분석 가능한 금속들은 아래와 같으며 측정하는 방법에 따라 마지막 처리가 달라진다.

표 1. 분석법에 따라 분석 가능한 금속

┌───┬────────────────────────────┐

│분석법│분석가능 금속                                           │

├───┼────────────────────────────┤

│AAS   │Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As(Hydride), Al, Mn, Fe     │

├───┼────────────────────────────┤

│GFAAS │Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As(Hydride), Mn, Fe         │

├───┼────────────────────────────┤

│ICP   │Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As(Hydride), Al, Li, Mn, Fe │

├───┼────────────────────────────┤

│ICP-MS│Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As, Li, Al, Cs, Mn, Fe      │

└───┴────────────────────────────┘

11.2  본 분석법은 강산 및 과염소산, 불산을 사용하기 때문에 반드시 흄후드 내부에서 이루어져야 하며 산 취급에 대한 교육을 잘 받은 실험자가 행해야 된다.

11.3  퇴적물의 중금속은 사용하는 시약, 용기 및 환경에 의해 영향을 받기 때문에 실험준비시 오염에 대한 고려가 있어야 한다.

11.4  본 실험방법에서 사용되는 시약들은 모두 맹독성이 있는 것들로 각 시약들의 사용 주의사항에 따라 취급한다.

11.5  질산, 과염소산 및 불산을 다룰 때는 반드시 고글 및 비닐장갑 혹은 화학분석용 고무장갑을 착용해야 하며, 산증기를 호흡하지 않도록 반드시 후드 내에서 취급한다.

11.6  전처리가 완료된 시료를 분석할 때 분석기기는 GF-AAS 혹은 ICP-OES, ICP-MS 중 하나를 선택한다.

11.7  분석장비의 검출한계, 정밀도, 신뢰도 등을 고려하여 직선 범위 내에서 분석시료의 양과 반응하는 시약의 양을 결정한다.

11.8. GF-AAS를 사용할 때 램프 위치, 좌우, 램프의 전류량, 시료의 흡입속도 등이 분석값의 정확도, 정밀도, 재현성 등에 크게 영향을 미칠 수 있으므로, 기기의 특성에 맞게 이들을 세밀하게 조절한다.

11.9  ICP-OES를 사용할 때 램프 위치, 좌우, 램프의 전류량, 시료의 흡입속도 등이 분석값의 정확도, 정밀도, 재현성 등에 크게 영향을 미칠 수 있으므로, 기기의 특성에 맞게 이들을 세밀하게 조절한다.

11.10  불산을 사용할 경우 규소를 용해시키는 성질을 가지고 있으므로 반드시 테프론 재질의 실험기구를 사용해야 한다. 일부 ICP-MS 경우 불산을 사용한 전처리 방법이 기기를 손상시키는 등 장해요인이 있으므로 주의를 요한다.

11.11  정량결과 예시: 시료의 채취 및 보관 방법, 전처리 방법, 정량결과, 검량선을 포함하여 상세하게 제시한다.

표 2. 시료 채취 및 보관, 전처리 정보(작성예시)

┌─────────────┐

│시료 채취 및 보관, 전처리 │

├──────┬──────┤

│시료명      │            │

├──────┼──────┤

│시료채취    │            │

├──────┼──────┤

│시료운반    │            │

├──────┼──────┤

│시료보관    │            │

├──────┼──────┤

│시료 전처리 │            │

└──────┴──────┘

표 3. 정량결과(작성예시)

┌─────────┐

│정량 결과         │

├────────┬┤

│분석항목        ││

├────────┼┤

│정량 기기       ││

├────────┼┤

│CRM 농도        ││

├────────┼┤

│정량 평균       ││

├────────┼┤

│표준편차        ││

├────────┼┤

│정밀도          ││

│(상대 표준편차) ││

├────────┼┤

│정확도          ││

│(회수율)        ││

├────────┼┤

│정량한계        ││

│ (검출한계)     ││

├────────┼┤

│시료개수        ││

├────────┼┤

│시료 중량       ││

├────────┼┤

│희석 배율       ││

└────────┴┘

제9항 납(Lead, Pb)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제10항 니켈(Nickel, Ni)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제11항 망간(Manganese, Mn)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질 

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제12항 아연(Zinc, Zn)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제13항 알루미늄(Aluminium, Al)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제14항 철(Iron, Fe)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제15항 카드뮴(Cadmium, Cd)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제16항 코발트(Cobalt, Co)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질 

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질 4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관  5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제17항 크롬(Chromium, Cr)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질 

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제18항 비소(Arsenic, As)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질 

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제19항 리튬(Lithium, Li)

1. 측정원리

건조한 해저퇴적물 시료를 분쇄하여 완전분해법으로 산분해하고 건조시킨 후, 희석질산으로 추출하여 GF-AAS, ICP-OES 또는 ICP-MS로 측정하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

제8항 구리 2. 측정범위 및 정밀도를 따른다.

3. 기구 및 기기

제8항 구리 3. 기구 및 기기 3.1 ∼ 3.7항에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제8항 구리 4. 시약 및 표준물질  4.1.∼ 4.3항에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제8항 구리 5. 시료의 채취 및 보관 5.1 ∼ 5.5항에 따른다.

6. 시험방법

제8항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 방해요인

제8항 구리 7. 방해요인 7.1 ∼ 7.3항에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제8항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4항에 따른다.

9. 결과

제8항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2항에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제8항 구리의 분석결과 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제8항 구리의 참고사항을 따른다.

제20항 총 수은(Total Mercury, Hg)

1. 측정원리

퇴적물의 총 수은을 왕수로 산분해하여 산화, 퍼지와 포집, 탈착시켜 냉증기 원자형광분석기(Cold Vapor Atomic Fluorescence Spectrometry)로 측정하기 위한 절차이다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 분석방법의 유효측정범위는 0.5 ∼ 250 ng/g 범위이고, 청정작업환경에서 최고의 기기 성능을 보유할 때 검출한계는 0.05 ng/g, 시료량을 증가시키고 BrCl 양(0.2 %)을 최소화하며 주변 오염을 최소화하면 0.01 ng/g까지 향상시킬 수 있다.

3. 방해요인

3.1  금-트랩은 잔류염소가 투입되거나 500 °C 이상으로 과열되었을 때 파손될 수 있다.

3.2  수증기가 금-트랩에 잡혀 원자형광셀에 영향을 줄 수 있다.

3.3  형광 세기는 운반기체에 있는 분자들에 의해 영향받을 수 있으므로 고순도의 가스를 사용해야 한다.

4. 기구 및 기기 

4.1  테프론(PTFE) 비이커 혹은 테프론(PFA) 가압형 산분해 용기: 125 mL 비이커, 60 mL 가압형 산분해 용기(Savillex)

4.2  가열판(hot plate): 세라믹 판, 온도 조절 가능

4.3  일회용 피펫(Disposable pipette)

4.4  폴리에틸렌 병: 20 mL 혹은 60 mL

4.5  폴리에틸렌 원심분리관: 60 mL 튜브

4.6  저울: 0.0001 g 분석 저울 및 0.01 g 윗접시 저울

4.7  표면 온도계: 적외선사용 온도측정 기구

4.8  자동피펫 및 일회용팁: 200 μL, 1 mL, 5 mL 피펫 및 피펫팁. 시약 주입시 사용한다.

4.9  원심분리기: 50 mL 부피, 3,000 rpm에서 원심분리 가능한 장비

4.10  분석기기: 냉증기 원자형광광도계

4.11  테프론 용기는 왕수에 4시간, 질산(1 : 1)에 6시간 이상 가열 후 초순수로 세척하여 사용하며 일반 플라스틱 용기는 10 % 염산 용액에 6시간 이상 가열한 후 초순수로 세척하여 사용한다.

5. 시약 및 표준물질

5.1  초순수: 전기 저항 18 ㏁ 이상의 정제수

5.2  염산(Hydrochloric acid, 35 % (w/v)): 수은 함량이 5 ng/L 이하인 중금속 분석용을 이용한다.

5.3  질산(Nitric acid, 65 % (w/v)): 수은 함량이 5 ng/L 이하인 중금속 분석용을 이용한다.

5.4  왕수(Aqua regia): 염산과 질산을 3 : 1 (v/v)로 혼합한다. 유독가스가 발생하므로 반드시 흄후드 내부에서 이루어져야 한다.

5.5  하이드록실아민 염화수소(Hydroxylamine hydrochloride, NH2OHㆍHCl) 용액: Hydroxylamine hydrochloride(시약급) 300 g을 초순수에 용해시키고 최종 부피를 1 L에 맞춘다. 이 용액에 20 % 염화제이주석 용액 1 mL를 넣고 수은이 없는 질소 가스로 4시간 이상 500 mL/min 속도로 폭기하여 수은을 제거한다.

5.6  염화제이주석 용액: 염화제이주석(SnCl2ㆍ2H2O) 200 g을 100 mL 진한 염산에 넣고 가열하면서 용해시킨다. 초순수로 최종 부피 1 L가 되도록 한다. 수은이 없는 질소 가스로 4시간 이상 500 mL/min 속도로 폭기하여 수은을 제거하고 뚜껑을 잘 닫아 보관한다. 시약을 제조하면서 열과 흄이 발생하므로 보호장구를 착용하고 흄후드 안에서 작업한다.

5.7  염화브롬(BrCl) 용액: 시약급의 브롬화칼륨(KBr) 27 g을 진한 염산 2.5 L에 녹인다. 이때, 테프론 코팅된 마그네틱바를 사용해서 1시간 이상 교반한다. 여기에 시약급 브롬산칼륨 (KBrO3) 38 g을 천천히 넣는다. 주의사항:　이때 격렬한 반응이 일어나 많은 양의 할로겐 가스를 방출하므로 반드시 소량씩 넣어준다.

 소량씩 넣으면 용액의 색깔이 노란색에서 빨간색으로 최종적으로는 오렌지색으로 변한다. 병뚜껑을 살짝 닫고 1시간 정도 더 교반하고 뚜껑을 잘 닫는다. 이 시약 제조는 반드시 흄후드 내부에서 이루어져야 한다.

5.8  수은 표준원액: 상용하는 1,000 mg/L 혹은 10,000 mg/L (NIST-3133) 용액을 사용한다.

5.9  수은 표준용액(1,000 μg/L): 초순수 0.5 L에 염화브롬 5 mL를 넣고 수은 표준원액 1 mL (1,000 mg/L) 혹은 0.1 mL (10,000 mg/L)를 첨가한 후 초순수로 최종 부피를 1 L가 되게 한다. 불화 폴리머병에 보관하면 표준원액의 보존기간까지 안전하다.

5.10  검량선용 수은 표준용액: 수은 표준용액을 초순수로 100배, 10,000배 희석하고 염화브롬 용액을 부피 비율로 0.5 %만큼 첨가한다 (5 mL/L). 이 용액은 10 ng/mL 및 0.1 ng/mL가 되며, 10 ng/mL 용액을 초순수로 희석하여 5 ng/L까지 만들면 된다. 이때에도 염화브롬 용액을 부피 비율로 0.5 %가 되게끔 첨가한다. 검량선용 표준용액은 분석할 때마다 새롭게 만든다.

5.11  질소 및 아르곤 가스: 질소 및 아르곤 가스는 고순도(99.999 % 이상)를 사용하며 금이 코팅된 모래 트랩을 사용하여 수은을 정제하여 사용한다.

6. 시료의 채취 및 보관

6.1  현장에서 폴리에틸렌병(혹은 비닐백)에 담겨 얼려진 시료를 해동시킨다.

6.2  플라스틱 주걱으로 시료를 균질화한다.

6.3  균질한 시료 5 ∼ 9 g을 시료병에 담아 냉동건조시킨다. 냉동건조가 어려운 경우 습시료를 직접 사용한다. 습시료를 사용하는 경우는 별도시료에서 수분 함량을 측정하여 분석 후 보정한다.

6.4  일정 무게가 유지된 후 시료를 마노 분쇄기(agate mortar)를 사용하여 곱게 분말화한다. 200 메쉬 체를 이용하여 통과된 분말만 시료병에 보관한다. 별도의 체질을 하지 않는 경우 손가락으로 만져보았을 때 입자가 만져지지 말아야 한다.

6.5  분말시료는 별도의 시료병에 넣어 수분이 조절되는 장소에 보관한다.

7. 시험방법

7.1  100 mL 테프론 비이커나 60 mL 산분해용 가압 용기에 분말화한 퇴적물 시료 0.2 g을 넣고 0.001 g까지 무게를 측정한다. 테프론 용기를 세척 후 열을 가해 건조시킬 경우 정전기로 인하여 퇴적물 시료 분말이 흩어질 수 있는데, 이때는 정전기 제거 장치를 통하여 무게를 측정한다. 공시료 3개, 퇴적물 표준물질 3개도 함께 준비한다.

7.2  왕수 10 mL를 일회용 피펫으로 첨가한다.

7.3  비이커에 테프론 시계접시를 덮고 가압 용기는 뚜껑을 닫고, 상온에서 4시간 방치한 후 발생한 가스를 날려보낸 다음, 시계접시를 덮거나 뚜껑을 닫고 가열판에 올린다. 가열판은 표면 온도 150 °C로 맞춘다. 상업적으로 판매하는 가열판은 코일선의 수가 적어 표면의 온도 분포가 불균일하므로, 가열판의 전 표면의 온도가 고르게 전달될 수 있도록 테프론 코팅된 알루미늄판을 덮고 사용하는 것이 좋다.

7.4  3,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 60 mL 폴리에틸렌병에 옮긴다.

7.5  퇴적물 산분해용액 분석 준비

7.5.1  시료 분석 24시간 전에 산분해용액 10 mL를 60 mL 원심분리관에 넣고 초순수 40 mL를 첨가한 후 염화브롬용액 0.5 mL를 첨가하여 노란색이 나타나도록 한다.

7.5.2  만약 노란색이 지속되지 않으면 염화브롬용액 0.5 mL를 추가로 첨가한다.

7.5.3  매질첨가 및 매질첨가 반복시료를 제조한다.

7.5.4  염화브롬용액으로 산화시킨 시료에 하이드록실아민 염화수소용액 0.2 ∼ 0.25 mL를 첨가 후 뚜껑을 닫고 흔들어 노란색이 없어지면 수은 분석 준비가 완료된다.

7.6  수은 분석

7.6.1  본 시험법은 흐름 주입(flow injection)으로 작성되었으므로 동일 성능 다른 기기의 경우 해당 매뉴얼을 참고한다.

7.6.2  분석 1시간 전에 수은분석기를 가동시킨다.

7.6.3  염화제이주석용액, 초순수를 연속주입장치에 연결하고 유로에 남아있을 수 있는 수은을 제거하며 시약 공시료를 사용하여 자동 시료 주입기를 포함하는 유로를 세척한다.

7.6.4  EPA 1631법에 해당하는 소프트웨어를 작동시킨 후, 검량선부터 작성하고 시료를 분석한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

본 분석법에서는 다음과 같은 정도관리 항목을 포함시키며 필요한 경우, 다른 정도관리 프로그램을 첨가할 수 있다.

8.1  검량선 작성

8.1.1  검량선 작성을 위해 준비된 표준용액을 3번 반복하여 측정하며 표준용액은 검량선 공시료를 포함하여 5개 이상의 농도 구간을 포함해야 한다.

8.1.2  각 표준용액에 대한 신호세기 평균값에서 검량선 공시료의 평균 신호세기를 뺀다.

8.1.3  각 표준용액 수은 농도에 해당되는 보정된 신호세기를 이용하여 검량선을 최소자승법으로 작성하고 검량선의 기울기, Y-절편 및 결정계수 값을 기록한다.

8.1.4  검량선 인자(Calibration Factor)를 계산하여 검량선을 이용할 수 있는지를 판단한다.

      (식 1)

8.1.5  CF 값의 평균과 표준편차를 구하여 상대표준편차가 15 % 이내이면 검량선을 이용하고 15 %를 벗어나면 검량선을 재작성한다.

8.2  공시료: 시료와 같은 처리(용기, 기구, 시약, 분석 과정)를 하여 제조하고 분석한다. 한 실험구당 최소 3개 이상을 만들고 분석하며 시료 중 수은농도 계산시 반영한다.

8.3  매질첨가 및 매질첨가 반복시료: 시료 전처리 및 분석방법이 해당 시료의 매질에 문제가 없는지를 확인하기 위하여, 현장시료 개수의 10 %에 해당되는 수만큼의 매질첨가 시료와 매질첨가 반복시료를 만든다. 즉, 20개 시료이면 2개의 매질첨가 시료와 2개의 반복시료를 제조한다.

8.3.1  첨가하는 표준용액의 농도는 측정하는 농도가 50 ng/L가 되게끔 한다.

8.3.2  회수율은 다음과 같이 계산하고 80 ∼ 120 % 이내가 되어야 한다.

 (식 2)

8.3.3  매질첨가 반복시료의 경우, 상대오차율을 다음과 같이 계산하며 30 % 이내가 되어야 한다.

          (식 3)

8.4  표준물질 분석: 수은 농도값이 보증된 퇴적물 표준시료를 분석하여 정확도를 평가한다.

9. 결과

9.1  최종 농도계산: 측정 농도에 희석배수를 곱하여 퇴적물 중 수은 농도를 계산한다. 염화브롬용액 및 하이드록실아민 염화수소는 검량선용 표준용액에도 같은 부피로 첨가되므로 결과에 영향을 주지 않는다. 퇴적물 시료의 수은 농도는 다음 식을 사용한다.

           (식 4)

9.2  정도관리 자료 보고: 위 8항에서 제시한 정도관리 내용을 보고한다.

9.2.1  검량선의 기울기, Y-절편, 결정계수(R2)

9.2.2  공시료의 평균 농도

9.2.3  퇴적물 표준물질 분석 및 보증 농도

9.2.4  매질첨가 회수율(%) 및 매질첨가 반복시료간 상대오차율

10. 분석절차 흐름도

┌─────────────────┐                                            

│시료 (0.2 g)                      │ 시료를 정확히 취하여 사용                  

└─────────────────┘                                            

┌─────────────────┐                                            

│테프론 비이커                     │                                            

└─────────────────┘                                            

                                       왕수 10 mL                                 

┌─────────────────┐                                            

│시계접시로 덮은 후 상온에서 4시간 │                                            

│반응                              │                                            

└─────────────────┘                                            

                                       가스를 날려보낸 후 가열판 온도를 150 °C   

                                       까지 서서히 올려 2시간 동안 반응시킨다.    

┌─────────────────┐                                            

│원심분리                          │ 3000 rpm에서 10분                          

└─────────────────┘                                            

                                       상등액 분리                                

┌─────────────────┐                                            

│폴리에틸렌 병                     │                                            

└─────────────────┘                                            

                                       상등액 분리                                

┌─────────────────┐                                            

│산분해 용액 10 mL +               │ 상온에서 12시간 반응                       

│초순수 40 mL +                    │                                            

│BrCl (0.02 N) 0.5 mL 첨가         │                                            

│(노랗게 변함)                     │                                            

└─────────────────┘                                            

                                       NH2OH.HCl 0.2 ∼ 0.25 mL 첨가하여          

                                      노란색이 없어지면 정량용액으로 한다.        

┌─────────────────┐                                            

│정량                              │ 이 용액을 수은분석기로 정량                

└─────────────────┘                                            

그림 1. 수은 분석절차

11. 참고사항

11.1  왕수와 염화브롬액을 사용하기 때문에 시약 제조와 시료 처리시에 피부접촉 또는 흄을 마시지 않도록 각별히 주의해야 한다.

11.2  실험복을 자주 세탁할 것을 권장한다.

11.3  실험 후에는 비누 등을 이용해서 손과 얼굴 등을 씻는다.

11.4  시약에 대한 자세한 안전 지침은 개별 물질의 안전 지침을 따른다.

11.5  고형 수은분석기를 사용하면 편리하고 정량한계가 매우 낮은 수은분석이 가능하다.

제21항 유기염소계 농약(Organochlorine Pesticides, OCPs)

1. 측정원리

해저퇴적물 중의 유기염소계 농약(Organochlorine Pesticides, OCPs)은 디클로로메탄 혹은 노말-헥산:아세톤(1 : 1) 용액을 사용하여 속실렛 추출법으로 추출ㆍ농축한 후, 이 농축액을 실리카겔-알루미나 컬럼을 통과시키고 황 성분을 제거하기 위하여 환원 구리에 농축액을 처리한 다음 전자포획검출기(Electron Capture Detector, ECD)가 부착된 기체크로마토그래피를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도 

기체크로마토그래피를 이용한, 퇴적물 중 각 유기염소계 농약의 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1.5 ng/g(건중량)이고 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 몇 기기 

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후, 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기 재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 속마개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어플라스크 (pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL와 250 mL 용량

3.1.3  속실렛 추출기: 유리섬유 혹은 텀블러(Tumbler) 사용. 속실렛 추출기로 예비 세정하거나 혹은 450 °C에서 5시간 가열처리하여 사용

3.1.4  냉각기

3.1.5  유리컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브

3.1.8  막자와 막자사발, 시약 스푼, 비등석

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기 

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소 농축기

3.2.4  저울: 퇴적물 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.5  기체크로마토그래피: 표 1과 같은 조건으로 분석이 가능한 기기

표 1. 기체크로마토그래피의 유기염소계농약 분석조건의 예

┌────────────────────────────┬───────────────────────┐

│검출기                                                  │전자포획검출기(ECD)                           │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│컬럼                                                    │모세관 컬럼                                   │

│                                                        │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)  │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│충전제                                                  │5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane          │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│운반기체                                                │헬륨(99.999 %)                                │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│운반기체 유속, 6 유속은 기기 사양에 따라 달라질 수 있다.│1.5 mL/분                                     │

│                                                        │                                              │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│검출기 기체 및 유속                                     │질소(99.999 %), 30 mL/분                      │

│                                                        │                                              │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│시료주입구 온도                                         │250 °C                                       │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│검출기 온도                                             │320 °C                                       │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│오븐 초기온도                                           │100 °C 에서 1분간 유지                       │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│오븐 1차 승온속도                                       │분당 5 °C로 140 °C까지 승온 후 1분간 유지   │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│오븐 2차 승온속도                                       │분당 1.5 °C로 250 °C까지 승온 후 1분간 유지 │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│오븐 3차 승온속도                                       │분당 10 °C                                   │

├────────────────────────────┼───────────────────────┤

│오븐 최종온도                                           │300 °C에서 5분간 유지                        │

└────────────────────────────┴───────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.1.3  디에틸에테르: 잔류농약 분석용 용매

4.1.4  아세톤: 잔류농약 분석용 용매

4.2  환원구리: 유기원소 분석용 환원구리(60 ∼ 80 메쉬)를 사용하기 전에 적당량의 진한 염산으로 세척하고 메탄올로 씻은 다음 노말-헥산으로 수회 세척한 후 노말-헥산에 보관한다.

4.3  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.4  1　% 함수 알루미나: 컬럼크로마토그래피용 알루미나를 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 99 g을 차광용기에 넣고 실온까지 냉각한다. 차광용기에 유리 피펫을 이용하여 증류수 1 mL를 첨가하고 마개를 막고 충분히 혼합

4.5  5　% 함수 실리카겔: 컬럼크로마토그래피용 실리카겔을 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 95 g을 갈색 삼각플라스크에 달아 실온까지 냉각한다. 실리카겔을 교반하면서 피펫으로 증류수 5 mL를 넣고 마개를 막아 충분히 혼합

4.6  정제수: 증류수 또는 화학분석용 물을 노말-헥산으로 2회 씻어 사용

4.7 표준용액

4.7.1  표준물질(standard, STD): 분석대상 유기염소계농약 표준물질(순도 95 % 이상)을 노말-헥산 용액으로 3개 이상의 서로 다른 농도로 조제하여 검정에 사용한다.

α-BHC; β-BHC; Aldrin; Dieldrin; Endrin; Heptachlor; Heptachlor epoxide; Lindane; o, p’-DDD; p, p’-DDD; p, p’-DDE; o, p’-DDT; p, p’-DDT; Chlordane; Hexachlorobenzene (HCB); Mirex

4.7.2  대체표준물질(surrogate, SU): 퇴적물 내 유기염소계 농약의 회수 정도를 검정하기 위한 목적으로 Dibromo-octafluoro-biphenyl (DBOFB)을 대체표준물질로 사용하며 노말-헥산 용매에 녹여 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 Tetrachloro-m-xylene (TCMX)을 내부표준물질로 사용하며 그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 퇴적물인증 표준물질은 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 실시되어야 하며 국제원자력기구 해양환경연구소, 미국 NIST (National Institute of Standard and Technology) 등에서 구매하여 사용한다(예: IAEA-417, IAEA-383, IAEA-408, SRM-1941a, SRM-1944 등).

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  퇴적물 시료는 스테인리스 스푼을 사용하여 표층 2 cm를 취해서 250 mL 차광용기에 담아 즉시 드라이아이스에 냉동 보관한다. 시료는 분석 전까지 -25 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 상태의 퇴적물 시료는 분석을 위하여 상온에서 해동한 후 시약 스푼으로 균질화하여 사용한다.

6. 시험방법

6.1  함수율 측정

사용될 퇴적물 2 g에 대하여 제4장 제2항 함수율의 측정방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  균질화된 퇴적물 10 g 및 40 g 이상의 무수황산나트륨을 막자사발에 넣어 혼합하고, 30분 정도 상온에 둔 상태로 수분을 완전히 제거하여 퇴적물이 가루 형태가 되도록 한다.

6.2.2  위의 균질화된 퇴적물에 대체표준물질인 DBOFB (Dibromo-octafluoro-biphenyl) 100 ng을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 최종 준비된 퇴적물을 속실렛 추출기 퇴적물은 속실렛 추출기속의 텀블러안에 놓거나 텀블러가 없으면 추출기 바닥에 유리 섬유를 깔고 퇴적물을 놓고 다시 그 위에 유리 섬유를 막는다.

에 넣는다.

6.2.3  추출기 아래 500 mL 넓적바닥 플라스크에 디클로로메탄 200 mL와 비등석 혹은 작은 유리조각 2개를 넣고 추출기와 냉각기를 연결한 후, 시간당 4 ∼ 6회 추출 용매가 속실렛 추출기를 회전할 수 있도록 플라스크 온도를 조절하고 16시간 동안 추출한다. 추출기와 냉각기 그리고 추출기와 플라스크와의 연결 부분을 점검하여 용매 누출 및  공기 중의 수분이 들어가지 주의해야 한다.

6.2.4  추출이 완료되었을 때, 추출용매와 속실렛 추출기 및 플라스크를 세척한 디클로로메탄 용매를 혼합하고 회전증발농축기를 이용하여 부피가 2 ∼ 3 mL로 되도록 농축한다.

6.2.5  농축된 플라스크에 노말-헥산 5 mL를 첨가하여 2분간 흔들어 디클로로메탄과 노말-헥산이 잘 섞이게 한다.

6.3  정제

6.3.1  미리 세척된 유리관 컬럼에 노말-헥산 40 mL를 채운 상태에서 무수황산나트륨 2 cm를 채우고 그 위에 1 % 함수 알루미나 10 g을 채운 다음, 다시 5 % 함수 실리카겔 20 g을 습식 충진한다. 그런 다음, 최상단에 무수황산나트륨 3 cm 정도를 다시 습식 충진하고 노말-헥산을 상단 무수황산나트륨층 바로 위 1 mm까지 흘려내린 후 컬럼 콕크를 잠궈 컬럼충진을 완성한다.

6.3.2  위 6.2.5에서 준비된 농축시료를 파스테르 피펫을 사용하여 컬럼 상부에 옮긴 후 코크를 열어 용매를 흘러준다. 농축시료가 무수황산나트륨층 아래로 흘러 들어가게 되면 노말-헥산으로 농축시료 플라스크를 세척하여 컬럼에 옮긴다.

6.3.3  컬럼 아래에 250 mL 가지 달린 플라스크 3개를 준비하여 다음과 같이 서로 다른 유기용매를 3 mL/min 속도로 컬럼 통과시켜 3개의 분액을 얻는다. 용매 유출이 느리게 되면 플라스크에 진공을 걸어 유속을 유지하도록 한다.

분액 1) 100 % 노말-헥산 용매로부터 얻어진 분액

분액 2) 10 % 디클로로메탄 ? 90 % 노말-헥산 혼합용액으로부터 얻어진 분액

분액 3) 15 % 디에틸에테르 ? 85 % 노말-헥산 혼합용액으로부터 얻어진 분액

6.3.4  분액 1)은 2 ∼ 3 mL로 농축 후 환원 구리를 넣어 색이 검은색으로 되도록 탈황시킨 다음, 분액 2)와 3)을 합친 후 회전증발기를 이용하여 다시 2 ∼ 3 mL 부피로 농축하고, 최종 GC 바이알에 시료 부피 1 mL가 되도록 질소농축한 다음, GC 내부표준물질 TCMX를 20 ng을 첨가한 후에 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μl를 GC 시료 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 유기염소계 농약의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간과 비교하여 각각의 성분을 지정하고, 각 피크의 면적을 측정하여 검량선 및 감응계수로부터 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

그림 1. 유기염소계농약 분석절차

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

8.1  검출한계

증류수 1 L에 표준용액을 정량한계 (1 ng/L)만큼 첨가한 시료 7개를 준비하고, 각 시료에 대하여 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 검출한계로 한다.

8.2  검량선 작성 및 검증

8.2.1  검량선 작성 및 감응계수 계산: 각 유기염소계 농약의 표준용액을 노말-헥산으로 희석하여 적당한 농도 범위에서 적어도 4가지 농도로 검정용 표준용액을 제조한다. 검량선 x축은 내부표준물질(IS)의 양에 대한 표준물질(S)의 양을 나타내고 y축은 내부표준물질과 표준물질의 기체크로마토그램에서 얻어진 면적의 비로 나타낸다. 두 축의 그래프에서 얻어진 기울기를 감응계수(response factor, RF)라 하며 분석대상인 유기염소계 농약의 표준물질에 대하여 각각의 RF 값을 얻는다.

그림 2. 표준물질의 검량선

                            (식 1)

As: 표준물질에 대한 GC 신호의 면적 

AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

Is: 표준물질에 대한 양 (ng)

IIS: 내부표준물질에 대한 양 (ng)

8.2.2  검량선 검증: 얻어진 검량선식은 측정 당일에 한 개 이상의 검정용 표준용액을 분석하여 검증해야 한다. 검증의 빈도는 검출기의 종류에 따라 다르다. 만약 검증결과 분석되는 성분의 농도가 ± 15 % 이상일 경우 검정관계식을 새로 구해야 한다.

8.3  정확도

8.3.1  대체표준물질의 회수율

8.3.1.1  6.2 및 6.3항의 전처리과정에서 대체표준물질에 대한 감응계수(RFSU)를 8.2.1 항과 같은 방법으로 각각 얻는다.

8.3.1.2  실제 시료 속에 첨가된 대체표준물질(SU)과 GC 내부표준물질(IS)의 기체 크로마토그램의 신호 면적과 첨가된 GC 내부표준물질의 양으로부터 회수된 대체표준물질의 양(ISU, ng)을 아래와 같은 식으로부터 계산한다.

                            (식 2)

RFSU: 각 검증대체 물질에 대한 감응계수 

AIS: 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS: 내부표준물질에 대한 양 (ng)

ASU: 대체표준물질에 대한 GC 신호의 면적

ISU: 대체표준물질에 대한 양 (ng)

8.3.1.3  회수율은 실제 시료에 첨가된 대체표준물질의 양에 대한 GC 분석결과 계산된 양의 비율로 나타낸다.

         (식 3)

8.3.2  인증표준물질의 회수율 측정

인증표준물질 1 g에 대하여, 위 6항 시험방법에 의한 분석대상 유기염소계농약의 값과 인증표준물질에 명시된 값을 비교하여 회수율을 검증한다.

        (식 4)

8.3.3  시료에 첨가된 표준물질의 회수율

저농도의 유기염소계 농약을 가진 해수시료에, 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후 8.3.1 항과 동일한 방법으로 실험을 수행한 후 회수된 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

      (식 5)

8.3.4  회수율이 60 ∼ 130 % 이내에 들어오지 않을 경우, 계산과정과 분석과정의 문제점을 점검해야 한다. 특히, 회수율 검정을 위한 내부표준물질이 분해되었거나 오염정도와 기기의 상태를 점검해 보아야 한다. 문제가 있는 시료에 대해서는 재분석을 실시한다.

8.4  정밀도

정밀도는 규정된 조건하에서 측정된 값들 사이에 근접 정도를 나타내는 것으로 검량선에 사용되는 농도범위에서 중간 농도에 해당되는 표준용액을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다. 이 실험으로부터 얻은 평균값과 표준편차로부터 변동계수를 구하고 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

                      (식 6)

CV : 변동계수 (Coefficient of variation)

SD : 표준 편차 (Standard Deviation)

x‘ : 평균값

9. 결과

9.1  농도계산

분석대상의 각 유기염소계 농약의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                       (식 7)

RF: 각 유기염소계 농약에 대한 감응계수

AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

AOCPs: 각 유기염소계 농약에 대한 GC 신호의 면적

w: 분석에 사용된 퇴적물의 양(g)

C: 퇴적물 1 g에 들어 있는 유기염소계 농약의 농도(ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각 유기염소계 농약의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  위 6.2항에서 사용되어진 속실렛 추출법 대신 가속용매추출법(Accelerated Solvent Extraction, ASE) 등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 8.3항의 정확도를 반드시 제시해야 한다.

10.2  위 4.7.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다.

10.3  위 6.3.4항의 방해물질인 황 제거를 위한 구리 사용은 실리카/알루미나 컬럼 단계 이전에 별도의 단계로 실시하여도 무방하다.

10.4  유기염소계 농약을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인이 발생할 수 있다.

10.4.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.4.2  매질에 의한 방해: 유기용매 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석 결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있으며, 이러한 문제는 기기분석 전에 정제과정을 통하여 제거할 수 있다.

10.4.3  유기염소계 농약은 광분해 혹은 퇴적물 중의 미생물 등에 의해 분해될 우려가 있으므로 미리 세척된 차광용기를 사용해야 한다.

10.4.4  전자포획검출기를 이용한 분석법에서는 퇴적물 중 황에 의한 방해를 심각하게 받을 수 있으므로 반드시 구리를 이용하여 황을 제거해야 한다.

10.5  내부표준물질의 회수율 및 농도 계산 시, 사용하는 검량식(8.2.1항)은 기기분석 사용자에 따라 절편을 추가하거나 지수함수를 사용할 수도 있다.

                       (식 8)

                    (식 9)

                  (식 10)

제22항 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)

1. 측정원리

해저퇴적물 중의 다환방향족탄화수소 화합물(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)을 고순도 디클로로메탄으로 추출한 후, 추출액 중 황과 같은 분석방해물질 등을 환원구리 및 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제한 후 기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/Mass Spectrometer, GC/MS)를 이용하여 정량ㆍ정성분석을 실시한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/Mass Spectrometer)에 의한, 퇴적물 중 각 다환방향족탄화수소(PAHs)의 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 2 ng/g(건중량)이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기 재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 덮개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어플라스크 (pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL, 250 mL 용량

3.1.3  속실렛 추출기: 유리섬유 혹은 텀블러(Tumbler) 사용. 속실렛 추출기로 예비 세정하거나 혹은 450 °C에서 5시간 가열처리하여 사용

3.1.4  냉각기

3.1.5  유리 컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브,

3.1.8  막자와 막자사발, 시약 스푼, 비등석

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소농축기

3.2.4  저울: 퇴적물 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.5  기체크로마토그래피

표 1. 기체크로마토그래피/질량분석기의 PAHs 분석조건의 예

┌───────────┬──────────────────────┐

│검출기                │질량분석기(MS)                              │

├───────────┼──────────────────────┤

│컬럼                  │모세관 컬럼                                 │

│                      │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)│

├───────────┼──────────────────────┤

│충전제                │5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane        │

├───────────┼──────────────────────┤

│운반기체              │헬륨(99.999 %)                              │

├───────────┼──────────────────────┤

│운반기체 유속         │1.0 mL/분(등속)                             │

├───────────┼──────────────────────┤

│검출기 기체 및 유속   │질소(99.999 %), 30 mL/분                    │

├───────────┼──────────────────────┤

│시료주입구 온도       │300 °C                                     │

├───────────┼──────────────────────┤

│오븐 초기온도         │60 °C에서 2분간 유지                       │

├───────────┼──────────────────────┤

│오븐 온도 1차 승온속도│분당 6 °C로 300 °C까지 승온 후 13분간 유지│

├───────────┼──────────────────────┤

│MS 이온화 전압        │70 eV                                       │

├───────────┼──────────────────────┤

│모니터링 방법         │SIM(Selected Ion Monitoring) mode           │

└───────────┴──────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.1.3  디에틸에테르: 잔류농약 분석용 용매

4.2  구리: 유기원소 분석용 구리 (60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 염산 원액으로 세척한 다음, 흐르는 증류수에 염산을 씻어낸다. 그 후 메탄올로 수회 세척하고 다시 노말-헥산으로 수회 세척하여 노말-헥산 중에 보관

4.3  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.4  1 % 함수 알루미나: 컬럼크로마토그래피용 알루미나를 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후 99 g을 차광용기에 넣고 실온까지 냉각한다. 차광용기에 유리 피펫을 이용하여 증류수 1 mL를 첨가하고 마개를 막고 충분히 혼합

4.5  5 % 함수 실리카겔: 컬럼크로마토그래피용 실리카겔을 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 95 g을 갈색 삼각플라스크에 달아 실온까지 냉각한다. 실리카겔을 교반하면서 피펫으로 증류수 5 mL를 넣고 마개를 막아 충분히 혼합

4.6  정제수: 증류수 또는 화학분석용 물을 노말-헥산으로 2회 씻어 사용

4.7  표준용액

4.7.1  표준물질(standard, STD): 분석대상 PAH 표준물질(순도 95 % 이상)을 노말-헥산 용액으로 3개 이상의 서로 다른 농도로 조제하여 검정에 사용한다.

Naphthalene, Acenaphthylene, Acenaphthene, Fluorene, Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Pyrene, Benzo[a]anthracene, Chrysene, Benzo[b]fluoranthene, Benzo[k]fluoranthene, Benzo[a]pyrene, Indeno[1,2,3-cd]pyrene, Dibenzo[a,h]anthracene,  Benzo[ghi]perylene, 2-methylnaphthalene, 1-methylnaphthalene, 2,6-dimethylnaphthalene, 2,3,5-trimethylnaphthalene, Biphenyl, 1-methylphenanthrene, Benzo[e]pyrene, Perylene

4.7.2  대체표준물질(surrogate, SU): 퇴적물 내 PAHs의 회수 정도를 검정하기 위한 목적으로 Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Chrysene-d12, Perylene-d12를 대체표준물질로 사용하며 노말-헥산 용매에 녹여 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체 크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 Terphenyl-d14를 내부표준물질로 사용하며 그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 퇴적물인증 표준물질은 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Environment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology) 등에서 구매하여 사용한다. 예: IAEA-417, IAEA-383, IAEA-408, SRM-1941a, SRM-1944 등

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  퇴적물 시료는 스테인리스 스푼을 사용하여 표층 2 cm 이내의 퇴적물을 취해 250 mL의 차광용기에 담아 즉시 -20 °C 이하로 냉동 보관한다.

5.2  냉동된 상태의 퇴적물 시료는 분석을 위하여 상온에서 해동한 후 시약 스푼으로 균질화하여 사용한다.

6. 시험방법

6.1  함수율 측정

사용될 퇴적물 2 g에 대하여 제4장 제2항 함수율의 측정방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  균질화된 퇴적물 10 g 및 40 g 이상의 무수황산나트륨을 막자사발에 넣어 혼합하고, 30분 정도 상온에 둔 상태로 수분을 완전히 제거하여 퇴적물이 가루 형태가 되도록 한다.

6.2.2  위의 준비된 퇴적물에 대체표준물질(Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Chrysene-d12, Perylene-d12) 100 ng을 첨가하여 균일하게 혼합하고 최종 준비된 퇴적물을 속실렛 추출기에 넣는다.

6.2.3  추출기 아래 500 mL 넓적바닥 플라스크에 디클로로메탄 200 mL와 비등석 혹은 작은 유리조각 2개를 넣고 제21항 유기염소계 농약(6.2.3)에서와 같은 방법으로 추출한다.

6.2.4  추출이 완료되었을 때 추출용매와 속실렛 추출기 및 플라스크를 세척한 디클로로메탄 용매를 혼합하고 회전증발농축기를 이용하여 부피가 2 ∼ 3 mL로 되도록 농축한다.

6.2.5  농축된 플라스크에 노말-헥산 5 mL를 첨가하여 2분간 흔들어 디클로로메탄과 노말-헥산이 잘 섞이게 한다.

6.3  정제

6.3.1  미리 세척된 유리관 컬럼에 노말-헥산 40 mL를 채운 상태에서 무수황산나트륨 2 cm를 채우고 그 위에 1 % 함수 알루미나 10 g을 채운 다음, 다시 5 % 함수 실리카겔 20 g을 습식 충진한다. 그런 다음, 최상단에 무수황산나트륨 3 cm 정도를 다시 습식 충진하고 노말-헥산을 상단 무수황산나트륨층 바로 위 1 mm까지 흘려내린 후 컬럼 콕크를 잠궈 컬럼충진을 완성한다.

6.3.2  위 6.2.5에서 준비된 농축시료를 파스테르 피펫을 사용하여 컬럼 상부에 옮긴 후 코크를 열어 용매를 흘러준다. 농축시료가 무수황산나트륨층 아래로 흘러 들어가게 되면 노말-헥산으로 농축시료 플라스크를 세척하여 컬럼에 옮긴다.

6.3.3   컬럼 아래에 250 mL 가지 달린 플라스크 3개를 준비하여 다음과 같이 서로 다른 유기용매를 3 mL/min 속도로 컬럼 통과시켜 3개의 분액을 얻는다. 용매 유출이 느리게 되면 플라스크에 진공을 걸어 유속을 유지하도록 한다.

분액 1) 100 % 노말-헥산 용매로부터 얻어진 분액

분액 2) 10 % 디클로로메탄 ? 90 % 노말-헥산 혼합용액으로부터 얻어진 분액

분액 3) 15 % 디에틸에테르 ? 85 % 노말-헥산 혼합용액으로부터 얻어진 분액

6.3.4  분액 1)은 2 ∼ 3 mL으로 농축 후 환원 구리를 넣어 색이 검은색으로 되도록 탈황시킨 다음, 분액 2)와 3)을 합친 후 회전증발기를 이용하여 다시 2 ∼ 3 mL 부피로 농축하고, 최종 GC 바이알에 시료 부피 1 mL가 되도록 질소농축한 다음, GC 내부표준물질 Terphenyl-d14를 20 ng 첨가한 후에 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μl를 GC 시료 주입부에 주입한다

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 PAHs의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간을 비교하고 표 2에 있는 측정 이온값으로 성분을 확인 및 각 피크의 면적을 측정하여 검량선 및 감응계수로부터 농도를 계산한다.

표 2. PAHs 분석에 이용한 질량분석기의 정량ㆍ정성 이온값

┌────────────────┬──────┬─────────┐

│24 PAHs                         │Target(m/z) │Confirmation(m/z) │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Naphthalene                     │128         │127               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│2-Methyl naphthalene            │142         │141               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│1-Methyl naphthalene            │142         │141               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Biphenyl                        │154         │152               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│2,6-Dimethyl naphthalene        │156         │154               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Acenaphthylene                  │152         │151               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Acenaphthene                    │154         │153, 152          │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│2,3,5-Trimethyl naphthalene     │170         │                  │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Fluorene                        │166         │164               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Phenanthrene                    │178         │176               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Anthracene                      │178         │176               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│1-Methylphenanthrene            │192         │191               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Fluoranthene                    │202         │101               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Pyrene                          │202         │101               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Benz[a]anthracene               │228         │226               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Chrysene                        │228         │226               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Benzo[b]fluoranthene            │252         │250               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Benzo[k]fluoranthene            │252         │250               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Benzo[e]pyrene                  │252         │250               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Benzo[a]pyrene                  │252         │250               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Perylene                        │252         │250               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Indeno[1,2,3-cd]pyrene          │276         │138               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Dibenz[a,h]anthracene           │278         │139               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Benzo[ghi]perylene              │276         │138               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Surrogate standard(대체표준물질)│Target(m/z) │Confirmation(m/z) │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Naphthalene-d8                  │136         │                  │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Acenaphthene-d10                │164         │162               │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Phenanthrene-d10                │188         │                  │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Terphenyl-d14                   │244         │                  │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Chrysene-d12                    │240         │                  │

├────────────────┼──────┼─────────┤

│Perylene-d12                    │264         │                  │

└────────────────┴──────┴─────────┘

7. 분석절차 흐름도

그림 1. PAHs 분석절차

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

제21항 유기염소계 농약 8. 정도평가/정도관리에 따른다.

9. 결과

9.1  농도계산

분석 대상의 각 PAHs의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                      (식 1)

RF: 각 PAH 표준물질에 대한 감응계수 

AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

APAHs: 각 PAHs에 대한 GC 신호의 면적

w: 분석에 사용된 퇴적물의 양(g)

C: 퇴적물 1 g에 들어 있는 PAHs의 농도(ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각 PAH의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  위 6.2항에서 사용되어진 속실렛 추출법 대신 가속용매추출법 (Accelerated Solvent Extraction, ASE)등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 정확도(제21항의 8.3)를 반드시 제시해야 한다.

10.2  위 4.7.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다.

10.3  위 6.3.4항의 방해물질인 황 제거를 위한 구리 사용은 실리카/알루미나 컬럼 단계 이전에 별도의 단계로 실시하여도 무방하다.

10.4  PAHs 성분을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인이 발생할 수 있다.

10.4.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.4.2  매질에 의한 방해: 유기용매 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있으며, 이러한 문제는 기기분석 전에 정제과정을 통하여 제거할 수 있다.

10.4.3  PAHs는 광분해 혹은 퇴적물 중의 미생물 등에 의해 분해될 우려가 있으므로 미리 세척된 차광용기를 사용해야 한다.

10.4.4  질량분석기를 이용한 분석법에서는 퇴적물 중 황에 의한 방해를 심각하게 받을 수 있으므로 반드시 구리를 이용하여 황을 제거해야 한다.

10.5  내부표준물질의 회수율 및 농도 계산 시, 사용하는 검량식은 기기분석 사용자에 따라 절편을 추가하거나 지수함수를 사용할 수도 있다.

                  (식 2)

                  (식 3)

                 (식 4)

제23항 폴리클로리네이티드비페닐(Polychlorinated Biphenyls, PCBs)

1. 측정원리

해저퇴적물 중의 Polychlorinated Biphenyls(PCBs)를 고순도 디클로로메탄으로 추출한 후에 속실렛 추출법으로 추출, 농축한 후 이 농축액을 실리카겔-알루미나 컬럼을 통과시키고 또한 황 성분을 제거하기 위하여 환원 구리에 농축액을 처리한 다음 전자포획검출기(Electron Capture Detector, ECD)가 부착된 기체크로마토그래피를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피를 이용한 퇴적물 중 총 PCBs의 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1.0 ng/g(건중량)이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며, 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기 재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 덮개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어 플라스크(pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL, 250 mL 용량

3.1.3  속실렛 추출기: 유리섬유 혹은 텀블러(Tumbler) 사용. 속실렛 추출기로 예비 세정하거나 혹은 450 °C에서 5시간 가열처리하여 사용

3.1.4  냉각기

3.1.5  유리 컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기

3.1.8  파스테르 피펫

3.1.9  실리콘 벌브

3.1.10  막자와 막자사발

3.1.11  시약 스푼

3.1.12  비등석

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소농축기

3.2.4  저울: 퇴적물 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.5  기체크로마토그래피

표 1. 기체크로마토그래피의 PCBs 분석조건의 예

┌───────────┬────────────────────────┐

│검출기                │전자포획검출기(ECD) 혹은 질량분석기(MS)         │

├───────────┼────────────────────────┤

│컬럼                  │모세관 컬럼                                     │

│                      │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)    │

├───────────┼────────────────────────┤

│충전제                │5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane            │

├───────────┼────────────────────────┤

│운반기체              │헬륨(99.999 %)                                  │

├───────────┼────────────────────────┤

│운반기체 유속         │1.5 mL/분(등속)                                 │

├───────────┼────────────────────────┤

│검출기 기체 및 유속   │질소(99.999 %), 30 mL/분 (ECD 사용시)           │

├───────────┼────────────────────────┤

│시료주입구 온도       │250 °C                                         │

├───────────┼────────────────────────┤

│검출기 온도           │320 °C (ECD 사용시)                            │

├───────────┼────────────────────────┤

│오븐 초기온도         │100 °C에서 1분간 유지                          │

├───────────┼────────────────────────┤

│오븐 온도 1차 승온속도│분당 5 °C로 140 °C까지 승온 후 1분간 유지     │

├───────────┼────────────────────────┤

│오븐 온도 2차 승온속도│분당 1.5 °C로 250 °C까지 승온 후 1분간 유지   │

├───────────┼────────────────────────┤

│오븐 온도 3차 승온속도│분당 10 °C                                     │

├───────────┼────────────────────────┤

│오븐 최종온도         │300 °C에서 5분간 유지                          │

├───────────┼────────────────────────┤

│MS 이온화 전압        │70 eV (MS 사용시)                               │

├───────────┼────────────────────────┤

│모니터링 방법         │SIM(Selected Ion Monitoring) mode, (MS 사용 시) │

└───────────┴────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.2  구리: 유기원소 분석용 구리 (60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 염산 원액으로 세척한 다음, 흐르는 증류수에 염산을 씻어낸다. 그 후 메탄올로 수회 세척하고 다시 노말-헥산으로 수회 세척하여 노말-헥산 중에 보관

4.3  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.4  1 % 함수 알루미나: 컬럼크로마토그래피용 알루미나를 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후 99 g을 차광용기에 넣고 실온까지 냉각한다. 차광용기에 유리 피펫을 이용하여 증류수 1 mL를 첨가하고 마개를 막고 충분히 혼합

4.5  5 % 함수 실리카겔: 컬럼크로마토그래피용 실리카겔을 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 95 g을 갈색 삼각플라스크에 달아 실온까지 냉각한다. 실리카겔을 교반하면서 피펫으로 증류수 5 mL를 넣고 마개를 막아 충분히 혼합

4.6  정제수: 증류수 또는 화학분석용 물을 노말-헥산으로 2회 씻어 사용

4.7  표준용액

4.7.1  표준용액(standard solution, STD): 분석하고자 하는 22종의 고순도의 PCBs를 말하며 각 PCBs에 대한 검량선 작성에 사용된다.

PCB8, PCB18, PCB28, PCB29, PCB44, PCB52, PCB66, PCB87, PCB101, PCB105, PCB110, PCB 118, PCB128, PCB138, PCB153, PCB170, PCB 180, PCB187, PCB195, PCB200, PCB206, PCB209

검량선 작성을 위하여 22종 PCBs가 들어 있는 혼합 표준용액을 3개 이상의 서로 다른 농도로 만든다.

4.7.2  대체표준물질(surrogate, SU): 해수시료로부터 분석대상인 PCBs의 회수 정도를 검정하기 위하여 사용된다. 3종류의 내부표준물질 [DBOFB (Dibromooctaflurobiphenyl), PCB103, PCB198]이 사용되며 노말-헥산 용매에 녹여 각각의 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 Tetrachloro-m-xylene(TCMX)가 내부표준물질로 사용되며그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 퇴적물인증 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Environment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC(National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다(예: IAEA-417, NIST1941a, NIST1944, DX-3, EC-4 등).

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  퇴적물 시료는 스테인리스 스푼을 사용하여 표층 2 cm 이내의 퇴적물을 취해 250 mL의 차광용기에 담아 즉시 -20 °C 이하로 냉동 보관한다.

5.2  냉동된 상태의 퇴적물 시료는 분석을 위하여 상온에서 해동한 후 시약 스푼으로 균질화하여 사용한다.

6. 시험방법

6.1  함수율 측정

사용될 퇴적물 2 g에 대하여 제4장 제2항 함수율의 측정방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  균질화된 퇴적물 10 g 및 40 g 이상의 무수황산나트륨을 막자사발에 넣어 혼합하고, 30분 정도 상온에 둔 상태로 수분을 완전히 제거하여 퇴적물이 가루 형태가 되도록 한다.

6.2.2  위의 준비된 퇴적물에  대체표준물질 DBOFB (Dimbromooctafluorobiphenyl), PCB103, PCB198을 각각 100 ng씩 첨가하여 균일하게 혼합하고 최종 준비된 퇴적물을 속실렛 추출기에 넣는다.

6.2.3  추출기 아래 500 mL 넓적바닥 플라스크에 디클로로메탄 200 mL와 비등석 혹은 작은 유리조각 2개를 넣고 제21항 유기염소계 농약(6.2.3)에서와 같은 방법으로 추출한다.

6.2.4  추출이 완료되었을 때 추출용매와 속실렛 추출기 및 플라스크를 세척한 디클로로메탄 용매를 혼합하고 회전증발농축기를 이용하여 부피가 2 ∼ 3 mL로 되도록 농축한다.

6.2.5  농축된 플라스크에 노말-헥산 5 mL를 첨가하여 2분간 흔들어 디클로로메탄과 노말-헥산이 잘 섞이게 한다.

6.3  정제

6.3.1  미리 세척된 유리관 컬럼에 노말-헥산 40 mL를 채운 상태에서 무수황산나트륨 2 cm를 채우고 그 위에 1 % 함수 알루미나 10 g을 채운 다음, 다시 5 % 함수 실리카겔 20 g을 습식 충진한다. 그런 다음, 최상단에 무수황산나트륨 3 cm 정도를 다시 습식 충진하고 노말-헥산을 상단 무수황산나트륨층 바로 위 1 mm까지 흘려내린 후 컬럼 콕크를 잠궈 컬럼충진을 완성한다.

6.3.2  위 6.2.5에서 준비된 농축시료를 파스테르 피펫을 사용하여 컬럼 상부에 옮긴 후 코크를 열어 용매를 흘러준다. 농축시료가 무수황산나트륨층 아래로 흘러 들어가게 되면 노말-헥산으로 농축시료 플라스크를 세척하여 컬럼에 옮긴다.

6.3.3  컬럼 아래에 250 mL 가지 달린 플라스크를 놓고 100 % 노말-헥산 100 mL를 3 mL/min 속도로 컬럼을 통과시킨다. 용매 유출이 느리게 되면 플라스크에 진공을 걸어 유속을 유지하도록 한다.

6.3.4  회전증발기에 의해 2 ∼ 3 mL로 농축 후, 환원 구리를 넣어 검은색이 되도록 탈황시킨 다음, GC 바이알에 옮긴다. 그 후 최종 GC 바이알에 시료 부피 1 mL가 되도록 질소농축한 다음, GC 내부표준물질 TCMX를 20 ng 첨가한 후에 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μl를 GC 시료 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 PCBs의 표준물질의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간과 비교하여 각각의 성분을 지정하고 각 피크의 면적을 측정하여 검량선 및 감응계수로부터 농도를 계산한다.

6.4.3  PCBs 표준물질에 대하여 농도별 관계식을 사용하여 퇴적물 중 각 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

그림 1. PCBs 분석절차

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

제21항 유기염소계 농약 8. 정도평가/정도관리에 따른다.

9. 결과

9.1  농도계산

분석대상의 각 PCBs의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                       (식 1)

RF: 각 PCB 표준물질에 대한 감응계수

AIS : GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS : GC 내부표준물질에 대한 양 (ng)

APCBs : 각 PCBs에 대한 GC 신호의 면적

w: 분석에 사용된 퇴적물의 양 (g) 

C: 퇴적물 1 g에 들어 있는 PCBs의 농도 (ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각 PCB의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r²)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  위 6.2항에서 사용되어진 속실렛 추출법 대신 가속용매추출법 (Accelerated Solvent Extraction, ASE)등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 정확도(제21항의 8.3)를 반드시 제시해야 한다.

10.2  위 4.7.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다. 전자포획검출기 대신 질량분석검출기를 사용할 경우, 13C로 표지된 PCB 동족체(congener)를 사용할 수 있다.

10.3  위 6.3.4 항의 방해물질인 황 제거를 위한 구리 사용은 실리카/알루미나 컬럼 단계 이전에 별도의 단계로 실시하여도 무방하다.

10.4  PCB 성분을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인이 발생할 수 있다.

10.4.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.4.2  매질에 의한 방해: 유기용매 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있으며, 이러한 문제는 기기분석 전에 정제과정을 통하여 제거할 수 있다.

10.4.3  전자포획검출기를 이용한 분석법에서는 퇴적물 중의 황에 의한 방해를 심각하게 받을 수 있으므로 반드시 구리를 이용하여 황을 제거해야 한다.

10.5  내부표준물질의 회수율 및 농도 계산 시, 사용하는 검량식은 기기분석 사용자에 따라 절편을 추가하거나 지수함수를 사용할 수도 있다.

                 (식 2)

                 (식 3)

                (식 4)

제24항 유기주석화합물(Butyltins, BTs)

1. 측정원리

해저퇴적물 중의 BTs(butyltins)은 0.1 % 트로폴론이 함유된 디클로로메탄으로 추출하고 프로필마그네슘 브로마이드(propylmagnesium bromide)를 가하여 그리그나드 (Grignard) 반응으로 유도체를 만든 후, 플로리실 컬럼으로 정제하고 불꽃광도검출기(Flame Photometric Detector, FPD)가 부착된 기체크로마토그래피로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피를 이용한 퇴적물 중 총 BTs의 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1.0 ng/g(건중량)이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 잘 세척하고, 그 다음 건조기에서 건조하여 보관하며, 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 덮개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어플라스크 (pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL, 250 mL 용량

3.1.3  원심분리관: 50 mL 용량으로 시료 추출을 위해 사용

3.1.4  유리 컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이, 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.5  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.6  유리깔때기

3.1.7  파스테르 피펫

3.1.8  실리콘 벌브

3.1.9  막자와 막자사발

3.1.10  시약 스푼

3.1.11  비등석

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소농축기

3.2.4  와류혼합기(vortex mixer): 시험관의 세척 혹은 시료와 대체표준물질을 균질화시킬 때 사용한다.

3.2.5  원심분리기: 4,000 rpm에서 사용 가능하고 15 mL 및 50 mL 원심분리관 사용이 가능한 기기

3.2.6  저울: 퇴적물 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.7  기체크로마토그래피

표 1. 기체크로마토그래피의 유기주석화합물 분석조건의 예

┌────────┬───────────────────────┐

│검출기          │불꽃광도검출기(FPD), 주석 필터 부착           │

├────────┼───────────────────────┤

│컬럼            │모세관 컬럼                                   │

│                │(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)  │

├────────┼───────────────────────┤

│충전제          │100 % methyl polysiloxane                     │

├────────┼───────────────────────┤

│운반기체        │헬륨(99.999 %)                                │

├────────┼───────────────────────┤

│운반기체 유속   │1.5 mL/분(등속)                               │

├────────┼───────────────────────┤

│검출기 기체     │수소(99.999 %), 공기(99,999 %)                │

├────────┼───────────────────────┤

│시료주입구 온도 │225 °C                                       │

├────────┼───────────────────────┤

│검출기 온도     │250 °C                                       │

├────────┼───────────────────────┤

│오븐 초기온도   │50 °C에서 5분간 유지                         │

├────────┼───────────────────────┤

│오븐 승온속도   │분당 20 °C로 240 °C까지 승온 후 10 분간 유지│

└────────┴───────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.2  0.1 % 트로폴론(tropolone, C7H6O2) 용액: 트로폴론 1 g을 1 L의 디클로로메탄에 녹여 만들고, 유리 차광용기에 보관하여 사용

4.3  1 M 프로필마그네슘 브로마이드(propylmagnesium bromide)용액: 상용의 1 M 프로필마그네슘 브로마이드 용액으로 반드시 냉장 보관하여 사용

4.4  50 % 염산 용액: 부피비로 염산과 초순수를 1 : 1로 만들어 유리 차광용기에 넣어 보관하여 사용

4.5  0.4 N 황산 용액: 황산 12 mL를 초순수로 1 L로 정용하여 유리용기에 넣어 보관하여 사용

4.6  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.7  플로리실: 80 ∼ 100 mesh 플로리실(florisil)을 450 °C에서 4시간 이상 활성화시킨 후 120 °C 건조기에 보관하고, 컬럼을 만들기 직전에 꺼내 상온으로 식힌 후 사용

4.8  표준용액

4.8.1  표준용액(standard solution, STD): 분석하고자 하는 트리부틸틴 클로라이드(tributyltin chloride, C12H27Sn+Cl-), 디부틸틴 클로라이드(dibutyltin chloride, C8H19Sn+Cl-), 모노부틸틴 클로라이드 (monobutyltin chloride, C4H11Sn+Cl-) 각각 10 mg을 노말-헥산 100 mL에 녹인 후 이 용액을 다시 노말-헥산으로 100배 희석시켜 최종농도 1 ppm의 표준용액을 만든다. 이 표준용액을 냉동 보관하여 사용하며 유효 기간은 3개월이다.

4.8.2  대체표준물질(surrogate, SU): 해수 시료로부터 분석대상인 BT의 추출과정 및 시험과정에서의 회수율을 검정하기 위하여 대체표준물질인 트리펜틸틴 클로라이드(tripentyltin chloride, C15H33Sn+Cl-)을 200 ng/mL 농도로 만든다. 이 표준용액을 냉동보관하여 사용하며 유효 기간은 3개월이다.

4.8.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 테트라부틸틴(tetrabuytltin, C16H36Sn)을 내부표준물질로 사용하여 그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다. 이 표준용액을 냉동보관하여 사용하며 유효 기간은 3개월이다.

4.8.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 퇴적물 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Environment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC(National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다. (예: PACS-1, BCR462, BCR646 등)

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 채취된 퇴적물 시료는 유리용기에 담아 -20 °C 암소에 보관한다.

5.2  퇴적물 시료는 화학분석 전 4 °C 이하의 암소에서 해동시켜 분석에 이용한다.

6. 시험방법

6.1  함수율 측정

사용될 퇴적물 2 g에 대하여 제4장 제2항 함수율의 측정방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  냉동된 시료를 동결건조 시킨 후 패각을 포함한 이물질을 제거한 다음, 막자사발을 이용하여 균일하게 분쇄하고 체질(120 μm mesh)한다.

6.2.2  균질화된 퇴적물 5 g을 원심분리관에 넣고 대체표준물질인 트리펜틸주석 클로라이드(tripentyltin chloride) 100 ng을 퇴적물에 섞어 준다.

6.2.3  시료가 담긴 원심분리관에 50 % 염산 용액 10 mL를 첨가하고 잘 섞은 후 30분간 방치한다. 

6.2.4  시료가 담긴 원심분리관에 0.1 % 트로폴론이 함유된 디클로로메탄 20 mL를 가하고 와류혼합기로 섞은 후에 교반기를 사용하여 3시간 동안 교반하여 추출한다.

6.2.5  교반이 끝난 원심분리관을 원심분리기에 넣고 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한다.

6.2.6  유기용매층 4 mL를 분취하여 부피 0.5 mL가 되도록 질소농축한 다음, 노말-헥산을 반복적으로 첨가ㆍ 농축하여 용매를 노말-헥산으로 치환한다.

6.3  유도체화 반응

6.3.1  농축액에 1 M 헥실마그네슘 브로마이드 0.5 mL를 가해 30초간 교반 후 30분간 35 °C의 항온 수조에서 유도체화한다.

6.3.2  반응 종료 후 0.4 N 황산 용액 4 mL를 가하여 중화시킨 후, 30초간 교반하여 유기용매층을 분취한다.

6.3.3  남은 층에 다시 노말-헥산 5 mL을 가하여 10분간 진탕해서 앞에서 얻어진 유기층과 합친 후 플로리실 컬럼을 통과시켜 정제한다.

6.3.4  컬럼을 세척하기 위하여 추가로 노말-헥산 10 mL을 컬럼에 통과시킨 후, 얻어진 용출액은 고순도 질소 가스로 농축하여 측정용 시료의 부피가 1 mL가 되도록 하며 GC 내부표준물질 테트라부틸틴(tetrabutyltin) 20 ng을 첨가하여 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μL를 기체크로마토크래피의 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 BTs 표준물질 유도체의 머무름시간을 비교하여 성분을 확인하고 각 성분의 피크 면적을 측정한다.

6.4.3  BTs 표준물질 유도체에 대하여 농도별 관계식을 사용하여 해수시료 중 각 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

그림 1. 유기주석화합물(BTs) 분석절차

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

제21항 유기염소계 농약 8. 정도평가/정도관리에 따른다.

9. 결과

9.1  농도계산

분석대상의 각 BTs의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                      (식 1)

RF: 각 BT 표준물질에 대한 감응계수

AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

ABTs : 각 BTs에 대한 GC 신호의 면적

w: 분석에 사용된 퇴적물의 양(g)

C: 퇴적물 1 g에 들어 있는 BTs의 농도(ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어 있는 각 BT의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  위 4.8.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다. 대신 질량분석검출기를 사용할 경우 2H로 표지된 유기주석화합물을 사용할 수 있다.

10.2  불꽃광도검출기의 경우 황에 의한 간섭이 없으나, 질량분석검출기를 사용할 경우 구리 등을 사용하여 방해물질인 황을 제거해야 한다.

10.3  유기주석화합물을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인이 발생할 수 있다.

10.3.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.3.2  매질에 의한 방해: 용매추출 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있다. 또한, 황에 의한 방해를 받을 수 있으나 이는 GC-FPD(불꽃광도검출기)분석 전 구리 처리와 같은 정제과정을 통하여 방해 요소를 제거할 수 있다.

10.3.3  유기주석화합물은 광분해되거나 생분해될 우려가 있으므로 되도록 차광용기를 사용하여 빠른 시간 내에 분석을 하도록 한다.

10.4  내부표준물질의 회수율 및 농도 계산 시, 사용하는 검량식은 기기분석 사용자에 따라 절편을 추가하거나 지수함수를 사용할 수도 있다.

                 (식 2)

                 (식 3)

                (식 4)

제25항 공극수 수소이온농도(Hydrogen Ion Concentration, pH)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 제3항 수소이온농도 1. 측정원리에 따른다.

2. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 제3항 수소이온농도 2. 기구 및 기기에 따른다.

3. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제3항 수소이온농도 3. 시약 및 표준물질에 따른다.

4. 시료의 채취 및 보관

공극수 내 수소이온농도 측정은 해수의 수소이온농도 측정방법과 동일하다. 단, pH 측정용 시료는 장시간 보관하여서는 안되며 공극수를 추출하자마자 그 중 일부를 취해 유리전극으로 최대한 빨리 측정해야 한다.

5. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제3항 수소이온농도 5. 시험방법에 따른다.

6. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제3항 수소이온농도 6. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

제26항 공극수 황화수소(Hydrogen Sulfide)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제7항 황화수소 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제7항 황화수소 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제7항 황화수소 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제7항 황화수소 4. 시약 및 표준물질에 따른다. 단, 고정 시약으로 10 % 아세트산아연을 사용하며 이는 4.4항과 같이 만든다.

5. 시료의 채취 및 보관

공극수를 추출하자마자, 여과하기 전 일부를 취해 최대한 빨리 10 % 아세트산아연용액 1 mL로 고정시킨 후 분석한다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제7항 황화수소 6. 시험방법에 따른다. 단, 황화수소의 농도가 높은 경우에는 초순수로 검정 범위 안에 들도록 희석해서 발색시킨다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제7항 황화수소 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제7항 황화수소 8. 참고사항에 따른다.

제27항 공극수 아질산성질소(Nitrite Nitrogen, NO2-N)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

공극수를 채취하여 여과한 후 해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 6. 시험방법에 따른다. 단, 농도가 높은 경우가 많으므로 이때는 초순수로 검정범위 안에 들도록 희석해야 한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 10. 참고사항에 따른다.

제28항 공극수 질산성질소(Nitrate Nitrogen, NO3-N)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제11항 질산성질소 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제11항 질산성질소 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제11항 질산성질소 4. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제11항 질산성질소 5. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

공극수를 채취하여 여과한 후 해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제11항 질산성질소 7. 시험방법에 따른다. 단, 농도가 높은 경우가 많으므로 이때는 초순수로 검정 범위 안에 들도록 희석해야 한다.

7. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 결과

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제11항 질산성질소 9. 결과에 따른다.

제29항 공극수 암모니아성질소(Ammonium Nitrogen, NH4-N)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제12항 암모니아성질소 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제12항 암모니아성질소 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제12항 암모니아성질소 4. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제12항 암모니아성질소 5. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제12항 암모니아성질소 6. 시료의 채취 및 보관에 따른다. 다만, 공극수를 추출하자마자, 여과하기 전 그 일부를 취해 최대한 빨리 측정해야 한다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제12항 암모니아성 질소 7. 시험방법에 따른다. 다만, 암모니아성질소의 농도가 높은 경우가 많으므로 이때는 초순수로 검정범위 안에 들도록 희석해야 한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제10항 아질산성질소 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제12항 암모니아성질소 11. 참고사항에 따른다.

제30항 공극수 구리(Copper, Cu)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제22항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 제22항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 제22항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  0.2 N 질산 용액: 14.2 mL의 질산을 초순수로 희석하여 1,000 mL로 만든다.

4.2  해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제22항 구리 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

공극수의 양이 제한되어 있을 경우 0.2 N 질산 용액으로 희석하여 총부피를 200 mL로 맞춘 다음, 해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제22항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다. 이때 희석 배수는 10배가 넘지 않도록 한다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제22항 구리 6. 시험방법에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제22항 구리 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제22항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제31항 공극수 납(Lead, Pb)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제23항 납 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제23항 납 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제23항 납 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제23항 납 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

위의 제30항 공극수 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제23항 납 6. 시험방법에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제23항 납 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제23항 납 8. 참고사항에 따른다.

제32항 공극수 니켈(Nickel, Ni)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제24항 니켈 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제24항 니켈 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제24항 니켈 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제24항 니켈 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

위의 제30항 공극수 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 제24항 니켈 6. 시험방법에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제24항 니켈 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 제24항 니켈 8. 참고사항에 따른다.

제33항 공극수 아연(Zinc, Zn)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제25항 아연 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제25항 아연 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기 

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제25항 아연 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제25항 아연 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

위의 제30항 공극수 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 제25항 아연 6. 시험방법에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제25항 아연 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 제25항 아연 8. 참고사항에 따른다.

제34항 공극수 카드뮴(Cadmium, Cd)

1. 측정원리

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제26항 카드뮴 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제26항 카드뮴 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기 

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제26항 카드뮴 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 제26항 카드뮴 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

위의 제30항 공극수 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

해수공정시험기준 제4장 제26항 카드뮴 6. 시험방법에 따른다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제26항 카드뮴 7. 정도평가/정도관리(QA/QC)에 따른다.

8. 참고사항

해수공정시험기준 제4장 제26항 카드뮴 8. 참고사항에 따른다.

제35항 폴리브롬화 디페닐에테르                         (Polybrominated  Diphenylethers,  PBDEs)

1. 측정원리

속실렛 추출법을 이용하여 퇴적물 중의 폴리브롬화 디페닐에테르(Polybrominated  Diphenylethers,  PBDEs)를 추출한다. 그 다음, 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 황 등의 분석 방해물질을 제거하고 기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/Mass Spectrometer, GC/MS)의 전자포획 화학음이온화(Electron Capture Negative Ionization, ECNI) 방식에 의한 선택적 이온모니터링(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법 검출한계(Method detection limit, MDL)를 표 1에 나타내었다.

표 1. PBDEs의 분석방법 검출한계(MDL)

┌─────────────────┬────────────┐

│성   분                           │분석방법 검출한계 (ng/g)│

├─────────────────┼────────────┤

│T3BDE, T4BDE, P5BDE, H6BDE, H7BDE │0.07                    │

├─────────────────┼────────────┤

│O8BDE, N9BDE                      │0.33                    │

├─────────────────┼────────────┤

│D10BDE                            │3.33                    │

└─────────────────┴────────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 폴리브롬화디페닐에테르의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용 전 확인시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다.

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹군 다음, 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시킨다. 사용하기 전에 아세톤으로 닦아 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  고상추출장치: GF/F 필터지, SPE 카트리지(Envi-Disk 및 동급 이상), 여과 장치, 진공펌프

3.1.2  속실렛 추출장치: 냉각장치, 사이폰, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.3  250, 500 mL 갈색 유리병 

3.1.4  250, 500 mL 가지형 플라스크

3.1.5  1 ∼ 2 mL 유리바이알

3.1.6  10 mL 시험관

3.1.7  액체컬럼크로마토관: 다층실리카겔 컬럼용 (길이 300 mm, 내경 20 mm)의 유리제 컬럼크로마토관

3.1.8  탈지면: 노말-헥산 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  농축장치

3.2.1  회전증발농축기(Rotary Evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정 온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인장치(Aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환장치(Cooling Circulator)

3.3  기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/Mass Spectrometer, GC/MS)

3.3.1  컬럼오븐

컬럼오븐의 온도 제어범위가 50 ∼ 350 °C이고, 측정 대상 물질의 최적 분리조건을 설정ㆍ제어가 가능하도록 승온 프로그래밍이 가능한 것을 사용한다.

3.3.2  모세관 컬럼

폴리브롬화디페닐에테르 분석을 위한 캐피러리 컬럼으로 분리가 양호한 극성 컬럼의 사용을 원칙으로 한다. 길이 15 m, 내경 0.25 mm, 막두께 0.1 μm 또는 이와 동등한 컬럼으로 분석 목적에 따라 알맞게 선정한다.

3.3.3  질량분석기(MS)

3.3.3.1  이온원은 온도를 160 ∼ 300 °C로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.3.3.2  전자포획 음이온화법(Electron Capture Negative Ionization, ECNI법)이 가능한 것을 사용한다. 

3.3.3.3  선택이온검출법(Selected Ion Monitoring: 이후 SIM법)이 가능하고, 필요한 측정 질량수의 채널 수와 감도의 관계를 고려하여 SIM법의 주기를 최대 1초 이하로 가능한 것을 사용한다.

3.3.4  시료도입부: splitless 등 시료의 전량을 분리 컬럼 내에 도입 가능한 것.

3.3.5  운반기체: 고순도 헬륨(순도 99.999 % 이상)

3.3.6  시약기체: 고순도 메탄(순도 99.95 % 이상)

표 2.  PBDEs 분석을 위한 GC/MS-ECNI 분석조건의 예

┌────────────────────────────────────────┐

│기체크로마토그래피 조건                                                         │

├──────┬─────────────────────────────────┤

│컬럼        │용융 실리카겔 모세관 컬럼                                         │

│            │내경 0.25 mm, 필름두께 0.1 μm, 길이 15 m                         │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│컬럼 온도   │70 °C(1.5분) → 200 °C(20 °C/분, 3분) → 310 °C(5 °C/분, 5분)│

├──────┼─────────────────────────────────┤

│주입구 온도 │280 °C                                                           │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│주입 방법   │splitless (split 유지 시간: 60 ∼ 90초)                           │

├──────┴─────────────────────────────────┤

│질량분석기 조건                                                                 │

├──────┬─────────────────────────────────┤

│이온화 방법 │전자포획 화학음이온화(ECNI)법                                     │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│반응 가스   │메탄(CH4)                                                         │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│이온화 전류 │500 ∼ 1,000 μA                                                  │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│이온원 온도 │280 ∼ 300 °C                                                    │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│운반기체    │헬륨(25 psi)                                                      │

└──────┴─────────────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

전체의 시약류에는 폴리브롬화디페닐에테르의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약을 사용한다.

4.1.1  아세톤(C3H6O)

4.1.2  노말-헥산(n-C6H14)

4.1.3  디클로로메탄(CH2Cl2)

4.1.4  노난(C9H20)

4.2  세정수: 노말-헥산으로 세정한 것

4.3  무수황산나트륨: 잔류농약 시험용 혹은 그와 동등 이상의 것

4.4  황산, 수산화칼륨, 질산은: 특급 혹은 이것과 동등 이상의 것

4.5  환원구리: 유기원소 분석용 환원구리(60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 진한 염산으로 세척한 다음, 증류수로 씻고, 메탄올로 수회 씻은 후 다시 노말-헥산으로 세척하여 노말-헥산 중에 보관한다.

4.6  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.7  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 1 M 수산화칼륨 용액을 위 4.6항의 실리카겔에 수산화칼륨이 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고 밀폐가능한 용기에 넣은 다음 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.8  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 위 4.6항의 실리카겔에 황산이 실리카겔에 대해 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그리고 밀폐가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.9  표준물질

4.9.1  표준물질(표 3): 표준물질은 노말-헥산 혹은 노난 등을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.9.2  내부표준물질(표 4): 실험에 사용되는 모든 내부표준물질은 적합한 작업농도범위로 희석하여 사용한다.

표 3. PBDEs 분석에 사용하는 표준물질

┌──────┬────────────────┬─────┐

│대상 화합물 │PBDEs 화합물                    │IUPAC No. │

├──────┼────────────────┼─────┤

│3브롬화물   │2,2',4-T3BDE                    │17        │

│            │2,4,4'-T3BDE                    │28        │

├──────┼────────────────┼─────┤

│4브롬화물   │2,2',4,4'-T4BDE                 │47        │

│            │2,3',4,4'-T4BDE                 │66        │

│            │2,3',4',6-T4BDE                 │71        │

├──────┼────────────────┼─────┤

│5브롬화물   │2,2',3,4,4'-P5BDE               │85        │

│            │2,2',4,4',5-P5BDE               │99        │

│            │2,2',4,4',6-P5BDE               │100       │

│            │2,3',4,4',6-P5BDE               │119       │

│            │3,3',4,4',5-P5BDE               │126       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│6브롬화물   │2,2',3,4,4',5'-H6BDE            │138       │

│            │2,2',4,4',5,5'-H6BDE            │153       │

│            │2,2',4,4',5,6'-H6BDE            │154       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│7브롬화물   │2,2',3,4,4',5',6-H7BDE          │183       │

│            │2,2',3,4,4',6,6'-H7BDE          │184       │

│            │2,2,3',4,4',5',6-H7BDE          │190       │

│            │2,3,3',4,4',5,6-H7BDE           │191       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│8브롬화물   │2,2',3,3',4,4',5,6'-O8BDE       │196       │

│            │2,2',3,3',4,4',6,6'-O8BDE       │197       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│9브롬화물   │2,2',3,3',4,4',5,5',6-N9BDE     │206       │

│            │2,2',3,3',4,4',5,6,6'-N9BDE     │207       │

├──────┼────────────────┼─────┤

│10브롬화물  │2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-D10BDE │209       │

└──────┴────────────────┴─────┘

표 4. PBDEs 분석에 사용하는 내부표준물질

┌───────────────────┬─────┐

│PBDEs 화합물                          │IUPAC No. │

├───────────────────┼─────┤

│2,2',4,4',5-P5BDE                     │77        │

├───────────────────┼─────┤

│2,2',4,4',5,6-H6BDE                   │139       │

├───────────────────┼─────┤

│13C12-2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-D10BDE │209       │

└───────────────────┴─────┘

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  퇴적물시료는 스테인레스 스파튤라를 이용해 표층 4 cm를 취해서 250 mL 차광용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 동결건조기를 사용하여 건조시키고 2 mm 체로 거른 다음, 막자사발을 이용ㆍ분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법

6.1  추출 (속실렛 추출방법)

6.1.1  균질화된 건시료 10 g을 칭량하여 팀블 여과지에 넣고 내부표준물질을 주입한다.

6.1.2  팀블 여과지를 사이폰에 넣은 후, 디클로로메탄:노말-헥산 혼합용액(3 : 1, v/v) 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

6.1.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속실렛 장치를 분리한다.

6.1.4  추출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.1.5  황 용출에 의한 기기분석의 방해가 염려될 경우에는 환원구리를 이용하여 황을 제거한 후 다음의 과정을 진행한다.

6.2  다층실리카겔 컬럼 크로마토그래피 정제

6.2.1  컬럼 크로마토관의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.2.2  노말-헥산을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.3  조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.2.4  실리카겔 1 g을 충진한다.

6.2.5  44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

6.2.6  실리카겔 1 g을 충진한다.

6.2.7  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.8  얻어진 시료 용액을 조심스럽게 이입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.2.9  15 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 150 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.10  얻어진 용출액을 회전증발농축기로 농축하고, 질소 가스로 농축하여 노난 20∼ 300 μL로 용매를 치환하여 GC/MS-ECNI로 분석한다.

6.3  기체크로마토그래피/질량분석기 분석

6.3.1  표 2의 조건하에서 측정용 시료를 시료 주입부에 주입한다.

6.3.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 브롬화물의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간을 비교하여 각각의 성분을 지정하고 각 피크의 면적을 측정하여 검량선 및 감응계수로부터 농도를 계산한다.

6.3.3  이때, 각 브롬화물의 모니터 이온을 1개의 브롬화물당 2개 이상 설정하고, 정량용 질량수와 정성용 질량수에 대하여 크로마토그램을 확인ㆍ기록하며, 정량용 이온과 내부표준물질 피크간의 면적비를 구하여 시료에 상응하는 농도값으로 환산한다.

7. 분석절차 흐름도

그림 1. PBDEs 분석절차

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  검출한계 

8.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석 절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

8.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양으로 시료 처리를 위한 화학분석과정에서는 나타날 수 있는 오차를 나타내는 방법검출한계와는 다르다. 기기검출한계는 분석 신호와 바탕 신호의 비(signal to noise ratio)에 3배(혹은 5배)로 정의한다.

8.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석 절차하에 측정하며, 이때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

8.3  검량선의 작성 및 검증

8.3.1  검량선의 작성

브롬화난연제(PBDEs) 분석 전 검량선 작성용 표준용액을 3개 이상의 농도구배로 하여 검량선을 작성한다. x축은 GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 GC 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 분석하고자 하는 검량선 작성용 표준물질의 양을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

그림 2. 표준물질의 검량선 

                           (식 1)

여기서,  RFs-is: GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질의 감응계수,

         표준용액의 검량곡선의 기울기에 해당함

   Is: GC 바이알에 첨가된 검량선 작성용 표준물질의 양(ng)

   Iis: GC 바이알에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

   As: GC 바이알에 첨가된 검량선 작성용 표준물질의 면적

   Ais: GC 바이알에 첨가된 GC 내부표준물질의 면적

8.3.2  검량선의 검증

검량선의 직선성을 평가하여 검증한다.

                              (식 2)

                        (식 3)

여기서,     A: 추세선의 기울기              Aa: 분석 대상화합물의 면적

           B: 추세선의 절편 값             Ais: GC 내부표준물질의 면적

           Ia: 분석 대상화합물의 양(ng)     Ais: GC 내부표준물질의 면적

           Iis: GC 내부표준물질의 양(ng)

각 시료군마다 1회의 검량선 검증을 실시하는 것이 바람직하며, 검량선의 중간 농도에 해당하는 표준용액을 측정한다. 측정값은 검량선 작성 당시의 값과 20 % 이내에서 일치해야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검량선의 재작성이 요구된다.

8.4  정확도(Accuracy)

8.4.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석전 시료에 첨가되어진 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 GC 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 GC 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 GC 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

그림 3. 표준물질의 검량선

             (식 4)

       (식 5)

여기서,   RFsu-is: GC 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질의 감응계수

         Asu: 시료 첨가용 내부표준물질의 면적

         Ais: GC 내부표준물질의 면적 

         Isu: 시료에 첨가된 시료 첨가용 내부표준물질의 양(ng)

         Iis: 시료의 최종추출액에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

8.4.2  시료에 첨가되어진 표준물질의 회수율

낮은 브롬화난연제(PBDEs) 농도를 가지는 해수시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후 동일한 실험을 수행한 후 회수되어진 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

        (식 6)

여기서,    M: 첨가한 표준물질의 양 

          Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값 

          Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

8.5  정밀도(Precision)

정밀도는 규정된 조건하에서의 측정값들 간의 근접정도를 나타내는 것으로써 검량곡선에 사용한 농도 범위에서 최소 3개의 농도에 해당하는 표준물질을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다.

실험으로부터 얻은 평균값과 표준편차로 변동계수를 구하여 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

정밀도(%) = CV =                     (식 7)

여기서,             CV: 변동계수(Coefficient of variation)

                   SD: 표준편차(Standard Deviation)

                   : 평균값

9. 결과

9.1  농도계산

브롬화난연제(PBDEs)의 농도는 다음의 식에 의해 구해진다.

                     (식 8)

                       (식 9)

여기서,      CS: 시료(sample)의 농도(ng/g)

            AS: 분석대상물질(PBDEs)의 면적

            AiS: GC 내부표준물질의 면적

            RFS-iS: GC 내부표준물질에 대한 분석대상물질의 감응계수,

                   표준용액의 검량곡선의 기울기에 해당함

            IiS: 시료 최종추출액에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

            IS: 시료에서의 분석대상물질(PBDEs)의 양(ng)

            W: 여과된 시료의 양(L)

이때, 시료 중에서의 내부표준물질 회수율이 많은 변동을 가진다면, 위 식에서 사용된 표준물질의 면적(As)은 위 8.4.1항에서 계산된 내부표준물질 회수율에 의한 보정된 값 ()을 이용해야 한다.

9.2  결과보고

시료에서의 농도와 함께 농도 계산에 사용된 검량선과 관련된 검량식 및 결정계수 그리고 자료질 검정을 위한 자료들을 함께 제시한다.

①  검량식

②  결정계수 (R2)

③  표준물질 농도

④  검출한계

⑤  정확도

⑥  정밀도

제36항 다이옥신 및 퓨란       (Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins and Furans, PCDD/Fs)

1. 측정원리

속실렛 추출법을 이용하여 해양퇴적물 중의 다이옥신(Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins, PCDD), 퓨란(Polychlorinated Dibenzo-Furans, PCDFs)을 추출한다. 그리고, 컬럼 정제과정으로 추출액 중 색소류, 황 등의 분석방해물질을 제거 및 분획화하고, 고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기(High Resolution Gas chromatography/Mass Spectrometer, HRGC/HRMS)를 사용하여 록매스(lock mass)에 의한 선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법 검출한계(Method detection limit, MDL)를 표 1에 나타내었다.

표 1. 다이옥신류의 분석방법 검출한계(MDL)

┌─────────────┬────────────┐

│성   분                   │분석방법 검출한계 (pg/g)│

├─────────────┼────────────┤

│T4CDD, T4CDF, P5CDD, P5CDF│0.2                     │

├─────────────┼────────────┤

│H6CDD, H6CDF, H7CDD, H7CDF│0.5                     │

├─────────────┼────────────┤

│O8CDD, O8CDF              │1                       │

└─────────────┴────────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 다이옥신류의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용전 확인시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다.

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하여 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시킨다. 사용하기 전에 아세톤으로 세척하여 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  속실렛 추출장치: 냉각장치, 사이폰, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.2  250, 500 mL 갈색 유리병

3.1.3  250, 500 mL 둥근바닥 플라스크

3.1.4  1 ∼ 2 mL 유리 바이알

3.1.5  10 mL 시험관

3.1.6  정제용 컬럼: 다층실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm), 알루미나 컬럼용(길이 250 mm, 내경 15 mm) 유리관

3.1.7  탈지면: 노말-헥산 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  농축장치

3.2.1  회전증발농축기(rotary evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정 온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인 장치(aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환 장치(cooling circulator)

3.2.4  질소농축기: 질소 기체가 연결될 수 있는 미세관, 기체의 유량조절이 가능한 유량계, 시료 용기를 고정할 수 있는 장치로 구성되어야 한다.

3.3  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기(High Resolution Gas Chromatography/Mass Spectrometer, HRGC/HRMS)

3.3.1  컬럼오븐

컬럼오븐의 온도 제어범위가 50 ∼ 350 °C이고, 측정 대상 물질의 최적 분리조건을 설정 및 제어가 가능하도록 승온 프로그래밍이 가능한 것을 사용한다.

3.3.2  모세관 컬럼

4염화물에서 8염화물까지 다이옥신류 분석을 위한 캐피러리 컬럼으로 2,3,7,8-치환이성질체를 포함한 모든 이성질체의 분리가 양호한 비극성 컬럼의 사용을 원칙으로 하되, 이와 동등한 성능을 가지는 모세관 컬럼의 사용도 가능하다. 길이 60 m, 내경 0.32 mm, 필름두께 0.25 μm 또는 이와 동등한 컬럼으로 분석 목적에 따라 알맞게 선정한다.

3.3.3  질량분석기(MS)

3.3.3.1  이중집속형(double-focusing type) 록매스방식과 분해능 10,000 이상으로 측정이 가능한 것을 사용한다.

3.3.3.2  이온원은 온도를 160 ∼ 300 °C로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.3.3.3  전자충격 이온화법(Electron Impact ionization, EI법)이 가능하고, 이온화 전압을 25 ∼ 70 eV 정도로 제어가능한 것을 사용한다.

3.3.3.4  선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM법)이 가능하고, 필요한 측정 질량수의 채널수와 감도의 관계를 고려하여 SIM법의 주기를 최대 1초 이하로 가능한 것을 사용한다.

3.3.4  시료도입부: 비분할(splitless) 등 시료의 전량을 분리 컬럼 내에 도입 가능한 것을 사용한다.

3.3.5  운반기체: 고순도 헬륨(순도 99.999 % 이상)

표 2. 다이옥신류 분석을 위한 HRGC/HRMS 분석조건의 예

┌────────────────────────────────────┐

│기체크로마토그래피 조건                                                 │

├──────┬─────────────────────────────┤

│컬럼        │실리카겔 모세관 컬럼                                      │

│            │내경 0.32 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 60 m                │

├──────┼─────────────────────────────┤

│컬럼 온도   │140 °C (4분) → 15 °C/분 → 220 °C → 1.5 °C/분       │

│            │             → 240 °C (2분) → 4 °C/분 → 310 °C (6분)│

├──────┼─────────────────────────────┤

│주입구 온도 │280 °C                                                   │

├──────┼─────────────────────────────┤

│주입방법    │splitless (split 유지 시간: 60 ∼ 90초)                   │

├──────┴─────────────────────────────┤

│질량분석기 조건                                                         │

├──────┬─────────────────────────────┤

│이온화 방법 │전자충격이온화(EI)법                                      │

├──────┼─────────────────────────────┤

│이온화 전압 │25 ∼ 70 eV                                               │

├──────┼─────────────────────────────┤

│이온화 전류 │500 ∼ 1,000 μA                                          │

├──────┼─────────────────────────────┤

│이온원 온도 │280 ∼ 300 °C                                            │

├──────┼─────────────────────────────┤

│운반 기체   │헬륨(25 psi)                                              │

└──────┴─────────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

전체의 시약류에는 다이옥신류의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용전 확인시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약을 사용한다.

4.1.1  아세톤(C3H6O)

4.1.2  톨루엔(C7H8)

4.1.3  노말-헥산(n-C6H14)

4.1.4  디클로로메탄(CH2C12)

4.1.5  노난(C9H20)

4.1.6  메탄올(CH3OH)

4.2  증류수: HPLC급 이상의 증류수를 이용해야 한다. 실험실에서 제조된 3차 증류수의 경우, 제조시 18 MΩ 이상의 저항값을 유지하도록 관리해야 하며, 분석대상물질의 피크가 검출한계의 1/3 이상 발견되지 않아야 한다.

4.3  무수황산나트륨(Na2SO4): 잔류농약 시험용 혹은 그와 동등 이상의 것을 사용한다.

4.4  황산(H2SO4), 수산화칼륨(KOH), 질산은(AgNO3), 염산(HCl): 특급 혹은 이것과 동등 이상의 것을 사용한다.

4.5  환원구리: 유기원소 분석용 환원구리(60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 진한 염산으로 세척한 다음 증류수로 수회 씻고, 메탄올로 수회 씻은 후 다시 노말-헥산으로 세척하여 노말-헥산 중에 보관한다.

4.6  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.7  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 위 4.6항의 실리카겔에 1 M 수산화칼륨 용액을 이용하여 수산화칼륨이 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고 밀폐가능한 용기에 넣은 다음 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.8  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 위 4.6항의 실리카겔에 황산이 실리카겔에 대해 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한 후 밀폐 가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.9  10 % 질산은 함유 실리카겔: 위 4.6항의 실리카겔에 40 %(w/w) 질산은 용액을 이용하여 질산은이 실리카겔에 대해 10 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고 밀폐가능한 용기에 넣어 진공 데시케이터 내에 보관한다. 조제 및 보관은 차광한 상태에서 행한다.

4.10  알루미나: 중성, 활성도Ⅰ, 70 ∼ 230 mesh, 600 °C에서 16시간 동안 활성화한 후, 밀폐 가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터에 넣어 보관한다.

4.11  표준물질

4.11.1  표준물질(표 3): 표준용액은 노말-헥산 혹은 노난 등을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석물질에 대한 기기 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.11.2  대체표준물질 및 내부표준물질(표 4): 실험에 사용되는 모든 대체 및 내부 표준용액은 적합한 작업농도 범위로 희석하여 사용한다.

4.11.3  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 인증표준물질은 환경 시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Environment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST (National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC (National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다(예: SRM1944 등).

표 3. 다이옥신 및 퓨란 표준물질(17종)

┌──────┬───────────┬───────────┐

│대상 화합물 │PCDD 화합물           │PCDF 화합물           │

├──────┼───────────┼───────────┤

│4염화물     │2,3,7,8-T4CDD         │2,3,7,8-T4CDF         │

├──────┼───────────┼───────────┤

│5염화물     │1,2,3,7,8-P5CDD       │1,2,3,7,8-P5CDF       │

│            │                      │2,3,4,7,8-P5CDF       │

├──────┼───────────┼───────────┤

│6염화물     │1,2,3,4,7,8-H6CDD     │1,2,3,4,7,8-H6CDF     │

│            │1,2,3,6,7,8-H6CDD     │1,2,3,6,7,8-H6CDF     │

│            │1,2,3,7,8,9-H6CDD     │1,2,3,7,8,9-H6CDF     │

│            │                      │2,3,4,6,7,8-H6CDF     │

├──────┼───────────┼───────────┤

│7염화물     │1,2,3,4,6,7,8-H7CDD   │1,2,3,4,6,7,8-H7CDF   │

│            │                      │1,2,3,4,7,8,9-H7CDF   │

├──────┼───────────┼───────────┤

│8염화물     │1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDD │1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDF │

└──────┴───────────┴───────────┘

표 4. 다이옥신 및 퓨란 대체표준물질(15종) 및 내부표준물질(2종)

┌──────┬──────────────┬─────────────┐

│대상 화합물 │PCDD 화합물                 │PCDF 화합물               │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│4염화물     │13C12-1,2,3,4-T4CDD*        │13C12-2,3,7,8-T4CDF       │

│            │13C12-2,3,7,8-T4CDD         │                          │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│5염화물     │13C12-1,2,3,7,8-P5CDD       │13C12-1,2,3,7,8-P5CDF     │

│            │                            │13C12-2,3,4,7,8-P5CDF     │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│6염화물     │13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDD     │13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDF   │

│            │13C12-1,2,3,6,7,8-H6CDD     │13C12-1,2,3,6,7,8-H6CDF   │

│            │13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDD*    │13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDF   │

│            │                            │13C12-2,3,4,6,7,8-H6CDF   │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│7염화물     │13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDD   │13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDF │

│            │                            │13C12-1,2,3,4,7,8,9-H7CDF │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│8염화물     │13C12-1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDD │                          │

└──────┴──────────────┴─────────────┘

  * 내부표준물질                                                          

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  퇴적물시료는 스테인레스 스파튤라를 이용해 표층 4 cm를 취해서 250 mL 차광용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 동결건조기를 사용하여 건조시키고 2 mm 체로 거른 다음 막자사발을 이용ㆍ분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법

6.1  추출(속실렛 추출방법)

6.1.1  균질화된 건시료 10 g을 칭량한 후 팀블 여과지에 넣고 대체표준물질을 주입한다.

6.1.2  팀블 여과지를 사이폰에 넣은 후, 톨루엔 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

6.1.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속실렛 장치를 분리한다.

6.1.4  추출액을 회전증발농축기 또는 질소농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.1.5  황 용출에 의한 기기분석의 방해가 염려될 경우에는 환원 구리를 이용하여 황을 제거한 후 다음의 과정으로 진행할 수 있다.

6.2  다층 실리카겔 컬럼 정제

6.2.1  정제용 컬럼의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.2.2  노말-헥산을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.3  4.7 항에서 조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.2.4  4.6항의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.5  4.8항의 44 % 황산이 함유된 실리카겔 3 g과 22 % 황산함유 실리카겔 3 g을 충진한다.

6.2.6  4.6항의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.7  4.9항의 10 % 질산은이 함유된 실리카겔을 4 g 충진한다.

6.2.8  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.9  6.1.5항에서 얻어진 시료용액을 조심스럽게 옮긴 후, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.2.10  노말-헥산 200 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.11  얻어진 용출액을 회전증발농축기를 이용하여 약 1 mL까지 농축한다.

6.3  알루미나 컬럼 정제

6.3.1  정제용 컬럼의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 세정된 탈지면을 충진한다.

6.3.2  무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.3  노말-헥산을 주입 후 4.10항의 알루미나 10 g을 습식충진한다.

6.3.4  무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.5  6.1.5항에서 얻어진 용액을 조심스럽게 이입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.3.6  3 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 70 mL를 유속 2.5 mL/min으로 흘려서 버린다.

6.3.7  50 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 80 mL를 유속 2.5 mL/min으로 흘린다.

6.3.8  얻어진 용출액을 회전증발농축기와 질소농축기를 이용하여 농축하고 내부표준물질을 주입하고 노난 20 ∼ 100 μL로 용매를 치환하여 HRGC/HRMS로 분석한다.

6.4  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기 분석

6.4.1  기기분석에 앞서, 질량분석기 교정을 위해 질량수교정용 표준물질 퍼플루오로케로센(Perfluorokerosene, PFK)을 이용한 매스 스펙트럼의 패턴, 분해능(10,000 이상, 10 % valley) 등 측정목적에 따른 최적의 값으로 교정한다. 질량 교정 결과를 측정결과와 함께 보존한다.

6.4.2  표 2의 조건하에서 측정용 시료 1 ∼ 2 μL를 시료 주입부에 주입한다.

6.4.3  얻어진 크로마토그램에서 개별 다이옥신류의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간을 비교하여 각각의 성분을 지정하고 각 피크의 면적을 측정하여 검량선 및 감응계수로부터 농도를 계산한다.

6.4.4  이때, 표 5와 같이 각 염소화물에 대해 2개 이상의 모니터 이온을 설정하고, 정량용 질량수와 정성용 질량수에 대하여 크로마토그램을 확인ㆍ기록한다. 측정 종료 후, 정량작업에 들어가기 전에 개개의 시료마다 록매스(Lock mass) 모니터 채널의 감도(response)를 확인한다. 정량용 이온과 내부표준물질 피크간의 면적비를 구하여 시료에 상응하는 농도값으로 환산한다.

표 5. 다이옥신 및 퓨란 분석을 위한 측정질량수

  (단위: m/z)                                 

┌──────┬────┬────┬────┐

│대상 화합물 │M       │M+2     │M+4     │

├──────┼────┼────┼────┤

│T4CDDs      │319.897 │321.894 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│P5CDDs      │353.858 │355.855 │357.852 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H6CDDs      │        │389.816 │391.813 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H7CDDs      │        │423.777 │425.774 │

├──────┼────┼────┼────┤

│O8CDD       │        │457.738 │459.735 │

├──────┼────┼────┼────┤

│T4CDFs      │303.902 │305.899 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│P5CDFs      │337.863 │339.860 │341.857 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H6CDFs      │        │373.821 │375.818 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H7CDFs      │        │407.782 │409.779 │

├──────┼────┼────┼────┤

│O8CDF       │        │441.743 │443.740 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-T4CDDs│331.937 │333.934 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-P5CDDs│365.898 │367.895 │369.892 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H6CDDs│399.859 │401.857 │403.853 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H7CDDs│        │435.817 │437.814 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-O8CDD │        │469.778 │471.775 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-T4CDFs│315.942 │317.939 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-P5CDFs│349.903 │351.900 │353.897 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H6CDFs│        │385.861 │387.858 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H7CDFs│        │419.822 │421.819 │

└──────┴────┴────┴────┘

표 6. 다이옥신류의 염소 동위체의 이론 천연 존재비

  (단위: %)                                   

┌──────┬──┬──┬──┬──┬──┐

│대상 화합물 │M   │M+2 │M+4 │M+6 │M+8 │

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│T4CDDs      │76.4│100 │49.4│11.0│1.00│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│P5CDDs      │61.3│100 │65.5│21.6│3.60│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H6CDDs      │51.1│100 │81.7│35.8│8.90│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H7CDDs      │43.9│100 │97.9│53.4│17.6│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│O8CDD       │33.7│87.7│100 │65.3│26.8│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│T4CDFs      │77.5│100 │49.2│10.9│1.00│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│P5CDFs      │61.3│100 │65.4│21.5│3.60│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H6CDFs      │51.6│100 │81.6│35.6│8.80│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H7CDFs      │43.9│100 │97.8│53.3│17.5│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┤

│O8CDF       │33.7│87.7│100 │65.2│26.7│

└──────┴──┴──┴──┴──┴──┘

7. 분석절차 흐름도

그림 1. 다이옥신 및 퓨란 분석절차

8. 정도평가/정도관리

8.1  검출한계, 정확도, 정밀도 측정은 제21항 유기염소제 농약 8. 정도평가/정도관리에 따른다.

8.2  시약의 조제와 시료의 전처리, HRGC/HRMS를 이용한 분석절차에서 발생할 수 있는 바탕오염을 확인하고, 시료의 분석에 지장이 없는 실험실 환경을 유지하기 위해 실험실 바탕시료(laboratory method blank) 시험을 수행한다.

8.3  다이옥신류의 분석에 대해 계산된 회수율은 50 ∼ 120 % 범위를 만족해야 하며, 이 범위를 벗어나면 정제과정을 새로 실시한다. 재정제시에도 이 범위를 만족하지 못하면 분석 결과는 폐기하고, 분석의 전과정을 재점검하여 다시 수행한다.

8.4  HRGC/HRMS를 이용한 다이옥신류의 분석 시, 표 1에 나타낸 분석방법 검출한계(MDL)를 만족해야 한다.

8.5  HRGC/HRMS는 분해능 10,000 이상에서 분석이 수행되어야 하며, 질량수 교정용 표준물질인 PFK의 검정결과는 이론값과 실측값과의 차이가 5 ppm 이하를 만족해야 하며, 이 값을 만족하지 못할 경우에는 HRGC/HRMS를 재조정해야 한다.

8.6  검량선 작성을 위해 사용되는 5단계 정량용 표준물질을 HRGC/HRMS에 주입하여 감응계수(RF)가 선형성을 보이는지를 확인하며, RF는 상대표준편차가 20 % 미만이어야 하며, 선형성을 만족하지 못하면 HRGC/HRMS를 재조정하여 재분석해야 한다.

8.7  다이옥신류의 각 분석대상 화합물의 정량을 위해 사용되는 두 개의 선택이온(m/z) 피크의 면적비가 표 5에 나타낸 동족체의 면적비에 대하여 ±15 % 이내에 있어야 한다.

8.8  분석대상 다이옥신류 화합물의 각 이온(m/z)값에 해당하는 크로마토그램의 피크에 대한 분석신호 대 바탕신호(S/N)의 비가 시료의 경우 2.5 이상이어야 하며, 정량용 표준물질에 대해서는 S/N비가 10 이상이어야 한다.

9. 결과

9.1  검량선

9.1.1  내부표준물질 중의 각 염화물에 대하여 0.5 ∼ 2,000 pg/μL 농도범위에서 0을 포함하여 5단계 이상의 표준농도계열을 만든다.

9.1.2  9.1.1에서 조제한 표준농도계열의 1 ∼ 2 μL를 HRGC/HRMS에 주입하고, 6.4항의 조작을 행하여 각 염화물의 크로마토그램을 기록한다.

9.1.3  9.1.2에서 측정한 검량선용 표준농도 계열의 각 염소화물마다 정량용 질량수와 확인용 질량수의 피크 면적비를 산출한다.

9.1.4  9.1.3에서 구한 각 염소화물의 면적비가 표 6의 천연존재비와 거의 일치하는 것을 확인한다.

9.1.5  각 염소화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 주입한 표준용액 중의 각 염소화물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

9.1.6  분석대상물질의 감응계수(Response Factor, RF)를 구한다. RF는 다음 식에 의해 산출한다.

                             (식 1)

AS: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

IS: 표준용액 중의 분석대상물질의 농도(첨가량)

I: 표IS준용액 중의 내부표준물질의 농도(첨가량)

9.2  농도계산

분석대상의 각 다이옥신 및 퓨란의 농도는 아래 식을 사용하여 구한다.

                          (식 2)

C : 분석대상물질의 농도(pg/g)

As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(pg)

RF: 감응계수

W: 시료량(건중량, g)

9.2.1  정량은 정량 하한치(분석방법 검출한계 0.2 ∼ 1 pg/g)이상의 피크에 대해서만 행한다.

9.2.2  동위체 농도는 4염소화물부터 8염소화물의 각 동위체와 그 총합을 표시한다.

9.2.3  동위체 농도는 2,3,7,8-염소치환 이성질체 농도 및 기타의 이성질체 농도의 총합으로 표시하고, 이성질체 농도는 2,3,7,8-염소치환 이성질체의 각 농도에 대하여 표시한다.

9.2.4  2,3,7,8-염소치환 이성질체의 각 농도는 사용한 표준물질의 측정 분석값을 사용하여 정량한다.

9.2.5  그 이외의 이성질체 농도(총합 농도)는 사용한 각 염소수마다 표준물질 측정치의 평균값을 사용하여 정량한다.

9.2.6  정량된 실측농도에 표 7의 다이옥신류의 독성등가계수(Toxic Equivalent Factor, TEF)를 곱하여 독성등가량(Toxic Equivalent, TEQ)을 산출하고, 그 합계를 구한다.

표 7. 다이옥신 및 퓨란의 독성등가계수(WHO-TEF 2005)

┌───────────┬───┬───────────┬───┐

│PCDDs 화합물          │TEF   │PCDFs 화합물          │TEF   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│2,3,7,8-T4CDD         │1     │2,3,7,8-T4CDF         │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,7,8-P5CDD       │1     │1,2,3,7,8-P5CDF       │0.03  │

│                      │      │                      │      │

│                      │      │2,3,4,7,8-P5CDF       │0.3   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,4,7,8-H6CDD     │0.1   │1,2,3,4,7,8-H6CDF     │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,6,7,8-H6CDD     │0.1   │1,2,3,6,7,8-H6CDF     │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,7,8,9-H6CDD     │0.1   │1,2,3,7,8,9-H6CDF     │0.1   │

│                      │      │                      │      │

│                      │      │2,3,4,6,7,8-H6CDF     │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,4,6,7,8-H7CDD   │0.01  │1,2,3,4,6,7,8-H7CDF   │0.01  │

│                      │      │                      │      │

│                      │      │1,2,3,4,7,8,9-H7CDF   │0.01  │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDD │0.0003│1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDF │0.0003│

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│그 외의 PCDDs         │0     │그 외의 PCDFs         │0     │

└───────────┴───┴───────────┴───┘

9.3  결과보고

시료에 들어 있는 각 다이옥신 및 퓨란의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 결정계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

위 6.1항에서 사용되어진 속실렛추출법 대신 가속용매추출법(accelerated solvent extraction) 등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 정확도(8.3항)을 반드시 제시해야 한다.

제37항 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐       (Dioxin-like PCBs, DL-PCBs)

1. 측정원리

속실렛 추출법을 이용하여 해양퇴적물 중의 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐(Dioxin-like PCBs, DL-PCBs)을 추출한 후 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 황 등의 분석방해물질을 제거하고, 고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기(High Resolution Gas chromatography/Mass Spectrometer, HRGC/HRMS)를 사용하여 록 매스(Lock mass)에 의한 선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법 검출한계(Method detection limit, MDL)를 표 1에 나타내었다.

표 1. DL-PCBs 분석방법 검출한계(MDL)

┌───────────┬────────────┐

│성   분               │분석방법 검출한계(pg/g) │

├───────────┼────────────┤

│T4CB, P5CB, H6CB, H7CB│0.2                     │

└───────────┴────────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지 확인하고, 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용 전 확인시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다.

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시킨다. 사용하기 전에 아세톤으로 세척하여 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  속실렛 추출장치: 냉각장치, 사이폰, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.2  250, 500 mL 갈색 유리병

3.1.3  250, 500 mL 둥근바닥 플라스크

3.1.4  1 ∼ 2 mL 유리 바이알

3.1.5  10 mL 시험관

3.1.6  정제용 컬럼: 다층실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm) 유리관

3.1.7  탈지면: 노말-헥산 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  농축장치

3.2.1  회전증발농축기(rotary evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인 장치(aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환 장치(cooling circulator)

3.2.4  질소농축기: 질소 기체가 연결될 수 있는 미세관, 기체의 유량조절이 가능한 유량계, 시료 용기를 고정할 수 있는 장치로 구성되어야 한다.

3.3  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기(High Resolution Gas Chromatography/Mass Spectrometer, HRGC/HRMS)

3.3.1  컬럼오븐

컬럼 오븐의 온도 제어범위가 50 ∼ 350 °C이고, 측정대상물질의 최적 분리조건을 설정 및 제어가 가능하도록 승온 프로그래밍이 가능한 것을 사용한다.

3.3.2  모세관 컬럼

4염화물에서 7염화물까지 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐 분석을 위한 모세관 컬럼으로 모든 이성질체의 분리가 양호한 비극성 컬럼(DB-5MS 등)의 사용을 원칙으로 하되, 이와 동등한 성능을 가지는 모세관 컬럼의 사용도 가능하다. 길이 60 m, 내경 0.25 mm, 막두께 0.25 μm 또는 이와 동등한 컬럼으로 분석 목적에 따라 알맞게 선정한다.

3.3.3  질량분석기(MS)

3.3.3.1  이중 수속형으로 록매스방식과 분해능 10,000 이상으로 측정이 가능한 것을 사용한다.

3.3.3.2  이온원은 온도를 160 ∼ 300 °C로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.3.3.3  전자충격 이온화법(Electron Impact, EI법)이 가능하고, 이온화 전압을 25 ∼70 eV 정도로 제어가능한 것을 사용한다.

3.3.3.4  선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM법)이 가능하고, 필요한 측정 질량수의 채널수와 감도의 관계를 고려하여 SIM법의 주기를 최대 1초 이하로 가능한 것을 사용한다.

3.3.4  시료도입부: splitless 등 시료 전량을 분리 컬럼 내에 도입 가능한 것을 사용한다.

3.3.5  운반기체: 고순도 헬륨(순도 99.999 % 이상)

표 2. 다이옥신-유사 PCBs 분석을 위한 HRGC/HRMS의 분석조건의 예

┌────────────────────────────────────────┐

│기체크로마토그래피 조건                                                         │

├──────┬─────────────────────────────────┤

│컬럼        │실리카겔 모세관 컬럼                                              │

│            │내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 60 m                        │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│컬럼 온도   │130 °C(1분) → 20 °C/분 → 220 °C → 5 °C/분 → 320 °C(4.5분)│

├──────┼─────────────────────────────────┤

│주입구 온도 │280 °C                                                           │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│주입방법    │splitless(split 유지 시간: 60 ∼ 90초)                            │

├──────┴─────────────────────────────────┤

│질량분석기 조건                                                                 │

├──────┬─────────────────────────────────┤

│이온화 방법 │전자충격이온화(EI)법                                              │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│이온화 전압 │25 ∼ 70 eV                                                       │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│이온화 전류 │500 ∼ 1,000 μA                                                  │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│이온원 온도 │280 ∼ 300 °C                                                    │

├──────┼─────────────────────────────────┤

│운반 기체   │헬륨(25 psi)                                                      │

└──────┴─────────────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

전체의 시약류에는 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약을 사용한다.

4.1.1  아세톤(C3H6O)

4.1.2  톨루엔(C7H8)

4.1.3  노말-헥산(n-C6H14)

4.1.4  디클로로메탄(CH2Cl2)

4.1.5  노난(C9H20)

4.1.6  메탄올(CH3OH)

4.2  증류수: HPLC급 이상의 증류수를 이용해야 한다. 실험실에서 제조된 3차 증류수의 경우, 제조 시 18 MΩ 이상의 저항값을 유지하도록 관리해야 하며, 분석대상물질의 피크가 검출한계의 1/3 이상 발견되지 않아야 한다.

4.3  무수황산나트륨(Na2SO4): 잔류농약 시험용 혹은 그와 동등 이상의 것을 사용한다.

4.4  황산(H2SO4), 수산화칼륨(KOH), 질산은(AgNO3), 염산(HCl): 특급 혹은 이것과 동등 이상의 것을 사용한다.

4.5  환원구리: 유기원소 분석용 환원구리(60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 진한 염산으로 세척한 다음 증류수로 수회 씻고, 메탄올로 수회 씻은 후 다시 노말-헥산으로 세척하여 노말-헥산 중에 보관한다.

4.6  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.7  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 위 4.6항의 실리카겔에 1 M 수산화칼륨 용액을 이용하여 수산화칼륨이 실리카겔에 대해 2%(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고, 밀폐가능한 용기에 넣은 다음 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.8  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 위 4.6항의 실리카겔에 황산이 실리카겔에 대해 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한 후 밀폐 가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.9  10 % 질산은 함유 실리카겔: 위 4.6항의 실리카겔에 40 %(w/w) 질산은 용액을 이용하여 질산은이 실리카겔에 대해 10 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고 밀폐가능한 용기에 넣어 진공 데시케이터 내에 보관한다. 조제 및 보관은 차광한 상태에서 행한다.

4.10  표준물질

4.10.1  표준물질(표 3): 표준물질은 노말-헥산 혹은 노난 등을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.10.2  대체표준물질 및 내부표준물질(표 4): 실험에 사용되는 모든 대체 및 내부 표준물질은 적합한 작업농도범위로 희석하여 사용한다.

4.10.3  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 인증표준물질은 환경 시료의 분석 자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC(National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다(예: IAEA-417, IAEA-383, SRM1941b, SRM1944 등).

표 3. 다이옥신-유사 PCBs 분석에 사용되는 표준물질(12종)

┌────────┬───────────┬─────┐

│대상 화합물     │PCBs 화합물명         │IUPAC 번호│

├────────┼───────────┼─────┤

│Non-ortho PCBs  │3,3',4,4'-T4CB        │77        │

│                │                      │          │

│                │3,3',4',5-T4CB        │81        │

│                │                      │          │

│                │3,3',4,4',5-P5CB      │126       │

│                │                      │          │

│                │3,3',4,4',5,5'-H6CB   │169       │

├────────┼───────────┼─────┤

│Mono-ortho PCBs │2,3,3',4,4'-P5CB      │105       │

│                │                      │          │

│                │2,3,4,4',5-P5CB       │114       │

│                │                      │          │

│                │2,3',4,4',5-P5CB      │118       │

│                │                      │          │

│                │2',3,4,4',5-P5CB      │123       │

│                │                      │          │

│                │2,3,3',4,4',5-H6CB    │156       │

│                │                      │          │

│                │2,3,3',4,4',5'-H6CB   │157       │

│                │                      │          │

│                │2,3',4,4',5,5'-H6CB   │167       │

│                │                      │          │

│                │2,3,3',4,4',5,5'-H7CB │189       │

└────────┴───────────┴─────┘

표 4. 다이옥신-유사 PCBs 분석에 사용되는 대체표준물질(12종) 및 내부표준물질 (4종)

┌────────┬───────────────┬─────┐

│대상 화합물     │PCBs 화합물명                 │IUPAC 번호│

├────────┼───────────────┼─────┤

│Non-ortho PCBs  │13C12-3,3',4,4'-T4CB          │77        │

│                │                              │          │

│                │13C12-3,3',4',5-T4CB          │81        │

│                │                              │          │

│                │13C12-3,3',4,4',5-P5CB        │126       │

│                │                              │          │

│                │13C12-3,3',4,4',5,5'-H6CB     │169       │

├────────┼───────────────┼─────┤

│Mono-ortho PCBs │13C12-2,3',4',5-T4CB          │70*       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4'-P5CB        │105       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',5,5'-P5CB        │111*      │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,4,4',5-P5CB         │114       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3',4,4',5-P5CB        │118       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2',3,4,4',5-P5CB        │123       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4',5-H6CB      │156       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4',5'-H6CB     │157       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3',4,4',5,5'-H6CB     │167       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4',5,5'-H7CB   │189       │

├────────┼───────────────┼─────┤

│                │13C12-2,2‘,3,4,4',5'-H6CB    │138*      │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,2‘,3,3',4,4',5,-H7CB │170*      │

└────────┴───────────────┴─────┘

  * 내부 표준물질                                               

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  퇴적물시료는 스테인레스 스파튤라를 이용해 표층 4 cm를 취해서 250 mL 차광용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 동결건조기를 사용하여 건조시키고 2 mm 체로 거른 다음 막자사발을 이용ㆍ분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법

6.1  추출(속실렛 추출방법)

6.1.1  균질화된 건시료 10 g을 칭량하여 팀블 여과지에 넣고 내부표준물질을 주입한다.

6.1.2  팀블 여과지를 사이폰에 넣은 후, 톨루엔 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

6.1.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속실렛 장치를 분리한다.

6.1.4  추출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.1.5  황 용출에 의한 기기분석의 방해가 염려될 경우에는 환원 구리를 이용하여 황을 제거한 후 다음의 과정을 거친다.

6.2  다층 실리카겔 컬럼 정제

6.2.1  정제용 컬럼의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.2.2  노말-헥산을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.3  4.7항에서 조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.2.4  4.6항의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.5  4.8항의 44 % 황산이 함유된 실리카겔 3 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 3 g을 충진한다.

6.2.6  4.6항의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.7  4.9항의 10 % 질산은이 함유된 실리카겔을 4 g을 충진한다.

6.2.8  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.9  6.1.5항에서 얻어진 시료 용액을 조심스럽게 이입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.2.10  노말-헥산 200 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.11  얻어진 용리액을 회전증발농축기와 질소농축기를 이용하여 농축하고 내부표준물질을 주입하고 노난 20∼100 μL로 용매를 치환하여 HRGC/HRMS로 분석한다.

6.3  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기 분석

6.3.1  기기분석에 앞서, 질량분석기 교정을 위해 질량수교정용 표준물질 퍼플루오로케로센(Perfluorokerosene, PFK)를 주입하고, 질량교정용 프로그램에 의해 매스 스펙트럼의 패턴, 분해능(10,000 이상, 10 % valley) 등을 측정목적에 따라 소정의 값으로 교정한다. 질량교정 결과를 측정결과와 함께 보존한다.

6.3.2  표 5에 나타낸 각 염소화합물의 모니터 이온을 1개의 염화물에 대하여 2개 이상 설정한다.

6.3.3  위 6.2.11항에서 제조한 분석용 시료액의 1 ∼ 2 μL를 HRGC/HRMS에 주입한다.

6.3.4  위 6.3.2항에서 설정한 각 염소화물의 정량용 질량수와 확인용 질량수에 대하여 크로마토그램을 기록하고, 2개 이상의 모니터 이온의 피크 면적비를 계산한다.

6.3.5  측정종료 후, 정량 작업에 들어가기 전에 개개의 시료마다 록매스(Lock mass) 모니터 채널의 감도(response)를 확인한다.

6.3.6  각 염소화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적을 구한다.

표 5. 다이옥신-유사 PCBs 분석을 위한 측정질량수

  (단위: m/z)                                 

┌──────┬────┬────┬────┐

│대상 화합물 │M       │M+2     │M+4     │

├──────┼────┼────┼────┤

│T4CBs       │289.922 │291.919 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│P5CBs       │        │325.880 │327.877 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H6CBs       │        │359.841 │361.839 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H7CBs       │        │393.802 │395.800 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-T4CBs │301.963 │303.960 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-P5CBs │        │337.921 │339.918 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H6CBs │        │371.882 │373.879 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H7CBs │        │405.843 │407.840 │

└──────┴────┴────┴────┘

표 6. 다이옥신-유사 PCBs 염소 동위체의 이론 천연 존재비

  (단위: %)                                         

┌──────┬──┬──┬──┬──┬──┬──┐

│대상 화합물 │M   │M+2 │M+4 │M+6 │M+8 │M+10│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│T4CBs       │76.7│100 │49.1│10.8│0.93│    │

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│P5CBs       │61.4│100 │65.3│21.4│3.56│    │

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H6CBs       │51.2│100 │81.5│35.5│8.75│1.17│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H7CBs       │43.9│100 │97.7│53.1│17.4│3.43│

└──────┴──┴──┴──┴──┴──┴──┘

7. 분석절차 흐름도

그림 1. 다이옥신-유사 PCBs 분석절차

8. 정도평가/정도관리

8.1  검출한계, 정확도, 정밀도 측정은 제21항 유기염소제 농약 8. 정도평가/정도관리에 따른다.

8.2  시약의 조제와 시료의 전처리, HRGC/HRMS를 이용한 분석 절차에서 발생할 수 있는 바탕오염을 확인하고, 시료의 분석에 지장이 없는 실험실 환경을 유지하기 위해 실험실 바탕시료(laboratory method blank) 시험을 수행한다.

8.3  다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 분석에 대해 계산된 회수율은 50 ∼ 120 %의 범위를 만족해야 하며, 이 범위를 벗어나면 정제과정을 새로 실시한다. 재정제시에도 이 범위를 만족하지 못하면 분석 결과는 폐기하고, 분석의 전과정을 재점검하여 다시 수행한다.

8.4  HRGC/HRMS를 이용한 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 분석 시, 표 1에 나타낸 분석방법 검출한계(MDL)를 만족해야 한다.

8.5  HRGC/HRMS는 분해능 10,000 이상에서 분석이 수행되어야 하며, 질량수 교정용 표준물질인 PFK의 검정결과는 이론값과 실측값과의 차이가 5 ppm 이하를 만족해야 한다. 이 값을 만족하지 못할 경우에는 HRGC/HRMS를 재조정해야 한다.

8.6  검량선 작성을 위해 사용되는 5단계 정량용 표준물질을 HRGC/HRMS에 주입하여 감응계수(RF)의 선형성을 보이는지를 확인한다. RF는 상대표준편차가 20 % 미만이어야 하며, 선형성을 만족하지 못하면 HRGC/HRMS를 재조정하여 재분석해야 한다.

8.7  다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 각 분석대상 화합물의 정량을 위해 사용되는 두 개의 선택이온(m/z) 피크의 면적비가 표 6에 나타낸 동족체의 면적비에 대하여 ±15 % 이내에 있어야 한다.

8.8  분석대상 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 각 이온(m/z)값에 해당하는 크로마토그램의 피크에 대한 분석신호 대 바탕신호(signal-to-noise, S/N)의 비가 시료의 경우 2.5 이상이어야 하며, 정량용 표준물질에 대해서는 S/N비가 10 이상이어야 한다.

9. 결과

9.1  검량선

9.1.1  내부표준물질에 해당하는 각 염소화물에 대하여 0.1 ∼ 800 pg/μL 농도범위에서 0을 포함하여 5단계 이상의 표준농도계열을 만든다.

9.1.2  앞의 9.1.1항에서 조제한 표준농도계열 1 ∼ 2 μL를 HRGC/HRMS에 주입하고, 위 6.3항의 조작을 행하여 각 염소화물의 크로마토그램을 기록한다.

9.1.3  9.1.2항에서 측정한 검량선용 표준농도계열의 각 염소화물마다 정량용 질량수와 확인용 질량수의 피크 면적비를 산출한다.

9.1.4  9.1.3에서 구한 각 염소화물의 면적비가 표 7의 천연존재비와 거의 일치하는 것을 확인한다.

9.1.5  각 염소화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 주입한 표준용액 중의 각 염소화물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

9.1.6  분석대상물질의 감응계수(Response Factor, RF)를 구한다. RF는 다음 식에 의해 산출한다.

                            (식 1)

AS: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

IS: 표준용액 중의 분석대상물질의 농도(첨가량)

IIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도(첨가량)

9.2  농도계산

다음 식에 의해 농도를 환산한다.

                        (식 2)

C : 분석대상물질의 농도(pg/g)

As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(pg)

RF: 감응계수

W: 시료량(건중량, g)

9.2.1  정량은 정량 하한치(분석방법 검출한계 0.2 pg/g) 이상의 피크에 대해서만 행한다.

9.2.2  동위체 농도는 4염소화물부터 7염소화물의 각 동위체와 그 총합을 표시한다.

9.2.3  동위체 농도는 독성등가계수(Toxic Equivalent Factor, TEF)를 가지는 PCB 이성질체 농도로 표시한다.

9.2.4  독성등가계수(TEF)를 가지는 PCB 이성질체의 각 농도는 사용한 표준물질의 측정 분석값을 사용하여 정량한다.

9.2.5  정량된 실측농도에 표 7의 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 독성등가계수(TEF)를 곱하여 독성등가량(Toxic Equivalent, TEQ)을 산출하고 그 합계를 구한다.

표 7. 다이옥신-유사 PCBs의 독성등가계수(WHO-TEF 2005)

┌────────┬───────────┬─────┬────┐

│대상 화합물     │PCBs 화합물명         │IUPAC No. │TEF     │

├────────┼───────────┼─────┼────┤

│Non-ortho PCBs  │3,3',4,4'-T4CB        │77        │0.0001  │

│                │                      │          │        │

│                │3,3',4',5-T4CB        │81        │0.0003  │

│                │                      │          │        │

│                │3,3',4,4',5-P5CB      │126       │0.1     │

│                │                      │          │        │

│                │3,3',4,4',5,5'-H6CB   │169       │0.03    │

├────────┼───────────┼─────┼────┤

│Mono-ortho PCBs │2,3,3',4,4'-P5CB      │105       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,4,4',5-P5CB       │114       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3',4,4',5-P5CB      │118       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2',3,4,4',5-P5CB      │123       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,3',4,4',5-H6CB    │156       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,3',4,4',5'-H6CB   │157       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3',4,4',5,5'-H6CB   │167       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,3',4,4',5,5'-H7CB │189       │0.00003 │

└────────┴───────────┴─────┴────┘

9.3  결과보고

시료에 들어 있는 각 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 결정계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

위 6.1항에서 사용되어진 속실렛 추출법 대신 가속용매추출법(accelerated solvent extraction) 등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 정확도(8.3항)를 반드시 제시해야 한다.

제38항 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs)

1. 측정원리

초음파 추출기를 이용하여 해저퇴적물 중의 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs)을 추출한 후 고상추출법(SPE)을 이용한 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 고분자화합물 등의 분석 방해물질을 제거한 뒤 액체크로마토그래프-삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)의 전자분무식이온화(ElectroSpray Ionization, ESI) 방식을 사용하여 MRM mode(Multiple reaction monitoring)로 분석한다.

2. 정량범위 및 정밀도

유효 정량 범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 분석기기에 대한 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있다. 건시료 5 g 기준 액체크로마토그래프-삼중질량분석기를 이용한 과불화화합물(PFASs)의 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 99 % 신뢰구간에서 0.01 ∼ 0.05 ng/g dw (건중량) 정도이며, 성분별 정량한계를 표 1에 나타내었다.

표 1. PFASs의 정량한계(LOQ)

┌───┬─────────┬───┬─────────┐

│성분  │정량한계(ng/g dw) │성분  │정량한계(ng/g dw) │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFBS  │0.05              │PFNA  │0.01              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFHS  │0.01              │PFDA  │0.01              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFOS  │0.02              │PFUnDA│0.01              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFDS  │0.01              │PFDoDA│0.01              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFPeA │0.02              │PFTrDA│0.01              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFHxA │0.01              │PFTeDA│0.01              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFHpA │0.01              │PFHxDA│0.01              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFOA  │0.01              │PFOcDA│0.02              │

└───┴─────────┴───┴─────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 기기는 과불화화합물의 측정 및 분석과정에서 발생할 수 있는 방해 요인을 최소화 하여 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮추어야한다. 실험 전 확인 시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염 유무를 반드시 확인해야 하고, 실험 전과정에 과불화화합물이 포함 될 수 있는 재질의 사용을 금해야 한다. 분석대상물질이 유리 표면에 흡착될 수 있으므로 과불화화합물 표준물질, 추출액과 시료 등은 유리재질의 용기나 피펫 등을 이용하지 말아야 한다. 구입한 표준용액이나 내부표준용액 등이 담겨 있는 유리용기(앰플)는 허용되지만 희석할 때에는 폴리프로필렌 재질의 용기를 이용해야 한다.

방해물질들은 용매에 포함된 오염물질, 시약(HPLC급 증류수 포함), 시료 용기와 뚜껑, 다른 시료처리 기구에서 비롯할 수 있으며 이들이 크로마토그램의 바탕선을 상승시킨다. 이 방법에 의한 분석대상물질은 일반적인 실험실 용품이나 장비, 예를 들면, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 제품, 액체크로마토그래프(LC) 용매 라인, 메탄올, 알루미늄 호일, 고체상추출(SPE) 시료 이송 라인 등에서도 발견될 수 있다. 이와 같이 오염 가능성이 있는 모든 용기나 기구는 정기적으로 검사하여 방해물질이 실험실 공시료 수준 이하로 존재하도록 해야 한다.

3.1  초자기구

3.1.1  시료용기: 폴리프로필렌(PP) 재질의 스크류뚜껑이 있는 50 mL 폴리프로필렌 일회용 용기, 15 mL 폴리프로필렌 용기, 원심분리관, 또는 폴리프로필렌 재질의 스크류뚜껑이 있는 폴리프로필렌 자동시료주입기 용기를 사용한다.

3.1.2  15, 50 mL 폴리프로필렌 튜브

3.1.3  250, 500 mL 폴리프로필렌 부피플라스크

3.2  기기

3.2.1  고체상 추출장치: 폴리머 또는 코폴리머 재질의 카트리지(Envicarb C18, 200 mg/6 cc 또는 동등 이상)를 이용한다.

3.2.2  진공 추출용 매니폴더: 많은 양의 시료를 전처리할 수 있는 진공추출용 매니폴더(Supelco 57030, 57275 또는 동급)를 사용한다.

3.2.3  질소농축기: 99.995 % 이상의 고순도 질소 사용

3.2.4  액체크로마토그래피/삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)

3.2.4.1  LC 시스템: 5 ∼ 10 μL 용량의 시료를 반복적으로 주입할 수 있어야 하며, 농도 기울기 조절이 가능하고 분석 유량(0.3 mL/min)을 일정하게 유지할 수 있는 이성분(binary) 펌프가 있는 시스템이 요구된다. 액체크로마토그래프 시스템은 오염의 원인이 될 수 있는 기포제거장치(degasser)가 없이도 용매를 일정하게 조절할 수 있어야 한다.

3.2.4.2  권장 컬럼: 적절한 분해능, 피크 모양, 정확도 및 정밀도를 가지는 역상 C18 액체크로마토그래프 컬럼(2.0 × 150 mm, 3 μm 또는 동급 이상)을 사용한다.

3.2.4.3  검출기(MS/MS):　액체크로마토그래프(LC)에서 분석하는 유량(0.2 mL/min) 근처에서 음이온 전자분사 이온화(ESI)가 가능한 장비이어야 한다. 적절한 정밀도를 유지하기 위해서 크로마토그램 상의 피크당 10번 이상의 스캔을 할 수 있어야 한다.

3.2.4.4  이동상: 이동상은 과불화화합물 분리에 적절하도록 선택한다. 이동상 A는 5 mM 암모늄아세테이트가 포함된 증류수, 이동상 B는 메탄올을 이용하여 분리하고 방해물질과 분석대상물질의 피크가 최대한 겹치지 않는 경사용매조성법(gradient mode)을 이용한다. 또한 이동상의 유량은 컬럼의 분리효율이 최대로 되는 300 μL/min으로 하고 시료 주입량은 10 μL로 한다.

4. 시약 및 표준용액

전체의 시약류에는 과불화화합물의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인 시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약

4.1.1  메탄올

4.1.2  아세토니트릴

4.1.3  암모늄아세테이트

4.2  증류수: HPLC급 이상의 증류수를 이용해야 한다. 분석대상물질의 피크가 검출한계의 1/3 이상 발견되지 않아야 한다. 실험실에서 제조된 3차 증류수의 경우 제조시 18 ΜΩ 이상의 저항값을 유지하도록 관리해야 하며, 공시료 및 시료의 전처리 및 분석에 이용하기 전에 고체상추출용 카트리지를 통과시켜야 한다.

4.3  표준용액과 내부표준용액

4.3.1  표준용액(표 2): 표준용액은 메탄올을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석 물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.3.2  내부표준용액(표 2): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업 농도범위로 희석하여 사용한다.

표 2. 측정에 사용하는 PFASs 표준물질

┌─────────┬─────────────┬───┬──────┐

│대상 화합물       │PFASs 화합물              │약어  │내부표준물질│

├─────────┼─────────────┼───┼──────┤

│PFSAs             │Perflurobutane sulfonate  │PFBS  │13C12-PFBS  │

│(Perfluoroalkane  │Perflurohexane sulfonate  │PFHS  │13C12-PFHS  │

│sulfonic acids)   │Perflurooctane sulfonate  │PFOS  │13C12-PFOS  │

│                  │Perflurodecane sulfonate  │PFDS  │13C12-PFOS  │

├─────────┼─────────────┼───┼──────┤

│PFCAs             │Perfluropentanoic acid    │PFPeA │13C12-PFHxA │

│(Perfluoroalkyl   │Perflurohexanoic acid     │PFHxA │13C12-PFHxA │

│carboxylic acids) │Perfluroheptanoic acid    │PFHpA │13C12-PFOA  │

│                  │Perflurooctanoic acid     │PFOA  │13C12-PFOA  │

│                  │Perflurononanoic acid     │PFNA  │13C12-PFNA  │

│                  │Perflurodecanoic acid     │PFDA  │13C12-PFDA  │

│                  │Perfluroundecanoic acid   │PFUnDA│13C12-PFUnDA│

│                  │Perflurododecanoic acid   │PFDoDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurotridecanoic acid  │PFTrDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurotetradecanoic acid│PFTeDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurohexadecanoic acid │PFHxDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurooctadecanoic acid │PFOcDA│13C12-PFDoDA│

└─────────┴─────────────┴───┴──────┘

5. 시료의 채취 및 보관

퇴적물 시료는 스텐레스 스파튤라를 이용해 표층 4 cm를 취해서 250 mL 차광용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 ?20 °C 이하에서 보관한다.

6. 시험 방법

6.1  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 시료를 동결건조기를 사용하여 건조시켜 2 mm 체로 거른 다음 막자사발을 이용 분쇄 및 균질화한다.

6.2  추출(초음파 추출방법)

6.2.1  균질화된 해저퇴적물 건시료 5 g을 칭량하여 50 mL 폴리프로필렌 튜브에 넣고 내부표준물질 5 ng을 주입한다.

6.2.2  메탄올 15 mL을 첨가하여 수평식진탕기(250 rpm, 20분)와 초음파추출기(30분)를 이용하여 추출한다.

6.2.3  추출이 끝난 후 원심분리(3000 rpm, 20분)하여 상등액을 분취한다.

6.2.4  6.2.2 ∼ 6.2.3항을 1회 더 반복한다.

6.2.5  추출된 용매를 질소가스를 이용하여 1 mL 이하로 농축한다.

6.3  카트리지를 이용한 정제

6.3.1  Activated carbon 100 mg이 충진 된 카트리지를 활용한 정제 및 활성화를 위해 메탄올 3 mL로 씻어 내린다.

6.3.2  6.2.5항에서 준비된 시료를 조심스럽게 주입하여 카트리지를 통과시킨다.

6.3.3  메탄올 4 mL을 이용하여 용출시킨다.

6.3.4  얻어진 용출액을 질소농축기로 농축하고, LC/MS/MS로 분석한다.

6.4  액체 크로마토그래피 분석

6.4.1  표 3에 주어진 액체 크로마토그래피 조건을 적용하여 제조된 측정용 시료 10 μL를 액체 크로마토그래피의 주입부에 주입한다.

6.4.2  액체크로마토그래프- 삼중질량분석기의 전자분사 이온화 방식을 이용하여 과불화화합물을 검출한다. 표 4와 표 5에 주어진 분석대상물질 별 정량 및 정성을 위한 모분자이온(Q1)과 생성이온(Q3) 조건을 적용하여 다중반응검지법(MRM)으로 분석한다. 정량 및 정성이온의 머무름 시간과 면적비를 검사하여 각 물질들을 확인한 다음 내부표준법으로 정량한다.

표 3. PFASs 분석을 위한 LC/MS/MS의 기기조건

┌───────────────────────────┐

│액체크로마토그래프(LC) 조건                           │

├─────────┬─────────────────┤

│Column            │C18, 2.1 × 150 mm, 5.0 μm       │

├─────────┼─────────────────┤

│Mobile phase      │A: 5 mM Ammonium acetate in water │

│                  │B: Methanol                       │

├─────────┼──┬─┬──┬──┬──┬───┤

│Gradient mode     │Time│0 │5   │10  │10.1│22    │

│                  ├──┼─┼──┼──┼──┼───┤

│                  │A(%)│70│0   │0   │70  │70    │

│                  ├──┼─┼──┼──┼──┼───┤

│                  │B(%)│30│100 │100 │30  │30    │

├─────────┼──┴─┴──┴──┴──┴───┤

│Flow rate         │300 μL/min                       │

├─────────┼─────────────────┤

│Injection volume  │10 μL                            │

├─────────┴─────────────────┤

│삼중질량분석기(MS/MS) 조건                            │

├─────────┬─────────────────┤

│Ionization mode   │ESI negative mode                 │

├─────────┼─────────────────┤

│Curtain gas       │25 psi                            │

├─────────┼─────────────────┤

│Gas temperature   │400 °C                           │

├─────────┼─────────────────┤

│Ion spray voltage │?4500 V                          │

├─────────┼─────────────────┤

│Ion source gas 1  │40 psi                            │

│Ion source gas 2  │60 psi                            │

├─────────┼─────────────────┤

│Collision gas(CAD)│6                                 │

└─────────┴─────────────────┘

표 4. PFASs 분석을 위한 표준물질(17종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질│정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│        ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │        │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │        │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │        │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│PFSAs │PFBS    │298.9 │99.9  │36        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHS    │398.9 │80.0  │48        │398.9 │99.0  │40        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOS    │498.9 │79.9  │60        │498.9 │99.0  │48        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDS    │598.9 │80.0  │60        │598.9 │99.0  │66        │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│PFCAs │PFPeA   │262.9 │218.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHxA   │312.9 │268.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHpA   │362.9 │318.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOA    │412.9 │368.9 │8         │412.9 │168.8 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFNA    │462.8 │418.9 │8         │462.8 │218.8 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDA    │513.0 │469.0 │8         │513.0 │269.0 │20        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFUnDA  │563.0 │518.8 │8         │563.0 │269.0 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDoDA  │613.0 │569.0 │8         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFTrDA  │663.0 │618.8 │8         │663.0 │268.9 │23        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFTeDA  │712.9 │668.8 │12        │712.9 │368.5 │20        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHxDA  │812.9 │768.8 │12        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOcDA  │912.9 │868.8 │12        │912.9 │369.0 │28        │

└───┴────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

표 5. PFASs 분석을 위한 내부표준물질(9종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬──────┬──────────────┬──────────────┐

│대상  │대상물질    │정량이온                    │정성이온                    │

│화합물│            ├────┬───┬─────┼────┬───┬─────┤

│      │            │Q1      │Q3    │Collision │Q1      │Q3    │Collision │

│      │            │(m/z)   │(m/z) │energy    │(m/z)   │(m/z) │energy    │

│      │            │        │      │(CE)      │        │      │(CE)      │

├───┼──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│PFSAs │13C12-PFBS  │301.9   │79.7  │62        │-       │-     │-         │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFHS  │402.9   │83.7  │60        │402.9   │102.8 │50        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFOS  │502.9   │79.9  │100       │502.9   │98.7  │50        │

├───┼──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│PFCAs │13C12-PFHxA │314.7   │269.9 │4         │-       │-     │-         │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFOA  │416.9   │371.9 │8         │416.9   │168.8 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFNA  │467.8   │422.9 │8         │467.8   │219.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFDA  │514.9   │469.9 │8         │514.9   │219.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFUnDA│564.9   │519.9 │8         │564.9   │269.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFDoDA│614.9   │569.9 │8         │614.9   │269.0 │20        │

└───┴──────┴────┴───┴─────┴────┴───┴─────┘

7. 정도평가/정도관리

7.1  검출한계

7.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

7.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 기기검출한계는 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 3배(혹은 5배)로 정의한다. 

7.1.3  정량한계(Limit of Quantification, LOQ)

측정장치에서 분석 물질의 정밀성과 정확성을 가지는 정량값을 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 정량한계는 일반적으로 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 10배로 정의한다.

7.1.4  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석절차 하에 측정하며, 이 때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

7.2  정확도(Accuracy)

7.2.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석 전 시료에 첨가되어진 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

7.2.2  표준시료(Certified reference material, CRM)의 회수율

공인되어진 표준시료를 분석하여 얻어진 값과 공인값을 비교하여 시료 분석의 정확도를 검증한다.

                             (식 1)

기기분석에서 관측되어진 값은 제 6.2.2항으로부터 계산되어진다. 공인된 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 자료질관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 측정된 농도는 표준물질의 공인값에 만족하는 결과를 나타내어야 한다. 국제원자력기구(IAEA) 및 미국 표준기술원(NIST) 등에서 생산된 다양한 CRM을 구입하여 사용할 수 있다.

7.2.3  시료에 첨가되어진 표준물질의 회수율

해저퇴적물 시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후, 동일한 실험을 수행하고 회수되어진 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

            (식 2)

     M: 첨가한 표준물질의 양

     Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값

     Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

7.3  검량선

7.3.1  분석대상 과불화화합물의 표준물질용액에 대하여 0.05 ∼ 1000 ng/mL 농도 범위에서 0을 포함한 5단계 이상의 표준농도 계열을 만들고, 내부표준물질이 일정 농도가 되도록 혼합 조제한다.

7.3.2  7.3.1항에서 조제한 농도별 표준물질혼합액 10 μL를 LC/MS/MS에 주입하고, 각 과불화화합물의 크로마토그램을 기록한다.

7.3.3  내부표준물질 및 농도별로 측정된 개별 과불화화합물의 크로마토그램을 확인 후, 머무름시간 및 설정된 다중반응검지법(MRM) 조건으로 정성ㆍ확정한다.

7.3.4  각각의 과불화화합물별로 검출된 피크(정량 이온) 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 표준용액 중의 각 과불화화합물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

7.3.5  분석대상 물질의 상대반응계수(RRF)를 구한다. RRF는 다음 식에 의해 산출한다.

                           (식 3)

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Cs: 표준용액 중의 분석 대상 물질의 농도

     CIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도

8. 결과

8.1  농도 계산

분석 대상의 각 과불화화합물의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                           (식 4)

     C: 분석대상물질의 농도

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(ng)

     RRF: 상대반응계수

     W: 시료량(건중량)

9. 분석 절차 흐름도

┌────────────────────────────┐  

│동결건조된 해저퇴적물 5 g                               │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　← 내부표준물질 5 ng 첨가                               

┌┴───────────────────────────┐  

│1차 용매추출: Methanol 15 mL                            │  

│                                                        │  

│(수평식 진탕기: 250 rpm, 20 분, 초음파추출장치: 30 분)  │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　                                                        

┌┴───────────────────────────┐  

│원심분리(3000 rpm, 20 분) 후 상등액(Methanol) 분취      │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　                                                        

┌┴───────────────────────────┐  

│2차 용매추출: Methanol 15 mL                            │  

│                                                        │  

│(수평식 진탕기: 250 rpm, 20 분, 초음파추출장치: 30 분)  │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　                                                        

┌┴───────────────────────────┐  

│원심분리(3000 rpm, 20 분) 후 상등액(Methanol) 분취      │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　                                                        

┌┴───────────────────────────┐  

│1차, 2차 용매추출 후 분취된 상등액(Methanol) 질소 농축  │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　                                                        

┌┴───────────────────────────┐  

│정제(Clean-up)                                          │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　                                                        

  │                                                          

  │←   Activated carbon (100 mg)                            

  │     카트리지 활성화(Methanol 3 mL)                       

  │                                                          

  │                                                          

┌┴───────────────────────────┐  

│용출(Methanol 4 mL)                                     │  

└┬───────────────────────────┘  

  │                                                          

┌┴───────────────────────────┐  

│농축(Evaporation)                                       │  

└┬───────────────────────────┘  

  │　                                                        

┌┴───────────────────────────┐  

│LC/MS/MS 분석                                           │  

└────────────────────────────┘  

제39항 헥사브로모사이클로도데칸류       (Hexabromocyclododecanes, HBCDs)

1. 측정원리

속슬렛 추출법을 이용하여 해저퇴적물 중의 브롬화난연제(BFRs) 중 헥사브로모사이클로도데칸(Hexabromocyclododecanes, HBCDs)을 추출한 후 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 황 등의 분석 방해물질을 제거한 뒤 액체크로마토그래프-삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)의 전자분무식이온화(ElectroSpray Ionization, ESI) 방식을 사용하여 다중반응검지법(Multiple Reaction Monitoring, MRM)으로 분석한다.

2. 정량범위 및 정밀도

유효 정량 범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 분석기기에 대한 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있다. 건시료 10 g의 기준 액체크로마토그래프-삼중질량분석기를 이용한 헥사브로모사이클로도데칸(HBCDs)의 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 99 % 신뢰구간에서 0.03 ng/g dw(건중량) 정도이며, 성분별 정량한계를 표 1에 나타내었다.

표 1. HBCDs의 정량한계(LOQ)

┌────┬─────────┐

│성분    │정량한계(ng/g dw) │

├────┼─────────┤

│α-HBCD │0.03              │

├────┼─────────┤

│β-HBCD │0.03              │

├────┼─────────┤

│γ-HBCD │0.03              │

└────┴─────────┘

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 HBCDs의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용 전 확인 시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다. 실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시켜 사용하기 전에 아세톤으로 닦아 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  속슬렛 추출장치: 냉각장치, 속슬렛 추출장치, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.2  250, 500 mL 갈색유리병

3.1.3  250, 500 mL 가지형 플라스크

3.1.4  1 ∼ 2 mL 유리바이알

3.1.5  10 mL 시험관

3.1.6  액체 컬럼크로마토관: 다층 실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm)의 유리제 컬럼크로마토관

3.1.7  탈지면: 헥세인 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  기기

3.2.1  회전증발농축기(Rotary Evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인장치(Aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환장치(Cooling Circulator)

3.2.4  액체크로마토그래피/삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)

3.2.4.1  LC 시스템: 5 ∼ 10 μL 용량의 시료를 반복적으로 주입할 수 있어야 하며, 농도 기울기 조절이 가능하고 분석 유량(0.4 mL/min)을 일정하게 유지할 수 있는 이성분(binary) 펌프가 있는 시스템이 요구된다. 액체크로마토그래프 시스템은 오염의 원인이 될 수 있는 기포제거장치(degasser)가 없이도 용매를 일정하게 조절할 수 있어야 한다.

3.2.4.2  권장 컬럼: 적절한 분해능, 피크 모양, 정확도 및 정밀도를 가지는 역상 C18 액체크로마토그래프 컬럼(2.1 × 150 mm, 3.5 μm 또는 동급 이상)을 사용한다.

3.2.4.3  검출기(MS/MS):　액체크로마토그래프(LC)에서 분석하는 유량(0.4 mL/min) 근처에서 음이온 전자분사 이온화(ESI)가 가능한 장비이어야 한다. 적절한 정밀도를 유지하기 위해서 크로마토그램 상의 피크당 10번 이상의 스캔을 할 수 있어야 한다.

3.2.4.4  이동상: 이동상은 HBCDs 분리에 적절하도록 선택한다. 이동상 A는 25 % 메탄올이 포함된 증류수, 이동상 B는 30 % 메탄올이 포함된 아세트나이트릴을 이용하여 분리하고 방해물질과 분석대상물질의 피크가 최대한 겹치지 않는 경사용매조성법(gradient mode)을 이용한다. 또한 이동상의 유량은 컬럼의 분리효율이 최대로 되는 400 μL/min으로 하고 시료 주입량은 10 μL로 한다.

4. 시약 및 표준용액

전체의 시약류에는 브롬화난연제의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인 시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약

4.1.1  아세톤

4.1.2  헥세인

4.1.3  디클로로메탄

4.1.4  메탄올

4.1.5  아세트나이트릴

4.2  세정수: 헥세인으로 세정한 것

4.3  무수황산나트륨: 잔류농약시험용 혹은 그와 동등 이상의 것

4.4  황산, 염산, 수산화칼륨, 질산은: 시약특급 혹은 이것과 동등 이상의 것

4.5  환원구리: 유기원소분석용 환원구리(60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 진한 염산으로 세척한 다음, 증류수로 씻고, 메탄올로 수 회 씻은 후 다시 헥세인으로 세척하여 헥세인 중에 보관한다.

4.6  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.6.1  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 1 mol/L 수산화칼륨 용액을 4.5의 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 혼합 후 밀폐 가능한 용기에 넣어 진공데시케이터 내에 보관한다.

4.6.2  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 4.5의 실리카겔에 황산이 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 혼합 후 밀폐 가능한 용기에 넣어 진공데시케이터 내에 보관한다.

4.7  표준용액과 내부표준용액

4.7.1  표준용액(표 2): 표준용액은 메탄올을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석 물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.7.2  내부표준용액(표 2): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업 농도범위로 희석하여 사용한다.

표 2. HBCDs의 표준물질 및 내부표준물질

┌──────┬─────────────┬────┬───────┐

│대상 화합물 │HBCDs 화합물              │약어    │내부표준물질  │

├──────┼─────────────┼────┼───────┤

│HBCDs       │α-Hexabromocyclododecane │α-HBCD │13C12-α-HBCD │

│            ├─────────────┼────┼───────┤

│            │β-Hexabromocyclododecane │β-HBCD │13C12-β-HBCD │

│            ├─────────────┼────┼───────┤

│            │γ-Hexabromocyclododecane │γ-HBCD │13C12-γ-HBCD │

└──────┴─────────────┴────┴───────┘

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  해저퇴적물 시료는 스테인레스 스파튤라를 이용해 표층 4 cm를 취해서 250 mL 차광용기에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 ?20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 시료를 동결건조기를 사용하여 건조시켜 2 mm 체로 거른 다음 막자사발을 이용 분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법

6.1  추출(속슬렛 추출방법)

6.1.1  균질화 된 해양퇴적물 건시료 10 g을 칭량하여 팀블 여과지에 넣고 내부표준물질을 20 ng을 첨가한다.

6.1.2  팀블 여과지를 속슬렛 추출장치에 넣은 후, 디클로로메탄:헥세인 혼합용액(3:1, v/v) 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

6.1.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속슬렛 장치를 분리한다.

6.1.4  추출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.1.5  황 용출에 의한 기기 분석의 방해가 염려될 경우에는 환원구리를 이용하여 황을 제거한 후 다음의 과정을 거친다.

6.2  다층실리카겔 컬럼 크로마토그래피 정제

6.2.1  컬럼 크로마토관의 액면을 헥세인으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.2.2  헥세인을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.3  4.6.1항에서 조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.2.4  4.6항의 실리카겔 1 g을 충진한다.

6.2.5  4.6.2항의 44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

6.2.6  4.6항의 실리카겔 1 g을 충진한다.

6.2.7  상층에 무수황산나트륨을 1cm 높이로 충진한다.

6.2.8  시료 용액을 조심스럽게 주입하고, 소량의 헥세인으로 세정한다.

6.2.9  50 % 디클로로메탄이 함유된 헥세인 용액 100 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.10 . 얻어진 용출액을 회전증발농축기로 1 mL까지 농축하고, 메탄올을 100 ∼ 1000 μL 첨가해 용매 치환 후 질소가스로 0.5 mL까지 농축하여 LC/MS/MS로 분석한다.

6.3  액체 크로마토그래프 분석

6.3.1  표 3에 주어진 액체 크로마토그래프 조건을 적용하여 제조된 측정용 시료 10 μL를 액체 크로마토그래프의 주입부에 주입한다.

6.3.2  액체크로마토그래프- 삼중질량분석기의 전자분사 이온화 방식을 이용하여 브롬화난연제를 검출한다. 표 4와 표 5에 주어진 분석대상물질 별 정량 및 정성을 위한 모분자이온(Q1)과 생성이온(Q3) 조건을 적용하여 다중반응검지법(MRM)으로 분석한다. 정량 및 정성이온의 머무름 시간과 면적비를 검사하여 각 물질들을 확인한 다음 내부표준법으로 정량한다.

표 3. HBCDs 분석을 위한 LC/MS/MS의 기기조건

┌──────────────────────────┐

│액체크로마토그래프(LC) 조건                         │

├─────────┬────────────────┤

│Column            │C18, 2.1 × 150 mm, 3.5 μm     │

├─────────┼────────────────┤

│Mobile phase      │A: 25 % Methanol in water       │

│                  │B: 30 % Methanol in Acetonitrile│

├─────────┼──┬─┬─┬──┬──┬─┬─┤

│Gradient mode     │Time│0 │1 │2   │10  │11│15│

│                  ├──┼─┼─┼──┼──┼─┼─┤

│                  │A(%)│90│90│0   │0   │90│90│

│                  ├──┼─┼─┼──┼──┼─┼─┤

│                  │B(%)│10│10│100 │100 │10│10│

├─────────┼──┴─┴─┴──┴──┴─┴─┤

│Flow rate         │400 μL/min                     │

├─────────┼────────────────┤

│Injection volume  │10 μL                          │

├─────────┴────────────────┤

│삼중질량분석기(MS/MS) 조건                          │

├─────────┬────────────────┤

│Ionization mode   │ESI negative mode               │

├─────────┼────────────────┤

│Curtain gas       │25 psi                          │

├─────────┼────────────────┤

│Gas temperature   │400 °C                         │

├─────────┼────────────────┤

│Ion spray voltage │?4500 V                        │

├─────────┼────────────────┤

│Ion source gas 1  │40 psi                          │

│Ion source gas 2  │60 psi                          │

├─────────┼────────────────┤

│Collision gas(CAD)│6                               │

└─────────┴────────────────┘

표 4. HBCDs 분석을 위한 표준물질(3종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질│정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│        ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │        │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │        │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │        │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│HBCDs │α-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │β-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │γ-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

└───┴────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

표 5. HBCDs 분석을 위한 내부표준물질(3종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬───────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질      │정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│              ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │              │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │              │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │              │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│HBCDs │13C12-α-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

│      ├───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │13C12-β-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

│      ├───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │13C12-γ-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

└───┴───────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  검출한계

7.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

7.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 기기검출한계는 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 3배(혹은 5배)로 정의한다.

7.1.3  정량한계(Limit of Quantification, LOQ)

측정장치에서 분석 물질의 정밀성과 정확성을 가지는 정량값을 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 정량한계는 일반적으로 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 10배로 정의한다.

7.1.4  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석절차 하에 측정하며, 이 때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

7.2  정확도(Accuracy)

7.2.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석 전 시료에 첨가된 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

7.2.2  표준시료(Certified reference material, CRM)의 회수율

공인되어진 표준시료를 분석하여 얻어진 값과 공인값을 비교하여 시료 분석의 정확도를 검증한다.

              (식 1)

기기분석에서 관측되어진 값은 제 6.2.2항으로부터 계산되어진다. 공인된 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 자료질관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 측정된 농도는 표준물질의 공인값에 만족하는 결과를 나타내어야 한다. 국제원자력기구(IAEA) 및 미국 표준기술원(NIST) 등에서 생산된 다양한 CRM을 구입하여 사용할 수 있다.

7.2.3  시료에 첨가된 표준물질의 회수율

해수 시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가하여 동일한 실험을 수행한 후 회수된 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

          (식 2)

     M: 첨가한 표준물질의 양 

     Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값 

     Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

7.3  검량선

7.3.1  분석대상 브롬화난연제의 표준물질 용액에 대하여 1 ∼ 500 ng/mL 농도 범위에서 5단계 이상의 표준농도 계열을 만들고, 일정 농도의 내부표준물질을 첨가한 후 혼합 조제한다.

7.3.2  7.3.1에서 조제한 표준 농도 계열의 10 μL를 LC/MS/MS에 주입하고, 각 브롬화화합물의 크로마토그램을 기록한다.

7.3.3  내부표준물질 및 농도별로 측정된 개별 브롬화화합물의 크로마토그램을 확인 후, 머무름시간 및 설정된 다중반응검지법(MRM) 조건으로 정성ㆍ확정한다.

7.3.4  각각의 브롬화화합물별로 검출된 피크(정량 이온) 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 표준용액 중의 각 브롬화화합물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

7.3.5  분석대상 물질의 상대반응계수(RRF)를 구한다. RRF는 다음 식에 의해 산출한다.

                           (식 3)

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Cs: 표준용액 중의 분석 대상 물질의 농도

     CIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도

8. 결과

8.1  농도 계산

다음 식에 의해 농도를 환산한다.

                        (식 4)

     C: 분석대상물질의 농도

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(ng)

     RRF: 상대반응계수

     W: 시료량(건중량)

9. 분석절차 흐름도

┌────────────────┐        

│퇴적물(건시료 약 10 g)          │        

└┬───────────────┘        

  │← 내부표준물질 20 ng 첨가              

┌┴───────────────┐        

│속슬렛 추출(Soxhlet Extraction) │        

└┬───────────────┘        

  │←  75 % DCM in Hexane (200 mL, 16 hr)  

┌┴───────────────┐        

│농축(Evaporation)               │        

└┬───────────────┘        

  │←  환원구리 첨가(황제거)               

┌┴───────────────┐        

│다층실리카겔컬럼 정제(Clean-up) │        

└┬───────────────┘        

  │← 50 % DCM in Hexane (100 mL)          

┌┴───────────────┐        

│농축(Evaporation)               │        

└┬───────────────┘        

  │← Methanol 치환                        

┌┴───────────────┐        

│LC/MS/MS 분석                   │        

└────────────────┘        

그림 1. 해저퇴적물 내 브롬화난연제(HBCDs)의 분석절차 흐름도

별표 0003: 해양생물공정시험기준

[별표3] 해양생물공정시험기준

2023. 12.

해양수산부 국립수산과학원

목   차

제1장 총칙1

제1항 개요1

제2장 시료의 채취 및 보관2

제1항 시료의 채취방법2

제2항 시료의 보관방법12

제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법16

제1항 분석자료의 기초통계16

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)16

제4장 항목별 시험방법17

제1항 클로로필(chlorophylls) 및 총 카로틴노이드(total carotenoids)17

제2항 HPLC를 이용한 광합성 색소 측정방법27

제3항 대장균군32

제4항 발광박테리아를 이용한 독성평가 방법49

제5항 구리(Copper, Cu)55

제6항 납(Lead, Pb)63

제7항 니켈(Nickel, Ni)65

제8항 망간(Manganese, Mn)67

제9항 아연(Zinc, Zn)69

제10항 카드뮴(Cadmium, Cd)71

제11항 코발트(Cobalt, Co)73

제12항 크롬(Chromium, Cr6+)75

제13항 비소(Arsenic, As)77

제14항 총 수은(Total Mercury, Hg)85

제15항 유기염소계 농약(Organochlorine Pesticides, OCPs)93

제16항 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)101

제17항 폴리클로리네이티드비페닐(Polychlorinated Biphenyls, PCBs)109

제18항 유기주석화합물(Butyltins, BTs)116

제19항 폴리브롬화 디페닐에테르(Polybrominated Diphenyl Ethers, PBDEs)123

제20항 해산규조류(Skeletonema costatum)를 이용한 해양생태독성 시험방법136

제21항 다시마(Saccharina japonica)를 이용한 해양생태독성 시험방법145

제22항 미역(Undaria pinnatifida)을 이용한 해양생태독성 시험방법154

제23항 해산 로티퍼(Brachionus plicatilis)를 이용한 해양생태독성 시험방법163

제24항 참굴(Crassostrea gigas)을 이용한 해양생태독성 시험방법172

제25항 성게(Hemicentrotus pulcherrimus)를 이용한 해양생태독성 시험방법 180

제26항 다이옥신 및 퓨란(Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins and Furans, PCDD/Fs)189

제27항 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐(Dioxin-like PCBs, DL-PCBs)202

제28항 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl Substances, PFASs)214

제29항 헥사브로모사이클로도데칸류(Hexabromocyclododecanes, HBCDs)225

제1장 총칙

제1항 개요

1. 목적

이 시험 방법은 「해양환경관리법」 제10조의 규정에 의거 해양생물에 관련된 오염 물질을 측정함에 있어서 측정 결과의 정확도 및 정밀도 그리고 분석 방법의 일관성을 유지하기 위하여 필요한 제반 사항을 규정하는 데 그 목적을 둔다.

2. 적용범위

「해양환경관리법」 제9조 제1항의 규정에 의한 "해양환경측정망", 「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」 제18조 제1항에 따른 "해양환경종합조사", 같은 법 제39조 "잔류성 유기오염물질 조사", 같은 법 제77조의 "해양오염영향조사", 그 외 「해양환경보전 및 활용에 관한 법률」에서 정하는 해양환경에 대한 조사는 별도의 규정이 없는 한 공정시험기준(해양생물편)의 규정에 따른다.

3. 일반사항

해수공정시험기준 제1장 총칙 중 개요 3. 일반사항에 따른다.

제2장 시료의 채취 및 보관

제1항 시료의 채취방법

1. 해양생물 시료채취의 일반사항

1.1  주의사항

해양생물의 자료는 시료채취ㆍ보관, 실험실 분석 및 통계처리 등 여러 단계를 거쳐 획득되는데 이러한 단계별로 정도가 다른 오류가 항시 존재한다. 이러한 오류는 단계에 따라 연계적으로 축적될 경우, 최종자료의 오류는 크게 증폭되어 부정확한 해양생물 자료를 나타내기 때문에 시험자는 항상 각 단계별로 오류를 최소화할 수 있도록 노력 한다. 이 중 가장 중요한 것은 가장 초기 단계인 시료채취 단계인데 육상환경 조사와는 달리 해양환경 조사는 해상조건과 조사작업 환경이 열악하기때문에 시료의 채취단계에서 시료병과 채수기 오염 또는 채수 과정에서의 교차오염을 최소화 한다.

1.2  시료채취

해양생물 시료채취 계획은 조사 해역의 해양생물 현황이 효율적으로 대표될 수 있도록 사전에 해수의 유동성, 각 조사항목의 시공간적인 변화폭을 고려하여 수립 한다. 이에 따른 고려사항은 다음과 같다.

1.2.1  채취지점의 수평적 간격: 해양생물의 수평분포 변화가 잘 나타날 수 있도록 채취 지점의 간격과 수를 결정한다.

1.2.2  채취수심의 수직적 간격: 채취지점의 밀도약층을 고려하여 해양생물의 수직적 변화가 잘 나타날 수 있도록 수직 간격을 결정한다.

1.2.3  시료채취의 시간 간격: 조사목적과 시간에 따른 해양생물의 변화가 잘 나타날 수 있도록 필요한 시간 간격을 결정한다. 그 예로 외양의 경우는 월별 또는 계절 간격이 될 수 있으며, 연안역 특히 조석 변화가 큰 해역에서는 주요 채취지점에서 2 조석주기 이상 매시간 연속 관측을 병행할 수 있다.

1.2.4  시료의 반복 개수: 동일 채취지점에서 시료의 대표성을 확보하기 위하여 농도에 따라 시료의 반복 개수를 증감한다. 예로서 미량 농도의 시료인 경우, 시료의 개수를 증가시켜 정밀도가 높은 평균 분석치를 얻을 수 있다.

1.2.5  시료채취 방법: 조간대와 조하에 서식하는 해양생물에 따라 적합한 채취 방법을 선택한다.

1.3  시료용기

시료채취 용기는 해양생물종 및 분석항목에 따라 적합한 용기를 사용한다. 경질의 유리용기 또는 플라스틱 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기를 선택하여 사용한다. 시료 용기는 사용 전에 미리 10 % 염산 또는 질산으로 세척 후 초순수로 세척하여 사용 하며 해양생물 시료채취 직전에 채취지점의 시료로 3회 이상 헹구어낸 뒤 용기에 시료를 담아야 한다.

2. 동ㆍ식물 플랑크톤 채집

2.1  주의사항

플랑크톤은 크기가 매우 작고 운동 능력이 상대적으로 작아 해수의 유동에 의해 떠다니는 생물을 칭한다. 이들은 다시 영양방식에 따라 광합성을 통해 스스로 유기물질을 합성하는 식물플랑크톤과 이들 식물플랑크톤과 작은 크기의 생물을 섭식하는 동물플랑크톤으로 나뉜다. 이들은 해양에서 유기물을 합성하고 이를 대형 동물이 먹고 자라게 해주는 연결고리 역할을 하기에 매우 중요한 생태계 요소이다. 이러한 이유에서 해양환경 또는 해양생태계 영향을 논할 때 이들의 생물량은 매우 중요한 판단 요소가 된다.

한편, 이들 플랑크톤은 해양에서 그 분포 형태가 매우 불규칙한 Patchy 분포라는 특성이 있다. 이러한 분포 특성은 생물량의 불편추정치(unbiased estimate)를 파악하는 데 많은 장애 요인이 있게 한다. 자연에 존재하는 생물량의 불편추정치를 얻지 못하면 환경의 변동이나 특정 요인에 대한 생물의 반응을 판단할 수 없다. 이러한 관점에서 동ㆍ식물플랑크톤 생물량의 불편추정치를 얻는 것은 매우 중요한 일이다. 동물플랑크톤은 심한 patchy라는 분포 특성 이외에도 일주수직이동(diel vertical migration)이라는 행동 특성을 갖는데, 이러한 행동 특성은 해양에 존재하는 동물플랑크톤이 어떤 종류이며 각각은 얼마나 존재하고 있는지 그 생물량의 불편추정치(unbiased estimate of biomass)를 얻는데 또 다른 장애 요인으로 작용한다.

식물플랑크톤과 관련하여서는 생물량 표현에서 가장 일반적인 클로로필(chlorophyll)량의 측정법과 현미경을 이용하여 동정ㆍ계수하는 방법만 기술하고, 동물플랑크톤에 대해서는 분포 특성과 행동 특성을 고려하여 신뢰성 높은 생물량의 불편추정치를 얻기 위한 현장 채집 방법과 실험실에서 얻어야 할 기본적인 자료의 종류와 그 도출 방법에 대하여 표준을 제시하고자 한다.

2.2  채집 정점의 선정

통상 해양에서 생물채집 정점을 정할 때 무작위 표본 추출방식(random sampling)은 잘 사용하지 않는다. 주로 일정 거리를 둔 격자 모양의 채집 정점을 정하는데 이러한 규칙적인 정점 선정 방식(systematic sampling)은 대상지역에 대한 사전 정보가 없을 때 유용하게 쓰인다. 그러나 대상 지역에 대한 사전 정보가 있고, 그 정보가 대상 지역을 몇 개의 특성 지역으로 세분할 수 있다면, 이 systematic sampling 방법에 stratified sampling 방식을 혼용하여 정점을 정한다. 따라서 대상 정점의 선정에 대해 일률적으로 말하기는 어렵다.

정점 선정에서 또 하나 중요한 것은 인접 정점 간 최소 거리로서, 이 거리는 해당 지역의 해수 유동 정도에 따라 정해져야 한다. 가령 정점 A에서 생물 채집을 마치고 다른 정점 B로 이동하였을 경우, 두 정점의 지리적 위치는 다르지만 그 사이 해수가 같은 방향으로 이동하여 생물이 채집되는 해수덩어리는 같은 것일 수 있다. 반대로 해수 이동의 반대 방향으로 채집 정점의 이동 순서를 정했다면 실제 동물플랑크톤을 채집한 해수 덩어리 간의 거리는 지리적 정점 간 거리보다 훨씬 멀리 떨어진 것이 된다. 이러한 점을 고려하여 인접 정점 간에는 충분한 거리 간격을 두어야 한다.

해양에서 동식물플랑크톤의 분포로 알고자 하는 것은 대체로 인간 활동의 영향이 해양생태계에 미친 영향을 파악하고자 함이다. 따라서 대부분의 경우, 이 인간 활동의 중심을 조사 영역의 중심으로 한다. 이런 경우는 대체로 영향권이 충분히 예상되기 때문에, 전혀 영향이 미치지 않을 것으로 생각되는 소위 control site를 정할 필요가 있다. 즉, 경우에 따라 다를 수도 있으나 가능한 한 control과 experimental이라는 비교적 관점을 항상 염두에 두어야 한다.

2.3  채집 시각 및 수심의 결정

2.3.1  식물플랑크톤

식물플랑크톤의 경우, 채집 시각은 통상 고려하지 않으나 주간 혹은 야간으로 통일시키는 것이 바람직하다. 채집 수심은 과학적 연구를 목표로 하는 경우는 소위 표준수심이라고 하여, 표층, 1 m, 2 m, 3 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 50 m, 75 m, 100 m 등 점차 간격을 넓혀가는 방법을 사용한다. 그러나 이러한 표준수심은 학문적 연구를 위한 것으로 환경영향평가와 같은 경우, 표준수심을 채택하면 시료의 수가 엄청나게 많아 현실적으로 인용하기 어렵다. 통상 표층, 중층, 저층의 3개 수층을 대상으로 한다. 우리나라 주변 해역의 경우, 서해 연안은 조석 혼합이 활발하여 표층과 저층의 두 개 수층을 선택할 수도 있으며, 남해의 경우는 표층, 중층, 저층의 3개 층을, 그리고 동해의 경우는 수온의 수직분포를 고려하여 표층, 수온약층 위, 수온약층, 그리고 수온약층 하부의 4개 층을 권장할 수 있다.

2.3.2  동물플랑크톤

2.3.2.1  일반적인 방법

동물플랑크톤의 경우, 채집 시각은 정점 간 이동 거리를 감안하여 결정해야 하며, 가능한 동일 시간대에 채집하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 낮 시간에 모든 정점을 채집한다거나 밤 시간에 모든 정점을 채집하는 등 채집 시각을 낮과 밤 또는 오전, 오후 등으로 맞추어 주는 것이 좋다. 정점 간 거리가 멀고 시일이 오래 걸리는 경우, 이렇게 채집 시각을 일치시키기 어려운 경우가 많다. 이렇게 불가피하게 하루 중 채집 시각을 비슷하게 유지시키지 못할 경우에는 반드시 채집 시각을 기록해두어야 한다. 채집 수심은 채집하고자 하는 대상 동물의 생태학적 특성과 연구 목적을 고려하여 결정 한다. 동물플랑크톤은 patchy 분포를 하기 때문에 각각의 조사 정점에서 일정한 수심 간격으로 채집하는 것보다는 조사 해역의 물리ㆍ화학적, 생물학적 특성을 고려하여 채집 수심을 결정하는 것이 좋다. 또한, 연구 목적이 일주수직이동이나 수층별 분포 양상과 같이 동물플랑크톤의 생태적 특성을 반영하는 것이라면 채집 기기와 채집 수심을 신중히 결정해야 한다.

일주수직이동과 수층별 채집 방법은 다시 다룰 것이고 여기에서는 일반적인 네트 채집 방법으로 채집 시 채집 수심을 결정하는 방법에 대해 기술한다. 예를 들어, 대양의 경우, 수온약층(thermocline)이나 염분약층(halocline)이 형성되어 있는 곳에서는 동물플랑크톤 군집이 이 층을 중심으로 상부와 하부에서 차이를 보일 수 있다. 동물플랑크톤의 개체군 밀도는 여과된 물속에 있던 평균값을 나타내기 때문에 동물플랑크톤 생물량은 채집 수심과 조건을 반드시 명시해야 한다. 예시: 수심 100m에서 표층까지 수직 인양하여 채집

 조석의 영향과 해수의 수괴 혼합이 활발한 연안역에서는 저층부터 표층까지 전 수층을 대상으로 채집하는 것이 좋다.

네트가 도달한 깊이는 인양줄의 각도에 의해 계산할 수 있다. 네트가 도달한 정확한 깊이를 측정하기 위해서는 수심 측정기(depth recorder)나 그 밖의 수심 기록 장치를 네트에 부착하여 채집 수심을 정확히 산출할 수 있다.

2.3.2.2  동물플랑크톤 일주수직이동을 고려한 방법

동물플랑크톤의 일주수직이동과 수층별 분포를 연구하기 위해서는 수층별로 분리된 시료를 채집하는 것이 필요하다. 이를 위해서는 개폐식 네트가 필요하다. 네트의 종류에 대해서는 다음에서 다루도록 하고 여기에서는 수층별 채집 시 주의 사항에 대해서만 다루도록 하겠다. 일주수직이동을 고려한 연구에서 채집 시각은 하루 중 4시간 간격으로 6회 채집을 권장한다. 그러나, 수괴의 이동과 혼합이 활발한 지역에서는 채집 간격을 보다 짧은 주기로 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 우리나라 연안역과 같이 하루 중 6시간 주기로 조석의 영향을 받는 해역에서는 4시간 간격의 채집보다는 조석 주기를 감안하여 3시간 또는 2시간 주기의 채집을 권장한다. 채집 수심은 앞서 일반적 방법의 채집 수심에서 언급된 바와 같이 조사 해역의 물리ㆍ화학적, 생물학적 특성을 고려하여 채집 수심을 결정해야 한다. 예를 들어, 수온약층(thermocline)이나 염분약층(halocline)이 형성되어 있는 경우, 수온약층이나 염분약층을 포함하여 최소 3층 이상을 채집하는 것이 바람직하다.

2.4  채집 기기의 선택

2.4.1  식물플랑크톤 채집

식물플랑크톤은 대부분 현미경적인 크기(수 μm ∼ 수백 μm)이며, 해수 1 L 중에 103 ∼ 108 세포의 농도로 존재한다. 따라서, 식물플랑크톤의 채집은 보통 채수병으로 하는 것이 일반적이다. 채수병의 종류는 아래 동물플랑크톤 부분에 서술되는 바와 같다. 식물플랑크톤을 네트로 채집하는 경우, 망목 크기는 25 μm가 적당하며 이 네트는 통상 표층 부근에서 수직인양하며, 실제의 궤적은 사선이 되는 경우가 많다. 일반적으로 식물플랑크톤을 네트로 채집한 경우는 정성적으로 출현종의 일람표를 얻는 데 사용되며, 일정 체적 혹은 단위 면적당 생물량을 추정하는 정량적인 채집은 채수 방법을 사용한다.

2.4.2  동식물플랑크톤 채집

동물플랑크톤을 채집할 때 사용되는 방법은 채수기, 펌프, 네트 등이 이용된다. 채수기는 주로 식물플랑크톤이나 소형플랑크톤(microplankton)을 채집할 때 사용된다. 플랑크톤의 밀도에 따라 1 ∼ 50 L 정도 채수하며, 일반적으로 1 L 시료 보관병(sampling bottle)을 이용하여 정량적으로 채수하는 것이 바람직하다.

채수기의 종류에는 여러 가지가 있는데 과거에 난센채수기(Nansen water sampler)를 많이 사용하였고 요즘은 흔히 반돈 채수기(Van Dorn, 1957)를 사용한다. 반돈 채수기는 양쪽 끝이 열려있는 원통형 채수기로 PVC(polyvinyl chloride)나 폴리에틸렌(polyethylene)과 같은 비금속 재질로 되어있고, 용량은 5 ∼ 20 L 정도이다. 채수기를 여러 개 부착하여 여러 수심에서 한꺼번에 채수를 할 수도 있다. 채집하고자 하는 수심에서 전달추(messenger)를 줄에 끼워 내리면 각 수심에 달린 채수기의 양쪽 고무마개가 자동으로 닫혀 물을 채수할 수 있다. 물론 대형 선박을 이용할 경우는 로젯 샘플러(Rosette sampler)와 같이 많은 채수기를 하나의 프레임에 달고 이 프레임을 수직으로 이동하면서 원하는 수심에서 채수할 수도 있다. 채수기를 이용한 채집은 채집 수심을 정확하게 알 수 있으며 작동이 용이한 장점이 있다.

2.4.2.1  펌프를 사용한 동물플랑크톤 채집

펌프를 사용한 채집은 얕은 수심에서 소형플랑크톤 또는 작고 몸체가 단단한 네트플랑크톤을 채집할 때 적합하다. 펌프의 종류에는 갑판용 펌프(hose-on-suction-side system)와 수중용 펌프(hose-on-output-side system)가 있다. 펌프를 사용하면 여과된 물의 양을 알 수가 있어 정확한 자료를 얻을 수 있다. 그러나, 네트로 채집할 때보다 여과되는 물의 양이 적으며, 운동 능력이 뛰어난 생물은 흡수구에서 도망칠 수 있다. 또한, 와류에 의해서 시료가 물리적인 상처를 입을 수 있으며, 젤라틴 동물플랑크톤의 경우, 시료에 상처를 입힐 수 있다.

2.4.2.2  네트를 사용한 동물플랑크톤 채집

네트는 보통 중형동물 플랑크톤(mesozooplankton) 채집을 위해 주로 사용한다. 동물플랑크톤 채집 시 가장 많이 이용되는 방법이다. 네트 채집 시 필요 품목은 네트, 채집통(cod-end bucket; 네트 후미에 부착하며 채집 시료를 모으는 시료통), 유량계(flowmeter), 부유 방지추(depressor; 네트가 부유하는 것을 방지) 등이다. 네트를 이용한 채집은 네트가 통과한 물속에 포함된 생물을 채집하는 것이다. 네트를 통과한 물의 양은 네트 입구에 부착된 유량계(flowmeter)를 이용하여 계산한다. 네트의 인양 속도 및 인양 방법은 다음에 기술된다.

유량계 제조사별 여수량 계산 방법을 따른다. 장기간 항해가 예정되어 있다면 조사 전ㆍ후에 유량계를 보정해 주는 것이 바람직하다. 유량계는 보통 네트 입구 중앙부에서 네트 안쪽으로 부착해야 한다. 네트 입구에 부착하게 되면 네트 앞쪽에 부착되어 있는 물림쇠(bridle)와 같은 장애물에 의해 물의 흐름이 방해를 받기 때문에 네트에 의해 여과된 물의 양이 실제보다 적어질 수 있다.

네트가 물표면 위로 올라오면 네트가 스크루에 닿지 않도록 주의해야 하며 유량계가 바람에 의해 돌아가지 않도록 조심해야 한다. 네트를 선상 위로 올린 후 즉시 유량계와 수심측정기  수심측정기를 부착하지 않았을 경우, 네트 줄의 각도와 줄이 풀려나간 길이를 이용하여 채집 수심을 결정

 값을 먼저 기록지에 기록한다. 그 후 네트는 현장 해수로 씻어 네트에 붙어 있을 수 있는 생물을 채집통 안으로 씻겨 들어가도록 한다. 그런 다음, 채집통을 네트로부터 분리하여 시료 보관병으로 옮긴다. 일반적으로 1 L 시료 보관병을 이용하여 보관하는 것이 바람직하다. 모든 시료를 시료 보관병으로 옮긴 후, 채집통을 부착하지 않은 상태에서 호스를 이용하여 네트를 깨끗하게 씻는다.

네트 채집 시 동물플랑크톤의 불균등분포(patchness)를 고려하여 반복 채집을 권장한다. 반복 채집의 횟수는 다음에 기술된다. 네트 사용이 종료된 후에는 네트와 네트의 틀, 물림쇠 등을 분리하여 깨끗한 담수로 씻은 후 보관하고 금속으로 이루어진 부품은 기름칠을 하여 따로 보관한다.

네트를 이용한 채집 시 발생할 수 있는 문제점과 보완방안은 다음과 같다.

① 동물플랑크톤이 채집 네트보다 작거나 인양하는 속도에 의해 발생한 압력으로 인해 망을 통과해 빠져나갈 수 있다(loss through the meshes) ■ 적절한 인양 속도 유지

② 다가오는 네트를 감지하고 회피할 수 있다(avoidance of the net by the zooplankton) ■ 네트의 색을 어두운 색으로 하고 네트 프레임과 링은 빛의 반사를 최소화할 수 있는 색을 선택. 태양빛을 향하며 채집. 네트 입구는 가능한 넓은 것이 좋다.

③ 네트 막힘 현상(clogging of the net) ■  채집하고자 하는 대상 생물에 맞는 망목 크기 결정. 실질적으로 채집하고자 하는 대상 생물 중 가장 작은 생물 체장의 약 75 % 정도의 망목을 선택하는 것이 좋다. 원통형 네트가 원뿔형 네트보다 네트 막힘 현상이 적다. 네트 인양 후 네트 세척을 깨끗이 한다. 미세한 망목의 네트는 채집 시 막혀서 여과효율을 저하시키게 된다. 그러므로, 외양에서는 망목이 100 μm 보다 작은 것, 연안역에서는 200 μm 보다 작은 망목을 가진 네트는 사용하지 않는 것이 좋다.

2.4.3  네트의 종류 선택(동물플랑크톤)

2.4.3.1  네트의 모양

네트의 모양은 일반적으로 원뿔형, 원뿔-원통형(원뿔형 네트에 원통형 주변부가 있음), 그리고 입구 쪽이 좁은 원뿔형이 있다. 직사각형 모양의 원뿔형 네트도 있다. 

2.4.3.2  개폐의 가능성

수평적으로 여러 개의 연속적 시료를 얻거나 수직적으로 여러 층을 한 번에 채집할 수 있도록 개폐 능력이 있는 네트도 있다. 열려진 네트를 일정 수심까지 내리고 채집하고자 하는 수층에서 닫아서 채집하는 폐쇄식 네트와, 네트를 닫은 상태로 채집하고자 하는 수층까지 내린 후 열어 채집한 후에 다시 네트를 닫는 개폐식 네트가 있다. 네트의 개폐는 전기적 신호, 메신저를 통한 물리적 충격, 압력 등에 의해 조절할 수 있으며 이런 개폐능력이 있는 네트로는 Clarke-Bumpus 채집기, Bongo 네트 등이 있다.

2.4.3.3  망목의 크기

미세한 망목의 네트는 채집 시 막혀서 채집 능력(여과효율)을 저하시키게 된다. 그러므로, 외양에서는 망목이 100 μm 보다 작은 것, 연안역에서는 200 μm 보다 작은 망목을 가진 네트는 사용하지 않는 것이 좋다.

네트 망목 크기가 채집 시료에 영향을 주기 때문에 연구의 목적이나 관심대상 생물에 따라 네트의 망목 크기를 결정하게 된다. 과거에는 중형동물플랑크톤을 대상으로 분포 및 군집구조 파악을 위한 연구에 주로 300 μm의 망목이 사용되었다. 그러나 최근에는 200 μm 네트가 보편적으로 이용된다. 이에 300 μm와 200 μm 네트의 망목 크기에 따른 시료의 변이를 실제 현장채집을 통해 검증하였다.

망목 크기가 200 μm 일 때는 인양 방법(수직 인양, 사선 인양)에 관계없이 주요 우점종 모두가 유의적인 차이가 없었고, 망목 크기가 330 μm일 때는 두 종 이외의 모든 주요 우점종이 유의적인 차이를 보였다. 즉, 망목 크기가 200 μm인 네트를 사용하면 수직 인양과 사선 인양 시 동물플랑크톤 생물량에 변이를 발생시키지 않으면서 채집이 가능하다는 것이다. 이에 반해, 망목 크기가 330 μm인 네트를 사용할 때는 채집 대상종에 따라 자료의 변이가 발생될 수 있기 때문에 채집 대상종을 고려하여 인양 방법을 선택해야 하는 문제가 발생하므로 동물플랑크톤 채집 시 200 μm 네트의 사용을 권장한다.

2.4.4  동물플랑크톤 채집을 위한 네트 인양 방법의 결정

네트를 인양하는 방법은 목적에 따라 수평, 수직, 사선 인양 등으로 구분 지을 수 있다.

수평 인양은 특정 수심에 분포하는 생물을 채집하는 데 주로 이용되며 동물플랑크톤의 수직분포나 일주 수직이동을 연구하기 위해 사용된다. 네트는 특정 수심의 생물을 채집하는 것이 목적이기 때문에 개폐식 네트를 사용해야 한다.

수직 인양과 사선 인양은 수심이 깊을 때 주로 사용하며, 수직 인양은 정지해 있는 배 위에서 네트를 채집하고자 하는 깊이까지 내린 후 다시 위쪽으로 끌어올려 인양한다.

사선 인양은 배가 이동하면서 채집하기 때문에 많은 주의를 기울여야 한다. 네트의 줄을 푸는 동안 배는 약 2 ∼ 3 m/sec로 천천히 움직여야 하며 물속에 내려진 네트 또한 일정 속도로 인양되어야만 한다. 사선 인양을 하는 동안 배는 정지하면 안 된다. 사선 인양의 단점은 배의 속도와 네트를 인양하는 속도를 각각의 수층에서 동일하게 유지하기가 쉽지 않고 각각의 수층에서 일정량의 물을 여과하기 위해 줄을 풀거나 되감는 속도를 조절하기가 쉽지 않다. 또한 네트가 내려진 수심을 정확히 알기가 어렵고 여과효율에 영향을 미치는 오랜 인양 거리로 인해 네트의 망목이 막힐 위험성도 있다.

중형동물플랑크톤의 분포 및 군집구조를 위한 연구에 적절한 인양 방법을 알아보기 위해 수직 인양 방법으로 채집했을 때와 사선 인양 방법으로 채집했을 때 생물량에 차이가 있는지를 실제 현장채집을 통해 검증해 보았다. 사선 인양과 수직 인양 모두 주요 우점종이 망목 크기에 따라 유의적인 차이를 보였다. 사선 인양 시 동물플랑크톤 생물량은 Bivalve larva, Gastropoda larva, Sagitta crassa와 전체 생물량(total abundance)이 망목 크기에 따라 유의적인 차이를 보였고, 수직 인양 시 Paracalanus parvus, Acartia hongi, Oikopleura spp., Cirripedia larva, Calanus sinicus와 전체 생물량(Total abundance)이 망목 크기에 따라 생물량 변이를 나타냈다.

망목 크기와 상관없이 수직 인양의 방법으로 채집했을 때 동물플랑크톤의 전체 생물량이 사선 인양으로 채집했을 때보다 많았다. 즉, 인양 방법의 차이가 전체 생물량에 영향을 주는 것을 알 수 있다. 사선 인양 시 수직 인양보다 더 많은 생물량이 잡힐 것으로 예측하였으나, 실제로 수직 인양 시 동물플랑크톤의 전체 생물량이 더 많았다. 이는 현장에서 채집 시 해수의 흐름, 배의 이동 등에 의해 네트의 이동양상이 정확하게 사선 또는 수직으로 이동하지 않고 같은 궤적으로 이동하기 때문에 발생하는 오류라고 여겨진다. 즉, 수직 인양 방법으로 네트를 인양할 때 네트의 실제 이동 궤적은 사선 인양의 결과로 도출되며 사선 인양 방법으로 네트를 인양할 때 네트의 실제 이동 궤적은 사선이 아닌 다른 양상으로 네트가 이동하게 된다. 또한, 사선 인양으로 채집을 할 때에는 배의 움직임, 물의 흐름, 네트를 내리고 올리는 속도, 네트 채집 시 입구에 다는 추의 무게 등에 많은 변수가 발생할 수 있다. 그러므로, 많은 변수를 포함한 사선인양 방법의 채집보다는 안전하고 간편한 수직 인양 방법의 채집을 권장한다.

2.4.5  네트의 세척

네트의 세척은 인양 전과 후에 모두 이루어져야 한다. 네트는 정점이 이동되었거나 반복채집 시 반드시 세척되어야 한다. 동물플랑크톤 특히, 요각류, 단각류, 곤쟁이류 등은 몸체에 많은 부속지들을 가지고 있어 이러한 부속지들이 네트의 망목에 걸려 네트로 채집된 생물들이 채집통(Cod-end bucket)으로 들어가지 않고 네트에 남아 있을 수 있다. 이러한 잔존물은 결과 도출 시 많은 오류를 발생시킬 수 있다. 또한, 식물플랑크톤의 대증식기, 부유물질이 많은 시기 또는 해역에서 네트를 세척하지 않고 채집할 때에는 네트 막힘 현상이 발생하여 여과된 물의 양과 생물량에 많은 영향을 줄 수 있다.

네트의 세척은 크게 두 가지로 나뉜다. 첫째는 채집 생물을 시료병(Sampling bottle)에 옮기기 전에 하는 세척이며, 둘째는 시료병으로 옮긴 후 세척하는 것이다. 채집 생물을 시료병으로 옮기기 전에 하는 세척은 채집된 생물 모두를 시료병에 담기 위한 작업으로, 네트를 선상으로 인양한 후 네트를 밖에서 씻어 시료들이 채집통 안으로 모두 들어가게 한 후에 채집통을 열어 시료를 시료병으로 옮기는 것이다. 1회 세척으로는 모든 생물을 채집통에 모을 수 없다. 반드시 1회 세척 후, 채집통에 들어있는 시료를 시료 병에 옮기고, 다시 채집통을 부착한 후 추가로 1회 더 세척을 하여 네트에 남아 있는 채집 생물을 채집통에 모은 후 다시, 시료병에 담는 것이 좋다. 시료를 옮긴 후 세척은 채집통을 제거한 상태에서 호스를 이용하여 네트를 깨끗하게 씻어내 남은 잔여물이 없도록 세척해야 한다. 그런 다음 채집병을 네트에 부착한다. 이렇게 하면 다음 채집 준비가 끝난다.

2.5  반복채집의 수

통상 채수를 통한 식물플랑크톤 채집의 경우는 반복 채집을 실시하지는 않는다.

동물플랑크톤 분포를 연구하기 위해 채집된 시료는 자연 상태의 모집단을 대표하는 것으로 간주되며, 채집된 시료에서 얻어진 통계량(statistics)이 모집단의 대응되는 인자(Parameter)를 얼마나 잘 나타내는가는 시료 채집상의 방법에 수반되는 기계적인 문제점들과 대상생물의 분포 및 행동 특성에 관계되는 생물학적 문제점들에 의해 좌우된다.

이로 인하여 같은 장소에서 같은 방법으로 같은 시기에 채집된 시료들의 통계치들 사이에도 변이를 나타내게 된다. 이런 변이는 동물플랑크톤의 주기적 수직이동, patchy 분포 등이 원인이 된다. 이러한 변이를 줄이기 위해서는 동물플랑크톤 시료 채집 시 반복 채집을 필요로 하지만 조사 시간과 비용이 결부되기 때문에 적절한 반복 채집의 횟수를 결정할 필요가 있다.

실제 현장채집에서 고정된 한 정점에서 5회에 걸쳐 반복 채집을 해본 결과, 반복 채집의 수에 따라 분산이 줄어듦을 알 수 있었다. 반복 채집의 필요성은 망목의 크기(330 μm, 200 μm) 차이에서는 두드러지지 않았지만, 인양 방법에서는 더욱 크게 나타났다. 수직 인양의 방법으로 네트를 인양하였을 때에는 반복 횟수에 관계없이 개체수의 변동이 크지 않았지만 사선 인양으로 네트를 인양했을 때에는 분산이 확대되는 경향이었다. 반복 채집의 수가 많아지면 분산은 작아지고 자료의 신뢰도는 증가하지만 시료수의 증가는 경비의 증가를 야기한다. 따라서, 적절한 선에서 타협이 불가피하다. 그러므로, 자료의 신뢰도와 경비를 고려하여 적어도 3회의 반복 채집을 권장한다.

제2항 시료의 보관방법

1. 동ㆍ식물 플랑크톤의 고정과 보존

1.1  식물플랑크톤 고정

현장에서 식물플랑크톤 시료를 즉시 관찰하는 것은 많은 제약이 있으므로 고정하여 보관한 후 관찰하게 된다. 일반적으로 식물플랑크톤은 Formalin, Lugol's solution, Glutaraldehyde로 고정한다. 그러나, 관찰하려는 종이 무각와편모조류(Naked or athcate dinoflagellate)라면 고정하지 않는다.

1.1.1  Formalin

Formalin은 가장 흔히 사용되어 온 경제적인 고정액으로, 유각와편모조류와 규조류가 많은 전형적인 해수 샘플을 고정하거나 오래 보관하는 데 효과적이다. 편모가 있는 플랑크톤의 경우, 편모가 떨어지는 단점이 있다.

1.1.2  Lugol's solution

Lugol's solution은 식물플랑크톤에 최소한의 손상을 주는 고정액으로 flagellates를 고정하는 데 효과적이다. flagella가 파손되지 않고 잘 보존됨.

 또한, 식물플랑크톤 시료를 갈색으로 염색하기 때문에 계수할 때 다른 유기침전물과 구별하기 쉽다. 그러나, 지나치게 염색되거나, acid Lugol's solution이 coccoliths를 용해시키고, iodine은 시간이 지나면 산화하는 단점이 있다. 따라서, Lugol's solution으로 고정하는 샘플은 주의가 필요하다.

1.1.3  Glutaraldehyde

Glutaraldehyde는 naked or athecate dinoflagellates를 고정하는데 유용하다. Glutaraldehyde로 고정한 샘플은 가능한 빨리 분석하는 것이 좋으며, 외부나 조직의 형태적 변화가 적기 때문에 전자현미경(SEM)으로 관찰하기에 용이하다. 단점은 고정 후 보존시간이 짧고, 고정액이 비싸다는 것이다.

1.2  동물플랑크톤 고정

동물플랑크톤 시료는 채집 후 10분 이내에 고정하는 것이 좋다. 초기 고정 과정에 따라 시료의 상태가 결정되므로 동물플랑크톤 시료를 고정할 때에는 항상 주의해야 한다. 동물플랑크톤 시료를 고정하는 가장 일반적인 방법은 중성 포르말린에 고정하는 것으로 가장 널리 사용된다.

중성 포르말린은 다음 과정을 거쳐 만든다. 분석용 시약 1 L 포르말린에 30 g Borax(sodium tetraborate)를 놓고 잘 젓는다. Borax는 완전히 녹은 후 점차 통 아래에 침전물을 형성하게 되므로 한 달 정도 시간이 흐른 뒤 침전물이 형성되면 침전물을 여과지에 걸러 사용해야 한다.

동물플랑크톤 고정 시 중성 포르말린의 최종 농도는 5 ∼ 10 % 정도가 되도록 넣어줘야 한다. 예를 들어, 1 L의 시료병을 채울 때 해수(시료 포함) 950 mL와 중성 포르말린 50 mL를 넣게 되면 중성 포르말린의 최종 농도는 5 %가 되는 것이다.

1.3  보존

식물플랑크톤의 경우, 장기 보존이 필요하다면 영구 보관용 슬라이드를 제작하며, 액상으로 보관하고자 할 때는 동물플랑크톤처럼 고정액보다는 낮은 농도로 보존한다.

동물플랑크톤의 경우, 현미경 관찰을 통해 채집해 온 시료의 동정이 끝난 시료를 보관할 때에는 포르말린의 농도를 2 ∼ 5 %로 낮춰줘야 한다. 보관용 포르말린 용액의 pH는 6.5에서 7.5 사이가 좋다.

스티드먼(Steedman, 1974)의 보존액 혼합용액(용적/용적비)은 다음과 같다.

┌───────────────────┐

│중성 포르말린 (원액)              2.5 │

│Propylene phenoxytol1.0               │

│Propylene glycol       10.0           │

│여과 해수       86.5                  │

└───────────────────┘

포르말린 이외에 동물플랑크톤 시료를 보존하는 데 적합한 보존액으로는 에탄올이 있다. 에탄올은 휘발성과 인화성이 있어 보존 시 주의해야 하며 가격이 비싼 것이 단점이다. 에탄올을 이용하여 시료를 보존할 경우, 시료를 고정액에서 꺼내 증류수로 씻어 낸 후에 에탄올에 보관해야 한다. 에탄올은 주로 다모류, 척색동물, 자포동물, 유즐동물 등의 보존 시 적합하며, 모악동물은 에탄올을 사용하여 고정하게 되면 몸체가 줄어들기 때문에 주의해야 한다.

2. 다양한 해양생물 시료 고정 및 보관

2.1  현장 생물별 개략적인 분리ㆍ동정 방법

채집된 해양생물은 개략적으로 분리하여 생물분류 전문가에게 의뢰한다.

2.2  습중량 측정

선별작업 후 습중량을 측정하는 것이 좋다. 습중량의 측정은 향후 생물 종류의 분리, 분석 후 결과정리 시 도움이 된다. 습중량은 구체적인 분석방법 없이 거름종이를 이용하여 물기를 제거한 후 소수점 세 자리의 저울을 사용하여 측정한다.

2.3  선별작업 후 분류를 위한 고정 방법

선별작업 후의 고정은 70 ∼ 80 %의 에틸알콜을 사용한다. 시료병은 유리재질의 것을 사용하며, 뚜껑을 닫은 후 파라필름으로 밀봉한다.

종 동정은 최소한 환형동물, 연체동물, 절지동물에 대해서는 종 수준까지 동정을 원칙으로 한다.

시료병 안에는 트레이싱지에 연필로 채집장소, 채집일시, 종명을 기입하여 넣는다. 시료의 보관은 냉암소에 하며, 1년에 2 ∼ 3회 고정액의 상태를 확인한다.

2.4  다양한 해양생물 자료의 기본적인 내용 기재

시료채취 시 수거된 해양생물에 대한 상세한 종 구분이 없더라도 육안으로 관찰된 시료의 구성 종에 대한 언급이 필요하다. 총 생체량, 총 개체수, 개략적이라도 자료에 수록해야 한다. 가능하다면, 우점종 목록 및 분포를 화학적인 분석자료와 함께 기록한다.

2.5  다양한 해양생물 조사 빈도

적어도 연중 4계절에 한 번씩 겨울(1 ∼ 2월), 봄(4 ∼ 5월), 여름(7 ∼ 8월), 가을(10 ∼ 11월)에 조사하고 장기 조사, 신규 조사지역은 학술적 의미가 있는 지역, 내만 및 외해 지역 등을 고려하여 선정한다.

2.6  현장에서 다양한 해양생물 시료 처리방법

채니기에 인양된 퇴적물 내 저서생물은 현장에서 해수 펌프를 이용하여 퇴적물 등 잔존물질을 제거한다. 대형저서생물 시료 채취와 동시에 저질 환경에 대한 기본조사로 병행하는 것이 좋다. 여기에 필요한 입도분석 등 분석 방법은 해양환경공정시험기준 해양퇴적물공정시험기준을 참고한다.

2.7  다양한 해양생물별 시료 보관방법

시료 보관은 자료의 검증과 시료 제공 등을 위해 보관하며, 네트 채집시료는 장기적으로, 정량시료는 최소 3년 보관을 기본으로 한다.

장기 보관용 시료는 네트 채집시료를 기본으로 하며, 침전된 네트 채집시료를 스포이드로 20 mL 바이알(vial)에 옮겨 담고 보관한다.

화학적인 분석용 생물 시료는 반드시 냉동보관한다. 중금속분석용 시료 보관 방법은 해저퇴적물 시료채취 방법과 유사하므로 이 방법을 원용한다.

3. 기타

채취된 생물 시료는 즉시 분석시험이 불가능할 경우, 각 항목별 시험 방법에 나타나 있는 시료의 보관 방법에 기술된 바와 같이 보관한다.

제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법

제1항 분석자료의 기초통계

기본적인 통계처리와 의미는 해수공정시험기준 제3장 분석자료의 통계처리와 표현 방법 제1항 분석자료의 기초통계에 따른다.

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)

시험절차와 결과에 대한 정도보증을 위해 해수공정시험기준 제3장 분석자료의 통계처리와 표현 방법 제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)의 내용을 준용한다.

제4장 항목별 시험방법

제1항 클로로필(chlorophylls) 및 총 카로티노이드(total  carotenoids)

식물플랑크톤의 광합성 색소는 chlorophyll a, b, c와 여러 보조색소로 구성되어 있다. 이 중 chlorophyll a는 모든 식물플랑크톤에 포함되어 있기 때문에 식물플랑크톤의 생체량을 가장 잘 평가할 수 있는 장점이 있다. 식물플랑크톤의 현존량(생체량, 생물량)을 클로로필양으로 측정하는 데는 분광광도계나 형광광도계를 사용한다.

1. 분광광도계에 의한 chlorophylls 및 카로티노이드 측정법

1.1  측정원리

식물플랑크톤의 광합성 색소는 chlorophyll a, b, c 및 보조색소가 있다. 이 중에서 chlorophyll a는 모든 식물플랑크톤에 포함되어 있으므로 그 양을 측정함으로써 식물플랑크톤의 생체량을 가장 잘 평가할 수 있다. 이들 색소를 90 % 아세톤 용액으로 추출하고 추출액의 흡광도를 750, 665, 645, 630, 480 nm에서 측정하여 chlorophyll a, b, c 및 총 카로티노이드(total carotenoids) 양을 계산한다.

1.2  측정범위 및 정밀도

해수 중 광합성 색소인 chlorophyll a의 검출한계는 0.02 μg/L이고, 그 이외 색소들의 검출한계는 0.04 μg/L이다.

정밀도는 chlorophyll a의 경우, 5 μg/L 농도 수준에서 ± 0.3 μg/L이며 chlorophyll b의 경우, 0.5 μg/L 농도 수준에서 ± 0.2 μg/L 이다.

1.3  기구 및 기기

1.3.1  여과기

1.3.2  유리섬유 여과지(보통의 경우, GF/F 47 mm) GF/F (0.7 μm) 대용으로 GF/B (1.0 μm), GF/C (1.2 μm), Gelman AE (1.0 μm) 등을 사용할 수 있다. 시료 여과시 여과압이 20 kPa을 초과하거나 오랜 시간(10분 이상) 동안 여과를 하면, 세포 손상으로 인한 클로로필의 유실을 일으킬 수 있다.

1.3.3  원심분리기

1.3.4  마개 있는 원심분리관 또는 시험관(보통 15 mL)

1.3.5  교반기

1.3.6  분광광도계(spectrophotometer)

1.4  시약 및 표준물질

1.4.1  90 % 아세톤(v/v): 1,000 mL 플라스크에 증류수 100 mL와 분석용 아세톤 900 mL를 넣어 만든다. 보관 시에는 마개를 잘 막고 어두운 곳에 보관한다.

1.4.2  1 % 탄산마그네슘(MgCO3) 용액: 탄산마그네슘 1 g을 증류수 100 mL에 첨가하고 잘 흔들어 만든다.

1.5  시료의 채취 및 보관

동물플랑크톤을 제거하기 위해 약 0.3 mm mesh size의 나일론 네트를 장착시킨 여과 세트에 해수 시료 0.5 ∼ 5,000 mL 해역에 따라 적당량을 취함

를 유리섬유 여과지로 여과하는 동안, 1 % 탄산마그네슘 용액 수 방울을 첨가하여 여과지에 걸러진 색소가 산성화됨을 방지한다. 물기가 제거된 여과지는 15 mL 시험관 또는 원심분리관에 잘 접어 넣는다. 만일, 곧바로 분석이 불가능할 경우, 빛을 차단하고 ?20 °C에 냉동 보관한다. 이 경우, 30일 정도 보관이 가능하다.

1.6  시험방법

1.6.1  유리섬유 여과지가 끼워진 여과기에 해수 시료 적당량을 따라 부으면서 여과시킨다. 여과압은 대기압의 1/2 이하(진공펌프 사용 시 진공압 20 mmHg 이하)로 하여 여과지 위에 수분이 남아 있지 않도록 한다. 여과 시 1 % 탄산나트륨 용액 수 (3 ∼ 5) 방울을 해수에 첨가한다.

1.6.2  수분이 제거된 여과지는 다음의 과정을 거치거나 필요시 클로로필(chlorophyll)을 위하여 냉장 보관 한다.

1.6.3  여과지를 원심분리관 또는 시험관에 넣고 90 % 아세톤 수용액 15 mL를 첨가한 후 교반기로 강하게 교반한 다음 하루 동안 4 °C 이하의 냉암소에 보관한다.

1.6.4  위 1.6.3 항의 원심분리관 또는 시험관을 실온에서 10분간 (3,000 ∼ 4,000 rpm) 원심분리 한다.

1.6.5  원심분리 후 상등액의 일부를 취하여 1 cm 셀에 옮겨 750 nm, 665 nm, 645  nm, 630 nm, 480 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

1.6.6  바탕용액의 흡광도 측정

1.6.6.1  Cell-to-Cell Blank 보정

먼저 바탕용액값은 분광광도계의 두 cell에 90 % 아세톤 용액을 채우고 대조 셀(Reference cell)에 대한 시료 셀(cell)의 Cell-to-Cell blank를 750 nm, 665 nm, 645 nm, 630 nm, 480 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 모든 E값을 보정한다. 

┌───────────────────────────────────────┐

│                            E665=OD665 ? OD750                         (식 1)│

│                            E645=OD645 ? OD750                         (식 2)│

│                            E630=OD630 ? OD750                         (식 3)│

│                                                                              │

│  여기에서, OD는 최적 흡광도 (optical  density)임.                            │

└───────────────────────────────────────┘

1.6.6.2  탁도 Blank의 측정

유리섬유 여과지를 사용할 경우, 빛의 흡수가 없는 것으로 알려진 파장 750 nm의 파장에서 E값을 읽는다. 이때 E값은 매우 낮으며, Blank값은 매우 적어 때때로 음의 값을 나타내기도 하지만 그 이유는 뚜렷하지 않다. 그 값이 음ㆍ양 어느 경우이든 ± 0.002를 초과해서는 안되며, Cell-to-Cell Blank 보정 후 모든 파장에서 E값에 사용한다.

┌────────────────────────────────────────┐

│f  =  1  (파장, 666, 645, 630 nm)                                               │

│f  =  2  (파장, 510 nm)                                                         │

│f  =  3  (파장, 480 nm)                                                         │

│                                                                                │

│따라서, 총 Blank 값은 Cell-to-Cell Blank 값과 탁도 Blank (f × Eb)를 합한 것이  │

│된다. 식으로 표현하면 다음과 같다.                                              │

│                Total Blank = (Cell-to-Cell Blank) + (f×Eb)           (식 4)   │

└────────────────────────────────────────┘

Membrane 여과지를 사용할 경우, 소량의 콜로이드 물질이 원심분리 후에도 남는 경우가 있다. 이때 이들 물질에 의한 E값은 사용하는 파장에 따라 변하며 빛의 산란효과에 의해 파장이 짧아질 때는 증가한다. Blank 값은 750 nm에서 Cell-to-Cell Blank 값으로 보정하여 얻어진 E값(Eb)을 아래의 f계수를 곱하면 탁도 Blank 값이 된다.

1.6.7  보정된 값들을 얻으면 해수 중의 광합성 색소인 chlorophyll a, b, c의 농도를 계산한다.

┌──────────────────────────────────┐

│                Chlorophyll a, b, c (μg/L) = × 1,000       (식 5) │

│ 여기서,  Ca, b, c = Chlorophyll a, b, c의 농도(μg/mL)             │

│          v = 추출한 아세톤의 양(mL)                                │

│          V = 여과한 해수의 양(mL)                                  │

│          Ca (chlorophyll a) = 11.6 E665 - 1.31 E645 - 0.14 E630    │

│          Cb (chlorophyll b) = 20.7 E645 - 4.34 E665 - 4.42 E630    │

│          Cc (chlorophyll c) = 55 E630 - 1.31 E665 - 0.14 E645      │

└──────────────────────────────────┘

1.6.8  식물 카로티노이드 (Plant carotenoids)의 계산

┌────────────────────────────────────────┐

│     C(Plant carotenoids) = 4.0 E480 (Chlorophyta, Cyanophyta 우점 시)   (식 6) │

│    C(Plant carotenoids) = 10.0 E480 (Chrysophyta, Pyrrophyta 우점 시)   (식 7) │

└────────────────────────────────────────┘

1.7  참고사항

1.7.1  광합성색소인 chlorophyll a, b, c의 추출용액은 광분해가 쉽게 일어나기 때문에 여과 등의 실험과정에서 직사광선을 피해야 한다.

1.7.2  750 nm는 시료 중의 현탁물질에 의한 탁도정도를 알기 위한 흡광도이다. 분광광도계의 측정파장을 정확하게 맞추지 않으면 오차가 크게 발생한다.

2. 분광광도계에 의한 chlorophyll  a 및 phaeo-pigment 정량법

2.1  측정원리

해수 중에서 살아있는 식물플랑크톤뿐만 아니라, 이들이 사후 분해되는 쇄설물(detritus)과 식물플랑크톤을 포식한 동물들의 분립 등에도 광합성 색소가 들어있기 때문에, 위 1항에서 기술된 바와 같은 클로로필 (chlorophylls) 및 총 카로티노이드 (total carotenoids) 시험법으로는 살아 있는 식물플랑크톤의 chlorophyll 양만을 나타내기는 어렵다. 그러므로, chlorophyll의 초기 분해 산물인 phaeo-pigment 양을 측정하여 살아있는 식물플랑크톤의 chlorophyll을 계산하는 방법이다.

2.2  측정범위 및 정밀도 

Phaeophytin a의 정밀도는 0.5 μg/L 농도 수준에서 ± 0.05 μg/L이다.

2.3  기구 및 기기

위 1.3항의 기구 및 기기에 따른다.

2.4  시약 및 표준물질

2.4.1  90 % 아세톤(v/v): 위 1.4.1 항에 따른다.

2.4.2  1 % 탄산마그네슘(MgCO3) 용액: 위 1.4.2 항에 따른다.

2.4.3  1:1 염산 용액: 진한 염산 50 mL를 증류수로 희석하여 100 mL로 만든다.

2.5  시료의 채취 및 보관

위 1.5항의 시료의 채취 및 보관에 따른다.

2.6  시험방법

2.6.1 ∼ 2.6.4  위 1.6.1 ∼ 1.6.4 항의 실험 방법에 따른다.

2.6.5  원심분리한 후 상등액의 일부를 취하여 1 cm 셀에 옮겨 750 nm 및 665 nm의 파장에서 흡광도를 측정하고 나서, 1:1 염산 용액 1 ∼ 2방울을 첨가하고 혼합한 다음 다시 750 및 665 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

2.6.6  665 nm의 파장에서 측정한 흡광도에서 750 nm의 파장에서 측정한 값을 빼고, 다음 식에 의해서 해수 중의 chlorophyll a 및 phaeo-pigment의 양을 구한다.

┌──────────────────────────────────┐

│              Chlorophyll a (μg/L) =             (식 8)            │

│            Phaeo-pigments (μg/L) =        (식 9)                  │

│                                                                    │

│    여기에서, 665b는 산을 첨가하기 전 665 nm 파장에서 측정한 흡광도 │

│             665a는 산을 첨가한 후 665 nm 파장에서 측정한 흡광도    │

│             V는 여과한 해수의 양(mL)                               │

│             v는 90 % 아세톤으로 추출한 양(mL)                      │

│             l은 셀의 길이(cm)                                      │

└──────────────────────────────────┘

3. 터너 형광분광광도계에 의한 chlorophyll  a 및 phaeo-pigment 정량법

3.1  측정원리

이 방법은 아세톤으로 추출된 chlorophyll을 터너 형광분광광도계를 이용하여 측정하는 방법으로 분광광도계로 측정하는 방법보다 5 ∼ 10배 감도가 높기 때문에 연안의 경우, 100 ∼ 200 mL 정도의 시료만으로도 chlorophyll a 와 phaeo-pigment의 정량이 가능하다. 

3.2  측정범위 및 정밀도

측정의 정밀도는 chlorophyll a의 농도 5 μg/L에서 ±10 % 이내이다.

3.3  기구 및 기기

3.3.1 ∼ 3.3.5  위 1.3.2 ∼ 1.3.5 항의 기구 및 기기에 따른다.

3.3.6  터너 형광분광광도계: F4T4-BL 램프, Wratten 47B 또는 Corning CS 5-60 filter, Corning CS 2-64 filter

3.3.7  스크루형 주사기: 50 mL 용량

3.3.8  스크루형 filter holder: 지름 25 mL용

3.4  시약 및 표준물질

3.4.1  90 % (v/v) 아세톤: 위 1.4.1 항에 따른다. 

3.4.2  탄산마그네슘 (MgCO3) 수용액: 위 1.4.2 항에 따른다.

3.4.3  5 % (v/v) 염산용액: 진한 염산 5 mL를 증류수로 희석하여 100 mL로 만든다.

3.5  시료의 채취 및 보관

식물플랑크톤의 현존량이 높은 연안역이나 내만 해역의 해수 시료 100 ∼ 200 mL를 정확히 취하여 여과기 또는 스크루형 주사기와 filter holder를 이용하여 유리섬유여과지 (GF/F, 직경 25 mm)에 여과하는 동안 1 % 탄산마그네슘 용액 수 방울을 첨가하여 여과지에 걸러진 색소가 산성화됨을 방지한다. 물기가 제거된 여과지는 15 mL 시험관 또는 원심분리 시험관에 잘 접어 넣는다. 만일 곧바로 분석이 불가할 경우는 빛을 차단하고 냉동(-20 °C) 보관한다. 이 경우, 30일 정도 보관이 가능하다.

3.6  시험방법

3.6.1  유리섬유 여과지가 끼워진 여과기 또는 스크루형 주사기에 직경 25 mm의 스크루형 filter holder를 끼우고 해수 시료 100 ∼ 200 mL를 따라 부으면서 여과시킨다. 여과압은 대기압의 1/2 이하로 하여 여과지 위에 수분이 남아 있지 않도록 한다. 여과 시 1 % 탄산마그네슘 용액 수(3 ∼ 5) 방울을 해수에 첨가한다.

3.6.2  수분이 제거된 여과지는 다음의 과정을 거치거나 필요시 클로로필(chlorophyll)을 위하여 냉장 보관 한다.

3.6.3  여과지를 원심분리관 또는 시험관에 넣고 90 % 아세톤 수용액을 10 mL를 첨가한 후 교반기로 강하게 교반한 다음 하루 동안 4 °C 이하의 냉암소에 보관한다. 

3.6.4  위 3.6.3 항의 원심분리관 또는 시험관을 실온에서 10분간 (3,000 ∼ 4,000 rpm) 원심분리시킨다.

3.6.5  바탕용액인 90 % 아세톤으로서 형광광도계의 눈금을 0에 맞춘다. 

3.6.6  원심분리한 시료의 상등액 일부를 취하여 측정셀로 옮기고 시료의 형광광도계의 형광을 읽는다 (RB). 그리고 나서 5 % 염산 용액 2 ∼ 3 방울을 측정셀에 떨어뜨리고 셀을 2 ∼ 3회 위아래로 뒤집어 혼합한 다음 형광광도계에 다시 셀을 넣고 형광을 읽는다 (RA). 이때 라운드 셀의 형광빛이 통과하는 부분에 이 물질이 묻지 않도록 주의한다.

3.6.7  Chlorophyll a 및 phaeo-pigment의 농도는 다음 식에 의하여 계산한다.

┌──────────────────────────────────┐

│        Chlorophyll a (μg/L) =  × 1,000          (식              │

│10)                                                                 │

│        Phaeo-pigment (μg/L) = × 1,000         (식                │

│11)                                                                 │

│                                                                    │

│    여기에서,  FD는 door의 계수,                                    │

│              r은 검량선 3.7.3항에서 얻어진 비                      │

│              RB는 산을 첨가하기 전 형광광도계의 형광을 읽은 값     │

│              RA는 산을 첨가하고 난 후 형광광도계의 형광을 읽은 값  │

└──────────────────────────────────┘

3.7  정도평가/정도관리(QA/QC)

3.7.1  순수한 chlorophyll a를 얻는 것은 매우 어렵기 때문에 해양 식물플랑크톤으로부터 추출만 한다. 이 방법은 전적으로 chlorophyll a만을 분석하도록 설정되어 있지만 다른 chlorophyll에도 약간의 반응과 변화를 보인다. 이 때문에 식물플랑크톤의 종과 종 사이에 약간의 차이가 있다. 건강하게 배양된 Skeletonema costatum 또는 Skeletonema costatum과 같은 양 (chlorophyll로서)의 Coccolithus huxleyii 및 Peridinium trochoidium로 혼합되어진 것을 chlorophyll source로 권장한다. 만약 그러한 배양을 이용할 수 없다면, phaeo-pigment 양이 불확실한 것을 제외하면 자연적인 식물플랑크톤의 개체군을 이용할 수 있다. 부영양화된 해역의 초기 ‘bloom’(대수 생장기) 상태인 표층수를 채수하여 이용한다.

3.7.2  충분히 배양된 자연적인 개체군 50 mL를 여과하여 90 % 아세톤으로 추출한다. 추출된 용액을 형광광도계의 door 3에서 50에 맞춘다(R3). 위 1.6항의 시험 방법에서 기술된 분광광도계의 파장 정열을 주의깊게 맞추어 chlorophyll a를 측정한 후, 다음 식으로부터 door 3에 대한 F3 값을 측정한다.

                              (식 12)

알고 있는 chlorophyll a의 새로운 값으로 door 10과 30에서 50 이상이 되도록 맞추기 위하여 90 % 아세톤으로 추출 용액을 희석한다. 위에서 아날로그로 표현된 것으로부터 F10과 F30을 계산한다.

3.7.3  Door의 계수 FD는 앞서 3.7.1항과 3.7.2항에서 얻어진 것과 동일하고, 같은 방법으로 구하여진다. 비 r은 피오피그먼트(phaeo-pigment)가 거의 없는 것으로부터 구하여진 RB/RA 값으로 표준화를 위해서 사용되어진 추출액이다. 비 값은 2.2에 가깝다.

4. 형광분광광도계에 의한 chlorophyll  a 및 phaeo-pigment 정량법

4.1  측정원리

이 방법은 아세톤으로 추출된 chlorophyll을 형광광도계를 이용하여 여기파장(exiting wavelength) 436 nm, 형광파장(emission wavelength) 670 nm에서 형광을 측정하여 chlorophyll a와 phaeo-pigment를 측정하는 방법이다.

4.2  측정범위 및 정밀도

측정의 정밀도는 chlorophyll a의 농도 5 μg/L에서 ± 10 % 이내이다.

4.3  기구 및 기기

4.3.1 ∼ 4.3.5  위 1.3.1 ∼ 1.3.5항의 기구 및 기기에 따른다.

4.3.6  형광분광광도계

4.3.7  50 mL용 스크루형 주사기

4.3.8  스크루형 filter holder (지름 25 mL용)  

4.4  시약 및 표준물질

4.4.1  90 % 아세톤 (v/v): 위 1.4.1 항에 따른다. 

4.4.2.  1 % 탄산마그네슘(MgCO3) 용액: 위 1.4.2 항에 따른다.

4.4.3  0.5 N 염산 용액: 진한 염산 (37 %) 41 mL를 증류수로 희석하여 1,000 mL로 만든다.

4.4.4  100 ppm 플로레신나트륨 (C20H10O4Na2, sodium fluorescein) 표준용액: 100 mg의 플로레신나트륨을 초순수에 녹여 1 L로 만들어 냉암소에 보관한다. 이 용액은 사용 직전에 홀 피펫을 사용해 정확히 1 mL를 취하여 100 mL로 만든다. 

4.5  시료의 채취 및 보관 

위 3.5 항의 시료의 채취 및 보관에 따른다.

4.6  시험방법

4.6.1 ∼ 4.6.5  위 3.6.1 ∼ 3.6.5 항의 내용에 따른다. 

4.6.6  형광광도계의 감도를 ×1에 맞추고, 여기파장 (exiting wavelength) 436 nm, 형광파장 (emission wavelength) 670 nm로 맞춘 다음, 플로레신나트륨 (C20H10O4Na2, sodium fluorescein) 표준용액 1 ppm의 형광을 100에 조정한다. 플로레신나트륨 표준용액 0.5 ppm을 사용할 시에는, 여기파장 436 nm, 형광파장 515nm에서 형광을 100이 되도록 조정한다.

4.6.7  시료 측정을 위해서 여기파장 436 nm, 형광파장 670 nm에 맞춘다. 우선 원심분리한 시료 용액의 소량을 취하여 1 cm 사각 셀에 넣고 형광를 측정한다(FB). 그 다음에 0.5 N 염산 용액 2 ∼ 3 방울을 첨가하고 혼합이 완전히 이루어져 형광이 안정될 때까지 기다린 후 형광을 측정한다(FA). 염산을 첨가하지 않는 시료를 측정할 때는 이전 시료의 염산이 셀에 남아 있지 않도록 주의만 하며 측정하고자 하는 시료 추출용액 1 ∼ 2 mL로 셀을 1 ∼ 2회 헹구어 주는 것이 좋다.

4.6.8  Chlorophyll a 및 phaeo-pigment의 농도는 다음 식으로 계산한다.

┌──────────────────────────────┐

│                Chlorophyll a (μg/L) =              (식 13)│

│               Phaeo-pigment (μg/L) =          (식         │

│14)                                                         │

│                                                            │

│    여기서,  R = Fch/Fph, 순수한 chlorophyll a의 FB/FA 값   │

│                   Fch: chlorophyll a에 맞는 고유 형광      │

│                   Fph: phaeo-pigment에 맞는 고유 형광      │

│              υ = 90 % 아세톤으로 추출한 양(mL)            │

│              V = 여과한 해수의 양(mL)                      │

└──────────────────────────────┘

제2항 HPLC를 이용한 광합성 색소 측정방법

1. 측정원리

해수 중 식물플랑크톤은 chlorophyll a, b, c 및 40여 종의 보조색소를 광합성 색소로 함유하고 있다. 각 식물플랑크톤은 class 수준에서 보조색소의 독특한 조합으로 이루어져 있어, chlorophyll a를 이용한 식물플랑크톤 생체량뿐만 아니라 보조색소의 정량분석 결과를 이용하면 해수 중에 존재하는 식물플랑크톤의 종 조성도 알 수 있다. 고성능 액체크로마토그래피 (High Performance Liquid chromatography, HPLC)를 이용한 색소 분석방법은 아세톤으로 추출한 색소를 역상 C18 또는 C8 컬럼을 이용하여, chlorophyll 계열의 색소와 보조색소, 분해 산물을 각각 분리한 상태에서 흡광검출기와 형광검출기로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도 

흡광검출기를 이용한 chlorophyll 계열의 색소와 보조색소의 검출한계는 각각 1 ng 및 0.5 ng이다. 형광검출기를 이용한 chlorophyll 계열 색소의 검출한계는 0.1 ng이다.

3. 기구 및 기기

3.1  여과기

3.2  47 mm GF/F 여과지(제1항 1.3.2 내용 참조)

3.3  진공펌프

3.4  액체질소 탱크

3.5  10 mL 시험관

3.6  초음파 분쇄기: 여과지에 끼어있는 입자 물질이나 세포를 분쇄하는 데 사용한다.

3.7  분쇄기: 추출과정에서 여과지를 분쇄하는 데 사용한다.

3.8  원심분리기

3.9  고성능 액체크로마토그래피

표 1. 고성능 액체크로마토그래피에 의한 광합성 색소 분석조건의 예

┌──────────┬───────────────────────────┐

│ 검출기             │ 흡광검출기: 436 nm                                   │

│                    │ 형광검출기: λem = 650 nm,λex = 432 nm              │

├──────────┼───────────────────────────┤

│ 컬럼               │ C18 또는 C8 컬럼                                     │

│                    │ (길이: 250 mm, 내경: 4.6 mm, 입자크기: 5 μm)        │

├──────────┼───────────────────────────┤

│ 용매탈기           │ 진공탈기                                             │

├──────────┼───────────────────────────┤

│ 용매유속           │ 0.5 ∼ 1 mL/min                                      │

├──────────┼───────────────────────────┤

│ 용매               │ 용매 A: Methanol 80 %, Ammonium Acetate(0.5 M) 20 %, │

│                    │         Butylated Hydrox Toluene 0.01 %              │

│                    │ 용매 B: Acetonitrile 87.5 %, H2O 12.5 %,             │

│                    │         Butylated Hydrox Toluene 0.01 %              │

│                    │ 용매 C: Ethyl Acetate 100 %                          │

│                    │ 용매 D: Methanol 100 %                               │

├──────────┼───────────────────────────┤

│자동시료주입기 온도 │ 4 °C                                                │

├──────────┼───────────────────────────┤

│시료주입량          │ 100 μL                                              │

└──────────┴───────────────────────────┘

표 2.  광합성 색소 분석을 위한 고성능 액체크로마토그래피의 용매 조성

┌─────┬───┬───┬───┬───┬─────┐

│Time (min)│A (%) │B (%) │C (%) │Curve │Flow rate │

│          │      │      │      │      │(mL/min)  │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│0         │90    │10    │0     │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│1         │0     │100   │0     │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│11        │0     │90    │10    │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│15        │0     │82.5  │17.5  │6     │0.5       │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│19        │0     │75    │25    │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│27        │0     │60    │40    │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│29        │0     │30    │70    │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│30        │0     │30    │70    │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│36        │0     │10    │90    │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│37        │90    │10    │0     │6     │1         │

├─────┼───┼───┼───┼───┼─────┤

│40        │90    │10    │0     │6     │1         │

└─────┴───┴───┴───┴───┴─────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  Acetone: HPLC 용매용

4.2  Methanol: HPLC 용매용

4.3  Acetonitrile: HPLC 용매용

4.4  Ethyl Acetate: HPLC 용매용

4.5  H2O: HPLC 용매용

4.6  Ammonium Acetate

4.7  Butylated Hydrox Toluene 

4.8  표준색소: 아래 표 3 참조

표 3. 분석대상 표준색소

┌───────────────┬───┬──────┬───────┐

│색소                          │파장  │용매        │흡광계수      │

│                              │      │            │(L·g-1·cm-1)│

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  chlorophyll c               │630.9 │90 % acetone│40.4          │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  peridinin                   │472   │ethanol     │132.5         │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  19'-butanoyloxy-fucoxanthin │446   │ethanol     │160           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  fucoxanthin                 │449   │ethanol     │160           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  19'-hexanoyloxy-fucoxanthin │447   │ethanol     │160           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  prasinoxanthin              │454   │ethanol     │160           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  violaxanthin                │443   │ethanol     │255           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  diadinoxanthin              │446   │ethanol     │262           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  alloxanthin                 │453   │ethanol     │262           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  diatoxanthin                │449   │ethanol     │262           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  lutein                      │445   │ethanol     │255           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  zeaxanthin                  │450   │ethanol     │254           │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  canthaxanthin               │      │acetone     │              │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  chlorophyll b               │646.8 │90 % acetone│51.36         │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  chlorophyll a               │663   │90 % acetone│88.15         │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  phaeophytin a               │667   │90 % acetone│51.2          │

├───────────────┼───┼──────┼───────┤

│  beta-carotene               │453   │90 % acetone│262           │

└───────────────┴───┴──────┴───────┘

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  해수 시료를 채수한 후 현장에서 GF/F 여과지가 끼워진 여과기를 이용하여 해수 0.5 ∼ 1.0 L를 여과한다. 여과압은 대기압의 1/2 이하로 하여 여과지 위에 수분이 남아 있지 않도록 한다.

5.2  여과지를 알루미늄 호일로 싸서, 액체질소 탱크에 넣어 급속 냉동시킨다. 만일 곧바로 분석이 불가능할 경우는 -70 °C에 냉동 보관한다.

6. 시험방법

6.1  전처리

6.1.1  위 5.1 ∼ 5.2항과 같이 처리된 여과지를 10 mL 시험관에 넣고 100 % 아세톤을 5 mL 첨가한 후 내부표준물질 canthaxanthin을 50 μL 첨가한다.

6.1.2  초음파 분쇄를 5분 정도 실시하고, 4 °C 이하의 냉암소에서 24시간 동안 추출한다.

6.1.3  추출 기간 중 분쇄기를 이용하여 여과지를 분쇄한다.

6.1.4  추출 후 2,000 rpm으로 10분간 원심분리 시킨다.

6.1.5  원심분리 후 상등액을 취하여 측정한다.

6.2  고성능 액체크로마토그래피 분석

6.2.1  추출한 상등액 1 mL와 HPLC용 H2O 300 μL를 섞은 후, 고성능 액체크로마토그래피에 주입한다.

6.2.2  얻어진 크로마토그램에서 각각의 피크에 대한 머무름시간(retention time)과 면적을 확인한다.

6.2.3  표준색소의 머무름시간과 시료 중 각 피크의 머무름시간을 비교하여 성분을 확인한다.

6.2.4  크로마토그램에서 얻은 각 피크의 면적과 농도를 알고 있는 표준용액의 피크 면적을 이용하여 시료 중의 농도를 계산한다. 시료 중의 농도는 다음과 같이 계산한다.

┌───────────────────────────────────────────────┐

│          색소 농도(ng/g)  = 시료의 피크면적 × Rf × ( Ve / Vs )       (식 1)                │

│                                                                                              │

│  여기에서,                                                                                   │

│                                                                                              │

│    Rf = 표준색소의 response factor (ng·L-1·area-1)                                         │

│                                                                                              │

│    Ve = × (시료에 첨가한 내부표준물질의양) (L)                                              │

│                                                                                              │

│    AIS = 내부표준물질 1 mL과 H2O 300 μL를 혼합하여 고성능 크로마토그래피로 분석한 피크 면적 │

│                                                                                              │

│    Vs = 여과한 해수의 양 (L)                                                                 │

└───────────────────────────────────────────────┘

표준색소의 감응계수(response factor, Rf)는 표준색소를 고성능 크로마토그래피에 주입하여 피크 면적을 계산하고, 이 면적으로 표준색소의 농도를 나누어 계산한다. 표준색소의 농도는 기존에 알려진 흡광계수를 이용하여 흡광광도계로 보정한다. 흡광도는 최대흡수파장과 750 nm에서 측정한다. 표준색소의 농도는 아래식에 의해 계산한다.

농도(μg/L)           (식 2)

7. 참고사항

7.1  크로마토그램의 피크에 대한 확인은 표준색소의 머무름시간과 배양된 식물플랑크톤의 단일종 배양 시료의 머무름시간을 비교하여 결정한다.

7.2  색소의 정량분석에 있어 가장 중요한 것은 표준색소의 response factor(Rf)를 구하는 과정이다. 순수한 표준색소를 구입하거나 실험실에서 분리·정제하여 사용할 수 있으며, 흡광광도계로 최소한 3회 이상 흡광도를 측정한 값을 사용한다.

제3항 대장균군

대장균군이라 함은 그람음성, 무아포성의 간균으로서 유당을 분해하여 가스 또는 산을 발생하는 모든 호기성 또는 통성혐기성균을 말한다. 일반적으로 미생물 시험에 있어서 유의할 점은 시료 중에 포함된 미생물이 상황에 따라 변할 수가 있으며, 처음 시료에 있던 미생물 외의 다른 미생물에 의해 시험 중에 오염이 일어날 수 있다는 점이다. 이러한 시험 상의 오염을 방지하기 위하여 모든 시험은 원칙적으로 무균조작을  하고, 시험 과정 중 오염 및 배지와 시약 등의 이상 유무 판단을 위해 반드시 양성대조군 양성대조군은 E. coli 표준균주를 사용

과 음성대조군 음성대조군은 멸균 희석수를 사용

 시험을 통해 확인함으로써 유효한 결과값 판정을 도출한다. 

1. 총대장균군 최적확수 시험관법

1.1  측정원리

대장균군이라 함은 그람음성, 무아포성의 간균으로서 유당을 분해하여 기체 또는 산을 발생하는 모든 호기성 또는 통성혐기성균을 말한다. 시료를 유당이 포함된 배지에 배양하면 대장균군은 증식하면서 기체를 생성하는데, 이때의 양성 시험관수를 확률적인 수치인 최적확수로 표시하는 방법이며, 그 결과는 MPN/100 mL의 단위로 표시한다.

1.2  기구 및 기기

1.2.1  발효관: 드럼 발효관 또는 스미드 발효관(보통의 경우, 25개)

1.2.2  백금이: 사용 전과 후에 반드시 불꽃에 멸균하여 사용한다.

1.2.3  페트리 접시(60 × 15 mm)

1.2.4  멸균된 피펫(1.0 mL, 10 mL)

1.2.5  배양기 

1.2.6  현미경: 1,000배 이상

1.3  시약 및 표준물질

1.3.1  라우릴 트립토스 배지(lauryl tryptose broth)

트립토스 20 g, 인산일수소칼륨(K2HPO4) 2.75 g, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 2.75 g, 염화나트륨(NaCl) 5 g, 황산라우릴나트륨[CH3(CH2)OSO3Na] 0.1 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 가열하면서 녹여 pH 6.8이 되도록 하여 발효관이나 다람발효관이 있는 시험관에 10 mL 이상씩 분주하여 멸균 후 사용한다. 그러나, 시료 10 mL를 시험할 경우에는 배지의 성분은 2배로 늘려서 농도를 맞추어야 한다.

1.3.2  BGLB배지(Brilliant green lactose bile broth)

펩톤(Peptone) 10 g, 유당(Lactose) 10 g을 증류수 약 500 mL에서 가온 용해하고 건조담즙분말 20 g을 증류수 200 mL에 녹인 것을 넣는다. 거기에 증류수를 넣어 약 950 mL로 하고 pH 7.2 ± 0.1로 조정한다. 차례로, 0.1 %(w/v) Brilliant green 용액 13.3 mL를 넣고 증류수로 1,000 mL를 맞춘 후 다람발효관에 약 10 mL씩 분주해서 121 °C에서 15분간 고압증기멸균을 한다. 다람발효관 내에 기포가 발생한 것은 사용하지 않는다.

1.3.3  엔도 배지

펩톤 10 g, 유당 10 g, 무수인산일수소칼륨 3.5g, 한천 15 g, 무수황산나트륨 2.5 g, 염기성푹신 0.5 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 가열하면서 녹여 pH 7.4 ± 0.1이 되도록 하고 121 °C에서 15분간 고압증기로 멸균하여 사용한다.

1.3.4  EMB 한천배지(Eosin Methylene Blue Agar)

펩톤 10 g, 유당 10 g, 무수인산일수소칼륨 2 g, 정제한천분말 18 g, 에오신 Y(Eosin Y) 0.4 g, 메틸렌블루 0.065 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 가열하면서 녹여 pH 7.1 ± 0.1이 되도록 하고 121 °C에서 15분간 고압증기로 멸균하여 사용한다.

1.3.5  보통한천배지

육 엑기스 3 g, 펩톤 5 g, 포도당 1 g, 정제한천분말 15 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 가열하면서 녹여 pH 6.9 ± 0.1이 되도록 하고 멸균하여 사용한다.

1.3.6  희석수

0.85 % 생리식염수 혹은 0.5 % peptone 수를 사용한다.

1.3.7  그람염색 시약

1.3.7.1  Ammonium oxalate-crystal violet: crystal violet 2 g을 95 % 에틸알코올 20 mL에서 녹이고, oxalic acid ammonium oxalate[(NH4)2C2O4H2O] 0.8 g을 증류수 80 mL에 녹여서 두 용액을 혼합한다.

1.3.7.2  Lugol 용액: KI 2 g을 증류수 약 10 mL에 녹이고 여기에 요오드 1 g을 가하여 녹인 후 증류수를 가하여 300 mL로 한다.

1.3.7.3  Counterstain: safranin 2.5 g을 95 % 에틸알코올 100 mL에 녹이며 증류수를 가하여 10배로 희석한다.

1.3.7.4  Acetone alcohol: 에틸알코올(95 %)과 아세톤을 같은 양으로 혼합한다.

1.3.8  이머젼 오일

1.4  시료의 채취 및 보관

시료의 채취는 최대한 무균으로 하고 멸균된 용기에 넣어 1시간 내로 실험실에 운반하여 시험해야 한다. 그 이상의 시간이 걸릴 경우에는 저온(10 °C 이하) 냉장하여 운반하고 6시간 내에 실험실에 도착하여 2시간 이내로 시험을 완료 한다. 만약 이 시간 내로 시험이 불가능할 경우, 현장용 시험기구 세트를 준비하여 현장에서 시험 한다. 시료의 균질화를 위해 액상 시료는 강하게 진탕하고, 고형인 시료는 멸균된 믹서를 사용하여 적당량의 희석액과 혼합 및 균질화한 후 시료로 사용한다.

1.5  시험방법

대장균군의 정성시험은 추정시험, 확정시험, 완전시험의 3단계로 나누어 시험하고 정량시험은 최적확수법(most probable number, MPN)으로 계산한다. 

1.5.1  추정시험

라우릴 트립토스 액상배지 10 mL씩 넣은 발효관을 35 ± 0.5 °C, 48 ± 3시간 배양하여 발효관에 가스발생이 있으면 대장균군이 존재하는 것으로 간주한다. 발효관의 수는 각 희석액에 따라 5개씩 쓴다. 즉, 시료를 10 mL, 1 mL, 0.1 mL, 0.01 mL, 0.001 mL씩 접종한다. 35 ± 0.5 °C, 24 ± 2시간 배양 후에 가볍게 흔들어 가스가 발생하지 않을 때는 추정시험 음성이고, 24시간 더 배양하여 가스 발생 또는 산 생성이 있을 때는 양성이며, 대장균군의 확인은 다음 방법에 따른다.

1.5.2  확정시험

추정시험에서 가스발생이 있는 발효관으로부터 백금이를 사용, 무균조작으로 BGLB 배지가 분주된 발효관에 이식하여 35 ± 0.5 °C, 48 ± 3시간 배양하여 가스가 발생하면 확정시험 양성으로 한다.

1.5.3  완전시험

대장균군의 존재를 완전히 증명하려면 위의 확정시험 양성발효관에 대하여 그람음성 무아포성의 간균임을 확인하고 유당을 분해하여 가스가 발생함을 재확인해야 한다. 확정시험에서 양성인 시험관은 다시 엔도 또는 EMB 평판배지에 이식하여 다음과 같은 조작을 한다. 24 ± 2시간 배양한 후 엔도 배지에서는 유당 분해균 때문에 정형적 집락이 적색으로 나타나고 EMB 배지에서는 정형적인 집락이 흑갈색으로, 얼른 보면 녹색의 금속광택을 띈다. 여기서, 정형적인 대장균군 집락 또는 2개 이상의 비정형적인 집락을 따서 라우릴 트립토스 액상배지 발효관과 보통한천 사면배지에 이식한다. 액상배지 발효관은 48 ± 3시간 배양하여 기체 발생 여부를 관찰하고, 보통한천 사면배지는 24 ± 2시간 배양한 후 그 집락에 대하여 그람염색하여 검정한다. 이때 모든 배양온도는 35 ± 0.5 °C로 한다. 라우릴 트립토스 액상배지에서 48 ± 3시간 내에 기체가 발생하고 보통한천 사면배지에서 그람음성 무아포성 간균이 증명되면 완전시험은 양성, 즉 대장균군은 양성이다. 대장균군 최적확수 계산은 최적확수표(MPN표) 계산법을 따른다.

1.5.4  그람염색 그람염색의 여러 가지 변법 중에서 Hucker 변법의 순서를 열거한다.

(Hucker 변법)

1.5.4.1  도말: 청정한 새 슬라이드 글라스 2 % 염산 Alcohol에 침적한 뒤 잘 씻고 gauze로 조심스럽게 잘 닦은 것을 사용한다.

에 고압증기 살균한 증류수 한 방울을 떨어뜨리고 여기에 백금이를 사용하여 미량의 균량을 취하여 잘 교반하여 박층을 만든다.

1.5.4.2  건조: 공기 중에서 자연 건조시킨다.

1.5.4.3  고정: 도말한 면을 위로하고 약한 화염 속을 천천히 3회 연속하여 통과시키고 방냉한다.

1.5.4.4  염색: Ammonium oxalate-crystal violet을 도말면에 적하하고 1분간 방치하여 염색한다.

1.5.4.5  수세: 증류수가 직접 도말면에 세게 닿지 않도록 글라스 뒷면에서 뿌린다. 여과지로 수분을 흡수한다.

1.5.4.6  Lugol 처리: Lugol 용액을 충분히 떨어뜨려 1분간 염색한다.

1.5.4.7  수세: 위 1.5.4.5항을 따른다.

1.5.4.8  건조: 위 1.5.4.2항을 따른다.

1.5.4.9  탈색: 가볍게 흔들면서 acetone alcohol로 대체로 무색이 될 때까지(30초 ∼1분간) 헹군다.

1.5.4.10  수세: 위 1.5.4.5항을 따른다.

1.5.4.11  대비 염색: Counterstain 용액으로 1분간 염색한다.

1.5.4.12  수세: 위 1.5.4.5항을 따른다.

1.5.4.13  건조: 위 1.5.4.2항을 따른다.

1.5.4.14  경검: 염색한 슬라이드 글라스는 이머젼 오일을 사용하여 약 1,000배로 확대해서 판별한다. 이때 그람 양성균은 청자색을 나타내고 그람 음성균은 담홍색(safranin색)을 나타낸다.

1.5.5  최적확수 계산법

발효관에 의한 대장균군 시험법은 일정량의 희석액 중에 1개 이상의 대장균군의 유무를 결정하는 정량적인 시험법이다. 정량적 시험법은 10 mL, 1 mL, 0.1 mL, 0.01 mL, 0.001 mL로 희석하고, 동일 희석도의 것을 각각 5개씩 시험하여 대장균군 양성인 발효관 수를 계산한다. 최적확수란 확률적으로 가장 가능한 수치를 말한다. 이때 희석액은 그 최대량을 가한 것의 전부 또는 대다수가 양성으로 나타나고, 최소량을 이식한 발효관의 대다수가 음성이 되도록 적절히 희석하여 사용한다. 이렇게 하면 대장균군 수는 앞의 양자 사이에 걸친 희석단계에 의하여 대체로 결정된다. 중간 부분 즉, 수적 근거가 얻어지는 부분의 양성 발효관 수가 충분히 있도록 계획 한다.

시험 결과에 의한 대장균군 수는 최적확수표에 의하여 결정한다. 표 중의 최적확수는 검액량이 10 mL, 1 mL, 0.1 mL 일 때 100 mL 중 대장균군 숫자로 표시되어 있으므로 검액량을 1 mL, 0.1 mL, 0.01 mL로 한 경우에는 표 중의 숫자를 10배로 하여 기록한다. 또한, 검액량을 0.1 mL, 0.01 mL, 0.001 mL로 한 경우에는 100배로 한다. 이하 각 희석도에 따라 이에 준하여 계산한다.

예를 들어, 다음 표에서 시료 3에 표시한 바와 같이 10 mL를 이식한 발효관 5개가 모두 양성, 1 mL의 이식관에 있어서도 똑같이 5개가 모두 양성, 0.1 mL에서는 5개 중에 2개 양성, 0.01 mL에서는 전부 음성의 결과가 얻어졌을 때는 각 희석도에 있어서 양성 시험관 수는 5, 5, 2, 0이 된다. 이로부터 100 mL 중의 최적확수를 구하려면 5, 2, 0의 경우를 취하여 표의 해당하는 난에서 최적확수 49를 구하고, 이것을 10배로 하여 시료의 최적확수 490을 산정한다. 또한, 시료 4의 결과와 같이 양성 시험관 수가 5, 4, 3으로 나타난 10 mL, 1 mL, 0.1 mL를 유효한 희석도로 간주하여 최적확수표에 의하여 시료의 최적확수를 산정한다. 시료 5와 같은 결과가 얻어졌을 때는 중간 희석이 양성이 되도록 10 mL, 1 mL, 0.1 mL의 성적을 취한다. 이때, 결과 값이 소수점(1.8)을 포함할 경우에는 반올림하여 정수(2)로 표기한다. 한편, 시료 6과 같은 결과가 얻어졌을 때는 0.01 mL의 양성시험관 수를 희석도가 한 단계 높은 0.1 mL의 양성시험관 수에 합하여 시료 6-1에 표시한 것과 같은 성적으로 취한다.

표 1. 최적확수(MPN) 산출방법 각 희석당 5개 시험관에 접종하여 양성시험관 수를 판정하는 방법

의 예

┌─────────┬──┬──┬──┬──┬──────┐

│          이식량  │10  │1   │0.1 │0.01│(MPN/100 mL)│

│                  │    │    │    │    │            │

│        (mL)      │    │    │    │    │            │

│  시료            │    │    │    │    │            │

├─────────┼──┼──┼──┼──┼──────┤

│1                 │5   │3   │1   │0   │110         │

├─────────┼──┼──┼──┼──┼──────┤

│2                 │5   │5   │3   │1   │1,100       │

├─────────┼──┼──┼──┼──┼──────┤

│3                 │5   │5   │2   │0   │490         │

├─────────┼──┼──┼──┼──┼──────┤

│4                 │5   │4   │3   │0   │280         │

├─────────┼──┼──┼──┼──┼──────┤

│5                 │0   │1   │0   │0   │2           │

├─────────┼──┼──┼──┼──┼──────┤

│6                 │5   │3   │1← │←1 │            │

├─────────┼──┼──┼──┼──┼──────┤

│6-1               │(5) │(3) │(2) │    │140         │

└─────────┴──┴──┴──┴──┴──────┘

표 2.  대장균군 시험관법 적용을 위한 최적확수표 3단계 희석 및 각 단계별로 5개 시험관 중 양성시험관 수를 적용하여, 최종 시료 100 mL당 확률적인 균 수치를 판정하기 위한 대비표

┌──────┬──┬──────┬──┬──────┬──┬──────┬──┬──────┬──┬──────┬───┐

│양성        │MPN │양성        │MPN │양성        │MPN │양성        │MPN │양성        │MPN │양성        │MPN   │

│시험관 수   │    │시험관 수   │    │시험관 수   │    │시험관 수   │    │시험관 수   │    │시험관 수   │      │

├──────┤    ├──────┤    ├──────┤    ├──────┤    ├──────┤    ├──────┤      │

│(mL)        │    │(mL)        │    │(mL)        │    │(mL)        │    │(mL)        │    │(mL)        │      │

│            │    │            │    │            │    │            │    │            │    │            │      │

│10  1   0.1 │    │10  1   0.1 │    │10  1   0.1 │    │10  1   0.1 │    │10  1   0.1 │    │10  1   0.1 │      │

├──────┴──┼──────┴──┼──────┴──┼──────┴──┼──────┴──┼──────┴───┤

│0   0   0     <1.8│1   0   0     2.0 │2   0   0     4.5 │3   0   0     7.8 │4   0   0     13  │5   0   0     23    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   0   1     1.8 │1   0   1     4.0 │2   0   1     6.8 │3   0   1     11  │4   0   1     17  │5   0   1     31    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   0   2     3.6 │1   0   2     6.0 │2   0   2     9.1 │3   0   2     13  │4   0   2     21  │5   0   2     43    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   0   3     5.4 │1   0   3     8.0 │2   0   3     12  │3   0   3     16  │4   0   3     25  │5   0   3     58    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   0   4     7.2 │1   0   4     10  │2   0   4     14  │3   0   4     20  │4   0   4     30  │5   0   4     76    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   0   5     9.0 │1   0   5     12  │2   0   5     16  │3   0   5     23  │4   0   5     36  │5   0   5     95    │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│0   1   0     1.8 │1   1   0     4.0 │2   1   0     6.8 │3   1   0     11  │4   1   0     17  │5   1   0     33    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   1   1     3.6 │1   1   1     6.1 │2   1   1     9.2 │3   1   1     14  │4   1   1     21  │5   1   1     46    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   1   2     5.5 │1   1   2     8.1 │2   1   2     12  │3   1   2     17  │4   1   2     26  │5   1   2     64    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   1   3     7.3 │1   1   3     10  │2   1   3     14  │3   1   3     20  │4   1   3     31  │5   1   3     84    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   1   4     9.1 │1   1   4     12  │2   1   4     17  │3   1   4     23  │4   1   4     36  │5   1   4     110   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   1   5     11  │1   1   5     14  │2   1   5     19  │3   1   5     27  │4   1   5     42  │5   1   5     130   │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│0   2   0     3.7 │1   2   0     6.1 │2   2   0     9.3 │3   2   0     14  │4   2   0     22  │5   2   0     49    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   2   1     5.5 │1   2   1     8.2 │2   2   1     12  │3   2   1     17  │4   2   1     26  │5   2   1     70    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   2   2     7.4 │1   2   2     10  │2   2   2     14  │3   2   2     20  │4   2   2     32  │5   2   2     95    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   2   3     9.2 │1   2   3     12  │2   2   3     17  │3   2   3     24  │4   2   3     38  │5   2   3     120   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   2   4     11  │1   2   4     15  │2   2   4     19  │3   2   4     27  │4   2   4     44  │5   2   4     150   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   2   5     13  │1   2   5     17  │2   2   5     22  │3   2   5     31  │4   2   5     50  │5   2   5     180   │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│0   3   0     5.6 │1   3   0     8.3 │2   3   0     12  │3   3   0     17  │4   3   0     27  │5   3   0     79    │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   3   1     7.4 │1   3   1     10  │2   3   1     14  │3   3   1     21  │4   3   1     33  │5   3   1     110   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   3   2     9.3 │1   3   2     13  │2   3   2     17  │3   3   2     24  │4   3   2     39  │5   3   2     140   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   3   3     11  │1   3   3     15  │2   3   3     20  │3   3   3     28  │4   3   3     45  │5   3   3     180   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   3   4     13  │1   3   4     17  │2   3   4     22  │3   3   4     31  │4   3   4     52  │5   3   4     210   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   3   5     15  │1   3   5     19  │2   3   5     25  │3   3   5     35  │4   3   5     59  │5   3   5     250   │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│0   4   0     7.5 │1   4   0     11  │2   4   0     15  │3   4   0     21  │4   4   0     34  │5   4   0     130   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   4   1     9.4 │1   4   1     13  │2   4   1     17  │3   4   1     24  │4   4   1     40  │5   4   1     170   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   4   2     11  │1   4   2     15  │2   4   2     20  │3   4   2     28  │4   4   2     47  │5   4   2     220   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   4   3     13  │1   4   3     17  │2   4   3     23  │3   4   3     32  │4   4   3     54  │5   4   3     280   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   4   4     15  │1   4   4     19  │2   4   4     25  │3   4   4     36  │4   4   4     62  │5   4   4     350   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   4   5     17  │1   4   5     22  │2   4   5     28  │3   4   5     40  │4   4   5     69  │5   4   5     430   │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

├─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼──────────┤

│0   5   0     9.4 │1   5   0     13  │2   5   0     17  │3   5   0     25  │4   5   0     41  │5   5   0     240   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   5   1     11  │1   5   1     15  │2   5   1     20  │3   5   1     29  │4   5   1     48  │5   5   1     350   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   5   2     13  │1   5   2     17  │2   5   2     23  │3   5   2     32  │4   5   2     56  │5   5   2     540   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   5   3     15  │1   5   3     19  │2   5   3     26  │3   5   3     37  │4   5   3     64  │5   5   3     920   │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   5   4     17  │1   5   4     22  │2   5   4     29  │3   5   4     41  │4   5   4     72  │5   5   4     1,600 │

│                  │                  │                  │                  │                  │                    │

│0   5   5     19  │1   5   5     24  │2   5   5     32  │3   5   5     45  │4   5   5     81  │5   5   5     >1,600│

└─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴──────────┘

2. 총대장균군 막여과법

2.1  측정원리

시료의 종류 및 특성에 따라 적당량의 시료를 취하고, 또는 여과 시료가 1 mL 이하인 경우에는 멸균된 희석수를 사용하여 적절히 희석한 후 여과한다. 이 여과지를 M-Endo.(또는 LES Endo 배지) 배지에 배양시킬 때, 대장균군이 lactose를 발효하여 aldehyde를 생성하게 되고 붉은색의 금속성 광택을 띠는 집락을 형성함으로 이 집락수를 계수하여 대장균군 수/100 mL의 단위로 표시하는 방법이다. 이러한 막여과 방법은 다량의 시료를 여과하므로 실제의 균 수에 가까운 신빙성 있는 결과를 얻을 수 있으며, 시험시간이 최적확수 시험법의 1/4 정도로 소요된다.

2.2  기구 및 기기

2.2.1  막여과장치: 여과막을 끼워서 여과할 수 있게 하는 장치로 무균조작 가능한 것을 사용하며, 멸균하여 사용 한다.

2.2.2  멸균된 매스실린더(10 mL)

2.2.3  멸균된 플라스틱 페트리 접시(60 × 15 mm 또는 50 × 12 mm)

2.2.4  멸균된 흡수패드와 여과막 셀룰로오즈 나이트레이트(cellulose nitrate) 혹은 셀룰로오즈 에스테르(cellulose ester) 재질로 직경 47 mm, 공경 0.45 μm 이하의 미생물 분석용 여과지를 사용

(Millipore #HAWG 047 SO, 직경 47 mm, 공경 0.45 μm 또는 0.22 μm): 멸균은 고압증기로 121 °C에서 15분간 멸균한다.

2.2.5  멸균된 피펫 및 핀셋

2.3  시약 및 표준물질

2.3.1  Endo 배지

2.3.1.1  막여과법 고체 배지(LES-Endo agar): 95 % 에탄올 20 mL를 포함한 증류수 1 L에 표 6의 고체 배지 조성대로 성분을 넣고, pH (7.2 ± 0.2)를 확인한 다음 완전히 녹을 때까지 저어주면서 끓인다. 끓인 후 45 ∼ 50 °C까지 식힌 다음, 5 ∼ 7 mL씩 페트리 접시에 넣어 굳힌다. 배지는 2 ∼ 10 °C의 냉암소에서 2주간 보관하면서 사용한다.

표 3. 대장균군 막여과법 고체 배지(LES-Endo agar) 조성

┌─────────────────────────┬────┐

│성   분                                           │조   성 │

├─────────────────────────┼────┤

│  트립토스(tryptose)                              │ 7.5 g  │

│  티오펩톤(thiopeptone) 또는 티오톤(thiotone)     │ 3.7 g  │

│  카지톤(casitone) 또는 트립티케이스(trypticase)  │ 3.7 g  │

│  효모엑기스(yeast extract)                       │ 1.2 g  │

│  염화나트륨(sodium chloride)                     │ 3.7 g  │

│  인산일수소칼륨(dipotassium phosphate, K2HPO4)   │ 3.3 g  │

│  인산이수소칼륨(monopotassium phosphate, KH2PO4) │ 1.0 g  │

│  아황산나트륨(sodium sulfate)                    │ 1.6 g  │

│  라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate)         │ 0.05 g │

│  데속시콜린산나트륨(sodium desoxycholate)        │ 0.1 g  │

│  염기성 푹신(basic fuchsin)                      │ 0.8 g  │

│  한천                                            │ 15.0 g │

└─────────────────────────┴────┘

2.3.1.2  막여과법 액체 배지(M-Endo): 95 % 에탄올 20 mL를 포함한 증류수 1 L에표 4의 액체 배지 조성대로 성분을 넣고, pH (7.2 ± 0.2)를 확인한 다음 완전히 녹을 때까지 저어주면서 끓인다. 끓인 후 50 °C까지 식힌 다음 사용한다. 준비된 배지는 그 즉시 사용 하며 고압증기 멸균하여서는 안된다.

표 4. 대장균군 막여과법 액체 배지(M-Endo) 조성

┌─────────────────────────┬────┐

│성   분                                           │조   성 │

├─────────────────────────┼────┤

│  트립토스(tryptose) 또는 폴리펩톤 (polypeptone)  │10.0 g  │

│  티오펩톤(thiopeptone) 또는 티오톤(thiotone)     │5.0 g   │

│  카지톤(casitone) 또는 트립티케이스(trypticase)  │5.0 g   │

│  효모엑기스(yeast extract)                       │1.5 g   │

│  유당(lactose)                                   │12.5 g  │

│  염화나트륨(sodium chloride)                     │5.0 g   │

│  인산일수소칼륨(dipotassium phosphate, K2HPO4)   │4.375 g │

│  인산이수소칼륨(monopotassium phosphate, KH2PO4) │1.375 g │

│  아황산나트륨(sodium sulfate)                    │2.1 g   │

│  라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate)         │0.05 g  │

│  데속시콜린산나트륨(sodium desoxycholate)        │0.1 g   │

│  염기성 푹신(basic fuchsin)                      │1.05 g  │

└─────────────────────────┴────┘

2.3.2  희석수: 0.85 % 생리식염수나 0.5 % peptone수를 사용한다.

2.4  시료의 채취 및 보관

제4장 제3항 1.4 시료의 채취 및 보관에 따른다.

2.5  시험방법

2.5.1  막여과

멸균한 핀셋으로 여과지의 눈금을 위로 가게 하여, 여과장치의 지지대 위에 올려놓는다. 막여과장치의 상부 여과관을 고정시킨 후, 일정량의 시료(표 5 참조)를 여과관에 주입하면서 흡입·여과하고 멸균한 증류수 20 ∼ 30 mL로 씻어준다. 총대장균군 수를 예측할 수 없을 경우에는 여과량을 달리하여 여러 개의 시료를 분석하고, 한 여과막 위에 모든 형태의 균 집락수가 200개 이상 형성되지 않도록  한다.

표 5. 시료 종류에 따라 예상되는 여과 시료량

┌────────┬──────────────────────┐

│시료의 종류     │여과해야 할 예상 시료량(X) mL               │

│                ├──┬─┬─┬─┬──┬──┬───┬───┤

│                │100 │50│10│1 │0.1 │0.01│0.001 │0.0001│

├────────┼──┼─┼─┼─┼──┼──┼───┼───┤

│호소, 저수지수  │X   │X │X │  │    │    │      │      │

│상수원수        │    │  │X │X │X   │    │      │      │

│해수욕장        │    │  │X │X │X   │    │      │      │

│하천수          │    │  │  │X │X   │X   │X     │      │

│염소 소독한 하수│    │  │  │X │X   │X   │      │      │

│하수원수        │    │  │  │  │X   │X   │X     │X     │

└────────┴──┴─┴─┴─┴──┴──┴───┴───┘

2.5.2  배양

반고체 배지인 LES Endo agar를 사용할 경우에는 여과지의 눈금을 위로 가게 하여 페트리 접시 내의 배지 위에 올려놓고 페트리 접시를 뒤집은 상태에서 35 ± 0.5 °C에서 24 ± 2시간 배양한다. 액체 배지인 M-Endo 배지를 사용할 경우에는 1.8 ∼ 2.0 mL의 M-Endo 배지가 들어 있는 페트리 접시의 흡수패드 위에 기포가 생기지 않도록 여과한 여과지를 올려놓은 다음 페트리 접시를 35 ± 0.5 °C로 24 ± 2시간 배양한다.

2.5.3  계수법

대장균군은 배양 후 금속성 광택을 띠는 붉은색의 집락을 형성하는데 페트리 접시를 저배율(10 또는 15배)의 해부현미경이나 실체현미경 위에 올려놓고 관찰된 집락 수를 계수한다. 대장균군은 시료 100 mL 중에 들어 있는 대장균군 집락 수로 나타내며, 여과지당 집락 수가 20　∼　80개의 범위에 드는 것을 선정하여 다음식에 의해 계산한다.

┌──────────────┐

│                     (식 1) │

└──────────────┘

집락들이 서로 융합되어 있을 경우에는 ‘CG’ confluent growth, 융합성 성장

로 표시하고 멸균수로 희석하여 다시 시험하거나 시료를 적게 취하여 다시 시험한다. 또한, 여과지당 집락 수가 200이상으로 계수가 불가능할 경우에는 ‘TNTC’ too numerous to count, 너무 많아 계수가 불가능

로 표기하고 시료를 희석하거나 적게 취하여 다시 실험한다. 대장균군수 계수법에 대한 예를 들면, 한 시료를 50 mL, 10 mL 그리고 1 mL씩 분취하여 여과한 다음 배양한 결과, 금속성 광택의 집락 수가 78, 20 그리고 3일 때, 이 시료의 대장균군 수는 유효범위 내에 있는 것만을 선택하여 계산하면,

                    (식 2)

이 된다.

또한, 시료를 분취하여 50, 25 그리고 10 mL씩 각각 여과하여 배양한 결과 15, 6 그리고 < 1로 대장균군 수가 유효범위 미만으로 계수되었을 경우, 총대장균군 수는

                  (식 3)

이 된다.

한편, 10 mL, 1 mL 그리고 0.1 mL의 시료를 취해 시험한 결과 40, 9 그리고  계산식 (40 × 100/10)에 의해 산정

 mL이 되며 집락 수가 200/100 mL 이상이므로 ≥400/100 mL로 표시한다.

3. 대장균군 효소발색법(chromogenic  substrate  coliform  test)

3.1  측정원리

3.1.1  발색제에 의한 대장균군 검사는 대장균군과 Escherichia coli(이하 E. Coli)의 효소를 동시에 검사하는 가수분해성 시약을 이용한 것이다. 대장균군을 효소 β-D-galactosidase를 가진 모든 박테리아로, E. coli를 대장균군 중 β-glucuronidase를 가진 박테리아로 정의할 때, 이들 효소가 발색제를 분해해 발색 또는 형광을 나타내는 원리를 이용한 것이다. 이 시험방법은 대장균군의 양성/음성을 판별할 수 있으며 최적확수 시험법(most probable number, MPN)으로 정량검사할 수 있다.

3.1.2  대장균군: 발색시약 성분 중 하나인 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(이하 ONPG)는 대장균군에 존재하는 효소 β-D- galactosidase와 반응한다. 시료에 대장균군이 존재할 경우, 이 효소는 ONPG를 가수분해시켜 26 ± 2시간 내에 검액의 색깔을 노란색으로 변화시킨다. 대장균군에 속하지 않는 Aeromonas속과 Pseudomonas속의 종은 미량의 β-D-galactosidas를 생성하나 대개 106 colony-forming units(CFU/100 mL) 이상 존재하지 않으면 28시간 내에 양성반응을 나타내지 않는다.

3.1.3  E. coli: 발색시약 성분 중 하나인 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(이하 MUG)는 E. coli에 존재하는 효소 β-glucuronidase와 반응한다. 시료 안에 E. coli가 존재할 경우, 이 효소는 MUG를 가수분해시킴으로써 366 nm 파장의 자외선을 조사했을 때 검액의 색이 푸른 형광색을 띈다. 또한, Shigella spp. 중에는 형광 반응에 양성을 나타내는 경우가 있다. 그러나, Shigella spp.는 공공연한 인체발병성 세균임으로 물의 수질 상태를 시험하는 데 있어서 문제가 되지 않는다.

3.2  기구 및 기기

3.2.1  멸균 마개가 있는 시험관 또는 상품화된 Quanti-Tray bag

3.2.2  Sealing-device: Quanti-Tray를 밀봉할 때 사용

3.2.3  멸균 시료용기: 시료와 발색제를 혼합할 용기로 사용 전 멸균해야 한다.

3.2.4  마개가 있는 무형광 유리병

3.2.5  희석수: 0.85 % 생리식염수 또는 0.5 % peptone 수

3.2.6  비교자: 변색된 색깔과 형광 정도를 비교하는 데 사용한다.

3.2.7  자외선 램프: 366 nm의 파장을 이용한다.

3.2.8  배양기

3.3  시약 및 표준물질

발색시약(ONPG, MUG 함유): 시료 1 L에 다음 표 6의 시약들을 첨가하고 잘 혼합한다.

표 6. 대장균군 효소발색법 발색시약 성능보증과 균질화를 위해 상품화된 발색시약 사용을 권장한다.

의 조성

┌─────────────────────┬─────┐

│성   분                                   │조   성   │

├─────────────────────┼─────┤

│Ammonium sulfate, (NH4)2SO4               │ 5.00 g   │

│Manganese sulfate, MnSO4                  │ 0.0005 g │

│Zinc sulfate, ZnSO4                       │ 0.0005 g │

│Magnesium sulfate, MgSO4                  │ 0.1 g    │

│Sodium chloride, NaCl                     │10.0 g    │

│Caclium chloride, CaCl2                   │ 0.05 g   │

│Sodium sulfate, Na2SO3                    │ 0.04 g   │

│Amphotericin B                            │0.001 g   │

│o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)│ 0.50 g   │

│4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG)│ 0.075 g  │

│Solanium                                  │ 0.50 g   │

│Hepes buffer_sodium salt                  │ 5.3 g    │

│Hepes buffer_organic acid                 │6.9 g     │

└─────────────────────┴─────┘

3.4  시료의 채취 및 보관

제4장 제3항 1.4 시료의 채취 및 보관에 따른다.

3.5  시험방법

대장균군에 대한 정성시험은 양성/음성 판별법으로 하고, 정량시험은 최적확수 시험법의 원리를 따른다.

3.5.1  정성시험(양성/음성 판별법)

멸균된 투명한 무형광 유리병에 해수 시료 100 mL와 발색시약을 넣어 잘 녹도록 흔들어 준다. 또는 상업용으로 만들어진 발색시약이 들어있는 멸균용기를 이용할 경우, 해수 시료 100 mL만 첨가하고 세게 흔들어 용해시킨다. 이 용기를 35 ± 0.5 °C에서 26 ± 2시간 배양한다.

3.5.1.1  대장균군 확인법: 26 ± 2 시간 배양 후에 검액의 색깔이 변해 있는지 조사한다. ONPG는 대장균군의 효소에 의해 노란색의 ortho-nitrophenol로 변화된다. 따라서, 노란색을 띄면 대장균군에 의한 양성반응으로 간주한다. 용기의 색깔 반응이 균일하지 않을 때는 흔들어준 후 관찰한다. 색깔의 정도가 뚜렷하지 않을 때는 상업용 색 비교자(color comparator)와 비교하여 시험관의 색 농도가 같거나 진한 경우는 양성반응으로 간주한다. 24시간 배양 후의 발색 반응이 의심스러운 경우에는 4시간 정도 추가적으로 배양하여 확인한다.

3.5.1.2  E. coli 확인법: 366 nm 파장의 자외선 램프를 이용하여 총대장균군이 검출된 용기의 형광 반응을 조사한다. 이때 형광 반응을 보이면 E. coli에 대한 양성반응으로 간주한다. 형광 정도가 뚜렷하지 않을 때는 비교자(상품화된 reference comparator)와 대조하여 확인한다. 24시간 배양 후의 형광 상태가 의심스러운 경우에는 4시간 정도 추가적으로 배양하여 확인한다.

3.5.2  정량시험(최적확수 시험법)

발색시약과 혼합된 해수 시료를 검액으로 10 mL, 1 mL, 0.1 mL, 0.01 mL, 0.001 mL씩 5개 시험관에 접종하고 멸균된 희석수로 10 mL가 되도록 희석한다. 마개를 단단히 닫고 세게 흔들어 용해시킨다. Quanti-Tray bag을 사용할 경우에는 해수 시료 100 mL에 발색시약을 넣고 접종한 후에 Sealing-device로 밀봉한다. 혼합물은 무색이며 어떤 경우는 약간의 용해가 안 된 입자가 남을 수 있으나 시험에 영향을 주지는 않는다. 희석한 시험관은 35 ± 0.05 °C에서 26 ± 2시간 동안 배양한다.

계수법(최적확수 계산): 최적확수 시험법의 경우는 양성반응을 보인 대장균군과 E. coli의 시험관 수(Quanti-Tray의 경우에는 양성반응을 보인 칸의 수)를 계산하여 최적확수(MPN)를 계산한다(Quanti-Tray의 경우에는 Quanti-Tray용 MPN표를 이용할 수 있다). 최적확수는 제3항 1.5.5 최적확수 계산법에 따라 계산한다.

4. 분변성 대장균 시험법

4.1  분변성 대장균 막여과법

시료에 존재하는 분변성 대장균군을 측정하기 위하여 페트리 접시에 M-FC 배지를 올려놓은 다음 배양 후 청색의 집락 수를 계수하는 방법이다.

4.1.1  기구 및 기기

4.1.1.1  멸균된 막여과장치: 제3항 2.2.1 참고

4.1.1.2  멸균된 여과지(공극 0.45 μm, 직경 47 mm): 제3항 2.2.4 참고

4.1.1.3  항온 수조 혹은 정밀배양기(44.5 ± 0.2 °C)

4.1.1.4  멸균된 피펫, 핀셋

4.1.1.5  멸균된 페트리 접시(60 × 15 mm 또는 50 × 12 mm)

4.1.2  시약 및 표준물질

4.1.2.1  M-FC 한천배지: 특수혼합 peptone 10.0 g, proteous peptone No.3 5.0 g, yeast extract 3.0 g, NaCl 5.0 g, lactose 12.5 g, bile salts 1.5 g, aniline blue 0.1 g, 한천 15.0 g을 증류수 1 L에 넣고 pH를 7.4로 조정한 다음, 가온 용해한다. 30분 이내로 완전히 끓인 다음, 60 °C 전후로 냉각시켜 두께가 5 mm 되도록 페트리 접시에 분사해 응고시킨다. 이 배지는 특히 고압 증기 멸균을 하지 않고 조제 후 96시간 이상 경과한 것은 사용하지 않는다. 

4.1.2.2  멸균 펩톤액: 증류수 1 L에 펩톤 5 g을 녹여서 pH를 6.8로 조정 

4.1.3  시험방법

4.1.3.1  막여과: 여과지를 멸균한 피펫으로 여과 장치 위에 넣는다. 여과지 위 집락 수가 20 ∼ 60개가 되도록 적당량의 시료를 여과시키고 여과 할 시료량이 10 mL보다 적을 경우에는 멸균된 희석액으로 희석하여 여과

 분원성 대장균 수를 예측할 수 없을 경우에는 여과량을 달리하여 여러 개의 시료를 분석한다. 시료를 여과시킨 후, 멸균한 펩톤액 약 30 mL로 여과장치 내벽을 씻어 여과시킨다. 

4.1.3.2  배양: 여과된 여과지를 M-FC 한천 평판 위에 기포가 생기지 않도록 밀착시킨 다음, 페트리 접시는 뒤집은 상태에서 44.5 ± 0.2 °C로 유지될 수 있는 정밀배양기 혹은 방수성 플라스틱 백에 넣어 항온 수조에 잠기도록 하여 24 ± 2시간 배양한다.

4.1.3.3  계수법: 배양 후 확대경이나 실체 현미경(10 ∼ 15배)으로 여과지 위에 청색 광택을 띠는 집락 수를 세어 계산한다. 분변성 대장균은 시료 100 mL 중에 들어 있는 대장균 집락 수로 나타내며, 여과막 당 그 집락 수가 20 ∼ 60의 범위에 드는 것을 선정하여 다음의 식에 의하여 계산한다.

┌──────┐

│      (식 4)│

└──────┘

4.2  분변성 대장균 최적확수법(MPN법)

EC 배지가 든 여러 개의 시험관을 44.5 ± 0.2 °C 환류 항온 수조에서 배양하는 방법으로 제3항 1.5의 시험 방법에 따라 진행한다. 시료에 존재하는 분변성 대장균군을 측정하기 위하여 발효관을 이용하는 추정시험과 백금이를 이용하는 확정시험으로 나뉘며 추정시험이 양성일 경우 확정시험을 시행한다.

4.2.1  기구 및 기기

제3항 1.2의 기구 및 기기를 따른다.

4.2.2  시약 및 표준물질

4.2.2.1  라우릴 트립토스 배지(추정시험용): 제3항 1.3.1의 내용을 따른다.

4.2.2.2  EC 배지(확정시험용): 트립토스나 트립티케이스 20.0 g, 유당 5.0 g, 담즙염 1.5 g, 무수인산일수소칼륨 4.0 g, 무수인산이수소칼륨 1.5 g, 염화나트륨 5.0 g을 증류수 1 L에 넣고 녹인 후 pH가 6.9 ± 0.2가 되도록 한다. 다람발효관에 약 10 mL씩 분주해서 121 °C에서 15분간 고압증기멸균을 한다. 다람발효관 내에 기포가 발생한 것은 사용하지 않는다.

4.2.3  시험방법

4.2.3.1  추정시험

제3항 1.5.1의 추정시험 방법을 따른다.

4.2.3.2  확정시험

모든 추정시험 발효관이 24 ± 2시간 또는 48 ± 3시간 배양 끝에 어떤 가스의 기미가 보일 때 확정시험으로 들어간다. 24시간 전에 발효시험관에서 발효 현상이 보이면 24시간을 기다리지 말고 확정시험에 들어간다. 추정시험 발효관을 가볍게 흔들어 내용물이 잘 섞이게 둔다.

추정시험 양성 시험관으로부터, 멸균된 EC 액상배지가 든 발효관에 직경 3 mm 백금이 백금이는 화염살균 후 충분히 냉각시켜 사용 한다.

를 사용하여 무균적으로 이식한다. 접종된 EC 발효관을 44.5 ± 0.2 °C의 환류 항온 수조에서 24 ± 2시간 배양시킨다. 모든 EC 발효관은 접종 후 30분 이내에 수조에 넣어야만 한다. 발효관을 충분히 잠기게 하여 수면이 배지 높이보다 위에 오도록 해야 한다. 온도계는 적어도 0.1 °C 간격으로 나누어져 정확하게 온도를 검안할 수 있어야 한다. 24 ± 2시간 후 EC 발효관의 가스 형성 여부를 기록한다. 24 ± 2 시간 내에 발효관에서 가스가 생성되었다면 분변성 대장균의 양성 확정시험으로 인정한다. 24 ± 2시간 내에 가스가 발생하지 않으면 분변성 대장균의 음성 확정시험으로 간주한다.

4.2.3.3  결과의 표시

분변성 대장균군의 수는 제3항 1.5.5의 최적확수 계산법에 따라 계산한다.

제4항 발광박테리아를 이용한 독성평가 방법

1. 측정원리

마이크로톡스 독성 바이오에세이(Microtox toxicity bioassay)는 해양에 존재하는 발광성 박테리아인 Vibrio fischeri의 발광 저해도를 측정하는 생물학적 독성평가 기법이다. 이들 박테리아는 배양액 상태에서 최적의 성장조건을 주면, 체내에서 생성되는 대사에너지의 일부(약 10 %)가 전자전달계에 의해 화학에너지로 바뀌어 빛(최대파장: 490nm)을 낸다. 하지만, 이 발광 기작은 박테리아 세포의 호흡 기작과 관련이 있는 바, 독성물질에 의해 세포의 구조가 변형되거나 세포 내 대사 과정에 변화가 있으면 세포의 호흡량이 달라지고 동시에 발광도가 변화한다. 이들 박테리아가 들어 있는 배양액에 시험하고자 하는 물질을 첨가한 후, 30분 내에 나타나는 발광도의 차이로부터 해당 물질의 독성을 측정한다. 이 방법은 독성시험을 위한 제반 시료 및 장치가 상용으로 제조되어 있어 쉽게 습득 및 적용이 가능하다. 또한, 간편하고 신속하며 해양 퇴적물뿐만 아니라 육상토양, 지표수 및 산업폐수 등 다양한 오염물질의 생물학적 독성을 민감하게 검색할 수 있다. 독성을 평가하고자 하는 퇴적물에 추출 용매를 넣어 액상형의 독성물질을 추출시키는 바, 어떤 물질을 추출 용매로 이용할 것인가에 따라 퇴적물의 전처리방법 및 평가내용이 크게 달라진다. 그 차이는 다음과 같다.

표 1. 발광박테리아를 이용한 독성평가 방법의 특정

┌─────────┬────────────────────────────┐

│독성평가 방법     │독성평가 방법의 특징                                    │

├─────────┼────────────────────────────┤

│염수 추출법       │- 퇴적물내 공극수와 무기용매에 의해 추출되는 성분을     │

│(saline extract)  │  이용한다.                                             │

│                  │- 약 2 % NaCl 용액을 추출용매로 이용한다.               │

│                  │- 퇴적물 내 용존상태 및 쉽게 수용성으로 추출되는        │

│                  │  독성물질을 검색한다(주로 이온성 금속류).              │

│                  │- 시료간의 염분 차이에 의한 발광도 차이를 보정해야 한다.│

│                  │- 전처리 과정이 단순하다.                               │

├─────────┼────────────────────────────┤

│ 유기용매 추출법  │- 공극수가 제거된 퇴적물을 대상으로 한다.               │

│(organic extract) │- 유기용매에 의해 퇴적물에서 추출되는 액상시료를        │

│                  │  이용한다.                                             │

│                  │- 추출 유기용매는 주로 디클로로메탄(원액)을 이용한다.   │

│                  │- 주로 중성 또는 비이온성 유기물질의 독성을 검색한다.   │

│                  │- 유기용매에 의해 추출된 물질의 농도는 공극수에서       │

│                  │  예상되는 독성보다 강하다.                             │

│                  │- 전처리 과정이 복잡하다.                               │

└─────────┴────────────────────────────┘

2. 기구 및 기기

2.1  마이크로톡스 독성분석 시스템(Microtox toxicity analyzer system): 상용의 박테리아 배양기 및 발광 검량기, Microtox 측정시험관 등이 포함되어 있다.

2.2  회전교반기(rotary shaker table): 추출 용매를 넣어 독성물질을 추출시킬 때 사용한다. 0 ∼ 500 rpm 범위에서 조절 가능한 기기를 사용한다.

2.3  실험 및 시약 용기: 30 mL 용량의 유리 시험관 및 코렉스 원심분리 시험관, 250 mL 삼각플라스크, 피펫 등 분석에 사용되는 모든 초자기구류 및 플라스틱 용기는 2 N 염산 용액으로 세척 후 1차 증류수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 특히 유기용매가 사용되는 기구는 해당 유기용매에 의해 최종 세척되어야 한다.

2.4  자동 피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 정밀도가 높은 디지털 피펫을 사용 하고 교차오염을 방지하기 위해서 일회용 피펫 팁을 사용한다.

3. 시약 및 표준물질

3.1  Freeze dried bacteria: 상용의 동결건조된 박테리아(Vibrio fischeri)

3.2  Microtox reconstitution 용액: 상용의 동결건조된 박테리아를 활성시키기 위한 용액

3.3  Microtox diluent 용액: 상용의 희석액. 염수나 유기용매에 의해 추출된 용액을 여러 비율로 희석시킬 때 이용된다. 염수 추출법에서는 추출 용매(염수)로도 이용한다.

3.4  Osmotic adjusting 용액: 상용의 삼투압 조절용액. 박테리아 배양 시 삼투압 조건을 일정하게 조절해주기 위해서 사용한다.

3.5  페놀(phenol, C6H6O): 상용의 표준 독성시험물질(100 ppm)

3.6  황산아연(zinc sulfate, ZnSO4·7H2O): 상용의 표준 독성시험물질(100 ppm)

3.7  디클로로메탄(dichloro methane, CH2Cl2)

3.8  금속 구리(metallic copper): 순도 99.9 % 이상

3.9  디메틸술폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO, C2H6SO)

3.10  황산나트륨(sodium sulfate, Na2SO4)

4. 시료의 채취 및 보관

4.1  염수 추출법을 위한 퇴적물을 채집할 때는 용기 내에 빈 공간이 없도록 퇴적물을 가득 채운다. 정점당 최소한 200 g의 퇴적물을 확보해야 한다. 퇴적물 시료는 4 °C, 어두운 곳에 보관하며, 채집 후 2주 이내에 시험해야 한다.

4.2  유기용매 추출법을 위한 퇴적물 채취 방법은 염수 추출법과 동일하다. 퇴적물 시료는 채집 후 8시간 이내에 -20 °C에서 보관해야 한다. 현장에서 고체 이산화탄소(dry ice)로 냉동시키는 것이 가장 안전하다. 냉동된 퇴적물 시료는 6개월 이내에 분석해야 한다.

5. 시험방법

5.1  염수 추출법

5.1.1  스텐레스 숟가락으로 퇴적물 30 g을 취해서 30 mL 유리시험관에 넣고 10 mL의 마이크로톡스 딜루언트(Microtox diluent) 용액을 넣는다.

5.1.2  회전교반기에서 100 rpm의 속도로 4 °C의 어두운 곳에서 24시간 동안 흔든다.

5.1.3  시료를 30 mL 코렉스 원심분리시험관으로 옮기고, 9,000 rpm, 4 °C에서 15분간 원심분리한다.

5.1.4  피펫으로 상등액을 깨끗한 30 mL 유리시험관으로 옮긴 후 얼음 위에서 보관한다. 즉시 발광률을 측정하는 것이 좋다. 상등액은 4 °C에서 2시간까지 보관 가능하다.

5.1.5  냉동건조된 박테리아에 1 mL의 마이크로톡스 재활성화(Microtox reconstitution) 용액을 넣고 뚜껑을 닫아 밀봉하여 4 °C의 배양대에 놓는다. 한번 배양된 박테리아는 5시간 이내에 사용해야 한다.

5.1.6  염수 추출액을 5단계(100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, 0 %)로 마이크로톡스 딜루언트 용액으로 희석한다. 100 %는 추출액 원액을 의미하며, 0 %는 바탕용액으로 염수 추출액을 넣지 않고 마이크로톡스 딜루언트만 넣는다.

5.1.7  마이크로톡스 측정시험관에 마이크로톡스 딜루언트 용액을 350 μL씩 분주하고, 위 5.1.5의 배양된 박테리아액을 각각 10 μL씩 접종하여, 15 °C에서 15분 기다린 후 마이크로톡스 독성 분석기(Microtox toxicity analyzer)의 검량기에서 초기발광도(Io)를 측정한다.

5.1.8  위 5.1.6 과정에서 희석된 퇴적물 염수 추출액(시료)을 5.1.7의 마이크로톡스  측정시험관에 각각 500 μL씩 넣는다. 정확히 30초 간격을 유지해야 한다.

5.1.9  정확히 15분이 지난 후, 30초 간격으로 각각의 마이크로톡스 측정시험관의 발광도를 측정한다(It).

5.1.10  각 시료의 발광 저해율은 다음식에 의해 계산한다.

┌───────────────────────────────────────┐

│                                                                              │

│            발광저해율(%)  =  [ ( R Io ? It) / ( RIo )] × 100        (식 1) │

│                                                                              │

│                                                                              │

│     여기에서, Io = 초기 발광율, 퇴적물 추출액이 들어가기 전의 발광율         │

│            It = 퇴적물 추출액을 넣고서 15분이 지난 후의 발광율               │

│   R = 바탕상태 하에서의 발광 변화율(= Bt/Bo)                                 │

│  Bo = 바탕용액에서 박테리아의 초기 발광율                                    │

│     Bt = 바탕용액에서 15분 후의 박테리아 발광율                              │

└───────────────────────────────────────┘

5.1.11  발광이 바탕용액에 비해 50 % 저해되는 희석농도(EC50)를 구한다. 마이크로톡스 독성분석기의 발광측정 프로그램 하에서는 자동으로 회귀곡선을 구하여 EC50을 계산하여 신뢰구간과 함께 제시된다.

5.1.12  EC50 값이 낮을수록 생물 독성이 높음을 의미하며, 오염되지 않는 대조구(control) 정점과의 EC50 값의 차이를 비교하여 퇴적물의 상대 독성을 평가할 수 있다.

5.2  유기용매 추출법

5.2.1  퇴적물을 녹여 윗물을 따라버리고 스테인리스 숟가락으로 골고루 섞는다. 자갈, 조개껍질, 나뭇조각 등은 골라내어 버린다.

5.2.2  퇴적물을 10.0 ± 0.5 g 취해서 디클로로메탄으로 최종 세척된 코렉스 원심분리 시험관에 넣는다.

5.2.3  별도로 퇴적물 10 g을 취해서 건중량을 측정하여 함수율을 계산한다.

5.2.4  1,500 rpm에서 20분간 원심분리한 후 윗물을 버리고, 디클로로메탄으로 세척된 250 mL 삼각 플라스크에 퇴적물을 옮겨 담는다.

5.2.5  추출 용매인 디클로로메탄 100 mL를 퇴적물이 담긴 플라스크에 넣고 수분 제거를 위해 10 g의 황산나트륨을 첨가한다. 또한, 황산염(sulfate)의 영향을 제거하고자 5 g의 금속 구리를 첨가하고 고무마개로 밀봉한다.

5.2.6  약 200 rpm으로 4시간 동안 교반한다.

5.2.7  1,500 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액인 유기용매 추출물을 취한다.

5.2.8  상등액을 후드(hood) 안에서 자연 증발시켜서 추출 용매인 디클로로메탄을 제거한다.

5.2.9  DMSO를 약 1.0 mL 첨가하여 잔류물을 완전히 용해한다.

5.2.10  마이크로톡스 딜루언트 용액을 49 mL 첨가하여 DMSO 용액의 최종 희석농도를 2 %가 되게 한다.

5.2.11  위 추출액을 5단계(100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, 0 %)로 마이크로톡스 희석 용액으로 희석한다. 100 %는 추출액 원액을 의미하며, 0 %는 바탕용액으로 유기용매 추출액을 넣지 않고 마이크로톡스 딜루언트 용액만 넣는다. 염분을 일정하게 유지하기 위해서 삼투압 조절 용액(Osmotic adjustment solution) 1 mL를 첨가한다.

5.2.12  마이크로톡스 측정시험관에 마이크로톡스 딜루언트 용액을 350 μL씩 분주하고, 염수추출법 5.1.5와 같이 배양된 박테리아 액을 각각 10 μL씩 접종하여, 15 °C에서 15분 기다린 후 마이크로톡스 독성분석기의 검량기에서 초기 발광도(Io)를 측정한다.

5.2.13  위 5.2.11 과정에서 희석된 퇴적물 유기용매 추출액(시료)을 5.2.12의 마이크로톡스 측정시험관에 각각 500 μL씩 넣는다. 정확히 30초 간격을 유지해야 한다.

5.2.14  정확히 15분이 지난 후, 30초 간격으로 각각의 마이크로톡스 측정시험관의 발광도를 측정한다(It).

5.2.15  박테리아의 발광 저해율 계산 및 EC50의 계산은 염수 추출법의 5.1.10 ∼5.1.12의 내용과 동일하다.

6. 참고사항

마이크로톡스 바이오에세이(Microtox bioassay) 독성평가 방법의 검정을 위해 마이크로톡스용 표준독성 시험물질(페놀과 황산아연)을 이용하여 시험의 정확성과 정밀성을 측정하고 이를 결과와 함께 제시한다. 그 과정은 다음과 같다. 아울러 이 시험을 반복 수행하여 시험의 정밀도를 제시한다.

6.1  양성대조군(Positive control)를 위한 표준독성 시험물질인 페놀 용액과 황산아연 용액(각각 100 ppm 용액)을 마이크로톡스 딜루언트 용액를 이용하여 100/2, 100/4, 100/8, 100/16, 100/32 ppm으로 희석한다.

6.2  동결건조된 박테리아에 1 mL의 마이크로톡스 재활성화 용액(Microtox reconstitution solution)을 넣고 뚜껑을 닫아 밀봉한 다음, 4 °C의 배양대 위에 올려놓는다. 한번 해동된 박테리아는 5시간 이내에 사용해야 한다.

6.3  마이크로톡스 측정시험관에 500 μL 마이크로톡스 딜루언트 용액을 넣고 위 6.2의 박테리아 용액 10 μL씩을 접종한다.

6.4  배양 후 15분 만에 초기발광량(Io)을 측정한다.

6.5  위 6.1에서 희석된 표준독성 용액을 각각 500 μL씩 넣고, 15분 후에 다시 발광량(It)을 측정한다.

6.6  발광 저해율 및 EC50 값의 계산 방법은 염수 추출법의 5.1.10 ∼5.1.12의 내용과 동일하다.

6.7  측정된 EC50을 제시된 EC50 값과 비교하여 그 결과를 제시한다.

제5항 구리(Copper, Cu)

1. 측정원리

건조한 해양생물 시료를 분쇄하여, 질산 및 과염소산으로 2단계에 걸쳐 산분해한 다음 희석 질산으로 추출 및 재용해하여 흑연로 원자흡광분석기(이하 GF-AAS) 혹은 유도결합플라즈마 분광분석기(이하 ICP-OES), 유도결합플라즈마 질량분석기(이하 ICP-MS)로 정량한다.

2. 측정범위 및 정밀도

GF-AAS와 ICP-OES, ICP-MS의 측정범위와 정밀도에 관한 내용은 해저퇴적물공정시험기준 제4장 제8항 구리(Cu) 편에 따른다.

3. 기구 및 기기 

3.1  실험기구: 희석 질산에 24시간 이상 담가둔 후 산을 제거하고 초순수로 3 ∼ 6회 이상 헹구어 사용한다. 사용하지 않을 경우, 클린벤치 내에서 뒤집어서 건조시킨 후, 밀봉하여 비닐 지퍼백 등에 넣어 보관한다. 

3.1.1  테프론 비이커 혹은 테프론 가압형 산분해용기: 125 mL 비이커, 60 mL 가압형 산분해용기

3.1.2  100 mL 플라스틱 병

3.1.3  피펫: 일회용 자동 피펫을 사용할 수 있다.

3.1.4  플라스틱 핀셋

3.2  볼밀 혹은 막자사발  

3.3  전자저울: 0.0001 g까지 정확히 측정할 수 있는 저울

3.4  화학분석용 후드: 후드 바닥을 테프론 혹은 비닐로 코팅하여 사용

3.5  가열판 (온도가 정확히 조절되는 것)

3.6  건조기로 세척하여 사용한다.

3.7  흑연로 원자흡광분석기(GF-AAS), 유도결합 플라즈마 분광분석기(ICP-OES), 유도결합 플라스마 질량분석기(ICP-MS)로 정량한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  산: 중금속 분석에 사용하는 산은 특급 수준 이상으로, 시료 정량 후 시약 공시료의 농도가 시료 측정농도의 25 % 미만인 것을 확인하여 사용한다.

4.1.1  진한 질산 (60 ∼ 70 % HNO3)

4.1.2  진한 과염소산 (60 ∼ 70 % HClO4)

4.1.3  희석질산 용액: 초순수 900 mL에 진한 질산 100 mL를 넣어 혼합하여 식힌 다음 1,000 mL로 맞추어 사용한다.

4.2  구리 표준원액: 상용으로 제조되는 GF-AAS, ICP-OES 혹은 ICP-MS 구리 표준용액을 사용한다.

4.3  공인된 해양생물 표준물질(Certified reference materials, CRM): 국내ㆍ외의 공인된 해저생물 표준물질 생물체 표준물질 : 생물체 분석 자료의 정확도를 평가하기 위한 생물체 표준시료로는 캐나다 NRC의 DOLT, DORM, TORT, 미국 NIST의 2976가 있다.

을 구입하고 시료와 똑같은 조작을 행하여 회수율을 측정한다

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료 채집: 조사목적에 따라 계획된 방법에 의해 생물을 채집한다. 금속성 채집기구를 사용하지 않는다. 채집 생물의 종류 및 채집 방법 등은 조사목적에 따라 다르다. 홍합의 경우, 되도록 5 ∼ 8 cm 크기의 것으로 한 장소에서 15개체 이상을 채집한다.

5.2  채집 시료의 탈장: 현장에서 시료를 현장 해수로 깨끗이 씻는다. 생물체의 장(gut) 내에 있는 퇴적물이나 기타 섭취물질 때문에 오차가 발생하므로 이들을 제거해야 하는 탈장을 시켜야 한다. 탈장 시간은 생물의 종류에 따라 다르나, 대략 여과시킨 현장 해수로 약 24시간 수행한다. 탈장 기간에는 통기(aeration)를 시켜야 한다. 식물체의 경우, 채집 현장 해수를 여과하여 엽체, 줄기 및 뿌리 등에 묻어 있는 입자 물질 등을 충분히 씻어 낸 후 시료로 사용하며, 증류수 등으로 씻을 시에는 삼투압 등에 의해 실제량보다 과소 평가될 수 있다.

5.3  보관: 탈장 후 시료를 바로 전처리하거나 냉장 또는 냉동시킨다. 가능하다면 -81 °C의 초저온 냉동고에 동결시킨다.

 분석 직전에 보관된 시료를 상온에서 녹인 다음, 15개체 이상의 속살을 혼합한 후, 약 10 g의 시료를 50 mL 비이커 혹은 스냅 바이알에 넣고 건조기에서 건조시킨다. 만약 동결건조기가 있다면 초저온 냉동 1일 후, 동결건조기에서 동결 건조시키는 것이 최선이다.

 건조된 시료를 볼밀 혹은 막자사발(agate mortar)에서 곱게 간 다음, 이를 유리병에 넣어 보관한다. 생물 시료는 장기간 보관 시 부패할 수도 있으므로 보관에 주의해야 한다.

5.4  분석 목적에 따라 생물체의 전체 또는 특정 부위만을 선택하여 체내 중금속량을 측정한다.

5.5  기록 사항: 생체 중금속량은 생물의 종류, 채집시기, 채집장소, 생물의 길이, 분석부위(tissue), 건중량 및 습중량 등 제반 조건에 따라 그 값이 달라진다. 따라서, 위 항목을 기록하여 시료와 함께 보관하고, 최종 결과 보고 시에 이를 명기해야 한다.

6. 시험방법

6.1  전처리가 완료된 시료 0.1 g을 취하여 60 mL 테프론 용기에 넣는다.

6.2  테프론 용기에 진한 질산 1 mL를 가하여 2시간 이상 실온에서 반응시킨 후, 진한 과염소산 1 mL를 첨가하여 뚜껑을 닫아 밀봉한다. 

6.3  밀봉된 테프론 용기를 가열판 위에 놓고 가열판 온도를 130 ∼ 150 °C까지 서서히 증가시켜 약 24시간 반응 후에 서서히 방냉하여 상온에 도달한 다음, 마개를 열어 시료와 산이 완전히 건조될 때까지 재가열한다. 만약, 용액이 전부 휘발되어도 완전히 분해되지 않을 경우에는 위 6.2 과정부터 재시행한다.

6.4  완전히 분해된 시료에 희석질산 용액 10 mL를 정확하게 넣고 뚜껑을 닫아 밀봉한 후 온도를 80 °C까지 증가시켜 약 2시간 반응 후 정량용 시료용액으로 한다. 

6.5  이 용액을 GF-AAS 혹은 ICP-OES, ICP-MS로 정량한다. 각 기기로 정량할 때의 조건은 사용하는 기기의 매뉴얼을 따른다.

6.6  검량선 작성

6.6.1  GF-AAS 혹은 ICP-OES, ICP-MS 표준용액을 이용하여 정량범위 내 5개 이상의 농도구간에 대해 표준용액을 만든다.

6.6.2  만들어진 표준용액을 시료정량과 동일한 절차(6.5항)로 정량하여 구리(Cu)의 농도와 흡광도의 관계선인 검량선을 작성한다.

6.6.3  흡광도와 농도의 상관관계식을 이용하여 시료의 구리(Cu)의 농도를 환산한다.

6.7  공시료 및 공인된 해양생물 표준물질(CRM)도 시료와 동일한 조작을 행하여 시료 20개당 1개씩 준비한다.

6.8  회수율: 해양생물 표준물질(CRM) 측정 결과와 제시된 농도 값을 비교한 후 회수율(recovery ratio)을 계산하여 분석된 시료의 결과와 함께 제시한다.

회수율(%) = (측정결과로 정량된 표준물질의 농도/인증된 표준물질의 농도)× 100

(식 1)

6.9  흡광도와 농도의 상관관계식을 이용하여 다음과 같이 구리 농도를 계산한다.

┌──────────────────────────────────────────┐

│                           (식                                                      │

│2)                                                                                  │

│                                                                                    │

│      A: 검량선식으로부터 구한 농도                                                 │

│      B: 공시료의 농도                                                              │

│      C: 희석배율 = 10 / M                                                          │

│            10: 최종 정량할 때 사용되는 희석질산 부피 10 mL 즉, 10 g에 해당         │

│            M: 시료의 무게(g)                                                       │

│      D: 회수율보정 = 인증된 표준물질의 농도 / 측정결과로 정량된 표준물질의 농도    │

│                                                                                    │

└──────────────────────────────────────────┘

6.10  GF-AAS나 ICP-OES로 정량하고자 하는 시료의 농도가 매우 낮거나 다른 항목의 간섭효과 등에 의해 정량이 어려울 경우에는 표준물질 첨가법을 이용하여 정량하고자 하는 항목을 정량할 수 있다. 표준물질 첨가법의 방법은 다음과 같다.

6.10.1  표준물질을 이용하여 3개 정도의 농도를 알고 있는 표준용액을 만든다.

6.10.2  정량하고자 하는 시료에 표준물질을 첨가하여 3개 이상의 표준물질을 첨가한 용액을 만든다. 이때 표준물질을 첨가한 후의 농도를 예측할 수 있도록 부피비율을 정하여 첨가한다. 예를 들어, 정량 용액의 부피가 1 mL일 경우, 농도가 X μg/L인 미지시료 0.9 mL와 농도가 10 μg/L인 표준용액 0.1 mL를 첨가하면 표준용액을 첨가한 시료의 농도는 X + 1 μg/L로 예상할 수 있다.

6.10.3  표준물질을 첨가한 시료를 GF-AAS나 ICP-OES를 이용하여 정량한다.

6.10.4  정량값을 이용하여 검량선을 그린다.

6.10.5  검량선을 이용하여 미지 농도 X값을 정량한다.

7. 방해요인

해저퇴적물공정시험기준 제4장 제8항 구리의 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  본 분석방법의 정도관리를 위해 필요한 최소한의 정도관리용 자료는 시약 공시료의 금속 농도, 반복시료 정밀도, 생물체 표준물질에서의 금속 농도가 있다.

8.2  실험실 시약에 의한 공시료에서의 금속 농도: 공시료를 분석한 금속농도 자료이다.

8.3  반복시료 정밀도: 실제 시료를 5개 복수 분석하여 농도의 표준편차를 구한 후 1.96(95 % 신뢰구간)을 곱하여 평균값 ± 유의수준으로 표시한다.

8.4  인증표준물질 생물체 시료 분석: 시료 수의 10 %에 해당하는 수만큼 시료와 같은 방법으로 분석하여 인증값과 비교한다.

9. 결과

9.1  보고되는 자료는 μg/g 단위로 표시하며 생물체 중금속 농도는 다음과 같은 식으로 계산한다.

(식 3)

9.2  분석과정 동안 얻은 정도관리용 자료는 시료 분석자료의 질을 나타내기 때문에 시료와 함께 보고한다.

10. 분석절차 흐름도

┌─────────┐                                                            

│시료              │ 0.1 g을 정확히 취하여 사용                                 

└─────────┘                                                            

┌─────────┐                                                            

│테프론 병         │                                                            

└─────────┘                                                            

                       ① 진한 질산 1 mL                                          

┌─────────┐                                                            

│밀봉 후 2시간 반응│                                                            

└─────────┘                                                            

                       ② 진한 과염소산 1 mL                                      

┌─────────┐                                                            

│혼합              │                                                            

└─────────┘                                                            

┌─────────┐                                                            

│가열              │ 130 ∼ 150 °C 까지 서서히 온도를 올린 후 24시간 가열      

└─────────┘                                                            

┌─────────┐                                                            

│방냉              │ 가열 후 뚜껑을 닫은 상태로 상온에서 방냉                   

└─────────┘                                                            

┌─────────┐                                                            

│재가열 및 건조    │ 상온에 도달한 후 뚜껑을 열고 재가열, 산이 모두 건조될 때   

│                  │ 까지 가열                                                  

└─────────┘                                                            

                       시료가 완전히 분해되지 않았을 경우, ① 과정부터 재실행     

┌─────────┐                                                            

│정량용 시료       │ 희석 질산용액 10 mL를 정확히 가하여 밀봉한 후 온도를 80    

│                  │ °C 까지 서서히 증가시켜 2시간 반응 후 정량용 시료 용액    

│                  │ 으로 사용                                                  

└─────────┘                                                            

┌─────────┐                                                            

│정량              │ 이 용액을 GF-AAS, ICP-OES 혹은 ICP-MS로 정량               

└─────────┘                                                            

그림 1. 구리 분석절차 흐름도

11. 참고사항

11.1  본 분석법으로 분석 가능한 금속들은 아래와 같으며 측정하는 방법에 따라 마지막 처리가 달라진다.

표 1. 분석법에 따라 분석 가능한 금속

┌───┬────────────────────────┐

│분석법│분석가능 금속                                   │

├───┼────────────────────────┤

│AAS   │Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As(Hydride), Al     │

├───┼────────────────────────┤

│GF-AAS│Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As(Hydride)         │

├───┼────────────────────────┤

│ICP   │Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As(Hydride), Al, Li │

├───┼────────────────────────┤

│ICP-MS│Co, Ni, Cr, Cu, Zn, Cd, Pb, As, Li, Al, Cs      │

└───┴────────────────────────┘

11.2  본 분석법은 강산 및 과염소산, 불산을 사용하기 때문에 반드시 흄후드 내부에서 이루어져야 하며 산 취급에 대한 교육을 잘 받은 실험자가 행해야 된다.

11.3  중금속 시료의 분석은 사용하는 시약, 용기 및 환경에 의해 영향을 받기 때문에 실험준비시 오염에 대한 고려가 있어야 한다.

11.4  본 실험방법에서 사용되는 시약들은 모두 맹독성이 있는 것들로 각 시약들의 사용 주의사항에 따라 취급한다.

11.5  자료의 질을 관리하기 위해서는 적어도 공시료와 생물체 표준물질(CRM)을 반드시 시료와 함께 분석한다.

11.6  홍합 시료는 5 ∼ 8 cm를 기준으로 채취하며 탈장 과정을 반드시 거치며 적어도 15개체 이상을 혼합한 후 분취하여 시료를 준비한다.

11.7  본 실험방법에서 사용되는 시약들은 모두 맹독성이 있는 것들로 각 시약들의 사용 주의사항에 따라 취급한다.

11.8  ICP 및 ICP-MS의 플라즈마는 라디오 주파수의 빛뿐만 아니라 강한 자외선을 방사하기 때문에 보호 안경을 착용하기 전에는 시야를 노출해서는 안된다.

11.9  생물체 산분해시, 사용하고 남은 산류 및 분석하고 남은 용액들은 산류 폐수통에 보관하였다가 해당 기관의 지침에 따라 처리한다.

11.10  폐기물 처리는 처리시설을 갖춘 업체에 위탁한다.

11.11  본 지침서에서 발생하는 폐액의 대부분은 산성 폐액이다. 따라서, 산 전용 폐액 보관용기에 폐액을 모으고 그늘지고 서늘한 장소에서 보관한다.

11.12  사용한 시약병은 수돗물로 내부를 씻어내고 뚜껑을 닫아 보관한다.

11.13  정량결과 예시: 시료의 채취 및 보관 방법, 전처리 방법, 정량결과, 검량선을 포함하여 상세하게 제시한다.

표 1. 시료 채취 및 보관, 전처리 정보(작성예시)

┌─────────────┐

│시료 채취 및 보관, 전처리 │

├──────┬──────┤

│시료명      │            │

├──────┼──────┤

│시료채취    │            │

├──────┼──────┤

│시료운반    │            │

├──────┼──────┤

│시료보관    │            │

├──────┼──────┤

│시료 전처리 │            │

└──────┴──────┘

표 2. 정량결과(작성예시)

┌───────────┐

│정량 결과             │

├──────────┬┤

│분석항목            ││

├──────────┼┤

│정량 기기           ││

├──────────┼┤

│CRM 농도            ││

├──────────┼┤

│정량 평균           ││

├──────────┼┤

│표준편차            ││

├──────────┼┤

│정밀도(상대표준편차)││

├──────────┼┤

│정확도(회수율)      ││

├──────────┼┤

│정량한계(검출한계)  ││

├──────────┼┤

│시료개수            ││

├──────────┼┤

│시료 중량           ││

├──────────┼┤

│희석 배율           ││

└──────────┴┘

제6항 납(Lead,  Pb)

1. 측정원리

제5항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

제5항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

제5항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제5항 구리 4. 시약 및 표준물질의 내용에 따라 표준용액은 납에 맞게 적용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

제5항 구리 6. 시험방법에 따라 납에 맞게 적용한다.

7. 방해요인

제5항 구리 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제5항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4에 따른다.

9. 결과

제5항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제5항 구리 10. 분석절차 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제5항 구리 11. 참고사항을 따른다.

제7항 니켈(Nickel,  Ni)

1. 측정원리

제5항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

제5항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기 

제5항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제5항 구리 4. 시약 및 표준물질의 내용에 따라 표준용액은 니켈에 맞게 적용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

제5항 구리 6. 시험방법에 따라 니켈에 맞게 적용한다.

7. 방해요인

제5항 구리 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제5항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4에 따른다.

9. 결과

제5항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제5항 구리 10. 분석절차 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제5항 구리 11. 참고사항을 따른다.

제8항 망간(Manganese,  Mn)

1. 측정원리 

제5항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

제5항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기 

제5항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질 

제5항 구리 4. 시약 및 표준물질의 내용에 따라 표준용액은 망간에 맞게 적용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

제5항 구리 6. 시험방법에 따라 망간에 맞게 적용한다.

7. 방해요인

제5항 구리 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제5항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4에 따른다.

9. 결과

제5항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제5항 구리 10. 분석절차 흐름도를 따른다. 

11. 참고사항

제5항 구리 11. 참고사항을 따른다.

제9항 아연(Zinc,  Zn)

1. 측정원리

제5항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

제5항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기 

제5항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질 

제5항 구리 4. 시약 및 표준물질의 내용에 따라 표준용액은 아연에 맞게 적용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

제5항 구리 6. 시험방법에 따라 아연에 맞게 적용한다.

7. 방해요인

제5항 구리 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제5항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4에 따른다.

9. 결과

제5항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제5항 구리 10. 분석절차 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제5항 구리 11. 참고사항을 따른다.

제10항 카드뮴(Cadmium,  Cd)

1. 측정원리

제5항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

제5항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기 

제5항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질 

제5항 구리 4. 시약 및 표준물질의 내용에 따라 표준용액은 아연에 맞게 적용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

제5항 구리 6. 시험방법에 따라 아연에 맞게 적용한다.

7. 방해요인

제5항 구리 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제5항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4에 따른다.

9. 결과

제5항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제5항 구리 10. 분석절차 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제5항 구리 11. 참고사항을 따른다.

제11항 코발트(Cobalt,  Co)

1. 측정원리

제5항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

제5항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

제5항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제5항 구리 4. 시약 및 표준물질의 내용에 따라 표준용액은 코발트에 맞게 적용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

제5항 구리 6. 시험방법에 따라 코발트에 맞게 적용한다.

7. 방해요인

제5항 구리 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제5항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4에 따른다.

9. 결과

제5항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제5항 구리 10. 분석절차 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제5항 구리 11. 참고사항을 따른다.

제12항 크롬(Chromium,  Cr)

1. 측정원리

제5항 구리 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

제5항 구리 2. 측정범위 및 정밀도에 따른다.

3. 기구 및 기기

제5항 구리 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제5항 구리 4. 시약 및 표준물질의 내용에 따라 표준용액은 크롬에 맞게 적용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

제5항 구리 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

제5항 구리 6. 시험방법에 따라 크롬에 맞게 적용한다.

7. 방해요인

제5항 구리 7. 방해요인에 따른다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

제5항 구리 8. 정도평가/정도관리 8.1 ∼ 8.4에 따른다.

9. 결과

제5항 구리 9. 결과 9.1 ∼ 9.2에 따른다.

10. 분석절차 흐름도

제5항 구리 10. 분석절차 흐름도를 따른다.

11. 참고사항

제5항 구리 11. 참고사항을 따른다.

제13항 비소(Arsenic,  As)

1. 측정원리 

이 실험방법은 해양생물체를 질산과 염산으로 산분해하여 총 비소와 무기비소 화학종 (As3+ 그리고 As5+)을 유도결합플라즈마 원자방출분광기 (Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometer, ICP-AES)로 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

분석방법의 유효측정범위는 총 비소의 경우 0.01 ∼ 1,000 μg/g이고, 무기비소 화학종의 경우는 1 ∼ 1,000 μg/g이다.

3. 기구 및 기기

3.1  30 mL Falcon Tube

3.2  Syringe Filter: Cellulose Acetate 재질로 0.20 μm의 pore size를 갖는다.

3.3  30 mL Vial Bottle

3.4  원심분리기: 30 mL 부피로 8,000 rpm이 가능한 원심분리기

3.5  100 mL 삼각플라스크

3.6  피펫: 10 mL, 20 mL 피펫. 시약 주입 시 사용한다.

3.7  Shaker: 200 rpm이 가능한 Shaker

3.8  Rotary evaporator 

3.9  저울: 0.0001 g까지 측정 가능한 전자저울 

3.10  분석기기: 유도결합 플라즈마 원자방출분광기(Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometer), 기기의 상세구성과 기구 및 재료는 각 기기 회사 사용 방법을 참고한다.

3.11  모든 유리용기는 10 % HNO3에 하루 동안 담군 후, Ultrasonic Cleaner로 3시간 세척하고 초순수로 헹궈 사용한다.

4. 시약 및 표준물질

4.1  초순수: 전기 저항이 18 ㏁ 이상이 되는 물이다.

4.2  질산 (Nitric acid, 70 % w/v): ACS reagent

4.3  질산 용액 (10 % v/v): 1 L 부피플라스크에 질산 원액 143 mL를 넣고 표시선까지 초순수로 채운다.

4.4  염산(Hydrochloric acid, 37 % w/v): ACS reagent

4.5  브롬산(Hydrobromic acid, 48 % w/v): ACS reagent

4.6  하이드라진 설페이트(Hydrizine sulfate, 99.0 %): ACS reagent

4.7  하이드라진 설페이트 용액(1.5 % w/v): 100 mL 부피플라스크에 하이드라진 설페이트 1.5 g을 넣고 표시선까지 초순수로 채운다.

4.8  클로로포름(Chloroform, 99.8 %): ACS reagent

4.9  5가 비소(Sodium arsenate dibasic heptahydrate, ≥ 98 %)

4.10  3가 비소(Sodium metaarsenite, ≥ 90 %)

4.11  비소 표준용액(100 mg/kg): 위 4.9항의 5가 비소 0.0208 g을 세척된 vial bottle에 넣고 초순수를 50 g이 되게 채운다.

4.12  검량선 비소 표준용액: 비소 표준액을 초순수로 희석하여 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 mg/kg의 농도를 갖도록 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 시료 채취시 폴리에틸렌 병이나 비닐백에 담아 냉동 후 이동하고, 실험 전 냉동 시료를 해동시킨다.

5.2  플라스틱 주걱으로 시료를 균질화한다.

5.3  균질 시료 5 ∼ 10 g을 시료병에 담아 냉동건조 시킨다. 냉동 건조가 어려운 경우, 습시료를 직접 사용한다. 습시료를 사용하는 경우에는 별도 시료에서 수분 함량을 측정 후 보정한다.

5.4  일정 무게가 유지된 후 시료를 마노 분쇄기(agate mortar)를 사용하여 곱게 분말화한다. 200 μm 메쉬 체를 이용하여 통과된 분말만 시료병에 보관한다. 별도의 체질을 하지 않는 경우, 손가락으로 만져봤을 때 입자가 만져지지 않아야 한다.

6. 시험방법

6.1  총 비소 분석을 위한 전처리

6.1.1  30 mL falcon tube에 분쇄한 생물체 약 0.2 g을 넣고 10 % HNO3 10 mL를을 채운다.

6.1.2  Shaker를 이용하여 위 6.1.1에서 준비한 시료를 24 h 동안 shaking한다.

6.1.3  Shaking한 시료를 원심분리용 용기에 옮기고 8,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 무게를 측정해 놓은 30 mL falcon tube에 옮긴다. 상층액은 0.20 μm syringe filter를 사용하여 여과되어야 한다. 여과 상층액을 3배 희석하고, 그 희석용액을 측정용액으로 한다.

6.2  무기비소 화학종 분석을 위한 전처리

6.2.1  30 mL vial bottle에 분쇄한 생물체 시료 약 0.5 g을 넣고 초순수 4.1 mL와 37 % 염산 18.4 mL를 넣어 밤새(12 h) 방치한다. 이 과정에서 As가 추출되고 그 중에서 As3+는 염산과 반응하여 AsCl3 염화물을 형성한다.

6.2.2  위의 용액을 원심분리용 용기에 옮기고, 8,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 100 mL 삼각플라스크에 옮긴다. 상층액은 0.20 μm syringe filter를 통하여 여과되어야 한다.

6.2.3  상층액에 브롬산 2 mL와 하이드라진 설페이트 1 mL를 넣고 흔들어서 잘 섞어준다. 이 과정에서 As5+는 As3+로 환원되어 진다. 환원된 As3+ 또한 염산과 반응하여 AsCl3 염화물을 형성한다.

6.2.4  5분 후에 클로로포름 30 mL을 넣고 흔들어 잘 섞어준다. 이 과정에서 수용액 층과 유기용매 층으로 분리가 된다. 그리고, AsCl3 염화물은 유기용매 층으로 추출되어 진다.

6.2.5  상층액인 수용액 층을 분리하여 제거하고 그 위에 1 M 염산 20 mL을 넣고 흔들어 잘 섞어준다. 그 결과, 다시 두 층이 형성되고 유기용매 층에 있던 AsCl3 염화물이 수용액 층으로 역추출 된다.

6.2.6  상층액인 수용액 층을 분리하여 둥근바닥 플라스크에 옮긴다.

6.2.7  Rotary evaporator을 이용하여 수용액 층에 혼입된 유기용매 층이 제거될 때까지 증발시킨다.

6.2.8  잔여물에 초순수를 넣어 희석시켜 무게를 알고 있는 30 mL 시료 병에 옮긴다. 용액의 최종 무게는 약 20 g가 되게 하고 그 용액을 측정용액으로 한다.

6.3  유도결합플라즈마 원자방출분광기 분석

6.3.1  분석 40여분 전에 유도결합플라즈마 원자방출분광기를 가동하여 충분히 안정화시킨다.

6.3.2  기기 매뉴얼에 따라 소프트웨어를 작동시켜 표준용액부터 시료를 분석한다.

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  검량선 작성

7.1.1  검량선 작성을 위해 준비된 표준용액을 3번 반복하여 측정하며 표준용액은 검량선 공시료를 포함하여 5개 농도구간 이상을 포함 한다.

7.1.2  각 표준용액 비소 농도에 해당되는 신호 세기를 이용하여 검량선을 최소자승법으로 작성하고, 검량선의 기울기, Y-절편 및 결정계수 값을 기록한다.

7.1.3  검량선 인자 (Calibration Factor, CF)를 계산하여 검량선의 이용 여부를 판단한다.

       (식 1)

7.1.4  CF 값의 평균과 표준편차를 구하여 상대표준편차가 15 % 이내이면 검량선을 이용하고 15 %를 벗어나면 검량선을 재작성한다.

7.2  바탕값 보정을 위한 공시료

시료와 같은 처리(용기, 기구, 시약, 분석 과정)를 하여 제조하고 분석한다. 한 실험구당 최소 3개 이상을 만들어 분석하며 시료 중 비소농도 계산 시 반영한다.

7.3  매질첨가 및 매질첨가 반복시료

시료 전처리 및 분석 방법이 해당 시료의 매질에 문제가 없는지를 확인하기 위하여, 현장시료 개수의 10 %에 해당하는 수만큼 매질첨가 시료와 매질첨가 반복시료를 만든다.

7.3.1  첨가하는 표준용액의 농도는 측정하는 농도가 30 ng/L가 되게 한다.

7.3.2  회수율은 다음과 같이 계산하고 80 ∼ 120 % 이내가 되어야 한다.

 (식 2)

7.3.3  매질첨가 반복시료의 경우, 상대오차율을 다음과 같이 계산하며, 30 % 이내가 되어야 한다.

           (식 3)

7.4  표준시료 분석을 통한 정확도 평가

비소 농도값이 보증된 생물표준 시료를 분석하여 정확도를 평가한다.

7.5  추출율 평가

전처리 과정의 정확도를 높이기 위해 사용하는 인증표준물질을 쉽게 구할 수 없는 경우, 시료 전처리 과정이 해당 시료에 있는 비소를 100 % 추출 가능한지에 대한 확인을 위해, 신뢰도가 높은 다른 전처리 과정을 통해 얻어진 결과값과 비교해 본다.

7.5.1  완전 용해가 가능한 Microwave Digestion System을 이용하여 해양 생물체 내 비소를 용출하고 적절하게 희석하여 비소량을 측정한다.

7.5.2  본 전처리 방법과 비교하여 정확도를 평가한다.

8. 분석절차 흐름도

8.1  총 비소

┌────────────┐                                                      

│시료                    │ 0.2 g을 정확히 취하여 사용                           

└────────────┘                                                      

┌────────────┐                                                      

│falcon tube             │                                                      

└────────────┘                                                      

                             ① 10 % 질산 10 mL                                   

┌────────────┐                                                      

│shaker로 24시간 shaking │                                                      

└────────────┘                                                      

┌────────────┐                                                      

│원심분리용 용기         │ 8,000 rpm으로 10분간 원심분리                        

└────────────┘                                                      

                             ② 상층액 추출(0.20 μm syringe filter를 사용하여    

                            여과)                                                 

┌────────────┐                                                      

│falcon tube             │                                                      

└────────────┘                                                      

                             ③ 초순수를 이용하여 3배 희석                        

┌────────────┐                                                      

│정량                    │ ICP-AES, ICP-OES로 정량                              

└────────────┘                                                      

그림 1. 총 비소 분석절차 흐름도

8.2  무기비소 화학종

┌────────┐                                                            

│시료            │ 0.5 g을 정확히 취하여 사용                                 

└────────┘                                                            

┌────────┐                                                            

│30 mL vial      │                                                            

└────────┘                                                            

                     ① 초순수 4.1 mL, 37 % 염산 18.4 mL 첨가 후 12시간 방치    

┌────────┐                                                            

│원심분리용 용기 │                                                            

└────────┘                                                            

                     ② 8,000 rpm으로 20분간 원심분리 후 상층액 분리            

                       (0.20 μm syringe filter 사용하여 여과)                  

┌────────┐                                                            

│삼각 플라스크   │                                                            

└────────┘                                                            

                     ③브롬산 2 mL, 하이드라진 설페이트 1 mL 첨가 후            

                      잘 흔들어 섞는다.                                         

┌────────┐                                                            

│5분 방치        │                                                            

└────────┘                                                            

                     ④ 클로로포름 30 mL 첨가 후 잘 흔들어 섞는다.              

┌────────┐                                                            

│상층액 제거     │                                                            

└────────┘                                                            

                     1 M 염산 20 mL 첨가 후 잘 흔들어 섞는다.                   

┌────────┐                                                            

│둥근플라스크    │ 상층액을 옮긴다.                                           

└────────┘                                                            

                     Rotary evaporator를 이용하여 유기용매층 제거한 후          

                     초순수로 희석                                              

┌────────┐                                                            

│falcon tube     │ 최종무게는 약 20 g 정도로 한다.                            

└────────┘                                                            

┌────────┐                                                            

│정량            │ ICP-AES, ICP-OES로 정량한다.                               

└────────┘                                                            

그림 2. 무기비소 분석절차 흐름도

9. 참고사항

9.1  실험 중 발생한 유해 폐액과 폐기물은 해당 기관의 지침을 우선으로 한다.

9.2  폐기물 처리는 처리 시설을 갖춘 업체에 위탁한다.

9.3  본 시험방법에서 발생하는 폐액의 대부분은 산 폐액이다. 따라서, 산 폐액 전용보관 용기에 폐액을 모으고 산 폐액통은 그늘지고 서늘한 장소에서 보관한다.

제14항 총 수은(Total  mercury,  Hg)

1. 측정원리

해양생물체의 총 수은을 질산-황산으로 산 분해하여 산화, 퍼지와 포집, 탈착시켜 냉증기 원자형광분석기(Cold Vapor Atomic Fluorescence Spectrometry, CVAFS)로 측정하기 위한 절차이다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 분석방법의 유효측정범위는 0.5 ∼ 250 ng/g이고, 청정작업환경에서 최고의 기기 성능을 보유할 때 검출한계는 0.05 ng/g이며, 시료량을 증가시키고 BrCl 양(0.2 %)을 최소화하여 주변 오염을 최소화하면 0.01 ng/g까지 향상시킬 수 있다.

3. 방해요인

3.1  시료 내 존재할 수 있는 방해요인에 의한 영향을 제거하기 위하여, 생물체 분말시료를 질산-황산으로 산분해하고 여과한 후 상등액에 염화브롬액을 첨가하여 모든 수은 형태를 Hg(II)로 산화시킨다.

3.2  산화 후 시료분석 직전에 NH2OHㆍHCl(hydroxylamine hydrochloride)로 남아 있는 잔류 염소를 파괴시키고 염화제2주석(SnCl2)으로 Hg(II)를 휘발성인 Hg(0)로 환원시킨다.

3.3  Hg(0)를 아르곤가스와 가스/액체 분리기로 휘발시켜 금-트랩에 아말감이 되게 한다.

3.4  열을 가하여 수은을 휘발시키고 두번째 금-트랩에 아말감이 되게 하고 마찬가지로 열을 가하여 원자형광분석기로 측정한다.

4. 기구 및 기기 

4.1  테프론(PTFE) 비이커: 125 mL 비이커

4.2  가열판 (hot plate): 세라믹판, 온도조절 가능

4.3  일회용 피펫 (disposable pipette)

4.4  폴리에틸렌 원심분리관: 60 mL 튜브

4.5  폴리에틸렌 병: 60 mL

4.6  저울: 0.0001g 전자식 분석저울과 0.01g 윗접시 저울

4.7  표면온도계: 적외선 사용온도 측정기구

4.8  자동피펫 및 일회용팁: 200 μL, 1 mL, 5 mL 피펫 및 피펫팁, 시약주입시 사용

4.9  원심분리기: 50 mL 부피, 3,000 rpm에서 원심분리 가능한 장비

4.10  분석기기: 냉증기 원자형광광도계

4.11  테프론 용기는 왕수에 4시간, 질산(1 : 1)에 6시간 이상 가열 후 초순수로 세척하여 사용하며 일반 플라스틱 용기는 10 % 염산 용액에 6시간 이상 가열한 후 초순수로 세척하여 사용한다.

5. 시약 및 표준물질

5.1  초순수: 전기 저항 18 ㏁ 이상의 정제수

5.2  질산(Nitric acid, 65 % (w/v)): 수은 함량이 5 ng/L 이하인 중금속 분석용을 이용한다.

5.3  황산(Sulfuric acid): 수은 함량이 5 ng/L 이하인 중금속 분석용을 이용한다.

5.4  질산/황산 혼합 용액: 700 mL 질산에 황산 300 mL를 천천히 혼합한다. 이 혼합 용액은 열과 흄이 있으므로 흄후드 내부에서 조제되어야 한다. 

5.5  하이드록실아민 염화수소(Hydroxylamine hydrochloride, NH2OHㆍHCl) 용액: Hydroxylamine hydrochloride 300 g을 초순수에 용해시키고 최종 부피를 1 L에 맞춘다. 이 용액에 20 % 염화제이주석 용액 1 mL를 넣고 수은이 없는 질소 가스로 4시간 이상 500 mL/min 속도로 폭기하여 수은을 제거한다.

5.6  염화제이주석 용액: 염화제이주석(SnCl2ㆍ2H2O) 200 g을 100 mL 진한 염산에 넣고 가열하면서 용해시킨다. 초순수로 최종 부피 1 L가 되도록 한다. 수은이 없는 질소 가스로 4시간 이상 500 mL/min 속도로 폭기하여 수은을 제거하고 뚜껑을 잘 닫아 보관한다. 시약을 제조하면서 열과 흄이 발생하므로 보호장구를 착용하고 흄후드 안에서 작업한다.

5.7  염화브롬(BrCl) 용액: 브롬화칼륨(KBr) 27 g을 진한 염산 2.5 L에 녹인다. 이때, 테프론 코팅된 마그네틱바를 사용해서 1시간 이상 교반한다. 여기에 시약급 브롬산칼륨(KBrO3) 38 g을 천천히 넣는다. 주의사항: 이때 격렬한 반응이 일어나 많은 양의 할로겐가스를 방출하므로 반드시 소량씩 넣어준다.

 소량씩 넣으면 용액의 색깔이 노란색에서 빨간색으로 최종적으로는 오렌지색으로 변한다. 병뚜껑을 살짝 닫고 1시간 정도 더 교반하고 뚜껑을 잘 닫는다. 이 시약 제조는 반드시 흄후드 내부에서 이루어져야 한다.

5.8  수은 표준원액: 상용하는 1,000 mg/L 혹은 10,000 mg/L (NIST-3133) 용액을 사용한다.

5.9  수은 표준용액(1,000 μg/L): 초순수 0.5 L에 염화브롬 5 mL를 넣고 수은 표준원액 1 mL (1,000 mg/L) 혹은 0.1 mL (10,000 mg/L)를 첨가한 후 초순수로 최종 부피를 1 L가 되게 한다. 불화 폴리머병에 보관하면 표준원액의 보존기간까지 안전하다.

5.10  검량선용 수은 표준용액: 수은 표준용액을 초순수로 100배, 10,000배 희석하고 염화브롬 용액을 부피 비율로 0.5 %만큼 첨가한다 (5 mL/L). 이 용액은 10 ng/mL 및 0.1 ng/mL가 되며, 10 ng/mL 용액을 초순수로 희석하여 5 ng/L까지 만들면 된다. 이때에도 염화브롬 용액을 부피 비율로 0.5 %가 되게끔 첨가한다. 검량선용 표준용액은 분석할 때마다 새롭게 만든다.

5.11  질소 및 아르곤 가스: 질소 및 아르곤 가스는 고순도(99.999 % 이상)를 사용하며 금이 코팅된 모래 트랩을 사용하여 수은을 정제하여 사용한다.

6. 시료의 채취 및 보관

시료 채취, 탈장, 보관 및 시료 준비는 제4장 제5항 구리의 5. 시료의 채취 및 보관과정을 따른다.

7. 시험방법

7.1  100 mL 테프론 비이커에 분말화한 생물체 시료 0.2 ∼ 0.4 g을 넣고 0.001 g까지 무게를 측정한다. 테플론 용기를 세척 후 열을 가해 건조시킬 경우, 정전기로 인하여 생물체 시료 분말이 흩어질 수 있는데, 이때는 정전기 제거 장치를 통하여 무게를 측정한다. 공시료 3개, 생물체 표준물질 3개도 함께 준비한다.

7.2  질산/황산 혼합 용액 10 mL를 일회용 피펫으로 첨가한다. 

7.3  비이커에 테플론 시계접시를 덮고 상온에서 4시간 방치한 후, 발생한 가스를 날려보내고 시계접시를 다시 덮어 가열판에 올린다. 가열판 표면 온도를 150 °C로 맞추고, 온도는 1시간에 걸쳐 서서히 올려 급격한 거품이 일어나지 않도록 주의하며 유기물을 충분히 산화시킬 수 있도록 2 ∼ 3시간 동안 가온· 환류시킨다.

7.4  산분해가 끝나면 냉각시킨 다음, 시료 전체를 60 mL 원심분리관에 옮기고 무게를 측정한 다음, 초순수를 사용하여 무게 50 g에 맞춘다.

7.5  3,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 60 mL 폴리에틸렌 병에 옮긴다. 

7.6  생물체 산분해용액 분석 준비

7.6.1  시료 분석 24시간 전에 산분해용액 10 mL를 60 mL 원심분리관에 넣고 초순수 40 mL를 첨가한 후 염화브롬용액 0.5 mL를 첨가하여 노란색이 나타나도록 한다.

7.6.2  만약 노란색이 지속되지 않으면 염화브롬용액 0.5 mL를 추가로 첨가한다.

7.6.3   매질첨가 및 매질첨가 반복시료를 제조한다.

7.6.4  염화브롬용액으로 산화시킨 시료에 하이드록실아민 염화수소용액 0.2 ∼ 0.25 mL를 첨가 후 뚜껑을 닫고 흔들어 노란색이 없어지면 수은 분석 준비가 완료된다.

7.7  수은 분석

7.7.1  본 시험법은 흐름 주입법(flow injection)으로 작성되었으므로 동일 성능 다른 기기의 경우 해당 매뉴얼을 참고한다.

7.7.2  분석 1시간 전에 수은분석기를 가동시킨다.

7.7.3  염화제이주석용액, 초순수를 연속주입장치에 연결하고 유로에 남아있을 수 있는 수은을 제거하며 시약 공시료를 사용하여 자동 시료 주입기를 포함하는 유로를 세척한다.

7.7.4  EPA 1631법에 해당하는 소프트웨어를 작동시킨 후, 검량선부터 작성하고 시료를 분석한다.

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

본 분석법에서는 다음과 같은 정도관리 항목을 포함시키며 필요한 경우, 다른 정도관리 프로그램을 첨가할 수 있다.

8.1  검량선 작성

8.1.1  검량선 작성을 위해 준비된 표준용액을 3번 반복하여 측정하며 표준용액은 검량선 공시료를 포함하여 5개 이상의 농도 구간을 포함 한다.

8.1.2  각 표준용액에 대한 신호세기 평균값에서 검량선 공시료의 평균 신호세기를 뺀다.

8.1.3  각 표준용액 수은 농도에 해당되는 보정된 신호세기를 이용하여 검량선을 최소자승법으로 작성하고 검량선의 기울기, Y-절편 및 결정계수 값을 기록한다.

8.1.4  검량선 인자(Calibration Factor)를 계산하여 검량선의 이용 여부를 판단한다.

         (식 1)

8.1.5  CF 값의 평균과 표준편차를 구하여 상대표준편차가 15 % 이내이면 검량선을 이용하고 15 %를 벗어나면 검량선을 재작성한다.

8.2  공시료: 시료와 같은 처리(용기, 기구, 시약, 분석 과정)를 하여 제조하고 분석한다. 한 실험구당 최소 3개 이상을 만들고 분석하며 시료 중 수은농도 계산시 반영한다.

8.3  매질첨가 및 매질첨가 반복시료: 시료 전처리 및 분석 방법이 해당 시료의 매질에 문제가 없는지를 확인하기 위하여, 현장시료 개수의 10 %에 해당되는 수만큼의 매질첨가 시료와 매질첨가 반복시료를 만든다. 즉, 20개 시료이면 2개의 매질첨가 시료와 2개의 반복시료를 제조한다.

8.3.1  첨가하는 표준용액의 농도는 측정하는 농도가 50 ng/L가 되게 한다.

8.3.2  회수율은 다음과 같이 계산하고 80 ∼120 % 이내가 되어야 한다.

  (식 2)

8.3.3  매질첨가 반복시료의 경우, 상대오차율을 다음과 같이 계산하며 30 % 이내가 되어야 한다.

           (식 3)

8.4  표준물질 분석: 수은 농도값이 보증된 표준시료를 분석하여 정확도를 평가한다.

9. 결과

9.1  최종 농도계산: 측정농도에 희석배수를 곱하여 수은 농도를 계산한다. 염화브롬용액 및 하이드록실아민 염화수소는 검량선용 표준용액에도 같은 부피로 첨가되므로 결과에 영향을 주지 않는다. 생물체 시료의 수은 농도는 다음 식을 사용한다.

              (식 4)

9.2  정도관리 자료 보고: 위 8항에서 제시한 정도관리 내용을 보고한다. 

9.2.1  검량선의 기울기, Y-절편, 결정계수(R2)

9.2.2  공시료의 평균 농도

9.2.3  표준물질 분석 및 보증 농도

9.2.4  매질첨가 회수율(%) 및 매질첨가 반복시료간 상대오차율

10. 분석절차 흐름도

┌───────────┐                                                  

│시료(0.2 ∼ 0.4 g)    │ 시료를 정확히 취하여 사용                        

└───────────┘                                                  

┌───────────┐                                                  

│테프론 비이커         │                                                  

└───────────┘                                                  

                           ① 질산/황산 혼합용액 10 mL                      

┌───────────┐                                                  

│시계접시로 덮은 후,   │                                                  

│상온에서 4시간 반응   │                                                  

└───────────┘                                                  

                           ② 가스를 날려보낸 후 가열판 온도를 150 °C      

                           까지 서서히 올려 2∼3 시간 동안 반응시킨다.      

┌───────────┐                                                  

│원심분리              │ 3,000 rpm에서 10분                               

└───────────┘                                                  

                           상등액 분리                                      

┌───────────┐                                                  

│폴리에틸렌 병         │                                                  

└───────────┘                                                  

                           상등액 분리                                      

┌───────────┐                                                  

│산분해 용액 10 mL     │ 상온에서 12시간 반응                             

│+                     │                                                  

│40 mL 초순수          │                                                  

│+                     │                                                  

│BrCl (0.02 N) 0.5 mL  │                                                  

│(노랗게 변함)         │                                                  

└───────────┘                                                  

                           NH2OH·.HCl 0.2 ∼ 0.25 mL 첨가하여 노란색이     

                           없어지면 정량용액으로 한다.                      

┌───────────┐                                                  

│정량                  │ 이 용액을 CVAFS로 정량                           

└───────────┘                                                  

그림 1. 총 수은 분석절차 흐름도

11. 참고사항

11.1  진한 질산 및 황산과 염화브롬액을 사용하기 때문에 시약 제조와 시료 처리 시에 피부접촉 또는 흄을 마시지 않도록 각별히 주의해야 한다.

11.2  실험복을 자주 세탁할 것을 권장한다.

11.3  실험 후에는 비누 등을 이용해서 손과 얼굴 등을 씻는다.

11.4  시약에 대한 자세한 안전 지침은 개별 물질의 안전 지침을 따른다.

11.5  실험 중 발생한 유해 폐액과 폐기물은 해당 기관의 지침을 우선으로 한다.

11.6  폐기물 처리는 처리 시설을 갖춘 업체에 위탁한다.

11.7  본 지침서에서 발생하는 폐액의 대부분은 산 폐액이다. 따라서, 산 폐액 전용보관 용기에 폐액을 모으고 산 폐액통은 그늘지고 서늘한 장소에서 보관한다.

11.8  고형수은 분석기를 사용하면 편리하고 정량한계가 매우 낮은 수은 분석이 가능하다.

제15항 유기염소계 농약(Organochlorine  Pesticides,  OCPs)

1. 측정원리 

해양생물 중의 유기염소계 농약(Organochlorine  Pesticides,  OCPs)은 디클로로메탄 혹은 노말-헥산:아세톤(1 : 1) 용액을 사용하여 속실렛 추출법으로 추출·농축한 후, 이 농축액을 실리카겔-알루미나 컬럼을 통과시키고 황 성분을 제거하기 위하여 환원 구리에 농축액을 처리한 다음 전자 포획검출기(Electron Capture Detector, ECD)가 부착된 기체크로마토그래피를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도 

기체크로마토그래피를 이용한, 유기염소계 농약의 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1.5 ng/g(건중량)이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 몇 기기 

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 일반세제로 깨끗이 세척한 후, 다시 유기 성분이 없는 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기 재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 속마개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어플라스크 (pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL와 250 mL 용량

3.1.3  속실렛 추출기: 유리섬유 혹은 텀블러(Tumbler) 사용. 속실렛 추출기로 예비 세정하거나 혹은 450 °C에서 5시간 가열처리하여 사용

3.1.4  냉각기

3.1.5  유리컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브

3.1.8  막자와 막자사발, 시약 스푼, 비등석 

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기 

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소 농축기

3.2.4  저울: 해양생물 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.5  기체크로마토그래피: 표 1과 같은 조건으로 분석이 가능한 기기

표 1. 기체크로마토그래피의 유기염소계농약 분석조건의 예

┌────────────┬───────────────────────┐

│ 검출기                 │전자포획검출기(ECD), 질량분석기(MSD)          │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 컬  럼                 │모세관 컬럼(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm,  │

│                        │길이 30 m)                                    │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 충전제                 │5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane          │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 운반기체               │헬륨(99.999 %)                                │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 운반기체 유속          │1.5 mL/분(등속)                               │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 검출기 기체 및 유속    │질소(99.999 %), 30 mL/분(ECD 사용시)          │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 시료주입구 온도        │250 °C                                       │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 검출기 온도            │320 °C(ECD 사용시)                           │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 오븐 초기온도          │100 °C에서 1분간 유지                        │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 오븐 온도 1차 승온속도 │분당 5 °C로 140 °C까지 승온 후 1분간 유지   │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 오븐 온도 2차 승온속도 │분당 1.5 °C로 250 °C까지 승온 후 1분간 유지 │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 오븐 온도 3차 승온속도 │분당 10 °C                                   │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 오븐 최종온도          │300 °C에서 5분간 유지                        │

├────────────┼───────────────────────┤

│ MS 이온화 전압         │70 eV (MSD 사용시)                            │

├────────────┼───────────────────────┤

│ 모니터링 방법          │SIM(Selected Ion Monitoring) mode(MSD 사용시) │

└────────────┴───────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.1.3  디에틸에테르: 잔류농약 분석용 용매

4.1.4  아세톤: 잔류농약 분석용 용매

4.2  환원구리: 유기원소 분석용 환원구리(60 ∼ 80 메쉬)를 사용하기 전에 적당량의 진한 염산으로 세척하고 메탄올로 씻은 다음 노말-헥산으로 수회 세척한 후 노말-헥산에 보관한다.

4.3  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.4  1　% 함수 알루미나: 컬럼크로마토그래피용 알루미나를 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 99 g을 차광용기에 넣고 실온까지 냉각한다. 차광용기에 유리 피펫을 이용하여 증류수 1 mL를 첨가하고 마개를 막고 충분히 혼합

4.5  5　% 함수 실리카겔: 컬럼크로마토그래피용 실리카겔을 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 95 g을 갈색 삼각플라스크에 달아 실온까지 냉각한다. 실리카겔을 교반하면서 피펫으로 증류수 5 mL를 넣고 마개를 막아 충분히 혼합

4.6  정제수: 증류수 또는 화학분석용 물을 노말-헥산으로 2회 씻어 사용

4.7  표준용액

4.7.1  표준물질(standard, STD): 분석대상 유기염소계농약 표준물질(순도 95 % 이상)을 노말-헥산 용액으로 3개 이상의 서로 다른 농도로 조제하여 검정에 사용한다.

α-BHC; β-BHC; Aldrin; Dieldrin; Endrin; Heptachlor; Heptachlor epoxide; Lindane; o, p’-DDD; p, p’-DDD; p, p’-DDE; o, p’-DDT; p, p’-DDT; Chlordane; Hexachlorobenzene (HCB); Mirex

4.7.2  대체표준물질(surrogate, SU): 유기염소계 농약의 회수 정도를 검정하기 위한 목적으로 Dibromo-octafluoro-biphenyl(DBOFB)을 대체표준물질로 사용하며 노말-헥산 용매에 녹여 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 Tetrachloro-m-xylene(TCMX)을 내부표준물질로 사용하며 그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 퇴적물인증 표준물질은 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 실시되어야 하며 국제원자력기구 해양환경연구소, 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology) 등에서 구매하여 사용한다(예: IAEA-417, IAEA-383, IAEA-408, SRM-1941a, SRM-1944 등).

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  홍합, 굴, 고둥 등의 생물 시료는 채집 즉시 미리 세척한 알루미늄 호일로 두 번 싸고 마지막으로 폴리에틸렌 백에 넣은 후에 아이스박스에 넣고 드라이아이스로 냉동 보관한다. 시료는 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 탈피한 후, 동결건조기를 사용하여 건조시키고 막자사발을 이용하여 분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법 

6.1  함수율 측정

사용될 생물시료 2 g에 대하여 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제2항 함수율의 측정 방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  균질화된 시료 10 g 및 40 g 이상의 무수황산나트륨을 막자사발에 넣어 혼합하고, 30분 정도 상온에 둔 상태로 수분을 완전히 제거하여 시료가 가루 형태가 되도록 한다.

6.2.2 위의 균질화된 시료에 대체표준물질인 DBOFB(Dibromo-octafluoro-biphenyl) 100 ng을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 최종 준비된 시료를 속실렛 추출기 시료는 속실렛 추출기속의 텀블러안에 놓거나, 텀블러가 없으면 추출기 바닥에 유리 섬유를 깔고 시료를 놓고 다시 그 위에 유리 섬유를 막는다.

에 넣는다.

6.2.3  추출기 아래 500 mL 넓적바닥 플라스크에 디클로로메탄 200 mL와 비등석 혹은 작은 유리조각 2개를 넣고 추출기와 냉각기를 연결한 후, 시간당 4 ∼ 6회 추출 용매가 속실렛 추출기를 회전할 수 있도록 플라스크 온도를 조절하고 16시간 동안 추출한다. 추출기와 냉각기 그리고 추출기와 플라스크와의 연결 부분을 점검하여 용매 누출 및  공기 중의 수분이 들어가지 주의 한다.

6.2.4  추출이 완료되었을 때, 추출용매와 속실렛 추출기 및 플라스크를 세척한 디클로로메탄 용매를 혼합하고 회전증발농축기를 이용하여 부피가 2 ∼ 3 mL로 되도록 농축한다.

6.2.5  농축된 플라스크에 노말-헥산을 5 mL를 첨가하여 2분간 흔들어 디클로로메탄과 노말-헥산이 잘 섞이게 한다.

6.3  정제 

6.3.1  해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 유기염소계 농약의 6,3 정제 과정과 동일하게 진행하여 정제한다.

6.3.2  퇴적물과 달리 해양생물은 다량의 지방과 같은 분석 방해물질을 함유하고 있으므로 추가적인 정제 과정이 필요하다. 이 경우, GC 분석에 앞서 HPLC를 이용하여 분석대상 물질이 아닌 기타 방해물질을 제거한다. 분석대상 유기염소계 농약과 DBOFB의 표준물질을 사용하여 HPLC 머무름시간을 측정하여 머무름시간 이전과 이후에 나오는 용출액을 버리고, 유기염소계 농약이 용출되는 시간대의 용액을 받아 다시 회전증발농축기를 사용하여 2 ∼ 3 mL까지 농축한다.

표 2. 유기염소계농약 분석 시료의 추가 정제를 위한 HPLC 운영조건의 예

┌────────────┬──────────────────────┐

│컬럼(Phenomenex)        │phenogelTM 10 μm, 100 A, 250 mm × 22.5 mm│

├────────────┼──────────────────────┤

│컬럼 온도               │40 °C                                      │

├────────────┼──────────────────────┤

│용매                    │디클로로메탄, 7 mL/분                       │

├────────────┼──────────────────────┤

│유기염소계 농약 분획시간│DBOFB 검출시간 부터                         │

└────────────┴──────────────────────┘

6.3.3  회전증발농축기를 이용하여 용출액을 농축한 후 노말-헥산을 다시 첨가하여 용매 치환을 실시한다.

6.3.4  최종 GC 바이알에 시료 부피 1 mL가 되도록 질소농축한 다음, GC 내부표준물질 TCMX를 10 μl(20 ng)을 첨가한 후에 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μL를 GC 시료 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 유기염소계 농약의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간과 비교하여 각각의 성분을 지정하고, 각 피크의 면적을 측정하여 검량선 및 감응계수로부터 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

┌─────────┐                                                  

│해양생물시료 10 g │                                                  

└─────────┘                                                  

                       회수용 검정 표준물질(DBOFB)                      

┌─────────┐                                                  

│추 출             │ 속실렛 추출기 16시간 추출                        

│                  │ (디클로로메탄 또는 아세톤 : 노말-헥산 = 1: 1)    

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│농 축             │                                                  

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│정 제             │ (알루미나-실리카젤-무수황산나트륨)               

│                  │ 1) 100 % 노말-헥산                               

│                  │ 2) 10 % 디클로로메탄 : 90 % 노말-헥산            

│                  │ 3) 15 % 디에틸에테르 : 85 % 노말-헥산            

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│HPLC 정제         │ (추가 정제가 필요한 경우)                        

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│용매치환          │ (추가 정제가 필요한 경우, 노말-헥산)             

└─────────┘                                                  

                       GC 내부 표준물질(TCMX)                           

┌─────────┐                                                  

│GC 분석           │                                                  

└─────────┘                                                  

그림 1. 유기염소계농약 분석절차 흐름도

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 유기염소계 농약의 8. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과 

9.1  농도계산

분석 대상의 각 유기염소계 농약의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                     (식 1)

             RF: 각 유기염소계 농약에 대한 감응계수 

             AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

             IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

             AOCPs: 각 유기염소계 농약에 대한 GC 신호의 면적

             w: 분석에 사용된 해양생물 시료의 양(g) 

             C: 시료 1 g에 들어 있는 유기염소계 농약의 농도(ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각 유기염소계 농약의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다. 

10. 참고사항

10.1  위 6.2항에서 사용되어진 속실렛 추출법 대신 가속용매추출법(Accelerated Solvent Extraction, ASE) 등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 정도평가/정도관리 관련 정확도를 반드시 제시 한다.

10.2  위 4.7.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다.

10.3  방해물질인 황 제거를 위한 구리 사용 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 6.3.4 참고

은 실리카/알루미나 컬럼 단계 이전에 별도의 단계로 실시하여도 무방하다.

10.4  유기염소계 농약을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인이 발생할 수 있다. 

10.4.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.4.2  매질에 의한 방해: 유기용매 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석 결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있으며, 이러한 문제는 기기분석 전에 정제과정을 통하여 제거할 수 있다.

10.4.3  유기염소계 농약은 광분해 혹은 퇴적물 중의 미생물 등에 의해 분해될 우려가 있으므로 미리 세척된 차광용기를 사용 한다.

10.4.4  전자포획검출기를 이용한 분석법에서는 퇴적물 중 황에 의한 방해를 심각하게 받을 수 있으므로 반드시 구리를 이용하여 황을 제거 한다. 

10.5  내부표준물질의 회수율 및 농도 계산시, 사용하는 검량식 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 8.2.1 참고

은 기기분석 사용자에 따라 절편을 추가하거나 지수함수를 사용할 수도 있다.

                      (식 2)

                 (식 3)

                (식 4)

제16항 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,  PAHs)

1. 측정원리

해양생물 중의 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)를 디클로로메탄을 사용하여 속실렛 추출법으로 추출·농축하고, 이 농축액에 남아 있는 지방과 같은 분석방해물질 등을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 제거한 후, 질량분석기(Mass Spectrometer Detector, MSD)가 부착된 기체크로마토그래피를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/Mass Spectrometer)에 의한,  생물 중 각 다환방향족탄화수소(PAHs)의 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 2 ng/g(건중량)이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기 재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 덮개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어플라스크 (pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL, 250 mL 용량

3.1.3  속실렛 추출기: 유리섬유 혹은 텀블러(Tumbler) 사용. 속실렛 추출기로 예비 세정하거나 혹은 450 °C에서 5시간 가열처리하여 사용

3.1.4  냉각기

3.1.5  유리 컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브

3.1.8  막자와 막자사발, 시약 스푼, 비등석

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기 

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소농축기

3.2.4  저울: 퇴적물 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.5  기체크로마토그래피

표 1. 기체크로마토그래피/질량분석기의 PAHs 분석조건의 예

┌────────────┬───────────────────────┐

│  검출기                │ 질량분석기(Mass spectrometer Detector, MSD)  │

├────────────┼───────────────────────┤

│  컬럼                  │ 모세관 컬럼                                  │

│                        │ (내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m) │

├────────────┼───────────────────────┤

│  충전제                │ 5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane         │

├────────────┼───────────────────────┤

│  운반기체              │ 헬륨(99.999 %)                               │

├────────────┼───────────────────────┤

│  운반기체 유속         │ 1.0 mL/분(등속)                              │

├────────────┼───────────────────────┤

│  검출기 기체 및 유속   │ 질소(99.999 %), 30 mL/분                     │

├────────────┼───────────────────────┤

│  시료주입구 온도       │ 300 °C                                      │

├────────────┼───────────────────────┤

│  오븐 초기온도         │ 60 °C에서 2분간 유지                        │

├────────────┼───────────────────────┤

│  오븐 온도 1차 승온속도│ 분당 6 °C로 300 °C까지 승온 후 13분간 유지 │

├────────────┼───────────────────────┤

│  MS 이온화 전압        │ 70 eV                                        │

├────────────┼───────────────────────┤

│  모니터링 방법         │ SIM(Selected Ion Monitoring) mode            │

└────────────┴───────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.1.3  디에틸에테르: 잔류농약 분석용 용매

4.2  구리: 유기원소 분석용 구리 (60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 염산 원액으로 세척한 다음, 흐르는 증류수에 염산을 씻어낸다. 그 후 메탄올로 수회 세척하고 다시 노말-헥산으로 수회 세척하여 노말-헥산 중에 보관 

4.3  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.4  1 % 함수 알루미나: 컬럼크로마토그래피용 알루미나를 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후 99 g을 차광용기에 넣고 실온까지 냉각한다. 차광용기에 유리 피펫을 이용하여 증류수 1 mL를 첨가하고 마개를 막고 충분히 혼합  

4.5  5 % 함수 실리카겔: 컬럼크로마토그래피용 실리카겔을 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 95 g을 갈색 삼각플라스크에 달아 실온까지 냉각한다. 실리카겔을 교반하면서 피펫으로 증류수 5 mL를 넣고 마개를 막아 충분히 혼합 

4.6  정제수: 증류수 또는 화학분석용 물을 노말-헥산으로 2회 씻어 사용

4.7  표준용액

4.7.1  표준물질(standard, STD): 분석대상 PAH 표준물질(순도 95 % 이상)을 노말-헥산 용액으로 3개 이상의 서로 다른 농도로 조제하여 검정에 사용한다.

Naphthalene, Acenaphthylene, Acenaphthene, Fluorene, Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Pyrene, Benzo[a]anthracene, Chrysene, Benzo[b]fluoranthene, Benzo[k]fluoranthene, Benzo[a]pyrene, Indeno[1,2,3-cd]pyrene, Dibenzo[a,h]anthracene, Benzo[ghi]perylene, 2-methylnaphthalene, 1-methylnaphthalene, 2,6-dimethylnaphthalene, 2,3,5-trimethylnaphthalene, Biphenyl, 1-methylphenanthrene, Benzo[e]pyrene, Perylene

4.7.2  대체표준물질(surrogate, SU): 퇴적물 내 PAHs의 회수 정도를 검정하기 위한 목적으로 Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Chrysene-d12, Perylene-d12를 대체표준물질로 사용하며 노말-헥산 용매에 녹여 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체 크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 Terphenyl-d14를 내부표준물질로 사용하며 그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 인증표준물질은 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Environment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology) 등에서 구매하여 사용한다. 예: IAEA-417, IAEA-383, IAEA-408, SRM-1941a, SRM-1944 등

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  생물 시료는 스테인리스 스푼을 사용하여 표층 2 cm를 취해서 250 mL의 차광용기에 담아 즉시 -20 °C 이하로 냉동 보관한다.

5.2  냉동된 상태의 생물 시료는 분석을 위하여 상온에서 해동한 후 시약 스푼으로 균질화하여 사용한다.

6. 시험방법

6.1  함수율 측정

사용될 생물시료 2 g에 대하여 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제2항 함수율의 측정 방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  균질화된 시료 10 g 및 40 g 이상의 무수황산나트륨을 막자사발에 넣어 혼합하고, 30분 정도 상온에 둔 상태로 수분을 완전히 제거하여 가루 형태가 되도록 한다.

6.2.2  위의 균질화된 시료에 대체표준물질(Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10, Chrysene-d12, Perylene-d12) 100 ng을 첨가하여 균일하게 혼합하고 최종 준비된 시료를 속실렛 추출기에 넣는다.

6.2.3  추출기 아래 500 mL 넓적바닥 플라스크에 디클로로메탄 200 mL와 비등석 혹은 작은 유리 조각 2개를 넣고 제15항 유기염소계 농약(6.2.3)에서와 같은 방법으로 추출한다.

6.2.4  추출이 완료되었을 때 추출용매와 속실렛 추출기 및 플라스크를 세척한 디클로로메탄 용매를 혼합하고 회전증발농축기를 이용하여 부피가 2 ∼ 3 mL로 되도록 농축한다.

6.2.5  농축된 플라스크에 노말-헥산을 5 mL를 첨가하여 2분간 흔들어 디클로로메탄과 노말-헥산이 잘 섞이게 한다.

6.3  정제

6.3.1  해양퇴적물공정시험기준 제4장 제22항 다환방향족탄화수소의 6.3 정제과정과 동일하게 진행한다.

6.3.2  퇴적물과 달리 해양생물은 다량의 지방과 같은 분석 방해물질을 함유하고 있으므로 추가적인 정제 과정이 필요하다. 이 경우, GC 분석에 앞서 HPLC를 이용하여 분석대상 물질이 아닌 기타 방해물질을 제거한다. 분석대상 PAHs의 표준물질을 사용하여 HPLC 머무름시간을 측정하여 머무름시간 이전과 이후에 나오는 용출액을 버리고, PAHs가 용출되는 시간대의 용액을 받아 다시 회전증발농축기를 사용하여 2 ∼ 3 mL까지 농축한다.

표 2.  PAHs 분석시료의 추가 정제를 위한 HPLC 운영조건의 예

┌─────────┬─────────────────────────────┐

│ 컬럼(Phenomenex) │ phenogelTM 10 μm, 100 A, 250 mm × 22.5 mm             │

├─────────┼─────────────────────────────┤

│ 컬럼 온도        │ 40 °C                                                   │

├─────────┼─────────────────────────────┤

│ 용매             │ 디클로로메탄, 7 mL/분                                    │

├─────────┼─────────────────────────────┤

│ PAHs 분획시간    │ (DBOFB 검출시간 ? 1분) 부터 (perylene 검출시간 + 1.2분) │

│                  │ 까지                                                     │

└─────────┴─────────────────────────────┘

6.3.3  회전증발농축기를 이용하여 용출액을 농축한 후 노말-헥산을 다시 첨가하여 용매 치환을 실시한다.

6.3.4  최종 GC 바이알에 시료 부피 1 mL가 되도록 질소농축한 다음, GC 내부표준물질 terphenyl-d14를 10 μl(20 ng)을 첨가한 후에 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μL를 GC 시료 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 PAHs의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간을 비교하고, 표 3에 있는 측정 이온값으로 성분을 확인하여 각 성분의 피크 면적을 측정한다.

표 3.  PAHs 분석에 이용한 질량분석기의 정량ㆍ정성 이온값

┌──────────────────────────────────┐

│    24 PAHs                         Target (m/z)  Confirmation (m/z)│

├──────────────────────────────────┤

│ Naphthalene                        128           127               │

│                                                                    │

│ 2-Methyl naphthalene               142           141               │

│                                                                    │

│ 1-Methyl naphthalene               142           141               │

│                                                                    │

│ Biphenyl                           154           152               │

│                                                                    │

│ 2,6-Dimethyl naphthalene           156           154               │

│                                                                    │

│ Acenaphthylene                     152           151               │

│                                                                    │

│ Acenaphthene                       154           153, 152          │

│                                                                    │

│ 2,3,5-Trimethyl naphthalene        170                             │

│                                                                    │

│ Fluorene                           166           164               │

│                                                                    │

│ Phenanthrene                       178           176               │

│                                                                    │

│ Anthracene                         178           176               │

│                                                                    │

│ 1-Methylphenanthrene               192           191               │

│                                                                    │

│ Fluoranthene                       202           101               │

│                                                                    │

│ Pyrene                             202           101               │

│                                                                    │

│ Benz[a]anthracene                  228           226               │

│                                                                    │

│ Chrysene                           228           226               │

│                                                                    │

│ Benzo[b]fluoranthene               252           250               │

│                                                                    │

│ Benzo[k]fluoranthene               252           250               │

│                                                                    │

│ Benzo[e]pyrene                     252           250               │

│                                                                    │

│ Benzo[a]pyrene                     252           250               │

│                                                                    │

│ Perylene                           252           250               │

│                                                                    │

│ Indeno[1,2,3-cd]pyrene             276           138               │

│                                                                    │

│ Dibenz[a,h]anthracene              278           139               │

│                                                                    │

│ Benzo[ghi]perylene                 276           138               │

├──────────────────────────────────┤

│  Surrogate standard(대체표준물질)  Target (m/z)  Confirmation (m/z)│

├──────────────────────────────────┤

│ Naphthalene-d8                     136                             │

│                                                                    │

│ Acenaphthene-d10                   164           162               │

│                                                                    │

│ Phenanthrene-d10                   188                             │

│                                                                    │

│ Terphenyl-d14                      244                             │

│                                                                    │

│ Chrysene-d12                       240                             │

│                                                                    │

│ Perylene-d12                       264                             │

└──────────────────────────────────┘

6.4.3  개별 PAHs의 감응계수를 이용하여 해양생물 시료 중 각 PAHs 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

┌─────────┐                                                        

│해양생물시료 10 g │                                                        

└─────────┘                                                        

                       회수용 검정표준물질                                    

                       (Naphthalene-d8, Acenaphthene-d10, Phenanthrene-d10,   

                       Chrysene-d12, Perylene-d12)                            

┌─────────┐                                                        

│추 출             │ (속실렛 추출법; 디클로로메탄, 16시간 추출)             

└─────────┘                                                        

┌─────────┐                                                        

│농 축             │                                                        

└─────────┘                                                        

┌─────────┐                                                        

│정 제             │ (알루미나-실리카젤-무수황산나트륨)                     

│                  │ 1) 100 % 노말-헥산                                     

│                  │ 2) 10 % 디클로로메탄 : 90 % 노말-헥산                  

│                  │ 3) 15 % 디에틸에테르 : 85 % 노말-헥산                  

└─────────┘                                                        

┌─────────┐                                                        

│HPLC 정제         │ (추가 정제가 필요한 경우)                              

└─────────┘                                                        

┌─────────┐                                                        

│용매치환          │ (추가 정제가 필요한 경우; 노말-헥산)                   

└─────────┘                                                        

                       GC 내부표준물질(Terphenyl-d14)                         

┌─────────┐                                                        

│GC 분석           │                                                        

└─────────┘                                                        

그림 1.  PAHs 분석절차 흐름도

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 유기염소계 농약의 8. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과

9.1  농도계산

분석 대상의 각 PAHs의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                          (식 1)

RF: 각 PAH 표준물질에 대한 감응계수 

AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

APAHs: 각 유기염소계 농약에 대한 GC 신호의 면적

w: 분석에 사용된 해양생물 시료의 양(g) 

C: 생물 시료 1 g에 들어 있는 PAHs의 농도(ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각 PAH의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  위 6.2항에서 사용되어진 속실렛 추출법 대신 가속용매추출법(Accelerated Solvent Extraction, ASE) 등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 정도평가/정도관리 관련 정확도를 반드시 제시 한다.

10.2  위 4.7.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다.

10.3  PAHs 성분을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인 발생할 수 있다.

10.3.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.3.2  매질에 의한 방해: 유기용매 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있으며, 이러한 문제는 기기분석 전에 정제과정을 통하여 제거할 수 있다.

10.3.3  PAHs는 광분해 혹은 퇴적물 중의 미생물 등에 의해 분해될 우려가 있으므로 미리 세척된 차광용기를 사용 한다.

제17항 폴리클로리네이티드비페닐(Polychlorinated Biphenyls,  PCBs) 

1. 측정원리

해양생물 중의 Polychlorinated Biphenyls(PCBs)는 디클로로메탄을 사용하여 속실렛 추출법으로 추출, 농축한 후 이 농축액에 남아 있는 지방과 같은 분석방해물질을 제거하기 위하여 컬럼크로마토그래피를 통과시킨 다음 전자포획검출기(Electron Capture Detector, ECD) 또는 질량분석기(Mass Spectrometer Detector, MSD)가 부착된 기체크로마토그래피를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피를 이용한 총 PCBs의 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1.0 ng/g(건중량)이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며, 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기 재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 덮개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어플라스크 (pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL, 250 mL 용량

3.1.3  속실렛 추출기: 유리섬유 혹은 텀블러(Tumbler) 사용. 속실렛 추출기로 예비 세정하거나 혹은 450 °C에서 5시간 가열처리하여 사용

3.1.4  냉각기

3.1.5  유리 컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.6  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.7  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브

3.1.8  막자와 막자사발, 시약 스푼, 비등석

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소농축기

3.2.4  저울: 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.5  기체크로마토그래피: GC-ECD 혹은 GC-MSD

표 1. 기체크로마토그래피의 PCBs 분석조건의 예

┌────────────┬────────────────────────────┐

│  검출기                │ 전자포획검출기(ECD) 혹은 질량분석기(MSD)               │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  컬럼                  │ 모세관 컬럼(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)│

├────────────┼────────────────────────────┤

│  충전제                │ 5 % phenyl, 95 % methyl polysiloxane                   │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  운반기체              │ 헬륨(99.999 %)                                         │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  운반기체 유속         │ 1.5 mL/분(등속)                                        │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  검출기 기체 및 유속   │ 질소(99.999 %), 30 mL/분 (ECD 사용시)                  │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  시료주입구 온도       │ 250 °C                                                │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  검출기 온도           │ 320 °C (ECD 사용시)                                   │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  오븐 초기온도         │ 100 °C에서 1분간 유지                                 │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  오븐 온도 1차 승온속도│ 분당 5 °C로 140 °C까지 승온 후 1분간 유지            │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  오븐 온도 2차 승온속도│ 분당 1.5 °C로 250 °C까지 승온 후 1분간 유지          │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  오븐 온도 3차 승온속도│ 분당 10 °C                                            │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  오븐 최종온도         │ 300 °C에서 5분간 유지                                 │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  MS 이온화 전압        │ 70 eV (MSD 사용시)                                     │

├────────────┼────────────────────────────┤

│  모니터링 방법         │ SIM(Selected Ion Monitoring) mode, (MSD 사용시)        │

└────────────┴────────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질 

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.2  구리: 유기원소 분석용 구리 (60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 염산 원액으로 세척한 다음, 흐르는 증류수에 염산을 씻어낸다. 그 후 메탄올로 수회 세척하고 다시 노말-헥산으로 수회 세척하여 노말-헥산 중에 보관 

4.3  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.4  1 % 함수 알루미나: 컬럼크로마토그래피용 알루미나를 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후 99 g을 차광용기에 넣고 실온까지 냉각한다. 차광용기에 유리 피펫을 이용하여 증류수 1 mL를 첨가하고 마개를 막고 충분히 혼합

4.5  5 % 함수 실리카겔: 컬럼크로마토그래피용 실리카겔을 130 °C에서 15시간 가열하여 활성화시킨 후, 95 g을 갈색 삼각플라스크에 달아 실온까지 냉각한다. 실리카겔을 교반하면서 피펫으로 증류수 5 mL를 넣고 마개를 막아 충분히 혼합

4.6  정제수: 증류수 또는 화학분석용 물을 노말-헥산으로 2회 씻어 사용

4.7  표준용액

4.7.1  표준용액(standard solution, STD): 분석하고자 하는 22종의 고순도의 PCBs를 말하며 각 PCBs에 대한 검량선 작성에 사용된다.

PCB8, PCB18, PCB28, PCB29, PCB44, PCB52, PCB66, PCB87, PCB101, PCB105, PCB110, PCB 118, PCB128, PCB138, PCB153, PCB170, PCB 180, PCB187, PCB195, PCB200, PCB206, PCB209 

검량선 작성을 위하여 22종 PCBs가 들어 있는 혼합 표준용액을 3개 이상의 서로 다른 농도로 만든다.

4.7.2  대체표준물질(surrogate, SU): 시료로부터 분석대상인 PCBs의 회수 정도를 검정하기 위하여 사용된다. 3종류의 내부표준물질 [DBOFB (Dibromooctaflurobiphenyl), PCB103, PCB198]이 사용되며 노말-헥산 용매에 녹여 각각의 농도가 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 Tetrachloro-m-xylene(TCMX)가 내부표준물질로 사용되며그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다.

4.7.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 퇴적물인증 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Environment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC(National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다(예: IAEA-417, NIST1941a, NIST1944, DX-3, EC-4 등).

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  생물 시료는 차광용기에 담아 즉시 -20 °C 이하로 냉동 보관한다.

5.2  냉동된 상태의 생물 시료는 분석을 위하여 상온에서 해동한 후 균질화하여 사용한다.

6. 시험방법

6.1  함수율 측정

사용될 생물시료 2 g에 대하여 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제2항 함수율의 측정 방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  균질화된 시료 10 g 및 40 g 이상의 무수황산나트륨을 막자사발에 넣어 혼합하고, 30분 정도 상온에 둔 상태로 수분을 완전히 제거하여 가루 형태가 되도록 한다.

6.2.2  위의 균질화된 시료에 대체표준물질(DBOFB, PCB103, PCB198)을 각각 0.5  mL(100 ng)씩 첨가하여 균일하게 혼합하고 최종 준비된 시료를 속실렛 추출기에 넣는다.

6.2.3  추출기 아래 500 mL 넓적바닥 플라스크에 디클로로메탄 200 mL와 비등석 혹은 작은 유리 조각 2개를 넣고 제15항 유기염소계 농약(6.2.3)에서와 같은 방법으로 추출한다.

6.2.4  추출이 완료되었을 때 추출용매와 속실렛 추출기 및 플라스크를 세척한 디클로로메탄 용매를 혼합하고 회전증발농축기를 이용하여 부피가 2 ∼ 3 mL로 되도록 농축한다.

6.2.5  농축된 플라스크에 노말-헥산을 5 mL를 첨가하여 2분간 흔들어 디클로로메탄과 노말-헥산이 잘 섞이게 한다.

6.3  정제

6.3.1  해양퇴적물공정시험기준 제4장 제23항 폴리클로리네이티드비페닐의 6.3 정제과정과 동일하게 진행한다.

6.3.2  퇴적물과 달리 해양생물은 다량의 지방과 같은 분석 방해물질을 함유하고 있으므로 추가적인 정제 과정이 필요하다. 이 경우, GC 분석에 앞서 HPLC를 이용하여 분석대상 물질이 아닌 기타 방해물질을 제거한다. 분석대상 PCB와 DBOFB의 표준물질을 사용하여 HPLC 머무름시간을 측정하여 머무름시간 이전과 이후에 나오는 용출액을 버리고, PCB가 용출되는 시간대의 용액을 받아 다시 회전증발농축기를 사용하여 2 ∼ 3 mL까지 농축한다.

표 2.  PCB 분석시료의 추가 정제를 위한 HPLC 운영조건의 예

┌─────────┬───────────────────────┐

│ 컬럼(Phenomenex) │ phenogelTM 10 μm, 100 A, 250 mm × 22.5 mm │

├─────────┼───────────────────────┤

│ 컬럼 온도        │ 40 °C                                       │

├─────────┼───────────────────────┤

│ 용매             │ 디클로로메탄, 7 mL/분                        │

├─────────┼───────────────────────┤

│ PCB 분획시간     │ DBOFB 검출시간 부터                          │

└─────────┴───────────────────────┘

6.3.3  회전증발농축기를 이용하여 용출액을 농축한 후 노말-헥산을 다시 첨가하여 용매 치환을 실시한다.

6.3.4  최종 GC 바이알에 시료 부피 1 mL가 되도록 질소농축한 다음, GC 내부표준물질 TCMX를 10 μl(20 ng)을 첨가한 후에 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μL를 GC 시료 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 PCB의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간(GC-ECD)을 비교하거나 표준물질의 측정이온값(GC-MSD)으로 성분을 확인하고 각 성분의 피크 면적을 측정한다.

6.4.3  PCBs 표준물질의 감응계수를 사용하여 해양생물 시료 중 각 PCBs 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

┌────────┐                                              

│해양생물시료 10g│                                              

└────────┘                                              

                     회수용 검정표준물질(DBOFP, PCB103, PCB198)   

┌────────┐                                              

│추 출           │ (속실렛 추출법: 디클로로메탄, 16시간 추출)   

└────────┘                                              

┌────────┐                                              

│농 축           │                                              

└────────┘                                              

┌────────┐                                              

│정 제           │ (알루미나-실리카젤-무수황산나트륨)           

│                │  100 % 노말-헥산                             

└────────┘                                              

┌────────┐                                              

│HPLC 정제       │ (추가 정제가 필요한 경우)                    

└────────┘                                              

┌────────┐                                              

│용매 치환       │ (추가 정제가 필요한 경우; 노말-헥산)         

└────────┘                                              

                     GC 내부표준물질(TCMX)                        

┌────────┐                                              

│GC 분석         │                                              

└────────┘                                              

그림 1.  PCBs 분석절차 흐름도 

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 유기염소계 농약의 8. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과 

9.1  농도계산

분석대상의 각 PCBs의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                        (식 1)

RF: 각 PCB 표준물질에 대한 감응계수 

AIS : GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS : GC 내부표준물질에 대한 양 (ng)

APCBs : 각 PCBs에 대한 GC 신호의 면적

w: 분석에 사용된 해양생물 시료의 양 (g) 

C: 해양생물 시료 1 g에 들어 있는 PCBs의 농도 (ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어있는 각 PCBs의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검량선의 상관계수(r2), 검출한계, 정확도, 정밀도를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  위 6.2항에서 사용되어진 속실렛 추출법 대신 가속용매추출법(Accelerated Solvent Extraction, ASE) 등의 기타 장비를 이용하여도 무방하나, 추출효율을 검정하기 위해 정도평가/정도관리 관련 정확도를 반드시 제시 한다.

10.2  위 4.7.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다. 전자포획검출기 대신 질량분석검출기를 사용할 경우, 13C로 표지된 PCB 동족체(congener)를 사용할 수 있다.

10.3  PCB 성분을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인 발생할 수 있다.

10.3.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.3.2  매질에 의한 방해: 유기용매 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있으며, 이러한 문제는 기기분석 전에 정제과정을 통하여 제거할 수 있다.

제18항 유기주석화합물(Butyltins,  BTs)

1. 측정원리

해양생물 중의 BTs(butyltins)은 0.1 % 트로폴론이 함유된 디클로로메탄으로 추출하고 프로필마그네슘 브로마이드(propylmagnesium bromide)를 가하여 그리그나드 (Grignard)반응으로 유도체를 만든 후, 플로리실 컬럼으로 정제하고 불꽃광도검출기(Flame Photometric Detector, FPD) 또는 질량분석기(Mass Spectrometer Detector, MSD)가 부착된 기체 크로마토그래피로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피를 이용한 유기주석화합물의 기기검출한계는 95 % 신뢰구간에서 5 ng/g 미만이며, 정밀도는 반복추출시험시 표준편차율 8 % 미만이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척한 후 다시 증류수로 잘 세척한 다음 건조기에서 건조하여 보관하며, 사용 전에는 디클로로메탄 용매로 세척한 후 사용한다.

3.1.1  시료용기: 250 mL 입구가 넓은 차광 유기재질을 사용하며, 뚜껑 안에 테프론 덮개가 있는 것을 사용

3.1.2  페어플라스크 (pear-type flask) 혹은 넓적바닥 플라스크: 회전증발기에 사용되는 100 mL, 250 mL 용량

3.1.3  원심분리관: 50 mL 용량으로 시료 추출을 위해 사용

3.1.4  유리 컬럼: 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 경질 유리관으로 하부에는 테프론 재질의 스톱콕이, 상부에는 250 mL 용기가 부착된 것을 사용

3.1.5  차광 바이알: 가스크로마토그래피 분석에 사용되는 2 mL 바이알

3.1.6  유리깔때기, 파스테르 피펫, 실리콘 벌브

3.1.7  막자와 막자사발, 시약 스푼, 비등석

3.2  기기

3.2.1  회화로: 550 °C까지 온도조절이 가능한 기기

3.2.2  회전증발농축기: 진공상태 조절과 온도조절이 가능한 기기

3.2.3  질소농축기

3.2.4  와류혼합기(vortex mixer): 시험관의 세척 혹은 시료와 대체표준물질을 균질화시킬 때 사용

3.2.5  원심분리기: 4,000 rpm에서 사용 가능하고 15 mL 및 50 mL 원심분리관 사용이 가능한 기기

3.2.6  저울: 퇴적물 시료의 무게를 측정하기 위하여 사용

3.2.7  기체크로마토그래피

표 1. 기체크로마토그래피의 유기주석화합물 분석조건의 예 

┌────────┬─────────────────────────────┐

│ 검출기         │불꽃광도검출기(Flame Photometric Detector, FPD)_주석 필터 │

│                │부착, 혹은 질량분석기(MSD)                                │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 컬럼           │모세관 컬럼(내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)   │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 충전제         │100 % methyl polysiloxane                                 │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 운반기체       │헬륨(99.999 %)                                            │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 운반기체 유속  │1.5 mL/분(등속)                                           │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 검출기 기체    │수소(99.999 %), 공기(99,999 %) (MSD 사용시)               │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 시료주입구 온도│225 °C                                                   │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 검출기 온도    │250 °C (MSD 사용시)                                      │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 오븐 초기온도  │50 °C에서 5분간 유지                                     │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 오븐 승온속도  │분당 20 °C로 240 °C까지 승온 후 10 분간 유지            │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ MS 이온화 전압 │70 eV (MSD 사용시)                                        │

├────────┼─────────────────────────────┤

│ 모니터링 방법  │SIM(Selected Ion Monitoring) mode (MSD 사용시)            │

└────────┴─────────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매

4.1.1  디클로로메탄: 잔류농약 분석용 용매

4.1.2  노말-헥산: 잔류농약 분석용 용매

4.2  0.1 % 트로폴론(tropolone, C7H6O2) 용액: 트로폴론 1 g을 1 L의 디클로로메탄에 녹여 만들고, 유리 차광용기에 보관하여 사용

4.3  1 M 프로필마그네슘 브로마이드(propylmagnesium bromide)용액: 상용의 1 M 프로필마그네슘 브로마이드 용액으로 반드시 냉장 보관하여 사용

4.4  50 % 염산 용액: 부피비로 염산과 초순수를 1 : 1로 만들어 유리 차광용기에 넣어 보관하여 사용

4.5  0.4 N 황산 용액: 황산 12 mL를 초순수로 1 L로 정용하여 유리용기에 넣어 보관하여 사용

4.6  무수황산나트륨: 450 °C 회화로에서 4 ∼ 5시간 가열 후 180 °C에서 보관

4.7  플로리실: 80 ∼ 100 mesh 플로리실(florisil)을 450 °C에서 4시간 이상 활성화시킨 후 120 °C 건조기에 보관하고, 컬럼을 만들기 직전에 꺼내 상온으로 식힌 후 사용

4.8  표준용액

4.8.1  표준용액(standard solution, STD): 분석하고자 하는 트리부틸틴 클로라이드(tributyltin chloride, C12H27Sn+Cl-), 디부틸틴 클로라이드(dibutyltin chloride, C8H19Sn+Cl-), 모노부틸틴 클로라이드 (monobutyltin chloride, C4H11Sn+Cl-) 각각 10 mg을 노말-헥산 100 mL에 녹인 후 이 용액을 다시 노말-헥산으로 100배 희석시켜 최종농도 1 ppm의 표준용액을 만든다. 이 표준용액을 냉동 보관하여 사용하며 유효 기간은 3개월이다.

4.8.2  대체표준물질(surrogate, SU): 해수 시료로부터 분석대상인 BT의 추출과정 및 시험과정에서의 회수율을 검정하기 위하여 대체표준물질인 트리펜틸틴 클로라이드(tripentyltin chloride, C15H33Sn+Cl-)을 200 ng/mL 농도로 만든다. 이 표준용액을 냉동보관하여 사용하며 유효 기간은 3개월이다.

4.8.3  GC 내부표준물질(internal standard, IS): 기체크로마토그래피 기기의 감도를 보정하기 위한 목적으로 테트라부틸틴(tetrabuytltin, C16H36Sn)을 내부표준물질로 사용하여 그 농도는 200 ng/mL가 되도록 한다. 이 표준용액을 냉동보관하여 사용하며 유효 기간은 3개월이다.

4.8.4  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 퇴적물 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Environment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC(National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다. (예: PACS-1, BCR462, BCR646 등)

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  현장에서 채취된 생물 시료는 유리용기에 담아 -20 °C 암소에 보관한다.

5.2  시료는 화학분석 전 4 °C 이하의 암소에서 해동시켜 분석에 이용한다.

6. 시험방법

6.1  함수율 측정

사용될 생물시료 2 g에 대하여 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제2항 함수율의 측정 방법으로 측정한다.

6.2  추출 및 농축

6.2.1  냉동된 시료를 동결건조 시킨 후 패각을 포함한 이물질을 제거한 다음, 막자사발을 이용하여 균일하게 분쇄하고 체질(120 μm mesh)한다.

6.2.2  균질화된 생물시료 5 g을 원심분리관에 넣고 대체표준물질인 트리펜틸주석 클로라이드(tripentyltin chloride) 100 ng을 퇴적물에 섞어 준다.

6.2.3  시료가 담긴 원심분리관에 50 % 염산 용액 10 mL를 첨가하고 잘 섞은 후 30분간 방치한다.

6.2.4  시료가 담긴 원심분리관에 0.1 % 트로폴론이 함유된 디클로로메탄 20 mL를 가하고 와류혼합기로 섞은 후에 교반기를 사용하여 3시간 동안 교반하여 추출한다.

6.2.5  교반이 끝난 원심분리관을 원심분리기에 넣고 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한다.

6.2.6  유기용매층 4 mL를 분취하여 부피 0.5 mL가 되도록 질소농축한 다음, 노말-헥산을 반복적으로 첨가· 농축하여 용매를 노말-헥산으로 치환한다.

6.3  유도체화 반응

6.3.1  농축액에 1 M 헥실마그네슘 브로마이드 0.5 mL를 가해 30초간 교반 후 30분간 35 °C의 항온 수조에서 유도체화한다.

6.3.2  반응 종료 후 0.4 N 황산 용액 4 mL를 가하여 중화시킨 후, 30초간 교반하여 유기용매층을 분취한다.

6.3.3  남은 층에 다시 노말-헥산 5 mL을 가하여 10분간 진탕해서 앞에서 얻어진 유기층과 합친 후 플로리실 컬럼을 통과시켜 정제한다.

6.3.4  컬럼을 세척하기 위하여 추가로 노말-헥산 10 mL을 컬럼에 통과시킨 후, 얻어진 용출액은 고순도 질소 가스로 농축하여 측정용 시료의 부피가 1 mL가 되도록 하며 GC 내부표준물질 테트라부틸틴(tetrabutyltin) 20 ng을 첨가하여 GC 분석용 시료로 준비 완료한다.

6.4  기체크로마토그래피 분석

6.4.1  표 1의 기체크로마토그래피 조건하에서 측정용 시료 2 μL를 기체크로마토크래피의 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 BTs 표준물질 유도체의 머무름시간을 비교하여 성분을 확인하고 각 성분의 피크 면적을 측정한다.

6.4.3  BTs 표준물질 유도체에 대하여 농도별 관계식을 사용하여 시료 중 각 성분의 농도를 계산한다.

7. 분석절차 흐름도

┌─────────┐                                                  

│해양생물 시료 5 g │                                                  

└─────────┘                                                  

                       회수용 검정표준물질(tripentyltin chloride)       

┌─────────┐                                                  

│추 출             │ ① 50 % 염산용액 10 mL 첨가 후 30분간 방치       

│                  │ ② 교반기; 0.1 % 트로폴론-디클로로메탄, 3시간    

│                  │    추 출                                         

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│원심분리          │ ③ 4,000 rpm, 10분                               

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│용매치환          │ ④ 0.1 % 트로폴론-디클로로메탄 → 노말-헥산      

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│유도체화 반응     │ ⑤ 1 M 헥실마그네슘 브로마이드 0.5 mL 첨가 후,   

│                  │    35 °C 30분간 유도체화                        

│                  │ ⑥ 0.4 N 황산 용액 4 mL 중화                     

└─────────┘                                                  

┌─────────┐                                                  

│정 제             │ ⑦ 유기용매층 플로리실컬럼 통과                  

└─────────┘                                                  

                       GC 내부표준물질(tetrabutyltin)                   

┌─────────┐                                                  

│GC 분석           │                                                  

└─────────┘                                                  

그림 1. 유기주석화합물 분석절차 흐름도

8. 정도평가/정도관리 (QA/QC)

해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 유기염소계 농약의 8. 정도평가/정도관리를 따른다.

9. 결과 

9.1  농도계산

분석대상의 각 BTs의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                       (식 1)

RF: 각 BT 표준물질에 대한 감응계수 

AIS: GC 내부표준물질에 대한 GC 신호의 면적

IIS: GC 내부표준물질에 대한 양(ng)

ABTs : 각 BTs에 대한 GC 신호의 면적

w: 분석에 사용된 해양생물 시료의 양(g) 

C: 해양생물 시료 1 g에 들어 있는 BTs의 농도(ng/g)

9.2  결과보고

시료에 들어 있는 각 BT의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 상관계수(r2)를 제시한다.

10. 참고사항

10.1  위 4.8.3항에 사용되어진 내부표준물질 대신 분석되어지는 표준물질과 피크가 겹치지 않고 시료 중에 존재하지 않는 다른 화합물을 내부표준물질로 사용하여도 무방하다. 대신 질량분석검출기를 사용할 경우 2H로 표지된 유기주석화합물을 사용할 수 있다.

10.2  불꽃광도검출기의 경우 황에 의한 간섭이 없으나, 질량분석검출기를 사용할 경우 구리 등을 사용하여 방해물질인 황을 제거 한다.

10.3  유기주석화합물을 분석할 경우, 다음과 같은 분석 방해요인이 발생할 수 있다.

10.3.1  실험방법상 방해: 사용되는 유기용매 혹은 시약의 순도, 초자기구의 이물질에 의해 방해받을 수 있다.

10.3.2  매질에 의한 방해: 용매추출 추출시에, 함께 추출된 원치 않는 물질에 의해 분석결과의 정확성이나 재현성이 저하될 수 있다. 또한, 황에 의한 방해를 받을 수 있으나 이는 GC-FPD(불꽃광도검출기)분석 전 구리 처리와 같은 정제과정을 통하여 방해 요소를 제거할 수 있다.

10.3.3  유기주석화합물은 광분해되거나 생분해될 우려가 있으므로 되도록 차광용기를 사용하여 빠른 시간 내에 분석을 하도록 한다.

제19항 폴리브롬화 디페닐에테르       (Polybrominated Diphenyl Ethers, PBDEs)

1. 측정원리

속실렛 추출법을 이용하여 해양생물 중의 폴리브롬화 디페닐에테르(Polybrominated Diphenyl Ethers, PBDEs)를 추출한다. 이후, 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 황 등의 분석 방해물질을 제거하고 기체크로마토그래피-질량분석기(Gas chromatography/Mass Spectrometer, GC/MS)의 전자포획 화학음이온화(Electron Capture Negative Ionization, ECNI) 방식에 의한 선택적 이온모니터링(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법 검출한계(Method detection limit, MDL)를 표 1에 나타내었다.

표 1.  PBDEs의 분석방법 검출한계(MDL)

──────────────────┬─────────────

  성   분                           │분석방법 검출한계 (ng/g)  

──────────────────┼─────────────

  T3BDE, T4BDE, P5BDE, H6BDE, H7BDE │0.07                      

──────────────────┼─────────────

  O8BDE, N9BDE                      │0.33                      

──────────────────┼─────────────

  D10BDE                            │3.33                      

──────────────────┴─────────────

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 폴리브롬화디페닐에테르의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용전 확인시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다.

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹군 다음, 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시킨다. 사용하기 전에 아세톤으로 닦아 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  고상추출장치: GF/F 필터지, SPE 카트리지(Envi-Disk 및 동급 이상), 여과 장치, 진공펌프

3.1.2  속실렛 추출장치: 냉각장치, 사이폰, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.3  250, 500 mL 갈색 유리병

3.1.4  250, 500 mL 가지형 플라스크

3.1.5  1 ∼ 2 mL 유리바이알

3.1.6  10 mL 시험관

3.1.7  액체컬럼크로마토관: 다층실리카겔 컬럼용 (길이 300 mm, 내경 20 mm)의 유리제 컬럼크로마토관

3.1.8  탈지면: 노말-헥산 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  농축장치

3.2.1  회전증발농축기(Rotary Evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정 온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인장치(Aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환장치(Cooling Circulator)

3.3  기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/Mass Spectrometer, GC/MS)

3.3.1  컬럼오븐

컬럼오븐의 온도 제어범위가 50 ∼ 350 °C이고, 측정 대상 물질의 최적 분리조건을 설정ㆍ제어가 가능하도록 승온 프로그래밍이 가능한 것을 사용한다.3.3.2  모세관 컬럼

3.3.1  모세관 컬럼

폴리브롬화디페닐에테르 분석을 위한 캐피러리 컬럼으로 분리가 양호한 극성 컬럼의 사용을 원칙으로 한다. 길이 15 m, 내경 0.25 mm, 막두께 0.1 μm 또는 이와 동등한 컬럼으로 분석 목적에 따라 알맞게 선정한다.

3.3.3  질량분석기(MS)

3.3.3.1  이온원은 온도를 160 ∼ 300 °C로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.3.3.2  전자포획 음이온화법(Electron Capture Negative Ionization, ECNI법)이 가능한 것을 사용한다.

3.3.3.3  선택이온검출법(Selected Ion Monitoring: 이후 SIM법)이 가능하고, 필요한 측정 질량수의 채널 수와 감도의 관계를 고려하여 SIM법의 주기를 최대 1초 이하로 가능한 것을 사용한다.

3.3.4  시료도입부: splitless 등 시료의 전량을 분리 컬럼 내에 도입 가능한 것.

3.3.5  운반기체: 고순도 헬륨(순도 99.999 % 이상)

3.3.6  시약기체: 고순도 메탄(순도 99.95 % 이상)

표 2.  PBDEs 분석을 위한 GC/MS-ECNI 분석조건의 예

┌─────────────────────────────────────────┐

│기체크로마토그래피 조건                                                           │

├──────┬──────────────────────────────────┤

│컬럼        │ 용융 실리카겔 모세관 컬럼                                          │

│            │ 내경 0.25 mm, 필름두께 0.1 μm, 길이 15 m                          │

├──────┼──────────────────────────────────┤

│컬럼 온도   │ 70 °C(1.5분) → 200 °C(20 °C/분, 3분) → 310 °C(5 °C/분, 5분) │

├──────┼──────────────────────────────────┤

│주입구 온도 │ 280 °C                                                            │

├──────┼──────────────────────────────────┤

│주입 방법   │ splitless (split 유지 시간: 60 ∼ 90초)                            │

├──────┴──────────────────────────────────┤

│질량분석기 조건                                                                   │

├──────┬──────────────────────────────────┤

│이온화 방법 │ 전자포획 화학음이온화(ECNI)법                                      │

├──────┼──────────────────────────────────┤

│반응 가스   │ 메탄(CH4)                                                          │

├──────┼──────────────────────────────────┤

│이온화 전류 │ 500 ∼ 1,000 μA                                                   │

├──────┼──────────────────────────────────┤

│이온원 온도 │ 280 ∼ 300 °C                                                     │

├──────┼──────────────────────────────────┤

│운반기체    │ 헬륨(25 psi)                                                       │

└──────┴──────────────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

전체의 시약류에는 폴리브롬화디페닐에테르의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용전 확인시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약을 사용한다.

4.1.1  아세톤(C3H6O)

4.1.2  노말-헥산(n-C6H14)

4.1.3  디클로로메탄(CH2Cl2)

4.1.4  노난(C9H20)

4.2  세정수: 노말-헥산으로 세정한 것

4.3  무수황산나트륨: 잔류농약 시험용 혹은 그와 동등 이상의 것

4.4  황산, 수산화칼륨, 질산은: 특급 혹은 이것과 동등 이상의 것

4.5  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.6  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 1 M 수산화칼륨 용액을 위 4.5항의 실리카겔에 수산화칼륨이 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고 밀폐가능한 용기에 넣은 다음 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.7  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 위 4.5항의 실리카겔에 황산이 실리카겔에 대해 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그리고 밀폐가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.8  GPC용 흡착제:　Bio-beads, 200 ∼ 400 mesh

4.9  표준물질

4.9.1  표준용액(표 3): 표준용액은 노말-헥산 혹은 노난 등을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.9.2  내부표준용액(표 4): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업농도범위로 희석하여 사용한다.

표 3.  PBDEs 분석에 사용하는 표준물질

───────┬────────────────┬──────

  대상 화합물 │PBDEs 화합물                    │IUPAC No.   

───────┼────────────────┼──────

  3브롬화물   │2,2',4-T3BDE                    │17          

              │2,4,4'-T3BDE                    │28          

───────┼────────────────┼──────

  4브롬화물   │2,2',4,4'-T4BDE                 │47          

              │2,3',4,4'-T4BDE                 │66          

              │2,3',4',6-T4BDE                 │71          

───────┼────────────────┼──────

  5브롬화물   │2,2',3,4,4'-P5BDE               │85          

              │2,2',4,4',5-P5BDE               │99          

              │2,2',4,4',6-P5BDE               │100         

              │2,3',4,4',6-P5BDE               │119         

              │3,3',4,4',5-P5BDE               │126         

───────┼────────────────┼──────

  6브롬화물   │2,2',3,4,4',5'-H6BDE            │138         

              │2,2',4,4',5,5'-H6BDE            │153         

              │2,2',4,4',5,6'-H6BDE            │154         

───────┼────────────────┼──────

  7브롬화물   │2,2',3,4,4',5',6-H7BDE          │183         

              │2,2',3,4,4',6,6'-H7BDE          │184         

              │2,2,3',4,4',5',6-H7BDE          │190         

              │2,3,3',4,4',5,6-H7BDE           │191         

───────┼────────────────┼──────

  8브롬화물   │2,2',3,3',4,4',5,6'-O8BDE       │196         

              │2,2',3,3',4,4',6,6'-O8BDE       │197         

───────┼────────────────┼──────

  9브롬화물   │2,2',3,3',4,4',5,5',6-N9BDE     │206         

              │2,2',3,3',4,4',5,6,6'-N9BDE     │207         

───────┼────────────────┼──────

  10브롬화물  │2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-D10BDE │209         

───────┴────────────────┴──────

표 4.  PBDEs 분석에 사용하는 내부표준물질

────────────────────┬──────

  PBDEs 화합물                          │IUPAC No.   

────────────────────┼──────

  2,2',4,4',5-P5BDE                     │77          

────────────────────┼──────

  2,2',4,4',5,6-H6BDE                   │139         

────────────────────┼──────

  13C12-2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-D10BDE │209         

────────────────────┴──────

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  채취된 해양생물 시료는 껍질을 제거한 후 가식부를 채취하여 250 혹은 500 mL의 갈색 유리병에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 해동하여 조직 분쇄기로 분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법

6.1  추출(속실렛 추출법)

6.1.1  균질화된 건시료 10 g을 칭량하여 팀블 여과지에 넣고 내부표준물질을 주입한다.

6.1.2  팀블 여과지를 사이폰에 넣은 후, 디클로로메탄:노말-헥산 혼합용액(3 : 1, v/v) 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

6.1.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속실렛 장치를 분리한다.

6.1.4  추출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.2  GPC 컬럼크로마토그래피 정제

6.2.1  위 4.8항의 Bio-beads(50 g)를 미리 세척된 유리 비커에 담는다.

6.2.2  충분한 양의 디클로로메탄:노말-헥산 혼합액(1 : 1, v/v)을 위 6.2.1의 유리 비커에 담아 둔다.

6.2.3  GPC용 컬럼에 위 6.2.2에서 준비된 Bio-beads 충진물을 충진한다.

6.2.4  위 6.1.4에서 얻어진 시료 용액을 조심스럽게 이입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.2.5  50 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 100 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 버린다.

6.2.6  50 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 150 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.7  얻어진 용출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.3  다층실리카겔 컬럼크로마토그래피 정제

6.3.1  컬럼크로마토관의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진 한다.

6.3.2  노말-헥산을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.3  조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.3.4  실리카겔 1 g을 충진한다.

6.3.5  44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

6.3.6  실리카겔 1 g을 충진한다.

6.3.7  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.8  얻어진 시료 용액을 조심스럽게 이입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.3.9  15 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 150 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.3.10  얻어진 용출액을 회전증발농축기로 농축하고, 질소가스로 농축하여 노난 20∼ 300 μL로 용매를 치환하여 GC/MS-ECNI로 분석한다.

6.4  기체크로마토그래피/질량분석기 분석

6.4.1  표 1의 GC/MS-ECNI 조건하에서 측정용 시료를 시료 주입부에 주입한다.

6.4.2  얻어진 크로마토그램에서 개별 브롬화물의 머무름시간과 표준용액의 머무름시간을 비교하여 각각의 성분을 지정하고 각 피크의 면적을 측정하여 검량선 및 감응계수로부터 농도를 계산한다.

6.4.3  이때, 각 브롬화물의 모니터 이온을 1개의 브롬화물당 2개 이상 설정하고, 정량용 질량수와 정성용 질량수에 대하여 크로마토그램을 확인·기록하며, 정량용 이온과 내부표준물질 피크간의 면적비를 구하여 시료에 상응하는 농도값으로 환산한다.

7. 분석절차 흐름도

그림 1.  PBDEs 분석절차 흐름도

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  검출한계

8.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석 절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

8.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양으로 시료 처리를 위한 화학분석과정에서는 나타날 수 있는 오차를 나타내는 방법검출한계와는 다르다. 기기검출한계는 분석 신호와 바탕 신호의 비(signal to noise ratio)에 3배(혹은 5배)로 정의한다. 

8.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석 절차하에 측정하며, 이때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

8.3  검량선의 작성 및 검증

8.3.1  검량선의 작성

브롬화난연제(PBDEs) 분석 전 검량선 작성용 표준용액을 3개 이상의 농도구배로 하여 검량선을 작성한다. x축은 GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 GC 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 분석하고자 하는 검량선 작성용 표준물질의 양을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

그림 2. 표준물질의 검량선

                        (식 1)

여기서,  RFs-is: GC 내부표준물질에 대한 검량선 작성용 표준물질의 감응계수,

               표준용액의 검량곡선의 기울기에 해당함

        Is: GC 바이알에 첨가된 검량선 작성용 표준물질의 양(ng)

        Iis: GC 바이알에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

        As: GC 바이알에 첨가된 검량선 작성용 표준물질의 면적

        Ais: GC 바이알에 첨가된 GC 내부표준물질의 면적

8.3.2  검량선의 검증

검량선의 직선성을 평가하여 검증한다.

                              (식 2)

                    (식 3)

여기서,   A: 추세선의 기울기              Aa: 분석 대상화합물의 면적 

          B: 추세선의 절편 값             Ais: GC 내부표준물질의 면적

          Ia: 분석 대상화합물의 양(ng)     Ais: GC 내부표준물질의 면적

          Iis: GC 내부표준물질의 양(ng)

각 시료군마다 1회의 검량선 검증을 실시하는 것이 바람직하며, 검량선의 중간 농도에 해당하는 표준용액을 측정한다. 측정값은 검량선 작성 당시의 값과 20 % 이내에서 일치 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검량선의 재작성이 요구된다.

8.4  정확도(Accuracy) 

8.4.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석 전 시료에 첨가되어진 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 GC 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 GC 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 GC 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

 그림 3. 표준물질의 검량선

              (식 5)

        (식 6)

여기서,

        RFsu-is: GC 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질의 감응계수

        Asu: 시료 첨가용 내부표준물질의 면적

        Ais: GC 내부표준물질의 면적

        Isu: 시료에 첨가된 시료 첨가용 내부표준물질의 양(ng)

        Iis: 시료의 최종추출액에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

8.4.2  시료에 첨가되어진 표준물질의 회수율

낮은 브롬화난연제(PBDEs) 농도를 가지는 해수시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후 동일한 실험을 수행한 후 회수되어진 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

         (식 7)

여기서,

          M: 첨가한 표준물질의 양 

          Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값 

          Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

8.5  정밀도(Precision)

정밀도는 규정된 조건하에서의 측정값들 간의 근접정도를 나타내는 것으로써 검량곡선에 사용한 농도 범위에서 최소 3개의 농도에 해당하는 표준물질을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다.

실험으로부터 얻은 평균값과 표준편차로 변동계수를 구하여 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

정밀도(%) = CV =                      (식 8)

여기서,

                     CV: 변동계수(Coefficient of variation)

                     SD: 표준편차(Standard Deviation)

                      : 평균값

9. 결과

9.1  농도계산

브롬화난연제(PBDEs)의 농도는 다음의 식에 의해 구해진다.

                     (식 9)

                       (식 10)

여기서,     CS: 시료(sample)의 농도(ng/g)

           AS: 분석대상물질(PBDEs)의 면적

           AiS: GC 내부표준물질의 면적

           RFS-iS: GC 내부표준물질에 대한 분석대상물질의 감응계수,

                  표준용액의 검량곡선의 기울기에 해당함

           IiS: 시료 최종추출액에 첨가된 GC 내부표준물질의 양(ng)

           IS: 시료에서의 분석대상물질(PBDEs)의 양(ng)

           W: 여과된 시료의 양(L)

이때, 시료 중에서의 내부표준물질 회수율이 많은 변동을 가진다면, 위 식에서 사용된 표준물질의 면적(As)은 위 8.4.1항에서 계산된 내부표준물질 회수율에 의한 보정된 값 ()을 이용 한다.

9.2  결과보고

시료에서의 농도와 함께 농도계산에 사용된 검량선과 관련된 검량식 및 결정계수 그리고 자료질 검정을 위한 자료들을 함께 제시한다.

①  검량식

②  결정계수(R2)

③  표준물질 농도

④  검출한계

⑤  정확도

⑥  정밀도

제20항 해산규조류(Skeletonema  costatum)를 이용한 해양생태독성 시험방법

1. 측정원리

본 시험법은 해양생태계의 생산자인 식물플랑크톤을 이용한 독성 시험방법으로써 유해 물질이 해양생태계 내 식물플랑크톤에게 미치는 영향을 파악하는 데 그 목적이 있다. 시험생물은 해산 규조류(Skeletonema costatum)이며, 이 시험법은 해산 규조류의 개체군 성장률을 이용하여 유해 물질의 독성을 검증하는 방법으로 해양 환경을 판단하는 기준으로 사용된다. 단일 물질이나 혼합물 및 상업용 제품 등 대부분의 화학 물질에 적용할 수 있고 고체상태의 물질은 추출 및 용출을 통하여 사용가능하지만, 산소요구량이 많은 물질, 휘발성이 강한 물질 및 생물학적 또는 화학적 변화를 급격하게 일으키는 물질 등을 시험하기에는 적당하지 않다.

2. 시험생물

2.1  시험생물은 해산 규조류 Skeletonema costatum(이하 S. costatum)이다.

2.2  S. costatum은 부유성 규조류로 해양과 기수역 및 연안에 널리 분포하는 종이다. 세포는 원반상, 원통상 또는 구형으로 굵고 기다란 주변 돌기환으로 세포들이 연결되어 사상 군체를 이룬다. 개각면은 볼록한 상태 또는 편평한 상태로서 미세한 소공으로 되어있고 주변부는 소공이 더 튀어나와 있어 가운데 부분의 큰 돌출이 일부 세포에서 확실하게 관찰된다. 개각면의 직경과 돌기의 길이에서 극단적 변이가 관찰되기도 하며, 세포의 크기는 직경이 8 ∼ 15 μm, 관각축은 4 ∼ 12 μm, 돌기의 길이는 6 ∼ 10 μm이며 사슬 모양을 하고 있다.

2.3  본 시험생물종(strain)은 국립수산과학원 서해수산연구소 해양위해평가센터와 해양시료도서관에서 구할 수 있다. 시험생물은 시험 시작 전에 적어도 두 번의 계대배양(2개월)을  하며, 입수 출처와 사육 방법이 모두 동일해야 한다.

3. 기구 및 기기

3.1  형광광도계(fluorometer)

3.2  현미경 

3.3  고압멸균기

3.4  항온배양기

3.5  수질측정기(염분, 수온, pH, DO)

3.6  초순수제조기

3.7  교반기 또는 공기발생기

3.8  50 mL 시험관

4. 시험준비

4.1  시험생물 사육

4.1.1  인공해수, 영양배지 및 시험물질 용액을 제조하는 데 사용하는 희석수는 탈이온수를 사용한다. 시험준비나 저장기간 동안 희석수가 오염되지 않도록 특별히 주의 하며, 본 시험에는 구리로 만든 도구나 기구는 사용할 수 없다.

4.1.2  시험생물은 인공해수에서 충분한 성장이 이루어지지 않아 시험기준에 미달되는 경우가 있으므로, 장기간 배양하려면 자연해수를 사용하는 것이 좋다. 자연해수의 염분은 25 ∼ 35 범위이며, 오염되지 않은 청정수역에서 채취된 해수를 사용 하고 GF/C 또는 0.45 μm membrane filter로 여과ㆍ멸균하여 사용한다.

4.2  시험생물 배양배지

┌─────┬────────────┬────────┬────────┐

│Stock명   │영양소                  │보존용액 내 농도│시험용액 내 농도│

├─────┼────────────┼────────┼────────┤

│Stock I   │  FeCl3·6H2O           │       48 mg/L  │149 μg/L(Fe)   │

│          │  MnCl2·4H2O           │                │605 μg/L(Mn)   │

│          │  ZnSO4·7H2O           │      144 mg/L  │150 μg/L(Zn)   │

│          │  CuSO4·5H2O           │       45 mg/L  │0.6 μg/L(Cu)   │

│          │  CoCl2·6H2O           │     0.157 mg/L │1.5 μg/L(Co)   │

│          │  H3BO3                 │     0.404 mg/L │17.1 μg/L      │

│          │  Na2-EDTA              │     1140 mg/L  │15.0 μg/L      │

│          │                        │     1000 mg/L  │                │

├─────┼────────────┼────────┼────────┤

│Stock II  │  Thiamin hydrochloride │50 mg/L         │25 μg/L        │

│          │  Biotin                │0.01 mg/L       │0.005 μg/L     │

│          │  Vitamin B12           │0.10 mg/L       │0.05 μg/L      │

├─────┼────────────┼────────┼────────┤

│Stock III │  K3PO4                 │3.0 g/L         │3.0 mg/L        │

│          │  NaNO3                 │50.0 g/L        │50.0 mg/L       │

│          │  Na2SiO3·5H2O         │14.9 g/L        │14.9 mg/L       │

└─────┴────────────┴────────┴────────┘

4.2.1  영양배지는 f/2 배지를 사용하며, 배지조성은 표 1과 같다. 영양배지 제조용 시약은 분석용 등급을 사용 한다. Stock I과 Stock III은 멸균하고, Stock II는 0.45 μm membrane filter로 여과하여 냉장 보관한다. 영양배지에 들어있는 상대적으로 많은 양의 EDTA가 중금속과 복합체를 형성할 수 있어, 중금속을 포함하는 배출수 시험에 영향을 줄 수 있으므로 주의한다. 영양배지 Stock을 희석하여 배양 배지를 만들거나(아래 4.2.2 참조), 상용화된 배지를 구매해서 사용할 수도 있다.

4.2.2  배양배지 조제: Stock I 15 mL, Stock II 0.5 mL, Stock III 1 mL를 900 mL 이하의 자연해수에 섞은 뒤, 자연해수를 추가로 넣어주어 영양배지가 정확하게 1 L가 되도록 한다. 식물플랑크톤을 접종하기 전에 pH를 염산이나 수산화나트륨을 사용하여 8.0 ± 0.5로 조절하며, 접종한 후에는 인위적으로 pH를 조절하지 않는다.

5. 시험방법

5.1  시험조건

시험생물의 개체군 성장률 시험조건은 표 2와 같다.

┌────────┬───────────────────────────┐

│항 목           │시 험 조 건                                           │

├────────┼───────────────────────────┤

│시험방법        │지수식 비교환방식                                     │

│                │                                                      │

│시험생물        │Skeletonema costatum                                  │

│                │                                                      │

│시험기간        │72시간 또는 96시간 개체군 성장률                      │

│                │                                                      │

│수온            │20.0 ± 1.0 °C                                       │

│                │                                                      │

│염분            │30.0 ± 5.0                                           │

│                │                                                      │

│pH              │8.0 ± 0.5                                            │

│                │                                                      │

│광종류          │백색형광등                                            │

│                │                                                      │

│광도            │7000 ∼ 9000 lux(111 ∼ 142 μEm-2s-1)                │

│                │                                                      │

│광주기          │10 Light : 14 Dark                                    │

│                │                                                      │

│시험용기의 크기 │50 mL 시험관                                          │

│                │                                                      │

│배양해수        │인공해수 또는 여과(0.45 μm membrane filter), 멸균한  │

│                │자연해수                                              │

│                │                                                      │

│시험용액 교환   │교환하지 않음                                         │

│                │                                                      │

│시험용액 부피   │시험용기 총 부피의 30 mL                              │

│                │                                                      │

│영양배지        │f/2 배지                                              │

│                │                                                      │

│접종세포농도    │약 15,000 cells/ mL                                   │

│                │                                                      │

│시험농도        │6구간 이상(대조구 포함)                               │

│                │                                                      │

│반복수          │3개                                                   │

│                │                                                      │

│세포밀도측정    │실험시작 후 24시간 간격(클로로필 a 농도 또는 세포수)  │

│                │                                                      │

│공기주입        │주입하지 않음                                         │

│                │                                                      │

│시험적합도      │대조구의 개체군 성장률(r)이 시간당 0.04 이상          │

└────────┴───────────────────────────┘

5.2  시험용액 및 시험농도

5.2.1  시험용액

시험용액은 일련의 방법에 따라 준비한다. 시험물질에 따라 배양액에 직접 희석하거나 유기용매와 분산제를 첨가하기도 하며, 시험물질의 입수경로를 포함하여 보관 장소 및 조제에 따른 계산까지 자세히 기록한다. 일반적으로 시험은 pH를 조절하지 않고 수행하지만, 극단적인 산성이나 알칼리성 물질인 경우는 염산이나 수산화나트륨을 등을 사용하여 pH를 조절한다.

5.2.2  시험농도

시험물질의 농도는 보통 기하학적인 순열을 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0의 비율이 되게 한다. 시험물질의 농도는 10 % 이하와 90 % 이상의 범위에서 최소 5구간 이상을 두어야 한다. 이때, 시험농도는 반드시 사망 및 성장 저해가 나타나는 구간을 포함 하고, 시험농도의 범위는 예비시험을 통하여 넓은 범위의 구간을 포함하는 것이 바람직하다. 최고 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도를 재조정할 필요가 없지만, 최저 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도 구간을 재설정 한다.

5.2.3  대조구

모든 시험은 시험대상 물질이 제외된 시험조건 및 시험과정이 동일한 대조구가 반드시 필요하다. 이때, 시험물질에 따라 운반체(carrier)가 쓰일 경우에는 운반체만이 첨가된 운반체 대조구가 필요하다.

5.3  개체군 성장률 시험법

5.3.1  시험물질 Stock, 배양배지 및 S. costatum 접종액(아래 5.3.2 참조)을 포함한 시험용액을 준비한다. 이때, 시험용액의 총 부피는 시험 용기별로 모두 같아야 한다. S. costatum 접종 양은 5,000 cells/mL 이상의 초기 농도가 되도록 충분하게 넣어주어야 한다. S. costatum은 사슬(chain)을 이루기 때문에 시작 세포 밀도를 결정할 때 이를 고려해서 단위세포 수를 계수한다.

5.3.2  S. costatum 접종액의 준비는 다음과 같다. 시험에 사용하는 식물플랑크톤은 사전 배양액으로부터 얻어야 한다. 사전 배양은 지수 성장 상태에 있어야 하고 시험의 접종액으로 사용하기에 충분한 세포 밀도가 되어야 한다. 시험에 사용하기 바로 직전에 사전 배양액의 세포 밀도를 측정하여 접종량을 결정한다.

5.3.3  50 mL 시험관에 시험수 30 mL씩 분주하고 20 ± 1.0 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상의 반복구를 둔다. 이때의 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.3.4  S. costatum을 준비된 각각의 시험관에 5,000 cells/mL의 농도로 접종한 뒤 형광광도계를 사용하여 340 ∼ 500 nm excitation, 680 nm 영역대의 초기 형광량을 측정하고, 온도 20 ± 1.0 °C, 광량 7,000 ∼ 9,000 lux (111 ∼ 142 μEm-2s-1), 광주기 (10 Light : 14 Dark), 백색 형광등의 항온배양기에서 96시간 배양한다. 만약, S. costatum이 과도하게 응집할 경우, 하루에 1 ∼ 2회 정도 흔들어 주거나 교반기를 이용하여 잘 섞어준다.

5.3.5  시험 시작 후 24시간마다 대조구를 포함한 각 시험관을 형광광도계로 클로로필 a 농도를 측정 후 이를 다시 시험에 사용하며, 측정시 시험생물이 골고루 섞이도록 잘 흔들어서 측정한다. 시험은 적어도 72 ∼ 96시간 동안 지속해야 하며, 보통 96시간 배양 후에 시험을 종료한다. 시험이 끝날 때 시험용액의 각 농도 용액과 대조구의 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

6. 결과

6.1  자료분석

6.1.1  개체군 성장률을 구하기 위해서는 시간대별로 측정한 세포 밀도 자료가 필요하다. 세포수를 직접 계수하는 대신 클로로필 a 농도를 측정한 경우에는 클로로필 a 농도 그대로 개체군 성장률 계산에 이용할 수 있다.

6.1.2  클로로필 a 농도를 이용하여 세포수를 환산할 경우에는 클로로필 a 최대 농도 이하에서 최소 5구간의 농도에 대한 세포 밀도 자료가 필요하다. 클로로필 a 농도와 세포 밀도 간의 검량선은 시험마다 구하여 사용한다.

6.1.3  결과의 표시는 다음과 같다. 생존율과 개체군 성장률을 이용하여 반수영향농도(EC50), 무영향농도(NOEC) 및 최소영향농도(LOEC)를 구하고, 노출 시간을 정확히 표시 한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 보통 mg/L 단위인 경우, 유효숫자 2자리까지 표시한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 일정한 조건에서 수행된 시험으로부터 도출되는 독성학적 자료이며, 이 결과는 어떤 물질이 생물에 미치는 위해성을 파악할 수는 있지만, 자연 상태에서 동일한 영향을 예측하기 위한 목적으로 사용하기에는 실험적 조건이라는 한계가 있다.

6.1.4  성장곡선 그리기: 각 시험농도와 대조구에 대해 실험 시작부터 24시간마다 세포수를 계수하여 클로로필 a 농도별 평균 세포 밀도(자연로그)를 계산한 후 이를 시간대별로 도식하여 개체군 성장률의 성장곡선을 그린다.

6.2  결과계산

6.2.1  개체군 성장률(r)의 계산: 각 시험구당 개체군 성장률을 아래 식에 의해 계산한다.

                        (식 1)

tL: 시험기간(시간)

NO: 시험 시작시 세포 밀도(또는 클로로필 a 농도)

NL: 시험 종료시 세포 밀도(또는 클로로필 a 농도)

이때, 대조구의 개체군 성장률은 시간당 0.04 이상이 되어야 유효하다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.2.2  성장 저해율(I)의 계산: 각 시험구와 대조구의 개체군 성장률 평균값을 이용하여 성장 저해율을 아래와 같은 식에 의해 계산한다.

                         (식 2)

: 시험 농도 i에 대한 개체군성장 저해 백분율

: 시험 농도 i의 평균 개체군 성장률

: 대조구의 평균 개체군 성장률 

6.3  통계처리

6.3.1  반수영향농도(EC50)는 프로빗(Probit)법 또는 Trimmed Spearman  Karber(TSK)법을 사용하여 95 %의 신뢰구간에서 구한다.

6.3.2  프로빗법은 1 ∼ 99 % 사이의 데이터가 1개 이하인 경우, TSK법은 2개 이상인 경우에 사용할 수 있다.

6.3.3  분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.4  결과보고

6.4.1  결과보고에는 모든 기초자료뿐만 아니라 시험결과까지 기록한다.

6.4.2  시험생물의 정보: 입수 출처와 사육방법 및 생활사 단계 등을 기록한다.

6.4.3  시험물질의 정보: 구입 위치, 순도, CAS 번호, 생산자의 로트(lot) 번호. 배출수인 경우에는 채집 위치, 채집 방법, 보관 시간, 방법 및 상태 등을 기록한다.

6.4.4  시험환경: 시험개시 및 종료시 수온, pH, 용존산소량 및 조도 등을 기록한다.

6.4.5  희석수: 희석수의 종류, 용매의 종류 및 이들의 농도를 기록한다.

6.4.6  종말점: 96시간 개체군 성장률 및 95 % 신뢰구간(95 % CI) 등을 기록하고, 이들의 통계처리 방법을 기록한다.

6.4.7  결과를 보증하는 자료로써 대조구의 개체군 성장률(r)에 대해 가장 최근에 수행된 표준독성물질 시험결과를 첨부한다.

6.4.8  본 시험법에 언급되지 않은 내용 및 문제는 US EPA(US Enviro nmental Protection Agency), ASTM(American Society for Testing and Materials)의 표준법(ASTM, 1991) 및 APHA(American Public Health Association)의 표준법(APHA, 1998) 등을 참고한다.

6.5  유효성 판정 

본시험은 다음과 같은 경우, 일반적으로 그 결과를 인정할 수 없다.

6.5.1  개체군 성장률의 대조구의 시간당 성장률이 0.04 미만인 경우

6.5.2  시험 용기의 크기나 재질이 동일하지 않은 경우

6.5.3  필요한 희석수나 용매 대조구가 시험에 포함되지 않은 경우

6.5.4  시험생물이 무작위로 배당되지 않은 경우

6.5.5  수온, 염분, pH, 용존산소량 및 조도 등의 시험조건이 명시되지 않은 경우

7. 참고사항

7.1  본 시험법은 산소요구량이 많은 물질, 휘발성 물질, 생물 및 화학적 변화가 급격히 발생하거나 시험 용기 등에 흡착이 쉬운 물질에는 적합하지 않다.

7.2  시험생물은 20.0 ± 1.0 °C에서 계대배양을  하고, 지수성장단계 시험생물을 사용하는 것이 가장 시험오차가 작다.

7.3  시험농도는 50 % 이하의 생존율 및 개체군 성장률이 발생하는 농도를 최고 농도로 설정하며, 그 이하 농도를 등비율로 조정한다. 예를 들면, 시험농도는 기하학적인 순열에 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0 사이가 되게 한다. 즉, 시험농도가 0, 2, 4, 8, 16 및 32 mg/L 혹은 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 및 100.0 %로 조정한다.

7.4  개체군 성장률 시험에서 수온이 20.0 ± 1.0 °C 이하인 경우, 72시간 및 96시간 후의 개체군 성장률이 낮아지므로 수온을 20.0 ± 1.0 °C로 유지 한다.

7.5  시험물질의 농도를 조정하기 위한 예비시험은 본 시험과 같은 반복구를 두지 않고 넓은 범위로 수행 가능하다.

7.6  개체군 성장률 시험은 대조구의 시간당 개체군 성장률이 반드시 0.04 이상인 경우에 유효하다. 이는 결과로 인정할 수 있는 최소한의 값이며, 이 값보다 낮은 경우, 희석수와 먹이 및 시험생물의 건강도 등을 검토하여 재시험한다.

7.7  영양배지의 품질이 낮은 경우, 정상적인 개체군 성장을 하지 않기 때문에 관리에 주의하도록 한다.

7.8  시료의 오염

7.8.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 염소계 산화제와 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 시안 분자 구조를 분해시킨다.

7.8.2  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 알데히드(Aldehyde) 계열의 화합물과의 접촉을 피한다. 알데히드와의 반응을 통해 시안화물이 시아노히드린(Cyanohydrin)으로 변화된다.

7.9  용어정리

7.9.1  반수영향농도(50 % Effective Concentration, EC50): 시험생물의 개체군 성장률이 50 % 저해된 농도

7.9.2  무영향농도(No Observed Effect Concentration, NOEC): 시험생물에게 영향을 미치지 않는 농도

7.9.3  최소영향농도(Lowest Observed Effect Concentration, LOEC): 시험생물에게 영향을 미치는 최소 농도

제21항 다시마(Saccharina  japonica)를 이용한 해양생태독성 시험방법

1. 측정원리

본 시험법은 해조류를 이용한 독성 시험방법으로 유해물질이 해양생태계 내 생산자 역할인 해조류에 미치는 영향을 파악하는 데 그 목적이 있다. 시험생물은 다시마(Saccharina japonica)이며, 이 시험법은 다시마의 발아율(Spore germination rate) 또는 배우체 성장률(Gametophyte length)를 이용하여 유해 물질의 독성을 검증하는 방법으로써, 해양환경을 판단하는 기준으로 사용된다. 단일 물질이나 혼합물, 상업용 제품 등 대부분의 화학 물질에 적용할 수 있고 고체상태의 물질은 추출 및 용출을 통하여 사용 가능하나, 산소요구량이 많은 물질, 휘발성이 강한 물질, 생물학적 또는 화학적 변화를 급격하게 일으키는 물질 등을 시험하기에는 적당하지 않다.

2. 시험생물

2.1  시험생물은 다시마 Saccharina japonica(이하 S. japonica)이다.

2.2  S. japonica는 갈조강 다시마목 다시마과의 한 종이다. 우리나라의 주요 양식 해조류 중 하나이며, 전복양식의 주요 먹이생물로 사용된다. 우리나라 일본 및 태평양 연안에 주로 분포하며, 외형은 암갈색의 줄기, 잎, 뿌리가 구분이 뚜렷하고 일반적으로 길이 1.5 ∼ 3.5 m, 너비 25 ∼ 40 cm 정도 자란다. 성숙한 다시마는 6월부터 다음해 3월까지 포자 방출을 통해 세대교번을 하는데 가을과 겨울에 포자 방출이 가장 활발하다. 다시마는 카로틴류, 크산토필류 및 클로로필류 등 여러 가지 색소와 알긴산, 라미나린 및 요오드 등 다양한 유용 물질을 포함하여 식용 및 건강 보조 식품의 원료로 주목받고 있다. 우리나라의 주요 양식종은 참다시마(Saccharina japonica)와 애기다시마(Laminaria religiosa)이다.

2.3  본 시험생물종(strain)은 국내 전 연안에서 양식되는 다시마이며, 채집된 시험생물은 자연채광 상태에서 유수식으로 순치시켜 시험에 사용한다.

3. 기구 및 기기

3.1  현미경

3.2  고압멸균기

3.3  항온배양기

3.4  수질측정기(염분, 수온, pH, DO)

3.5  초순수제조기

3.6  이미지 분석장치

3.7  사육수조

3.8  트레이

3.9  커버글라스 24 × 24 mm

3.10  6-well plate

3.11  3 % 포르말린

4. 시험준비

4.1  시험생물 사육

4.1.1  시험생물을 장기간 사육하려면 여과된 자연해수를 사용하는 것이 좋으며, 염분은 30.0 ± 1.0, 수온은 10.0 ± 1.0 °C 유수식으로 깨끗한 해수가 유입되도록 한다.

4.1.2  시험생물의 사육 기간에 수온 15 °C 이상에서 유주자 방출이 시작되므로 15 °C 이하의 일정한 수온이 유지되도록 주의한다.

4.1.3  시험생물의 노출 광량은 자연채광 또는 형광등 12 light : 12 Dark에서 보관한다.

4.1.4  시험생물은 인공해수에서 충분한 성장이 이루어지지 않아 시험 기준에 미달되는 경우가 있으므로, 영양배지도 자연해수를 사용하는 것이 좋다. 자연해수의 염분은 25 ∼ 35 범위이며, 오염되지 않은 청정수역에서 채취된 해수를 사용해야 한다. 자연해수는 GF/C 또는 0.45 μm membrane filter로 여과하고 멸균하여 사용한다.

4.2  시험생물 배양배지

4.2.1  영양배지는 PESI 배지를 사용하며, 배지조성은 표 1과 같다. 영양배지 제조용 시약은 분석용 등급을 사용 한다. Stock III을 제외한 나머지 4개 Stock은 멸균한다. Stock III는 0.45 μm membrane filter로 여과하여 냉장 보관한다. 영양배지는 상용화된 배지를 구입하여 사용할 수도 있다. 영양배지에 들어있는 상대적으로 많은 양의 EDTA가 중금속과 복합체를 형성함으로써 중금속이 들어있는 배출수의 시험에 영향을 줄 수 있으므로 주의한다.

4.2.2  배양배지 조제: 배양배지는 다음의 과정으로 영양배지 Stock을 만든 다음, 자연해수 1 L당 PESI 배지 20 mL/L로 희석하여 만든다.

4.2.2.1  Stock I은 증류수 970 mL, Stock II는 증류수 10 mL, Stock III은 증류수 100 mL, Stock Ⅳ는 증류수 2000 mL, Stock Ⅴ는 증류수 2,000 mL에 각각 녹인 후, Stock III을 제외한 나머지는 멸균하고, Stock III의 비타민은 열에 약하기 때문에 0.45 μm membrane fiter로 여과한다.

4.2.2.2  Stock I 970 mL, Stock II 10 mL, Stock III 20 mL, Stock Ⅳ 500 mL, Stock Ⅴ 500 mL를 모두 섞어서 총 2,000 mL의 PESI 배지 원액을 만든다.

4.2.2.3  PESI 배지 원액 20 mL를 멸균된 자연해수 980 mL 또는 시험수 980 mL에 첨가하여 PESI 배지 20 mL/L 농도로 시험에 사용할 배양배지를 제조한다.┌─────┬──────────┬────┬────────┐

│Stock명   │영양소              │투입량  │비고            │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock I   │Na2-glycerophosphate│1.00 g  │증류수 970 mL   │

│          │NaNO3               │7.00 g  │(Autoclave)     │

│          │Tris HCl            │8.14 g  │                │

│          │Tris Base           │1.86 g  │                │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock II  │KI                  │2.50 mg │증류수 10 mL    │

│          │                    │        │(Autoclave)     │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock III │Vitamin B12         │1.00 mg │증류수 100 mL   │

│          │Thiamin             │50.00 mg│(Filter-sterize)│

│          │Biotin              │0.50 mg │                │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock Ⅳ  │Fe(NH4)2(SO4)·6H2O │1.40 g  │증류수 2,000 mL │

│          │Na2-EDTA            │1.32 g  │(Autoclave)     │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│StockⅤ   │Boric acid          │2.24 g  │증류수 2,000 mL │

│          │F2Cl3·6H2O         │0.096 g │(Autoclave)     │

│          │MnSO4               │0.24 g  │                │

│          │ZnSO4·7H2O         │0.044 g │                │

│          │CoSO4·7H2O         │0.0096 g│                │

│          │Na2-EDTA            │2.00 g  │                │

└─────┴──────────┴────┴────────┘

5. 시험방법

5.1  시험조건

시험생물의 발아율 및 배우체 성장률 시험조건은 표 2와 같다.

┌───────┬───────────────────────────┐

│항 목         │시 험 조 건                                           │

├───────┼───────────────────────────┤

│시험방법      │비교환식(발아율), 교환식(배우체 성장률)               │

│              │                                                      │

│시험생물      │Saccharina japonica                                   │

│              │                                                      │

│시험기간      │24시간(발아율) 또는 7일(배우체 성장률)                │

│              │                                                      │

│수온          │15 °C ± 0.5 °C                                     │

│              │                                                      │

│염분          │30.0 ± 1.0                                           │

│              │                                                      │

│pH            │8.0 ± 0.5                                            │

│              │                                                      │

│산소          │주입하지 않음                                         │

│              │                                                      │

│광주기        │암배양(발아율), 12 Light : 12 Dark(배우체 성장률)     │

│              │                                                      │

│광량          │3,000 lux                                             │

│              │                                                      │

│시험용기      │6-well plate                                          │

│              │                                                      │

│시험농도      │6구간 이상(대조구 포함)                               │

│              │                                                      │

│배양해수      │PESI 배지                                             │

│              │                                                      │

│시험용액      │교환하지 않음(발아율), 2일에 한번 교환(배우체 성장률) │

│              │                                                      │

│시험용액 부피 │10 mL                                                 │

│              │                                                      │

│시험반복수    │3개 이상                                              │

│              │                                                      │

│종말점        │발아율(%) 및 반수영향농도(EC50)                       │

│              │                                                      │

│시험적합도    │발아율 시험은 대조구의 포자발아율 90 %이상, 배우체    │

│              │성장률 시험은 대조구 배우체 길이의 평균이 15 μm 이상 │

└───────┴───────────────────────────┘

5.2  시험용액 및 시험농도

5.2.1  시험용액

시험용액은 일련의 방법에 따라 준비한다. 시험물질에 따라 배양액에 직접 희석하거나 유기용매와 분산제를 첨가하기도 하며, 시험물질의 입수경로를 포함하여 보관 장소 및 조제에 따른 계산까지 자세히 기록한다. 일반적으로 시험은 pH를 조절하지 않고 수행하지만, 극단적인 산성이나 알칼리성 물질인 경우는 염산이나 수산화나트륨을 등을 사용하여 pH를 조절한다.

5.2.2  시험농도

시험물질의 농도는 보통 기하학적인 순열을 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0의 비율이 되게 한다. 시험물질의 농도는 10 % 이하와 90 % 이상의 범위에서 최소 5구간 이상을 두어야 한다. 이때, 시험농도는 반드시 사망 및 성장 저해가 나타나는 구간을 포함 하고, 시험농도의 범위는 예비시험을 통하여 넓은 범위의 구간을 포함하는 것이 바람직하다. 최고 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도를 재조정할 필요가 없지만, 최저 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도 구간을 재설정 한다.

5.2.3  대조구

모든 시험은 시험대상 물질이 제외된 시험조건 및 시험과정이 동일한 대조구가 반드시 필요하다. 이때, 시험물질에 따라 운반체(carrier)가 쓰일 경우에는 운반체만이 첨가된 운반체 대조구가 필요하다.

5.3  유주자 방출 유도

5.3.1  시험시작 12 ∼ 24시간 전에 보관 중인 다시마 중에서 자낭반 다세포 조류에서 포자낭이 뭉쳐진 부분에 나타나는 짙은 얼룩

 형성 유무를 기준으로 성숙한 다시마를 선별한다. 붓 또는 부드러운 천으로 다시마 표면의 이물질 또는 부착생물을 닦아내고, 여과된 해수로 깨끗이 세척한다. 세척 시에 다시마 표면이 손상되지 않도록 주의한다.

5.3.2  세척된 다시마에서 자낭반이 있는 부분을 손바닥 크기 이하로 조각내고 잘린 단면에서 발생되는 알긴산(alginic acid)은 부드러운 천으로 닦아낸다. 다시마 조각 표면의 수분을 제거하고 은박지에 싸서 15 °C 암 상태에서 12 ∼ 24시간 음건시킨다. 충분히 음건된 다시마 조각을 여과된 해수에 넣고 천천히 저어서 포자 방출을 유도한다.

5.3.3  트레이에 필요한 만큼의 커버글라스를 겹치지 않게 두고 방출된 유주자를 넣은 후 60분 정도 방치하여 커버글라스에 유주자가 부착되도록 한다. 60분 이후 현미경으로 유주자가 잘 부착되었는지 확인한다. 유주자는 유리 표면에도 부착할 수 있을 정도로 부착력이 있지만, 부착이 잘되지 않을 경우 부착이 쉽도록 커버글라스에 미세한 흠집을 낼 수 있다.

5.4  다시마 발아율 시험

5.4.1  위 5.3.3의 유주자가 부착되어있는 커버글라스를 사용한다.

5.4.2.  6-well plate에 시험수 10 mL씩 분주하고 각 시험수에는 영양배지를 20 mL/L의 농도로 첨가하여 15.0 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상의 반복구를 둔다.

5.4.3  미리 준비된 6-well plate에 유주자가 부착된 커버글라스를 넣고 뚜껑을 덮어 파라 필름으로 밀봉한 뒤, 24시간 동안 15 ± 0.5 °C 항온배양기에서 암 배양한다.

5.4.4  24시간 후, 3 % 포르말린으로 고정하고 100 개체를 무작위로 관찰하여 현미경으로 발아한 유주자와 발아하지 않은 유주자를 계수하여 발아율을 계산한다. 실험은 농도별로 3회 반복 실시하며 48시간마다 시험수를 교체한다.

5.5  다시마 배우체 성장률

5.5.1  위 5.3.3의 유주자가 부착되어 있는 커버글라스를 사용한다.

5.5.2  6-well plate에 시험수 10 mL씩 분주하고 각 시험수에는 영양배지를 20 mL/L의 농도로 첨가하여 15.0 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상은 반복구를 둔다.

5.5.3  미리 준비된 6-well plate에  유주자가 부착된 커버글라스를 넣고 뚜껑을 덮어 파라 필름으로 밀봉한 뒤, 온도는 15.0 ± 0.5 °C, 광량은 3000 lux, 광주기는 12 light : 12 dark의 항온배양기에서 7일간 배양한다.

5.5.4  7일 후 3 % 포르말린 용액으로 고정시키고, 20 개체를 무작위로 관찰하여 배우체의 길이를 마이크로미터 또는 이미지분석 장치를 사용하여 측정한다. 실험은 농도별로 3회 반복 실시하며 48시간마다 시험수를 교체한다.

6. 결과

6.1  자료분석

6.1.1  발아율 및 배우체 성장률을 구하기 위해서는 발아율을 계수한 자료와 배우체 길이를 측정한 자료가 필요하다. 현미경을 통해 발아한 포자의 계수 및 배우체 길이를 측정한 결과를 발아율과 배우체 성장률 계산에 이용한다.

6.1.2  결과의 표시는 다음과 같다. 발아율과 배우체 성장률을 이용하여 반수영향농도(EC50), 무영향농도(NOEC) 및 최소영향농도(LOEC)를 구하고, 노출 시간을 정확히 표시해야 한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 보통 리터당 밀리그램 단위인 경우, 유효숫자 2자리까지 표시한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 일정한 조건에서 수행된 시험으로부터 도출되는 독성학적 자료이며, 이 결과는 어떤 물질이 생물에 미치는 위해성을 파악할 수는 있지만, 자연 상태에서 동일한 영향을 예측하기 위한 목적으로 사용하기에는 실험적 조건이라는 한계가 있다.

6.2  결과계산

6.2.1  발아율의 계산: 각 시험구당 발아율을 아래 백분율 식에 의해 계산한다.

                       (식 1)

a: 정상 발아한 유주자

b: 발아하지 않은 유주자

이때, 대조구의 발아율은 최소 90 % 이상이 되어야 유효하며, 발아는 현미경 상에서 발아관의 생성 유ㆍ무에 따라 판단한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.2.2  배우체 성장률(r)의 계산: 각 시험구당 배우체 성장률은 마이크로미터 또는 이미지 분석장치를 통해 측정된 값을 사용한다. 이때 대조구의 배우체 길이의 평균이 15.0  μm 이상이 되어야 유효하다. 배우체 길이는 현미경으로 관찰되는 배우체의 중심에 가까운 가장 긴 길이를 측정하며,  μm 단위로 표기한다. 또한 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.3  통계처리

6.3.1  반수영향농도(EC50)는 프로빗(Probit)법 또는 Trimmed Spearman Karber(TSK)법을 사용하여 95 %의 신뢰구간에서 구한다.

6.3.2  프로빗법은 1 ∼ 99 % 사이의 데이터가 1개 이하인 경우, TSK법은 2개 이상인 경우에 사용할 수 있다.

6.3.3  분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.4  결과보고

6.4.1  결과보고에는 모든 기초자료뿐만 아니라 시험결과까지 기록한다.

6.4.2  시험생물의 정보: 입수 출처와 사육방법 및 생활사 단계 등을 기록한다.

6.4.3  시험물질의 정보: 구입 위치, 순도, CAS 번호, 생산자의 로트(lot) 번호. 배출수인 경우에는 채집 위치, 채집 방법, 보관 시간, 방법 및 상태 등을 기록한다.

6.4.4  시험환경: 시험개시 및 종료시 수온, pH, 용존산소량 및 조도 등을 기록한다.

6.4.5  희석수: 희석수의 종류, 용매의 종류 및 이들의 농도를 기록한다.

6.4.6  종말점: 72시간 발아율, 7일 배우체 성장률 및 95 % 신뢰구간(95 % CI) 등을 기록하고, 이들의 통계처리 방법을 기록한다.

6.4.7  결과를 보증하는 자료로써 대조구의 발아율, 배우체 성장률에 대해 가장 최근에 수행된 표준독성물질을 사용한 시험결과를 첨부한다.

6.4.8  본 시험법에 언급되지 않은 내용 및 문제는 US EPA(US Enviro nmental Protection Agency), ASTM(American Society for Testing and Materials)의 표준법(ASTM, 1991) 및 APHA(American Public Health Association)의 표준법(APHA, 1998) 등을 참고한다.

6.5  유효성 판정 

본시험은 다음과 같은 경우, 일반적으로 그 결과를 인정할 수 없다.

6.5.1  발아율 시험에서 대조구의 발아율이 90 % 미만인 경우

6.5.2  배우체 성장률 시험에서 대조구의 배우체 길이가 15.0 μm 미만인 경우

6.5.3  시험 용기의 크기나 재질이 동일하지 않은 경우

6.5.4  필요한 희석수나 용매 대조구가 시험에 포함되지 않은 경우

6.5.5  시험생물이 무작위로 배당되지 않은 경우

6.5.6  수온, 염분, pH, 용존산소량 및 조도 등의 시험조건이 명시되지 않은 경우

7. 참고사항

7.1  본 시험법은 산소요구량이 많은 물질, 휘발성 물질, 생물 및 화학적 변화가 급격히 발생하거나 시험 용기 등에 흡착이 쉬운 물질에는 적합하지 않다.

7.2  시험농도는 50 % 이하의 발아율 및 배우체 성장률이 발생하는 농도를 최고 농도로 설정하며, 그 이하 농도를 등비율로 조정한다. 예를 들면, 시험농도는 기하학적인 순열에 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0 사이가 되게 한다. 즉 시험농도가 0, 2, 4, 8, 16 및 32 mg/L 혹은 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 및 100.0 %로 조정한다.

7.3  시험물질의 농도를 조정하기 위한 예비시험은 본 시험과 같은 시험의 반복구를 두지 않고 넓은 범위로 수행 가능하다.

7.4  발아율 시험은 대조구의 발아율이 반드시 90 % 이상 나타나야 하며, 배우체 성장률은 대조구의 배우체 길이가 반드시 15.0 μm 이상인 경우에 유효하다. 이는 결과로 인정할 수 있는 최소한의 값이며, 이 값보다 낮은 경우, 희석수와 먹이 및 시험생물의 건강도 등을 검토하여 재시험한다.

7.5  시료의 오염

7.5.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 염소계 산화제와의 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 시안 분자 구조를 분해시킨다.

7.5.2  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 알데히드(Aldehyde) 계열의 화합물과의 접촉을 피한다. 알데히드와의 반응을 통해 시안화물이 시아노히드린 (Cyanohydrin)으로 변화된다.

7.6  용어정리

7.6.1  반수영향농도(50 % Effective Concentration, EC50): 시험생물의 발아율 및 배우체 성장률이 50% 저해된 농도

7.6.2  무영향농도(No Observed Effect Concentration, NOEC): 시험생물에게 영향을 미치지 않는 농도

7.6.3  최소영향농도(Lowest Observed Effect Concentration, LOEC): 시험생물에게 영향을 미치는 최소의 농도

7.7  시험관련 문의

해양위해평가센터22383 인천광역시 중구 선녀바위로 14국립수산과학원 서해수산연구소 자원환경과 해양위해평가센터전화: 032-745-0680 팩스: 032-745-0686

제22항 미역(Undaria  pinnatifida)을 이용한 해양생태독성 시험방법

1. 측정원리

본 시험법은 해조류를 이용한 독성 시험방법으로 유해 물질이 해양생태계 내 생산자 역할인 해조류에게 미치는 영향을 파악하는 데 그 목적이 있다. 시험생물은 미역(Undaria pinnatifida)이며, 이 시험법은 미역의 발아율(Spore germination rate) 및 아포체 성장률(Sporophyte length)을 이용하여 유해 물질의 독성을 검증하는 방법으로써, 해양환경을 판단하는 기준으로 사용된다. 단일 물질이나 혼합물, 상업용 제품 등 대부분의 화학 물질에 적용할 수 있고 고체상태의 물질은 추출 및 용출을 통하여 사용 가능하나, 산소 요구량이 많은 물질, 휘발성이 강한 물질 및 생물학적 또는 화학적 변화를 급격하게 일으키는 물질 등을 시험하기에는 적당하지 않다.

2. 시험생물

2.1  시험생물은 미역 Undaria pinnatifida(이하 U. pinnatifida)이다.

2.2  U. pinnatifida는 연평균 수온이 10 °C 이상 되는 해역에서 살고 있는 난류성 해조류이며 우리나라와 일본의 특산물이다. 우리나라에서 남쪽은 제주도, 북쪽은 황해도 두만강에 이르는 전 연안에 분포하며 특히 제주, 강원, 경북 및 경남 등지에서 많이 생산되고 있다. 미역의 서식대는 바닷물이 깨끗하고 연안의 암초상에 생육하며 간조선에서부터 수심 3 ∼ 4발 되는 곳에 번무하고, 수심 7 ∼ 8발의 깊은 곳에도 생육한다. 일반적으로 미역 서식 수심은 지방에 따라 차이가 있으나 북쪽일수록 비교적 얕고 남하할수록 깊은 곳에 살고 있다. 또, 미역의 형태에 있어서도 지방 혹은 산지에 따라 달라서 동해안에서는 길이 2 m에 달하지만, 남해안에서는 겨우 1 m 내외에 불과하다.

2.3  본 시험생물종(strain)은 국내 전 연안에서 양식되는 미역이며, 채집된 시험생물은 자연채광 상태에서 유수식으로 순치시켜 시험에 사용한다.

3. 기구 및 기기

3.1  현미경

3.2  고압멸균기

3.3  항온배양기

3.4  수질측정기(염분, 수온, pH, DO)

3.5  초순수제조기

3.6  사육수조

3.7  Petri dish

3.8  커버글라스 24 × 24 mm

3.9  이미지 분석장치 또는 마이크로미터

3.10  트레이

4. 시험준비

4.1  시험생물 사육

4.1.1  시험생물을 장기간 사육하려면 여과된 자연해수를 사용하는 것이 좋으며, 염분은 30.0 ± 1.0, 수온은 10.0 ± 1.0 °C 유수식으로 깨끗한 해수가 유입되도록 한다.

4.1.2  시험생물의 사육 기간에 수온 14 °C 이상에서 유주자 방출이 시작되므로 14 °C 이하의 일정한 수온이 유지되도록 주의한다.

4.1.3  유주자 방출이 많이 되는 기간의 평균 수온은 17 ∼ 22 °C이며, 22 °C에서는 방출이 끝난다. 방출되는 시간은 9 ∼ 16시 사이에 많으며 방출 지속시간은 2시간 이내다.

4.1.4  시험생물의 노출 광량은 자연채광 상태 또는 형광등 12 light : 12 Dark에서 보관한다.

4.1.5  시험생물은 인공해수에서 충분한 성장이 이루어지지 않아 시험기준에 미달되는 경우가 있으므로 영양배지도 자연해수를 사용하는 것이 좋다. 자연해수의 염분은 25 ∼ 35 범위이며, 오염되지 않은 청정수역에서 채취된 해수를 사용해야 한다. 자연해수는 GF/C 또는 0.45 μm membrane filter로 여과하고 멸균하여 사용한다.

4.2  시험생물 배양배지

4.2.1  영양배지는 PESI 배지를 사용하며, 배지조성은 표 1과 같다. 영양배지 제조용 시약은 분석용 등급을 사용 한다. Stock III을 제외한 나머지 4개 Stock은 멸균한다. Stock III은 0.45 μm membrane filter로 여과하여 냉장 보관한다. 영양배지는 상용화된 배지를 구입하여 사용할 수도 있다. 영양배지에 들어있는 상대적으로 많은 양의 EDTA가 중금속과 복합체를 형성함으로써, 중금속이 들어있는 배출수의 시험에 영향을 줄 수 있으므로 주의한다.

4.2.2  배양배지 조제: 배양배지는 다음의 과정으로 영양배지 Stock을 만든 다음, 자연해수 1 L당 PESI 배지 20 mL/L로 희석하여 만든다.

4.2.2.1  Stock I은 증류수 970 mL, Stock II는 증류수 10 mL, Stock III은 증류수 100 mL, Stock Ⅳ는 증류수 2000 mL, Stock Ⅴ는 증류수 2,000 mL에 각각 녹인 후, Stock III을 제외한 나머지는 멸균하고, Stock III의 비타민은 열에 약하기 때문에 0.45 μm membrane fiter로 여과한다.

4.2.2.2  Stock I 970 mL, Stock II 10 mL, Stock III 20 mL, Stock Ⅳ 500 mL, Stock Ⅴ 500 mL를 모두 섞어서 총 2,000 mL의 PESI 배지 원액을 만든다.

4.2.2.3  PESI 배지 원액 20 mL를 멸균된 자연해수 980 mL 또는 시험수 980 mL에 첨가하여 PESI 배지 20 mL/L 농도로 시험에 사용할 배양배지를 제조한다.

┌─────┬──────────┬────┬────────┐

│Stock명   │영양소              │투입량  │비고            │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock I   │Na2-glycerophosphate│1.00 g  │증류수 970 mL   │

│          │NaNO3               │7.00 g  │(Autoclave)     │

│          │Tris HCl            │8.14 g  │                │

│          │Tris Base           │1.86 g  │                │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock II  │KI                  │2.50 mg │증류수 10 mL    │

│          │                    │        │(Autoclave)     │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock III │Vitamin B12         │1.00 mg │증류수 100 mL   │

│          │Thiamin             │50.00 mg│(Filter-sterize)│

│          │Biotin              │0.50 mg │                │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│Stock Ⅳ  │Fe(NH4)2(SO4)·6H2O │1.40 g  │증류수 2,000 mL │

│          │Na2-EDTA            │1.32 g  │(Autoclave)     │

├─────┼──────────┼────┼────────┤

│StockⅤ   │Boric acid          │2.24 g  │증류수 2,000 mL │

│          │F2Cl3·6H2O         │0.096 g │(Autoclave)     │

│          │MnSO4               │0.24 g  │                │

│          │ZnSO4·7H2O         │0.044 g │                │

│          │CoSO4·7H2O         │0.0096 g│                │

│          │Na2-EDTA            │2.00 g  │                │

└─────┴──────────┴────┴────────┘

5. 시험방법 

5.1  시험조건

시험생물의 발아율 및 아포체 성장률 시험조건은 표 2와 같다.

표 2. 미역 발아율 및 아포체 성장률 시험조건

┌───────┬─────────────────────────┐

│항 목         │시 험 조 건                                       │

├───────┼─────────────────────────┤

│시험방법      │교환식                                            │

│              │                                                  │

│시험생물      │Undaria pinnatifida                               │

│              │                                                  │

│시험기간      │72시간(발아율) 또는 21일(아포체 성장률)           │

│              │                                                  │

│수온          │20.0 ± 0.5℃                                     │

│              │                                                  │

│염분          │30.0 ± 1.0                                       │

│              │                                                  │

│pH            │8.0 ± 0.5                                        │

│              │                                                  │

│산소          │주입하지 않음                                     │

│              │                                                  │

│광주기        │12 Light : 12 Dark                                │

│              │                                                  │

│광량          │3,000 lux                                         │

│              │                                                  │

│시험용기      │25 mL petri dish                                  │

│              │                                                  │

│시험농도      │6구간 이상(대조구 포함)                           │

│              │                                                  │

│배양해수      │PESI 배지                                         │

│              │                                                  │

│시험용액      │48시간 마다 시험수 교환                           │

│              │                                                  │

│시험용액 부피 │20 mL                                             │

│              │                                                  │

│조사항목      │발아율과 아포체 성장률                            │

│              │                                                  │

│시험반복수    │3개 이상                                          │

│              │                                                  │

│종말점        │발아율(%) 및 반수영향농도(EC50)                   │

│              │                                                  │

│시험적합도    │발아율 시험은 대조구의 발아율이 90 % 이상, 아포체 │

│              │성장률 시험은 대조구 아포체 길이의 평균이 300 μm │

│              │이상                                              │

└───────┴─────────────────────────┘

5.2  시험용액 및 시험농도

5.2.1  시험용액

시험용액은 일련의 방법에 따라 준비한다. 시험물질에 따라 배양액에 직접 희석하거나 유기용매와 분산제를 첨가하기도 하며, 시험물질의 입수경로를 포함하여 보관 장소 및 조제에 따른 계산까지 자세히 기록한다. 일반적으로 시험은 pH를 조절하지 않고 수행하지만, 극단적인 산성이나 알칼리성 물질인 경우는 염산이나 수산화나트륨을 등을 사용하여 pH를 조절한다.

5.2.2  시험농도

시험물질의 농도는 보통 기하학적인 순열을 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0의 비율이 되게 한다. 시험물질의 농도는 10 % 이하와 90 % 이상의 범위에서 최소 5구간 이상을 두어야 한다. 이때, 시험농도는 반드시 사망 및 성장 저해가 나타나는 구간을 포함 하고, 시험농도의 범위는 예비시험을 통하여 넓은 범위의 구간을 포함하는 것이 바람직하다. 최고 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도를 재조정할 필요가 없지만, 최저 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도 구간을 재설정 한다.

5.2.3  대조구

모든 시험은 시험대상 물질이 제외된 시험조건 및 시험과정이 동일한 대조구가 반드시 필요하다. 이때, 시험물질에 따라 운반체(carrier)가 쓰일 경우에는 운반체만이 첨가된 운반체 대조구가 필요하다.

5.3  유주자 방출 유도

5.3.1  성숙한 미역귀의 깨끗한 부분을 잘라내어 멸균 해수로 세척하고, 붓으로 이물질을 제거한다. 세척된 미역귀 조각을 신문지 또는 거즈로 감싸 물기를 제거하여 건조 스트레스를 준다. 12 ∼ 24시간 음건한 미역을 18 °C의 멸균 해수에 넣고 막대로 약하게 저어 유주자 방출을 유도한다. 3분 후 현미경으로 유주자를 관찰하고 시험에 사용한다.

5.3.2  트레이에 필요한 만큼의 커버글라스를 겹치지 않게 두고 방출된 유주자를 넣은 후 60분 정도 방치하여 커버글라스에 유주자가 부착되도록 한다. 60분 이후 현미경으로 유주자가 잘 부착되었는지 확인한다. 유주자는 유리 표면에도 부착할 수 있을 정도로 부착력이 있지만, 부착이 잘되지 않을 경우 부착이 쉽도록 커버글라스에 미세한 흠집을 낼 수 있다.

5.4  미역 발아율 시험

5.4.1  위 5.3.2의 유주자가 부착되어 있는 커버글라스를 사용한다.

5.4.2  Petri dish에 시험수 20 mL씩 분주하고 각 시험수에는 영양배지를 20 mL/L의 농도로 첨가하여 20.0 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등 비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상은 반복구를 둔다.

5.4.3  미리 보관된 각 petri dish에 유주자가 부착된 커버글라스를 넣고 뚜껑을 덮어 파라 필름으로 밀봉한 뒤, 온도는 20.0 ± 1.0 °C, 광량은 3,000 lux, 광주기는 12 light : 12 dark의 항온배양기에서 72시간 배양한다.

5.4.4  72시간 후, 3 % 포르말린 용액으로 고정시키고 100 개체를 무작위로 관찰하여 현미경으로 발아한 유주자와 발아하지 않은 유주자를 계수하여 발아율을 계산한다. 실험은 농도별로 3회 반복 실시하며 48시간마다 시험수를 교체한다.

5.5  미역 아포체 성장률

5.5.1  위 5.3.2의 유주자가 부착되어 있는 커버글라스를 사용한다.

5.5.2  Petri dish에 시험수 20 mL씩 분주하고 각 시험수에는 영양배지를 20 mL/L의 농도로 첨가하여 20.0 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등 비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상은 반복구를 둔다. 또한 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.5.3  미리 보관된 각 petri dish에 유주자가 부착된 커버글라스를 넣고 뚜껑을 덮어 파라 필름으로 밀봉한 뒤, 온도는 20.0 ± 0.5 °C, 광량은 3,000 lux, 광주기는 12 light : 12 dark의 항온배양기에서 21일 동안 배양한다.

5.5.4  21일 후, 3 % 포르말린 용액으로 고정시키고 20 개체를 무작위로 관찰하여 아포체의 길이를 마이크로미터 또는 이미지분석 장치를 사용하여 측정한다. 실험은 농도별로 3회 반복 실시하며 48시간마다 시험수를 교체한다.

6. 결과

6.1  자료분석

6.1.1  발아율 및 아포체 성장률을 구하기 위해서는 발아율을 계수한 자료와 아포체 길이를 측정한 자료가 필요하다. 현미경을 통해 계수한 결과를 발아율과 아포체 성장률 계산에 이용한다.

6.1.2  결과의 표시는 다음과 같다. 생존율과 개체군 성장률을 이용하여 반수영향농도(EC50), 무영향농도(NOEC) 및 최소영향농도(LOEC)를 구하고, 노출 시간을 정확히 표시 한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 보통 리터당 밀리그램 단위인 경우, 유효숫자 2자리까지 표시한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 일정한 조건에서 수행된 시험으로부터 도출되는 독성학적 자료이며, 이 결과는 어떤 물질이 생물에 미치는 위해성을 파악할 수는 있지만 자연 상태에서 동일한 영향을 예측하기 위한 목적으로 사용하기에는 실험적 조건이라는 한계가 있다.

6.2  결과계산

6.2.1  발아율의 계산: 각 시험구당 발아율을 아래 백분율 식에 의해 계산한다.

                        (식 1)

a: 정상 발아한 유주자

b: 발아하지 않은 유주자

이때, 대조구의 발아율은 최소 90 % 이상이 되어야 유효하며, 발아는 현미경 상에서 발아관의 생성 유ㆍ무에 따라 판단한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.2.2  아포체 성장률(r)의 계산: 각 시험구당 아포체 성장률은 마이크로미터 또는 이미지 분석장치를 통해 측정된 값을 사용한다. 이때, 대조구의 아포체 길이가 평균 300.0 μm 이상 되어야 유효하다. 아포체 길이는 현미경으로 관찰되는 아포체의 중심에 가까운 가장 긴 길이를 측정하며, μm 단위로 표기한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.3  통계처리

6.3.1  반수영향농도(EC50)는 프로빗(Probit)법 또는 Trimmed Spearman Karber(TSK)법을 사용하여 95 %의 신뢰구간에서 구한다.

6.3.2  프로빗법은 1 ∼ 99 % 사이의 데이터가 1개 이하인 경우, TSK법은 2개 이상인 경우에 사용할 수 있다.

6.3.3  분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.4  결과보고

6.4.1  결과보고에는 모든 기초자료뿐만 아니라 시험결과까지 기록한다.

6.4.2  시험생물의 정보: 입수 출처와 사육방법 및 생활사 단계 등을 기록한다.

6.4.3  시험물질의 정보: 구입 위치, 순도, CAS 번호, 생산자의 로트(lot) 번호. 배출수인 경우에는 채집 위치, 채집 방법, 보관 시간, 방법 및 상태 등을 기록한다.

6.4.4  시험환경: 시험개시 및 종료시 수온, pH, 용존산소량 및 조도 등을 기록한다.

6.4.5  희석수: 희석수의 종류, 용매의 종류 및 이들의 농도를 기록한다.

6.4.6  종말점: 72시간 발아율, 21일 아포체 성장률 및 95 % 신뢰구간(95 % CI) 등을 기록하고, 이들의 통계처리 방법을 기록한다.

6.4.7  결과를 보증하는 자료로써 대조구의 발아율, 아포체 성장률(r)에 대해 가장 최근에 수행된 표준독성물질 시험결과를 첨부한다.

6.4.8  본 시험법에 언급되지 않은 내용 및 문제는 US EPA(US Enviro nmental Protection Agency), ASTM(American Society for Testing and Materials)의 표준법(ASTM, 1991) 및 APHA(American Public Health Association)의 표준법(APHA, 1998) 등을 참고한다.

6.5  유효성 판정 

본시험은 다음과 같은 경우, 일반적으로 그 결과를 인정할 수 없다.

6.5.1  발아율 시험에서 대조구의 발아율이 90 % 미만인 경우

6.5.2  아포체 성장률 시험에서 대조구의 아포체 길이 성장이 300.0 μm 미만인 경우

6.5.3  시험 용기의 크기나 재질이 동일하지 않은 경우

6.5.4  필요한 희석수나 용매 대조구가 시험에 포함되지 않은 경우

6.5.5  시험생물이 무작위로 배당되지 않은 경우

6.5.6  수온, 염분, pH, 용존산소량 및 조도 등의 시험조건이 명시되지 않은 경우

7. 참고사항

7.1  본 시험법은 산소요구량이 많은 물질, 휘발성 물질, 생물 및 화학적 변화가 급격히 발생하거나 시험 용기 등에 흡착이 쉬운 물질에는 적합하지 않다.

7.2  시험농도는 50 % 이하의 생존율 및 개체군 성장률이 발생하는 농도를 최고 농도로 설정하며, 그 이하 농도를 등비율로 조정한다. 예를 들면, 시험농도는 기하학적인 순열에 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0 사이가 되게 한다. 즉, 시험농도가 0, 2, 4, 8, 16 및 32 mg/L 혹은 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 및 100.0 %로 조정한다.

7.3  시험물질의 농도를 조정하기 위한 예비시험은 본 시험과 같은 반복구를 두지 않고 넓은 범위로 수행 가능하다.

7.4  발아율 시험은 대조구의 발아율이 반드시 90 %이상 나타나야 하며, 아포체 성장률은 대조구의 아포체 길이가 반드시 300.0 μm 이상인 경우에 유효하다. 이는 결과로 인정할 수 있는 최소한의 값이며, 이 값보다 낮은 경우, 희석수, 먹이 및 시험생물의 건강도 등을 검토하여 재시험한다.

7.5  시료의 오염

7.5.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 염소계 산화제와의 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 시안 분자구조를 분해시킨다.

7.5.2  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 알데히드(Aldehyde) 계열의 화합물과의 접촉을 피한다. 알데히드와의 반응을 통해 시안화물이 시아노히드린(Cyanohydrin)으로 변화된다.

7.6  용어정리

7.6.1  반수영향농도(50 % Effective Concentration, EC50): 시험생물의 개체군 성장률이 50 % 저해된 농도

7.6.2  무영향농도(No Observed Effect Concentration, NOEC): 시험생물에게 영향을 미치지 않는 농도

7.6.3  최소영향농도(Lowest Observed Effect Concentration, LOEC): 시험생물에게 영향을 미치는 최소 농도

제23항 해산 로티퍼(Brachionus  plicatilis)를 이용한 해양생태독성 시험방법

1. 측정원리

본 시험법은 해양생태계의 1차 소비자인 해산 로티퍼를 이용한 독성 시험방법으로써, 유해 물질이 해양생태계 내 해산 로티퍼에게 미치는 영향을 파악하는 데 그 목적이 있다. 시험생물은 해산 로티퍼(Brachionus plicatilis)이며, 이 시험법은 해산 로티퍼의 생존률 및 개체군 성장률을 이용하여 유해 물질의 독성을 검증하는 방법으로 해양환경을 판단하는 기준으로 사용된다. 단일 물질이나 혼합물, 상업용 제품 등 대부분의 화학물질에 적용할 수 있고 고체 상태의 물질은 추출 및 용출을 통하여 사용 가능하나, 산소요구량이 많은 물질, 휘발성이 강한 물질 및 생물학적 또는 화학적 변화를 급격하게 일으키는 물질 등을 시험하기에는 적당하지 않다.

2. 시험생물

2.1  시험생물은 해산 로티퍼인 Brachionus plicatilis(이하 B. plicatilis)이다.

2.2  B. plicatilis는 크기가 0.1 ∼ 0.21 mm로 난원형 혹은 구형이며, 주로 온대 및 아열대 지방에 분포하며, 하구 등을 포함하는 기수 지역에도 분포한다. 로티퍼는 광염성으로 배양이 용이하며, 세대기간이 짧고 높은 번식력을 가지고 있으며, 유해 물질에 대해 민감한 종으로 공시생물의 장점을 가지고 있다.

2.3  B. plicatilis는 단성생식과 유성생식 두 가지 형태의 세대를 가지고 있다. 로티퍼의 암컷에는 두 종류가 있는데 개체군의 증식을 목적으로 한 amictic female과 생식세포의 감수분열을 통하여 양성 생식을 하는 mictic female이 있다. 단성생식은 amictic female이 수컷 없이 다음 세대를 생산하게 되며, 서식 환경이 악화되어 생존에 위협을 받게 되면 수컷을 생산하여 mictic female과 내구란을 만들어 환경변화에 대처한다. 그러나, 일부의 담수산 로티퍼에서는 암컷 1개체가 단성생식 및 양성생식이 동시에 가능한 경우가 보고되었으며, amphoteric female이라 부른다. 본 시험의 개체군 성장률은 amictic female을 이용하여 개체군 증가를 관찰하기 때문에 B. plicatilis의 환경 조건을 일정하게 유지하여 양성생식 과정이 진행되지 않도록 한다.

2.4  본 시험생물종(strain)은 국립수산과학원 서해수산연구소 해양위해평가센터 및 강릉대학교 먹이생물연구실에서 구할 수 있다. 시험 먹이생물인 해산 Chlorella (Chlorella vulgaris)는 국립수산과학원 서해수산연구소 및 해양시료도서관에서 구할 수 있다. 시험생물은 시험 시작 전에 적어도 두 번의 계대배양(2개월)을  하며, 입수 출처와 사육 방법이 모두 동일 한다.

3. 기구 및 기기

3.1  해부현미경

3.2  고압멸균기

3.3  항온배양기

3.4  수질측정기(염분, 수온, pH, DO)

3.5  초순수제조기

3.6  24-well plate

3.7  미세파이펫

3.8  Petri dish

3.9  Sieve(? 125 μm)

4. 시험 준비

4.1  시험생물 사육

4.1.1  시험생물은 계대배양을 통해 일정한 연령 및 크기의 개체만을 선별하여 사용한다. 시험생물의 계대배양은 2 L의 유리병을 사용하여 염분 30.0 ± 1.0의 인공해수(Synthetic seawater, ISO 10253:2006(E)) 또는 자연해수를 0.45 μm의 membrane 필터 이후 멸균하여 1 L를 사용한다(표 1). 이때, 수온은 25.0 ± 1.0 °C, 광 조건은 500 ∼ 2,000 Lux를 연속적으로 유지한다. 먹이는 C. vulgaris를 하루에 한번 충분히 공급하며, 배양액은 주 1회 전량 교환한다.

표 1. 인공해수의 조성

┌─────────┬──────┐

│항 목             │첨가량(g/L) │

├─────────┼──────┤

│NaCl              │22.0        │

│                  │            │

│MgCl2ㆍ6H2O       │9.7         │

│                  │            │

│Na2SO4(anhydrous) │3.7         │

│                  │            │

│CaCl2(anhydrous)  │1.0         │

│                  │            │

│KCl               │0.65        │

│                  │            │

│NaHCO3            │0.20        │

│                  │            │

│H3BO3             │0.023       │

└─────────┴──────┘

4.1.2  생존율 및 개체군 성장률 시험은 부화 후 2시간 이내의 신생 개체(neonate)를 사용한다. 즉, 시험생물은 시험 개시 2시간 전에 포란한 성체만 분리한 다음, 2시간 동안 배양하여 새로 부화된 2시간 이내 신생 개체를 사용한다.

5. 시험방법

5.1  시험조건

시험생물의 사망률 및 개체군 성장 저해율의 시험조건은 표 2와 같다.

┌─────────┬──────────────────────────┐

│항 목             │시 험 조 건                                         │

├─────────┼──────────────────────────┤

│시험방법          │지수식 또는 비교환방식                              │

│                  │                                                    │

│시험생물          │Brachionus plicatilis                               │

│                  │                                                    │

│시험기간          │24시간(생존율) 또는 72시간(개체군 성장률)           │

│                  │                                                    │

│수온              │25.0 ± 1.0 °C                                     │

│                  │                                                    │

│염분              │30.0 ± 1.0                                         │

│                  │                                                    │

│pH                │8.0 ± 0.5                                          │

│                  │                                                    │

│산소              │주입하지 않음                                       │

│                  │                                                    │

│광주기            │암조건                                              │

│                  │                                                    │

│시험용기          │24-well plate                                       │

│                  │                                                    │

│시험농도          │6구간 이상(대조구 포함)                             │

│                  │                                                    │

│배양해수          │인공해수 또는 여과(0.45 μm membrane filter)하여    │

│                  │멸균한 자연해수                                     │

│                  │                                                    │

│시험용액          │교환하지 않음                                       │

│                  │                                                    │

│시험용액 부피     │1.0  mL                                             │

│                  │                                                    │

│먹이생물          │Chlorella vulgaris                                  │

│                  │                                                    │

│먹이공급          │사망률 시험은 먹이를 공급하지 않으며, 개체군 성장률 │

│                  │시험은 시험 시작시 200만 cells/ mL를 공급함         │

│                  │                                                    │

│농도별 시험동물 수│5 개체 / well                                       │

│                  │                                                    │

│시험 동물         │부화 2시간 이내 신생개체(nenonate)                  │

│                  │                                                    │

│시험반복수        │6개 이상                                            │

│                  │                                                    │

│종말점            │생존율(%) 및 반수영향농도(EC50)                     │

│                  │                                                    │

│시험적합도        │생존율 시험은 대조구의 생존율이 90 % 이상, 개체군   │

│                  │성장률 시험은 대조구의 개체군 성장률(r)이 0.5 이상  │

└─────────┴──────────────────────────┘

5.2  시험용액 및 시험농도

5.2.1  시험용액

시험용액은 일련의 방법에 따라 준비한다. 시험물질에 따라 배양액에 직접 희석하거나 유기용매와 분산제를 첨가하기도 하며, 시험물질의 입수경로를 포함하여 보관 장소 및 조제에 따른 계산까지 자세히 기록한다. 일반적으로 시험은 pH를 조절하지 않고 수행하지만, 극단적인 산성이나 알칼리성 물질인 경우는 염산이나 수산화나트륨을 등을 사용하여 pH를 조절한다.

5.2.2  시험농도

시험물질의 농도는 보통 기하학적인 순열을 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0의 비율이 되게 한다. 시험물질의 농도는 10 % 이하와 90 % 이상의 범위에서 최소 5구간 이상을 두어야 한다. 이때, 시험농도는 반드시 사망 및 성장 저해가 나타나는 구간을 포함 하고, 시험농도의 범위는 예비시험을 통하여 넓은 범위의 구간을 포함하는 것이 바람직하다. 최고 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도를 재조정할 필요가 없지만, 최저 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도 구간을 재설정 한다.

5.2.3  대조구

모든 시험은 시험대상 물질이 제외된 시험조건 및 시험과정이 동일한 대조구가 반드시 필요하다. 이때, 시험물질에 따라 운반체(carrier)가 쓰일 경우에는 운반체만이 첨가된 운반체 대조구가 필요하다.

5.3  생존율 시험

5.3.1  시험 1 ∼ 2일 전에 시험생물의 먹이를 충분히 공급하며, 시험생물의 상태를 확인한다.

5.3.2  시험 시작 2시간 전에 포란한 성체를 배양액과 같은 해수에 분리하고 2시간 방치하여 새로운 신생 개체가 부화할 수 있도록 유도한다. 그리고, 시험용액은 24 well plate에 1 mL씩 분주하여 25.0 ± 1.0 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 6개 이상의 반복구를 둔다.

5.3.3  준비된 신생 개체를 미세 파이펫을 이용하여 well plate의 각 well 당 5개체씩 넣는다. 시험에 사용되는 신생 개체는 부화 후 2시간 이내 일정한 크기를 사용하며, 운동성이 좋은 개체를 선별하여 사용한다. 또한, 미세 파이펫으로 이동시 신생 개체가 물리적인 손상을 받지 않도록 주의한다.

5.3.4  신생 개체의 개체수가 시험구별로 정확히 수용되었는지를 확인하고 이때의 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경 요인을 측정하여 기록한다.

5.3.5  신생 개체를 넣은 well plate를 25.0 ± 1.0 °C의 항온배양기에 24시간 암배양한다.

5.3.6  24시간 후에 현미경으로 관찰하여 생존한 개체수를 계수하고 생존율을 산출하여 기록하며, 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.4  개체군 성장률 시험

5.4.1  시험 1 ∼ 2일 전에 시험생물의 먹이를 충분히 공급하며, 시험생물의 상태를 확인한다.

5.4.2  시험 시작 2시간 전에 포란한 성체를 배양액과 같은 해수에 분리하고 2시간 방치하여 새로운 신생 개체가 부화할 수 있도록 유도한다.

5.4.3  시험용액에 먹이생물인 C. vulgaris를 각 well 당 200만 cell/mL을 주입하며, 시험용액의 농도 변동이 없도록 원심 분리(3,000 rpm, 5분) 후 cell만 분리하여 시험용액에 주입한다. C. vulgaris가 포함된 시험용액을 24-well plate에 1 mL씩 분주하여 25.0 ± 1.0 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 6개 이상의 반복구를 둔다.

5.4.4  신생 개체의 개체수가 시험구별로 정확히 수용되었는지를 확인하고 이때의 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.4.5  C. vulgaris와 신생 개체를 넣은 well plate를 25.0 ± 1.0 °C의 항온배양기에서 72시간 암배양한다.

5.4.6  72시간 후, 3 % 포르말린 용액으로 고정하고 현미경으로 모든 개체수를 계수하여 개체군 성장률을 산출한다. 그리고, 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

6. 결과

6.1  자료분석

6.1.1  생존율 및 개체군 성장률을 구하기 위해서는 생존 개체수를 계수한 자료와 개체군을 계수한 자료가 필요하다. 현미경을 통해 계수한 결과를 계산에 사용하게 된다.

6.1.2  결과의 표시는 다음과 같다. 생존율과 개체군 성장률을 이용하여 반수영향농도(EC50), 무영향농도(NOEC) 및 최소영향농도(LOEC)를 구하고, 노출 시간을 정확히 표시 한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 보통 리터당 밀리그램 단위인 경우, 유효숫자 2자리까지 표시한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 일정한 조건에서 수행된 시험으로부터 도출되는 독성학적 자료이며, 이 결과는 어떤 물질이 생물에 미치는 위해성을 파악할 수는 있지만, 자연 상태에서 동일한 영향을 예측하기 위한 목적으로 사용하기에는 실험적 조건이라는 한계가 있다.

6.2  결과계산

6.2.1  생존율의 계산: 각 시험구당 생존율을 아래 백분율식에 의해 계산한다.

                          (식 1)

a: 생존한 개체수

이때, 대조구의 생존율은 최소 90 % 이상이 되어야 유효하며, 생존은 현미경 상에서 개체의 운동성 및 내부 기관의 활성화 유ㆍ무에 따라 판단한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.2.2  개체군 성장률(r)의 계산: 각 시험구당 개체군 성장률(r)을 아래와 같은 식에 의해 계산한다.

                              (식 2)

T: 시험기간

Nt: 시험 종료 때 전체 개체수

N0: 시험 개시 때 전체 개체수

이때, 대조구의 개체군 성장률은 최소 0.5 이상이 되어야 유효하며, 개체군은 현미경상에서 관찰되는 시험구 내 모든 개체를 포함한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.2.3  성장 저해율(I)의 계산: 각 시험구와 대조구의 개체군 성장률 평균값을 이용하여 성장 저해율을 아래와 같은 식에 의해 계산한다.

                            (식 3)

  : 시험 농도 i에 대한 저해 백분율

: 시험 농도 i에 대한 평균 성장률

: 대조구의 평균 성장률 

6.3  통계처리

6.3.1  반수영향농도(EC50)는 프로빗(Probit)법 또는 Trimmed Spearman Karber(TSK)법을 사용하여 95 %의 신뢰구간에서 구한다.

6.3.2  프로빗법은 1 ∼ 99 % 사이의 데이터가 1개 이하인 경우, TSK법은 2개 이상인 경우에 사용할 수 있다.

6.3.3  분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.4  결과보고

6.4.1  결과보고에는 모든 기초자료뿐만 아니라 시험결과까지 기록한다.

6.4.2  시험생물의 정보: 입수 출처와 사육방법 및 생활사 단계 등을 기록한다.

6.4.3  시험물질의 정보: 구입 위치, 순도, CAS 번호, 생산자의 로트(lot) 번호. 배출수인 경우에는 채집 위치, 채집 방법, 보관 시간, 방법 및 상태 등을 기록한다.

6.4.4  시험환경: 시험개시 및 종료시 수온, pH, 용존산소량 및 조도 등을 기록한다.

6.4.5  희석수: 희석수의 종류, 용매의 종류 및 이들의 농도를 기록한다.

6.4.6  종말점: 24시간 생존율 및 72시간 반수영향농도 및 95 % 신뢰구간(95 % CI) 등을 기록하고, 이들의 통계처리 방법을 기록한다.

6.4.7  결과를 보증하는 자료로써 대조구의 생존 백분율, 개체군 성장률(r)에 대해 가장 최근에 수행된 표준독성물질을 사용한 시험결과를 첨부한다.

6.4.8  본 시험법에 언급되지 않은 내용 및 문제는 US EPA(US Enviro nmental Protection Agency), ASTM(American Society for Testing and Materials)의 표준법(ASTM, 1991) 및 APHA(American Public Health Association)의 표준법(APHA, 1998) 등을 참고한다.

6.5  유효성 판정

본시험은 다음과 같은 경우, 일반적으로 그 결과를 인정할 수 없다.

6.5.1  생존율 시험에서 대조구의 생존율이 90 % 미만인 경우

6.5.2  개체군 성장률 시험에서 대조구의 개체군 성장률이 0.5 미만인 경우

6.5.3  시험 용기의 크기나 재질이 동일하지 않은 경우

6.5.4  필요한 희석수나 용매 대조구가 시험에 포함되지 않은 경우

6.5.5  시험생물이 무작위로 배당되지 않은 경우

6.5.6  수온, 염분, pH, 용존산소량 및 조도 등의 시험조건이 명시되지 않은 경우

7. 참고사항

7.1  본 시험법은 산소요구량이 많은 물질, 휘발성 물질, 생물 및 화학적 변화가 급격히 발생하거나 시험 용기 등에 흡착이 쉬운 물질에는 적합하지 않다.

7.2  시험생물은 25.0 ± 1.0 °C에서 계대배양을  하고, 부화한 지 2시간 이내의 신생 개체를 사용해야 시험 오차가 작다.

7.3  C. vulagris는 수온 25 °C에서 3,000 rpm(800 g)으로 원심분리하여 농축한다.

7.4  시험생물의 신생 개체를 시험용기에 수용할 경우에, 설정 시험농도가 변동될 가능성이 있으므로 시험농도가 최대한 희석되지 않도록 주의한다.

7.5  시험농도는 50 % 이하의 생존율 및 개체군 성장률이 발생하는 농도를 최고 농도로 설정하며, 그 이하 농도를 등비율로 조정한다. 예를 들면, 시험농도는 기하학적인 순열에 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0 사이가 되게 한다. 즉, 시험농도가 0, 2, 4, 8, 16 및 32 mg/L 혹은 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 및 100.0 %로 조정한다.

7.6  개체군 성장률 시험에서 수온이 25.0 ± 1.0 °C 이하인 경우, 72시간 후의 개체군 성장률이 낮아지기 때문에 수온을 25.0 ± 1.0 °C로 유지 한다.

7.7  시험물질의 농도를 조정하기 위한 예비시험은 본 시험과 같은 시험의 반복구를 두지 않고 넓은 범위로 수행 가능하다.

7.8  생존율 시험은 대조구의 생존율이 반드시 90 % 이상 나타나야 하며, 개체군 성장률 시험은 대조구의 개체군 성장률이 반드시 0.5 이상인 경우에 유효하다. 이는 결과로 인정할 수 있는 최소한의 값이며, 이 값보다 낮은 경우, 희석수, 먹이 및 시험생물의 건강도 등을 검토하여 재시험한다.

7.9  시험생물의 먹이인 C. vulgaris의 품질이 낮은 경우, 정상적인 개체군 성장을 하지 않기 때문에 관리에 주의하도록 한다.

7.10  시료의 오염

7.10.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 염소계 산화제와의 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 시안 분자구조를 분해시킨다.

7.10.2  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 알데히드(Aldehyde) 계열의 화합물과의 접촉을 피한다. 알데히드와의 반응을 통해 시안화물이 시아노히드린(Cyanohydrin)으로 변화된다.

7.11  용어정리

7.11.1  반수영향농도(50 % Effective Concentration, EC50): 시험생물의 생존율 또는 개체군 성장률이 50 % 저해된 농도

7.11.2  무영향농도(No Observed Effect Concentration, NOEC): 시험생물에게 영향을 미치지 않는 농도

7.11.3  최소영향농도(Lowest Observed Effect Concentration, LOEC): 시험생물에게 영향을 미치는 최소의 농도

제24항 참굴(Crassostrea  gigas)을 이용한 해양생태독성 시험방법

1. 측정원리

본 시험법은 해양 이매패류인 참굴을 이용한 독성 시험방법으로, 유해 물질이 해양생태계 내 이매패류에게 미치는 영향을 파악하는 데 그 목적이 있다. 시험생물은 참굴(Crassostrea gigas)이며, 이 시험법은 참굴의 수정률 및 D형 발생률을 이용하여 해양환경을 판단하는 기준으로 사용된다. 단일 물질이나 혼합물, 상업용 제품 등 대부분의 화학 물질에 적용할 수 있고 고체 상태의 물질은 추출 및 용출을 통하여 사용 가능하나, 산소 요구량이 많은 물질, 휘발성이 강한 물질, 생물학적 또는 화학적 변화를 급격하게 일으키는 물질 등을 시험하기에는 적당하지 않다.

2. 시험생물 

2.1  시험생물은 이매패류 참굴 Crassostrea gigas(이하 C. gigas)이다.

2.2  참굴은 연체동물문으로 주로 조간대에서 많이 서식하지만, 바다 밑 5 ∼ 40 m 깊이의 진흙 바닥에 붙어 있는 것이 발견되기도 한다. 서식 환경에 따라 개체의 형태에 변화가 있는데, 조간대 부근에서는 작은 개체들이 살며 해역에 따라 가늘면서 길고 크게 자라는 것도 있다. 크기는 8 ∼ 15 cm이며, 몸의 빛깔은 흰색 껍데기에 보라색의 띠, 안쪽은 회백색이다.

2.3  암컷과 수컷의 성질이 한 몸에 들어있는 자웅동체로, 계절 또는 주위 환경에 따라 성별을 바꾼다. 산란 시기는 6 ∼ 8월이며, 산란은 주로 수온이 18 ∼ 24 °C 정도일 때 가능하며 수천만 개의 알을 낳는다. 유생 시기에는 물을 떠다니며 생활하다가 조금 더 자라면 성체기간 동안 붙어서 살만한 단단한 장소를 골라서 정착한다. 바닷물에 떠다니는 작은 부유생물들을 잡아먹고 살며, 대체로 환경에 대한 적응력이 강해서 널리 퍼져 서식한다. 하지만 서식지 주변이 오염되면, 굴은 오염물질을 몸 안에 축적하는 특징이 있기 때문에 오염이 지속되면 서식지가 파괴가 빠르게 나타난다. 우리나라를 비롯한 북태평양, 지중해 연안, 오스트레일리아 연안에 널리 분포한다.

3. 기구 및 기기 

3.1  현미경

3.2  고압멸균기

3.3  항온배양기

3.4  수질측정기(염분, 수온, pH, DO)

3.5  사육수조

3.6  6-well plate

3.7  포르말린(3 %)

3.8  Petri dish

3.9  Sieve(? 20 μm)

4. 시험준비

4.1  시험생물 사육

4.1.1  시험생물을 장기간 사육하려면 여과된 자연해수를 사용하는 것이 좋으며, 염분은 30.0 ± 1.0, 수온은 15.0 ± 1.0 °C 유수식으로 깨끗한 해수가 유입되도록 한다.

4.1.2  시험생물의 사육 기간에 수온이 증가하면 자연적인 방란ㆍ방정이 발생하므로 17.0 °C 이하의 일정한 수온이 유지되도록 주의한다.

4.1.3  사육기간 동안 먹이는 식물플랑크톤인 아이소크라이시스 갈바나(Isochrysis galbana)를 대량 배양하여 아침, 저녁으로 1일 2회 공급한다. 먹이 공급시, 사육 수조는 지수식으로 유지하여 충분히 먹이를 먹을 수 있도록 한다.

5. 시험방법

5.1  시험조건

시험생물의 수정률 및 D형 발생률 시험조건은 표 1과 같다.

표 1. 참굴 수정률 및 D형 발생률 시험조건

┌───────┬─────────────────────────┐

│항 목         │시 험 조 건                                       │

├───────┼─────────────────────────┤

│시험방법      │지수식 또는 비교환방식                            │

│              │                                                  │

│시험생물      │참굴(Crassostrea gigas)                           │

│              │                                                  │

│시험기간      │1시간(수정률)                                     │

│              │26시간 30분 ∼ 30시간(D형 발생률)                 │

│              │                                                  │

│수온          │25.0 ± 0.5 °C                                   │

│              │                                                  │

│염분          │30.0 ± 1.0                                       │

│              │                                                  │

│pH            │8.0 ± 0.5                                        │

│              │                                                  │

│산소          │주입하지 않음                                     │

│              │                                                  │

│광주기        │16 Light : 8 Dark                                 │

│              │                                                  │

│시험용기      │6-well plate                                      │

│              │                                                  │

│시험농도      │6구간 이상(대조구 포함)                           │

│              │                                                  │

│배양해수      │여과(0.45 μm membrane filter)하여 멸균한 자연해수│

│              │                                                  │

│시험용액      │교환하지 않음                                     │

│              │                                                  │

│시험용액 부피 │10 mL                                             │

│              │                                                  │

│시험반복수    │3개 이상                                          │

│              │                                                  │

│종말점        │수정률 및 반수영향농도(EC50)                      │

│              │                                                  │

│시험적합도    │수정률 시험은 대조구의 수정률이 80 % 이상         │

│              │D형 발생률은 대조구의 D형 발생률이 80 % 이상      │

└───────┴─────────────────────────┘

5.2  시험용액 및 시험농도

5.2.1  시험용액

시험용액은 일련의 방법에 따라 준비한다. 시험물질에 따라 배양액에 직접 희석하거나 유기용매와 분산제를 첨가하기도 하며, 시험물질의 입수경로를 포함하여 보관 장소 및 조제에 따른 계산까지 자세히 기록한다. 일반적으로 시험은 pH를 조절하지 않고 수행하지만, 극단적인 산성이나 알칼리성 물질인 경우는 염산이나 수산화나트륨을 등을 사용하여 pH를 조절한다.

5.2.2  시험농도

시험물질의 농도는 보통 기하학적인 순열을 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0의 비율이 되게 한다. 시험물질의 농도는 10 % 이하와 90 % 이상의 범위에서 최소 5구간 이상을 두어야 한다. 이때, 시험농도는 반드시 사망 및 성장 저해가 나타나는 구간을 포함 하고, 시험농도의 범위는 예비시험을 통하여 넓은 범위의 구간을 포함하는 것이 바람직하다. 최고 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도를 재조정할 필요가 없지만, 최저 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도 구간을 재설정 한다.

5.2.3  대조구

모든 시험은 시험대상 물질이 제외된 시험조건 및 시험과정이 동일한 대조구가 반드시 필요하다. 이때, 시험물질에 따라 운반체(carrier)가 쓰일 경우에는 운반체만이 첨가된 운반체 대조구가 필요하다.

5.3  정자와 난자 방출 유도

5.3.1  참굴을 여과 해수로 간단히 씻어낸 뒤, 절개법으로 정자와 난자를 받으므로 조심히 껍질을 분리한다.

5.3.2  커버글라스로 몸통의 생식소에 상처를 낸 후, 정자와 난자를 현미경으로 확인하여 해수를 담은 비커에 나누어 담아 정자와 난자 방출을 유도한다.

5.4  수정률 시험

5.4.1  위 5.3에서 방출 유도된 정자와 난자를 사용한다.

5.4.2.  6-well plate에 시험수 10 mL씩 분주하고 25 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상은 반복구를 둔다. 또한, 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.4.3  미리 보관된 6-well plate의 각 well 당 정자 100 μL를 넣어 30분 노출시킨다. 30분 후, 정자가 주입된 각 well 당 난자 100 ∼ 150개를 넣는다.

5.4.4  1시간 후, 대조구의 극체 방출 유ㆍ무를 확인하여 극체가 방출되었을 때 전체 시험구를 3 % 포르말린 용액으로 고정시키고, 극체가 방출된 정상 수정란을 계수하여 수정률을 산출한다.

5.5  D형 발생률 시험

5.5.1  위 5.3.에서 방출 유도된 난자에 정자를 섞어 수정시키고 1분 이내 20 μm sieve를 이용하여 거른 후에 난자만 수거한다. 거른 난자를 3회 여과 해수로 세척하여 남아 있는 정자를 제거한다.

5.5.2  6-well plate에 시험수 10 mL씩 분주하고 25 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다. 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상은 반복구를 둔다. 이때의 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.5.3  수정시킨 수정란은 1시간 경과 후 극체 방출 유ㆍ무를 확인한다. 정상 수정이 된 수정란을 6-well plate의 각 well 당 100 ∼ 150개씩 넣은 뒤, 온도는 25 ± 0.5 °C, 광주기는 8L : 16D로 항온배양기에서 26시간 30분 ∼ 30시간 배양한다.

5.5.4  최대 30시간 후, 3 % 포르말린 용액으로 고정하고 현미경으로 100 개체를 무작위로 관찰하여, 수정란이 정상 D형 유생 및 미발달 수정란의 개체수를 계수하여 정상 D형 유생 발생률을 산출한다.

6. 결과

6.1  자료분석

6.1.1  수정률 및 D형 발생률을 구하기 위해서는 참굴의 정상 수정란과 D형 유생을 계수한 자료가 필요하다. 현미경을 통해 계수한 결과를 수정률과 D형 발생률 계산에 이용한다.

6.1.2  결과의 표시는 다음과 같다. 수정률과 D형 발생률을 이용하여 반수영향농도(EC50), 무영향농도(NOEC) 및 최소영향농도(LOEC)를 구하고, 노출 시간을 정확히 표시 한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 보통 리터당 밀리그램 단위인 경우, 유효숫자 2자리까지 표시한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 일정한 조건에서 수행된 시험으로부터 도출되는 독성학적 자료이며, 이 결과는 어떤 물질이 생물에 미치는 위해성을 파악할 수는 있지만, 자연 상태에서 동일한 영향을 예측하기 위한 목적으로 사용하기에는 실험적 조건이라는 한계가 있다.

6.2  결과계산

6.2.1  수정률의 계산: 각 시험구당 수정률을 아래 백분율 식에 의해 계산한다.

                      (식 1)

a: 정상 수정란

b: 수정이 안된 난자

c: 비정상 수정란

이때, 대조구의 수정률은 최소 80 % 이상이 되어야 유효하다. 정상 수정은 현미경 상에서 수정란 표면에 작은 구형의 극체 방출이 관찰되었을 때 정상 수정이라고 판단하며, 극체 방출이 되지 않은 수정란을 비정상 수정란, 수정이 되지 않은 경우, 수정이 안된 난자라고 판단한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.2.2  D형 발생률의 계산: 각 시험구당 D형 발생률을 아래 백분율 식에 의해 계산한다.

                             (식 2)

d: 정상 D형 유생

e: 수정란

f: 비정상 D형 유생

이때, 대조구의 정상 D형 유생 발생률은 최소 80 % 이상이 되어야 유효하다. 정상 D형 발생은 ‘D’와 같은 모양으로 발생되었을 때 정상 D형 발생으로 판단하며, ‘D’와 같은 모양을 보이지 못하는 경우, 비정상 D형 유생, 발달하지 못하고 극체가 방출된 직후의 수정란의 모양으로 유지하는 경우에 수정란이라고 판단한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.3  통계처리

6.3.1  반수영향농도(EC50)는 프로빗(Probit)법 또는 Trimmed Spearman Karber(TSK)법을 사용하여 95 %의 신뢰구간에서 구한다.

6.3.2  프로빗법은 1 ∼ 99 % 사이의 데이터가 1개 이하인 경우, TSK법은 2개 이상인 경우에 사용할 수 있다.

6.3.3  분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.4  결과보고

6.4.1  결과보고에는 모든 기초자료뿐만 아니라 시험결과까지 기록한다.

6.4.2  시험생물의 정보: 입수 출처와 사육방법 및 생활사 단계 등을 기록한다.

6.4.3  시험물질의 정보: 구입 위치, 순도, CAS 번호, 생산자의 로트(lot) 번호. 배출수인 경우에는 채집 위치, 채집 방법, 보관 시간, 방법 및 상태 등을 기록한다.

6.4.4  시험환경: 시험개시 및 종료시 수온, pH, 용존산소량 및 조도 등을 기록한다.

6.4.5  희석수: 희석수의 종류, 용매의 종류 및 이들의 농도를 기록한다.

6.4.6  종말점: 1시간 수정률(%), 최대 30시간 반수영향농도(EC50) 및 95 % 신뢰구간(95 % CI) 등을 기록하고, 이들의 통계처리 방법을 기록한다.

6.4.7  결과를 보증하는 자료로써 대조구의 수정률, 정상 D형 발생률에 대해 가장 최근에 수행된 표준독성물질을 사용한 시험결과를 첨부한다.

6.4.8  본 시험법에 언급되지 않은 내용 및 문제는 US EPA(US Enviro nmental Protection Agency), ASTM(American Society for Testing and Materials)의 표준법(ASTM, 1991) 및 APHA(American Public Health Association)의 표준법(APHA, 1998) 등을 참고한다.

6.5  유효성 판정

본시험은 다음과 같은 경우, 일반적으로 그 결과를 인정할 수 없다.

6.5.1  수정률 시험에서 대조구의 수정률이 80 % 미만인 경우

6.5.2  정상 D형 발생률 시험에서 대조구의 정상 D형 발생률이 80 % 미만인 경우

6.5.3  시험 용기의 크기나 재질이 동일하지 않은 경우

6.5.4  필요한 희석수나 용매 대조구가 시험에 포함되지 않은 경우

6.5.5  시험생물이 무작위로 배당되지 않은 경우

6.5.6  수온, 염분, pH, 용존 산소량 및 조도 등의 시험 조건이 명시되지 않은 경우

7. 참고사항

7.1  본 시험법은 산소요구량이 많은 물질, 휘발성 물질, 생물 및 화학적 변화가 급격히 발생하거나 시험 용기 등에 흡착이 쉬운 물질에는 적합하지 않다.

7.2  시험농도는 50 % 이하의 생존율 및 개체군 성장률이 발생하는 농도를 최고 농도로 설정하며, 그 이하 농도를 등비율로 조정한다. 예를 들면, 시험농도는 기하학적인 순열에 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0 사이가 되게 한다. 즉, 시험농도가 0, 2, 4, 8, 16 및 32 mg/L 혹은 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 및 100.0 %로 조정한다.

7.3  시험물질의 농도를 조정하기 위한 예비시험은 본 시험과 같은 반복구를 두지 않고 넓은 범위로 수행해도 된다.

7.4  수정률 시험은 대조구의 수정률이 반드시 80 % 이상 나타나야 하며, 정상 D형 발생률 시험은 대조구의 정상 D형 발생률이 반드시 80 % 이상인 경우에 유효하다. 이는 결과로 인정할 수 있는 최소한의 값이며, 이 값보다 낮은 경우, 희석수, 먹이 및 시험생물의 건강도 등을 검토하여 재시험한다.

7.5  시료의 오염

7.5.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 염소계 산화제와의 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 시안 분자구조를 분해시킨다.

7.5.2  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 알데히드(Aldehyde) 계열의 화합물과의 접촉을 피한다. 알데히드와의 반응을 통해 시안화물이 시아노히드린(Cyanohydrin)으로 변화된다.

7.6  용어정리

7.6.1  반수영향농도(50 % Effective Concentration, EC50): 시험생물의 개체군 성장률이 50 % 저해된 농도

7.6.2  무영향농도(No Observed Effect Concentration, NOEC): 시험생물에게 영향을 미치지 않는 농도

7.6.3  최소영향농도(Lowest Observed Effect Concentration, LOEC): 시험생물에게 영향을 미치는 최소 농도

제25항 성게(Hemicentrotus  pulcherrimus)를 이용한 해양생태독성 시험방법

1. 측정원리

본 시험법은 해양 무척추동물인 성게를 이용한 독성 시험방법으로 유해 물질이 해양생태계 내 무척추동물에게 미치는 영향을 파악하는 데 그 목적이 있다. 시험생물은 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)이며 산란 시기에 따라 둥근성게(Strongylocentrotus nudus)를 대신 이용할 수 있다. 이 시험법은 성게의 수정률 또는 정상 유생 발생률을 이용하여 유해 물질의 독성을 검증하는 방법으로 해양 환경을 판단하는 기준으로 사용된다. 단일 물질이나 혼합물, 상업용 제품 등 대부분의 화학 물질에 적용할 수 있고 고체상태의 물질은 추출 및 용출을 통하여 사용 가능하나, 산소 요구량이 많은 물질, 휘발성이 강한 물질, 생물학적 또는 화학적 변화를 급격하게 일으키는 물질 등을 시험하기에는 적당하지 않다.

2. 시험생물

2.1  시험생물은 무척추동물인 말똥성게 Hemicentrotus pulcherrimus(이하 H. pulcherrimus)와 둥근성게 Strongylocentrotus nudus(이하 S. nudus)이다.

2.2  H. pulcherrimus는 극피동물문 성게목 둥근성게과 생물로 조간대의 바위가 많은 곳에서 돌 밑이나 틈에 서식한다. 몸은 둥글고 가시가 많이 나 있다. 몸통은 지름 2 ∼ 5.5 cm, 높이는 1 ∼ 3 cm이며, 위아래가 다소 넓고 가시가 짧아서 말똥처럼 보인다. 가시를 포함한 몸통은 전체적으로 짙은 녹갈색 또는 황갈색을 띠며 가시 길이는 1 cm 전후이고 끝이 다소 뭉툭하며 몸통 표면 전체에 조밀하게 형성되어 있다. 산란 시기는 3 ∼ 4월이고 생식선은 오렌지색이다. 한국ㆍ일본ㆍ중국 등지에 널리 분포한다.

2.3  S. nudus는 극피동물문 성게목 둥근성게과 생물로 수심 5 m 이상의 암반 및 조하대의 수중 암초 주변에 서식한다. 몸통은 7 cm 이상인 대형 성게이며, 가시 길이가 2 cm 이상으로 가시를 포함한 전체 모습이 둥글다. 전체적으로 적갈색이나 흑갈색을 띠고 산란 시기는 7 ∼ 8월이며 우리나라 전 연안에 널리 분포한다.

2.4  본 시험생물종(strain)은 국내 전 연안의 조간대 암반 지역에서 채집 가능하다. 채집된 시험생물은 자연채광 상태에서 유수식으로 순치시켜 시험에 사용한다.

3. 기구 및 기기

3.1  현미경

3.2  고압멸균기

3.3  항온배양기

3.4  수질측정기(염분, 수온, pH, DO)

3.5  초순수제조기

3.6  사육수조

3.7  6-well plate

3.8  포르말린(3 %)

4. 시험준비

4.1  시험생물 사육

4.1.1  시험생물을 장기간 사육하려면 여과된 자연해수를 사용하는 것이 좋으며, 자연채광 아래 염분은 30.0 ± 1.0, 수온은 9.0 ± 1.0 °C 유수식으로 깨끗한 해수가 유입되도록 한다.

4.1.2  시험생물의 사육 기간에 수온이 증가하면 자연적인 방란ㆍ방정이 발생하므로 15.0 °C 이하의 일정한 수온이 유지되도록 주의한다.

4.1.3  사육기간 동안 먹이는 성게 채집지역에서 자생하는 해조류를 채집하여 공급한다. 부득이한 경우, 시중에 유통되는 건미역을 먹이로 공급할 수 있다.

5. 시험방법

5.1  시험조건 

시험생물의 수정률 및 정상유생 발생률 시험조건은 표 1과 같다.

표 1. 성게 수정률 및 정상유생 발생률 시험조건

┌────────┬──────────────────────────┐

│항 목           │시 험 조 건                                         │

├────────┼──────────────────────────┤

│시험방법        │지수식 또는 비교환방식                              │

│                │                                                    │

│시험생물        │64시간 말똥성게(H. pulcherrimus, 3 ∼ 4월)          │

│                │48시간 둥근성게(S. nudus, 7 ∼ 8월)                 │

│                │                                                    │

│시험기간        │10분(수정률) 또는 64시간(정상유생 발생률)           │

│                │                                                    │

│수온            │16.0 ± 0.5 °C(말똥성게), 20.0 ± 0.5 °C(둥근성게)│

│                │                                                    │

│염분            │30.0 ± 1.0                                         │

│                │                                                    │

│pH              │8.0 ± 0.5                                          │

│                │                                                    │

│산소            │주입하지 않음                                       │

│                │                                                    │

│광주기          │8 Light : 16 Dark                                   │

│                │                                                    │

│시험용기        │6-well plate                                        │

│                │                                                    │

│시험농도        │6구간 이상(대조구 포함)                             │

│                │                                                    │

│배양해수        │여과(0.45 μm membrane filter), 멸균한 자연해수     │

│                │                                                    │

│시험용액        │교환하지 않음                                       │

│                │                                                    │

│시험용액 부피   │10 mL                                               │

│                │                                                    │

│농도별 수정란 수│수정란 100 ∼ 150 개/mL                             │

│                │                                                    │

│시험반복수      │3개 이상                                            │

│                │                                                    │

│종말점          │수정률(%) 및 반수영향농도(EC50)                     │

│                │                                                    │

│시험적합도      │수정률은 대조구의 수정률이 80 % 이상,               │

│                │정상 유생 발생률은 대조구의 정상 유생 발생이 80 %   │

│                │이상                                                │

└────────┴──────────────────────────┘

5.2  시험용액 및 시험농도

5.2.1  시험용액

시험용액은 일련의 방법에 따라 준비한다. 시험물질에 따라 배양액에 직접 희석하거나 유기용매와 분산제를 첨가하기도 하며, 시험물질의 입수경로를 포함하여 보관 장소 및 조제에 따른 계산까지 자세히 기록한다. 일반적으로 시험은 pH를 조절하지 않고 수행하지만, 극단적인 산성이나 알칼리성 물질인 경우는 염산이나 수산화나트륨을 등을 사용하여 pH를 조절한다.

5.2.2  시험농도

시험물질의 농도는 보통 기하학적인 순열을 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0의 비율이 되게 한다. 시험물질의 농도는 10 % 이하와 90 % 이상의 범위에서 최소 5구간 이상을 두어야 한다. 이때, 시험농도는 반드시 사망 및 성장 저해가 나타나는 구간을 포함 하고, 시험농도의 범위는 예비시험을 통하여 넓은 범위의 구간을 포함하는 것이 바람직하다. 최고 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도를 재조정할 필요가 없지만, 최저 시험농도에서 50 % 이상의 사망 및 성장 저해가 발생하는 경우에는 시험농도 구간을 재설정 한다.

5.2.3  대조구

모든 시험은 시험대상 물질이 제외된 시험조건 및 시험과정이 동일한 대조구가 반드시 필요하다. 이때, 시험물질에 따라 운반체(carrier)가 쓰일 경우에는 운반체만이 첨가된 운반체 대조구가 필요하다.

5.3  말똥성게의 방란ㆍ방정 유도

5.3.1  말똥성게를 여과해수로 간단히 씻어낸다. 주사기를 사용하여 0.5 M KCl 1 ∼ 2 mL를 성게 체강 내로 주입한 뒤, 항문이 위로 향하도록 바닥에 내려놓는다.

5.3.2  정자와 난자가 나오는지 확인한 뒤, 비커에 여과해수를 가득 담아 말똥성게를 항문이 아래로 향하도록 뒤집어 올려놓고 30분간 정자와 난자를 받는다.

5.3.3  방란ㆍ방정 시켜 얻은 정자는 1회, 난자는 3회 여과해수로 세척하고 적정한 정자 접종을 위하여 정자는 2,000 ∼ 2,500배 희석한다. 또한, 현미경으로 정자의 운동성과 난자의 물리적인 모양이 정상적인지 확인한다.

5.3.4  둥근성게도 말똥성게와 동일한 방법으로 진행한다.

5.4  말똥성게 수정률 시험

5.4.1  위 5.3에서 방란ㆍ방정을 유도하여 얻은 정자와 난자를 사용한다.

5.4.2.  6-well plate에 시험수 10 mL씩 분주하고 16.0 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다(둥근성게의 경우, 20.0 ± 0.5 °C). 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상은 반복구를 둔다. 또한 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.4.3  미리 보관된 6-well plate의 각 well 당 정자 1 μL를 넣어 30분 노출시킨다. 30분 후, 정자가 주입된 각 well 당 난자 100 ∼ 150개를 넣는다.

5.4.4  10분 후, 대조구의 수정막 형성 유ㆍ무를 확인하여 수정막이 제대로 형성되었을 때, 전체 시험구를 3 % 포르말린 용액으로 고정시키고 정상 수정된 수정란을 계수하여 수정률을 산출한다.

5.4.5  둥근성게의 경우, 온도를 제외한 다른 과정은 말똥성게와 동일하게 시험한다.

5.5  말똥성게 정상 유생 발생률 시험

5.5.1  위 5.3에서 방란ㆍ방정을 유도하여 얻은 난자에 정자를 넣어 10분 방치하여 수정시킨다. 수정할 때 정자를 다량 주입하게 되면 남는 정자로 인해 오염될 가능성이 있으므로 정자가 다량 투입되지 않도록 주의한다.

5.5.2  6-well plate에 시험수 10 mL씩 분주하고 16 ± 0.5 °C의 항온배양기에 넣어 보관한다(둥근성게의 경우, 20 ± 0.5 °C). 이때, 시험용액은 대조구를 포함하여 등 비율로 6구간 이상의 농도와 3개 이상은 반복구를 둔다. 이때의 수온, pH, 염분, 용존산소 및 조도 등의 환경요인을 측정하여 기록한다.

5.5.3  위 5.5.1에서 수정한 수정란의 정상적인 수정막 형성을 확인한다. 정상 수정이 된 수정란을 6-well plate의 각 well 당 100 ∼ 150개씩 넣은 뒤, 온도는 16 ± 0.5 °C, 광주기는 8L : 16D로 항온배양기에서 64시간 배양한다.

5.5.4  64시간 후(둥근성게는 48시간), 3 % 포르말린 용액으로 고정하고 현미경으로 100 개체를 무작위로 관찰하여 수정란이 정상 pluteus 유생, 기형 pluteus 유생 및 수정란 상태의 개체수를 계수하여 정상 유생 발생률을 산출한다.

5.5.5  둥근성게는 온도와 배양 시간을 제외한 다른 과정은 말똥성게와 동일하게 시험한다.

6. 결과

6.1  자료분석

6.1.1  수정률과 정상 유생 발생률을 구하기 위해서는 성게의 정상 수정란과 정상 pluteus 유생을 계수한 자료가 필요하다. 현미경을 통해 계수한 결과를 수정률과 정상 유생 발생률을 계산에 이용한다.

6.1.2  결과의 표시는 다음과 같다. 생존율과 개체군 성장률을 이용하여 반수영향농도(EC50), 무영향농도(NOEC) 및 최소영향농도(LOEC)를 구하고, 노출 시간을 정확히 표시 한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 보통 리터당 밀리그램 단위인 경우, 유효숫자 2자리까지 표시한다. EC50, NOEC 및 LOEC는 일정한 조건에서 수행된 시험으로부터 도출되는 독성학적 자료이며, 이 결과는 어떤 물질이 생물에 미치는 위해성을 파악할 수는 있지만 자연 상태에서도 동일한 영향을 예측하는 데 바로 사용될 수 없다.

6.2  결과계산

6.2.1  수정률의 계산: 각 시험구당 수정률을 아래 백분율 식에 의해 계산한다.

                    (식 1)

a: 정상 수정란

b: 수정이 안된 난자

c: 비정상 수정란

이때, 대조구의 수정률은 최소 80 % 이상이 되어야 유효하다. 정상 수정은 현미경 상에서 수정란의 수정막이 완전한 원형으로 나타난 경우, 정상 수정란이라고 판단하며, 수정막이 원형을 이루지 못하면 비정상 수정란, 수정막이 없는 경우, 수정이 안된 난자라고 판단한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.2.2  정상 유생 발생률 계산: 각 시험구당 정상 유생 발생률을 아래 백분율식에 의해 계산한다.

              (식 2)

d: 정상 pluteus 유생

e: 수정란

f: 비정상 pluteus 유생

이때, 대조구의 정상 유생 발생률은 최소 80 % 이상이 되어야 유효하다. 정상 발생은 현미경상에서 pluteus 유생이 삼각형의 2개의 돌기를 갖췄을 때 정상 발생이라고 판단하며, 정상적인 모양을 갖추지 못했거나 발달 단계가 pluteus 유생까지 도달하지 못한 경우에는 비정상 pluteus 유생, 발달하지 못하고 수정란 상태인 경우에 수정란이라고 판단한다. 또한, 이 자료는 분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.3  통계처리

6.3.1  반수영향농도(EC50)는 프로빗(Probit)법 또는 Trimmed Spearman Karber(TSK)법을 사용하여 95 %의 신뢰구간에서 구한다.

6.3.2  프로빗법은 1 ∼ 99 % 사이의 데이터가 1개 이하인 경우, TSK법은 2개 이상인 경우에 사용할 수 있다.

6.3.3  분산분석(ANOVA), Dunnett 검정, student-t test 등을 통해 시험구와 대조구 사이의 유의성을 비교할 수 있으며, NOEC, LOEC, EC50을 계산할 수 있다.

6.4  결과보고

6.4.1  결과보고에는 모든 기초자료뿐만 아니라 시험결과까지 기록한다.

6.4.2  시험생물의 정보: 입수 출처와 사육방법 및 생활사 단계 등을 기록한다.

6.4.3  시험물질의 정보: 구입 위치, 순도, CAS 번호, 생산자의 로트(lot) 번호. 배출수인 경우에는 채집 위치, 채집 방법, 보관 시간, 방법 및 상태 등을 기록한다.

6.4.4  시험환경: 시험개시 및 종료시 수온, pH, 용존산소량 및 조도 등을 기록한다.

6.4.5  희석수: 희석수의 종류, 용매의 종류 및 이들의 농도를 기록한다.

6.4.6  종말점: 10분 수정률(%), 64시간 반수영향농도(EC50) 및 95 % 신뢰구간(95 % CI) 등을 기록하고, 이들의 통계처리 방법을 기록한다.

6.4.7  결과를 보증하는 자료로 대조구의 수정률, 정상 유생 발생률에 대해 가장 최근에 수행된 표준독성물질을 사용한 시험 결과를 첨부한다.

6.4.8  본 시험법에 언급되지 않은 내용 및 문제는 US EPA(US Enviro nmental Protection Agency), ASTM(American Society for Testing and Materials)의 표준법(ASTM, 1991) 및 APHA(American Public Health Association)의 표준법(APHA, 1998) 등을 참고한다.

6.5  유효성 판정

본시험은 다음과 같은 경우, 일반적으로 그 결과를 인정할 수 없다.

6.5.1  수정률 시험에서 대조구의 수정률이 80 % 미만인 경우

6.5.2  정상 유생 발생률 시험에서 대조구의 정상 유생 발생률이 80 % 미만인 경우

6.5.3  시험 용기의 크기나 재질이 동일하지 않은 경우

6.5.4  필요한 희석수나 용매 대조구가 시험에 포함되지 않은 경우

6.5.5  시험생물이 무작위로 배당되지 않은 경우

6.5.6  수온, 염분, pH, 용존 산소량 및 조도 등의 시험조건이 명시되지 않은 경우

7. 참고사항

7.1  본 시험법은 산소요구량이 많은 물질, 휘발성 물질, 생물 및 화학적 변화가 급격히 발생하거나 시험 용기 등에 흡착이 쉬운 물질에는 적합하지 않다.

7.2  시험농도는 50 % 이하의 생존율 및 개체군 성장률이 발생하는 농도를 최고 농도로 설정하며, 그 이하 농도를 등비율로 조정한다. 예를 들면, 시험농도는 기하학적인 순열에 따라 그 비가 1.5 ∼ 2.0 사이가 되게 한다. 즉, 시험농도가 0, 2, 4, 8, 16 및 32 mg/L 혹은 0, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 및 100.0 %로 조정한다.

7.3  시험물질의 농도를 조정하기 위한 예비시험은 본 시험과 같은 반복구를 두지 않고 넓은 범위로 수행해도 된다.

7.4  수정률 시험은 대조구의 수정률이 반드시 80 %이상 나타나야 하며, 정상 유생 발생률 시험은 대조구의 정상 배아 발생률이 반드시 80 % 이상인 경우에 유효하다. 이는 결과로 인정할 수 있는 최소한의 값이며, 이 값보다 낮은 경우, 희석수, 먹이 및 시험생물의 건강도 등을 검토하여 재시험한다.

7.5  시료의 오염

7.5.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 염소계 산화제와의 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 시안 분자구조를 분해시킨다.

7.5.2  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 알데히드(Aldehyde) 계열의 화합물과의 접촉을 피한다. 알데히드와의 반응을 통해 시안화물이 시아노히드린(Cyanohydrin)으로 변화된다.

7.6  용어정리

7.6.1  반수영향농도(50 % Effective Concentration, EC50): 시험생물의 개체군 성장률이 50 % 저해된 농도

7.6.2  무영향농도(No Observed Effect Concentration, NOEC): 시험생물에게 영향을 미치지 않는 농도

7.6.3  최소영향농도(Lowest Observed Effect Concentration, LOEC): 시험생물에게 영향을 미치는 최소 농도

제26항 다이옥신 및 퓨란       (Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins and Furans, PCDD/Fs)

1. 측정원리

알카리 분해법을 이용하여 해양생물(어류, 패류, 갑각류 등) 중 다이옥신(Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins, PCDDs) 및 퓨란(Polychlorinated Dibenzo-Furans, PCDFs)을 추출한다. 그리고, 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 지방 등 분석 방해물질을 제거 및 분획화하고, 최종적으로 고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기(High Resolution Gas chromatography/Mass Spectrometer, HRGC/HRMS)를 사용하여 록매스(Lock mass)에 의한 선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법 검출한계(Method detection limit, MDL)를 표 1에 나타내었다.

표 1. 다이옥신류의 분석방법 검출한계(MDL)

┌─────────────┬────────────┐

│성   분                   │분석방법 검출한계 (pg/g)│

├─────────────┼────────────┤

│T4CDD, T4CDF, P5CDD, P5CDF│0.2                     │

├─────────────┼────────────┤

│H6CDD, H6CDF, H7CDD, H7CDF│0.5                     │

├─────────────┼────────────┤

│O8CDD, O8CDF              │1                       │

└─────────────┴────────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 다이옥신류의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용전 확인시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다.

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하여 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시킨다. 사용하기 전에 아세톤으로 세척하여 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  250, 500 mL 갈색 유리병 

3.1.2  1 L 분액여두

3.1.3  250, 500 mL 둥근바닥 플라스크

3.1.4  깔때기

3.1.5  1 ∼ 2 mL 유리 바이알

3.1.6  10 mL 시험관

3.1.7  정제용 컬럼: 다층 실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm), 알루미나 컬럼용(길이 250 mm, 내경 15 mm) 유리관을 사용한다.

3.1.8  탈지면: 노말-헥산 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  교반기

속도 조절이 가능한 것을 사용한다.

3.3  농축장치

3.3.1  회전증발농축기(rotary evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.3.2  흡인장치(aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.3.3  냉각수 순환장치(cooling circulator)

3.3.4  질소농축기: 질소 기체가 연결될 수 있는 미세관, 기체의 유량 조절이 가능한 유량계, 시료 용기를 고정할 수 있는 장치로 구성되어야 한다.

3.4  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기(High Resolution Gas chromatography /Mass Spectrometer,  HRGC/HRMS)

3.4.1  컬럼오븐

컬럼오븐의 온도 제어범위가 50 ∼ 350 °C이고, 측정 대상 물질의 최적 분리조건을 설정 및 제어가 가능하도록 승온 프로그래밍이 가능한 것을 사용한다.

3.4.2  모세관 컬럼

4염화물에서 8염화물까지 다이옥신류 분석을 위한 캐피러리 컬럼으로 2,3,7,8-치환이성질체를 포함한 모든 이성질체의 분리가 양호한 비극성 컬럼(SP-2330, DB-5MS 등)의 사용을 원칙으로 하되, 이와 동등한 성능을 가지는 모세관 컬럼의 사용도 가능하다. 길이 60 m, 내경 0.32 mm, 필름두께 0.25 μm 또는 이와 동등한 컬럼으로 분석 목적에 따라 알맞게 선정한다.

3.4.3  질량분석기(MS)

3.4.3.1  이중집속형(double-focusing type) 록매스방식과 분해능 10,000 이상으로 측정이 가능한 것을 사용한다.

3.4.3.2  이온원은 온도를 160 ∼ 300 °C로 유지할 수 있는 것을 사용한다. 

3.4.3.3  전자충격 이온화법(Electron Impact ionization, EI법)이 가능하고, 이온화 전압을 25 ∼ 70 eV 정도로 제어가능한 것을 사용한다.

3.4.3.4  선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM법)이 가능하고, 필요한 측정 질량수의 채널수와 감도의 관계를 고려하여 SIM법의 주기를 최대 1초 이하로 가능한 것을 사용한다.

3.4.4  시료도입부

비분할(splitless) 등 시료의 전량을 분리 컬럼 내에 도입 가능한 것을 사용한다.

3.4.5  운반기체

고순도 헬륨(순도 99.999 % 이상)

표 2. 다이옥신류 분석을 위한 HRGC/HRMS 분석조건의 예

┌────────────────────────────────────┐

│기체크로마토그래피 조건                                                 │

├──────┬─────────────────────────────┤

│컬럼        │실리카겔 모세관 컬럼                                      │

│            │내경 0.32 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 60 m                │

├──────┼─────────────────────────────┤

│컬럼 온도   │140 °C (4분) → 15 °C/분 → 220 °C → 1.5 °C/분       │

│            │             → 240 °C (2분) → 4 °C/분 → 310 °C (6분)│

├──────┼─────────────────────────────┤

│주입구 온도 │280 °C                                                   │

├──────┼─────────────────────────────┤

│주입방법    │splitless (split 유지 시간: 60 ∼ 90초)                   │

├──────┴─────────────────────────────┤

│질량분석기 조건                                                         │

├──────┬─────────────────────────────┤

│이온화 방법 │전자충격이온화(EI)법                                      │

├──────┼─────────────────────────────┤

│이온화 전압 │25 ∼ 70 eV                                               │

├──────┼─────────────────────────────┤

│이온화 전류 │500 ∼ 1,000 μA                                          │

├──────┼─────────────────────────────┤

│이온원 온도 │280 ∼ 300 °C                                            │

├──────┼─────────────────────────────┤

│운반 기체   │헬륨(25 psi)                                              │

└──────┴─────────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

전체의 시약류에는 다이옥신류의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용전 확인시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약을 사용한다.

4.1.1  아세톤(C3H6O)

4.1.2  노말-헥산(n-C6H14)

4.1.3  디클로로메탄(CH2Cl2)

4.1.4  에탄올(C2H6O)

4.1.5  노난(C9H20)

4.2  증류수: HPLC급 이상의 증류수를 이용 한다. 실험실에서 제조된 3차 증류수의 경우, 제조시 18 MΩ 이상의 저항값을 유지하도록 관리해야 하며, 분석대상 물질의 피크가 검출한계의 1/3 이상 발견되지 않아야 한다.

4.3  무수황산나트륨(Na2SO4): 잔류농약 시험용 혹은 그와 동등 이상의 것을 사용한다.

4.4  황산(H2SO4), 수산화칼륨(KOH), 질산은(AgNO3): 시약특급 혹은 이것과 동등 이상의 것을 사용한다.

4.5  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.6  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 위 4.5의 실리카겔에 1 M 수산화칼륨 용액을이용하여 수산화칼륨이 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고, 밀폐가능한 용기에 넣은 다음 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.7  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 위 4.5의 실리카겔에 황산이 실리카겔에 대해 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한 후 밀폐 가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.8  10 % 질산은 함유 실리카겔: 위 4.5의 실리카겔에 40 %(w/w) 질산은 용액을 이용하여 질산은이 실리카겔에 대해 10 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고 밀폐가능한 용기에 넣어 진공 데시케이터 내에 보관한다. 조제 및 보관은 차광한 상태에서 행한다.

4.9  알루미나: 중성, 활성도Ⅰ, 70 ∼ 230 mesh, 600 °C에서 16시간 동안 활성화한 후, 밀폐 가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터에 넣어 보관한다.

4.10  표준물질

4.10.1  표준물질(표 3): 표준용액은 노말-헥산 혹은 노난 등을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석물질에 대한 기기 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.10.2  대체표준물질 및 내부표준물질(표 4): 실험에 사용되는 모든 대체 및 내부 표준용액은 적합한 작업농도 범위로 희석하여 사용한다.

4.10.3  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 인증표준물질은 환경 시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 국제원자력기구 해양환경연구소(International Atomic Energy Agency-Marine Enviro nment Laboratory, IAEA-MEL), 미국 NIST (National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC (National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다(예: CARP-2 등).

표 3. 다이옥신 및 퓨란 표준물질(17종)

┌──────┬───────────┬───────────┐

│대상 화합물 │PCDD 화합물           │PCDF 화합물           │

├──────┼───────────┼───────────┤

│4염화물     │2,3,7,8-T4CDD         │2,3,7,8-T4CDF         │

├──────┼───────────┼───────────┤

│5염화물     │1,2,3,7,8-P5CDD       │1,2,3,7,8-P5CDF       │

│            │                      │2,3,4,7,8-P5CDF       │

├──────┼───────────┼───────────┤

│6염화물     │1,2,3,4,7,8-H6CDD     │1,2,3,4,7,8-H6CDF     │

│            │1,2,3,6,7,8-H6CDD     │1,2,3,6,7,8-H6CDF     │

│            │1,2,3,7,8,9-H6CDD     │1,2,3,7,8,9-H6CDF     │

│            │                      │2,3,4,6,7,8-H6CDF     │

├──────┼───────────┼───────────┤

│7염화물     │1,2,3,4,6,7,8-H7CDD   │1,2,3,4,6,7,8-H7CDF   │

│            │                      │1,2,3,4,7,8,9-H7CDF   │

├──────┼───────────┼───────────┤

│8염화물     │1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDD │1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDF │

└──────┴───────────┴───────────┘

표 4. 다이옥신 및 퓨란 대체표준물질(15종) 및 내부표준물질(2종)

┌──────┬──────────────┬─────────────┐

│대상 화합물 │PCDD 화합물                 │PCDF 화합물               │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│4염화물     │13C12-1,2,3,4-T4CDD*        │13C12-2,3,7,8-T4CDF       │

│            │13C12-2,3,7,8-T4CDD         │                          │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│5염화물     │13C12-1,2,3,7,8-P5CDD       │13C12-1,2,3,7,8-P5CDF     │

│            │                            │13C12-2,3,4,7,8-P5CDF     │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│6염화물     │13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDD     │13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDF   │

│            │13C12-1,2,3,6,7,8-H6CDD     │13C12-1,2,3,6,7,8-H6CDF   │

│            │13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDD*    │13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDF   │

│            │                            │13C12-2,3,4,6,7,8-H6CDF   │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│7염화물     │13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDD   │13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDF │

│            │                            │13C12-1,2,3,4,7,8,9-H7CDF │

├──────┼──────────────┼─────────────┤

│8염화물     │13C12-1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDD │                          │

└──────┴──────────────┴─────────────┘

  * 내부표준물질                                                          

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  채취된 해양생물(어류, 패류, 갑각류 등) 시료는 껍질을 제거한 후 가식부를 채취하여 250 혹은 500 mL의 갈색 유리병에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 해동하여 조직 분쇄기로 분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법

6.1  추출(알칼리 분해방법)

6.1.1  균질화된 습시료 40 g을 칭량한 후, 1 L 분액여두에 넣는다.

6.1.2  내부표준물질을 주입한 후, 1 N 수산화칼륨/에탄올 270 mL를 넣는다.

6.1.3  2시간 동안 진탕한다.

6.1.4  세정수 150 mL와 노말-헥산 200 mL을 위 6.1.3의 분액여두에 넣는다.

6.1.5  10분간 다시 진탕 후, 용매층과 수층을 분리한다.

6.1.6  수층 시료를 다른 분액여두에 담아 노말-헥산 150 mL을 넣고 10분간 진탕한 후 분리된 수층 시료를 버린다.

6.1.7  위 6.1.6의 분리된 용매층에, 위 6.1.5에서 분리된 용매층을 합한 후 세정수 150 mL를 넣고 30초간 진탕한 다음, 분리된 수층 시료를 버린다.

6.1.8  위 6.1.7의 분리된 용매층에, 세정수 150 mL를 넣고 5분간 재진탕한 다음, 분리된 수층 시료를 버린다.

6.1.9  위 6.1.8에서 얻어진 노말-헥산층의 남은 수분은 무수황산나트륨으로 탈수한 후 회전증발농축기를 이용하여 1  mL 미만으로 농축한다.

6.2  다층 실리카겔 컬럼 정제

6.2.1  정제용 컬럼의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.2.2  노말-헥산을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.3  위 4.6에서 조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.2.4  위 4.5의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.5  위 4.7의 44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

6.2.6  위 4.5의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.7.  위 4.8의 10 % 질산은이 함유된 실리카겔 3 g을 충진한다.

6.2.8  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.9  위 6.1.9에서 얻어진 시료 용액을 조심스럽게 주입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.2.10  노말-헥산 130 mL를 적하 속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.11  얻어진 용출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL까지 농축한다.

6.3  알루미나 컬럼 정제

6.3.1  정제용 컬럼의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 세정된 탈지면을 충진한다.

6.3.2  무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.3  노말-헥산을 주입 후 위 4.9의 알루미나 10 g을 습식 충진한다.

6.3.4  무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.5  위 6.2.11에서 얻어진 용액을 조심스럽게 주입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.3.6  3 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 70 mL를 유속 2.5 mL/min으로 흘린다.

6.3.7  50 % 디클로로메탄이 함유된 노말-헥산 용액 80 mL를 유속 2.5 mL/min으로 흘린다.

6.3.8  얻어진 용출액을 회전증발농축기와 질소농축기를 이용하여 농축하고, 내부표준물질을 주입 후 노난 20 ∼ 100 μL로 용매를 치환하여 HRGC/HRMS로 분석한다.

6.4  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기 분석

6.4.1  질량수 교정

질량분석기에 질량수 교정용 표준물질 퍼플루오로케로센(Perfluorokerosene, PFK)를 주입하고, 질량수 교정 프로그램에 의해 매스 스펙트럼의 패턴, 분해능(10,000 이상, 10 % valley) 등을 측정 목적에 따라 소정의 값으로 교정한다. 질량 교정 결과를 측정 결과와 함께 보존한다.

6.4.2  시료의 측정

6.4.2.1  표 5에 나타낸 각 염소 화합물의 모니터 이온을 1개의 염화물에 대하여 2개 이상 설정한다.

6.4.2.2  위 6.3.8에서 제조한 최종 분석용 시료액 1 ∼ 2 μL를 HRGC/HRMS에 주입한다.

6.4.2.3  위 6.4.2.1에서 설정한 각 염소화물의 정량용 질량수와 확인용 질량수에 대하여 크로마토그램을 기록하고, 2개 이상의 모니터 이온의 피크 면적비를 계산한다.

6.4.2.4  측정 종료 후, 정량 작업에 들어가기 전에 개개의 시료마다 록매스(Lock mass) 모니터 채널의 감도(response)를 확인한다.

6.4.2.5  각 염소화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적을 구한다.

표 5. 다이옥신 및 퓨란 분석을 위한 측정질량수의 예

  (단위: m/z)                                 

┌──────┬────┬────┬────┐

│대상 화합물 │M       │M+2     │M+4     │

├──────┼────┼────┼────┤

│T4CDDs      │319.897 │321.894 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│P5CDDs      │353.858 │355.855 │357.852 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H6CDDs      │        │389.816 │391.813 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H7CDDs      │        │423.777 │425.774 │

├──────┼────┼────┼────┤

│O8CDD       │        │457.738 │459.735 │

├──────┼────┼────┼────┤

│T4CDFs      │303.902 │305.899 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│P5CDFs      │337.863 │339.860 │341.857 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H6CDFs      │        │373.821 │375.818 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H7CDFs      │        │407.782 │409.779 │

├──────┼────┼────┼────┤

│O8CDF       │        │441.743 │443.740 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-T4CDDs│331.937 │333.934 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-P5CDDs│365.898 │367.895 │369.892 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H6CDDs│399.859 │401.857 │403.853 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H7CDDs│        │435.817 │437.814 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-O8CDD │        │469.778 │471.775 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-T4CDFs│315.942 │317.939 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-P5CDFs│349.903 │351.900 │353.897 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H6CDFs│        │385.861 │387.858 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H7CDFs│        │419.822 │421.819 │

└──────┴────┴────┴────┘

표 6. 다이옥신류의 염소 동위체의 이론 천연 존재비

                                                                             (단위:%)   

┌──────┬──┬──┬──┬──┬───────────────────────┐

│대상 화합물 │M   │M+2 │M+4 │M+6 │M+8                                           │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│T4CDDs      │76.4│100 │49.4│11.0│1.00                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│P5CDDs      │61.3│100 │65.5│21.6│3.60                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│H6CDDs      │51.1│100 │81.7│35.8│8.90                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│H7CDDs      │43.9│100 │97.9│53.4│17.6                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│O8CDD       │33.7│87.7│100 │65.3│26.8                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│T4CDFs      │77.5│100 │49.2│10.9│1.00                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│P5CDFs      │61.3│100 │65.4│21.5│3.60                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│H6CDFs      │51.6│100 │81.6│35.6│8.80                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│H7CDFs      │43.9│100 │97.8│53.3│17.5                                          │

├──────┼──┼──┼──┼──┼───────────────────────┤

│O8CDF       │33.7│87.7│100 │65.2│26.7                                          │

└──────┴──┴──┴──┴──┴───────────────────────┘

7. 분석절차 흐름도

그림 1. 다이옥신 및 퓨란 분석절차 흐름도

8. 정도평가/정도관리

8.1  검출한계, 정확도, 정밀도 측정은 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 유기염소계 농약의 8. 정도평가/정도관리를 따른다.

8.2  시약의 조제와 시료의 전처리, HRGC/HRMS를 이용한 분석절차에서 발생할 수 있는 바탕오염을 확인하고, 시료의 분석에 지장이 없는 실험실 환경을 유지하기 위해 실험실 바탕시료(laboratory method blank) 시험을 수행한다.

8.3  다이옥신류의 분석에 대해 계산된 회수율은 50 ∼ 120 % 범위를 만족 하며, 이 범위를 벗어나면 정제과정을 새로 실시한다. 재정제시에도 이 범위를 만족하지 못하면 분석 결과는 폐기하고, 분석의 전과정을 재점검하여 다시 수행한다.

8.4  HRGC/HRMS를 이용한 다이옥신류의 분석시, 표 1에 나타낸 분석방법 검출한계(MDL)를 만족 한다.

8.5  HRGC/HRMS는 분해능 10,000 이상에서 분석이 수행되어야 하며, 질량수 교정용 표준물질인 PFK의 검정결과는 이론값과 실측값과의 차이가 5 ppm 이하를 만족 하며, 이 값을 만족하지 못할 경우에는 HRGC/HRMS를 재조정 한다.

8.6  검량선 작성을 위해 사용되는 5단계 정량용 표준물질을 HRGC/HRMS에 주입하여 감응계수(RF)의 선형성 여부를 확인하며, RF는 상대표준편차가 20 % 미만이어야 하며, 선형성을 만족하지 못하면 HRGC/HRMS를 재조정하여 재분석 한다.

8.7  다이옥신류의 각 분석대상 화합물의 정량을 위해 사용되는 두 개의 선택이온(m/z) 피크의 면적비가 표 6에 나타낸 동족체의 면적비에 대하여 ±15 % 이내에 있어야 한다.

8.8  분석대상 다이옥신류 화합물의 각 이온(m/z)값에 해당하는 크로마토그램의 피크에 대한 분석신호 대 바탕신호(S/N)의 비가 시료의 경우 2.5 이상이어야 하며, 정량용 표준물질에 대해서는 S/N비가 10 이상이어야 한다.

9. 결과

9.1  검량선

9.1.1  내부표준물질 중의 각 염화물에 대하여 0.5 ∼ 2,000 pg/μL 농도범위에서 0을 포함하여 5단계 이상의 표준농도계열을 만든다.

9.1.2  위 9.1.1에서 조제한 표준농도계열의 1 ∼ 2 μL를 HRGC/HRMS에 주입하고, 위 6.4의 조작을 행하여 각 염화물의 크로마토그램을 기록한다.

9.1.3  9.1.2에서 측정한 검량선용 표준농도 계열의 각 염소화물마다 정량용 질량수와 확인용 질량수의 피크 면적비를 산출한다.

9.1.4  9.1.3에서 구한 각 염소화물의 면적비가 표 6의 천연존재비와 거의 일치하는 것을 확인한다.

9.1.5  각 염소화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 주입한 표준용액 중의 각 염소화물의 질량으로부터 검량선을 작성한다. 

9.1.6  분석대상물질의 감응계수(Response Factor, RF)를 구한다. RF는 다음 식에 의해 산출한다.

                            (식 1)

AS: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

IS: 표준용액 중의 분석대상물질의 농도(첨가량)

IIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도(첨가량)

9.2  농도계산

분석대상의 각 다이옥신 및 퓨란의 농도는 아래 식을 사용하여 구한다.

                          (식 2)

C : 분석대상물질의 농도(pg/g)

As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(pg)

RF: 감응계수

W: 시료량(습중량, g)

9.2.1  정량은 정량 하한치(분석방법 검출한계 0.2 ∼ 1 pg/g)이상의 피크에 대해서만 행한다.

9.2.2  동위체 농도는 4염소화물부터 8염소화물의 각 동위체와 그 총합을 표시한다.

9.2.3  동위체 농도는 2,3,7,8-염소치환 이성질체 농도 및 기타의 이성질체 농도의 총합으로 표시하고, 이성질체 농도는 2,3,7,8-염소치환 이성질체의 각 농도에 대하여 표시한다.

9.2.4  2,3,7,8-염소치환 이성질체의 각 농도는 사용한 표준물질의 측정 분석값을 사용하여 정량한다.

9.2.5  그 이외의 이성질체 농도(총합 농도)는 사용한 각 염소수마다 표준물질 측정치의 평균값을 사용하여 정량한다.

9.2.6  정량된 실측농도에 표 7의 다이옥신류의 독성등가계수(Toxic Equivalent Factor, TEF)를 곱하여 독성등가량(Toxic Equivalent, TEQ)을 산출하고, 그 합계를 구한다.

표 7. 다이옥신 및 퓨란의 독성등가계수(WHO-TEF 2005)

┌───────────┬───┬───────────┬───┐

│PCDDs 화합물          │TEF   │PCDFs 화합물          │TEF   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│2,3,7,8-T4CDD         │1     │2,3,7,8-T4CDF         │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,7,8-P5CDD       │1     │1,2,3,7,8-P5CDF       │0.03  │

│                      │      │                      │      │

│                      │      │2,3,4,7,8-P5CDF       │0.3   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,4,7,8-H6CDD     │0.1   │1,2,3,4,7,8-H6CDF     │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,6,7,8-H6CDD     │0.1   │1,2,3,6,7,8-H6CDF     │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,7,8,9-H6CDD     │0.1   │1,2,3,7,8,9-H6CDF     │0.1   │

│                      │      │                      │      │

│                      │      │2,3,4,6,7,8-H6CDF     │0.1   │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,4,6,7,8-H7CDD   │0.01  │1,2,3,4,6,7,8-H7CDF   │0.01  │

│                      │      │                      │      │

│                      │      │1,2,3,4,7,8,9-H7CDF   │0.01  │

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDD │0.0003│1,2,3,4,6,7,8,9-O8CDF │0.0003│

├───────────┼───┼───────────┼───┤

│그 외의 PCDDs         │0     │그 외의 PCDFs         │0     │

└───────────┴───┴───────────┴───┘

9.3  결과보고

시료에 들어 있는 각 다이옥신 및 퓨란의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 결정계수(r2)를 제시한다.

제27항 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐       (Dioxin-like  PCBs, DL-PCBs)

1. 측정원리

알카리 분해법을 이용하여 해양생물(어류, 패류, 갑각류 등) 중의 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐(Dioxin-like PCBs, DL-PCBs)를 추출한 후 컬럼 정제과정으로 추출액 중의 색소류, 지방 등의 분석방해물질을 제거하고, 고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기(High Resolution Gas chromatography/Mass Spectrometer, HRGC/HRMS)를 사용하여 록 매스(Lock mass)에 의한 선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

고분해능 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법 검출한계(Method detection limit, MDL)를 표 1에 나타내었다.

표 1. 다이옥신-유사 PCBs 분석방법 검출한계(MDL)

┌───────────┬────────────┐

│성   분               │분석방법 검출한계(pg/g) │

├───────────┼────────────┤

│T4CB, P5CB, H6CB, H7CB│0.2                     │

└───────────┴────────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕 농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용 전 확인 시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다.

3.1  초자기구

실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시킨다. 사용하기 전에 아세톤으로 세척하여 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  250, 500 mL 갈색 유리병

3.1.2  1 L 분액여두

3.1.3  250, 500 mL 둥근바닥 플라스크

3.1.4  깔때기

3.1.5  1 ∼ 2 mL 유리 바이알

3.1.6  10 mL 시험관

3.1.7  정제용 컬럼: 다층 실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm) 유리관

3.1.8  탈지면: 노말-헥산 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  교반기

속도 조절이 가능한 것을 사용한다.

3.3  농축장치

3.3.1  회전증발농축기(rotary evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.3.2  흡인장치(aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.3.3  냉각수 순환장치(cooling circulator)

3.3.4  질소농축기: 질소 기체가 연결될 수 있는 미세관, 기체의 유량조절이 가능한 유량계, 시료 용기를 고정할 수 있는 장치로 구성되어야 한다. 

3.4  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기(High Resolution Gas Chromatography /Mass Spectrometer,  HRGC/HRMS)

3.4.1  컬럼오븐

컬럼 오븐의 온도 제어범위가 50 ∼ 350 °C이고, 측정대상물질의 최적 분리조건을 설정 및 제어가 가능하도록 승온 프로그래밍이 가능한 것을 사용한다

3.4.2  모세관 컬럼

4염화물에서 7염화물까지 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐 분석을 위한 모세관 컬럼으로 모든 이성질체의 분리가 양호한 비극성 컬럼(DB-5MS 등)의 사용을 원칙으로 하되, 이와 동등한 성능을 가지는 모세관 컬럼의 사용도 가능하다. 길이 60 m, 내경 0.25 mm, 막두께 0.25 μm 또는 이와 동등한 컬럼으로 분석 목적에 따라 알맞게 선정한다.

3.4.3  질량분석기(MS)

3.4.3.1  이중 수속형으로 록매스방식과 분해능 10,000 이상으로 측정이 가능한 것을 사용한다.

3.4.3.2  이온원은 온도를 160 ∼ 300 °C로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.4.3.3  전자충격 이온화법(Electron Impact, EI법)이 가능하고, 이온화 전압을 25 ∼70 eV 정도로 제어가능한 것을 사용한다.

3.4.3.4  선택이온검출법(Selected Ion Monitoring, SIM법)이 가능하고, 필요한 측정 질량수의 채널수와 감도의 관계를 고려하여 SIM법의 주기를 최대 1초 이하로 가능한 것을 사용한다.

3.4.4  시료도입부

splitless 등 시료 전량을 분리 컬럼 내에 도입 가능한 것을 사용한다.

3.4.5  운반기체

고순도 헬륨(순도 99.999 % 이상)

표 2. 다이옥신-유사 PCBs 분석을 위한 HRGC/HRMS의 분석조건의 예

┌─────────────────────────────────┐

│기체크로마토그래피 조건                                           │

├──────┬──────────────────────────┤

│컬럼        │실리카겔 모세관 컬럼                                │

│            │내경 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 60 m          │

├──────┼──────────────────────────┤

│컬럼 온도   │130 °C(1분) → 20 °C/분 → 220 °C → 5 °C/분 → │

│            │320°C(4.5분)                                       │

├──────┼──────────────────────────┤

│주입구 온도 │280 °C                                             │

├──────┼──────────────────────────┤

│주입방법    │splitless(split 유지 시간: 60 ∼ 90초)              │

├──────┴──────────────────────────┤

│질량분석기 조건                                                   │

├──────┬──────────────────────────┤

│이온화 방법 │전자충격이온화(EI)법                                │

├──────┼──────────────────────────┤

│이온화 전압 │25 ∼ 70 eV                                         │

├──────┼──────────────────────────┤

│이온화 전류 │500 ∼ 1,000 μA                                    │

├──────┼──────────────────────────┤

│이온원 온도 │280 ∼ 300 °C                                      │

├──────┼──────────────────────────┤

│운반 기체   │헬륨(25 psi)                                        │

└──────┴──────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

전체의 시약류에는 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약을 사용한다.

4.1.1  아세톤(C3H6O)

4.1.2  노말-헥산(n-C6H14)

4.1.3  디클로로메탄(CH2Cl2)

4.1.4  에탄올(C2H6O)

4.1.5  노난(C9H20)

4.2  증류수: HPLC급 이상의 증류수를 이용 한다. 실험실에서 제조된 3차 증류수의 경우, 제조시 18 MΩ 이상의 저항값을 유지하도록 관리해야 하며, 분석 대상 물질의 피크가 검출한계의 1/3 이상 발견되지 않아야 한다.

4.3  무수황산나트륨(Na2SO4): 잔류농약 시험용 혹은 그와 동등 이상의 것을 사용한다.

4.4  황산(H2SO4), 수산화칼륨(KOH), 질산은(AgNO3): 특급 혹은 이것과 동등 이상의 것을 사용한다.

4.5  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.6  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 위 4.5의 실리카겔에 1 M 수산화칼륨 용액을이용하여 수산화칼륨이 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고, 밀폐가능한 용기에 넣은 다음 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.7  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 위 4.5의 실리카겔에 황산이 실리카겔에 대해 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한 후 밀폐 가능한 용기에 넣고 진공 데시케이터 내에 보관한다.

4.8  10 % 질산은 함유 실리카겔: 위 4.5의 실리카겔에 40 %(w/w) 질산은 용액을 이용하여 질산은이 실리카겔에 대해 10 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 교반하여 혼합한다. 그 후, 진공감압농축기로 농축하고 밀폐가능한 용기에 넣어 진공 데시케이터 내에 보관한다. 조제 및 보관은 차광한 상태에서 행한다.

4.9  표준물질

4.9.1  표준물질(표 3): 표준물질은 노말-헥산 혹은 노난 등을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석 물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.9.2  대체표준물질 및 내부표준물질(표 4): 실험에 사용되는 모든 대체 및 내부표준물질은 적합한 작업농도 범위로 희석하여 사용한다.

4.9.3  인증표준물질(Certified Reference Material, CRM): 인증표준물질은 환경 시료의 분석자료에 대한 정도관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 미국 NIST(National Institute of Standard and Technology), 캐나다 NRC(National Research Council) 등에서 구매하여 사용한다(예: SRM1946, CARP-2 등).

표 3. 다이옥신-유사 PCBs 분석에 사용되는 표준물질(12종)

┌────────┬───────────┬─────┐

│대상 화합물     │PCBs 화합물명         │IUPAC 번호│

├────────┼───────────┼─────┤

│Non-ortho PCBs  │3,3',4,4'-T4CB        │77        │

│                │                      │          │

│                │3,3',4',5-T4CB        │81        │

│                │                      │          │

│                │3,3',4,4',5-P5CB      │126       │

│                │                      │          │

│                │3,3',4,4',5,5'-H6CB   │169       │

├────────┼───────────┼─────┤

│Mono-ortho PCBs │2,3,3',4,4'-P5CB      │105       │

│                │                      │          │

│                │2,3,4,4',5-P5CB       │114       │

│                │                      │          │

│                │2,3',4,4',5-P5CB      │118       │

│                │                      │          │

│                │2',3,4,4',5-P5CB      │123       │

│                │                      │          │

│                │2,3,3',4,4',5-H6CB    │156       │

│                │                      │          │

│                │2,3,3',4,4',5'-H6CB   │157       │

│                │                      │          │

│                │2,3',4,4',5,5'-H6CB   │167       │

│                │                      │          │

│                │2,3,3',4,4',5,5'-H7CB │189       │

└────────┴───────────┴─────┘

표 4. 다이옥신-유사 PCBs 분석에 사용되는 대체표준물질(12종) 및 내부표준물질 (4종)

┌────────┬───────────────┬─────┐

│대상 화합물     │PCBs 화합물명                 │IUPAC 번호│

├────────┼───────────────┼─────┤

│Non-ortho PCBs  │13C12-3,3',4,4'-T4CB          │77        │

│                │                              │          │

│                │13C12-3,3',4',5-T4CB          │81        │

│                │                              │          │

│                │13C12-3,3',4,4',5-P5CB        │126       │

│                │                              │          │

│                │13C12-3,3',4,4',5,5'-H6CB     │169       │

├────────┼───────────────┼─────┤

│Mono-ortho PCBs │13C12-2,3',4',5-T4CB          │70*       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4'-P5CB        │105       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',5,5'-P5CB        │111*      │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,4,4',5-P5CB         │114       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3',4,4',5-P5CB        │118       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2',3,4,4',5-P5CB        │123       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4',5-H6CB      │156       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4',5'-H6CB     │157       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3',4,4',5,5'-H6CB     │167       │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,3,3',4,4',5,5'-H7CB   │189       │

├────────┼───────────────┼─────┤

│                │13C12-2,2‘,3,4,4',5'-H6CB    │138*      │

│                │                              │          │

│                │13C12-2,2‘,3,3',4,4',5,-H7CB │170*      │

└────────┴───────────────┴─────┘

  * 내부 표준물질                                               

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  채취된 해양생물(어류, 패류, 갑각류 등) 시료는 껍질을 제거한 후 가식부를 채취하여 250 혹은 500 mL의 갈색 유리병에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 -20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 해동하여 조직 분쇄기로 분쇄 및 균질화한다.

6. 시험방법

6.1  추출(알칼리 분해방법)

6.1.1  균질화된 습시료 40 g을 칭량한 후, 1 L 분액여두에 넣는다.

6.1.2  내부표준물질을 주입한 후, 1 N 수산화칼륨/에탄올 270 mL를 넣는다.

6.1.3  2시간 동안 진탕한다.

6.1.4  세정수 150 mL와 노말-헥산 200 mL을 위 6.1.3의 분액여두에 넣는다.

6.1.5  10분간 다시 진탕 후, 용매층과 수층을 분리한다.

6.1.6  수층 시료를 다른 분액여두에 담아 노말-헥산 150 mL을 넣고 10분간 진탕한 후 분리된 수층 시료를 버린다.

6.1.7  위 6.1.6의 분리된 용매층에, 위 6.1.5에서 분리된 용매층을 합한 후 세정수 150 mL를 넣고 30초간 진탕한 다음, 분리된 수층 시료를 버린다.

6.1.8  위 6.1.7의 분리된 용매층에, 세정수 150 mL를 넣고 5분간 재진탕한 다음, 분리된 수층 시료를 버린다.

6.1.9  위 6.1.8에서 얻어진 노말-헥산층의 남은 수분은 무수황산나트륨으로 탈수한 후 회전증발농축기를 이용하여 1  mL 미만으로 농축한다.

6.2  다층 실리카겔 컬럼 정제

6.2.1  정제용 컬럼의 액면을 노말-헥산으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.2.2  노말-헥산을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.3  위 4.6에서 조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.2.4  위 4.5의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.5  위 4.7의 44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

6.2.6  위 4.5의 실리카겔 0.6 g을 충진한다.

6.2.7.  위 4.8의 10 % 질산은이 함유된 실리카겔 3 g을 충진한다.

6.2.8  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.2.9  위 6.1.9에서 얻어진 시료 용액을 조심스럽게 주입하고, 소량의 노말-헥산으로 세정한다.

6.2.10  노말-헥산 130 mL를 적하 속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.11  얻어진 용출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL까지 농축하고 내부표준물질을 주입하고 노난 20 ∼ 100 μL로 용매를 치환하여 HRGC/HRMS로 분석한다.

6.3  고분해능 기체크로마토그래피/질량분석기 분석

6.3.1  질량수 교정

질량분석기에 질량수 교정용 표준물질 퍼플루오로케로센(Perfluorokerosene, PFK)를 주입하고, 질량수 교정 프로그램에 의해 매스 스펙트럼의 패턴, 분해능(10,000 이상, 10 % valley) 등을 측정 목적에 따라 소정의 값으로 교정한다. 질량 교정 결과를 측정 결과와 함께 보존한다.

6.3.2  시료의 측정

6.3.2.1  표 5에 나타낸 각 염소 화합물의 모니터 이온을 1개의 염화물에 대하여 2개 이상 설정한다.

6.3.2.2  위 6.2.11에서 제조한 최종 분석용 시료액 1 ∼ 2 μL를 HRGC/HRMS에 주입한다.

6.3.2.3  위 6.3.2.1에서 설정한 각 염소화물의 정량용 질량수와 확인용 질량수에 대하여 크로마토그램을 기록하고, 2개 이상의 모니터 이온의 피크 면적비를 계산한다.

6.3.2.4  측정 종료 후, 정량 작업에 들어가기 전에 개개의 시료마다 록매스(Lock mass) 모니터 채널의 감도(response)를 확인한다.

6.3.2.5  각 염소화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적을 구한다.

표 5. 다이옥신-유사 PCBs 분석을 위한 측정질량수

  (단위: m/z)                                 

┌──────┬────┬────┬────┐

│대상 화합물 │M       │M+2     │M+4     │

├──────┼────┼────┼────┤

│T4CBs       │289.922 │291.919 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│P5CBs       │        │325.880 │327.877 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H6CBs       │        │359.841 │361.839 │

├──────┼────┼────┼────┤

│H7CBs       │        │393.802 │395.800 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-T4CBs │301.963 │303.960 │        │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-P5CBs │        │337.921 │339.918 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H6CBs │        │371.882 │373.879 │

├──────┼────┼────┼────┤

│13C12-H7CBs │        │405.843 │407.840 │

└──────┴────┴────┴────┘

표 6. 다이옥신-유사 PCBs 염소 동위체의 이론 천연 존재비

  (단위: %)                                         

┌──────┬──┬──┬──┬──┬──┬──┐

│대상 화합물 │M   │M+2 │M+4 │M+6 │M+8 │M+10│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│T4CBs       │76.7│100 │49.1│10.8│0.93│    │

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│P5CBs       │61.4│100 │65.3│21.4│3.56│    │

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H6CBs       │51.2│100 │81.5│35.5│8.75│1.17│

├──────┼──┼──┼──┼──┼──┼──┤

│H7CBs       │43.9│100 │97.7│53.1│17.4│3.43│

└──────┴──┴──┴──┴──┴──┴──┘

7. 분석절차 흐름도

그림 1. 다이옥신-유사 PCBs 분석절차 흐름도

8. 정도평가/정도관리(QA/QC)

8.1  검출한계, 정확도, 정밀도 측정은 해양퇴적물공정시험기준 제4장 제21항 유기염소계 농약의 8. 정도평가/정도관리를 따른다.

8.2  시약의 조제와 시료의 전처리, HRGC/HRMS를 이용한 분석절차에서 발생할 수 있는 바탕오염을 확인하고, 시료의 분석에 지장이 없는 실험실 환경을 유지하기 위해 실험실 바탕시료(laboratory method blank) 시험을 수행한다.

8.3  다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 분석에 대해 계산된 회수율은 50 ∼ 120 % 범위를 만족 하며, 이 범위를 벗어나면 정제과정을 새로 실시한다. 재정제시에도 이 범위를 만족하지 못하면 분석 결과는 폐기하고, 분석의 전과정을 재점검하여 다시 수행한다.

8.4  HRGC/HRMS를 이용한 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 분석시, 표 34에 나타낸 분석방법 검출한계(MDL)를 만족 한다.

8.5  HRGC/HRMS는 분해능 10,000 이상에서 분석이 수행되어야 하며, 질량수 교정용 표준물질인 PFK의 검정결과는 이론값과 실측값과의 차이가 5 ppm 이하를 만족 하며, 이 값을 만족하지 못할 경우에는 HRGC/HRMS를 재조정 한다.

8.6  검량선 작성을 위해 사용되는 5단계 정량용 표준물질을 HRGC/HRMS에 주입하여 감응계수(RF)의 선형성 여부를 확인하며, RF는 상대표준편차가 20 % 미만이어야 하며, 선형성을 만족하지 못하면 HRGC/HRMS를 재조정하여 재분석 한다.

8.7  다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 각 분석대상 화합물의 정량을 위해 사용되는 두 개의 선택이온(m/z) 피크의 면적비가 표 6에 나타낸 동족체의 면적비에 대하여 ±15 % 이내에 있어야 한다.

8.8  분석대상 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐 화합물의 각 이온(m/z)값에 해당하는 크로마토그램의 피크에 대한 분석신호 대 바탕신호(S/N)의 비가 시료의 경우 2.5 이상이어야 하며, 정량용 표준물질에 대해서는 S/N비가 10 이상이어야 한다.

9. 결과

9.1  검량선

9.1.1  내부표준물질에 해당하는 각 염소화물에 대하여 0.1 ∼ 800 pg/μL 농도범위에서 0을 포함하여 5단계 이상의 표준농도계열을 만든다.

9.1.2  앞의 9.1.1항에서 조제한 표준농도계열 1 ∼ 2 μL를 HRGC/HRMS에 주입하고, 위 6.3항의 조작을 행하여 각 염소화물의 크로마토그램을 기록한다.

9.1.3  9.1.2항에서 측정한 검량선용 표준농도계열의 각 염소화물마다 정량용 질량수와 확인용 질량수의 피크 면적비를 산출한다.

9.1.4  9.1.3에서 구한 각 염소화물의 면적비가 표 6의 천연존재비와 거의 일치하는 것을 확인한다.

9.1.5  각 염소화물의 정량용 질량수 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 주입한 표준용액 중의 각 염소화물의 질량으로부터 검량선을 작성한다. 

9.1.6  분석대상물질의 감응계수(Response Factor, RF)를 구한다. RF는 다음 식에 의해 산출한다.

                             (식 1)

AS: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

IS: 표준용액 중의 분석대상물질의 농도(첨가량)

IIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도(첨가량)

9.2  농도계산

다음 식에 의해 농도를 환산한다.

                          (식 2)

 C : 분석대상물질의 농도(pg/g)

 As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

 AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적)

 Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(pg)

 RF: 감응계수

 W: 시료량(습중량, g)

9.2.1  정량은 정량 하한치(분석방법 검출한계 0.2 pg/g) 이상의 피크에 대해서만 행한다.

9.2.2  동위체 농도는 4염소화물부터 7염소화물의 각 동위체와 그 총합을 표시한다.

9.2.3  동위체 농도는 독성등가계수(Toxic Equivalent Factor, TEF)를 가지는 PCB 이성질체 농도로 표시한다.

9.2.4  독성등가계수(TEF)를 가지는 PCB 이성질체의 각 농도는 사용한 표준물질의 측정 분석값을 사용하여 정량한다.

9.2.5  정량된 실측농도에 표 7의 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 독성등가계수(TEF)를 곱하여 독성등가량(Toxic Equivalent, TEQ)을 산출하고 그 합계를 구한다.

표 7. 다이옥신-유사 PCBs의 독성등가계수(WHO-TEF 2005)

┌────────┬───────────┬─────┬────┐

│대상 화합물     │PCBs 화합물명         │IUPAC No. │TEF     │

├────────┼───────────┼─────┼────┤

│Non-ortho PCBs  │3,3',4,4'-T4CB        │77        │0.0001  │

│                │                      │          │        │

│                │3,3',4',5-T4CB        │81        │0.0003  │

│                │                      │          │        │

│                │3,3',4,4',5-P5CB      │126       │0.1     │

│                │                      │          │        │

│                │3,3',4,4',5,5'-H6CB   │169       │0.03    │

├────────┼───────────┼─────┼────┤

│Mono-ortho PCBs │2,3,3',4,4'-P5CB      │105       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,4,4',5-P5CB       │114       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3',4,4',5-P5CB      │118       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2',3,4,4',5-P5CB      │123       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,3',4,4',5-H6CB    │156       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,3',4,4',5'-H6CB   │157       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3',4,4',5,5'-H6CB   │167       │0.00003 │

│                │                      │          │        │

│                │2,3,3',4,4',5,5'-H7CB │189       │0.00003 │

└────────┴───────────┴─────┴────┘

9.3  결과보고

시료에 들어 있는 각 다이옥신-유사 폴리클로리네이티드비페닐의 농도와 함께 검량식 및 감응계수, 검출한계, 정확도, 정밀도, 결정계수(r2)를 제시한다.

제28항 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl Substances, PFASs)

1. 측정원리

이온쌍 추출법을 이용하여 해양생물 중의 과불화화합물(Per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs)을 추출한 뒤 액체크로마토그래프-삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)의 전자분무식이온화(ElectroSpray Ionization, ESI) 방식을 사용하여 다중반응검지법(Multiple reaction monitoring, MRM)로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효 정량 범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 분석기기에 대한 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있다. 건시료 0.5 g 기준 액체크로마토그래프-삼중질량분석기를 이용한 과불화화합물(PFASs)의 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 99 % 신뢰구간에서 0.05 ∼ 0.50 ng/g dw (건중량) 정도이며, 성분별 정량한계를 표 1에 나타내었다.

표 1. PFASs의 정량한계(LOQ)

┌───┬─────────┬───┬─────────┐

│성분  │정량한계(ng/g dw) │성분  │정량한계(ng/g dw) │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFBS  │0.50              │PFNA  │0.10              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFHS  │0.20              │PFDA  │0.05              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFOS  │0.20              │PFUnDA│0.10              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFDS  │0.20              │PFDoDA│0.10              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFPeA │0.20              │PFTrDA│0.10              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFHxA │0.05              │PFTeDA│0.10              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFHpA │0.10              │PFHxDA│0.10              │

├───┼─────────┼───┼─────────┤

│PFOA  │0.10              │PFOcDA│0.10              │

└───┴─────────┴───┴─────────┘

3. 기구 및 기기

실험에 사용되는 기구 및 기기는 과불화화합물의 측정 및 분석과정에서 발생할 수 있는 방해 요인을 최소화 하여 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮추어야한다. 실험 전 확인 시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염 유무를 반드시 확인해야 하고, 실험 전과정에 과불화화합물이 포함 될 수 있는 재질의 사용을 금해야 한다. 분석대상물질이 유리 표면에 흡착될 수 있으므로 과불화화합물 표준물질, 추출액과 시료 등은 유리재질의 용기나 피펫 등을 이용하지 말아야 한다. 구입한 표준용액이나 내부표준용액 등이 담겨 있는 유리용기(앰플)는 허용되지만 희석할 때에는 폴리프로필렌 재질의 용기를 이용 한다.

방해물질들은 용매에 포함된 오염물질, 시약(HPLC급 증류수 포함), 시료 용기와 뚜껑, 다른 시료처리 기구에서 비롯할 수 있으며 이들이 크로마토그램의 바탕선을 상승시킨다. 이 방법에 의한 분석대상물질은 일반적인 실험실 용품이나 장비, 예를 들면, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 제품, 액체크로마토그래프(LC) 용매 라인, 메탄올, 알루미늄 호일, 고체상추출(SPE) 시료 이송 라인 등에서도 발견될 수 있다. 이와 같이 오염 가능성이 있는 모든 용기나 기구는 정기적으로 검사하여 방해물질이 실험실 공시료 수준 이하로 존재하도록  한다.

3.1  초자기구

3.1.1  시료용기: 폴리프로필렌(PP) 재질의 스크류뚜껑이 있는 50 mL 폴리프로필렌 일회용 용기, 15 mL 폴리프로필렌 용기, 원심분리관, 또는 폴리프로필렌 재질의 스크류뚜껑이 있는 폴리프로필렌 자동시료주입기 용기를 사용한다.

3.1.2  15, 50 mL 폴리프로필렌 튜브

3.1.3  250, 500 mL 폴리프로필렌 부피플라스크

3.2  기기

3.2.1  폴리머 또는 코폴리머 재질의 카트리지(Envicarb C18, 200 mg/6 cc 또는 동등 이상)를 이용한다.

3.2.2  진공 추출용 매니폴더: 많은 양의 시료를 전처리할 수 있는 진공추출용 매니폴더(Supelco 57030, 57275 또는 동급)를 사용한다.

3.2.3  질소농축기: 99.995 % 이상의 고순도 질소 사용

3.2.4  액체크로마토그래피/삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)

3.2.4.1  LC 시스템: 5 ∼ 10 μL 용량의 시료를 반복적으로 주입할 수 있어야 하며, 농도 기울기 조절이 가능하고 분석 유량(0.2 mL/min)을 일정하게 유지할 수 있는 이성분(binary) 펌프가 있는 시스템이 요구된다. 액체크로마토그래프 시스템은 오염의 원인이 될 수 있는 기포제거장치(degasser)가 없이도 용매를 일정하게 조절할 수 있어야 한다.

3.2.4.2  권장 컬럼: 적절한 분해능, 피크 모양, 정확도 및 정밀도를 가지는 역상 C18 액체크로마토그래프 컬럼(2.0 × 150 mm, 3 μm 또는 동급 이상)을 사용한다.

3.2.4.3  검출기(MS/MS):　액체크로마토그래프(LC)에서 분석하는 유량(0.3 mL/min) 근처에서 음이온 전자분사 이온화(ESI)가 가능한 장비이어야 한다. 적절한 정밀도를 유지하기 위해서 크로마토그램 상의 피크당 10번 이상의 스캔을 할 수 있어야 한다.

3.2.4.4  이동상: 이동상은 과불화화합물 분리에 적절하도록 선택한다. 이동상 A는 5 mM 암모늄아세테이트가 포함된 증류수, 이동상 B는 메탄올을 이용하여 분리하고 방해물질과 분석대상물질의 피크가 최대한 겹치지 않는 경사용매조성법(gradient mode)을 이용한다. 또한 이동상의 유량은 컬럼의 분리효율이 최대로 되는 300 μL/min으로 하고 시료 주입량은 10 μL로 한다.

4. 시약 및 표준용액

전체의 시약류에는 과불화화합물의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인 시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약

4.1.1  메탄올

4.1.2  아세토니트릴

4.1.3  암모늄아세테이트

4.2  증류수: HPLC급 이상의 증류수를 이용 한다. 분석대상물질의 피크가 검출한계의 1/3 이상 발견되지 않아야 한다. 실험실에서 제조된 3차 증류수의 경우 제조시 18 ΜΩ 이상의 저항값을 유지하도록 관리해야 하며, 공시료 및 시료의 전처리 및 분석에 이용하기 전에 고체상추출용 카트리지를 통과시켜야 한다.

4.3  표준용액과 내부표준용액

4.3.1  표준용액(표 2): 표준용액은 메탄올을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석 물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.3.2  내부표준용액(표 2): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업 농도범위로 희석하여 사용한다.

표 2. 측정에 사용하는 PFASs 표준물질

┌─────────┬─────────────┬───┬──────┐

│대상 화합물       │PFASs 화합물              │약어  │내부표준물질│

├─────────┼─────────────┼───┼──────┤

│PFSAs             │Perflurobutane sulfonate  │PFBS  │13C12-PFBS  │

│(Perfluoroalkane  │Perflurohexane sulfonate  │PFHS  │13C12-PFHS  │

│sulfonic acids)   │Perflurooctane sulfonate  │PFOS  │13C12-PFOS  │

│                  │Perflurodecane sulfonate  │PFDS  │13C12-PFOS  │

├─────────┼─────────────┼───┼──────┤

│PFCAs             │Perfluropentanoic acid    │PFPeA │13C12-PFHxA │

│(Perfluoroalkyl   │Perflurohexanoic acid     │PFHxA │13C12-PFHxA │

│carboxylic acids) │Perfluroheptanoic acid    │PFHpA │13C12-PFOA  │

│                  │Perflurooctanoic acid     │PFOA  │13C12-PFOA  │

│                  │Perflurononanoic acid     │PFNA  │13C12-PFNA  │

│                  │Perflurodecanoic acid     │PFDA  │13C12-PFDA  │

│                  │Perfluroundecanoic acid   │PFUnDA│13C12-PFUnDA│

│                  │Perflurododecanoic acid   │PFDoDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurotridecanoic acid  │PFTrDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurotetradecanoic acid│PFTeDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurohexadecanoic acid │PFHxDA│13C12-PFDoDA│

│                  │Perflurooctadecanoic acid │PFOcDA│13C12-PFDoDA│

└─────────┴─────────────┴───┴──────┘

5. 시료보관 및 전처리

채취된 해양생물 시료는 껍질을 제거한 후 가식부를 채취하여 250 혹은 500 mL의 갈색유리병에 담아 즉시 냉동시켜  분석 전까지 ?20 °C 이하에서 보관한다. 냉동된 시료를 실험실로 운반하여 해동하여 조직 분쇄기로 분쇄 및 균질화 한다.

6. 시험 방법

6.1  추출(이온쌍 추출법)

6.1.1  균질화된 건시료 0.5 g을 칭량하여 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 넣고 증류수 2 mL를 넣고 내부표준물질 5 ng을 첨가한다.

6.1.2  0.5 M TBA solution(1 mL), 0.25 M Sodium carbonate buffer solution(2 mL)을 넣고 MTBE 5 mL을 첨가하여 수평식진탕기(250 rpm, 20분)이용하여 진탕 추출한다.

6.1.3  추출이 끝난 후 원심분리(3000 rpm, 20분)하여 상등액을 분취한다.

6.1.4  6.1.2 ∼ 6.1.3항을 1회 더 반복한다.

6.1.5  얻어진 상등액을 질소농축기로 1 mL까지 농축하고, 메탄올을 100 ∼ 1000 μL 첨가해 용매 치환 후 질소가스로 0.5 mL까지 농축한다.

6.1.6  용매 치환된 시료를 0.22 μm 공경의 나일론 재질 필터(Nylon filter)를 이용해 여과 후, LC/MS/MS로 분석한다.

6.2  액체 크로마토그래피 분석

6.2.1  표 3에 주어진 액체 크로마토그래피 조건을 적용하여 제조된 측정용 시료 10 μL를 액체 크로마토그래피의 주입부에 주입한다.

6.2.2  액체크로마토그래프- 삼중질량분석기의 전자분사 이온화 방식을 이용하여 과불화화합물을 검출한다. 표 4와 표 5에 주어진 분석대상물질 별 정량 및 정성을 위한 모분자이온(Q1)과 생성이온(Q3) 조건을 적용하여 다중반응검지법(MRM)으로 분석한다. 정량 및 정성이온의 머무름 시간과 면적비를 검사하여 각 물질들을 확인한 다음 내부표준법으로 정량한다.

표 3. PFASs 분석을 위한 LC/MS/MS의 기기조건

┌───────────────────────────┐

│액체크로마토그래프(LC) 조건                           │

├─────────┬─────────────────┤

│Column            │C18, 2.1 × 150 mm, 5.0 μm       │

├─────────┼─────────────────┤

│Mobile phase      │A: 5 mM Ammonium acetate in water │

│                  │B: Methanol                       │

├─────────┼──┬─┬──┬──┬──┬───┤

│Gradient mode     │Time│0 │5   │10  │10.1│22    │

│                  ├──┼─┼──┼──┼──┼───┤

│                  │A(%)│70│0   │0   │70  │70    │

│                  ├──┼─┼──┼──┼──┼───┤

│                  │B(%)│30│100 │100 │30  │30    │

├─────────┼──┴─┴──┴──┴──┴───┤

│Flow rate         │300 μL/min                       │

├─────────┼─────────────────┤

│Injection volume  │10 μL                            │

├─────────┴─────────────────┤

│삼중질량분석기(MS/MS) 조건                            │

├─────────┬─────────────────┤

│Ionization mode   │ESI negative mode                 │

├─────────┼─────────────────┤

│Curtain gas       │25 psi                            │

├─────────┼─────────────────┤

│Gas temperature   │400 °C                           │

├─────────┼─────────────────┤

│Ion spray voltage │?4500 V                          │

├─────────┼─────────────────┤

│Ion source gas 1  │40 psi                            │

│Ion source gas 2  │60 psi                            │

├─────────┼─────────────────┤

│Collision gas(CAD)│6                                 │

└─────────┴─────────────────┘

표 4. PFASs 분석을 위한 표준물질(17종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질│정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│        ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │        │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │        │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │        │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│PFSAs │PFBS    │298.9 │99.9  │36        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHS    │398.9 │80.0  │48        │398.9 │99.0  │40        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOS    │498.9 │79.9  │60        │498.9 │99.0  │48        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDS    │598.9 │80.0  │60        │598.9 │99.0  │66        │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│PFCAs │PFPeA   │262.9 │218.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHxA   │312.9 │268.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHpA   │362.9 │318.9 │4         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOA    │412.9 │368.9 │8         │412.9 │168.8 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFNA    │462.8 │418.9 │8         │462.8 │218.8 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDA    │513.0 │469.0 │8         │513.0 │269.0 │20        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFUnDA  │563.0 │518.8 │8         │563.0 │269.0 │16        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFDoDA  │613.0 │569.0 │8         │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFTrDA  │663.0 │618.8 │8         │663.0 │268.9 │23        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFTeDA  │712.9 │668.8 │12        │712.9 │368.5 │20        │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFHxDA  │812.9 │768.8 │12        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │PFOcDA  │912.9 │868.8 │12        │912.9 │369.0 │28        │

└───┴────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

표 5. PFASs 분석을 위한 내부표준물질(9종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬──────┬──────────────┬──────────────┐

│대상  │대상물질    │정량이온                    │정성이온                    │

│화합물│            ├────┬───┬─────┼────┬───┬─────┤

│      │            │Q1      │Q3    │Collision │Q1      │Q3    │Collision │

│      │            │(m/z)   │(m/z) │energy    │(m/z)   │(m/z) │energy    │

│      │            │        │      │(CE)      │        │      │(CE)      │

├───┼──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│PFSAs │13C12-PFBS  │301.9   │79.7  │62        │-       │-     │-         │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFHS  │402.9   │83.7  │60        │402.9   │102.8 │50        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFOS  │502.9   │79.9  │100       │502.9   │98.7  │50        │

├───┼──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│PFCAs │13C12-PFHxA │314.7   │269.9 │4         │-       │-     │-         │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFOA  │416.9   │371.9 │8         │416.9   │168.8 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFNA  │467.8   │422.9 │8         │467.8   │219.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFDA  │514.9   │469.9 │8         │514.9   │219.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFUnDA│564.9   │519.9 │8         │564.9   │269.0 │16        │

│      ├──────┼────┼───┼─────┼────┼───┼─────┤

│      │13C12-PFDoDA│614.9   │569.9 │8         │614.9   │269.0 │20        │

└───┴──────┴────┴───┴─────┴────┴───┴─────┘

7. 정도평가/정도관리

7.1  검출한계

7.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

7.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 기기검출한계는 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 3배(혹은 5배)로 정의한다.

7.1.3  정량한계(Limit of Quantification, LOQ)

측정장치에서 분석 물질의 정밀성과 정확성을 가지는 정량값을 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 정량한계는 일반적으로 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 10배로 정의한다.

7.1.4  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(Method blank 혹은 Procedural blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 시료를 첨가하지 않은 상태에서 시료와 동일한 분석절차 하에 측정하며, 이 때 얻은 값이 방법검출한계 이하이어야 한다.

7.2  정확도(Accuracy)

7.2.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석 전 시료에 첨가되어진 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

7.2.2  표준시료(Certified reference material, CRM)의 회수율

공인되어진 표준시료를 분석하여 얻어진 값과 공인값을 비교하여 시료 분석의 정확도를 검증한다.

             (식 1)

기기분석에서 관측되어진 값은 제 6.2.2항으로부터 계산되어진다. 공인된 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 자료질관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 측정된 농도는 표준물질의 공인값에 만족하는 결과를 나타내어야 한다. 국제원자력기구(IAEA) 및 미국 표준기술원(NIST) 등에서 생산된 다양한 CRM을 구입하여 사용할 수 있다.

7.2.3  시료에 첨가되어진 표준물질의 회수율

해양생물 시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가한 후, 동일한 실험을 수행하고 회수되어진 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

          (식 2)

     M: 첨가한 표준물질의 양

     Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값

     Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

7.3  검량선

7.3.1  분석대상 과불화화합물의 표준물질용액에 대하여 0.05 ∼ 1000 ng/mL 농도 범위에서 0을 포함한 5단계 이상의 표준농도 계열을 만들고, 내부표준물질이 일정 농도가 되도록 혼합 조제한다.

7.3.2  7.3.1항에서 조제한 농도별 표준물질혼합액 10 μL를 LC/MS/MS에 주입하고, 각 과불화화합물의 크로마토그램을 기록한다.

7.3.3  내부표준물질 및 농도별로 측정된 개별 과불화화합물의 크로마토그램을 확인 후, 머무름시간 및 설정된 다중반응검지법(MRM) 조건으로 정성ㆍ확정한다.

7.3.4  각각의 과불화화합물별로 검출된 피크(정량 이온) 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 표준용액 중의 각 과불화화합물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

7.3.5  분석대상 물질의 상대반응계수(RRF)를 구한다. RRF는 다음 식에 의해 산출한다.

                           (식 3)

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Cs: 표준용액 중의 분석 대상 물질의 농도

     CIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도

8. 결과

8.1  농도 계산

분석 대상의 각 과불화화합물의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                         (식 4)

     C: 분석대상물질의 농도

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(ng)

     RRF: 상대반응계수

     W: 시료량(건중량)

9. 분석 절차 흐름도

┌───────────────────────────┐  

│동결건조된 해양생물시료 0.5 g                         │  

└┬──────────────────────────┘  

  │　                                                      

┌┴──────────────────────────┐  

│초순수  2 mL 첨가 후 혼합                             │  

└┬──────────────────────────┘  

  │←  내부표준물질 5 ng 첨가                              

┌┴──────────────────────────┐  

│1차 이온쌍 추출                                       │  

│                                                      │  

│0.5 M TBA solution(pH 10): 1 mL / 0.25 M Sodium       │  

│carbonate buffer solution 2 mL / MTBE 5 mL            │  

│                                                      │  

│(수평식 진탕기: 250 rpm, 20분)                        │  

└┬──────────────────────────┘  

  │　                                                      

┌┴──────────────────────────┐  

│원심분리(3000 rpm, 30 분) 후 상등액(MTBE) 분취        │  

└┬──────────────────────────┘  

  │　                                                      

┌┴──────────────────────────┐  

│2차 이온쌍 추출                                       │  

│                                                      │  

│0.5 M TBA solution(pH 10): 1 mL / 0.25 M Sodium       │  

│carbonate buffer solution 2 mL / MTBE 5 mL            │  

│                                                      │  

│(수평식 진탕기: 250 rpm, 20분)                        │  

└┬──────────────────────────┘  

  │　                                                      

┌┴──────────────────────────┐  

│원심분리(3000 rpm, 30 분) 후 상등액(MTBE) 분취        │  

└┬──────────────────────────┘  

  │　                                                      

┌┴──────────────────────────┐  

│1차, 2차 이온쌍 추출 후 분취된 상등액(MTBE) 질소 농축 │  

└┬──────────────────────────┘  

  │                                                        

  │                                                        

  │　                                                      

┌┴──────────────────────────┐  

│농축(Evaporation)                                     │  

└┬──────────────────────────┘  

  │　                                                      

  │                                                        

  │←  Methanol 치환                                       

  │                                                        

  │←  Nylon filter (0.22μm) 여과                         

  │                                                        

  │                                                        

┌┴──────────────────────────┐  

│LC/MS/MS 분석                                         │  

└───────────────────────────┘  

그림 1. 해양생물 내 과불화화합물(PFASs)의 분석절차 흐름도

제29항 헥사브로모사이클로도데칸류       (Hexabromocyclododecanes, HBCDs)

1. 측정원리

속슬렛 추출법을 이용하여 해양생물 중의 브롬화난연제(BFRs) 중 헥사브로모사이클로도데칸((Hexabromocyclododecanes, HBCDs)을 추출한 후 GPC 컬럼을 이용하여 추출액 중의 지방을 제거한 뒤, 다층 실리카겔 컬럼 정제과정으로 색소류, 황 등의 분석 방해물질을 제거한 뒤 액체크로마토그래프-삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)의 전자분무식이온화(ElectroSpray Ionization, ESI) 방식을 사용하여 다중반응검지법(Multiple Reaction Monitoring, MRM)으로 분석한다.

2. 정량범위 및 정밀도

유효 정량 범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 분석기기에 대한 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있다. 건시료 2 g의 기준 액체크로마토그래프-삼중질량분석기를 이용한 헥사브로모사이클로도데칸(HBCDs)의 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 99 % 신뢰구간에서 0.06 ng/g dw(건중량) 정도이며, 성분별 정량한계를 표 1에 나타내었다.

표 1. HBCDs의 정량한계(LOQ)

┌────┬─────────┐

│성분    │정량한계(ng/g dw) │

├────┼─────────┤

│α-HBCD │0.06              │

├────┼─────────┤

│β-HBCD │0.06              │

├────┼─────────┤

│γ-HBCD │0.06              │

└────┴─────────┘

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

실험에 사용되는 기구 및 장치에는 브롬화난연제의 측정 및 분석에 방해를 주는 것이 없는지를 확인하고 동시에 바탕농도(blank) 값을 가능한 한 낮춘다. 사용 전 확인 시험을 통해 기구 및 장치에 의한 오염이 없는지를 확인하는 것이 좋다. 실험에 사용되는 모든 초자기구는 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 잘 헹구고 아세톤으로 세척한 후 건조기에서 충분히 건조시켜 사용하기 전에 아세톤으로 닦아 기구에 의한 오염 영향을 줄인다.

3.1.1  속슬렛 추출장치: 냉각장치, 속슬렛 추출장치, 팀블 여과지, 추출용 플라스크 및 가열장치 등으로 구성되어야 한다.

3.1.2  250, 500 mL 갈색유리병 

3.1.3  250, 500 mL 가지형 플라스크

3.1.4  1 ∼ 2 mL 유리바이알

3.1.5  10 mL 시험관

3.1.6  액체 컬럼크로마토관: 다층 실리카겔 컬럼용(길이 300 mm, 내경 20 mm)의 유리제 컬럼크로마토관

3.1.7  GPC 컬럼용(길이 500 mm, 내경 30 mm)의 유리제 컬럼크로마토관

3.1.8  탈지면: 헥세인 혹은 톨루엔으로 세정하여 건조된 것을 사용한다.

3.2  기기

3.2.1  회전증발농축기(Rotary Evaporator): 온도를 조절할 수 있고 일정온도를 유지하는 기능을 가진 수욕조가 갖추어져야 한다.

3.2.2  흡인장치(Aspirator): 회전증발농축기를 진공상태로 유지할 수 있어야 한다.

3.2.3  냉각수 순환장치(Cooling Circulator)

3.2.4  액체크로마토그래피/삼중질량분석기(Liquid Chromatograph/Tandem Mass Spectrometer, LC/MS/MS)

3.2.4.1  LC 시스템: 5 ∼ 10 μL 용량의 시료를 반복적으로 주입할 수 있어야 하며, 농도 기울기 조절이 가능하고 분석 유량(0.4 mL/min)을 일정하게 유지할 수 있는 이성분(binary) 펌프가 있는 시스템이 요구된다. 액체크로마토그래프 시스템은 오염의 원인이 될 수 있는 기포제거장치(degasser)가 없이도 용매를 일정하게 조절할 수 있어야 한다.

3.2.4.2  권장 컬럼: 적절한 분해능, 피크 모양, 정확도 및 정밀도를 가지는 역상 C18 액체크로마토그래프 컬럼(2.1 × 150 mm, 3.5 μm 또는 동급 이상)을 사용한다.

3.2.4.3  검출기(MS/MS):　액체크로마토그래프(LC)에서 분석하는 유량(0.4 mL/min) 근처에서 음이온 전자분사 이온화(ESI)가 가능한 장비이어야 한다. 적절한 정밀도를 유지하기 위해서 크로마토그램 상의 피크당 10번 이상의 스캔을 할 수 있어야 한다.

3.2.4.4  이동상: 이동상은 HBCDs 분리에 적절하도록 선택한다. 이동상 A는 25 % 메탄올이 포함된 증류수, 이동상 B는 30 % 메탄올이 포함된 아세트나이트릴을 이용하여 분리하고 방해물질과 분석대상물질의 피크가 최대한 겹치지 않는 경사용매조성법(gradient mode)을 이용한다. 또한 이동상의 유량은 컬럼의 분리효율이 최대로 되는 400 μL/min으로 하고 시료 주입량은 10 μL로 한다.

4. 시약 및 표준용액

전체의 시약류에는 브롬화난연제의 측정분석에 영향 혹은 방해성분이 함유되지 않은 것이 필요하며 사용 전 확인 시험을 해야 한다.

4.1  유기용매: 잔류농약분석용 혹은 그와 동등 이상의 시약

4.1.1  아세톤

4.1.2  헥세인

4.1.3  디클로로메탄

4.1.4  메탄올

4.1.5  아세트나이트릴

4.2  세정수: 헥세인으로 세정한 것

4.3  무수황산나트륨: 잔류농약시험용 혹은 그와 동등 이상의 것

4.4  황산, 수산화칼륨, 질산은: 시약특급 혹은 이것과 동등 이상의 것

4.5  실리카겔: 중성, 무활성, 70 ∼ 230 mesh

4.5.1  2 % 수산화칼륨 함유 실리카겔: 1 mol/L 수산화칼륨 용액을 4.5의 실리카겔에 대해 2 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 혼합 후 밀폐 가능한 용기에 넣어 진공데시케이터 내에 보관한다.

4.5.2  22 % 및 44 % 황산 함유 실리카겔: 4.5의 실리카겔에 황산이 22 %(w/w) 및 44 %(w/w)가 되도록 첨가하고, 충분히 혼합 후 밀폐 가능한 용기에 넣어 진공데시케이터 내에 보관한다.

4.6  GPC용 흡착제: Bio-beads, 200 ∼ 400 mesh

4.7  표준용액과 내부표준용액

4.7.1  표준용액(표 2): 표준용액은 메탄올을 이용하여 적합한 작업농도로 희석하여 분석 물질에 대한 기기의 감응도 평가를 위한 농도별 검정곡선 작성에 사용한다.

4.7.2  내부표준용액(표 2): 실험에 사용되는 모든 내부표준용액은 적합한 작업 농도범위로 희석하여 사용한다.

표 2. HBCDs의 표준물질 및 내부표준물질

┌──────┬─────────────┬────┬───────┐

│대상 화합물 │HBCDs 화합물              │약어    │내부표준물질  │

├──────┼─────────────┼────┼───────┤

│HBCDs       │α-Hexabromocyclododecane │α-HBCD │13C12-α-HBCD │

│            ├─────────────┼────┼───────┤

│            │β-Hexabromocyclododecane │β-HBCD │13C12-β-HBCD │

│            ├─────────────┼────┼───────┤

│            │γ-Hexabromocyclododecane │γ-HBCD │13C12-γ-HBCD │

└──────┴─────────────┴────┴───────┘

5. 시료의 보관 및 전처리

5.1  채취된 해양생물 시료는 껍질을 제거한 후 가식부를 채취하여 250 혹은 500 mL의 갈색유리병에 담아 즉시 냉동시켜 분석 전까지 ?20 °C 이하에서 보관한다.

5.2  냉동된 시료를 실험실로 운반하여 해동하여 조직 분쇄기로 분쇄 및 균질화 한다.

6. 시험방법

6.1  추출(속슬렛 추출방법)

6.1.1  균질화된 건시료 2 g을 칭량하여 팀블 여과지에 넣고 내부표준물질 20 ng을 첨가한다  

6.1.2  팀블 여과지를 속슬렛 추출장치에 넣은 후, 디클로로메탄:헥세인 혼합용액(3:1, v/v) 200 mL를 추출용 플라스크에 넣고 본체 냉각장치와 연결한 후 16시간 이상 추출한다.

6.1.3  추출이 끝난 후 실온으로 될 때까지 방치하고 속슬렛 장치를 분리한다.

6.1.4  추출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.2  GPC 컬럼 크로마토그래피 정제

6.2.1  4.6항의 Bio-beads(50 g)를 미리 세척된 유리비커에 담는다.

6.2.2  충분한 양의 디클로로메탄:헥세인(1:1, v/v)을 6.2.1항에서 준비한 유리비커에 담아 준다.

6.2.3  3.1.7항의 GPC용 컬럼에 6.2.2항에서 준비한 물질을 충진한다.

6.2.4  6.1.4항에서 얻어진 시료 용액을 조심스럽게 주입하고, 소량의 헥세인으로 세정한다.

6.2.5  50 % 디클로로메탄이 함유된 헥세인 용액 100 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려버린다.

6.2.6  50 % 디클로로메탄이 함유된 헥세인 용액 150 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.2.7  얻어진 용출액을 회전증발농축기를 이용하여 1 mL 미만으로 농축한다.

6.3  다층실리카겔 컬럼 크로마토그래피 정제

6.3.1  컬럼 크로마토관의 액면을 헥세인으로 채운 후 정제된 탈지면을 충진한다.

6.3.2  헥세인을 주입 후 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.3  4.5.1항에서 조제한 2 % 수산화칼륨이 함유된 실리카겔 2 g을 충진한다.

6.3.4  4.5항의 실리카겔 1 g을 충진한다.

6.3.5  4.5.2항의 44 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g과 22 % 황산이 함유된 실리카겔 4 g을 충진한다.

6.3.6  4.5항의 실리카겔 1 g을 충진한다.

6.3.7  상층에 무수황산나트륨을 1 cm 높이로 충진한다.

6.3.8  6.2.7항에서 얻어진 시료 용액을 조심스럽게 주입하고, 소량의 헥세인으로 세정한다.

6.3.9  50 % 디클로로메탄이 함유된 헥세인 용액 100 mL를 적하속도 2.5 mL/min로 흘려 용출시킨다.

6.3.10  얻어진 용출액을 회전증발농축기로 1 mL까지 농축하고, 메탄올을 100 ∼ 1000 μL 첨가해 용매 치환 후 질소가스로 0.5 mL까지 농축하여 LC/MS/MS로 분석한다.

6.4  액체 크로마토그래프 분석

6.4.1  표 3에 주어진 액체 크로마토그래프 조건을 적용하여 제조된 측정용 시료 10 μL를 액체 크로마토그래프의 주입부에 주입한다.

6.4.2  액체크로마토그래프-삼중질량분석기의 전자분사 이온화 방식을 이용하여 브롬화난연제를 검출한다. 표 4와 표 5에 주어진 분석대상물질 별 정량 및 정성을 위한 모분자이온(Q1)과 생성이온(Q3) 조건을 적용하여 다중반응검지법(MRM)으로 분석한다. 정량 및 정성이온의 머무름 시간과 면적비를 검사하여 각 물질들을 확인한 다음 내부표준법으로 정량한다.

표 3. HBCDs 분석을 위한 LC/MS/MS의 기기조건

┌──────────────────────────┐

│액체크로마토그래프(LC) 조건                         │

├─────────┬────────────────┤

│Column            │C18, 2.1 × 150 mm, 3.5 μm     │

├─────────┼────────────────┤

│Mobile phase      │A: 25 % Methanol in water       │

│                  │B: 30 % Methanol in Acetonitrile│

├─────────┼──┬─┬─┬──┬──┬─┬─┤

│Gradient mode     │Time│0 │1 │2   │10  │11│15│

│                  ├──┼─┼─┼──┼──┼─┼─┤

│                  │A(%)│90│90│0   │0   │90│90│

│                  ├──┼─┼─┼──┼──┼─┼─┤

│                  │B(%)│10│10│100 │100 │10│10│

├─────────┼──┴─┴─┴──┴──┴─┴─┤

│Flow rate         │400 μL/min                     │

├─────────┼────────────────┤

│Injection volume  │10 μL                          │

├─────────┴────────────────┤

│삼중질량분석기(MS/MS) 조건                          │

├─────────┬────────────────┤

│Ionization mode   │ESI negative mode               │

├─────────┼────────────────┤

│Curtain gas       │25 psi                          │

├─────────┼────────────────┤

│Gas temperature   │400 °C                         │

├─────────┼────────────────┤

│Ion spray voltage │?4500 V                        │

├─────────┼────────────────┤

│Ion source gas 1  │40 psi                          │

│Ion source gas 2  │60 psi                          │

├─────────┼────────────────┤

│Collision gas(CAD)│6                               │

└─────────┴────────────────┘

표 4. HBCDs 분석을 위한 표준물질(3종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질│정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│        ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │        │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │        │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │        │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│HBCDs │α-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │β-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

│      ├────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │γ-HBCD │640.7 │81.0  │25        │-     │-     │-         │

└───┴────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

표 5. HBCDs 분석을 위한 내부표준물질(3종)의 다중반응검지법(MRM)조건

┌───┬───────┬─────────────┬─────────────┐

│대상  │대상물질      │정량이온                  │정성이온                  │

│화합물│              ├───┬───┬─────┼───┬───┬─────┤

│      │              │Q1    │Q3    │Collision │Q1    │Q3    │Collision │

│      │              │(m/z) │(m/z) │energy    │(m/z) │(m/z) │energy    │

│      │              │      │      │(CE)      │      │      │(CE)      │

├───┼───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│HBCDs │13C12-α-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

│      ├───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │13C12-β-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

│      ├───────┼───┼───┼─────┼───┼───┼─────┤

│      │13C12-γ-HBCD │652.8 │79.0  │80        │-     │-     │-         │

└───┴───────┴───┴───┴─────┴───┴───┴─────┘

7. 정도평가/정도관리(QA/QC)

7.1  검출한계

7.1.1  방법검출한계(Method Detection Limit, MDL)

바탕시료에 정량한계 부근의 농도가 되도록 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고 각 시료를 분석절차에 따라 시험하여 표준편차를 구한다. 표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로 정의한다.

7.1.2  기기검출한계(Instrumental Detection Limit, IDL)

측정장치에서 분석 물질의 존재를 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 기기검출한계는 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 3배(혹은 5배)로 정의한다.

7.1.3  정량한계(Limit of Quantification, LOQ)

측정장치에서 분석 물질의 정밀성과 정확성을 가지는 정량값을 감지할 수 있는 최소 물질양을 의미하며, 시료처리를 포함한 화학분석 전 과정에서 나타날 수 있는 오차(방법검출한계)와는 다르다. 정량한계는 일반적으로 분석신호와 바탕신호의 비(signal to noise ratio, S/N)에 10배로 정의한다.

7.2  정확도(Accuracy)

7.2.1  시료 첨가용 내부표준물질의 회수율

분석 전 시료에 첨가된 시료 첨가용 내부표준물질의 회수율을 측정함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다. x축은 내부표준물질에 대한 시료 첨가용 내부표준물질 양의 비를 나타내며, y축은 스펙트럼에서 내부표준물질에 대한 내부표준물질의 면적비를 나타낸다. 일반적으로 내부표준물질의 첨가량은 일정하게 하고 내부표준물질을 3개 이상의 농도구배로 하여 시행한다.

7.2.2  표준시료(Certified reference material, CRM)의 회수율

공인되어진 표준시료를 분석하여 얻어진 값과 공인값을 비교하여 시료 분석의 정확도를 검증한다.

          (식 1)

기기분석에서 관측되어진 값은 제 6.2.2항으로부터 계산되어진다. 공인된 표준시료는 환경시료의 분석자료에 대한 자료질관리를 위해서 한 세트에 동시에 실시되어야 하며, 측정된 농도는 표준물질의 공인값에 만족하는 결과를 나타내어야 한다. 국제원자력기구(IAEA) 및 미국 표준기술원(NIST) 등에서 생산된 다양한 CRM을 구입하여 사용할 수 있다.

7.2.3  시료에 첨가된 표준물질의 회수율

해수 시료에 알려진 양의 표준물질을 첨가하여 동일한 실험을 수행한 후 회수된 양을 비교함으로써 시료 분석의 정확도를 검증한다.

         (식 2)

     M: 첨가한 표준물질의 양

     Mspiked: 표준물질을 첨가한 시료에서의 측정값

     Munspiked: 표준물질을 첨가하지 않은 시료에서의 측정값

7.3  검량선

7.3.1  분석대상 브롬화난연제의 표준물질 용액에 대하여 1 ∼ 500 ng/mL 농도 범위에서 5단계 이상의 표준농도 계열을 만들고, 일정 농도의 내부표준물질을 첨가한 후 혼합 조제한다.

7.3.2  7.3.1에서 조제한 표준 농도 계열의 10 μL를 LC/MS/MS에 주입하고, 각 브롬화화합물의 크로마토그램을 기록한다.

7.3.3  내부표준물질 및 농도별로 측정된 개별 브롬화화합물의 크로마토그램을 확인 후, 머무름시간 및 설정된 다중반응검지법(MRM) 조건으로 정성ㆍ확정한다.

7.3.4  각각의 브롬화화합물별로 검출된 피크(정량 이온) 및 내부표준물질의 피크 면적비를 구하고, 이들의 피크 면적비와 표준용액 중의 각 브롬화화합물의 질량으로부터 검량선을 작성한다.

7.3.5  분석대상 물질의 상대반응계수(RRF)를 구한다. RRF는 다음 식에 의해 산출한다.

                         (식 3)

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Cs: 표준용액 중의 분석 대상 물질의 농도

     CIS: 표준용액 중의 내부표준물질의 농도

8. 결과

8.1  농도 계산

분석 대상의 각 브롬화화합물의 농도는 아래식을 사용하여 구한다.

                          (식 4)

     C: 분석대상물질의 농도

     As: 분석대상물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     AIS: 내부표준물질의 모니터 이온의 감도(피크 면적값)

     Is: 분석시료 중의 내부표준물질의 첨가량(ng)

     RRF: 상대반응계수

     W: 시료량(건중량)

9. 분석절차 흐름도

┌────────────────┐        

│해양생물(건시료 약 2 g)         │        

└┬───────────────┘        

  │← 내부표준물질 20 ng 첨가              

┌┴───────────────┐        

│속슬렛 추출(Soxhlet Extraction) │        

└┬───────────────┘        

  │←  75 % DCM in Hexane (200 mL, 16 hr)  

┌┴───────────────┐        

│농축(Evaporation)               │        

└┬───────────────┘        

  │                                        

┌┴───────────────┐        

│GPC 칼럼 정제(Clean-up)         │        

└┬───────────────┘        

  │← 50 % DCM in Hexane (150 mL)          

┌┴───────────────┐        

│다층실리카겔컬럼 정제(Clean-up) │        

└┬───────────────┘        

  │← 50 % DCM in Hexane (100 mL)          

┌┴───────────────┐        

│농축(Evaporation)               │        

└┬───────────────┘        

  │← Methanol 치환                        

┌┴───────────────┐        

│LC/MS/MS 분석                   │        

└────────────────┘        

그림 1. 해양생물 내 브롬화난연제(HBCDs)의 분석절차 흐름도

별표 0004: 해양폐기물공정시험기준

[별표4] 해양폐기물공정시험기준

2023. 11.

해양수산부 국립수산과학원

목   차

제1장 총칙1

제1항 개요1

제2장 시료의 채취 및 보관3

제1항 시료의 채취방법3

제2항 시료의 보관방법7

제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법8

제1항 분석자료의 기초통계8

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)8

제3항 농도표시 및 단위8

제4장 항목별 시험방법9

제1항 함수율(Water Content)9

제2항 용존산소(Dissolved Oxygen, DO)10

제3항 생물화학적 산소요구량 (Biochemical Oxygen Demand, BOD)17

제4항 화학적 산소요구량(Chemical Oxygen Demand, COD)23

제5항 총질소(Total Nitrogen, TN)27

제6항 총인(Total Phosphorus, TP)36

제7항 시안(Cyanides, CN)41

제8항 페놀류(Phenols)46

제9항 광유류(Mineral oil)51

제10항 구리(Copper, Cu)56

제11항 납(Lead, Pb)61

제12항 니켈(Nickel, Ni) 63

제13항 아연(Zinc, Zn) 65

제14항 카드뮴(Cadmium, Cd)67

제15항 크롬(Chromium, Cr)69

제16항 비소(Arsenic, As)71

제17항 수은(Mercury, Hg)73

제18항 유기인(Organophosphorus Pesticides, OPs) 77

제19항 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) 85

제20항 폴리클로리네이티드비페닐(Polychlorinated Biphenyls, PCBs) 94

제21항 발광박테리아(Vibrio fischeri)를 이용한 해양배출 폐기물 독성평가 방법104

제22항 저서성 단각류(Monocorophium)를 이용한 해양배출 폐기물 독성평가 방법108

제1장 총칙

제1항 개요

1. 목적

이 시험방법은 「해양환경관리법」 제10조와 「해양폐기물 및 해양오염퇴적물 관리법」(이하 ‘해양폐기물관리법’) 시행령 별표 1에서 규정한 해양에 배출할 수 있는 폐기물이 「해양폐기물관리법」시행규칙 별표 1의 폐기물의 해양배출 처리기준에 적합한지를 판정한 측정 결과의 정확도ㆍ정밀도 및 분석 방법의 일관성 유지에 필요한 사항을 규정함을 목적으로 한다.

2. 적용범위

2.1  본 해양환경공정시험기준(이하 ‘해양폐기물공정시험기준’이라 한다)은 해양배출 대상 폐기물에 관련된 기준의 적합한지를 판정하는 데 사용한다.

2.2  이 해양폐기물공정시험기준에서 규정하는 해양배출 폐기물이란 「해양폐기물관리법」시행령 별표 1에서 규정하는 물질을 말한다.

2.3  제2호의 해양배출 폐기물의 해양배출 처리기준은 별도의 규정이 없는 한 「해양폐기물관리법」시행규칙 별표 1을 따른다.

2.4  「해양폐기물관리법」 시행규칙 별표 1의 정밀 평가란, 이 해양폐기물공정시험기준에 따라 폐기물의 해양배출 적합성을 판정하기 위해 수행하는 해양생태독성 평가를 말하며, 시험항목은 다음과 같다.

가. 발광박테리아를 이용한 해양배출 폐기물 생태독성 시험기준

나. 저서성 단각류를 이용한 해양배출 폐기물 생태독성 시험기준

2.5  「해양폐기물관리법」시행규칙 별표 1에 따라, 제1기준 이하이고 제2기준 이상인 폐기물을 해양에 배출하려는 자는 제4호에 따라 두 개의 생태독성 시험을 모두 거쳐야 한다. 해당 폐기물이 두 개의 생태독성 시험항목?중 어느 하나에서라도 "독성있음"으로 판정되면 이를 해양에 배출할 수 없다.

3. 일반사항

3.1  해수공정시험기준 제1장 총칙 중 개요 3. 일반사항 및 제2항 시험관련 표시방법에 따른다.

3.2  함수율이 95 %를 초과하는 폐기물의 경우에는 해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 또는 폐기물공정시험기준(국립환경과학원고시 제2017-54호) 함량 시험방법을 준용할 수 있으며, 분석 결과는 함수율을 고려하여 단위를 환산할 수 있다. 단 PAHs, 광유류 등 해수공정시험기준 제4장 항목별 시험방법 또는 폐기물공정시험기준 함량 시험방법에서 규정되지 않은 항목은 본 해양폐기물공정시험기준 제4장 항목별 시험방법을 따른다.

3.3  본 해양폐기물공정시험기준에서 동결건조된 시료라 함은, 전체 시료 중 일부를 취한 다음 동결건조기를 사용하여 항량(Constant)이 될 때까지 건조시킨 것을 말한다.

3.4  본 해양폐기물공정시험기준에 따른 시험에서 시료의 동질성 확보가 어려운 경우에는 폐기물공정시험기준(국립환경과학원고시 제2017-54호) 시료의 채취 및 시료의 준비 방법에 따라서 균질한 시료를 조제하여 시험한다.

3.5  분석한 결과를 「해양폐기물관리법」시행규칙 별표1 폐기물의 해양배출 처리 기준에 의거하여 해양배출에 적합 또는 부적합으로 판정하거나 검사 성적서를 작성하는 경우에 한하여 결과값의 표시는 다음과 같이 한다.

3.5.1  해양배출 폐기물의 항목별 시험 결과: mg/kg(건조 중량 단위)로 표시

3.5.2  함수율, 생물화학적 산소요구량, 화학적 산소요구량, 유분(광유류), 시안화합물, 페놀류, 중금속(크롬, 아연, 구리, 카드뮴, 수은, 유기인, 비소, 납, 니켈) 또는 그 화합물, 페난트렌, 벤조(a)안트라센, 총 다환방향족탄화수소: 소수 셋째 자리까지 측정하고 소수 셋째 자리의 값을 반올림하여 소수 둘째 자리로 표시

3.5.3  총질소, 나프탈렌, 안트라센, 벤조(a)피렌, 플루오란텐, 벤죠(b)플루오란텐: 소수 넷째 자리까지 측정하고 소수 넷째 자리의 값을 반올림하여 소수 셋째 자리로 표시

3.5.4  총인, 폴리클로리네이티드비페닐 -?28, 52, 101, 118, 138, 153, 180: 소수 다섯째 자리까지 측정하고 소수 다섯째 자리의 값을 반올림하여 소수 넷째 자리로 표시

3.5.5  총 폴리클로리네이티드비페닐: 소수 여섯째 자리까지 측정하고 소수 여섯째 자리의 값을 반올림하여 소수 다섯째 자리로 표시

제2장 시료의 채취 및 보관

제1항 시료의 채취방법

1. 해양폐기물 시료채취의 일반사항

1.1  해양배출 폐기물의 자료는 시료 채취, 보관, 실험실 분석 등 여러?단계를 거쳐 획득되는데 이러한 단계별로 정도가 다른 오류가 항시 존재한다. 이러한 오류는 단계에 따라 연계적으로 축적될 경우 최종 자료의 오류는 크게 증폭되어 부정확한 결과를 나타내기 때문에 시험자는 항상 각 단계별로 오류를 최소화할 수 있도록 노력해야 한다.

1.2  해양배출 폐기물 시료는 개별 사업장이나 위탁 처리업체에서 폐기물을 폐기물 배출 전용 선박으로 수송하기 위하여 지정폐기물 운반 차량에 적재하기 직전의 최종저장고에서 채취해야 한다. 다만, 정화처리공정을 거친 후 해양배출되는 해양오염퇴적물의 시료는 정화 후 토운선에 적재되어 있는 퇴적물을 채취하며, 이 경우 시료 채취 개수 및 방법 등은 2.1.4에 따른다.

1.3  해양배출 폐기물은 여러 가지 크기의 다양한 입자들로 구성되어 있기 때문에 채취하기 전에 폐기물을 잘 혼합해야 하며, 이것이 불가능할 경우에는 전체의 성질을 대표할 수 있도록 서로 다른 곳에서 채취해야 한다. 다만 서로 다른 종류의 폐기물이 혼재되어 있다고 판단될 때에는 혼재된 폐기물의 성분별로 각각에 대해 시료를 채취할 수 있다. 시료를 채취한 후 보관 및 분석하는 과정에서 시료의 동질성(homogeneity)이 유지되도록 해야 한다.

1.4  해양배출 폐기물 시료는 다음과 같은 사항을 고려하여 채취해야 한다.

1.4.1  시료 채취 도구: 시료의 채취 과정 또는 보관 중에 침식되거나 녹이 스는 재질의 것을 사용해서는 안된다.

1.4.2  시료 용기: 시료 용기는 무색경질의 유리병 또는 고밀도 폴리에틸렌병(High Density Polyethylene: HDPE)을 사용한다. 다만, 광유류, 유기인, PCBs, PAHs 시험을 위한 시료의 채취 시에는 테프론 재질의 마개로 된 무색경질의 유리병을 사용해야 한다.

1.4.3  시료 채취량은 각 분석항목에 필요한 시료의 양을 누적 계산한 다음 손실에 대비하여 1.5배가 되도록 채취량을 결정한다.

1.4.4  시료의 반복 개수는 시료의 각 조사 항목에 따라 필요한 경우 동일 채취 지점에서 시료를 반복 채취한다.

2. 해양폐기물 수저 준설토사

해양배출 폐기물 중 수저 준설토사에 대한 시료채취 개수 및 지점선정 방법은 다음과 같다.

2.1  준설토사 부피당 시료채취 개수

2.1.1 준설대상 지역의 준설토사 부피(준설 예정 구역의 표면적 × 준설 깊이)에 따라 시료 지점수는 아래의 표 1과 같이 결정한다.

표 1. 준설토사 부피당 시료채취 개수

┌───────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│준설부피(단위: m³)   │시료채취 지점 개수                                                                                │

│                      │ 총 시료 채취(지점) 개수는 표층 퇴적물의 개수이며, 주상 퇴적물은 표층 퇴적물(지점) 중에서 채취함  │

│                      │  (다만, 부시료 개수는 다음 2.1.3의 방식에 의거 별도 산정한다)                                    │

│                      │                                                                                                  │

├─────┬─────┼────────┬───────┬────────────────────────────────┤

│ 초  과   │ 이  하   │표층퇴적물      │주상퇴적물    │총 개수                                                         │

├─────┼─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│0         │10,000    │6               │2             │6                                                               │

├─────┼─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│10,000    │50,000    │12              │4             │12                                                              │

├─────┼─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│50,000    │100,000   │18              │6             │18                                                              │

├─────┼─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│100,000   │264,000   │22              │7             │22                                                              │

├─────┼─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│264,000   │509,000   │28              │9             │28                                                              │

├─────┼─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│509,000   │1,000,000 │38              │12            │38                                                              │

├─────┼─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│1,000,000 │2,000,000 │48              │16            │48                                                              │

├─────┴─────┼────────┼───────┼────────────────────────────────┤

│2,000,000 초과        │1,000,000 m3 당 │1,000,000 m3당│                                                                │

│                      │10개 추가       │3개 추가      │                                                                │

└───────────┴────────┴───────┴────────────────────────────────┘

2.1.2  표층 퇴적물이라 함은, 해저면으로부터 20 cm 깊이까지의 퇴적물을 말하며 여기서는 그랩?시료채니기 그랩?시료채니기는 퇴적물공정시험기준 제2장 시료의 채취 및 보관 제2항 시료 채취, 보관 및 전처리 방법 참고

로 채취한 퇴적물을 말한다.

2.1.3  주상(柱狀)퇴적물이라 함은, 해저면으로부터 준설 예정 깊이보다 30 cm 더 추가한 깊이까지의 퇴적물을 말한다. 주상 퇴적물은 시료를 20 cm 간격으로 절단하되, 깊이가 1 m 이내일 경우는 3개(표층, 중층, 저층), 1 m 초과일 경우는 5개(표층, 중상층, 중층, 중하층, 저층)를 취하여 부시료를 만들어 분석하되, 만약 오염경계면이 불분명할 경우에는 절개된 나머지 시료를 추가 분석한다. 주상 시료 채니기는 퇴적물공정시험기준 제2장 시료의 채취 및 보관 제2항 시료 채취, 보관 및 전처리 방법 참고

2.1.4  정화처리공정을 거친 해양오염퇴적물(이하 ‘정화처리퇴적물’) 시료는 원지반(原地盤) 오염도 조사에서 오염이 가장 심한 것으로 확인된 대표지점 1개소를 선정하여 정화 처리하고, 정화 후 토운선에 적재되어 있는 퇴적물을 시료로 채취하여 해양배출 적합한지를 판단한다. 정화처리퇴적물의 시료 채취 개수는 표 1의 준설 부피(m³)당 총 개수로 하되, 시료의 대표성과 신뢰성을 확보할 수 있도록 정화처리 퇴적물을 토운선 내 동일한 지점에서 그랩 시료채니기 등을 이용하여 토운선에 적재하는 작업시간을 시료의 총 개수로 나눈 시간 간격으로 채취한다. 예를 들어, 해양오염퇴적물 준설 부피가 5천 m³이고, 정화처리 퇴적물의 토운선 적재가 3일에 걸쳐 시행되며 1일 토운선 적재 작업시간이 8시간인 경우, 전체 토운선 적재 작업시간은 24시간이 되므로 시료는 토운선 적재 작업시간(24시간)을 시료의 총 개수(6개)로 나눈 4시간(산정식: 24시간/6개) 간격으로 채취해야 한다.

2.2  준설토사 시료채취 지점 선정

2.2.1  준설 지역에서의 채취 시료수 대비 격자 설계

격자는 준설예정 구역의 표면적과, 그 기하학적 모양을 고려하여 채취 시료수에 해당하는 정사각형 격자로 구성한다. 정북 좌측 상단 격자를 1번으로 하여 우측으로 향하여 오름차순으로 번호를 지정하고, 그 아래 행의 최좌측 격자에 그 다음 번호를 부여하는 방식으로 모든 격자에 번호를 부여한다. 단, 격자는 경계선을 포함할 수 있으며 각 격자의 면적에는 준설예정 지역이 50 %이상 포함되어야 한다(그림?1 참고).

예를 들어, 준설 부피가 10,000 m3이고 준설 깊이가 1 m인 경우, 준설예정 구역의 표면적이 10,000 m2이다. 이 경우, 시료수(격자의 중앙정점)는 6개이고, 격자수 또한 6개가 된다. 한 격자의 면적이 1,666.6 m2이고, 가로ㆍ세로 길이는 약 40.8 × 40.8 m이다.

그림 1. 준설 지역에서의 격자구분 및 번호지정

2.2.2  주상 퇴적물 시료 채취에 해당되는 격자 선정은 정북 좌측 상단 격자를 1번으로 하여 포함시키고, 표 2와 같이 선정한다.

표 2. 주상 퇴적물 시료채취를 위한 격자선정 방법

┌───────────┬────────────────────────────────┐

│준설부피(단위: m³)   │주상퇴적물시료채취 개수 및 격자 번호                            │

├─────┬─────┼────────┬───────────────────────┤

│초과      │이하      │개수            │주상퇴적물시료채취 격자 번호                  │

├─────┼─────┼────────┼───────────────────────┤

│0         │10,000    │2               │1, 5                                          │

├─────┼─────┼────────┼───────────────────────┤

│10,000    │50,000    │4               │1, 5, 8, 11                                   │

├─────┼─────┼────────┼───────────────────────┤

│50,000    │100,000   │6               │1, 5, 8, 11, 15, 17                           │

├─────┼─────┼────────┼───────────────────────┤

│100,000   │264,000   │7               │1, 5, 8, 11, 15, 17, 21                       │

├─────┼─────┼────────┼───────────────────────┤

│264,000   │509,000   │9               │1, 5, 8, 11, 15, 17, 21, 24, 27               │

├─────┼─────┼────────┼───────────────────────┤

│509,000   │1,000,000 │12              │1, 5, 8, 11, 15, 17, 21, 24, 27, 30, 34, 37   │

├─────┼─────┼────────┼───────────────────────┤

│1,000,000 │2,000,000 │16              │1, 5, 8, 11, 15, 17, 21, 24, 27, 30, 34, 37,  │

│          │          │                │40, 42, 45, 48                                │

├─────┴─────┼────────┼───────────────────────┤

│2,000,000 초과        │1,000,000 m3당  │추가되는 격자는 행정청과 협의하여 결정        │

│                      │3개 추가        │                                              │

└───────────┴────────┴───────────────────────┘

2.2.3  지점선정 및 시료채취 시에 투명성을 확보하기 위하여, 필요할 경우에는 사업허가 담당공무원이 참관할 수 있다.

2.3  준설토사 시료채취 방법

2.3.1  시료 동질성 확보

시료 채취 후 큰 테프론 용기에 옮긴 후, 테프론 주걱으로 충분하게 저어 채취 시료를 균질하게 혼합시킨 후, 부시료를 취한다.

2.3.2  금속원소 분석용 시료의 오염방지

금속원소 분석용 부시료를 채취할 때에는 기기의 금속재질과 직접 접촉한 부분에서는 부시료를 채취하지 않도록 조심한다. 시료를 옮기는 과정에서도 금속재질의 물질을 사용하지 않는다. 유기오염물질 분석용 부시료를 채취할 때에는 기기의 플라스틱 재질과 직접 접촉한 부분에서는 부시료를 취하지 않도록 조심한다. 시료를 옮기는 과정에서도 플라스틱 재질의 물질을 사용하지 않는다.

2.3.3  시료 채취량

각 조사 항목에 필요한 시료의 양을 누적 계산한 다음 손실에 대비하여 1.5배가 되도록 채취량을 결정한다.

2.3.4  시료의 반복 개수

퇴적물이 고르지 않게 분포되어 있거나, 오염원(하수 배출구, 하천 입구 등)의 가까운 지역에서는 적어도 3개의 시료를 채취한다.

제2항 시료의 보관방법

해양배출 폐기물 시료의 보관은 개별 분석항목에 따라 다음과 같이 행한다.

표 1. 분석 항목별 해양폐기물 시료 보관법

┌──────┬──────────┬──────┬──────┬─────────┐

│항 목       │시료보관            │보관방법    │저장상태    │저장기간          │

├──────┼──────────┼──────┼──────┼─────────┤

│중금속      │산으로 세척한       │드라이아이스│4 °C 이하  │6개월             │

│            │고밀도 폴리에틸렌병 │또는 냉동   │            │수은(Hg)은 얼리지 │

│            │(HDPE)              │            │            │않는 한 28일      │

├──────┼──────────┼──────┼──────┼─────────┤

│유기물      │유기용매로 세척한   │드라이아이스│4 °C 이하, │냉동시킬 경우 14일│

│(PCB, PAH   │테플론 마개 유리병  │또는 냉동   │암소        │                  │

│등)         │                    │            │            │                  │

├──────┼──────────┼──────┼──────┼─────────┤

│생태독성    │증류수로 세척한     │냉장 또는   │4 °C 이하, │냉장일 경우 7일,  │

│시험용 시료 │고밀도 폴리에틸렌병 │냉동        │암소 또는   │냉동일 경우 14일  │

│            │(HDPE) 또는         │            │?20 °C    │                  │

│            │유리병              │            │이하        │                  │

└──────┴──────────┴──────┴──────┴─────────┘

제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법

제1항 분석자료의 기초통계

기본적인 통계처리와 의미는 해수편 제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법 제1항 분석자료의 기초통계에 따른다.

제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)

해수공정시험기준 제3장 제2항 정도평가/정도관리(QA/QC)의 내용에 따른다.

제3항 농도표시 및 단위

1. 주요 단위는 KS A ISO 80000-1 국제단위계(SI) 및 이에 따른 규정에 따른다.

2. 해양배출 폐기물의 항목별 시험결과는 mg/kg(건조중량 단위)로 표시한다.

제4장 항목별 시험방법

제1항 함수율(Water Content)

평량병 또는 증발접시

 평량병 또는 증발접시는 시료의 두께를 10 mm 이하로 넓게 펼 수 있는 정도로 하부 면적이 넓은 것을 사용해야 하며 가급적 무게가 적은 것을 사용한다.

를 미리 105 ∼ 110 °C에서 1시간 건조시킨 다음, 황산 데시케이터 안에서 방냉하고 항량으로 무게(W1)를 정밀히 달고, 여기에 시료 적당량을 취하여 평량병 또는 증발접시와 시료의 무게(W2)를 정밀히 단다. 다음에 수욕상에서 수분을 거의 날려 보내고 105 ∼ 110 °C의 건조기 안에서 4시간 건조시킨 다음 황산 데시케이터 안에 넣어 방냉하고 항량으로 하여 무게(W3)를 정밀히 단다.

함수율 및 고형물의 계산식은 다음과 같다.

함수율(%) = (W2 - W3)/(W2 ? W1) × 100          (식 1)

고형물(%) = (W3 - W1)/(W2 ? W1) × 100          (식 2)

               W1: 시료접시 항량 무게(g)

               W2: 건조 전 시료접시와 시료의 무게(g)

               W3: 건조 후 시료접시와 시료의 항량 무게(g)

제2항 용존산소(Dissolved Oxygen, DO)

1. 윙클러-아지드화나트륨 변법

1.1  측정원리

황산망간과 알칼리성 요오드화칼륨?용액을 넣을?때 생기는 수산화제일망간이 시료중의 용존산소에 의하여 산화되어 수산화제이망간으로 되고, 황산 산성에서 용존산소량에 대응하는 요오드를 유리한다. 유리된 요오드를 티오황산나트륨으로 적정하여 용존산소의 양을 정량하는 방법이다.

1.2  측정범위 및 정밀도

이 방법은 아질산염 5 mg/L 이하, 제일철염 1.0 mg/L 이하에서 방해를 받지 않으며 정량범위는 0.1 mg/L 이상이다.

1.3  기구 및 기기

용존산소 측정병(300 mL) 혹은 BOD병 : 용량이 정확히 기재되어 있고 유리 마개가 있는 차광용 산소병을 이용하여 마개와 시료병에 식별번호를 붙인다.

1.4  시약 및 표준물질

1.4.1  칼륨명반 용액: 황산알루미늄칼륨(24수화물) 10 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

1.4.2  암모니아수(NH4OH, 28 %이상, 비중: 0.90)

1.4.3  황산구리-설파민산 용액: 설파민산 32 g을 증류수 475 mL에 녹인다. 따로 황산구리(5수화물, CuSO4ㆍ5H2O) 50 g을 증류수 500 mL에 녹인다. 양액을 섞고 아세트산(CH3COOH) 25 mL를 넣는다.

1.4.4  황산망간 용액: 황산망간(4수화물, MnSO4ㆍ4H2O) 480 g을 증류수에 녹이고 불용분을 여과하여 버리고 증류수를 넣어 1,000 mL로 한다.

1.4.5  알칼리성 요오드화칼륨-아지드화나트륨 용액: 수산화나트륨(NaOH) 500 g, 요오드화칼륨(KI) 150 g, 아지드화나트륨(NaN3) 10 g을 각각 증류수에 녹인 다음 전량을 1 L로 한다.

1.4.6  황산(H2SO4, 95 % 이상)

1.4.7  0.025 N-티오황산나트륨 용액: 티오황산나트륨(Na2S2O3ㆍ5H2O) 6.025 g을 증류수에 녹여 정확히 1 L로 한다.

1.4.8  전분 용액

1.5  시료의 채취 및 보관

시료가 현저히 착색되어 있거나 현탁되어 있을 때에는 용존산소의 정량이 곤란하며, 시료에 활성 오니의 미생물 플록(floc)이 형성되었을 때에는 정량에 방해를 준다. 또한, 시료?중에 잔류 염소와 같은 산화성 물질이 공존할 경우에도 방해를 받게 되는데 이러한 경우에는 다음과 같이 시료를 전처리해야 한다.

1.5.1 시료의 착색, 현탁된 경우

시료를 마개있는 1 L 유리병

 마개는 접촉 부분이 45°로 절단되어 있는 것

에 기울여서 기포가 생기지 않도록 조심하면서 가득 채우고, 칼륨명반 용액 10 mL와 암모니아수 1 ∼ 2 mL를 유리병의 위로부터 넣고 공기 피펫의 공기

가 들어가지 않도록 주의하면서 마개를 닫고, 조용히 위아래를 바꾸어 가면서 1분간 흔들어 섞고 10분간 정치하여 현탁 물질을 침강시킨다. 상등액을 고무판 또는 폴리에틸렌관을 이용하여 사이펀 작용으로 300 mL 용존산소 측정병 또는 BOD병

의 아래로부터 침강된 응집물이 들어가지 않도록 주의하면서 조용히 가득 채운다.

1.5.2  황산구리-술퍼민산법(활성오니에 미생물의 플록(floc)이 형성된 경우

시료를 마개있는 1 L 유리병(마개는 접촉 부분이 45 °C로 절단되어 있는 것)에 기울여서 기포가 생기지 않도록 조심하면서 가득 채우고 황산구리-술퍼민산 용액 10 mL를 유리병의 위로부터 넣고 공기가 들어가지 않도록 주의하면서 마개를 닫고, 조용히 위아래를 바꾸어 가면서 1분간 흔들어 섞고 10분간 정치하여 현탁 물질을 침강시킨다. 깨끗한 상등액을 고무판 또는 폴리에틸렌관을 이용하여 사이펀작용으로 300 mL 용존산소?측정병의 아래로부터 침강된 응집물이 들어가지 않도록 주의하면서 조용히 가득 채운다.

1.5.3  산화성 물질을 함유한 경우

시료?중에는 잔류 염소 등이 함유되어 있을 때에는 바탕 시험으로 별도의 용존산소측정병에 시료를 가득 채운 다음, 알칼리성 요오드화칼륨-아지드화나트륨?용액 1 mL와 황산 1 mL를 넣어 마개를 닫고, 조용히 위아래를 바꾸어 가면서 약 1분간 흔들어 섞는다. 여기에 황산망간 용액 1 mL를 넣고 다시 위 아래를 바꾸어 가면서 흔들어 섞은 다음 이 용액 200 mL를 취하여 삼각플라스크에 옮기고 전분 용액을 지시약으로 하여 0.025 N 티오황산나트륨?용액으로 적정하고 그 측정값을 용존산소량의 측정값에 보정한다.

1.5.4  Fe(III) 공존하는 경우

Fe(III) 100 ∼ 200 mg/L이 함유되어 있는 시료의 경우, 황산의 첨가 전 불화칼륨 용액(300 g/L) 1 mL를 가한다.

1.6  시험방법

1.6.1  시료를 가득 채운 300 mL 용존산소?측정병(또는 BOD병)에 황산망간 용액 1 mL와 알칼리성 요오드화칼륨-아지드화나트륨 용액 1 mL를 넣고 기포가 남지 않게 조심하여 마개를 닫고 수회 병을 회전하면서 섞는다. 시료가 해수이거나 알칼리성에서 산화되기 쉬운 유기물을 함유하는 폐수의 경우에는 2분간 병을 회전하여 섞는다. 2분간 이상 정치시키고 위의 맑은 액에 미세한 침전이 남아 있으면 다시 회전시켜 혼화한 다음 정치하여 완전히 침전시킨다.

1.6.2  100 mL 이상의 맑은 층이 생기면 마개를 열고 황산 2.0 mL를 병목으로부터 넣는다. 마개를 다시 닫고 갈색의 침전물이 완전히 용해할 때까지 병을 회전시킨다. 용존산소 측정병의 용액 200 mL를 정확히 취하여 황색이 될 때까지 0.025 N-티오황산나트륨?용액으로 적정한 다음, 전분 용액 1 mL를 넣고 액의 청색이 무색이 될 때까지 적정한다.

용존산소 계산은 다음과 같다.

           (식 1)

          a: 적정에 소비된 0.025 N-티오황산나트륨 용액 (mL)

          f: 0.025 N-티오황산나트륨?용액의 역가(factor)

          V1: 전체의 시료량(mL)

          V2: 적정에 사용한 시료량(mL)

          R: 황산망간 용액과 알칼리성 요오드화칼륨-아지드화나트륨 용액의 첨가량(mL)

용존산소량을 포화율로 나타낼 경우에는 표 1 수중의 용존산소 포화량으로부터 시료의 온도와 염소이온 농도에 일치하는 값을 찾아내서 다음 식에 따라 계산한다.

용존산소 포화율(%) =  × 100              (식 2)

DO: 시료의 용존산소량(mg/L)

DOt: 표 1의 수중 용존산소 포화량(mg/L)

B: 시료채취시 대기압(mmHg)

1.7  참고사항

이 방법 이외의 분석 방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

표 1. 수중의 용존산소 포화량

┌───┬───────────────────┬───────────┐

│온도  │수중의 염소 이온량(mgCl/L )           │염소이온 100 mg Cl/L에│

│(°C) ├───┬───┬───┬───┬───┤대한 용존산소 차감량  │

│      │0     │5,000 │10,000│15,000│20,000│(mgO2/L )             │

│      ├───┴───┴───┴───┴───┤                      │

│      │수중 용존산소 포화량 (mgO2/L )        │                      │

├───┼───┬───┬───┬───┬───┼───────────┤

│ 0    │14.16 │13.40 │12.63 │11.87 │11.10 │0.0153                │

│ 1    │13.77 │13.03 │12.29 │11.55 │10.80 │0.0148                │

│ 2    │13.40 │12.68 │11.97 │11.25 │10.52 │0.0144                │

│ 3    │13.01 │12.45 │11.65 │10.95 │10.25 │0.0440                │

│ 4    │12.70 │12.03 │11.35 │10.67 │9.99  │0.0135                │

│ 5    │12.37 │11.72 │11.00 │10.40 │9.71  │0.0131                │

│ 6    │12.00 │11.42 │10.79 │10.15 │9.51  │0.0128                │

│ 7    │11.78 │11.15 │10.52 │9.90  │9.28  │0.0124                │

│ 8    │11.47 │10.87 │10.27 │9.67  │9.06  │0.0120                │

│ 9    │11.19 │10.61 │10.03 │9.44  │8.85  │0.0117                │

│10    │10.92 │10.36 │9.79  │9.23  │8.66  │0.0113                │

│11    │10.67 │10.12 │9.57  │9.02  │8.47  │0.0110                │

│12    │10.43 │9.90  │9.36  │8.82  │8.29  │0.0107                │

│13    │10.20 │9.68  │9.16  │8.64  │8.11  │0.0104                │

│14    │9.97  │9.47  │8.97  │8.40  │7.95  │0.0101                │

│15    │9.70  │9.27  │8.78  │8.29  │7.79  │0.0099                │

│16    │9.56  │9.06  │8.60  │8.12  │7.63  │0.0096                │

│17    │9.37  │8.90  │8.44  │7.97  │7.49  │0.0094                │

│18    │9.18  │8.73  │8.27  │7.82  │7.36  │0.0091                │

│19    │9.01  │8.57  │8.12  │7.67  │7.22  │0.0089                │

│20    │8.84  │8.41  │7.97  │7.54  │7.10  │0.0087                │

│21    │8.68  │8.26  │7.83  │7.40  │6.97  │0.0086                │

│22    │8.53  │8.11  │7.70  │7.26  │6.85  │0.0084                │

│23    │8.39  │7.98  │7.57  │7.06  │6.74  │0.0082                │

│24    │8.25  │7.85  │7.44  │7.14  │6.65  │0.0081                │

│25    │8.14  │7.72  │7.32  │6.95  │6.52  │0.0079                │

│26    │7.99  │7.60  │7.21  │6.82  │6.42  │0.0078                │

│27    │7.87  │7.48  │7.10  │6.71  │6.32  │0.0077                │

│28    │7.75  │7.37  │6.99  │6.61  │6.22  │0.0076                │

│29    │7.64  │7.26  │6.88  │6.51  │6.12  │0.0076                │

│30    │7.53  │7.16  │6.78  │6.41  │6.03  │0.0075                │

│31    │7.43  │7.06  │6.66  │6.31  │5.93  │0.0075                │

│32    │7.32  │6.96  │6.59  │6.21  │5.84  │0.0074                │

│33    │7.23  │6.86  │6.49  │6.12  │5.75  │0.0074                │

│34    │7.13  │6.77  │6.40  │6.03  │5.65  │0.0074                │

│35    │7.04  │6.67  │6.30  │5.93  │5.56  │0.0074                │

└───┴───┴───┴───┴───┴───┴───────────┘

2. 격막 전극법

2.1  측정원리

시료 중의 용존산소가 격막을 통과하여 전극의 표면에서 산화, 환원반응을 일으키고 이때 산소의 농도에 비례하여 전류가 흐르게 되는데 이 전류량으로부터 용존산소량을 측정하는 방법이다.

2.2  측정범위 및 정밀도

이 방법은 산화성 증류수질이 함유된 시료나 착색된 시료에 적합하며, 특히 윙클러-아지드화나트륨 변법을 사용할 수 없는 시료의 용존산소 측정에 유용하게 사용할 수 있다. 정량 범위는 0.5 mg/L이다.

2.3  기구 및 기기

2.3.1  용존산소 측정기

2.3.2  측정 용기(용존산소?측정병)

2.3.3  자석 교반기

2.4  시약 및 표준물질

2.4.1  5 % (w/v) 아황산나트륨 용액: 무수아황산나트륨(Na2SO3) 5 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다

2.4.2  용존산소 포화증류수: 약 500 mL의 증류수를 비이커에 담고 실온에서 약 1시간 정도 자석교반기를 이용하여 교반한다.

2.5  시험방법

2.5.1  시료와 같은 온도의 5 % 아황산나트륨?용액을 가득 채운 측정 용기에 전극을 담그고 밀봉한 다음, 일정한 속도로 교반하면서 기기가 안정되면 계기판의 지시값을 영점에 맞춘다.

2.5.2  별도로 용존산소 포화수를 측정 용기에 조용히 가득 채우고 같은 조작을 하여 계기판의 지시값을 그 온도에서의 용존산소 포화농도 값(표 1)에 맞춘다.

2.5.3  시료를 기포가 들어가지 않도록 조심하여 측정 용기에 가득 채우고 같은 조작을 하여 계기판의 지시값이 안정되면 용존 산소값을 직접 읽는다.

2.6  참고사항

이 방법 이외의 분석 방법 또는 자동화 분석 기기를 포함한 기타 분석 기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제3항 생물화학적 산소요구량 (Biochemical Oxygen Demand, BOD)

1. 측정원리

시료를 20 °C에서 5일간 저장하여 두었을 때 시료 중의 호기성 미생물의 증식과 호흡작용에 의하여 소비되는 용존산소의 양으로부터 측정하는 방법이다. 시료 중의 용존산소가 소비되는 산소의 양보다 적을 때에는 시료를 희석수로 적당히 희석하여 사용한다. 공장 폐수나 혐기성 발효의 상태에 있는 시료는 호기성 산화에 필요한 미생물을 식종해야 한다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효측정범위는 초기용존산소 포화값(7 ∼ 9 mg/L)과 최소용존산소 잔류값(1 mg/L)의 차이에 희석 배수를 곱한 값이 된다. 일반적으로 측정할 수 있는 하한 값은 1 mg/L이다.

3. 기구 및 기기

3.1  BOD병(300 mL)

3.2  BOD 배양기

3.3  진공 데시케이터

3.4  동결건조기

3.5  초음파기: 초음파 수조, 초음파 교반기 등

4. 시약 및 표준물질

4.1  염산(1 + 11): 염산(HCl) 1에 증류수(H2O) 11의 비율로 조제한다.

4.2  4 % 수산화나트륨 용액: 수산화나트륨(NaOH) 4 g을 증류수(H2O)에 녹여 100 mL로 한다.

4.3  아지드화나트륨(NaN3)

4.4  요오드화칼륨(KI)

4.5  염산: 염산(HCl)(35 % 이상)

4.6  전분 지시약: 수용성 전분 1 g을 증류수(H2O) 10 mL에 넣어 혼화하고 열수 100 mL 중에 넣고 1분간 끓이고 냉각하여 정치한 다음 상층액을 사용한다. 사용할 때 조제한다.

4.7  아황산나트륨 용액(0.025 N): 무수 아황산나트륨(Na2SO3) 1.6 g을 증류수(H2O)에 녹여 1,000 mL로 한다.

4.8  완충액(A액): 인산일수소칼륨(K2HPO4) 21.75 g, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 8.5 g, 인산일수소나트륨(Na2HPO4ㆍ12H2O) 44.6 g 및 염화암모늄(NH4Cl) 1.7 g을 증류수(H2O)로 녹여 1 L로 한다. 이 완충액의 pH값은 7.2를 나타낸다.

4.9  황산마그네슘 용액(B액): 황산마그네슘(MgSO4ㆍH2O) 22.5 g을 증류수(H2O)로 녹여 1 L로 한다.

4.10  염화칼슘 용액(C액): 염화칼슘(CaCl2) 27.5 g을 증류수(H2O)로 녹여 1 L로 한다.

4.11  염화제이철 용액(D액): 염화제이철(FeCl3ㆍ6H2O) 0.25 g을 정제수로 녹여 1 L로 한다.

4.12  BOD용 희석수: 희석수의 조제에 쓰이는 물은,

4.12.1  생물의 증식을 방해하는 물질(동, 잔류염소, 수산화알칼리)이 함유되어서는 안된다.

4.12.2  용존산소가 포화되어야 한다.

4.12.3  pH 값이 7.2로 완충되어 있어야 하며 배양 중에 발생하는 탄산, 질산, 또는 다른 산에 의해 값이 변할 수 있으므로 완충제를 첨가한다.

4.12.4  호기성 미생물의 정상적 발육에 필요한 미량 성분(칼슘, 마그네슘,  철, 질소, 인산 등)을 포함해야한다.

따라서, 이 조건을 만족시키기 위해 미리 20 °C로 유지시킨 후 폭기하고, 정치한 정제수를 취한 다음 정제수 1 L당 A액, B액, C액, D액을 각각 1 mL의 비율로 넣는다.

4.13  BOD용 식종 희석수: 시료에 호기성 미생물이 존재하지 않을 경우, 또는 충분하지 않을 경우는 희석수에 호기성 미생물을 첨가한 것을 사용한다. 식종(seeding)은 통상 희석수 1 L에 대해 실온에서 24 ∼ 36시간 정치한 하수의 1 ∼ 10 mL, 하천수 10 ∼ 50 mL를 첨가하는 것이 적당하다. 식종 희석수는 사용 당일 제조한다. 식종은 시료에 하지 않고 희석수에 행하는 것이다. 시험할 때는 식종 희석수의 BOD를 측정하여 그 값을 식종 희석검수의 BOD에서 뺀 것이 되므로, 식종 희석검수에 미량의 이물질이 있어도 그것이 독성이 없어 용존산소 정량에 장해가 안?되는 한 지장이 없다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료

5.1.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료는 동결건조기를 사용하여 항량이 될 때까지 건조시킨 다음 밀폐용기에 담아서 보관한다. 이 경우 시험 전에 진공 데시케이터 안에 30분간 넣어둔 다음 시험에 사용한다.

5.1.2  동결건조된 시료 3 ∼ 5 g을 취한 다음 100 mL 메스플라스크에 담는다. 증류수 80 mL를 가한 다음 마개를 닫고 초음파기를 사용하여 약 5분 정도 혼합시킨다. 메스플라스크 바닥에 침전물이 많이 남아 있거나, 혼합 상태가 좋지 않을 때는 앞 과정을 2 ∼ 3회 반복한다. 증류수를 넣어 100 mL 메스플라스크의 표선을 맞춘다. 이 용액을 BOD 시험용 검액으로 사용한다. 검액은 사용 직전에 조제해서 사용한다. 검액은 아래에 기술된 전 처리 및 시험 방법에 따라 시험한다.

5.2  함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료

함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료는 아래에 기술된 전처리 및 시험 방법에 따라 시험한다. 시료가 산성 또는 알칼리성을 나타내거나 잔류 염소 등 산화성 물질을 함유하였거나 용존산소가 과포화 되어 있을 때에는 다음과 같이 전처리를 행한다.

5.2.1  산성 또는 알칼리성 시료

pH가 6.5 ∼ 8.5의 범위를 벗어나는 시료는 염산(1 + 11) 또는 4 % 수산화나트륨 용액으로 시료를 중화하여 pH 7로 한다. 다만 이때 넣어주는 산 또는 알칼리의 양이 시료량의 0.5 %가 넘지 않도록 해야 한다.

5.2.2  잔류 염소가 함유된 시료

시료 100 mL에 아지드화나트륨 0.1 g과 요오드화칼륨 1 g을 넣고 흔들어 섞은 다음 염산을 넣어 산성으로 한다(pH 약 1). 유리된 요오드를 전분 지시약을 사용하여 아황산나트륨 용액(0.025 N)으로 액의 청색이 무색으로 될 때까지 적정하여 얻은 아황산나트륨액(0.025 N)의 소비량(mL)을 남아 있는 시료의 양에 대응하여 넣어 준다. 일반적으로 잔류 염소가 함유된 시료는 BOD용 식종 희석수로 희석하여 사용한다.

5.2.3  용존산소가 과포화된 시료

수온이 20 °C 이하이거나 20 °C일 때의 용존산소 함유량이 포화량 이상으로 과포화되어 있을 때에는 수온을 23 ∼ 25 °C로 하여 15분간 통기하고 방냉하여 수온을 20 °C로 한다.

5.3  시료는 시험하기 바로 전에 온도를 20 ± 1 °C로 조정한다.

6. 시험방법

6.1  BOD 시험방법

6.1.1  시료(또는 전처리한 시료)의 예상 BOD 농도값으로부터 단계적으로 희석 배율을 정하여 3 ∼ 5종의 희석 검액을 2개를 한 조로 하여 조제한다.

6.1.2  예상 BOD 농도값에 대한 사전 경험이 없을 때에는 다음과 같이 희석하여 검액을 조제한다. 강한 공장 폐수는 0.1 ∼ 1.0 %, 처리하지 않은 공장 폐수와 침전된 하수는 1 ∼ 5 %, 처리하여 방류된 공장 폐수는 5 ∼ 25 %, 오염된 하천수는 25 ∼100 %의 시료가 함유되도록 희석 조제한다.

6.1.3  BOD용 희석수 또는 BOD용 식종 희석수를 사용하여 검액을 희석할 때에는 2 L 메스실린더에 공기가 갇히지 않게 조심하면서 1/2 용량만큼 채우고, 시료(또는 전처리한 시료) 적당량을 넣은 다음 BOD용 희석수 또는 식종 희석수로 희석 배율에 맞는 눈금의 높이까지 채운다. 공기가 갇히지 않게 젖은 막대로 조심하면서 섞고 2개의 300 mL BOD병에 완전히 채운 다음, 한병은 마개를 꼭 닫아 증류수로 마개 주위를 밀봉하여 BOD용 배양기에 넣고 20 °C 어두운 곳에서 5일간 배양한다. 나머지 한 병은 15분간 방치 후에 희석된 시료 자체의 처음 용존산소를 측정하는 데 사용한다.같은 방법으로 미리 정하여진 희석 배율에 따라 몇 세트의 희석?검액을 조제하여 2개의 300 mL BOD 병에 완전히 채운 다음 위와 같이 실험한다.

6.1.4  처음의 희석 시료 자체의 용존산소량과 20 °C에서 5일간 배양할 때 소비된 용존산소의 양을 제3항 용존산소 측정법에 따라 측정하여 구한다. 5일간 저장한 다음 산소의 소비량이 40 ∼ 70 % 범위 내의 희석검액을 선택하여, 처음의 용존산소량과 5일간 배양한 다음 남아 있는 용존산소량의 차로부터 BOD를 계산한다. 다만, 시료를 식종하여 BOD를 측정할 때는 실험에 사용한 식종액을 희석수로 단계적으로 희석하여 이하 위의 실험 방법에 따라 실험하고 배양 후의 산소 소비량이 40 ∼70 % 범위 안에 있는 식종 희석수를 선택하여 배양 전후의 용존산소량과 식종액 함유율을 구하고 시료의 BOD값을 보정한다.

6.2  BOD용 희석수 및 BOD용 식종 희석수의 검토

6.2.1  시료(또는 전처리한 시료)를 BOD용 희석수(또는 BOD용 식종 희석수)를 사용하여 희석할 때에 이들 중에 독성물질이 함유되어 있거나 구리, 납 및 아연 등의 금속 이온이 함유된 시료(또는 전처리한 시료)는 호기성 미생물의 증식에 영향을 주어 정상적인 BOD값을 나타내지 않게 된다. 이러한 경우에 다음의 시험을　행하여 적정한지를 검토한다.

6.2.2  글루코오스 및 글루타민산 각 150 mg씩을 취하여 증류수에 녹여 1,000 mL로 한 액 5 ∼ 10 mL를 3개의 300 mL BOD병에 넣고 BOD용 희석수(또는 BOD용 식종 희석수)를 완전히 채운 다음, 이하 BOD 시험방법에 따라 시험할 때에 측정하여 얻은 BOD값은 220 ± 20 mg/L의 범위 안에 있어야 한다. 얻은 BOD 값의 편차가 클 때에는 BOD용 희석수(또는 BOD용 식종희석수) 및 시료에 문제점이 있으므로 시험 전반에 대한 검토가 필요하다.

6.3  BOD 계산

6.3.1  식종하지 않은 시료의 BOD

BOD(mg/L) = (D1-D2) × P                       (식 1)

6.3.2  식종 희석수를 사용한 시료의 BOD

BOD(mg/L) = [ (D1-D2) - (B1-B2) × f ] × P             (식 2)

D1: 희석(조제)한 검액(시료)의 15분간 방치한 후의 용존산소(mg/L)

D2: 5일간 배양한 다음의 희석(조제)한 검액(시료)의 용존산소(mg/L)

B1: 식종액의 BOD를 측정할 때 희석된 식종액의 배양전의 용존산소(mg/L)

B2: 식종액의 BOD를 측정할 때 희석된 식종액의 배양후의 용존산소(mg/L)

f: 시료의 BOD를 측정할 때 희석시료 중의 식종액 함유율(x %)에 대한 

  식종액의 BOD를 측정할 때 희석한 식종액 중의 식종액 함유율(y %)의

  비(x/y)

P: 희석시료 중 시료의 희석 배수(희석시료량/시료량)

6.4  측정값의 단위 환산

6.4.1  동결건조된 시료를 사용하여 검액을 만든 경우,

BOD(mgO2/kg, dry weight) = BOD(mgO2/L) × (V/W)        (식 3)

V: 검액의 부피(mL)

W: 검액 제조 시 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

6.4.2  위 6.4.1이 아닌 경우, 따로 함수율을 측정한 다음 BOD 값을 건조 중량 단위로 보정한다.

7. 참고사항

이 방법 이외의 분석 방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제4항 화학적 산소요구량(Chemical Oxygen Demand, COD)

1. 측정원리

시료를 황산산성으로 하여 중크롬산칼륨 일정 과량을 넣고 2시간 가열반응 시킨 다음 소비된 중크롬산칼륨의 양을 구하기 위해 환원되지 않고 남아 있는 중크롬산칼륨을 황산제일철암모늄 용액으로 적정하여 시료에 의해 소비된 중크롬산칼륨을 계산하고 이에 상당하는 산소의 양을 측정하는 방법이다. 따로 규정이 없는 한 해수를 제외한 모든 시료의 중크롬산칼륨에 의한 화학적 산소 요구량을 필요로 하는 경우에 이 방법에 따라 시험한다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 방법은 유기물이 거의 완전에 가까울 정도로 산화된다. 이 방법에 의한 측정값은 20일 BOD 값에 접근하는 경우가 많다. 일반적으로 측정할 수 있는 하한값은 1 mg/L이다.

3. 기구 및 기기

3.1  250 mL 삼각플라스크 또는 둥근바닥 플라스크로서 아래 3.2의 냉각관과 서로 갈아 맞춘 것

3.2  300 mm 리비히 냉각관 또는 이와 동등한 것으로서 위 3.1의 플라스크와 서로 갈아 맞춘 것

3.3  열판(1.4 w/cm2) 또는 맨틀 히터(mantle heater)

3.4  초음파기(초음파 수조, 초음파 교반기 등)

4. 시약 및 표준물질

4.1  황산제이수은(HgSO4)

4.2  황산은 용액: 황산은(Ag2SO4) 11 g을 황산(H2SO4) 1 L에 녹인다. 완전히 용해할 때까지 1 ∼ 2일 소요된다.

4.3  0.025 N-중크롬산칼륨 용액: 중크롬산칼륨(K2Cr2O7) 1.23 g을 증류수에 녹여 1 L로 한다.

4.4  o-페난트로린제일철 용액: o-Phenanthroline(H2O)1.48 g와 FeSO4ㆍ7H2O 0.70 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.5  0.025 N-황산제일철암모늄액: 황산제일철암모늄(FeSO4(NH4)2SO4ㆍ6H2O) 10 g을 증류수 500 mL에 녹이고 황산(H2SO4) 20 mL를 가한 다음, 냉각한 후 증류수를 가하여 1 L로 한다. 이 용액은 사용할 때 표정한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료

5.1.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료는 동결건조기를 사용하여 항량이 될 때까지 건조시킨 다음 밀폐용기에 담아서 보관한다. 이 경우 시험 전에 진공 데시케이터 안에 30분간 넣어둔 다음 시험에 사용한다.

5.1.2  동결?건조된 시료 3 ∼ 5 g을 취한 다음 100 mL 메스플라스크에 담는다. 증류수 80 mL를 가한 다음 마개를 닫고 초음파기를 사용하여 약 5분 정도 혼합시킨다. 메스플라스크 바닥에 침전물이 많이 남아 있거나, 혼합 상태가 좋지 않을 때는 앞 과정을 2 ∼ 3회 반복한다. 증류수를 넣어 100 mL 메스플라스크의 표선을 맞춘다. 이 용액을 COD 시험용 검액으로 사용한다. 검액은 사용 직전에 조제해서 사용한다. 검액은 아래에 기술된 시험방법에 따라 시험한다.

5.2  함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료

함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료는 그대로 아래에 기술된 시험방법에 따라 시험한다.

6. 시험방법

6.1  COD 시험방법

6.1.1  250 mL 플라스크에 시료 현탁 물질을 포함하는 경우에는 잘 흔들어 섞어 균일하게 한 다음 신속하게 분취한다.

 적당량 2시간 동안 끊인 다음 최초에 넣은 0.025 N 중크롬산칼륨용 액의 약 1/2이 남도록 취한다.

를 넣고 여기에 황산제이수은 약 0.4 g 염소이온의 양이 40 mg 이상 공존할 경우에는 HgSO4 : Cl- = 10 : 1의 비율로 황산제이수은의 첨가량을 늘린다.

을 넣은 다음, 증류수를 넣어 20 mL로 하여 잘 흔들어 섞고 몇 개의 비등석을 넣은 다음 천천히 흔들어 주면서 황산은 용액 2 mL를 천천히 넣고, 0.025 N 중크롬산칼륨 용액 10 mL를 정확히 넣은 다음 플라스크에 냉각관을 연결시키고 냉각수를 흘린다.

6.1.2  열린 냉각관 끝에서 황산은 용액 28 mL를 천천히 흔들면서 넣은 다음 냉각관 끝을 작은 비이커로 덮고 열판에서 2시간 동안 가열한다.

6.1.3  방냉시키고 증류수 약 10 mL로 냉각관을 씻은 다음 냉각관을 떼어내고 전체 액량이 약 140 mL가 되도록 증류수를 넣고 o-페난트로린제일철 용액 2 ∼ 3 방울 넣은 다음 0.025 N 황산제일철암모늄액을 사용하여 액의 색이 청록색에서 적갈색으로 변할 때까지 적정한다. 따로 증류수 20 mL를 사용하여 같은 조건으로 바탕 시험을 행한다.

6.2  COD 농도계산

화학적산소요구량 계산은 다음과 같다.

COD(mgO2/L) = (b-a) × f ×  × 0.2               (식 1)

a: 바탕시료 적정에 소비된 0.025N 황산제일철암모늄액(mL)

b: 시료의 적정에 소비된 0.025N 황산제일철암모늄액(mL)

f: 0.025 N 황산제일철암모늄 용액의 역가(factor)

V: 시료의 양(mL)

6.3  COD 측정값의 단위 환산

6.3.1  동결건조된 시료를 사용하여 검액을 만든 경우

COD(mgO2/kg, dry weight) = COD(mgO2/L) × (V/W)        (식 2)

V: 검액의 부피(mL)

W: 검액 제조 시 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

6.3.2  위 6.3.1이 아닌 경우, 따로 함수율을 측정한 다음 COD 값을 건조중량 단위로 보정한다.

7. 참고사항

7.1  고농도 시료의 경우에는 위 시험방법의 중크롬산칼륨액과 황산제일철암모늄액 0.025 N 규정농도와 다른 0.25 N 농도를 사용하는 것을 제외하고는 위 6.1의 시험방법과 동일하게 따른다.

7.2  아질산 이온(NO2-) 1 mg으로 1.1 mg의 산소(O)를 소비한다. 아질산 이온에 의한 방해를 제거하기 위해 시료에 존재하는 아질산성질소(NO2-N) mg당 술퍼민산 10 mg을 첨가한다.

7.3  이 방법에서는 수은 화합물을 사용하므로 시험 후 폐액 처리에 특히 주의해야 한다.

7.4  이 방법 이외의 분석 방법 또는 자동화 분석 기기를 포함한 기타 분석 기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

7.5  해양환경관리법시행규칙 별표6 육지에서 처리가 곤란한 폐기물로서 해양배출이 가능한 폐기물 중에서 해저퇴적물에 기인한 수저 준설토사는 염소이온이 다량 존재하기 때문에 중크롬산칼륨법으로 분석 시 저해 현상이 나타날 수 있다. 이 경우에 한하여, 분석은 해양환경공정시험기준 해저퇴적물편 제6항 화학적산소요구량(COD)을 준용할 수 있다.

제5항 총질소(Total Nitrogen, TN)

1. 흡광광도법

1.1  측정원리

시료 중 질소화합물을 알칼리성 과황산칼륨의 존재하에 120 °C에서 유기물과 함께 분해하여 질산이온으로 산화시킨 다음, 산성에서 자외부 흡광도를 측정하여 질소를 정량하는 방법이다. 이 방법은 비교적 분해되기 쉬운 유기물을 함유하고 있거나 자외부에서 흡광도를 나타내는 브롬 이온이나 크롬을 함유하지 않는 시료에 적용된다.

1.2  측정범위 및 정밀도

이 방법의 정량 범위는 0.005 ∼ 0.05?mgN이며 표준편차는 3 ∼ 10 %이다.

1.3  기구 및 기기

1.3.1  광전광도계 또는 광전분광광도계: 220 nm에서 측정 가능한 것

1.3.2  고압증기멸균기: 약 120 °C에서 가열이 가능한 것

1.3.3  분해병: 용량 약 100 mL의 내압ㆍ내열의 마개있는 유리병 또는 테프론병

1.3.4  초음파기(초음파 수조, 초음파 교반기 등)

1.4  시약 및 표준물질

1.4.1  알카리성과황산칼륨 용액: 증류수 250 mL에 수산화나트륨(NaOH) 10 g을 넣어 녹인 다음 과황산칼륨(K2S2O8) 7.5 g을 넣어 녹인다. 사용시 조제한다.

1.4.2  질산 질소 표준원액(0.1 mgNO3-N/mL): 질산칼륨(KNO3)을 105 ∼ 110 °C에서 4시간 건조한 다음 항량하여 0.7218 g을 정확히 단 다음 증류수에 녹여 1 L로 한다.

1.4.3  질산 질소 표준액(0.02 mgNO3-N/mL): 질산성 질소 표준원액 20 mL를 정확히 취하여 증류수를 가하여 전량을 100 mL로 한다.

1.5  시료의 채취 및 보관

1.5.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료

1.5.1.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료는 동결건조기를 사용하여 항량이 될 때까지 건조시킨 다음 밀폐용기에 담아서 보관한다. 이 경우 시험 전에 진공 데시케이터 안에 30분간 넣어둔 다음 시험에 사용한다.

1.5.1.2  동결?건조된 시료 3 ∼ 5 g을 취한 다음 100 mL 메스플라스크에 담는다. 증류수 80 mL를 가한 다음 마개를 닫고 초음파기를 사용하여 약 5분 정도 혼합시킨다. 메스플라스크 바닥에 침전물이 많이 남아 있거나, 혼합 상태가 좋지 않을 때는 앞 과정을 2 ∼ 3회 반복한다. 증류수를 넣어 100 mL 메스플라스크의 표선을 맞춘다. 이 용액을 총질소 시험용 검액으로 사용한다. 검액은 사용 직전에 조제해서 사용한다.

1.5.2  함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료

함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료는 그대로 아래에 기술된 전처리 및 시험방법에 따라 시험한다.

1.5.3  시료 50 mL

 질소함량이 0.1 mg 이상일 경우에는 희석하여 사용

를 분해병에 넣고 알카리성과황산칼륨 용액 10 mL를 넣어 마개를 닫고 흔들어 섞은 다음 고압증기멸균기에 넣고 가열한다. 약 120 °C가 될 때부터 30분간 가열 분해하고 분해병을 꺼내어 방냉한다.

1.6  시험방법

1.6.1  흡광광도 시험법

1.6.1.1  전처리한 시료의 상등액을 취하여 유리섬유 여과지(GF/C)로 여과하고 처음 여액 5 ∼ 10 mL는 버린 다음, 여액 25 mL를 정확히 취하여 50 mL 비이커 또는 비색관으로 옮긴다.

1.6.1.2  여기에 염산(1 + 16) 5 mL를 넣어 pH 2 ∼ 3으로 하고, 이 용액의 일부를 층장 10 mm 흡수셀에 옮겨 검액으로 한다. 따로 증류수 50 mL를 취하여 시료의 전처리 시험방법에 따라 시험하고 바탕시험액으로 한다.

1.6.1.3  바탕시험액을 대조액으로 하여 220 nm에서 검액의 흡광도를 측정하고, 미리 작성한 검량선으로부터 질소의 양을 구하여 시료 중의 총질소 농도(mg/L)를 산출한다.

1.6.2  검량선

1.6.2.1  질산성질소 표준액(0.02 mg NO3-N/mL) 0 ∼ 10 mL를 단계적으로 취하여 100 mL 용량 플라스크에 넣고 증류수를 넣어 표선을 채운다.

1.6.2.2  이 액 25 mL씩을 정확히 취하여 각각 50 mL 비이커 또는 비색관에 넣고 염산(1 + 500) 5 mL를 넣은 다음, 시료의 시험방법에 따라 시험하고 질소의 양과 흡광도와의 관계선을 작성한다.

 이 방법은 브롬 이온 10 mg/L, 크롬 0.1 mg/L 정도에서 영향을 받으며 해수와 같은 시료에는 적용할 수 없다.

1.6.3  농도계산

총질소 계산식은 다음과 같다.

                  (식 1)

a: 검량선으로부터 구한 질소의 양(mg)

V: 전처리에 사용한 시료량(L)

1.6.4  측정값의 단위환산

1.6.4.1  동결건조된 시료를 사용하여 검액을 만든 경우

총질소(mg N/kg, dry weight) = 총질소(mgN/L) × (V/W)        (식 2)

V: 검액의 부피(mL)

W: 검액 제조 시 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

1.6.4.2  위 1.6.4.1이 아닌 경우 따로 함수율을 측정한 다음 총질소값을 건조 중량 단위로 보정한다.

1.7  참고사항

이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

2. 카드뮴 환원법

2.1  측정원리

시료 중 질소화합물을 알카리성 과황산칼륨 존재하에 120 °C에서 유기물과 함께 분해하여 질산 이온으로 산화시킨 다음, 질산 이온을 다시 카드뮴-구리환원 컬럼을 통과시켜 아질산 이온으로 환원시키고 아질산성질소의 양을 구하여 질산성?질소로 환산하는 방법이다. 이 방법은 비교적 분해되기 쉬운 유기물을 함유한 시료나 시료량이 소량일 경우로서 총질소농도가 낮은 시료에 적용된다.

2.2  측정범위 및 정밀도

이 방법의 정량 범위는 0.0002 ∼ 0.002 mgN이며 표준편차는 3 ∼ 10 %이다.

2.3  기구 및 기기

2.3.1  광전광도계 또는 광전분광광도계

2.3.2  고압증기멸균기

2.3.3  분해병

2.3.4  카드뮴-구리 환원 컬럼(이하 환원 컬럼)

 컬럼의 바닥에 유리섬유를 끼우고 컬럼 충전액을 채운 다음 카드뮴-구리 컬럼 충전제를 액과 함께 흘려보내 공간이 없도록 채운 다음 위에 다시 유리섬유를 끼우고 상부로부터 컬럼 충진액 100 mL, 질산질소표준원액(0.1 mgNO3-N/mL)을 컬럼 충진액으로 100배 희석한 액 200 mL, 컬럼 충진액 100 mL 순으로 매분 약 10 mL의 유속에서 흘려보낸다. 컬럼을 사용하지 않을 때에는 항상 상부에 컬럼 충진액을 채워둠으로써(약 1 cm) 공기와의 접촉을 방지한다. 또한, 환원 컬럼은 시료에 따라서 15 ∼ 20회 정도 사용하면 질산 이온의 환원율이 저하되므로 이때는 컬럼 활성화액 약 20 mL를 컬럼에 주입하여 카드뮴-구리 컬럼 충진제와 충분히 접촉된 상태에서 2 ∼ 3시간 방치하고 흘려보낸 다음 컬럼 충진액 약 100 mL로 씻어주면 환원 컬럼이 활성화된다.

2.3.5  초음파기 초음파기의 예로 초음파 수조, 초음파 교반기 등이 있다.

2.4  시약 및 표준물질

2.4.1  염산(1 + 11): 염산(HCl) 1에 대하여 증류수 11을 첨가하여 제조한다.

2.4.2  염화암모늄-암모니아 용액: 염화암모늄(NH4Cl) 100 g을 증류수 700 mL에 녹인 다음 암모니아수(NH4OH) 50 mL를 넣고 증류수를 넣어 1 L로 한다.

2.4.3  카드뮴-구리 컬럼 충진제: 입상 카드뮴  (입경 0.5 ∼ 2 mm) 약 40 g을 삼각플라스크에 넣는다. 염산(1 + 5) 약 50 mL를 넣어 씻어 준다. 다시 증류수 약 100 mL씩으로 2회 씻어주고 5회 정도 씻어준 다음 씻은 액은 버린다. 카드뮴-구리 환원 컬럼 활성화액 200 mL를 넣어 24시간 방치해서 카드뮴의 표면에 구리의 피막을 형성하게 한 다음 밀봉하여 보존한다.

2.4.4  카드뮴-구리 컬럼 활성화액: 증류수 700 mL에 8 % 수산화나트륨 용액 70 mL를 넣는다. 에틸렌디아민테트라초산이나트륨(2수화물) 38 g 및 황산구리(5수화물) 12.5 g을 넣어 녹인다. 8 % 수산화나트륨 용액을 넣어 pH 7로 조절한 다음 증류수를 넣어 1,000 mL로 한다.

2.4.5  술퍼닐아미드 용액: 술퍼닐아미드(C6H8O2ㆍN2S) 5 g을 용량 500 mL 비이커에 넣고 초순수 300 mL를 첨가한 다음 진한 염산 50 mL를 첨가하여 혼합하여 녹인 후 실온으로 냉각한 다음 용량 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500  mL로 한다. 이 용액은 플라스틱 용기에 넣어 보관하며, 수개월간 안정하다.

2.4.6  염화나프틸에틸렌디아민 용액(N-(1-naphtyl)-ethylenediamine dihydrochloride): 염화나프틸에틸렌디아민(C12H14N2ㆍ2HCl) 0.5 g을 100 mL 비이커에 옮긴 다음 초순수 약 50 mL에 녹인 후 500 mL 부피플라스크에 옮긴다. 소량의 초순수로 비이커를 세척하여 부피플라스크에 옮긴(3회 반복) 다음 초순수로 최종 부피를 500 mL로 한다. 이 용액은 차광용기에 넣어 냉장 보관(8 °C 이하)하며, 유효기간은 1개월 이상이다. 그러나, 용액이 갈색으로 변색된 경우에는 1개월 이전이라도 사용하지 않고 다시 만들어야 한다.

2.4.7  질산성질소 표준액(0.002 mgNO3-N/mL): 질산성질소 표준액(0.02 mg NO3-N/mL) 10 mL를 정확히 취하여 증류수를 가하여 전량을 100 mL로 한다.

2.5  시료의 채취 및 보관

위 제5항 총질소 흡광광도법의 1.5 시료의 채취 및 보관에 따른다.

2.6  시험방법

2.6.1  카드뮴 환원법

2.6.1.1  전처리한 시료(위 1.5.3)가 들어있는 분해병에 염산(1 + 11) 10 mL를 넣고 흔들어 섞은 다음 100 mL 용량 플라스크에 옮긴다. 분해병의 안쪽을 소량의 증류수로 수회 씻어서 용량 플라스크에 합하고 염화암모늄-암모니아 용액 10 mL

 환원용 시료 100 mL 중 총질소의 양이 0.02 mL 이상일 경우에는 200 ∼ 500 mL 용량 플라스크를 사용하여 100 mL당 염화암모늄ㆍ암모니아 용액 10 mL씩을 더 넣어주고 증류수로 표선을 채운 다음 환원용 시료로 한다. 이때는 총질소 농도 계산식에 C/100(C:사용한 플라스크 용량 L)를 곱해 준다.

를 넣어 증류수로 표선을 채워서 환원용 시료액으로 한다.

2.6.1.2  이 액 5 mL를 환원 컬럼의 상부로부터 매분당 약 10 mL의 속도로 흘려보내 유출액은 버리고 이 조작을 한번 더 반복한다. 다음에 환원용 시료액 약 80 mL를 위와 같은 속도로 흘려보내 처음의 유출액 20 mL는 버리고 다음 유출액 50 mL를 수기에 받아 측정용 시료로 사용한다.

2.6.1.3  유리시험관(또는 플라스틱 시험관)에 시료 10 mL를 정확히 취하고, 술퍼닐아미드 용액 0.2 mL를 첨가하여 충분히 혼합하고 약 2분 이상 방치한 후(8분 이내)에 염화나프틸에틸렌디아민 용액을 첨가한다.

2.6.1.4  염화나프틸에틸렌디아민 용액 0.2 mL를 첨가하고, 혼합한 후에 약 10분 이상 2시간 이내에 파장 543(혹은 540 nm)에서 흡광도를 측정한다.

2.6.1.5  따로 증류수 50 mL를 취하여 시료의 전처리 및 시험방법과 동일한 과정으로 시험하여 검액의 흡광도를 보정한다.

2.6.2  검량선

질산성질소 표준액(0.002 mgNO3-N/L) 0 ∼ 10 mL를 단계적으로 취하여 100 mL 용량 플라스크에 넣고, 염화암모늄ㆍ암모니아 용액 10 mL와 증류수를 넣어 표선을 채운 다음, 각 농도별 환원용 표준액으로 하여 시료의 시험방법에 따라 시험하고 총질소의 양과 흡광도와의 검량선을 작성한다.

2.6.3  농도계산

미리 작성한 검량선으로부터 환원용 시료 100 mL 중의 총질소 양을 구하고 다음식에서 농도(mg/L)를 산출한다.

총질소(mgN/L)  = a ×                      (식 3)

a: 환원용 시료 100 mL 중의 총질소(mg)

V: 전처리에서 취한 시료량(mL)

2.6.4  측정값의 단위환산

2.6.4.1  동결건조된 시료를 사용하여 검액을 만든 경우

총질소(mgN/kg, dry weight) = 총질소(mgN/L) × (V/W)       (식 4)

V: 검액의 부피(mL)

W: 검액 제조 시 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

2.6.4.2  위 2.6.4.1이 아닌 경우 따로 함수율을 측정한 다음 총질소 값을 건조중량 단위로 보정한다.

2.7  참고사항

이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

3. 환원증류-킬달법(합산법)

3.1  측정원리

시료에 데발다합금을 넣고 알칼리성에서 증류하여 시료 중의 무기질소를 암모니아로 환원 유출시키고, 다시 잔류시료 중의 유기질소를 킬달 분해한 다음 증류하여 암모니아로 유출시켜 각각의 암모니아성 질소의 양을 구하고 이들을 합하여 총질소를 정량하는 방법이다.

3.2  측정범위 및 정밀도

이 방법의 정량범위는 0.008 ∼ 0.16 mg N이며 표준편차는 3 ∼ 10 %이다.

3.3  기구 및 기기

3.3.1  광전광도계 또는 광전분광광도계

3.3.2  증류장치

3.3.3  킬달 분해장치

3.3.4  초음파기(예: 초음파 수조, 초음파 교반기 등)

3.4  시약 및 표준물질

3.4.1  데발다합금 분말

3.4.2  수산화나트륨 용액(30 % w/v)

3.4.3  0.05 N 황산: 황산(H2SO4) 1.5 mL를 증류수 1 L 중에 섞으면서 천천히 넣어 식힌다.

3.4.4  황산(H2SO4, 95 % 이상)

3.4.5  과산화수소수(H2O2, 30 % 이상)

3.4.6  수산화나트륨 용액(50 % w/v)

3.5  시료의 채취 및 보관

3.5.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료

3.5.1.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료는 동결건조기를 사용하여 항량이 될 때까지 건조시킨 다음 밀폐용기에 담아서 보관한다. 이 경우 시험 전에 진공 데시케이터 안에 30분간 넣어둔 다음 시험에 사용한다.

3.5.1.2  동결건조된 시료 3 ∼ 5 g을 취한 다음 100 mL 메스플라스크에 담는다. 증류수 80 mL를 가한 다음 마개를 닫고 초음파기를 사용하여 약 5분 정도 혼합시킨다. 메스플라스크 바닥에 침전물이 많이 남아 있거나, 혼합상태가 좋지 않을 때는 앞 과정을 2 ∼ 3회 반복한다. 증류수를 넣어 100 mL 메스플라스크의 표선을 맞춘다. 이 용액을 총질소 시험용 검액으로 사용한다. 검액은 사용 직전에 조제해서 사용한다. 검액은 아래에 기술된 전처리 및 시험방법에 따라 시험한다.

3.5.2  함수율 95 % 이상(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료

함수율 95 % 이상(고형물 5% 미만)인 폐기물 시료는 그대로 아래에 기술된 전처리 및 시험방법에 따라 시험한다.

3.5.3  무기질소의 환원

3.5.3.1  시료 적당량(0.7 ∼ 10 mg N 함유)을 취하여 1 L 증류플라스크에 넣고 물을 넣어 약 350 mL로 한다.

3.5.3.2  비등석 수 개, 데발다합금 분말 3 g과 수산화나트륨 용액(30 %. w/v) 10 mL를 넣어 증류 장치를 조립하고, 냉각관의 끝을 미리 0.05 N 황산 50 mL를 넣어 둔 200 mL 메스실린더 수기에 연결하여 매분 5 ∼ 7 mL의 유출 속도로 증류한다.

3.5.3.3  수기의 유출 액량이 약 180 mL가 되면 증류를 끝내고 냉각관의 안쪽을 소량의 물로 수회 씻어서 수기에 합하여 물을 넣어 표선을 채운다(A액).

3.5.4  유기질소의 분해

3.5.4.1  위 3.5.3의 과정에서 증류하고 남은 증류플라스크의 내용물과 증류플라스크를 물로 씻은 액 전량을 조심하여 적당한 용량의 킬달플라스크에 옮기고, 총질소 시험용 분해 촉진제 2 g을 넣고 플라스크의 목 부분에 남아 있는 잔류물을 소량의 물로 씻어 넣은 플라스크의 내벽을 따라 황산 5 ∼ 10 mL를 넣는다.

3.5.4.2  다음에 과산화수소수 1 mL를 주의하여 넣고 석면상에서 가열하여 백연이 발생하여 내용물이 투명해질 때까지 분해를 계속한다.

3.5.4.3  방냉한 다음 증류수 약 100 mL를 넣어 석출된 결정성 물질을 가열 용해하여 분해한 액을 1 L 증류플라스크에 옮기고 소량의 물로 킬달플라스크를 수회 씻어서 합한다.

3.5.4.4  물을 넣어 액량을 약 350 mL로 하고 증류 장치를 조립하여 냉각관의 끝을 미리 0.05 N 황산 50 mL를 넣어둔 200 mL 매스실린더 수기에 연결한다. 증류플라스크의 상부로부터 수산화나트륨 용액(50 % w/v) 40 mL를 넣고 증류플라스크를 가열하여 매분 5 ∼ 7 mL의 유출 속도로 증류한다.

3.5.4.5  수기의 유출 액량이 약 180 mL가 되면 증류를 끝내고 냉각관의 안쪽을 소량의 물로 수회 씻어서 수기에 합하고 물을 넣어 표선을 채운다(B액).

3.6  시험방법

3.6.1  위 전처리 과정에서 얻어진 A, B액의 일부 또는 전량을 취하여 수질오염공정시험기준 암모니아성 질소 시험법(ES 04355.0) 중 자외선, 가시선 분광법(인도페놀법)(ES 04355.1c) 또는 적정법(ES 04355.3b)에 따라 시험한다.

3.6.2  따로 시료와 같은 양의 물을 취하여 1 L 증류플라스크에 넣고 시료의 전처리와 같은 조작을 하여 바탕시험액으로 한다. 

3.6.3  바탕 시험을 대조액으로 하여 각각 A, B액 중의 총질소 농도를 구하고 두 값을 합하여 시료의 총질소 농도(mgN/L)로 한다.

3.6.4  측정값의 단위 환산

3.6.4.1  동결 건조된 시료를 사용하여 검액을 만든 경우

총질소(mg N/kg, dry weight) = 총질소(mg N/L) × (V/W)      (식 5)

V: 검액의 부피(mL)

W: 검액 제조 시 사용한 동결 건조된 시료의 무게(g)

3.6.4.2  위 3.6.4.1이 아닌 경우 따로 함수율을 측정한 다음 총질소 값을 건조 중량 단위로 보정한다.

3.7  참고사항

이 방법 이외의 분석 방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제6항 총인(Total Phosphorus, TP)

1. 측정원리

시료 중의 유기물을 산화 분해하여 모든 인 화합물을 인산염(PO4) 형태로 변화시킨 다음 인산염을 아스코르빈산 환원 흡광광도법으로 정량하여 총 인의 농도를 구하는 방법이다.

2. 측정범위 및 정밀도

이 방법의 정량범위는 0.001 ∼ 0.025 mgP/mL이며, 표준편차는 2 ∼ 10 %이다.

3. 기구 및 기기

3.1  광전광도계 또는 광전분광광도계

3.2  고압증기멸균기

3.3  분해병

3.4  킬달 분해장치

3.5  초음파기(초음파 수조, 초음파 교반기 등)

4. 시약 및 표준물질

4.1  과황산칼륨 용액(4 % w/v)

4.2  질산(HNO3)

4.3  황산(H2SO4, 95 % 이상)

4.4  p-니트로페놀(0.1 % w/v)

4.5  수산화나트륨 용액(20 % w/v)

4.6  수산화나트륨 용액(4 % w/v)

4.7  몰리브덴산암모늄ㆍ아스코르빈산 혼액: 몰리브덴산암모늄?4수화물[(NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O] 6 g과 타르트라트안티몬(III)산칼륨(C4H4O6KㆍSbOㆍ1/2H2O) 0.24 g을 증류수 약 300 mL에 녹이고, 황산(2 + 1) 120 mL와 설파민산암모늄 5 g을 넣어 녹인 다음 증류수를 넣어 500 mL로 하고, 여기에 L-아스코르빈산 용액 100 mL를 넣어 섞는다. 사용 시 조제한다. L-아스코르빈산 용액은 아스코르빈산(C6H8O6) 5 g을 증류수 100 mL에 녹여서 제조한다.

4.8  인산염인 표준원액(0.1 mgP/ mL): 인산이수소칼륨(KH2PO4)을 110 °C에서 3시간 건조 후 데시케이터에서 방냉한 다음 0.439 g을 정확히 단다. 이를 증류수에 녹여 전량을 1 L로 한다. 이용액 1 mL는 인 0.1 mg을 함유한다.

4.9  인산염인 표준액(0.005 mgP/ mL): 메스플라스크 200 mL에 인산염인 표준원액(0.1 mgP/mL) 10 mL를 정확히 취한 다음 증류수를 표선까지 가한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료

5.1.1  함수율 95 % 미만(고형물 5 % 이상)인 폐기물 시료는 동결건조기를 사용하여 항량이 될 때까지 건조시킨 다음 밀폐용기에 담아서 보관한다. 이 경우 시험 전에 진공데시케이터 안에 30분간 넣어둔 다음 시험에 사용한다.

5.1.2  동결건조된 시료 3 ∼ 5 g을 취한 다음 100 mL 메스플라스크에 담는다. 증류수 80 mL를 가한 다음 마개를 닫고 초음파기를 사용하여 약 5분 정도 혼합시킨다. 메스플라스크 바닥에 침전물이 많이 남아 있거나, 혼합상태가 좋지 않을 때는 앞 과정을 2 ∼ 3회 반복한다. 증류수를 넣어 100 mL 메스플라스크의 표선을 맞춘다. 이 용액을 총인 시험용 검액으로 사용한다. 검액은 사용 직전에 조제해서 사용한다. 검액은 아래에 기술된 전처리 및 시험방법에 따라 시험한다.

5.2  함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료

함수율 95 % 이상(고형물 5 % 미만)인 폐기물 시료는 그대로 아래에 기술된 전처리 및 시험방법에 따라 시험한다.

5.3  과황산칼륨 분해(분해되기 쉬운 유기물을 함유한 시료)

5.3.1  시료 50 mL(인으로서 0.06 mg 이하 함유)를 분해병에 넣고 과황산칼륨 용액(4 % w/v) 10 mL를 넣어 마개를 닫고 섞은 다음 고압증기멸균기에 넣어 가열한다.

5.3.2  약 120 °C가 될 때부터 30분간 가열 분해를 계속하고 분해병을 꺼내 방냉한다.

5.4  질산-황산 분해(다량의 유기물을 함유한 시료)

5.4.1  시료 50 mL(인으로서 0.06 mg이하 함유)를 킬달플라스크에 넣고 질산 2 mL를 넣어 액량이 약 10 mL가 될 때까지 서서히 가열 농축하고 방냉한다.

5.4.2  여기에 질산 2 ∼ 5 mL와 황산 2 mL를 넣고 가열을 계속하여 황산의 백연이 격렬하게 발생할 때까지 가열한다.

5.4.3  만일 액의 색이 투명하지 않을 경우에는 방냉한 다음 질산 2 ∼ 5 mL를 더 넣고 가열 분해를 반복한다.

5.4.4  분해가 끝나면 증류수 약 30 mL를 넣고 약 10분간 조용히 가열하여 가용성 염을 녹이고 방냉한다.

5.4.5  이 용액을 P-니트로페놀(0.1 % w/v)을 지시액으로하여 수산화나트륨 용액(20 % w/v) 및 수산화나트륨 용액(4 % w/v)을 넣어 액의 색이 황색을 나타낼 때까지 중화한 다음 50 mL 용량 플라스크에 옮기고 물을 넣어 표선까지 채운다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료의 상등액

 전처리한 시료의 상등액이 탁할 경우에는 유리섬유 여과지로 여과하여 여액을 사용한다.

 25 mL를 취하여 마개있는 시험관에 넣고 몰리브덴산암모늄ㆍ아스코르빈산 혼액 2 mL를 넣어 흔들어 섞은 다음 20 ∼ 40 °C에서 15분간 방치한다.

6.2  이 용액의 일부를 층장 10 mm 흡수셀에 옮겨 검액으로 하고 따로 증류수 50  mL 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.3  바탕시험액을 대조액으로 하여 880 nm 880 nm에서 흡광도 측정이 불가능할 경우에는 710 nm에서 측정한다.

에서 검액의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검량선으로부터 총인의 양을 구하여 농도(mg/L)를 산출한다.

6.4  검량선

인산염인 표준용액(0.005 mgP/ mL) 1 ∼ 20 mL를 단계적으로 취하여 100 mL 용량 플라스크에 넣고 물을 넣어 표선을 채운 다음, 이 액 25 mL씩을 마개있는 시험관에 넣고 시료의 시험방법에 따라 시험하여 인의 양과 흡광도와의 관계선을 작성한다.

6.5  농도계산

6.5.1  과황산칼륨 분해한 경우

총인(mgP/L)  = a ×  ×                 (식 1)

a: 검량선으로 부터 구한 인의 양(mg)

6.5.2  질산-황산 분해한 경우

총인(mgP/L)  = a ×                     (식 2)

a : 검량선으로 부터 구한 인의 양(mg)

6.6  측정값의 단위 환산

6.6.1  동결건조된 시료를 사용하여 검액을 만든 경우

총인(mg P/kg, dry weight) = 총인(mg P/L) × (V/W)        (식 3)

V: 검액의 부피(mL)

W: 검액 제조 시 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

6.6.2  위 6.6.1이 아닌 경우 따로 함수율을 측정한 다음, 총인값을 건조중량 단위로 보정한다.

7. 참고사항

이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제7항 시안(Cyanides, CN)

1. 측정원리

폐기물 시료 내에는 다양한 형태의 수용성 시안화물 혹은 시안화착화합물이 존재한다. pH 2 이하의 산성 수용액에서 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA, (COOCCH2)2NCH2CH2N(CH2COO-)2)를 가한 후 가열 증류하여, 시안화물 및 시안착화합물들을 시안화수소(HCN, pKa ∼ 9.2) 기체로 유출시켜 수산화나트륨 용액(NaOH)에 포집한다. 포집된 시안 이온을 중화시키고 클로라민 T(Chloramine-T, CH3C6H4SO2NClNa) 용액을 넣어 염화시안(CNCl)으로 산화시킨 후, 피리딘-피라졸론(Pyridine- Pyrazolone) 혼합 용액을 넣어 청색으로 발색시킨다. 발색된 시료의 스펙트럼은 가시광선 영역인 620 nm 부근에서 흡수가 일어나며 분광광도계를 이용하여 이때의 흡광도를 측정한다. 시안화수소와 염화시안은 독성의 기체이다. 반드시 후드 내에서 실험해야 한다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효 측정범위는 검출한계에서 0.50 mg CN/L까지이다. 일반적인 검출한계는 1 cm 셀 사용시 99 % 신뢰구간에서 0.01 mg CN/L이며 표준편차율은 약 2 ∼ 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  분광광도계(spectrophotometer)

3.2  증류장치

┌┬────────────────────┐

││A : 1 L 증류플라스크   B : 연결관       │

││C : 콕크                 D : 안전깔때기 │

││E : 분리관          F : 냉각관          │

││G : 역류방지관          H : 수기        │

││I : 접합부               J : 볼접합부   │

││K : 집게                                │

└┴────────────────────┘

그림 1. 시안분석 증류장치

4. 시약 및 표준물질

4.1  0.5 % 페놀프탈레인 에틸알코올 용액: 페놀프탈레인(C20H14O4) 0.5 g을 에틸알코올(95.0 % v/v) 50 mL에 녹인 후 초순수 증류수를 넣어 100 mL로 한다.

4.2  10 % 술퍼민산암모늄 용액: 술퍼민산암모늄(NH4OSO2NH2) 10 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.3  에틸렌디아민테트라초산이나트륨 용액: 에틸렌디아민테트라초산이나트륨 (2수화물) [C1OH14N2Na2O8NH2Oㆍ2H2O] 10 g을 80 mL 정도의 초순수 증류수에 가열하며 녹인 후 100 mL로 만든다.

4.4  1 % 클로라민 T용액: 클로라민 T(3수화물)[C7H7ClNaO2Sㆍ3H2O] 1.25 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다 이 용액은 측정 당일 매번 새롭게 만든다.

4.5  피리딘-피라졸론 혼합 용액: 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론(C10H10N2) 0.25 g을 75 °C의 증류수 100 mL에 녹이고 방냉한 다음 Bis[1-페닐-3-메틸-5 피라졸론(C20H18O2N4)] 0.02 g을 피리딘(C5H5N)에 녹인 용액 20 mL와 혼합한다. 이 용액은 측정 당일 매번 새롭게 만든다.

4.6  시안이온 표준원액(1 mg CN-/mL): 시안화칼륨(KCN) 2.51 g을 정확히 취해 적량의 증류수로 녹여 정확히 1,000 mL로 한다. 이 용액은 사용할 때 조제하며 표정은 수질오염공정시험기준 시안-자외선/가시선 분광법(ES 04353.1d)에 기술된 방법에 따른다.

4.7  시안이온 표준액(0.001 mg CN-/mL): 시안이온으로 10 mg에 해당하는 양의 시안이온 표준원액의 mL 수를 정확히 취하여 2 % 수산화나트륨 용액 100 mL와 증류수를 넣어 정확히 1,000 mL로 한다. 이 액 10 mL를 정확히 취하여 증류수를 넣어 정확히 100 mL로 한다. 사용할 때 조제한다.

4.8  인산염 완충액(pH 6.8): 인산이수소칼륨(KH2PO4) 34 g과 무수인산일수소나트륨(Na2HPO4) 35.6 g을 증류수에 녹여 1,000 mL로 한다.

4.9  2 % 수산화나트륨 용액: 수산화나트륨(NaOH) 2 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  동결건조된 시료 2 ∼ 3 g을 정확히 취하여 500 mL 삼각플라스크에 넣고 증류수 200 mL를 첨가한다. 진탕기를 이용하여 1시간 정도 진탕시킨 다음 증류수를 넣어 250 mL로 만든다.

5.2  위 5.1에서 만들어진 용액 250 mL를 증류플라스크에 넣고 지시약으로 페놀프탈레인 에틸알코올 용액(0.5 % w/v) 2 ∼ 3방울을 넣은 다음, 인산 또는 2 % 수산화나트륨용액을 사용하여 중화한 후 증류장치를 조립한다.

5.3  시안증류장치의 주입깔때기를 통하여 술퍼민산암모늄 용액(10 % w/v) 1 mL와 인산 10 mL 및 에틸렌디아민테트라초산이나트륨 용액 10 mL를 넣고 가스누출 방지를 위해 깔대기에 증류수를 채운 후 수분간 방치한 다음 증류플라스크를 가열하여 매분 2 ∼ 3 mL의 유출 속도로 증류를 행한다.

5.4  수기는 미리 2 % 수산화나트륨 용액 20 mL를 넣어둔 마개 있는 100 mL 매스실린더를 사용하여 수기 중의 액량이 90 mL가 되었을 때 증류를 끝내고, 냉각기를 떼어내어 냉각기의 안쪽을 소량의 증류수로 세척한 후 증류수를 넣어 정확히 100 mL로 한다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료 20 mL를 정확히 취하여 50 mL 용량 플라스크에 넣고 지시약으로 페놀프탈레인ㆍ에틸알코올 용액(0.5 % w/v) 한 방울을 넣어 조용히 흔들어 주면서 용액의 적색이 없어질 때까지 초산용액(1 + 8)을 넣는다(약 1 mL 소요).

6.2  인산염 완충액(pH 6.8) 10 mL, 클로라민 T용액(1 % w/v) 0.25 mL를 넣고 마개를 막아 조용히 섞는다. 약 5분간 방치하고 피리딘-피라졸론 혼합 용액 15 mL를 넣고 증류수를 넣어 표선을 채운 다음 조용히 섞고 25 °C의 수욕 중에서 30분간 방치한다.

6.3  위 용액의 일부를 1 cm 셀에 옮겨 620 nm에서 흡광도를 측정한다. 따로 증류수를 바탕시험용 시료로서 시료의 시험방법에 따라 시험하여 그 결과를 보정한 다음, 시안의 농도와 흡광도의 검정관계식으로부터 시안의 농도(mgCN/L)를 산출한다.

6.4  위 6.3에서 구한 시안의 농도(C1)로부터 5.4의 전처리 과정을 통하여 얻어진 용액의 전체 부피(V)와 실험에 사용한 동결 건조된 시료의 무게(W)를 고려하여 전체 시료 중 시안의 농도(C2)를 구한다.

    C1(mgCN/L) × V(mL) × (1/W(g)) = C2(mgCN/kg 건조 중량)      (식 1)

C1: 검량선식에서 얻어진 시안의 농도(mg/L)

C2: 전체 시료 중 시안의 농도(mgCN/kg 건중량)

V: 전처리 과정을 통하여 얻어진 용액의 전체 부피(mL)

W: 실험에 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

증류수 20 mL를 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕용액으로 한다. 정량 분석용 시안이온 표준용액 (0.001 mg CN/ mL) 1 ∼ 10 mL를 4개 이상 단계적으로 취하여 증류수로 각각의 전체 부피를 20 mL로 맞춘 후 시료의 시험방법에 따라 시험하여 시안의 농도와 흡광도의 검량선식을 작성한다.

8. 참고사항

8.1  시료의 오염

8.1.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 실수로 인한 염소계 산화제와의 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 시안 분자 구조를 분해시킨다.

8.1.2  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 실수로 인한 알데히드(Aldehyde) 계열의 화합물과의 접촉을 피한다. 알데히드와의 반응을 통해 시안화물이 시아노히드린 (Cyanohydrin)으로 변화된다.

8.2  분석 시 방해요인

8.2.1  위 8.1 시료의 오염 항목에 열거한 사항들은 분석 시 방해 요인으로 작용한다.

8.2.2  시료 내에 황화물이 포함되어 있을 경우 시료의 발색에 영향을 줄 수 있다.

8.2.3  분광기기를 이용한 흡광도 측정시 시료가 담긴 셀(Cell)의 표면이 오염되지 않도록 주의한다.

8.3  이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제8항 페놀류(Phenols)

1. 측정원리

페놀계 화합물은 약알칼리성 수용액(pH 8 ∼ 10)에서 페리시안화칼륨(Potassium ferricyanide)의 존재하에 아미노안티피린(4-Amino antipyrine)과 반응하여 적갈색의 안티피린계 색소(Antipyrine dye)가 된다. 발색된 시료의 스펙트럼은 가시광선 영역인 460 nm 부근(추출법)과 510 nm 부근(직접법)에서 흡수가 일어나며 분광기를 이용하여 이때의 흡광도를 측정한다. 아미노안티피린을 이용한 분석 방법은 페놀분자의 파라(p-), 메타(m-) 위치에 치환체를 갖는 모든 페놀류와 오쏘(o-) 위치에 치환체를 갖는 일부 페놀류의 분석에 적용할 수 있다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효 측정범위는 추출법의 경우 0.0025 ∼ 0.05 mg/L, 직접법의 경우 0.005 ∼ 0.05 mg/L이다. 일반적인 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 추출법의 경우 0.005 mg/L, 직접법의 경우 0.5 mg/L이며 표준편차율은 약 3 ∼ 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  분광광도계(spectrophotometer)

3.2  증류장치

그림 1. 페놀 증류장치

4. 시약 및 표준물질

4.1  메틸오렌지 용액 (0.1 % w/v): 0.1 g의 메틸오렌지(C14H14N3NaO3S)를 100 mL의 뜨거운 증류수 (약 80 °C)에 녹인 후 방냉시킨다.

4.2  염화암모늄-암모니아 완충액: 염화암모늄(NH4Cl) 100 g을 증류수 700 mL에 녹인 후 암모니아수 50 mL을 넣고 증류수를 사용하여 1,000 mL으로 한다.

4.3  2 % w/v 4-아미노안티피린 용액: 4-아미노안티피린(C11H13N3O) 2 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다. 이 용액은 분석 당일 매번 새롭게 만든다.

4.4  페리시안화칼륨 용액: 페리시안화칼륨 [K3Fe(CN)6] 9 g을 증류수에 녹여 100 mL로 만든다. 분석 당일 제조하여 사용한다.

4.5  클로로포름(CHCl3)

4.6  무수황산나트륨(Na2SO4)

4.7  페놀 표준원액(1,000 mg C6H5OH/L): 페놀 1 g을 증류수에 녹여 정확히 1,000 mL로 하고 차광용기에 넣어 냉암소에 보관한다. 표정은 수질오염공정시험기준 페놀류-자외선/가시선 분광법(ES 04365.1c)에 기술된 방법에 따른다.

4.8  페놀 표준용액(1 mg C6H5OH/L): 페놀 1 mg에 해당하는 양의 페놀 표준원액의 mL수를 정확히 취한 다음 증류수를 넣어 정확히 1,000 mL로 한다. 이 시약은 분석 당일 조제해야 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  동결건조된 시료 2 ∼ 3 g을 정확히 취하여 500 mL 삼각플라스크에 넣고 증류수 200 mL를 첨가한다. 진탕기를 이용하여 1시간 정도 진탕시켜 시료를 완전히 용융시킨 다음 증류수를 넣어 250 mL로 만든다.

5.2  위 5..1에서 만들어진 용액 250 mL를 증류플라스크에 넣고 메틸오렌지용액(0.1 % w/v) 수 방울을 넣고 10 % 인산 용액을 넣어 pH를 약 4로 조절한 후 황산구리 용액 2.5 mL를 넣는다.

5.3  증류플라스크를 증류장치의 냉각관과 연결하고 250 mL 매스실린더를 수기로 사용한다.

5.4  증류액이 225 mL가 되었을 때 가열을 중지하고 증류플라스크에 증류수 25 mL를 넣어 다시 증류를 시작하고, 전체 증류액이 250 mL가 되었을 때 증류를 끝낸다. 증류액이 혼탁할 때에는 증류 조작을 반복하여 재증류한다.

6. 시험방법

6.1  추출법

6.1.1  전처리한 시료 100 mL를 정확히 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣고 염화암모늄-암모니아 완충액(pH 10.0) 3.0 mL를 넣어 섞고 pH를 9.8 ∼ 10.2로 조절한다.

6.1.2  2 %(w/v) 4-아미노안티피린 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞고 페리시안화칼륨 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞은 다음 3분간 방치한다.

6.1.3  클로로포름 10 mL를 정확히 넣어 1분 이상 세게 흔들어 섞어 정치하고 클로로포름층에 무수황산나트륨 약 1 g을 넣어 탈수시킨 다음 일부를 1 cm 셀에 옮겨 시료로 한다. 따로 증류수 100 mL를 사용하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕용액으로 한다.

6.1.4  바탕용액으로 영점을 조정하여 460 nm에서 시료의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검정관계식을 이용하여 페놀의 농도(mg/L)를 산출한다.

6.1.5  위 6.1.4.에서 구한 페놀의 농도(C1)로부터 위 5.4의 전처리 과정을 통하여 얻어진 용액의 전체 부피(V)와 실험에 사용한 동결 건조된 시료의 무게(W)를 고려하여 전체 시료 중 페놀의 농도(C2)를 구한다.

C1(mg페놀/L) × V(mL) × 1/W(g) = C2(mg페놀/kg 건조중량)        (식 1)

C1: 검량선식에서 얻어진 페놀의 농도(mg/L)

C2: 전체 시료 중 페놀의 농도(mg페놀/kg 건중량)

V: 전처리 과정을 통하여 얻어진 용액의 전체 부피(mL)

W: 실험에 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

6.2  직접법

6.2.1  전처리한 시료 100 mL를 정확히 취하여 플라스크 또는 비색관에 넣은 다음 염화암모늄-암모니아 완충액(pH 10.0) 3.0 mL를 넣어 섞고 pH를 9.8 ∼ 10.2로 조절한다.

6.2.2  2 %(w/v) 4-아미노안티피린 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞고 페리시안화칼륨 용액 2.0 mL를 넣어 흔들어 섞은 다음 3분간 방치한다.

6.2.3  일부를 1 cm 셀에 옮겨 시료로 한다. 따로 증류수 100 mL를 사용하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕용액으로 한다.

6.2.4  바탕용액으로 영점을 조정하여 510 nm에서 시료의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검정관계식을 이용하여 페놀의 농도(mg/L)를 산출한다.

6.2.5  위 6.2.4.에서 구한 페놀의 농도(C1)로부터 5.4.의 전처리 과정을 통하여 얻어진 용액의 전체 부피(V)와 실험에 사용한 동결 건조된 시료의 무게(W)를 고려하여 전체 시료 중 페놀의 농도(C2)를 구한다.

C1(mg페놀/L) × V(mL) × 1/W(g) = C2(mg페놀/kg 건조중량)      (식 2)

C1: 검량선식에서 얻어진 페놀의 농도(mg/L)

C2: 전체 시료 중 페놀의 농도(mg페놀/kg 건중량)

V: 전처리 과정을 통하여 얻어진 용액의 전체 부피(mL)

W: 실험에 사용한 동결건조된 시료의 무게(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

7.1  추출법

정량분석용 페놀 표준용액(1 mg C6H5OH/L) 2.5 ∼ 50.0 mL를 4개 이상 단계적으로 취하여 증류수로 각각의 전체 부피를 100 mL로 맞춘 후 시료의 시험방법에 따라 시험하여 페놀의 농도와 흡광도의 검량선식을 작성한다.

7.2  직접법

정량분석용 페놀 표준용액(10 mg C6H5OH/L) 5.0 ∼ 50.0 mL를 4개 이상 단계적으로 취하여 증류수로 각각의 전체 부피를 100 mL로 맞춘 후 시료의 시험방법에 따라 시험하여 페놀의 농도와 흡광도의 검량선식을 작성한다.

8. 참고사항

8.1  시료의 오염

8.1.1  시료의 보관 혹은 전처리 과정 중에 실수로 인한 염소계 산화제와의 접촉을 피한다. 대부분의 염소계 산화제는 페놀을 산화시킨다.

8.1.2  페놀 분해 능력이 있는 박테리아나 기타 산화, 환원시킬 수 있는 물질들에 의해 시료가 오염될 경우 시료가 변질될 수 있다.

8.2  분석 시 방해요인

8.2.1  위 8.1 시료의 오염 항목에 열거한 사항들은 분석 시 방해 요인으로 작용한다.

8.2.2  시료 내에 황화물이 포함되어 있을 경우, 시료의 발색에 영향을 줄 수 있다.

8.2.3  분광기기를 이용한 흡광도 측정 시 시료가 담긴 셀(Cell)의 표면이 오염되지 않도록 주의한다.

8.3  이 방법 이외의 분석 방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제9항 광유류(Mineral oil)

1. 측정원리

노말-헥산류의 비극성 유기 용매에 의해 추출 되는 유분은 일반적으로 지질, 왁스, 탄화수소, 탄화수소유도체, 특정 유기 색소 물질, 황 화합물 그리고 그리이스 유상물질 등의 수많은 화합물들이 복잡하게 혼합되어 있다. 폐기물 시료를 pH 4 이하의 산성으로 처리한 후, 유기 물질들을 노말-헥산으로 추출하여  활성규산마그네슘 (혹은 실리카겔이나 플로리실) 칼럼을 이용하여 동식물유지류를 흡착ㆍ제거하고 광유류 만을 분리해 낸 후 정제된 광유류의 질량을 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효 측정범위는 질량법을 이용할 경우 2∼200mg/kg이고 표준편차율은 5∼20%이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구  

시험에 사용되는 모든 초자기구는 경질 유리 재질로서, 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 세척한 다음 회화로(Furnace)에서 450 °C이상의 온도로 4시간 이상 완전히 태운 후 보관하고, 사용하기 전에 잔류농약 분석용 노말-헥산이나 아세톤으로 세척하여 사용한다.

3.1.1  속슬렛 추출장치(Soxhlet Extractor)

그림 1. 광유류 속슬렛 추출장치

3.1.2  냉각용 콘덴서(Cooling Condenser)

3.1.3  부피플라스크

3.1.4  갈색병(Amber bottle) 혹은 일반 유리병을 알루미늄 포일로 감싸서 사용한다.

3.1.5  150, 250 mL 둥근바닥 플라스크(Round Bottom Flask)

3.1.6  깔때기(Funnel)

3.1.7  1회용 피펫(Disposable Pipet)

3.1.8  진공용 데시케이터(Desiccator)

3.1.9  정제 컬럼(Column): 하부에 테프론 재질의 잠금 꼭지(Stopcock)가 부착된 것으로서 길이가 30 cm이고 내경이 1.0 ∼ 1.2 cm인 것을 사용한다.

3.1.10  원통형 여지(Thimble): GF/F 재질이나 혹은 유리 재질의 것을 사용하며, 노말-헥산으로 4시간 동안 충분히 씻어낸 후 사용한다.

3.1.11  알루미늄 포일(Aluminum Foil, 5 g 이하):잔류농약 분석용 노말-헥산으로 3회 세척 후 건조용 오븐에서 60 ℃로 20분간 건조 후 사용한다.

3.2  기기

3.2.1  가열기구(Heating mantle)와 온도 조절기

3.2.2  환류 냉각용 순환장치(Low Temperature Circulator)

3.2.3  회전식 증발농축기(Rotary evaporator)

3.2.4  회화로(Muffle Furnace)

3.2.5  건조용 오븐(Dry Oven)

3.2.6  전자저울(0.1 mg 이하의 무게 측량이 가능한 것)

3.2.7  동결건조기

4. 시약 및 표준물질

4.1 유기용매

잔류농약 분석용 혹은 그 순도와 동등한 등급의 것을 사용한다.

4.1.1  노말-헥산(n-Hexane: C6H14)

4.1.2  아세톤(Acetone: CH3COCH3)

4.2  무수황산나트륨(Sodium Sulfate, Anhydrous: Na2SO4): 잔류농약 분석용, 또는 특급시약으로서 400 °C에서 4시간 가열하여 정제한 후, 진공상태에서 상온까지 방랭한 후 사용한다.

4.3 활성 규산-마그네슘(Florisil, 입자크기: 150 ∼ 250 μm): 컬럼 크로마토그래피용으로서, 사용하기 전 150 °C에서 4시간 이상 가열하여 활성화시킨 후 진공상태에서 서서히 냉각시킨다. 보관은 데시케이터(건조제: 실리카겔) 내에서 하며, 분석 시는 2시간 이상 보관한 것을 사용한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료의 보관: 현장에서 수집된 유분 시료는 갈색병에 담아 냉동 보관한 후 실험실에 즉시 운반하여 동결건조시킨다. 이후 동결건조된 시료는 분석 전까지 진공 데시케이터 내에 보관한다.

5.2  시료의 전처리

 전처리가 끝난 시료는 직사광선과의 접촉을 피하도록 주의한다. 햇빛을 촉매로 하여 발생할 수 있는 광반응은 분석 대상 화학종의 분자구조에 변화를 줄 우려가 있다.

5.2.1  유기용매를 이용한 총 유분 추출

5.2.1.1  동결 건조한 시료 3 ∼ 5 g을 취하여 미리 세척된 원통형 여지에 옮긴 후 속슬렛 추출장치에 담는다. 250 mL 둥근바닥 플라스크에 노말-헥산과 아세톤 1 : 1 혼합용액(v/v) 150 mL를 넣고 가열장치를 이용하여 4시간 동안 추출한 다음, 추출한 용액의 부피가 4 ∼ 5 mL 정도 될 때까지 회전식 증발 농축기(Rotary evaporator)를 사용하여 용매를 제거한다.

5.2.1.2  청정시설 안에서 12시간 동안 방치하거나 혹은 오염되지 않은 건조 오븐 (65 °C이하) 내에서 유기용매를 완전히 증발시킨다.

5.2.2  총 유분물질 중 광유류 분리

5.2.2.1  위의 과정을 통해 얻은 총 유분 물질을 소량의 노말-헥산에 녹인다.

5.2.2.2  활성화된 규산-마그네슘 10 g을 취하여 컬럼 내부를 12 ∼ 15 cm 높이로 충전하고 컬럼의 상단에 무수황산나트륨(Na2SO4) 1.5 ∼ 2 cm를 얹은 다음, 노말-헥산 20 mL를 이용하여 충분히 씻어준다.

5.2.2.3  둥근바닥 플라스크에 담긴 총 유분물질을 유리 피펫을 이용하여 컬럼 상단에 얹는다. 총 유분물질을 모두 옮긴 후, 최소량의 노말-헥산을 이용하여 둥근바닥 플라스크 내부를 3회 세척한 후 세척액을 컬럼 상단에 더한다. 컬럼에 옮기기 전, 총 유분물질이 담긴 둥근바닥 플라스크에 10 g 정도의 황산나트륨을 첨가하여 조심스럽게 몇 분간 흔들어 주면 시료에 존재할 수 있는 수분을 효과적으로 제거할 수 있다.

5.2.2.4  노말-헥산 100 mL를 전개 용매로 하고 전개 속도는 1 ∼ 2 mL/min으로 하여 시료 용액으로부터 광유류를 분리한다.

5.2.2.5  추출액 중 유기용매를 회전식 증발농축기(Rotary evaporator) 혹은 동등한 성능의 장치를 사용하여 2 mL까지 농축한 다음 (미리 세척한) 알루미늄 접시로 옮긴 후 60 ℃에서 정확히 20분간 건조시킨다.

5.2.2.6  동일한 방법으로 3회 반복 수행한다.

6. 시험방법

6.1  전처리에서 분리된 광유류의 무게를 0.1 mg까지 측정한다.

6.2  시험에 사용한 동일한 무게의 노말-헥산을 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험에 의한 잔유물의 무게를 측정한다.

6.3  노말-헥산 추출물질 중 광유류의 무게는 아래 식을 사용하여 계산하고, 3회 반복 수행한 값의 평균으로 한다.

노말-헥산추출물질 중 광유류의 무게(mg/kg ) = (a-b) ×       (식 1)

a: 유출액 중의 노말-헥산 추출물질의 무게(mg)

b: 바탕시험에 의한 잔류물의 무게(mg)

c: 노말-헥산 추출물질 시험에 사용된 시료의 양(g)

7. 참고사항

이 방법 이외의 분석방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도를 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제10항 구리(Copper, Cu)

1. 측정원리

폐기물 내에 존재하는 미량금속(Trace metal)은 다양한 화학적 형태로 존재한다. 이들을 정량하기 위해서는 각각의 미량금속의 화학적 특성에 따라 질산(HNO3), 과염소산(HClO4) 및 불산(HF) 등의 다양한 산을 이용해야 완전 분해가 가능하다. 이렇게 완전 분해된 미량금속들을 1 % 질산 용액으로 다시 용해시킨 후, 유도결합플라즈마분광계(ICP 또는 ICP-MS)로 측정하거나 또는 원자흡광광도계(AAS)를 이용하여 흡광도를 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 구리의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만, 일반적으로 검출한계에서 100 μg Cu/L까지이다. 만일, 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Cu/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

실험에 사용하는 기구들은 세제를 이용하거나 초음파 세척기 등으로 내부와 외부를 잘 세척한 후 수돗물로 세제가 남지 않도록 3 ∼ 4회 헹군다. 이를 2 N 이상의 염산, 질산 혼합용액 혹은 왕수에 24시간 이상 담가둔 후 증류수로 3회 이상 헹구어 사용하고, 사용하지 않을 경우 클린 벤치(Clean bench) 내에서 건조시킨 후 마개를 덮어 비닐 지퍼백 등에 넣어 보관한다.

3.1  50 mL 테프론 가열 용기(Teflon bomb)

3.2  피펫(Pipet): 일회용 자동 피펫팁을 사용할 수 있다.

3.3  전자저울(Balance): 0.001 g의 질량까지 정확히 측정할 수 있는 저울을 사용한다.

3.4  초음파 세척기(Sonicator)

3.5  화학분석용 후드(Fume Hood): 바닥이 납판일 경우 테프론 및 비닐로 바닥을 코팅하여 사용한다.

3.6  수평 기류식 클린벤치(Clean bench)

3.7  가열판(Hot Plate): 온도 조절이 정확한 것을 사용한다.

3.8  동결건조기(Freeze dryer)

3.9  원자흡광광도계(AAS) 또는 유도결합 플라즈마분광계(ICP 또는 ICP-MS)

4. 시약 및 표준물질

4.1  산(Acid)

미량금속 분석용 등급 이상의 시약 또는 특급시약을 사용한다.

4.1.1  진한 질산(Nitric acid: HNO3 순도: 65 % 이상)

4.1.2  진한 염산(Hydrochloric acid: HCl 순도: 30 % 이상)

4.1.3  진한 과염소산(Perchloric acid: HClO4 순도: 70 % 이상)

4.1.4  진한 불산(Hydrofluoric acid: HF 순도: 48 % 이상)

4.1.5  2 % 질산: 진한 질산 20.0 mL를 초순수에 넣어 혼합한 후 전체 부피를 1,000 mL로 한다. 질산, 염산, 과염소산 및 불산을 다룰 때는 반드시 비닐장갑 및 화학분석용 고무장갑을 착용해야 하며, 산으로부터 발생하는 증기를 호흡하지 않도록 반드시 후드 내에서 취급한다.

4.2  표준용액(1,000 mg/L): 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 및 ICP용 표준용액을 사용한다.

4.3  폐기물?표준물질(standard reference material, SRM): 표준물질은 미국의 NIST, 캐나다의 NRC 등 공인기관에서 구입하여 시료와 똑같은 조작을 행하여 회수율을 결정한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1 시료의 보관

채취한 폐기물 시료는 미리 산으로 세척된 HDPE(High Density Polyethylene) 시료병에 담아 동결 건조한다. 건조기(dry oven)을 사용할 경우에는 시료를 파이렉스 재질의 비커 혹은 테프론 재질의 비커에 담고 대량 여과지 등으로 덮어 건조기 내에 산화물질이 들어가지 않도록 주의하며 110 °C이하의 온도에서 건조한다. 동결 건조된 시료는 60 ∼ 65 °C 건조기에서 24시간 이상 건조시켜 수분을 완전히 제거한다. 건조된 시료는 막자사발을 사용하여 곱게 분쇄하여 플라스틱 용기에 담아 실험 전까지 진공 데시케이터 내에서 보관한다.

5.2  시료의 전처리

5.2.1  동결건조된 시료 약 0.1 ∼ 0.5 g을 정확히 취하여 테프론 가열 용기에 넣고 진한 질산 5 mL을 가하고 가열판에서 약 120 °C에서 한 시간 정도 가열한다.

5.2.2  고순도의 불산 5 mL, 과염소산 2.5 mL를 가한 뒤 용기의 뚜껑을 닫고 가열판에서 약 120 °C에서 입자가 완전히 녹아 투명한 용액이 될 때까지 가열한다. 투명한 용액이 되면 시료와 산이 건조될 때까지 가열한다. 만약, 용액이 휘발되어도 시료가 완전히 녹지 않을 경우에는 진한 질산 5 mL, 진한 과염소산 2.5 mL, 진한 불산 5 mL를 다시 첨가하여 가열한다.

5.2.3  시료가 완전히 분해되면 진한 질산 2 mL를 가하여 남아있는 불산을 완전히 휘발시킨 다음, 2 % 질산 10 mL를 가하여 가열판 위에서 따뜻한 상태로 하여 완전 분해된 원소들을 용존시키고, 1 % 질산 용액으로 희석 용액을 만든다. 희석 용액의 부피를 정확하게 측정한 다음 측정용 시료로 사용한다.

5.2.4  상기 전처리 방법 이외에 외국이나 국내의 공인된 기관에서 인정하고 있는 전처리 방법을 사용할 수 있다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료를 원자흡광광도계로 측정할 경우, 흡수 파장은 324.7 nm 그리고 슬릿너비는 0.5 nm로 한다. 따로 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 구리 농도를 결정한다.

시료의 구리 농도(mg Cu/L) = 검량선에서 얻어진 구리 농도 - 바탕시험액의 농도

(식 1)

6.3  회수율

시료 개수의 10 %에 해당하는 개수의 바탕용액과 같은 수의 표준물질을 미국의 NIST, 캐나다의 NRC 등 공인기관에서 구입하여 시료와 똑같은 조작을 행하고, 그 결과와 제시된 농도 값을 비교한 후 회수율(recovery ratio)을 계산하여 분석된 시료의 결과와 함께 제시한다.

회수율(%) = (시료로 분석된 표준물질의 농도/표준물질의 농도) × 100   (식 2)

6.4  전체 시료 중 구리의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 구리의 농도(mg/kg) =         (식 3)

Z: 시료의 구리 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 희석 용액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 동결건조된 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

정량분석용 구리 표준용액을 4개 이상의 농도 범위로 단계적으로 취하여 증류수로 각각의 전체 부피를 전처리시 만든 희석 용액의 부피와 동일하게 맞춘 후, 시료의 시험방법에 따라 시험하여 구리의 농도와 흡광도의 검량선식을 작성한다.

8. 참고사항

8.1 시료의 오염

8.1.1 시료 채취시 유리 재질의 시료병은 미량금속이 용출되어 나올 우려가 있으므로 HDPE(High density Polyethylene) 재질의 용기를 사용하는 것이 좋다. 

8.1.2  경질유리 재질의 초자기구는 산분해 가열시 비소(As), 안티몬(Sb), 납(Pb) 등의 미량금속이 용출되어 나올 수 있으므로 테프론 재질의 용기를 사용하는 것이 좋다.

8.2  분석 시 방해요인

8.2.1  위 8.1항의 시료의 오염 항목에 열거한 사항들은 분석 시 방해 요인으로 작용한다.

8.2.2  심하게 오염된 시료는 기기분석 시 바탕선(Base line)의 안정적인 재현을 방해한다.

8.3  전처리가 완료된 시료를 분석할 때 분석기기는 원자흡광 광도계(AAS) 또는 유도결합 플라즈마분광계(ICP 또는 ICP-MS) 중 하나를 선택한다. ICP-MS가 원자흡광광도계보다 효율성과 정밀도 면에서 우월하기 때문에 ICP-MS를 권장한다. ICP-MS를 사용할 경우 표준물질 외에 내부표준물질(Internal standard)로 인듐 (In-115) 등을 사용한다.

8.4  이 방법 이외의 분석 방법 또는 자동화 분석기기를 포함한 기타 분석기기에 의한 분석은 검출한계와 정밀도가 이 방법과 비교하였을 때 동등하거나 그 이상일 경우 사용할 수 있다.

제11항 납(Lead, Pb)

1. 측정원리

제4장 제10항 구리의 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 납의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Pb/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Pb/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제4장 제10항 구리의 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제4장 제10항 구리의 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제4장 제10항 구리의 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료를 원자흡광광도계로 측정할 경우 흡수 파장은 283.3 nm 그리고 슬릿너비는 0.5 nm로 한다. 따로 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 납 농도를 결정한다.

시료의 납 농도(mg Pb/L)= 검량선에서 구한 시료의 납 농도 - 바탕시험액의 농도

(식 1)

6.3  회수율

제4장 제10항 구리의 시험방법 6.3에 따른다.

6.4  전체 시료 중 납의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 납의 농도(mg/kg) =          (식 2)

Z: 시료의 납 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 희석 용액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 동결 건조된 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

제4장 제10항 구리의 7. 정도관리/정도평가(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준물질은 정량 분석용 납 표준용액을 사용한다.

8. 참고사항

제4장 제10항 구리의 8. 참고사항에 따른다.

제12항 니켈(Nickel, Ni)

1. 측정원리

제4장 제10항 구리의 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 니켈의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Ni/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1 μg Ni/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제4장 제10항 구리의 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제4장 제10항 구리의 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제4장 제10항 구리의 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료를 원자흡광광도계로 측정할 경우 흡수 파장은 232.0 nm로 한다. 따로 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 니켈 농도를 결정한다.

          시료의 니켈 농도(mg Ni/L)

= 검량선에서 구한 시료의 니켈 농도 - 바탕시험액의 농도       (식 1)

6.3  회수율

제4장 제10항 구리의 시험방법 6.3에 따른다.

6.4  전체 시료 중 니켈의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 니켈의 농도(mg/kg) =           (식 2)

Z: 시료의 니켈 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 희석 용액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 동결 건조된 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

제4장 제10항 구리 7. 정도관리/정도평가(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준물질은 정량 분석용 니켈 표준용액을 사용한다. 

8. 참고사항

제4장 제10항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제13항 아연(Zinc, Zn)

1. 측정원리

제4장 제10항 구리의 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 아연의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 10 μg Zn/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.1 μg Zn/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제4장 제10항 구리의 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제4장 제10항 구리의 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제4장 제10항 구리의 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료를 원자흡광광도계로 측정할 경우 흡수 파장은 213.9 nm 그리고 슬릿너비는 1.0 nm로 한다. 따로 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 아연 농도를 결정한다.

           시료의 아연 농도(mg Zn/L)

= 검량선에서 구한 시료의 아연 농도 - 바탕시험액의 농도      (식 1)

6.3  회수율

제4장 제10항 구리의 시험방법 6.3에 따른다.

6.4  전체 시료 중 아연의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 아연의 농도(mg/kg) =           (식 2)

Z: 시료의 아연 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 희석 용액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 동결 건조된 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

제4장 제10항 구리 7. 정도관리/정도평가(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준물질은 정량 분석용 아연 표준용액을 사용한다.

8. 참고사항

제4장 제10항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제14항 카드뮴(Cadmium, Cd)

1. 측정원리

제4장 제10항 구리의 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 카드뮴의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 10 μg Cd/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.1 μg Cd/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제4장 제10항 구리의 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제4장 제10항 구리의 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제4장 제10항 구리의 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료를 원자흡광광도계로 측정할 경우 흡수 파장은 228.8 nm 그리고 슬릿너비는 0.5 nm로 한다. 따로 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 카드뮴 농도를 결정한다.

           시료의 카드뮴 농도(mg Cd/L)

= 검량선에서 구한 시료의 카드뮴 농도 - 바탕시험액의 농도     (식 1)

6.3  회수율

제4장 제10항 구리의 시험방법 6.3에 따른다.

6.4   전체 시료 중 카드뮴의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 카드뮴의 농도(mg/kg) =         (식 2)

Z: 시료의 카드뮴 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 희석 용액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 동결 건조된 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

제4장 제10항 구리 7. 정도관리/정도평가(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준물질은 정량 분석용 카드뮴 표준용액을 사용한다.

8. 참고사항

제4장 제10항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제15항 크롬(Chromium, Cr)

1. 측정원리

제4장 제10항 구리의 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 크롬의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 100 μg Cr/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1 N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 2 μg Cr/L이며 표준편차율은 5 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

제4장 제10항 구리의 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제4장 제10항 구리의 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제4장 제10항 구리의 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료를 원자흡광광도계로 측정할 경우 흡수 파장은 357.9 nm 그리고 슬릿너비는 0.2 nm로 한다. 따로 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 크롬 농도를 결정한다.

시료의 크롬 농도(mg Cr/L)

= 검량선에서 구한 시료의 크롬 농도 - 바탕시험액의 농도     (식 1)

6.3  회수율

제4장 제10항 구리의 시험방법 6.3에 따른다.

6.4  전체시료 중 크롬의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 크롬의 농도(mg/kg) =          (식 2)

Z: 시료의 크롬 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 희석 용액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 동결건조된 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

제4장 제10항 구리 7. 정도관리/정도평가(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준물질은 정량 분석용 크롬 표준용액을 사용한다.

8. 참고사항

제4장 제10항 구리 8의 참고사항에 따른다.

제16항 비소(Arsenic, As)

1. 측정원리

제4장 제10항 구리의 1. 측정원리에 따른다.

2. 측정범위 및 정밀도

원자흡광광도법을 이용한 크롬의 기기 유효측정범위는 기기에 따라 다소 상이하지만 일반적으로 검출한계에서 50 μg As/L까지이다. 만일 시료의 농도가 최대측정범위를 크게 초과할 때에는 1N 질산 용액으로 희석하여 측정해야 한다. 일반적인 기기 검출한계는 99% 신뢰구간에서 0.02 μg As/L이며 표준편차율은 5% 정도이다.

3. 기구 및 기기

제4장 제10항 구리의 3. 기구 및 기기에 따른다.

4. 시약 및 표준물질

제4장 제10항 구리의 4. 시약 및 표준물질에 따른다.

5. 시료의 채취 및 보관

제4장 제10항 구리의 5. 시료의 채취 및 보관에 따른다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료를 원자흡광광도계로 측정할 경우 흡수 파장은 193.7 nm로 한다. 따로 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 비소 농도를 결정한다.

시료의 비소 농도(mg As/L)

= 검량선에서 구한 시료의 비소 농도 - 바탕시험액의 농도      (식 1)

6.3  회수율

제4장 제10항 구리의 시험방법 6.3에 따른다.

6.4  전체시료 중 비소의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 비소의 농도(mg/kg) =         (식 2)

Z: 시료의 비소 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 희석 용액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 동결건조된 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

제4장 제10항 구리 7. 정도관리/정도평가(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준물질은 정량 분석용 비소 표준용액을 사용한다.

8. 참고사항

제4장 제10항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제17항 수은(Mercury, Hg)

1. 측정원리

폐기물 시료 내에 존재하는 생체 수은을 측정하기 위해서는 건조가 안 된 생체시료를 이용한다. 이는 건조시키는 과정에 수은이 손실될 가능성이 있기 때문이다. 냉동 보관된 시료를 질산과 황산으로 녹인 다음, 용액 속의 수은 이온을 금속 수은으로 환원시켜 원자흡광광도법으로 그 양을 측정한다. 용액 속의 수은은 이온 형태로 있어 직접 측정이 불가능하므로, 염화주석과 산을 넣어 이온 상태의 수은을 금속 수은으로 환원시키는 환원기화장치(hydride generator)를 거친 후 원자흡광광도계(AAS)로 흡입시켜 측정한다.

2. 측정범위 및 정밀도

정량범위는 사용하는 장치 및 측정조건에 따라 다르다. 원자흡광광도법(환원기화법)의 경우 정량범위는 253.7 nm에서 0.0005 ∼ 0.01 mg/L이고, 표준편차율은 4 ∼ 20 %이며 유효측정농도는 0.0005 mg/L 이상이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구: 분석에 사용되는 모든 초자기구류는 반드시 1 N 질산, 염산 또는 왕수에 하룻밤 이상 산용출시키고, 1 % DDDC 또는 1 % APDC용액으로 세척한 후 초순수로 3회 이상 반복 세척하여 사용한다. 보관 혹은 분석 반응 시 모든 시약과 시료에 사용되는 초자기구류는 마개로 단단히 봉하여 오염을 차단해야 한다. 

3.2  피펫: 시료 및 시약을 분주할 때 가능한 정밀도가 높은 디지털식 피펫과 교차오염을 방지하기 위해 일회용 피펫팁을 사용하는 것이 좋다.

3.3  수욕조(water bath)

3.4  수은환원기화 장치

3.5  원자흡광광도계

3.5.1  램프: 수은 중공음극램프

3.5.2  석영으로 만들어진 측정셀(길이 200 mm, 내경 13 mm)

4. 시약 및 표준물질

4.1  산(Acid): 미량금속 분석용 등급 이상의 시약 또는 특급시약을 사용한다.

4.1.1  진한 질산(Nitric acid: HNO3): 순도 65 % 이상

4.1.2  황산(1 + 1) 혹은 황산(1 + 20): 황산

 수은 시험용 황산을 사용한다.

과 증류수 수은을 함유하지 않은 물(증류수)를 사용한다.

를 사용하여 조제한다.

4.2  과망간산칼륨용액(5 % w/v): 과망간산칼륨(KMnO4) 5 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.3  과황산칼륨용액(5 % w/v): 과황산칼륨(K2S2O8) 5 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.4  염산하이드록실 아민용액(10 % w/v): 염산히드록실 아민(NH2OHㆍHCl) 10 g을 증류수에 녹여 100 mL로 한다.

4.5  염화제일주석(2수화물) 용액: 염화제일주석(SnCl2ㆍ2H2O) 10 g에 황산(1 + 20) 60 mL를 넣어 섞으면서 가열하여 녹이고 냉각시킨 다음 증류수를 넣어 100 mL로 한다.

4.6  표준용액(1,000 mg/L): 상용으로 제조되는 원자흡광광도계용 표준용액을 사용한다.

4.7  폐기물?표준물질(standard reference material, SRM): 표준물질은 미국의 NIST, 캐나다의 NRC 등 외국의 공인기관에서 구입하여 시료와 똑같은 조작을 행하여 회수율을 결정한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료의 보관

채취한 폐기물 시료는 미리 산으로 세척된 HDPE(High density poly ethylene) 시료병에 담아 동결시킨 다음, 실험 전까지 냉동고에서 보관한다.

5.2  시료의 전처리

5.2.1  동결된 시료 약 1 ∼ 5 g을 취하여 삼각플라스크에 넣고 증류수를 넣어 약 200 mL로 하고 황산(1 + 1) 20 mL와 질산 5 mL 및 과망간산칼륨 용액(5 % w/v) 10 mL를 넣어 흔들어 섞고 약 15분간 방치한다.

5.2.2  과망간산칼륨의 색이 없어지면 2 mL씩 추가하여 약 15분간 색이 지속될 때까지 반복한다. 

5.2.3  과황산칼륨 용액(5 % w/v) 10 mL를 넣고 95 °C 수욕조에서 2시간 가열한 다음 실온으로 냉각하고 염산히드록실아민 용액(10 % w/v)을 한 방울씩 넣어 과잉의 과망간산칼륨을 분해한 다음 증류수를 넣어 250 mL로 한다.

6. 시험방법

6.1  전처리한 시료 전량을 검액으로 환원용기에 옮기고 환원기화장치와 원자흡광분석장치를 연결한 다음, 환원용기에 염화제일주석 용액(수은 시험용) 10 mL를 넣고 송기 펌프를 작동시켜 발생한 수은 증기를 흡수셀로 보낸다.

6.2  253.7 nm에서 흡광도가 상승하여 일정할 때의 값을 측정하고 미리 작성한 검량선을 이용하여 다음과 같이 시료의 수은 농도를 결정한다. 따로 시료와 동일한 무게의 증류수를 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

시료의 수은 농도(mg Hg/L)

= 검량선에서 구한 시료의 수은 농도 - 바탕시험액의 농도     (식 1)

6.3  회수율

시료 개수의 10 %에 해당하는 개수의 바탕용액과 같은 수의 표준물질을 미국의 NIST, 캐나다의 NRC 등 외국의 공인기관에서 구입하여 시료와 똑같은 조작을 행하고, 그 결과와 제시된 농도 값을 비교한 후 회수율(recovery ratio)을 계산하여 분석된 시료의 결과와 함께 제시한다.

회수율(%) = (시료로 분석된 표준물질의 농도/표준물질의 농도) × 100   (식 2)

6.4  냉동된 시료를 취하여 함수율을 측정한 다음, 시험에 사용한 냉동된 시료의 무게를 보정하여 시료의 건조중량(g)을 구한다.

6.5  전체시료 중 수은의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체시료 중 수은의 농도(mg/kg) =         (식 3)

Z: 시료의 수은 농도(mg/L)

V: 전처리에서 만든 검액의 부피(mL)

X: 시험에 사용한 시료의 건조중량(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

제4장 제10항 구리 7. 정도관리/정도평가(QA/QC)에 따른다. 다만, 표준물질은 정량 분석용 수은 표준용액을 사용한다.

8. 참고사항

제4장 제10항 구리 8. 참고사항에 따른다.

제18항 유기인(Organophosphorus Pesticides, OPs)

1. 측정원리

폐기물 내에 존재하는 유기인계 농약(Organophosphorus Pesticides, OPs)을 초음파 추출장치(Ultrasonic extractor)를 이용하여 추출한 후에 흡착제를 이용한 정제 과정을 통해 추출액 중의 지방, 황 그리고 기타 복잡한 유기물 등의 분석 방해물질들을 제거하고 기체크로마토그래피(Gas Chromatograph, GC)에서 분리되는 화합물들을 질소-인 검출기(Nitrogen Phosphorus Detector, NPD), 불꽃광도검출기(Flame Photometric Detector, FPD) 혹은 질량분석기(Mass Spectrometer Detector, MSD)가 부착된 기체크로마토그래피를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

기체크로마토그래피를 이용할 경우, 유효측정범위는 일반적으로 검출한계에서 200 μg/L까지이다. 일반적인 기기 검출한계는 각 성분의 측정 감도와 검출기의 종류에 따라 차이가 있는데 99 % 신뢰구간에서 질소-인 검출기가 0.5 μg/L이고, 불꽃광도검출기가 0.04 μg/L이며, 표준편차율은 0.3 ∼ 9.0 %의 범위이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

시험에 사용되는 초자기구는 주로 경질유리 재질로, 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 세척한 다음 회화로(Furnace)에서 450 °C 이상의 온도로 4시간 이상 완전히 태운 후 보관하고, 사용하기 전에 잔류농약 분석용 노말-헥산용액으로 세척하여 사용한다.

3.1.1  갈색병(Amber bottle): 덮개 내부가 테프론 재질의 것을 사용하거거나, 유리 덮개를 사용한다. 필요하면 덮개 외부를 테프론 테입으로 밀봉한다.

3.1.2  부피 플라스크(Volumetric flask): 아세톤으로 세척한 후 반드시 자연 건조 시킨다. 부피를 측정하는 초자들은 높은 온도를 가할 경우 부피가 변할 우려가 있으므로 아세톤과 노말-헥산을 적절히 사용하여 세척하거나, 초음파 세척기를 사용하는 것이 안전하다.

3.1.3  분별깔때기(Separation Funnel): 유리 혹은 테프론 재질의 것을 사용한다.

3.1.4  100, 250 mL 둥근바닥 플라스크(Round Bottom Flask)

3.1.5  100, 250 mL 비이커(Beaker)

3.1.6  2 mL 바이알(Vial): 갈색 바이알을 사용하거나 혹은 일반 바이알의 외부를 알루미늄 호일로 감싸서 사용한다.

3.1.7  깔때기(Funnel)

3.1.8  정제용 컬럼(Column): 하부에 테플론 재질의 잠금 꼭지(Stopcock)가 부착된 것으로서 길이가 30 cm이고 내경이 1.0 ∼ 1.2 cm인 것을 사용한다.

3.2  장치 및 기기

3.2.1  회화로(Muffle Furnace): 400 °C 이상의 온도 조절이 가능한 것

3.2.2  회전식 증발농축기(Rotary Evaporator)

3.2.3  속슬렛 추출장치(Soxhlet Extractor)

3.2.4  기체크로마토그래피(Gas Chromatograph)

표 1.  유기인 기체크로마토그래피/질소-인 검출기 분석조건의 예

┌──────────┬───────────────────────────┐

│검출기              │질소-인 검출기(NPD)                                   │

├──────────┼───────────────────────────┤

│컬럼                │모세관 컬럼: DB-5 혹은 DB-35                          │

│                    │(내경 0.25 ∼ 0.32 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)  │

├──────────┼───────────────────────────┤

│충전물질            │(5 ∼ 35 % phenyl)-methyl polysiloxane                │

├──────────┼───────────────────────────┤

│운반기체            │He(99.999 %)                                          │

├──────────┼───────────────────────────┤

│운반기체 유속       │1.0 mL/min                                            │

├──────────┼───────────────────────────┤

│검출기 기체 및 유속 │압축공기(99.999 %): 60 mL/min, 수소(99.999%): 2 mL/min│

├──────────┼───────────────────────────┤

│시료주입구 온도     │250 ∼ 280 °C                                        │

├──────────┼───────────────────────────┤

│검출기 온도         │280 ∼ 310 °C                                        │

├──────────┼───────────────────────────┤

│오븐 초기온도       │100 °C, 2분                                          │

└──────────┴───────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그 순도와 동등한 등급의 것을 사용한다.

4.1.1  디클로로메탄(Methylene chloride: CH2Cl2)

4.1.2  노말-헥산(n-Hexane: C6H14)

4.1.3  아세톤(Acetone: CH3COCH3)

4.1.4  에테르(Ether: C2H5OC2H5)

4.2  무수황산나트륨(Sodium Sulfate, Anhydrous: Na2SO4): 잔류농약 분석용, 또는 특급시약으로서, 400 °C에서 4시간 가열하여 정제한 후, 진공상태에서 상온까지 방냉 후 사용한다.

4.3  증류수: 전기적 저항이 18 MΩ/cm 이상인 정제수를 사용한다.

4.4  구리(Copper): 유기원소 분석용 환원구리(20 ∼ 30 mesh)를 사용하기 전에 진한 염산으로 세척한 후, 증류수로 세척하고 아세톤으로 물을 제거하여 디클로로메탄으로 수회 세척하고 디클로로메탄 내에 보관하면서 사용한다.

4.5  염화나트륨용액: 염화나트륨(NaCl)은 사용하기 전 노말-헥산을 넣어 초음파 세척기로 세척 후 건조시켜 사용한다.

4.6  플로리실(Florisil): 컬럼크로마토그래용 플로리실(입자크기: 575 μm)을 130 °C에서 16시간 이상 가열하여 활성화시킨 후, 진공상태에서 서서히 냉각시킨다. 보관은 데시케이터(건조제: 실리카겔) 내에서 하며, 분석 시는 15시간 이상 보관한 것을 사용한다.

4.7  유리섬유 여지: GF/F

4.8  표준물질과 내부표준물질

4.8.1  표준물질: OPs 정량 분석용으로서 순도 98 % 이상의 것을 사용한다. 성분별(이피엔, 파라치온, 메틸디메톤(s-type), 다이아지논, 펜토에이트 등) 표준액 10 mg을 정확히 정량하여 10 mL의 매스플라스크에 넣고 노말-헥산에 녹여 10 mL이 되도록 한다. 상용으로 제조된 표준물질을 구입하여 사용할 수도 있다. 표준물질은 빛이 들어가지 않도록 차광용기에 4 °C에서 보관한다.

4.8.2  내부표준물질: 정량 분석용으로 순도 99 % 이상의 것으로 하며, 추출 과정 및 시험과정에서의 회수율 검정을 위한 내부표준물질로, 시료에서 검출되지 않는 농약 1종 이상을 선정하여 사용한다. 본 시험방법에서는 트리페닐인산(triphenyl phosphate)을 사용하며 그 농도는 200 ng/mL이 되도록 한다.

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료의 보관

시료를 채취하여 250mL의 차광 용기에 담아 보관한다. 시료는 분석 전까지 냉동 보관한다.

5.2  시료의 전처리

5.2.1  시료를 동결건조 시킨 후, 적당량(3 ∼ 5 g 정도)의 무게를 측정하여 분석에 사용한다. 시료에 내부표준물질(트리페닐인산(triphenyl phosphate)) 1 ∼ 2 mL를 넣은 다음, 속슬렛 추출장치를 이용하여 노말-헥산과 디클로로메탄 1 : 1 용액(v/v) 150 mL로 16시간 동안 추출한다. 추출용매는 노말-헥산과 아세톤 1 : 1 용액(v/v) 150 mL를 사용하여도 된다.

5.2.2  추출한 용액은 분별깔때기에 옮긴 뒤, 5 % 염화나트륨 용액 200 mL를 넣어 디클로로메탄 50 mL로 추출하고, 위 추출 과정을 2회 반복한다.

5.2.3  추출한 용액의 부피가 4 ∼ 5 mL 정도 될 때까지 용매를 휘발ㆍ 농축시킨다.

5.2.4  전처리가 끝난 시료는 직사광선과의 접촉을 피하도록 주의한다. 햇빛을 촉매로 하여 발생할 수 있는 광반응은 분석대상 화학종의 분자구조에 변화를 줄 우려가 있다.

5.2.5  상기의 시료 전처리 방법 이외에 외국이나 국내의 공인된 기관에서 인정하고 있는 전처리 방법을 사용할 수 있다.

5.3  시료의 정제

추출물에 포함된 여러 화학적 성분들로부터 OPs만을 얻기 위해선 다음의 모든 정제 작업을 필요로 한다. 

5.3.1  구리(Cu)를 이용한 정제(Cu Clean-up)

5.3.1.1  진한 염산으로 활성화된 구리를 시료 용액에 투여한 후, 충분히 교반시켜 황을 제거한다.

5.3.1.2  시료 용액은 무수황산나트륨층을 통과시켜 구리와 용액에 포함되어 있는 수분을 완전히 제거한다. 이때, 황은 상온에서 구리 등의 금속과 반응하여 쉽게 착화합물(Complex)을 형성한다.

5.3.2  플로리실 컬럼정제(Florisil Clean-up)

5.3.2.1  활성화된 플로리실 10 g을 취하여 컬럼내부에 충전하고, 컬럼의 상단에 Na2SO4 1.5 ∼ 2 cm를 채운 다음, 노말-헥산을 이용하여 충분히 씻어준다.

5.3.2.2  적당한 부피로 농축된 시료용액을 유리 피펫을 이용하여 컬럼 상단에 주입시킨다.

5.3.2.3  노말-헥산과 에테르 혼합용액을 전개용매로 사용하여 시료용액으로부터 유기인계 화합물을 분리한다.

5.3.2.4  분리된 유기인계 화합물을 GC 분석용 2 mL 갈색 바이알에 옮긴 후, 용매를 완전히 제거하여 분석 시까지 냉장 보관한다.

6. 시험방법

6.1  전처리가 끝난 시료에 내부표준물질을 첨가하고, 전체 시료부피 1 mL가 되도록 노말-헥산을 첨가한다. 따로 아세톤 30 mL와 내부표준물질을 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검액 일정량(1 ∼ 3 μL)을 마이크로 실린지를 사용하여 기체크로마토그래피에 주입하고 크로마토그램을 기록한다.

6.3  검액 중 유기인의 체류시간에 해당하는 피크로부터 피크 높이 또는 면적을 측정하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 시료의 유기인 농도(mg/L)를 산출한다.

6.4   전체 시료 중 유기인의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체 시료 중 유기인의 농도(mg/kg) =             (식 1)

a: 시료의 유기인 농도(mg/L)

b: 시험에 사용한 시료의 부피(mL)

c: 시험에 사용한 동결 건조한 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제36항 유기인 8. 정도평가/정도관리(QA/QC)의 내용을 참고한다.

7.1  정량분석: 정량분석용 유기인 표준용액을 4개 이상 농도범위로 단계적으로 취하여 노말-헥산으로 1 mL로 한 다음, 시료의 시험방법에 따라 시험하여 유기인의 농도와 크로마토그램의 검량선식을 작성한다.

7.2   회수율: 검정을 위한 내부표준물질을 이용하여 추출과정과 시험과정의 회수율을 산출한다.

회수율(%) = (시료로 분석된 표준물질의 농도/표준물질의 농도) × 100   (식 2)

7.3   위 7.1에서 구해진 검량선식을 이용하여 계산된 각 성분별 농도 계산값을 회수율로 나누어 시료 중의 최종 농도를 계산한다. 만약 회수율이 60 ∼ 130 % 이내에 들어오지 않을 경우 계산과정과 분석과정의 문제점을 점검해야 한다. 특히, 회수율 검정을 위한 내부표준물질이 분해되었거나 오염되었는지와 기기의 상태를 점검해 보아야 한다. 문제가 있는 시료에 대해서는 재분석을 실시한다.

7.4  검출한계(MDL) 및 정량한계(LOQ): 증류수 1 L에 예상되는 정량한계의 10배 정도의 농도로 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고, 각 시료에 대하여 분석절차를 거쳐 시험하여 표준편차(s)를 구한다. 표준편차값에 3.14(t0.01,6 = 3.143)를 곱한 값을 방법검출한계로 한다. 또한, 표준편차값에 10을 곱한 값을 정량한계로 한다.

방법검출한계(MDL) =  tα,n-1 × s                   (식 3)

정량한계(LOQ) =  10 × s                         (식 4)

7.5  정밀도(RSD): 규정된 조건하에서 측정값들 간의 근접 정도를 나타내는 것으로 검량선에 사용되는 농도 범위에서 중간 농도에 해당되는 표준물질을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다. 이 실험으로부터 얻은 평균값과 표준편차로부터 변동계수를 구하고 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

정밀도(%) = 표준편차(s)/평균값(avg) × 100             (식 5)

7.6  결과보고 시에는 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도, 검출한계를 기재하도록 한다.

8. 참고사항

8.1  시료의 오염과 분석 시 방해요인

유기인 분석은 극미량 분석실험이므로 여러 단계별 실험과정 하나하나에 세심한 주의를 기울여야 한다. 순간의 작은 실수 하나가 실험결과에 미치는 영향은 굉장히 크다. 시료의 오염은 곧바로 분석의 방해 요인으로 작용할 뿐만 아니라, 이는 잘못된 분석결과로 직결된다. 따라서, 이러한 방해 요인들로부터의 영향을 최소화시키기 위한 몇 단계의 까다로운 정제 과정을 반드시 필요로 한다.

8.1.1  시료의 오염

8.1.1.1  시료의 채취 및 분석 시 사용하는 기구들에 의한 오염

최초 시료의 채취부터 분석 완료에 이르기까지의 과정들 중 가장 주의를 요하는 부분이다. 테프론을 제외한 모든 합성수지 제품의 사용은 엄격히 금한다. 이는 대부분의 합성수지에 함유되어 있는 Phthalate ester에 의한 분석방해 요인을 제거하기 위함이다.

8.1.1.2  분석자의 경험 부족에 의한 오염

전처리 과정 중 분석자의 손이나 신체에 의한 오염, 분석물을 다른 초자로 옮기는 과정에서의 오염 가능성을 주의해야 한다.

8.1.1.3  유지, 관리 소홀로 인한 분석기기(GC)의 오염

GC의 시료 주입부는 매우 오염되기 쉬운 부분 중 하나이다. 특히, 분석물의 양이 많거나 분석물의 농도가 높을 경우엔 수시로 이 부분의 오염도를 확인하여 분석 결과에 영향을 주지 않도록 주의해야 한다. 또한 컬럼, 검출기, 시료 주입 시 사용되는 마이크로 주사기나 세척용 용매의 오염도 주의해야 한다.

8.1.1.4  GC에 사용되는 운반기체(Carrier Gas)

질소-인 검출기(NPD)에 사용하는 운반기체로는 고순도급의 헬륨(He, 99.999 %)을 사용하고, 운반기체가 포함할 수 있는 불순물을 제거하기 위해 목적에 맞는 트랩

 예를 들어 moisture trap, hydrocarbon trap, oxygen trap 등이 있다.

을 사용하여 불순물에 의한 영향을 최소화시킨다.

8.1.2  분석 시 방해요인

8.1.2.1  위 8.1.1 시료의 오염에서 열거한 사항들은 분석 시 방해 요인으로 작용한다.

8.1.2.2  심하게 오염된 시료는 기기분석 시 크로마토그램의 바탕선(Base line)의 안정적인 재현을 방해한다.

8.1.2.3  현장에서 채취한 폐기물 시료는 분석대상 화학종과 비슷한 화학적 성질을 갖는 유기, 무기 불순물을 다량 함유하고 있다. 이들은 기기분석 시 크로마토그램에서 복잡한 불순물 피크(noise peak)를 제공하여 정량 분석에 많은 혼돈을 초래한다.

8.1.2.4  폐기물 시료는 다량의 황 화합물을 포함하고 있다. 유기용매에 대한 이들의 용해도는 유기염소계(Organochlorine)나 유기인계(Organophosphorus) 화합물과 비슷하며, 기기분석 시 크로마토그램에서 불순물 피크(noise peak)를 유발할 수 있다.

8.1.2.5  대부분의 합성수지가 포함하는 Phthalate Ester의 경우도 마찬가지로 기기분석 시 크로마토그램에서 불순물 피크(noise peak)를 유발할 수 있다.

8.2  시료의 화학적 특성에 따라 질소-인 검출기(NPD)를 대신하여 불꽃광도검출기(FPD) 또는 전자포획검출기(ECD)를 사용할 수 있다.

8.3  이 방법 이외의 분석방법으로 분석하였을 때 검출한계와 정밀도가 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제19항 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)

1. 측정원리

폐기물 내에 존재하는 다환방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)를 속슬렛 추출장치(Soxhlet extractor)를 이용하여 추출한 후, 비누화 반응, 황산과 흡착제를 이용한 정제 과정을 통해 추출액 중의 지방, 황 그리고 기타 복잡한 유기물 등의 분석방해 물질들을 제거하고 기체크로마토그래피(Gas Chromatography, GC)에서 분리되어 나오는 다환방향족탄화수소를 질량분석기(Mass Spectrometer, MS)를 사용하여 선택적 이온 모니터링(SIM: Selected Ion Monitoring)으로 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효측정범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 기체크로마토그래피의 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있는데, 1 L의 시료를 사용하였을 경우 각 화합물에 대한 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 2 μg/L 정도이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

시험에 사용되는 초자기구는 대부분 경질유리 재질로서, 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 세척한 다음 회화로(Furnace)에서 450 °C 이상의 온도로 4시간 이상 완전히 태운 후 보관하고, 사용하기 전에 잔류농약 분석용 디클로로메탄 용액으로 세척하여 사용한다.

3.1.1  부피 플라스크(Volumetric flask): 아세톤으로 세척한 후 반드시 자연 건조 시킨다. 이때, 부피를 측정하는 초자들은 높은 온도를 가할 경우 부피가 변할 우려가 있으므로 아세톤과 노말-헥산을 적절히 사용하여 세척하거나, 초음파 세척기를 사용하는 것이 안전하다.

3.1.2  갈색병(Amber bottle): 덮개 내부가 테프론 재질의 것을 사용하거나, 유리덮개를 사용한다. 필요하면 덮개 외부를 테프론 테이프로 밀봉한다.

3.1.3  분별깔때기(Separation Funnel): 유리 혹은 테프론 재질의 것을 사용한다.

3.1.4  100, 250 mL 둥근바닥 플라스크(Round Bottom Flask)

3.1.5  100, 250 mL 비커(Beaker)

3.1.6  2 mL 바이알(Vial): 갈색 바이알을 사용하거나 혹은 일반 바이알의 외부를 알루미늄 호일로 감싸서 사용한다.

3.1.7  깔때기(Funnel)

3.1.8  정제컬럼(Column): 하부에 테프론 재질의 잠금 꼭지(Stopcock)가 부착된 것으로 길이가 30 cm이고 내경이 1.0 ∼ 1.2 cm인 것을 사용한다.

3.1.9  원통형 여지(Thimble): 일회용 GF/F 재질이나 혹은 유리 재질의 것을 사용하며, 시료에 사용할 추출용매로 4시간 동안 충분히 씻어낸 후 사용한다.

3.2  장치 및 기기

3.2.1  초음파 세척기(Sonicator)

3.2.2  진공용 데시케이터(Desiccator)

3.2.3  회화로(Muffle Furnace): 400 °C 이상의 온도 조절이 가능한 것

3.2.4  감압 여과장치(Suction filtration apparatus)

3.2.5  회전식 증발농축기(Rotary Evaporator)

3.2.6  환류냉각용 순환장치(Low Temperature Circulator)

3.2.7  속슬렛 추출장치(Soxhlet Extractor) 

3.2.8  기체크로마토그래피(Gas Chromatography)

표 1. 기체크로마토그래피/질량분석기(GC/MS) PAHs 분석조건의 예

┌──────────┬─────────────────────┐

│검출기              │질량분석기(MS)                            │

├──────────┼─────────────────────┤

│컬럼                │모세관 컬럼                               │

│                    │(내경 0.25mm, 필름두께 0.25μm, 길이 30m) │

├──────────┼─────────────────────┤

│충전물질            │50 % phenyl                               │

│                    │50 % methyl polysiloxane                  │

├──────────┼─────────────────────┤

│운반기체            │헬륨(99.999 %)                            │

├──────────┼─────────────────────┤

│운반기체 유속       │1.0 mL/min                                │

├──────────┼─────────────────────┤

│검출기 기체 및 유속 │N2(99.999 %), 30 mL/min                   │

├──────────┼─────────────────────┤

│시료주입구 온도     │280 °C                                   │

├──────────┼─────────────────────┤

│Transfer line 온도  │300 °C                                   │

├──────────┼─────────────────────┤

│오븐 초기온도       │100 °C, 2분                              │

└──────────┴─────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질 

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그 순도와 동등한 등급의 것을 사용한다.

4.1.1 디클로로메탄(Methylene chloride: CH2Cl2)

4.1.2 노말-헥산(n-Hexane: C6H14)

4.1.3 메탄올(Methanol: CH3OH)

4.1.4 아세톤(Acetone: CH3COCH3)

4.2  무수산나트륨(Sodium Sulfate, Anhydrous: Na2SO4): 잔류농약 분석용, 또는 특급시약으로서, 400 °C에서 4시간 가열하여 정제한 후, 진공상태에서 상온까지 방랭 후 사용한다.

4.3  증류수: 전기적 저항이 18 MΩ/cm 이상인 정제수를 사용한다.

4.4  구리(Copper): 유기원소 분석용 환원 구리(20 ∼ 30 mesh)를 사용하기 전에 진한 염산으로 세척한 후, 증류수로 세척하고 아세톤으로 물을 제거하여 디클로로메탄으로 수회 세척하고 디클로로메탄 중에 보관하면서 사용한다.

4.5  6 % 수산화칼륨/메탄올용액: 수산화칼륨(KOH)은 사용하기 전 노말-헥산을 넣어 초음파 세척기로 세척 후 건조시켜 사용한다.

4.6  5 % 함수 실리카겔/알루미나(Silica/Alumina combination column): 컬럼 크로마토그래피용 실리카겔 (70 ∼ 230 mesh)을 120 °C에서, 알루미나(70 ∼ 230 mesh)를 350 °C에서 16시간 이상 가열하여 활성화시킨 후 진공상태에서 서서히 냉각시킨다. 무게 측정 후 5 %의 증류수 첨가하여 마개를 단단히 봉한 후, 충분한 시간 동안 혼합시킨다. 보관은 데시케이터(건조제: 실리카겔) 내에서 하며, 분석 시는 15시간 이상 보관한 것을 사용한다.

4.7  유리섬유 여지: GF/F

4.8  표준물질과 내부표준물질

4.8.1  표준물질(표 2): PAHs 정량 분석용으로서 순도 98 % 이상의 것을 사용한다.

4.8.2  내부표준물질(표 8): 정량 분석용으로 순도 99 % 이상의 것으로 하며 회수율 검정을 위한 내부표준물질로 사용한다.

4.8.3  2-fluorobiphenyl: 2-fluorobiphenyl은 순도 99 % 이상의 것으로 하며 주입량 보정을 위한 기체크로마토그래피 내부표준물질로 사용한다. 내부표준물질로 반드시 2-fluorobiphenyl를 사용해야 하는 것은 아니며, 크로마토그램에서 표준물질로 사용된 PAHs 종류와 피크 겹침이 일어나지 않는 다른 PAH 이성체, 혹은 검출기에 감응하는 그 외의 화학종을 사용해도 무방하다.

표 2. 분석대상 PAHs 표준물질의 예

┌───────────┬─────────┐

│다환방향족탄화수소류  │모니터 이온 분자량│

├───────────┼─────────┤

│naphthalene           │128               │

├───────────┼─────────┤

│acenaphthylene        │152               │

├───────────┼─────────┤

│acenaphthene          │154               │

├───────────┼─────────┤

│fluorene              │166               │

├───────────┼─────────┤

│phenanthrene          │178               │

├───────────┼─────────┤

│anthracene            │178               │

├───────────┼─────────┤

│fluoranthene          │202               │

├───────────┼─────────┤

│pyrene                │202               │

├───────────┼─────────┤

│benzo(a)anthracene    │228               │

├───────────┼─────────┤

│chrysene              │228               │

├───────────┼─────────┤

│benzo(b)fluoranthene  │252               │

├───────────┼─────────┤

│benzo(k)fluoranthene  │252               │

├───────────┼─────────┤

│benzo(a)pyrene        │252               │

├───────────┼─────────┤

│indeno(1,2,3-cd)pyrene│276               │

├───────────┼─────────┤

│dibenzo(a,h)anthracene│278               │

├───────────┼─────────┤

│benzo(ghi)perylene    │276               │

└───────────┴─────────┘

표 3. PAHs의 내부표준물질의 예

┌──────────┬─────────┐

│다환방향족탄화수소류│모니터 이온 분자량│

├──────────┼─────────┤

│naphthalene-d8      │136               │

├──────────┼─────────┤

│acenaphthylene-d8   │160               │

├──────────┼─────────┤

│phenanthrene-d10    │188               │

├──────────┼─────────┤

│pyrene-d8           │212               │

├──────────┼─────────┤

│chrysene-d12        │240               │

├──────────┼─────────┤

│perylene-d12        │264               │

└──────────┴─────────┘

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료의 보관

시료를 채취하여 250mL의 차광 용기에 담아 보관한다. 시료는 분석 전까지 냉동 보관한다.

5.2  시료의 전처리

시료를 동결건조 시킨 후, 시료 적당량(3 ∼ 5 g)을 취하고, 노말-헥산에 녹인 회수율 검정용 내부표준물질(Surrogate standard) 1 ∼ 2 mL를 시료에 첨가한다. 속슬렛 추출장치를 이용하여 아세톤과 노말-헥산 1 : 1 용액 또는 아세톤과 디클로로메탄 1 : 1 용액(v/v) 150 mL로 24시간 동안 추출한 다음, 추출한 용액의 부피가 4 ∼ 5 mL 정도 될 때까지 용매를 휘발ㆍ농축시킨다. 전처리가 끝난 시료는 직사광선과의 접촉을 피하도록 주의한다. 햇빛을 촉매로 하여 발생할 수 있는 광반응은 분석 대상 화학종의 분자 구조에 변화를 줄 우려가 있다.

5.3  시료의 정제

추출물에 포함된 여러 화학적 성분들로부터 PAHs만을 얻기 위해서 다음의 정제 작업을 필요로 한다.

5.3.1  비누화 반응을 이용한 정제(Saponification Clean-up): 시료가 기름 성분에 심하게 오염되어 있을 때 사용한다.

5.3.1.1  추출한 시료용액을  둥근바닥 플라스크 안에서 6 % 수산화칼륨 용액 50 mL를 사용하여 2시간 동안 환류(Reflux)시킨다.

5.3.1.2  공기 중에서 냉각시킨 후, 분별 깔때기로 추출물이 녹아있는 유기용매층만을 노말-헥산용액으로 다시 추출한다. 이 과정을 3회 반복한다.

5.3.2  구리(Cu)를 이용한 정제(Cu Clean-up)

5.3.2.1  진한 염산으로 활성화된 구리를 시료 용액에 투여한 후, 충분히 교반시켜 황을 제거한다. 

5.3.2.2  시료 용액은 무수황산나트륨층을 통과시켜 구리와 용액에 포함되어 있는 수분을 완전히 제거한다. 황은 상온에서 구리 등의 금속과 반응하여 쉽게 착화합물(Complex)을 형성한다.

5.3.3  실리카겔/알루미나 컬럼 정제(Silica/Alumina Clean-up)

5.3.3.1  5 % 비활성화 된 실리카겔 10 g과 알루미나 10 g을 취하여 순서대로 컬럼 내부에 충전하고 컬럼의 상단에 Na2SO4 1.5 ∼ 2 cm를 채운 다음, 노말-헥산을 이용하여 충분히 씻어준다.

5.3.3.2  적당한 부피로 용매가 제거된 시료 용액을 유리 피펫을 이용하여 컬럼 상단에 주입시킨다. 

5.3.3.3  노말-헥산 용액으로 포화탄화수소 성분을 제거한 후 노말-헥산과 디클로로메탄 혼합용액을 전개용매로 사용하여 시료 용액으로부터 PAHs 성분을 분리한다.

5.3.3.4  분리된 PAHs 성분들을 GC 분석용 2 mL 갈색 바이알에 옮긴 후, 용매를 완전히 제거하여 분석 시까지 냉장 보관한다.

6. 시험방법

6.1  전처리가 끝난 시료에 내부표준물질(2-fluorobiphenyl)을 첨가하고, 전체 시료  부피 1 mL가 되도록 노말-헥산을 첨가한다. 따로 시험에 사용한 시료의 무게와 같은 양의 노말-헥산을 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검액 일정량(1 ∼ 3 μL)을 마이크로 실린지를 사용하여 기체크로마토그래피에 주입하고 크로마토그램을 기록한다.

6.3  검액 중 PAHs의 체류시간에 해당하는 피크로부터 피크의 높이 또는 면적을 측정하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 시료의 PAHs 농도(mg/L)를 산출한다.

6.4  전체 시료 중 PAHs의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체 시료 중 PAHs의 농도(mg/kg) =               (식 1)

a: 시료의 PAHs 농도(mg/L)

b: 시험에 사용한 시료의 부피(mL)

c: 시험에 사용한 동결 건조한 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제36항 유기인 8. 정도평가/정도관리(QA/QC)의 내용을 참고한다.

7.1  정량분석: 정량분석용 PAHs 표준용액(표 2 참고)을 4개 이상 단계적으로 취하고 내부표준물질(2-fluorobiphenyl)을 첨가한 다음, 노말-헥산을 사용하여 전체 부피를 1 mL로 한다. 시료의 시험방법에 따라 시험하여 PAHs의 농도와 크로마토그램의 검량선식을 작성한다.

7.2  회수율: 회수율 검정을 위한 내부표준물질(표 3 참고)을 이용하여 추출과정과 시험과정의 회수율을 산출한다.

회수율(%) = (시료로 분석된 표준물질의 농도/표준물질의 농도) × 100   (식 2)

7.3  위 7.1에서 구해진 검량선식을 이용하여 계산된 각 성분별 농도 계산값을 회수율로 나누어 시료 중의 최종 농도를 계산한다. 만약 회수율이 60 ∼ 130 % 이내에 들어오지 않을 경우 계산과정과 분석과정의 문제점을 점검해야 한다. 특히, 회수율 검정을 위한 내부표준물질이 분해되었거나 오염되었는지와 기기의 상태를 점검해 보아야 한다. 문제가 있는 시료에 대해서는 재분석을 실시한다.

7.4  검출한계(MDL) 및 정량한계(LOQ): 증류수 1 L에 예상되는 정량한계의 10배 정도의 농도로 표준물질을 첨가한 시료 7개를 준비하고, 각 시료에 대하여 분석절차를 거쳐 시험하여 표준편차(s)를 구한다. 표준편차값에 3.14(t0.01,6 = 3.143)를 곱한 값을 방법검출한계로 한다. 또한, 표준편차값에 10을 곱한 값을 정량한계로 한다.

방법검출한계(MDL) =  tα,n-1 × s                   (식 3)

정량한계(LOQ) =  10 × s                         (식 4)

7.5  정밀도(RSD): 규정된 조건하에서 측정값들 간의 근접 정도를 나타내는 것으로 검량선에 사용되는 농도 범위에서 중간 농도에 해당되는 표준물질을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다. 이 실험으로부터 얻은 평균값과 표준편차로부터 변동계수를 구하고 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

정밀도(%) = 표준편차(s)/평균값(avg) × 100              (식 5)

7.6  결과보고 시에는 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도, 검출한계를 기재하도록 한다.

8. 참고사항

8.1  시료의 오염과 분석 시 방해요인

PAHs 분석은 극미량 분석실험이므로 여러 단계별 실험 과정 하나하나에 세심한 주의를 기울여야 한다. 순간의 작은 실수 하나가 실험 결과에 미치는 영향은 굉장히 크다. 시료의 오염은 곧바로 분석의 방해 요인으로 작용할 뿐만 아니라, 이는 잘못된 분석 결과로 직결된다. 따라서, 이러한 방해요인들로부터의 영향을 최소화시키기 위한 몇 단계의 까다로운 정제 과정을 반드시 필요로 한다.

8.1.1  시료의 오염

8.1.1.1  시료의 채취 및 분석 시 사용하는 기구들에 의한 오염

최초 시료의 채취부터 분석 완료에 이르기까지의 과정들 중 가장 주의를 요하는 부분이다. 테프론을 제외한 모든 합성수지 제품의 사용은 엄격히 금한다. 이는 대부분의 합성수지에 함유되어 있는 Phthalate ester에 의한 분석방해 요인을 제거하기 위함이다.

8.1.1.2  분석자의 경험 부족에 의한 오염

전처리 과정 중 분석자의 손이나 신체에 의한 오염, 분석물을 다른 초자로 옮기는 과정에서의 오염 가능성을 주의해야 한다.

8.1.1.3  유지, 관리 소홀로 인한 분석기기(GC)의 오염

GC의 시료 주입부는 매우 오염되기 쉬운 부분 중 하나이다. 특히, 분석물의 양이 많거나 분석물의 농도가 높을 경우엔 수시로 이 부분의 오염도를 확인하여 분석 결과에 영향을 주지 않도록 주의해야 한다. 또한 컬럼, 검출기, 시료 주입시 사용되는 마이크로 주사기나 세척용 용매의 오염도 주의해야 한다.

8.1.1.4  GC에 사용되는 운반기체(Carrier Gas)

질량분석기(MS: Mass Spectrometer)에 사용하는 운반기체로는 고순도급의 헬륨(He, 99.999 %)을 사용하고, 운반기체가 포함할 수 있는 불순물을 제거하기 위해 목적에 맞는 트랩

 예를 들어 moisture trap, hydrocarbon trap, oxygen trap 등이 있다.

을 사용하여 불순물에 의한 영향을 최소화시킨다.

8.1.2  분석 시 방해요인

8.1.2.1  위 8.1.1 시료의 오염에서 열거한 사항들은 분석 시 방해 요인으로 작용한다.

8.1.2.2  심하게 오염된 시료는 기기분석 시 크로마토그램의 바탕선(Base line)의 안정적인 재현을 방해한다.

8.1.2.3  현장에서 채취한 폐기물 시료는 분석대상 화학종과 비슷한 화학적 성질을 갖는 유기, 무기 불순물을 다량 함유하고 있다. 이들은 기기분석 시 크로마토그램에서 복잡한 불순물 피크(noise peak)를 제공하여 정량 분석에 많은 혼돈을 초래한다.

8.1.2.4  폐기물 시료는 다량의 황 화합물을 포함하고 있다. 유기용매에 대한 이들의 용해도는 유기염소계(Organochlorine)나 유기인계(Organophosphorus) 화합물과 비슷하며, 기기분석 시 크로마토그램에서 불순물 피크(noise peak)를 유발할 수 있다.

8.1.2.5  대부분의 합성수지가 포함하는 Phthalate Ester의 경우도 마찬가지로 기기분석 시 크로마토그램에서 불순물 피크(noise peak)를 유발할 수 있다.

8.1.2.6  기름 성분에는 지질, 왁스 등의 물질들이 포함되어 있으며, 이들은 분자 내 에스터 작용기(Ester Functional group: R-COO-R‘)를 가지고 있기 때문에 노말-헥산에 용해되기 쉽다. 비누화 반응은 친핵성 치환반응(Nucleophilic substitution)을 이용하여 분자 내 에스터 작용기를 산 작용기(Acid Functional group: R-COOH)로 치환시켜서 수용성의 물질들로 변환시켜 준다.

8.1.2.7  위 5.3.1의 비누화 반응을 이용한 시료 정제작업(Saponification Clean-up)은 시료가 기름성분에 심하게 오염되었다고 판단될 때 사용한다. 오염도가 경미할 경우에는 생략해도 무방하다.

8.1.2.8  이 방법 이외의 분석 방법으로 분석하였을 때 검출한계와 정밀도가 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

8.2  이 방법 이외의 분석방법으로 분석하였을 때 검출한계와 정밀도가 이 방법과 비교하였을 때 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제20항 폴리클로리네이티드비페닐(Polychlorinated biphenyls, PCBs)

1. 측정원리

폐기물 내에 존재하는 폴리클로리네이티드비페닐(Polychlorinated biphenyls, PCBs)을 속슬렛 추출장치(Soxhlet extractor)를 이용하여 추출한 후, 비누화 반응, 황산과 흡착제를 이용한 정제 과정을 통해 추출액에 포함된 지방류와 기타 복잡한 유기물 등의 분석 방해물질들을 제거하고, 기체크로마토그래피(Gas Chromatography)에서 분리되는 화합물들을 이들 화합물에 대해 선택적으로 감도가 높은 전자포획검출기( Electron Capture Detector, ECD)를 사용하여 분석한다.

2. 측정범위 및 정밀도

유효측정범위는 시료량을 증가시키고 최종 농축한 부피를 줄이거나 기체크로마토그래피의 시료 주입량을 늘림으로써 조정할 수 있는데, 1 L의 시료를 사용하였을 경우 각 화합물에 대한 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 1.0 μg/L 정도이며 표준편차율은 10 % 정도이다.

3. 기구 및 기기

3.1  초자기구

시험에 사용되는 초자기구는 대부분 경질 유리재질로서, 세제로 깨끗이 세척하고 증류수로 세척한 다음, 회화로(Furnace)에서 450 °C 이상의 온도로 4시간 이상 완전히 태운 후 보관하고, 사용하기 전에 잔류농약 분석용 노말-헥산 용액으로 세척하여 사용한다.

3.1.1  속슬렛 추출장치(Soxhlet Extractor)

3.1.2  냉각용 콘덴서(Cooling Condenser)

3.1.3  부피 플라스크

3.1.4  갈색병(Amber bottle)

3.1.5  분별깔때기(Separation Funnel)

3.1.6  100, 250 mL 둥근바닥 플라스크(Round Bottom Flask)

3.1.7  100, 250 mL 비커(Beaker)

3.1.8  2 mL 유리병(Vial)

3.1.9  깔때기(Funnel)

3.1.10  1회용 피펫(Disposable Pipet)

3.1.11  원통형 여지(Thimble): 일회용 유리섬유 여과지(GF/F) 재질이나 혹은 유리재질의 것을 사용하며, 시료에 사용할 추출 용매로 4시간 동안 충분히 씻어낸 후 사용한다.

3.1.12  알루미늄 포일(Aluminum Foil): 사용 전 회화로에서 450 °C 이상의 온도로 4시간 이상 완전히 태운 후 사용한다.

3.1.13  정제용 컬럼(Column): 하부에 테프론 재질의 잠금 꼭지(Stopcock)가 부착된 것으로서 길이가 30 cm이고 내경이 1.0 ∼ 1.2 cm인 것을 사용한다.

3.2  장치 및 기기

3.2.1  진공용 데시케이터(Desiccator)

3.2.2  회화로(Muffle Furnace)

3.2.3  자석 교반기(Magnetic Stirrer)

3.2.4  가열기구(Heating mantle)와 온도 조절기

3.2.5  환류냉각용 순환장치(Low Temperature Circulator)

3.2.6  농축장치: 회전식 증발농축기(Rotary evaporator), Kuderna-Danish 농축기, 질소농축기 등

그림 1. Kuderna-Danish 농축기

3.2.7  감압 여과장치(Suction Filtration Apparatus)

3.2.8  기체크로마토그래피(Gas Chromatography)

표 1. 기체크로마토그래피 PCBs 분석조건의 예

┌──────────┬──────────────────────────┐

│검출기              │전자포획검출기(ECD)                                 │

├──────────┼──────────────────────────┤

│컬럼                │모세관 컬럼: DB-5 혹은 DB-35                        │

│                    │(내경 0.25 ∼ 0.32 mm, 필름두께 0.25 μm, 길이 30 m)│

├──────────┼──────────────────────────┤

│충전물질            │(5 ∼ 35 % phenyl)-methyl polysiloxane              │

├──────────┼──────────────────────────┤

│운반기체            │N2(99.999 %)                                        │

├──────────┼──────────────────────────┤

│운반기체 유속       │0.5 ∼ 1 mL/min                                     │

├──────────┼──────────────────────────┤

│검출기 기체 및 유속 │N2(99.9999 %), 60 mL/min                            │

├──────────┼──────────────────────────┤

│시료주입구 온도     │250 ∼ 280 °C                                      │

├──────────┼──────────────────────────┤

│검출기 온도         │280 ∼ 310 °C                                      │

├──────────┼──────────────────────────┤

│오븐 초기온도       │50 ∼ 120 °C                                       │

└──────────┴──────────────────────────┘

4. 시약 및 표준물질

4.1  유기용매: 잔류농약 분석용 혹은 그 순도와 동등한 등급의 것을 사용한다.

4.1.1  노말-헥산(n-Hexane: C6H14)

4.1.2  에탄올(Ethanol: C2H5OH)

4.1.3  아세톤(Acetone: CH3COCH3)

4.2  무수황산나트륨(Sodium Sulfate, Anhydrous, Na2SO4): 잔류농약 분석용, 또는 특급시약으로서 400 °C에서 4시간 가열하여 정제한 후, 진공상태에서 상온까지 방랭한 후 사용한다.

4.3  증류수: 전기적 저항이 18 MΩ/cm 이상인 정제수를 사용한다.

4.4  구리 분말(Cu powder): 유기원소 분석용 환원구리(60 ∼ 80 mesh)를 사용하기 전에 적당량의 진한 염산으로 세척한 후, 메탄올로 수회 씻고 다시 노말-헥산으로 수 회 세척하여 노말-헥산 중에 보관하면서 사용한다.

4.5  황산(H2SO4): 순도 96 % 이상

4.6  1 M 수산화나트륨/에탄올 용액: 수산화나트륨 (NaOH)의 경우, 에탄올에 대한 용해도가 좋지 않기 때문에 용액 제조 시, 먼저 소량의 증류수를 사용하여 완전히 녹인 후 에탄올로 부피를 맞춘다.

4.7  2 % 함수 플로리실(Florisil): 컬럼크로마토그래피용 플로리실(입자크기: 575 μm)을 140 °C에서 16시간 이상 가열하여 활성화시킨 후 진공상태에서 서서히 냉각시킨다. 98 g의 무게를 정확히 측정한 활성 플로리실에 증류수 2 mL를 첨가시켜 마개를 단단히 봉한 후, 충분한 시간 동안 혼합시킨다. 보관은 데시케이터(건조제: 실리카겔) 내에서 하며, 분석 시는 15시간 이상 보관한 것을 사용한다.

4.8  유리섬유 여과지: 예 GF/F

4.9  표준물질과 내부표준물질

4.9.1  표준물질(표 2): PCBs 정량 분석용으로 순도 98 % 이상의 것을 사용한다. 비페닐에 있는 하나 이상의 수소가 염소로 치환된 수에 따라 표 2와 같이 분류된 PCB 표준물질 중 선택할 수 있다. 

4.9.1.1  시료 내 존재하는 총 PCBs 함량을 분석하기 위해서는 여러 종류의 PCBs가 혼합되어 있는 혼합표준물질

 예: Arochlor1016, Arochlor1242, Arochlor1254, Arochlor1260

을 사용한다.

4.9.1.2  시료 내 존재하는 개별 PCB 함량을 분석하기 위해선 개별 PCB 표준물질 예: PCB 15, PCB 28, PCB 180

을 사용한다.

4.9.2  내부표준물질: 주로 Tetrachloro-m-xylene(TCMX)을 사용하며 정량분석용으로서 순도 99 % 이상의 것을 사용한다. 내부표준물질로 반드시 TCMX를 사용해야 하는 것은 아니며, 크로마토그램에서 표준물질로 사용된 폴리클로리네이티드비페닐 종류와 피크 겹침이 일어나지 않는 다른 폴리클로리네이티드비페닐 이성체, 혹은 검출기에 감응하는 그 외의 화학종을 사용해도 무방하다.

4.9.3  인증표준물질(CRM): IAEA-MEL(국제원자력기구), NIST(미국), NRC(캐나다) 등에서 구입하여 사용한다.

표 2. 염소 치환수에 따른 PCBs 표준물질의 예

┌────────┬────────────────────────┐

│염소(Cl) 치환수 │PCBs congener IUPAC No.                         │

├────────┼────────────────────────┤

│1               │1, 3                                            │

├────────┼────────────────────────┤

│2               │15                                              │

├────────┼────────────────────────┤

│3               │28                                              │

├────────┼────────────────────────┤

│4               │44, 52, 77, 81                                  │

├────────┼────────────────────────┤

│5               │87, 101, 102, 103, 105, 110, 114, 118, 123, 126 │

├────────┼────────────────────────┤

│6               │138, 153, 156, 157, 167, 169                    │

├────────┼────────────────────────┤

│7               │170, 180, 187, 189                              │

├────────┼────────────────────────┤

│8               │198                                             │

├────────┼────────────────────────┤

│9               │206                                             │

└────────┴────────────────────────┘

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  시료의 보관

시료를 채취하여 250 mL의 차광용기에 담아 즉시 냉동 보관한다. 시료는 분석 전까지 -20 °C에 보관한다.

5.2  시료의 전처리

시료를 동결건조 시킨 후, 시료 적당량 (3 ∼ 5 g)을 취하고, 노말-헥산에 녹인 회수율 검정용 표준물질(Surrogate standard) 1 ∼ 2 mL를 시료에 첨가한다. 속슬렛 추출장치를 이용하여 노말-헥산과 아세톤 1 : 1 (v/v) 용액 150 mL로 12시간 동안 추출한 다음, 추출한 용액의 부피가 4 ∼ 5 mL 정도 될 때까지 용매를 휘발ㆍ 농축시킨다. 전처리가 끝난 시료는 직사광선과의 접촉을 피하도록 주의한다. 햇빛을 촉매로 하여 발생할 수 있는 광반응은 분석 대상 화학종의 분자구조에 변화를 줄 우려가 있다.

상기의 시료 전처리 방법 이외에 외국 또는 국내의 공인된 기관에서 인정하고 있는 전처리 방법을 사용할 수 있다.

5.3  시료의 정제

추출물에 포함된 여러 화학적 성분들로부터 PCBs만을 얻기 위해서는 다음과 같은 여러 단계의 정제 작업이 필요하다.

5.3.1  비누화 반응을 이용한 정제(Saponification Clean up)

 시료가 기름 성분에 심하게 오염되어 있을 때 사용한다.

5.3.1.1  추출한 시료 용액을 둥근바닥 플라스크 안에서 1 M 수산화나트륨 용액 50 mL를 사용하여 2시간 동안 환류시킨다.

5.3.1.2  공기 중에서 냉각시킨 후, 분별깔때기로 추출물이 녹아있는 유기용매층만을 노말-헥산으로 다시 추출한다.

5.3.1.3  위의 5.3.1.1과 5.3.1.2 과정을 3회 반복한다.

5.3.2  황산을 이용한 정제

5.3.2.1  추출물이 녹아있는 유기용매층을 황산과 증류수를 1 : 1 (v/v)로 섞은 용액 10 mL로 역추출하고, 이 과정을 3회 반복한다.

5.3.2.2  유기용매층을 다시 황산나트륨(Na2SO4)으로 충전된 관을 통과시켜서 유기용매층에 포함되어 있는 수분을 완전히 제거한다.

5.3.3  구리분말을 이용한 정제 시료에 다량의 황화합물이 포함되어 있을 때 사용한다.

5.3.3.1  활성화된 구리분말 2 g을 시료용액에 투여한 후, 자석막대 등을 이용하여 1 ∼ 2분 동안 저어준다.

5.3.3.2  시료용액으로부터 구리를 제거한 후, 적정 부피가 될 때까지 용매를 제거한다.

5.3.3.3  정제에 사용한 구리는 3회 이상 노말-헥산으로 씻어내고 그 용액을 시료용액에 더한다.

5.3.4  플로리실 컬럼 정제

5.3.4.1  2 % 비활성화된 플로리실 14 ∼ 15 g을 취하여 컬럼 내부를 충전하고, 컬럼의 상단에 황산나트륨(Na2SO4) 1.5 ∼ 2 cm를  채운 다음, 노말-헥산을 이용하여 충분히 씻어준다.

5.3.4.2  적당한 부피로 용매가 제거된 시료용액을 유리피펫을 이용하여 컬럼 상단에 주입시킨다.

5.3.4.3  노말-헥산을 전개용매로 사용하여 시료용액으로부터 PCBs 성분을 분리한다.

5.3.4.4  분리된 PCBs 성분들을 GC 분석용 2 mL 갈색 바이알에 옮긴 후, 용매를 완전히 제거하여 분석 시까지 냉장 보관한다.

6. 시험방법

6.1  전처리가 끝난 시료에 내부표준물질(Tetrachloro m-xylene, TCMX)을 첨가하고 시료전체 부피가 1 mL 되도록 노말-헥산을 첨가한다. 따로 시험에 사용한 시료의 무게와 같은 양의 노말-헥산을 취하여 시료의 시험방법에 따라 시험하여 바탕시험액으로 한다.

6.2  검액 일정량(1 ∼ 3 μL)을 마이크로 실린지를 사용하여 기체크로마토그래피에 주입하고 크로마토그램을 기록한다.

6.3  검액 중 PCBs의 체류시간에 해당하는 피크로부터 피크의 높이 또는 면적을 측정하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 시료의 PCBs 농도(mg/L)를 산출한다.

6.4  전체 시료 중 PCBs의 농도는 다음과 같이 계산한다.

전체 시료 중 PCBs의 농도(mg/kg) =              (식 1)

a: 시료의 PCBs 농도(mg/L)

b: 시험에 사용한 시료의 부피(mL)

c: 시험에 사용한 동결 건조한 시료의 양(g)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

해수공정시험기준 제4장 제36항 유기인 8. 정도평가/정도관리(QA/QC)의 내용을 참고한다.

7.1  정량분석: 정량분석용 PCBs 표준용액(표 2 참고)을 4개 이상 농도로 단계적으로 취하고 내부표준물질(2-fluorobiphenyl)을 첨가한 다음, 노말-헥산을 사용하여 전체 부피를 1 mL로 한다. 시료의 시험방법에 따라 시험하여 PCBs의 농도와 크로마토그램의 검량선식을 작성한다.

7.2  회수율: 회수율 검정을 위한 내부표준용액을 이용하여 추출과정과 시험과정의 회수율을 산출한다.

회수율(%) = (시료로 분석된 표준물질의 농도/표준물질의 농도) × 100   (식 2)

7.3  위 7.1에서 구해진 검량선식을 이용하여 계산된 각 성분별 농도 계산값을 회수율로 나누어 시료 중의 최종 농도를 계산한다. 만약 회수율이 60 ∼ 130 % 이내에 들어오지 않을 경우 계산과정과 분석과정의 문제점을 점검해야 한다. 특히, 회수율 검정을 위한 내부표준물질이 분해되었거나 오염되었는지와 기기의 상태를 점검해 보아야 한다. 문제가 있는 시료에 대해서는 재분석을 실시한다.

7.4  검출한계(MDL) 및 정량한계(LOQ): 증류수 1 L에 예상되는 정량한계의 10배 정도의 농도로 표준용액을 첨가한 시료 7개를 준비하고, 각 시료에 대하여 분석절차를 거쳐 시험하여 표준편차(s)를 구한다. 표준편차값에 3.14(t0.01,6 = 3.143)를 곱한 값을 방법검출한계로 한다. 또한, 표준편차값에 10을 곱한 값을 정량한계로 한다.

방법검출한계(MDL) =  tα,n-1 × s                (식 3)

정량한계(LOQ) =  10 × s                        (식 4)

7.5  정밀도(RSD): 규정된 조건하에서 측정값들 간의 근접 정도를 나타내는 것으로 검량선에 사용되는 농도 범위에서 중간 농도에 해당되는 표준용액을 대상으로 최소 3회 이상 반복하여 평가한다. 이 실험으로부터 얻은 평균값과 표준편차로부터 변동계수를 구하고 재현성을 확인하고 이를 정밀도로 이용한다.

정밀도(%) = 표준편차(s)/평균값(avg) × 100             (식 5)

7.6  결과보고 시에는 검량선식, 상관계수(r2), 정밀도, 검출한계를 기재하도록 한다.

8. 참고사항

8.1  시료의 오염과 분석 시 방해요인

PCBs 분석은 극미량 분석실험이므로 여러 단계별 실험 과정 하나하나에 세심한 주의를 기울여야 한다. 순간의 작은 실수 하나가 실험 결과에 미치는 영향은 굉장히 크다. 시료의 오염은 곧바로 분석의 방해 요인으로 작용할 뿐만 아니라, 이는 잘못된 분석 결과로 직결된다. 따라서 이러한 방해 요인들로부터의 영향을 최소화시키기 위한 몇 단계의 까다로운 정제 과정을 반드시 필요로 한다.

8.1.1  시료의 오염

8.1.1.1  시료의 채취 및 분석 시 사용하는 기구들에 의한 오염

최초 시료의 채취부터 분석 완료에 이르기까지의 과정들 중 가장 주의를 요하는 부분이다. 테프론을 제외한 모든 합성수지 제품의 사용은 엄격히 금한다. 이는 대부분의 합성수지에 함유되어 있는 Phthalate ester에 의한 분석방해 요인을 제거하기 위함이다.

8.1.1.2  분석자의 경험 부족에 의한 오염

전처리 과정 중 분석자의 손이나 신체에 의한 오염, 분석물을 다른 초자로 옮기는 과정에서의 오염 가능성을 주의해야 한다.

8.1.1.3  유지, 관리 소홀로 인한 분석기기(GC)의 오염

GC의 시료 주입부는 매우 오염되기 쉬운 부분 중 하나이다. 특히, 분석물의 양이 많거나 분석물의 농도가 높을 경우엔 수시로 이 부분의 오염도를 확인하여 분석 결과에 영향을 주지 않도록 주의해야 한다. 또한 컬럼, 검출기, 시료 주입 시 사용되는 마이크로 주사기나 세척용 용매의 오염도 주의해야 한다.

8.1.1.4  GC에 사용되는 운반기체(Carrier Gas)

전자포획검출기(ECD)에 사용하는 운반 기체로는 초고순도급의 질소(N2 99.999 %)를 사용하여 운반 기체가 포함할 수 있는 불순물에 의한 영향을 최소화시킨다.

8.1.2  분석 시 방해요인

8.1.2.1  위 8.1.1 시료의 오염에서 열거한 사항들은 분석 시 방해 요인으로 작용한다.

8.1.2.2  심하게 오염된 시료는 기기분석 시 크로마토그램의 바탕선(Base line)의 안정적인 재현을 방해한다.

8.1.2.3  현장에서 채취한 폐기물 시료는 분석대상 화학종과 비슷한 화학적 성질을 갖는 유기, 무기 불순물을 다량 함유하고 있다. 이들은 기기분석 시 크로마토그램에서 복잡한 불순물 피크(noise peak)를 제공하여 정량 분석에 많은 혼돈을 초래한다.

8.1.2.4  대부분의 합성수지가 포함하는 Phthalate Ester의 경우도 마찬가지로 기기분석 시 크로마토그램에서 불순물 피크(noise peak)를 제공한다.

8.1.2.5  위 5.3.1의 비누화 반응을 이용한 시료정제작업(Saponification Clean-Up)은 시료가 기름 성분에 심하게 오염되었다고 판단될 때 사용한다. 오염도가 경미할 경우에는 생략해도 무방하다.

8.1.2.6  기름 성분에는 지질, 왁스 등의 물질들이 포함되어 있으며, 이들은 분자 내 에스터 작용기(Ester Functional group: R-COO-R‘)를 가지고 있기 때문에 노말-헥산에 용해되기 쉽다. 비누화 반응은 친핵성 치환반응(Nucleophilic substitution)을 이용하여 분자 내 에스터 작용기를 산 작용기(Acid Functional group: R-COOH)로 치환시켜서 수용성의 물질들로 변환시켜 준다.

8.1.2.7  위 5.3.2에서 황산은 산화력을 가지고 있으며 불필요한 유기물질들은 황산에 의해 산화된다. 단, PCBs는 황산에 의해 산화되지 않는다.

8.1.2.8  위 5.3.3에서 구리분말을 이용한 정제작업은 시료가 해수를 포함하거나 해수에 노출 혹은 다량의 황 화합물을 포함한다고 판단될 때 사용한다.

8.1.2.9  유기용매에 대한 황화합물의 용해도는 유기염소계(Organochlorine)나 유기인계(Organophosphorus) 화합물과 비슷하며, 기기분석 시 크로마토그램에서 불순물 피크(noise peak)를 생성하기 때문에 전처리과정에서 제거해야 한다.

8.1.2.10  위 5.3.3에서 황은 구리 등의 금속과 반응하여 쉽게 착화합물을 형성한다. 이러한 황의 화학적 성질을 이용하여 시료로부터 쉽게 황을 제거할 수 있다.

8.1.2.11  위 5.3.4의 플로리실 컬럼 정제 작업은 PCBs 분획의 끝지점을 확인할 수 있는 한 방법으로, UV-vis 스펙트럼을 이용하면 자외선 영역인 230 ∼ 260 nm에서 비페닐 계열 분자의 특징적인 2차 전이 흡수를 확인할 수 있다.

8.2  이 방법 이외의 분석방법으로 분석하였을 때, 검출한계와 정밀도가 이 방법과 비교하여 동등 이상일 경우 사용할 수 있다.

제21항 발광박테리아(Vibrio fischeri)를 이용한 해양배출 폐기물 독성평가 방법

1. 측정원리

이 시험방법은 폐기물의 해양배출 적합성을 판정하기 위한 생태독성시험법의 기준으로서, 해양성 발광박테리아인 Vibrio fischeri의 발광 저해율을 이용하여 폐기물의 해양배출 가능한지를 판정하기 위한 검사 방법이다.

2. 시험생물

2.1  표준시험생물은 해양성 발광 미생물인 Vibrio fischeri 이며, 호흡작용의 일환으로 푸른색의 빛을 발생시킨다.

2.2  시험생물은 생물제공 업체에서 생산한 것을 구입하거나 직접 배양하여 사용할 수 있으며, 검사 성적서에 시험생물의 제조 회사명과 제품명을 반드시 명기해야 한다. 시험생물은 표준물질 독성시험을 거쳐 민감도가 확인된 경우에 한하여 사용할 수 있다.

3. 기구 및 기기

3.1? 발광량 측정기: 발광박테리아의 생물 발광량을 측정

3.2? 수질측정기: 수온, 염분, pH 측정

3.3? 회전교반기

3.4? 소형교반기

3.5? 냉장/냉동고

3.6? 유리 큐벳: 발광박테리아와 시료의 혼합 용기

3.7? 피펫 또는 디스펜서

4. 시약 및 표준물질

4.1  동결건조 제품 또는 배양 중인 발광박테리아(Vibrio fischeri)

4.2  발광박테리아 재활성화 시약: 동결건조된 박테리아를 활성화시키기 위한 용액으로 시험생물 제조사에서 제공하는 시약

4.3  희석액: 염수 추출용 여과 해수 또는 제조사의 희석용액

4.4  pH 조절용 시약: 염산(HCl)과 수산화나트륨(NaOH)

4.5  삼투압 조절용액: 삼투압 조절용액으로 박테리아 배양시 삼투압 조건을 일정하게 유지하기 위해서 사용하며, 동결건조 박테리아 제조회사의 제품을 사용

4.6  표준독성물질: 황산아연(zinc sulfate heptahydrate, ZnSO47H2O)

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  생태독성 검사용 시료의 채취 및 보관은 해양폐기물공정시험기준 제2장 시료의 채취 및 보관에 따른다.

5.2  위 5.1에 따라 채취된 시료는 성상과 무관하게 오염되지 않은 여과해수 또는 인공해수(30 psu)와 1 : 10 (w:v 또는 v:v)의 비로 1,000 mL 분별깔때기에 넣어 혼합한다.

5.3  위 5.2에 따른 혼합액은 상온, 상압에서 진탕 횟수가 분당 약 200회, 진폭이 4 ∼ 5 cm인 진탕기를 사용하여 6시간 연속 진탕한 다음, 상등액을 1.0 μm의 유리섬유 여과지로 여과하여 검액으로 사용한다. 여과 후에도 색도나 탁도가 높을 경우에는 고속원심분리기를 이용하여 9,000 rpm으로 4 °C에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 검액으로 사용한다.

5.4  시험용 검액의 pH가 6.0 ∼ 8.5, 염분이 29.0 ∼ 31.0 psu의 범위에 포함되지 않을 경우에는 각각의 범위 내에 포함되도록 조절한다. pH나 염분조절용 시약은 시험생물에 대한 독성이 없어야 하며, 보정을 위해서 첨가되는 시약의 양은 시료부피의 5 %를 초과할 수 없다.

6. 시험방법

6.1  동결 건조된 박테리아의 재활성 방법은 제조회사가 제시하는 방법에 따르며, 재활성된 박테리아를 4 °C의 배양대에 보관한다. 한번 재활성된 박테리아는 5시간 이내에 사용해야 한다.

6.2  피펫으로 검액 10 mL를 유리 시험관으로 옮긴 후, 약 15 °C에서 보관한다.

6.3  재활성된 박테리아 배양액과 시료의 비율은 제조회사에 따라 상이하므로 제조회사의 방법에 따른다. 그 외의 경우에는 시료(최대 1 mL)와 발광박테리아 배양액의 비율은 초기 발광량을 고려하여 1 : 1에서 1 : 100의 범위에서 조절할 수 있다.

6.4  시료와 대조구의 반복수는 각각 4개이며, 박테리아 배양액과 시료를 위 6.3에 따라 혼합한 후 30분이 지나면 발광량을 측정한다. 대조구는 염수 추출에 사용한 여과해수 또는 발광량 측정기 제조회사의 희석액을 대상으로 시료와 동일한 방법으로 발광량을 측정한다. 이때, 접종 후 정확히 30분 후에 박테리아 배양액의 발광량을 측정해야 하므로, 다수의 시료를 분석할 때에는 발광량 측정기의 측정 용량을 고려하여 접종 시기를 차별화하여 정확히 접종 30분 후 발광량을 측정해야한다.

6.5  각 시료의 상대발광저해율은 대조구의 발광량을 100 %로 하여 상대적인 비율로 계산한다.

  (식 1)

6.6  시험대상 시료의 상대발광저해율이 30 % 이하일 경우에는 ‘독성없음’으로 판정한다.

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

7.1  시험방법의 정도관리를 위해 반드시 표준독성물질 시험을 수행한다. 표준독성물질은 황산아연(zinc sulfate heptahydrate)을 사용하며, 정도관리 자료는 시료의 독성 측정자료와 함께 제시되어야 한다.

7.2  시험 시작시 발광박테리아의 초기 발광량과 30분 후의 발광량의 비가 0.6 ∼ 1.8의 범위에 포함되어야 한다.

7.3  발광박테리아의 건강도 및 민감도 시험을 위한 검정은 위 7.1에 따른 표준독성물질을 이용하여, 표준독성물질에 대한 30분 EC50 값이 황산아연을 이용할 경우 1 ∼ 10 mg/L의 범위에 포함되어야 한다. EC50 값의 계산은 다음의 제22항 7.9 검정의 LC50 계산 방법을 참고하여 계산할 수 있다.

제22항 저서성 단각류(Monocorophium)를 이용한 해양배출 폐기물 독성평가 방법

1. 측정원리

이 시험방법은 폐기물의 해양배출 적합성을 판정하기 위한 생태독성시험법의 기준으로서, 해양 저서성 단각류를 이용하여 폐기물의 해양배출이 가능한지를 판정하기 위한 검사방법이다. 저서성 단각류를 시험대상 시료에 노출시킨 후, 생존 또는 사망 개체수를 측정하여 시험대상 물질의 독성을 검사한다.

2. 시험생물

2.1  표준시험생물로서는 저서성 단각류인 Monocorophium속의 일종을 이용한다. 만일 다른 저서성 단각류를 이용하고자 할 때에는 독성시험에 적절한 생물인지를 판단할 수 있는 근거 자료와 표준독성물질(카드뮴)을 이용한 민감도 시험결과, 상기 종의 민감도에 상응하는 경우에 한하여 이용할 수 있다.

2.2  표준시험종인 단각류는 단각목(Amphipoda), 갑각강(Crustacea)에 속한다. 우리나라 서ㆍ남해안과 일본, 북미 및 유럽 등의 전세계에 분포하는 종이다. 이 종은 내서 생물로서 자신이 만든 관(tube)에 서식한다. 주된 먹이는 퇴적물 내 유기 파편이며, 최대 8 mm까지 성장한다. 실험실에서 연중 산란하므로 계대 배양이 가능하여 독성시험생물로서 유용한 생물이다.

2.3  시험생물은 공급업체에서 생산한 것을 구입하거나 직접 배양하여 사용할 수 있다. 이때, 반드시 공급 회사명을 명시하고 표준물질 독성시험(카드뮴)을 통하여 민감도가 입증되어야 한다.

3. 기구 및 기기

3.1  항온 시설: 독성시험 과정 동안 일정한 온도를 유지할 수 있는 배양기, 또는 배양실과 이에 상응하는 시설

3.2  표준체: 평가대상 시료에서 굵은입자 및 내서생물 제거용, 혹은 일정 크기의 시험 개체를 선별ㆍ 회수하기 위한 표준체(300 μm, 500 μm, 1,000 μm)

3.3  냉장고: 독성 시험전 평가대상 시료 보관용(4 °C)

3.4  유리수조(20 L): 독성 시험전 시험생물을 순치 또는 사육

3.5  폭기장치: 순치기간과 독성 시험중 산소 공급

3.6  유리피펫(1 mL): 시험용기의 폭기

3.7  강화유리 비이커 (250 mL, 1,000 mL): 독성시험 용기

3.8  덮개: 폭기로 인한 해수의 증발을 최소화하기 위한 유리 접시

3.9  암모니아 측정기: 시료 내의 암모니아 농도 측정

3.10  수질 측정기: 수온, pH, 염분 및 용존산소 측정

3.11  자동피펫: 시료 및 시약을 분주

4. 시약 및 표준물질

4.1  시험생물 배양용 퇴적물: 순치 또는 배양기간 중 시험생물의 배양 기질로 이용하기 위해 오염되지 않은 퇴적물로서 내서생물과 굵은 입자를 제거하기 위하여 300μm 표준체로 거른 후 사용

4.2  시험 해수: 시험전 또는 시험과정에서 시험생물을 건강하게 유지할 수 있는 오염되지 않은 자연해수 또는 인공해수를 1 μm 이하의 여과지로 거른 후 사용

4.3  희석액: 염수 추출용 해수

4.4  pH 조절용 시약: 염산(HCl)과 수산화나트륨(NaOH)

4.5  먹이: 순치 또는 배양기간 중 시험생물의 사육을 위한 어류 사육용 사료와 살아있는 식물플랑크톤(Skeletonema 등)

4.6  표준독성물질: 염화카드뮴(CdCl2)

5. 시료의 채취 및 보관

5.1  생태독성 검사용 시료의 채취 및 보관은 해양폐기물공정시험기준 제2장 시료의 채취 및 보관에 따른다. 

5.2  확산식 해양배출물질의 전처리는 해양폐기물공정시험기준 제4장 제21항 5. 시료의 채취 및 전처리에 따른다.

5.3  집중식 해양배출물질인 준설물질의 전처리는 다음과 같다.

5.3.1  시험대상 시료가 해양 준설물(퇴적물)인 경우에는 채취한 퇴적물 시료를 300 μm 표준체에 통과시켜 굵은 입자와 내서생물을 제거한다. 퇴적물을 표준체에 통과시킬 때에는 인위적으로 해수를 첨가하지 않고, 시료를 체 위에서 압박하여 짜내는 것이 좋다.

5.3.2  독성시험에 필요한 퇴적물의 최소량은 1 L이며, 퇴적물 양의 약 5배에 해당하는 여과해수를 부어 24시간 동안 폭기한다. 만약 24시간 후에 해수 중의 암모니아 농도가 1 mM 이상이면, 해수의 80 %를 교환한 후 다시 24시간 동안 폭기한다. 암모니아의 농도가 1 mM 미만이 될 때까지 이 과정을 반복한다.

6. 시험방법

6.1  염수추출액 시험방법

6.1.1  위 5.1에 따라 준비된 시료를 잘 혼합한다. 250 mL 유리 비이커 4개에 염수 추출된 검액을 각각 200 mL씩 넣는다. 또한, 250 mL 유리 비이커 4개에 염수 추출 시 사용했던 여과해수를 각각 200 mL 넣어서 대조구로 사용한다.

6.1.2  시험생물은 실험실에서 최소 7일간 순치해야 한다. 순치기간 중에 10 % 이상의 개체들이 특별한 이유 없이 사망한다면, 모든 개체를 폐기하고 시험생물을 다시 준비해야 한다.

6.1.3  시험생물의 크기는 500 μm 표준체를 통과하고 300 μm 표준체는 통과하지 못하는 건강한 개체를 골라 각각의 비이커에 10마리씩 투입한다. 이때, 계수 과정의 실수를 최소화하기 위해 5마리씩 나누어 투입하는 것이 좋다.

6.1.4  시료가 담긴 비이커에 시험생물을 투입한 시점으로부터 4일 동안 배양한다. 배양기간 동안 폭기를 지속하며, 증발로 인하여 염분이 1 psu 이상 증가할 경우에는 증류수를 첨가하여 시험시작 시점의 염분(30 psu)으로 조절한다. 시험 수온과 염분은 각각 20 ± 1 °C 및 30 ± 1 psu가 유지되도록 한다. 먹이는 순치기간에만 공급하며 시험기간에는 공급하지 않는다. 자세한 시험조건은 표 1을 참고한다.

6.1.5  시험기간 동안 수질모니터링을 위해 최소 2회(실험 시작과 종료) 이상 수온, 염분, pH, 용존산소, 암모니아 농도를 측정하여 기록한다.

6.1.6  4일간의 독성시험이 끝나면 비이커별로 조심스럽게 생존개체를 회수한다. 회수된 생존개체를 계수하여 비이커별 생존율을 계산하고 이를 평균하여 시험구별 생존율로 제시한다. 이때, 시험생물의 사망 판정이 불분명할 경우에는 10초 이상 움직임이 없는 개체는 사망한 것으로 간주한다.

6.2  해양 준설물질 시험방법

6.2.1  위 5.2에서 준비된 시료를 잘 혼합한다. 이때, 혼합 과정에서 공기와의 접촉을 가급적 피한다. 1 L 유리 비이커 4개에 혼합된 시료를 각각 175 mL씩 넣고, 바닥에 골고루 퍼지도록 한다. 또한, 오염되지 않은 퇴적물을 이용하여 1 L 유리 비이커 4개에 대조구를 준비한다.

6.2.2  시험생물은 실험실 내에서 최소 7일간 순치해야 한다. 순치기간?중에 10 % 이상의 개체들이 특별한 이유 없이 사망한다면 모든 개체를 폐기하고 시험생물을 다시 준비해야 한다.

6.2.3  퇴적물 시료가 담긴 비이커에 여과해수 800 mL를 붓는다. 이때, 얇은 플라스틱 접시를 시료 위에 얹어 시료가 교란되지 않도록 한다. 모든 비이커에 해수를 채운 후 덮개를 덮고 폭기를 시작한다.

6.2.4  시험생물의 크기는 500 μm 표준체를 통과하고 300 μm 표준체는 통과하지 못하는 건강한 개체를 골라 비이커별로 20마리씩 투입한다. 이때, 계수 과정의 실수를 최소화하기 위해 5마리씩 나누어 투입하는 것이 좋다.

6.2.5  시료가 담긴 비이커에 시험생물을 투입한 시점으로부터 10일 동안 배양한다. 배양기간 동안 폭기를 지속하며, 염분이 1 psu 이상 증가할 경우에는 증류수를 첨가하여 시험시작 시점의 염분(30 psu)으로 조절한다.

6.2.6  먹이는 순치기간에만 공급하며 노출시험기간에는 공급하지 않는다. 시험 온도와 염분은 각각 20 ± 1 °C 및 30 ± 1 psu가 유지되도록 한다. 자세한 시험조건은 표 1을 참고한다.

6.2.7  시험기간 동안 수질모니터링을 위해 최소 3회(실험 시작, 중간, 종료 시) 이상 온도, 염분, pH, 용존산소, 암모니아 농도를 측정하여 기록한다.

6.2.8  10일간의 독성시험이 끝나면 비이커별로 조심스럽게 생존개체를 회수한다. 비이커 내 해수와 시료를 300 μm 표준체에 붓고 조심스럽게 시험생물을 걸러낸다.

6.2.9  회수된 생존개체를 대조구와 동일한 퇴적물에 시험조건과 동일하게 투여한 후, 생존개체가 퇴적물 안으로 잠입하는지를 확인해야 한다. 이때, 재잠입하지 못하는 개체와 10초 이상 움직임이 없는 개체는 사망한 것으로 간주한다.

6.2.10  사망개체를 계수하여 시료별 평균생존율을 계산한다.

6.3  시험대상 시료의 상대 평균생존율을 다음의 식으로 계산하고, 그 값이 30 % 이하일 경우에는 ‘독성없음’으로 판정한다.

상대 평균생존율(%) = 대조구의 평균생존율(%) - 시료의 평균생존율(%)  (식 1)

7. 정도관리/정도평가(QA/QC)

7.1  독성시험을 수행하는 동안이나 전후(1주 이내)에 동일한 시험생물을 이용하여 카드뮴(cadmium)에 대한 해수 표준물질독성시험을 수행해야 한다. 자세한 내용은 표 3을 참고한다.

7.2  먼저 용존 카드뮴 1,000 mg/L 농도의 stock solution(염화카드뮴, CdCl2)을 증류수에 녹여서 제조한다. 시험목적에 따라 정해진 카드뮴 농도구배와 반복수를 고려하여 필요한 수의 250 mL 비이커를 준비하고 농도구배는 0, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 mg/L로 한다.

7.3  비이커 내 해수를 저으면서 농도별로 일정량의 stock solution을 피펫으로 천천히 첨가한다. 시험해수를 준비할 때 증류수 첨가로 인한 염분 감소를 사전에 고려하도록 한다. 카드뮴을 투여한 이후부터 시험생물을 투입하기 전 약 10시간 정도 비이커 위에 아크릴 덮개를 얹고 안정화시킨다.

7.4  비이커별로 시험생물을 10개체씩 투입한다.

7.5  사망 개체의 관찰은 24시간마다 한다. 사망 개체는 발견 즉시 제거해야 한다. 사망의 판단은 시험 개체가 10초 이상 움직임이 없는 경우이다.

7.6  시험해수의 수질은 최소한 실험시작과 종료시점을 포함하여 2회이상 측정한다.

7.7  카드뮴에 96시간 동안 노출한 이후에 비이커별로 생존 개체수를 확인하여 기록한다. 농도별 생존율을 이용하여 96시간 반수치사 농도 (96h LC50)를 계산한다.

7.8  시험기간 동안 대조구의 평균생존율은 항상 90 % 이상이 되어야 한다. 만일 대조구의 평균생존율이 90 % 미만인 경우에는 시험조건이나 시험생물의 상태를 점검하여 재시험한다.

7.9  96시간 반수치사농도는 프로빗(Probit) 방법과 TSK(Trimmed Spearman-Karber) 방법, 그리고 그래프 방법이 있다.

7.9.1  Probit 방법

1 ∼ 99 % 사이의 부분 생존 또는 사망률 자료가 2개 이상인 경우에만 이용가능하며 카이자승(Chi-square) 검정을 통해 자료가 프로빗 모형(Probit model)에 적합한지를 판단한 이후에 사용 가능하다. Probit 방법을 이용하면 반수치사농도와 함께 95 % 신뢰구간을 구할 수 있다.

7.9.2  TSK 방법

부분 사망률 자료가 1개 이상인 경우에 이용하며, 이 방법은 자료가 프로빗 모형에 적합하지 않은 경우에도 반수치사농도를 계산할 수 있다. TSK 방법을 이용하면 반수치사농도와 함께 95 % 신뢰구간을 구할 수 있다.

7.9.3 그래프 방법

부분 사망률 자료가 하나도 없는 경우, 즉 모든 생존율 자료가 0 또는 100 %인 경우에는 그래프 방법을 이용하여 반수치사농도를 구할 수 있다. 이 방법은 생존율이 100 %인 최대농도와 0 %인 최저농도 사이에 선형회귀를 통해 반수치사농도를 계산하는 것으로 신뢰구간을 구할 수 없다.

7.9.4  Probit과 TSK 방법에 대한 상세한 설명은 통계학 서적을 참고한다. 다만, 이 두 방법을 간편하게 적용할 수 있도록 개발된 통계프로그램을 활용할 수 있다.

7.10  카드뮴 독성시험 결과의 96시간 반수치사농도 적합도 판정기준은 96h LC50가  0.2 ∼ 2.2 mgCd/L의 범위에 포함되어야 하며, 그렇지 않은 경우에는 시험생물의 건강도 및 민감도에 문제가 있다고 판단되므로 독성시험 결과를 이용할 수 없다.

8. 참고사항

표 1. 저서성 단각류를 이용한 해양배출물질(염수추출액) 급성독성 시험조건

┌─────────┬──────────────────────┐

│항   목           │조   건                                     │

├─────────┼──────────────────────┤

│시험 방법         │비교환 정수식                               │

│                  │                                            │

│시험 생물         │저서성 단각류 Monocorophium 외              │

│                  │                                            │

│시험 기간         │4일(96시간)                                 │

│                  │                                            │

│시험 온도         │20 ± 1 °C                                 │

│                  │                                            │

│시험 염분         │30 ± 1 psu                                 │

│                  │                                            │

│광조건            │빛 차단                                     │

│                  │                                            │

│시험 용기         │250 mL 강화 유리비이커                      │

│                  │                                            │

│시험 용액         │200 mL                                      │

│                  │                                            │

│희석 용액         │1.0 μm의 유리섬유 여과지로 여과한 해수     │

│                  │                                            │

│시험 용액의 교환  │없음                                        │

│                  │                                            │

│시험구별 개체수   │10                                          │

│                  │                                            │

│시험농도별 반복수 │4                                           │

│                  │                                            │

│시험 생물의 크기  │300 ∼ 500 μm(표준체 기준)                 │

│                  │                                            │

│먹이 공급         │공급하지 않음                               │

│                  │                                            │

│폭기              │용존산소 포화도가 80 % 이하일 경우에만 폭기 │

│                  │                                            │

│수질 측정         │실험시작과 종료시에 측정                    │

│                  │                                            │

│최종 측정치       │생존율                                      │

│                  │                                            │

│시험 적합도 기준  │대조구의 생존율이 90 % 이상                 │

└─────────┴──────────────────────┘

표 2. 저서성 단각류를 이용한 해양준설물질(퇴적물) 급성독성 시험조건

┌─────────┬───────────────────────┐

│항   목           │조   건                                       │

├─────────┼───────────────────────┤

│시험 종류         │비교환 정수방식                               │

│                  │                                              │

│시험 생물         │저서성 단각류 Monocorophium 외                │

│                  │                                              │

│시험 기간         │10일                                          │

│                  │                                              │

│시험 온도         │20 ± 1 °C                                   │

│                  │                                              │

│시험 염분         │30±1 psu                                     │

│                  │                                              │

│광조건            │24시간 연속 조명                              │

│                  │                                              │

│광종류            │형광등                                        │

│                  │                                              │

│조도              │500 ∼ 1000 lux                               │

│                  │                                              │

│시험 용기         │1,000 mL 강화유리비이커                       │

│                  │                                              │

│퇴적물 부피       │175 mL(300 μm 표준체를 통과한 퇴적물만 사용) │

│                  │                                              │

│희석 용액         │1.0 μm의 유리섬유 여과지로 여과한 멸균 해수  │

│                  │                                              │

│해수 부피         │800 mL                                        │

│                  │                                              │

│해수 교환         │없음                                          │

│                  │                                              │

│시험구별 개체수   │20 마리                                       │

│                  │                                              │

│시험농도별 반복수 │4개                                           │

│                  │                                              │

│시험생물의 크기   │300 ∼ 500 μm(표준체 기준)                   │

│                  │                                              │

│먹이 공급         │공급하지 않음                                 │

│                  │                                              │

│폭기              │용존산소 포화도가 80 % 이하일 경우에만 폭기   │

│                  │                                              │

│수질 측정         │실험시작, 중간 및 종료시에 측정               │

│                  │                                              │

│최종 측정치       │생존율                                        │

│                  │                                              │

│시험 적합도 기준  │대조구의 생존율이 90 % 이상                   │

└─────────┴───────────────────────┘

표 3. 저서성 단각류의 민감도 점검을 위한 표준독성물질 급성독성 시험조건

┌─────────┬──────────────────────┐

│항   목           │조   건                                     │

├─────────┼──────────────────────┤

│시험 방법         │비교환 정수식                               │

│                  │                                            │

│시험 생물         │저서성 단각류 Monocorophium 외              │

│                  │                                            │

│시험 기간         │4일(96시간)                                 │

│                  │                                            │

│표준독성물질      │카드뮴(pH는 중성으로 조정)                  │

│                  │                                            │

│시험 농도         │대조구, 0, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 mg/L│

│                  │                                            │

│시험 온도         │20 ± 1 °C                                 │

│                  │                                            │

│시험 염분         │30 ± 1 psu                                 │

│                  │                                            │

│광조건            │빛 차단                                     │

│                  │                                            │

│시험 용기         │250 mL 강화유리비이커                       │

│                  │                                            │

│시험 용액         │200 mL                                      │

│                  │                                            │

│희석 용액         │1.0 μm의 유리섬유 여과지로 여과한 해수     │

│                  │                                            │

│시험 용액의 교환  │교환없음                                    │

│                  │                                            │

│시험구별 개체수   │10                                          │

│                  │                                            │

│시험농도별 반복수 │4                                           │

│                  │                                            │

│시험 생물의 크기  │300 ∼ 500 μm(표준체 기준)                 │

│                  │                                            │

│먹이 공급         │공급하지 않음                               │

│                  │                                            │

│폭기              │용존산소 포화도가 80 % 이하일 경우에만 폭기 │

│                  │                                            │

│수질 측정         │실험시작과 종료 시에 측정                   │

│                  │                                            │

│최종 측정치       │생존율                                      │

│                  │                                            │

│시험 적합도 및    │대조구의 생존율이 90 % 이상이고             │

│민감도 판정 기준  │96h Cd LC50 = 0.6 ∼ 2.2 mgCd/L             │

└─────────┴──────────────────────┘

별표 0005: 해양환경공정시험기준 제정체계 표준화 지침

(별표 5)

해양환경공정시험기준 제정체계 표준화 지침

제1조(목적) 이 지침은 해양환경공정시험기준(이하 "공정시험기준"이라 한다)의 제정ㆍ개정을 위하여 분류체계, 작성체계, 단위체계 및 용어의 선택 등에 대한 표준화에 필요한 사항을 규정함을 목적으로 한다.

제2조(적용범위) 이 지침은 「해양환경관리법」제10조에 규정된 공정시험기준의 제ㆍ개정 체계의 표준화를 위해 적용한다.

제3조(용어의 정의) 이 지침에서 사용하는 용어의 정의는 다음과 같다.

  1. ‘표준화’란 정부 표준의 용어, 단위, 종류, 등급, 품질, 성능, 시험방법, 표시사항 등을 일치시키는 제반 노력을 말한다.

  2. ‘분류체계’라 함은 공정시험기준을 효과적으로 분류하기 위한 구성 및 형식을 말한다.

  3. ‘작성체계’라 함은 공정시험기준을 기술하기 위한 구성 및 형식을 말한다.

  4. ‘단위체계’ 또는 ‘단위’라 함은 같은 종류의 다른 양을 비교하여 그 크기를 나타내기 위한 기준으로 사용되는 특정량을 말한다.

제4조(분류체계) ①공정시험기준은 분석할 매체를 기준으로 다음 각 호의 어느 하나에 속해야 한다. 

  1. 해수

  2. 해저퇴적물

  3. 해양생물

  4. 해양폐기물 

  ②매체별 공정시험기준은 내용에 따라 제1장 총칙, 제2장 시료채취 및 보관, 제3장 분석자료의 통계처리와 표현방법, 제4장 항목별 시험방법으로 구분한다. 

  ③공정시험기준의 제ㆍ개정시 분류번호는 공정시험기준 제ㆍ개정 담당부서에서 부여한다.

제5조(작성체계) ①공정시험기준 제ㆍ개정 시 작성체계는 국제표준에 부합하도록 한다.

  ②공정시험기준의 각 매체별 시험기준 및 항목별 시험방법의 작성체계 및 구성내용은 표 1, 표 2에 따름을 원칙으로 한다.

  ③공정시험기준의 작성은 표 3의 시험방법의 작성기준에 따른다. 

제6조(단위체계)①공정시험기준에 사용하는 단위는 KS A ISO 80000-1 국제단위계(SI Units, The International System of Units)와 부합하도록 한다.

  ②공정시험기준에 쓰이는 단위기호의 사용과 표기방법은 표 3의 시험방법 작성기준 중 "10.0 단위기호의 사용과 표기방법"에 따른다.

제7조(용어사용)①공정시험기준에 사용하는 용어는 혼란을 방지하기 위하여 다음 각 호의 순서에 따라 적용해야 한다. 다만, 해양생물분야의 용어는 제6호와 제7호를 순서에 따라 우선 적용한다. 

   1. 대한화학회의 화학술어집 및 화합물 명명법 편수자료

   2. 한국산업표준의 분석화학용어(KS M 0124, KS M 0126, KS M 0127, KS M 0128, KS M 0129)

   3. 국립국어연구원의 표준국어사전

   4. 국립국어연구원의 외래어표기용례집

   5. 한국해양학회 해양학용어집 

   6. 한국수산학회 수산과학용어집

   7. 한국산업표준의 생물산업용어(KS J 0001)

   8. 환경관련법 등에서 보편적으로 사용되고 있는 용어

  ②제1항의 규정에 비해 보편적으로 널리 사용되는 용어가 있는 경우, 공정시험기준 제ㆍ개정 담당부서에서 이를 사용토록 할 수 있다.

[표 1]  매체별 시험기준 작성체계 및 구성내용

┌────────────────┬────────────────────────────────────┐

│중분류                          │구성내용                                                                │

├────────────────┼────────────────────────────────────┤

│  1. 총칙                       │ 목적, 적용 범위, 공정시험기준 내용, 관련 용어ㆍ단어의 정의 및 설명 등  │

├────────────────┼────────────────────────────────────┤

│  2. 시료의 채취 및 보관        │ 조사정점 선정, 시료채취 방법(채수기, 채취시기, 채취빈도 등), 시료용기, │

│                                │시료채취 시 주의사항, 채취 시료의 전처리, 시료의 보관 및 보전방법 등    │

├────────────────┼────────────────────────────────────┤

│  3. 분석자료의 통계처리와 표현 │ 분석자료의 기초통계 방법(표준편차 와 신뢰구간, 유효숫자 표시 방법 등), │

│                                │농도표시 및 단위, 정도관리 및 평가(정도관리 관련 용어의 정의 및 설명,   │

│                                │정도관리 절차, 기록의 유지 및 결과보고 방법 등) 등                      │

├────────────────┼────────────────────────────────────┤

│  4. 항목별 시험방법            │ 측정원리, 정량범위 및 정밀도, 기구 및 기기, 시약 및 표준용액, 시료의   │

│                                │보관 및 전처리(관리), 정도평가 및 관리, 시험방법, 결과보고, 분석절차    │

│                                │흐름도, 참고사항 등                                                     │

└────────────────┴────────────────────────────────────┘

┌─────────┬────────────────────────────────────────┐

│작성체계          │구성내용                                                                        │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│측정원리          │- 시험항목의 정의, 시험방법의 일반적인 소개(사용 시약 또는 이화학시험 원리 등), │

│                  │- 측정기기 및 기기원리에 대한 간단한 기술                                       │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│2. 측정범위 및    │- 정량범위, 시험방법의 검출한계 제시(단, 시험방법검출한계를 제시하지            │

│정밀도            │ 못할 경우, 기기검출한계로 제시 가능)                                           │

│                  │- 정밀도 제시                                                                   │

│                  │ 예) 기기 검출한계는 99 % 신뢰구간에서 0.05 mg C/L (4.16 μM)이며 정밀도는      │

│                  │5 mg C/L (416.2 μM)에서 ±0.08 mg C/L (6.66 μM)정도이다.                      │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│3. 방해요인       │시험과정 및 결과값에 영향을 미칠 수 있는 방해물질과 이를 제거할 수              │

│                  │있는 방법 및 점검사항 등에 대해 기술                                            │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│4. 기구 및 기기   │- 실험에 사용되는 기구 및 용기, 용기 세척방법 등 제시                           │

│                  │ 기본 시험장비인 경우에는 장비의 용도, 특별한 형태 또는 특성에 대해서만 언급    │

│                  │ 예) 자석교반기 : 시료와 시약을 혼합할 때 사용, 회전 시 열이 발생하지 않는 것   │

│                  │- 분석장비의 경우 분석기기와 요구되는 사양 및 부품에 관한 사항을 우선 서술      │

│                  │ 예) 기체크로마토그래피/질량분석기                                              │

│                  │     검출기 : 이온원은 온도를 160~300℃로 유지할 수 있을 것,                    │

│                  │              전자포획 화학음이온화이 가능한 것                                 │

│                  │     시료도입부 : splitless 등 시료의 전량을 분리컬럼내에 도입 가능한 것        │

│                  │- 상표명 사용 금지 (단, 상표명 제시가 불가피한 경우 “또는 이와 동등한”        │

│                  │ 이라는 문구 포함)                                                              │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│ 5. 시약 및       │ 5.1 시약                                                                       │

│표준물질          │- 실험에서 사용되는 초순수 혹은 증류수, 시약의 종류와 기준 등 제시              │

│                  │- 시약의 경우 시약명과 함께 괄호 안에 영문명, 분자식, 순도 등 명시              │

│                  │- 조제시약의 경우는 사용되는 시약명과 함께 분자식, 순도 등을 괄호 안에          │

│                  │ 표기하고 조제방법, 보관 방법 및 보존기간 등을 제시                             │

│                  │- 진한 산, 염기의 경우는 비중을 괄호 안에 표기                                  │

│                  │- 희석한 산, 염기용액은 희석 정도 표시                                          │

│                  ├────────────────────────────────────────┤

│                  │ 5.2 표준용액                                                                   │

│                  │- 표준시약(원액)의 농도, 순도 제시(단, 표준시약(원액)은 인정표준물질을 사용)    │

│                  │- 실험에서 사용되는 표준용액의 농도, 제조방법, 보관 방법 및 보존기간 등 제시    │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│6. 시험생물       │ (미)생물실험에 사용되는 대상 생물에 관해 기술                                  │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│7. 시료의 채취    │ 시료채취 직후 실험이 불가능 할 경우 시료의 보관법 제시                         │

│및 보관           │- 시료의 여과방법, 첨가시약 및 첨가량, pH 조건 등 실험실 실험 전 시료           │

│                  │ 전처리 방법에 대해 기술                                                        │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│8. 시험방법       │- 시료량, 첨가시약 및 첨가량, 가열온도 및 시간, 초자기구 등 기기분석            │

│                  │ 전 시료 분석방법에 대해 기술                                                   │

│                  │기본 시험장비의 사용시 실험조건을 상세히 명시                                   │

│                  │   예) 분액깔대기를 교반기에 넣고 300rpm에서 5분간 교반한다                     │

│                  │- 검량선 작성방법(바탕용액/표준용액 준비, 농도구간 등) 제시                     │

│                  │ 분석기기의 조작절차, 작동조건 등에 관한 내용을 기술                            │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│9.정도평가/정도관 │- QA(Quality Assurance)/QC (Quality Control) 수행방법과 결과(검출한계,          │

│리 (QA/QC)        │정밀도, 검량선식, 상관계수 등) 제시                                             │

│                  │- 요구되는 실험실 시설 및 환경조건 제시                                         │

│                  │- 분석기기의 교정방법 명시                                                      │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│10. 결과          │- 결과 값에 영향을 주는 인자(희석배수, 농축계수, 표준물질 회수율 등)에 대한 보정│

│                  │ㆍ환산 방법을 기술(필요에 따라 농도계산식, 검량선식, 검량선 그림 등 제시)       │

│                  │- 결과의 표기방식(유효숫자 자릿수, 농도단위 등) 제시                            │

│                  │- 결과보고 양식(분석일자. 분석자, 의뢰기관, 분석기관명 등)                      │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│11. 분석절차      │- 시험기준에 명시된 시험방법 순서대로 단계별 중요 분석절차 명시                 │

│흐름도            │- 시험단계별 첨가시약, 여과지, 시험장비 작동조건 등 간략히 작성                 │

├─────────┼────────────────────────────────────────┤

│12. 참고사항      │- 실험과정중의 주의사항 및 위험사항 등은 표시하고 설명                          │

│                  │- 시험기준의 운용과정에서 일어날 수 있는 시료 및 장비의 오염, 분석기            │

│                  │ 기의 잡음 등의 알려진 또는 잠재적인 문제들을 명시                              │

│                  │- 시약별, 폐액 등 실험 폐기물 처리방법 제시                                     │

└─────────┴────────────────────────────────────────┘

[표 2]   항목별 시험방법의 작성체계 및 구성내용

[표 3]  시험방법 작성 기준 

┌─────┬───────────────────────────────────────────────┐

│구분      │작성 기준                                                                                     │

├─────┼───────────────────────────────────────────────┤

│1. 제목   │제목(시험항목명)               │

│          │↕ 12 pt                                                                                      │

│          │소제목                         │

│          │↕ 12 pt                                                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │1. 첫 번째 소제목              │

│          │1.1 두 번째 소제목                    │

│          │1.1.1 세 번째 소제목                  │

│          │1.1.1.1 네 번째 제목                  │

│          │                                                                                              │

│          │예) 4. 세부 정도관리 절차                                                                     │

│          │    4.1 정도관리 목표값 설정                                                                  │

│          │    4.1.1 검출한계 및 정량한계                                                                │

│          │    4.1.1.1 검출한계                                                                          │

│          │    4.1.1.2 정량한계                                                                          │

│          │                                                                                              │

│          │1. 제목은 14 pt 진한 신명조체로 하고, 왼쪽정렬을 실시한다.                                    │

│          │                                                                                              │

│          │2. 첫 번째 소제목은 12 pt 진한 신명조체로 하고, 왼쪽정렬을 실시한다                           │

│          │                                                                                              │

│          │3. 두 번째, 세 번째, 네 번째 소제목은 12 pt 신명조체로 하고, 왼쪽으로부터 15 pt 띄운다.       │

│          │                                                                                              │

│          │4. 소제목간의 줄간격은 160%, 문단 위 12pt, 문단아래 3 pt의 간격으로 하고, 두 번째 소제목간    │

│          │간격은 160%, 문단 위 5pt, 문단아래 3 pt, 세 번째 소제목간 간격은 160%, 문단 위 3pt, 문단아    │

│          │래 3 pt를 기본으로 둔다.                                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │5. 항목별 시험기준 명칭은 ‘항목-분석법’ 순서로 작성한다.                                    │

│          │     예) 제32항 수은(Hg) - 냉증기원자흡광광도법                                               │

│          │         제33항 수은(Hg) - 냉증기원자형광분석법                                               │

├─────┼───────────────────────────────────────────────┤

│7.        │1. 본문은 12 pt 신명조체(장평 100% 자간 0%)로 하고, 왼쪽으로부터 15 pt 띄운다.                │

│정도평가/ │                                                                                              │

│정도관리  │2. 영문은 가능한 경우 적절한 한글로 번역하고 한글 뒤에 영어 원어 등을 괄호로 사용             │

│(QA/QC)   │할 때는 한 칸(컴퓨터에서는 1바이트) 띄운 후에 괄호를 사용하여 전체 영어단어와                 │

│          │약어를 표현하며 쉼표를 넣어 구분한다. 전체 영문단어는 고유명사가 아니면 모두 소               │

│          │문자로 표현한다. 같은 영문이 뒤에 반복되면 약어만 사용할 수 있다.                             │

│          │   예) 검출한계 (detection limit, DL)                                                         │

│          │                                                                                              │

│          │3. 시험기준의 작성 소프트웨어는 (주)한글과컴퓨터의 한글 2010 이후의 버전을 사용할             │

│          │것을 권장한다.                                                                                │

│          │                                                                                              │

│          │4. 시험기준 작성 규격은  A4 크기(210 mm×297 mm)로, 줄간격은 160%, 문단아래 3 pt의            │

│          │간격을 둔다.                                                                                  │

│          │                                                                                              │

│          │5. 본문의 여백주기는 다음과 같이 통일한다.                                                    │

│          │  ┌────┬──┬───┬──┬───┬───┬───┬───┐                            │

│          │  │        │위쪽│아래쪽│왼쪽│오른쪽│머리말│꼬리말│제 본 │                            │

│          │  ├────┼──┼───┼──┼───┼───┼───┼───┤                            │

│          │  │여백주기│20  │10    │20  │20    │0     │0     │0     │                            │

│          │  └────┴──┴───┴──┴───┴───┴───┴───┘                            │

│          │6. 각 소제목에 해당하는 내용이 없을 경우, 번호 다음 두 칸 띄우고 “내용 없음” 이라고 한다.   │

│          │   예) 4. 시약 및 표준용액 “내용 없음”                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │7. 그림은 컴퓨터 그래픽 또는 상세 도면으로 그 내용을 명확히 이해할 수 있도록 표현한다.        │

│          │                                                                                              │

│          │8. 표와 그림의 제목은 신명조 12 pt 글씨체로 표 1, 표 2, 표 3..., 그림 1, 그림 2, 그           │

│          │림 3...과 같이 사용하고 표의 제목은 표 왼쪽 위에, 그림의 제목은 그림 아래 가운데              │

│          │에 기입한다. 단, 항목별 시험기준내 표 또는 그림이 하나인 경우에는 번호를 생략할               │

│          │수 있다.                                                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │9. 본문 중에 식을 작성할 때는 본문과 한 줄을 띄우고, 가운데에 식이 오도록 작성하고            │

│          │번호는 (식 1), (식 2), (식 3)...의 식 번호를 부여한 후 오른쪽 끝에 기입한다. 만약,            │

│          │식에 기호(or 알파벳 등)를 사용한 경우에는 식 한줄 아래에 쓰인 기호(or 알파벳 등)              │

│          │및 기호(or 알파벳 등)가 의미하는 내용에 대해 반드시 식 아래에 사용 기호(or 알파               │

│          │벳 등)에 대한 설명을 해야 한다. 또한, 단위가 있는 기호(or 알파벳 등)는 괄호를 사              │

│          │용하여 단위를 명기한다.                                                                       │

│          │  예)                                                                                         │

│          │                              Ｘ + Ｙ = Ｚ                             (식 1)                 │

│          │                                                                                              │

│          │                     Ｘ = x 물질의 농도 (mol/L)                                               │

│          │                     Ｙ = y 물질의 농도 (mol/L)                                               │

│          │                     Ｚ = z 물질의 농도 (mol/L)                                               │

│          │                                                                                              │

│          │                                                                                              │

│          │10. 단위기호의 사용과 표기방법                                                                │

│          │10.1 단위기호는 SI단위(국제단위계) 사용을 원칙으로 하며, 직립체(정체)를 사용한다.             │

│          │10.2 단위기호는 복수의 경우에도 변하지 않으며, 단위기호 뒤에 마침표 등 다른 기호나            │

│          │다른 문자를 첨가해서는 안 된다.                                                               │

│          │     예) 5 sec. (×), 5 sec (×), 5 secs (×),    5 s (○)                                    │

│          │10.3 수치와 단위기호를 동시에 나타낼 때 그 사이를 한 칸(컴퓨터로서는 1바이트) 띄운            │

│          │다. 다만, 위경도를 나타내는 도 (°), 분 (′), 초 (″)에 대해서는 그 기호와 수치               │

│          │사이를 띄우지 않는다.                                                                         │

│          │     예) 35mm (×),    35 mm (○)                                                             │

│          │         32°C (×) 또는 320C (×),    32 ℃ (○)                                             │

│          │         25° 23′ (×),    25°23′27″ (○)                                                 │

│          │10.4 3자리 이상의 숫자를 표시할 경우에는 읽기 쉽도록 소수점을 중심을소 콤마(,)를              │

│          │사용하거나 세 자리씩 묶어서 그 사이를 한 칸(컴퓨터로서는 1바이트) 띄워서 쓴다.                │

│          │표시해야 하는 양이 합이나 차이일 경우는 수치 부분을 괄호로 묶고 공통되는 단위                 │

│          │기호는 뒤에 쓴다.                                                                             │

│          │     예) c = 299,792,458 m/s (빛의 속력), c = 299 792 458 m/s (빛의 속력)                     │

│          │         t = 28.4 ± 0.1 ℃ (×),    t = 28.4 ℃ ± 0.2 ℃ = (28.4 ± 0.2) ℃                 │

│          │(○)                                                                                          │

│          │10.5 두 개 이상의 단위가 나누기로 표시되는 유도단위를 나타낼 경우, 사선, 횡선 또는            │

│          │음의 지수를 사용한다.                                                                         │

│          │      예)  (○)                                                                               │

│          │10.6 어떤 양을 한 단위와 수치로 나타낼 때 보통 수치가 0.1과 1 000사이에 오도록 접             │

│          │두어를 선택한다.                                                                              │

│          │      예) 12 300 mm (×),  12.3 m (○)       0.00123 μm (×), 1.23 nm (○)                   │

│          │10.7 ppm, ppb 등은 특정 언어에서 온 약어이므로 사용하지 말고 10-6, 10-9 등을 사               │

│          │용하되 단위를 명확히 표기한다.  농도를 나타낼 때의 리터는 대문자를 사용한다.                  │

│          │      예) 2 ppm (×),  2 × 10-6 (○).   농도를 나타낼 경우 2 ppm → 2 mg/L                   │

│          │          mg/l (×), mg/ℓ (×),   mg/L (○)                                                  │

│          │          μg/ml (×), μg/mℓ (×),   μg/mL (○)                                            │

└─────┴───────────────────────────────────────────────┘

[표 3]  시험방법 작성 기준 

┌─────┬───────────────────────────────────────────────┐

│구분      │작성 기준                                                                                     │

├─────┼───────────────────────────────────────────────┤

│1. 제목   │제목(시험항목명)               │

│          │↕ 12 pt                                                                                      │

│          │소제목                         │

│          │↕ 12 pt                                                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │1. 첫 번째 소제목              │

│          │1.1 두 번째 소제목                    │

│          │1.1.1 세 번째 소제목                  │

│          │1.1.1.1 네 번째 제목                  │

│          │                                                                                              │

│          │예) 4. 세부 정도관리 절차                                                                     │

│          │    4.1 정도관리 목표값 설정                                                                  │

│          │    4.1.1 검출한계 및 정량한계                                                                │

│          │    4.1.1.1 검출한계                                                                          │

│          │    4.1.1.2 정량한계                                                                          │

│          │                                                                                              │

│          │1. 제목은 14 pt 진한 신명조체로 하고, 왼쪽정렬을 실시한다.                                    │

│          │                                                                                              │

│          │2. 첫 번째 소제목은 12 pt 진한 신명조체로 하고, 왼쪽정렬을 실시한다                           │

│          │                                                                                              │

│          │3. 두 번째, 세 번째, 네 번째 소제목은 12 pt 신명조체로 하고, 왼쪽으로부터 15 pt 띄운다.       │

│          │                                                                                              │

│          │4. 소제목간의 줄간격은 160%, 문단 위 12pt, 문단아래 3 pt의 간격으로 하고, 두 번째 소제목간    │

│          │간격은 160%, 문단 위 5pt, 문단아래 3 pt, 세 번째 소제목간 간격은 160%, 문단 위 3pt, 문단아    │

│          │래 3 pt를 기본으로 둔다.                                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │5. 항목별 시험기준 명칭은 ‘항목-분석법’ 순서로 작성한다.                                    │

│          │     예) 제32항 수은(Hg) - 냉증기원자흡광광도법                                               │

│          │         제33항 수은(Hg) - 냉증기원자형광분석법                                               │

├─────┼───────────────────────────────────────────────┤

│7.        │1. 본문은 12 pt 신명조체(장평 100% 자간 0%)로 하고, 왼쪽으로부터 15 pt 띄운다.                │

│정도평가/ │                                                                                              │

│정도관리  │2. 영문은 가능한 경우 적절한 한글로 번역하고 한글 뒤에 영어 원어 등을 괄호로 사용             │

│(QA/QC)   │할 때는 한 칸(컴퓨터에서는 1바이트) 띄운 후에 괄호를 사용하여 전체 영어단어와                 │

│          │약어를 표현하며 쉼표를 넣어 구분한다. 전체 영문단어는 고유명사가 아니면 모두 소               │

│          │문자로 표현한다. 같은 영문이 뒤에 반복되면 약어만 사용할 수 있다.                             │

│          │   예) 검출한계 (detection limit, DL)                                                         │

│          │                                                                                              │

│          │3. 시험기준의 작성 소프트웨어는 (주)한글과컴퓨터의 한글 2010 이후의 버전을 사용할             │

│          │것을 권장한다.                                                                                │

│          │                                                                                              │

│          │4. 시험기준 작성 규격은  A4 크기(210 mm×297 mm)로, 줄간격은 160%, 문단아래 3 pt의            │

│          │간격을 둔다.                                                                                  │

│          │                                                                                              │

│          │5. 본문의 여백주기는 다음과 같이 통일한다.                                                    │

│          │  ┌────┬──┬───┬──┬───┬───┬───┬───┐                            │

│          │  │        │위쪽│아래쪽│왼쪽│오른쪽│머리말│꼬리말│제 본 │                            │

│          │  ├────┼──┼───┼──┼───┼───┼───┼───┤                            │

│          │  │여백주기│20  │10    │20  │20    │0     │0     │0     │                            │

│          │  └────┴──┴───┴──┴───┴───┴───┴───┘                            │

│          │6. 각 소제목에 해당하는 내용이 없을 경우, 번호 다음 두 칸 띄우고 “내용 없음” 이라고 한다.   │

│          │   예) 4. 시약 및 표준용액 “내용 없음”                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │7. 그림은 컴퓨터 그래픽 또는 상세 도면으로 그 내용을 명확히 이해할 수 있도록 표현한다.        │

│          │                                                                                              │

│          │8. 표와 그림의 제목은 신명조 12 pt 글씨체로 표 1, 표 2, 표 3..., 그림 1, 그림 2, 그           │

│          │림 3...과 같이 사용하고 표의 제목은 표 왼쪽 위에, 그림의 제목은 그림 아래 가운데              │

│          │에 기입한다. 단, 항목별 시험기준내 표 또는 그림이 하나인 경우에는 번호를 생략할               │

│          │수 있다.                                                                                      │

│          │                                                                                              │

│          │9. 본문 중에 식을 작성할 때는 본문과 한 줄을 띄우고, 가운데에 식이 오도록 작성하고            │

│          │번호는 (식 1), (식 2), (식 3)...의 식 번호를 부여한 후 오른쪽 끝에 기입한다. 만약,            │

│          │식에 기호(or 알파벳 등)를 사용한 경우에는 식 한줄 아래에 쓰인 기호(or 알파벳 등)              │

│          │및 기호(or 알파벳 등)가 의미하는 내용에 대해 반드시 식 아래에 사용 기호(or 알파               │

│          │벳 등)에 대한 설명을 해야 한다. 또한, 단위가 있는 기호(or 알파벳 등)는 괄호를 사              │

│          │용하여 단위를 명기한다.                                                                       │

│          │  예)                                                                                         │

│          │                              Ｘ + Ｙ = Ｚ                             (식 1)                 │

│          │                                                                                              │

│          │                     Ｘ = x 물질의 농도 (mol/L)                                               │

│          │                     Ｙ = y 물질의 농도 (mol/L)                                               │

│          │                     Ｚ = z 물질의 농도 (mol/L)                                               │

│          │                                                                                              │

│          │                                                                                              │

│          │10. 단위기호의 사용과 표기방법                                                                │

│          │10.1 단위기호는 SI단위(국제단위계) 사용을 원칙으로 하며, 직립체(정체)를 사용한다.             │

│          │10.2 단위기호는 복수의 경우에도 변하지 않으며, 단위기호 뒤에 마침표 등 다른 기호나            │

│          │다른 문자를 첨가해서는 안 된다.                                                               │

│          │     예) 5 sec. (×), 5 sec (×), 5 secs (×),    5 s (○)                                    │

│          │10.3 수치와 단위기호를 동시에 나타낼 때 그 사이를 한 칸(컴퓨터로서는 1바이트) 띄운            │

│          │다. 다만, 위경도를 나타내는 도 (°), 분 (′), 초 (″)에 대해서는 그 기호와 수치               │

│          │사이를 띄우지 않는다.                                                                         │

│          │     예) 35mm (×),    35 mm (○)                                                             │

│          │         32°C (×) 또는 320C (×),    32 ℃ (○)                                             │

│          │         25° 23′ (×),    25°23′27″ (○)                                                 │

│          │10.4 3자리 이상의 숫자를 표시할 경우에는 읽기 쉽도록 소수점을 중심을소 콤마(,)를              │

│          │사용하거나 세 자리씩 묶어서 그 사이를 한 칸(컴퓨터로서는 1바이트) 띄워서 쓴다.                │

│          │표시해야 하는 양이 합이나 차이일 경우는 수치 부분을 괄호로 묶고 공통되는 단위                 │

│          │기호는 뒤에 쓴다.                                                                             │

│          │     예) c = 299,792,458 m/s (빛의 속력), c = 299 792 458 m/s (빛의 속력)                     │

│          │         t = 28.4 ± 0.1 ℃ (×),    t = 28.4 ℃ ± 0.2 ℃ = (28.4 ± 0.2) ℃                 │

│          │(○)                                                                                          │

│          │10.5 두 개 이상의 단위가 나누기로 표시되는 유도단위를 나타낼 경우, 사선, 횡선 또는            │

│          │음의 지수를 사용한다.                                                                         │

│          │      예)  (○)                                                                               │

│          │10.6 어떤 양을 한 단위와 수치로 나타낼 때 보통 수치가 0.1과 1 000사이에 오도록 접             │

│          │두어를 선택한다.                                                                              │

│          │      예) 12 300 mm (×),  12.3 m (○)       0.00123 μm (×), 1.23 nm (○)                   │

│          │10.7 ppm, ppb 등은 특정 언어에서 온 약어이므로 사용하지 말고 10-6, 10-9 등을 사               │

│          │용하되 단위를 명확히 표기한다.  농도를 나타낼 때의 리터는 대문자를 사용한다.                  │

│          │      예) 2 ppm (×),  2 × 10-6 (○).   농도를 나타낼 경우 2 ppm → 2 mg/L                   │

│          │          mg/l (×), mg/ℓ (×),   mg/L (○)                                                  │

│          │          μg/ml (×), μg/mℓ (×),   μg/mL (○)                                            │

└─────┴───────────────────────────────────────────────┘

별표 0001: 해양환경공정시험기준 개정(안) 전ㆍ후 대비표

[별지 제1호서식]

해양환경공정시험기준 개정(안) 전ㆍ후 대비표

┌──────────┬────┬────┬────┐

│공정시험기준        │개정 전 │개정 후 │개정사유│

├──────┬───┤        │        │        │

│분야        │      │        │        │        │

├──────┼───┤        │        │        │

│항목번호    │      │        │        │        │

│/시험기준명 │      │        │        │        │

├──────┼───┤        │        │        │

│연번        │페이지│        │        │        │

├──────┼───┼────┼────┼────┤

│            │      │        │        │        │

│            │      │        │        │        │

│            │      │        │        │        │

└──────┴───┴────┴────┴────┘

별표 0002: 해양환경공정시험기준 제정(개정ㆍ폐지) 신청서

[별지 제2호서식]  

해양환경공정시험기준 제정(개정, 폐지) 신청서 양식 

──────────────────────────────────────────────────

  해양환경공정시험기준 제정(개정ㆍ폐지) 신청서                                                      

──────────────────────────────────────────────────

──────────┬───────────────────────────────────────

  신청인            │① 상호(사업장 명칭)                                                          

                    │                                                                              

                    ├──────────────┬────────────────────────

                    │② 성명(법인의 경우 대표자) │③ 생년월일                                     

                    ├──────────────┴────────────────────────

                    │④주소                                                                        

                    │(전화번호:                         )                                          

──────────┴───────────────────────────────────────

──────────┬───────────────────────────────────────

  ⑤신청 분야       │                                                                              

                    │ [  ] 해수      [  ] 해저퇴적물    [  ] 해양생물      [  ] 해양폐기물         

──────────┼───────────────────────────────────────

  ⑥ 공정시험기준   │                                                                              

  (항목번호/시험명) │                                                                              

──────────┴───────────────────────────────────────

   해양환경공정시험기준 심의위원회 운영규정 제4조(제·개정의 검토) 따라 공정시험기준의 제정         

  (개정ㆍ폐지)을 신청합니다.                                                                        

                                                                         년      월       일        

       신 청 인                  (서명 또는 인)                                                     

    국립수산과학원장 귀하                                                                           

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  첨부서류│ 1. 공정시험기준 제·개정 요청서        │수수료                                        

          │ 2. 제·개정안                          │없 음                                         

          │ 3. 제·개정안 관련 자료                │                                              

─────┴────────────────────┴───────────────────────

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  작 성 방 법                                                                                       

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  1. 행정기관인 경우에는 ②란 및 ③란을 적지 아니합니다.                                            

  2. 단체인 경우에는 ②란 및 ③란에 대표자의 성명 및 생년월일(외국인은 등록번호)을 각각 적습니다.   

  3. 개인인 경우에는 ①란을 적지 아니합니다.                                                        

  4. 제정 신청인 경우에는 ⑥란을 적지 아니합니다.                                                   

──────────────────────────────────────────────────

[첨부서류]

━━━━━━━━━━━━━━━━

  공정시험기준 제·개정 요청서  

━━━━━━━━━━━━━━━━

1. 신청자 

┌─────┬┬────┬┐

│소속/직책 ││성  명  ││

├─────┼┴────┴┤

│주  소    │            │

├─────┼┬────┬┤

│E-mail    ││전화번호││

└─────┴┴────┴┘

2. 공정시험기준 제·개정 세부내용 

┌────────┬──────────────────────────────┐

│제·개정        │① 단위, 용어 등의 단순 오류                                │

│필요성          │② 국제표준과의 부합화(관련 표준의 세부명칭 및 자료 제시)   │

│                │③ 공정시험기준 타분야와의 통일성                           │

│                │④ 활용도가 떨어지는 기준에 대한 폐지, 또는 중복 기준의 조정│

│                │⑤ 기타(                                                  ) │

├────────┼────┬─────────────────────────┤

│제·개정        │신청분야│공정시험기준 항목번호 및 시험명                   │

│대상            ├────┼─────────────────────────┤

│                │        │                                                  │

├────────┼────┴─────────────────────────┤

│제·개정        │                                                            │

│요지 및 내용    │                                                            │

├────────┼──────────────────────────────┤

│제·개정에 따라 │                                                            │

│예상되는 문제점 │                                                            │

├────────┼──────────────────────────────┤

│기타 필요한 사항│                                                            │

├────────┴──────────────────────────────┤

│붙임: 1. 제·개정안  2. 제·개정 관련 연구자료                                │

└───────────────────────────────────────┘

별표 0003: 해양환경공정시험기준 심의위원회 심의의견서

[별지 제3호서식]

해양환경공정시험기준 심의위원회 심의의견서

 □ 의안번호 : 

┌─────────┬──────┬────────────┐

│공정시험기준      │제ㆍ개정(안)│제ㆍ개정(안)에 대한 의견│

├─────┬───┤            │(적합, 부적합 등 기재)  │

│분야      │      │            │                        │

├─────┼───┤            │                        │

│항목번호/ │      │            │                        │

│시험기준명│      │            │                        │

├─────┼───┤            │                        │

│연번      │페이지│            │                        │

├─────┼───┼──────┼────────────┤

│          │      │            │                        │

├─────┴───┴──────┴────────────┤

│ 종합의견                                                 │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

│                                                          │

└─────────────────────────────┘

             (심의위원)

                                         소   속 : 

                                         성   명 :                          (인)

별표 0004: 해양환경공정시험기준 소위원회 심의의견서

[별지 제4호서식]

해양환경공정시험기준 소위원회 심의의견서

□ 의안번호 : 

┌─────────┬───────────┬─────────────────────────┐

│공정시험기준      │제ㆍ개정(안) 주요내용 │제ㆍ개정(안) 검토의견(시험기준 별 적합, 부적합 등)│

├─────┬───┤                      │                                                  │

│분야      │      │                      │                                                  │

├─────┼───┤                      │                                                  │

│항목번호/ │      │                      │                                                  │

│시험기준명│      │                      │                                                  │

├─────┼───┤                      │                                                  │

│연번      │페이지│                      │                                                  │

├─────┼───┼───────────┼─────────────────────────┤

│          │      │                      │                                                  │

├─────┴───┴───────────┴─────────────────────────┤

│ 종합의견                                                                                     │

│                                                                                              │

│                                                                                              │

└───────────────────────────────────────────────┘

                                                      (심의위원)


부칙

        부칙 이 고시는 발령한 날부터 시행한다.

부칙 공포정보: 20231211 (공포번호: 2023-5)