title: Diauxie

text: Mit Diauxie (von altgriechisch δί αὕξη, "di auxe" = „zwei Wachstum“) bezeichnet man ein zweiphasiges Wachstum von chemotrophen Mikroorganismen in Gegenwart von zwei verschiedenen Energiequellen.


title: Diauxie

text: Sind zwei vom Organismus verwertbare Energiequellen gleichzeitig verfügbar, wird bei Diauxie zunächst nur eine verwertet. Dabei bleibt der Metabolismus für den Abbau der zweiten solange ausgeschaltet, bis die erste gänzlich verbraucht ist. Nach dem Abbau der ersten Energiequelle vergeht eine gewisse Zeit, bis der Metabolismus der zweiten beginnt. Daraus folgt ein kurzer Wachstumsstillstand, den man "Lag-Phase" nennt.


title: Diauxie

text: Auf physiologischer Ebene wird die Diauxie durch Katabolitrepression erklärt: Diejenige Energiequelle, deren Verwertung einfacher ist, weil dafür weniger Enzyme benötigt werden als bei der Verwertung der anderen, bewirkt eine Repression der Bildung derjenigen Enzyme, die speziell zum Abbau der zweiten Energiequelle benötigt werden. Erst wenn die erste Energiequelle verbraucht ist, wird die Bildung der für den Abbau der zweiten Energiequelle erforderlichen Enzyme induziert (sogenannte Substratinduktion). Beispielsweise werden beim Bakterium "Escherichia coli" die Glucose abbauenden Enzyme ständig produziert und unterliegen nicht der Substratinduktion. Die speziell für den Abbau von Lactose erforderlichen Enzyme werden dagegen erst dann gebildet, wenn die Glucose verbraucht ist. Deshalb erfolgt in den meisten Fällen das Wachstum mit Glucose schneller als mit anderen Zuckern (Glucose-Effekt). Auf genetischer Ebene liegt der Diauxie sowohl eine negative als auch eine positive Kontrolle zugrunde. In diesem Zusammenhang wurde das Lactose-Operon im Genom von "Escherichia coli" sehr ausführlich beschrieben.


title: Diauxie

text: Mit Lactose als Energiequelle ist bei "Escherichia coli" die Zeitdauer zwischen zwei aufeinanderfolgenden Teilungen (Verdopplungszeit) etwa doppelt so lang wie bei Glucose. Der durch Lactose ermöglichte Zuwachs an Bakterienmasse ist somit deutlich langsamer als der mit Glucose als Energiequelle.


title: Bundesstraße 216

text: Die Bundesstraße 216 (Abkürzung: "B 216") ist eine Bundesstraße in Niedersachsen. Sie beginnt an der Ostumgehung in Lüneburg-Hagen (B 4/B 209) und endet in Dannenberg (Elbe) an der B 191.


title: Bundesstraße 216

text: Lüneburg – Barendorf – Horndorf – Bavendorf – Oldendorf an der Göhrde – Göhrde – Metzingen – Riskau – Dannenberg (Elbe)


title: Bundesstraße 216

text: Die B 216 verbindet Lüneburg mit dem Landkreis Lüchow-Dannenberg.


title: Bundesstraße 216

text: Bei der 1932 eingeführten Nummerierung der Reichsstraßen wurde die Straße von Lüneburg nach Dannenberg/Elbe als Reichsstraße 216 bezeichnet.


title: Geburtsfehlertheorie

text: Die sogenannte Geburtsfehlertheorie ist eine Doktrin der deutschen Außenpolitik, die Mitte der 1960er Jahre in der Großen Koalition unter Kurt Georg Kiesinger entstand. Sie wandte sich gegen die bis dahin vorherrschende Hallstein-Doktrin.


title: Geburtsfehlertheorie

text: Die Hallstein-Doktrin hatte die Bundesrepublik seit 1955 verpflichtet, mit jedem Land die diplomatischen Beziehungen abzubrechen, das diplomatische Beziehungen mit der Deutschen Demokratischen Republik eingeht. Ziel war die außenpolitische Isolation der DDR.


title: Geburtsfehlertheorie

text: Wie sich schnell zeigte, war ein solches Vorgehen auf die Dauer nicht durchzuhalten. Daher entwickelten die Ostexperten des Auswärtigen Amts die Geburtsfehlertheorie, die konzedierte, dass die Satellitenstaaten der Sowjetunion die Beziehungen zur DDR nicht freiwillig, sondern unter sowjetischen Druck eingegangen seien. Diese Theorie unterschied also zwischen Staaten, die die DDR schon zwischen 1949 und 1955 anerkannt hatten und solchen, die dies erst später taten. Nur die zweite Gruppe habe eine Wahl zwischen den beiden deutschen Gebieten gehabt und sei daher nach der Hallstein-Doktrin zu behandeln. Den Staaten des Ostblocks sei eine Anerkennung der DDR zur Festigung des politischen Systems Osteuropas nach dem Zweiten Weltkrieg praktisch aufgezwungen worden; dies sei als eine Art „Geburtsfehler“ anzusehen, den man hinnehmen müsse.


title: Adobe After Effects

text: Adobe After Effects ist eine Compositing- und Animationssoftware des Herstellers Adobe Inc. Mit ihr lassen sich Filmaufnahmen mit computergenerierten Bildern und Effekten zusammenfügen. Das Programm ist in seiner Oberfläche und den Features sehr an Adobe Photoshop angelehnt, bietet jedoch eine Zeitleiste und die Möglichkeit, nahezu jeden Parameter durch Schlüsselbilder ("keyframes") animieren zu können.


title: Adobe After Effects

text: Mit After Effects lassen sich beispielsweise Motion-Design-Clips (Intros für TV-Sendungen, Typo-Animationen, Bumper etc.) oder aber Visual Effects für Film und Fernsehen kreieren und/oder vollenden. Insbesondere die Kombination mit 3D-Programmen wie 3D Studio Max, Maya oder Cinema 4D erlaubt es in After Effects Filmaufnahmen nachzubearbeiten und mit anderen (realen oder computergenerierten) Aufnahmen zu kombinieren. Ab der Version 9 hat man zudem auch die Möglichkeit, 3D-Objekte aus Photoshop zu importieren und jene direkt in After Effects zu bearbeiten.


title: Adobe After Effects

text: Hauptaufgaben des Programms sind das Bewegen (Animieren) von Clips in einem zwei- oder dreidimensionalen Raum und das Manipulieren von Videos durch Masken oder Effekte. Der Betrachter kann mit Hilfe einer virtuellen Kamera durch einen dreidimensionalen Raum fliegen und dafür künstliche Lichtquellen programmieren. Ziel des Programms ist die Herstellung kurzer, effektlastiger Videos, z. B. Trailer oder von Vorspännen für das Fernsehen bzw. Werbeclips.


title: Adobe After Effects

text: Die vorhandenen Funktionen können mittels Plugins erweitert werden, diese können beispielsweise neue Effekte oder Partikelsysteme beinhalten.


title: Adobe After Effects

text: Bis zur Version 7 wurde After Effects in zwei verschiedenen Versionen ausgeliefert (Standard und Professional) und ist neben Premiere Pro, Audition und EncoreDVD einer der Hauptbestandteile des neuen Adobe-Creative-Suite-Production-Studios. Ab der Version 7 hat man jedoch auf diese Zweier-Auflage verzichtet, so dass man heute nur noch die Professional-Version erwerben kann. Die Professional-Version bot gegenüber der Standardversion zusätzlich für das Compositing wichtige Features wie das Keying-Plugin Keylight, erweiterte Matte-Werkzeuge, Import von RPF-/RLA-Daten aus 3D-Programmen, Grain-Removal, einen Tracker/Bildstabilisator sowie das Plugin 3D-Invigorator für die Erstellung von 3D-Texten und Objekten, welches aber ab der Version 7 nicht mehr mitgeliefert wird.


title: Adobe After Effects

text: Bis 2003 kostete das Programm in der Professional-Version bis zu 3.000 Euro, inzwischen hat Adobe die Preise etwas gesenkt. Für Studenten gibt es eine vergünstigte Education-Lizenz der Professional-Version, die nach dem Studium weiterhin genutzt werden kann und außerdem zu Updates berechtigt ist.


title: Adobe After Effects

text: Zielgruppe des Programms sind hauptberufliche Videobearbeiter und Effektspezialisten. Dank der nun sehr umfassend integrierten 16- und 32-bit-Farbunterstützung (pro Kanal) eignet sich After Effects auch zur Nachbearbeitung von gescannten Zelluloidaufnahmen (z. B. im Kodak-Cineon-Format), die nach der Bearbeitung wieder mit hohem Kontrastumfang auf "echten" Film ausbelichtet werden sollen. Alternativen zu After Effects sind u. a. Discreet / Autodesk Combustion, Digital Fusion, Apple Shake / Motion, Nuke, sowie die "großen" Compositing-Systeme von discreet und Avid, die jedoch im Gegensatz zu After Effects größtenteils auf einen "Node"-basierten Workflow mit schematischen Ansichten statt Timelines/Compositions setzen. Die aktuelle Version ist After Effects CC. Diese Version setzt ein 64-Bit Betriebssystem voraus und ist im Gegensatz zu den vorherigen Versionen nur mehr im Abomodell verfügbar.


title: Samoa-Vorlage

text: Die Samoa-Vorlage war eine am 14. April 1880 von Otto zu Stolberg-Wernigerode für den krankheitsbedingt verhinderten Reichskanzler Otto von Bismarck in den Reichstag eingebrachte Gesetzesvorlage, die am 27. April 1880 mit 128 gegen 112 Stimmen abgelehnt wurde.


title: Samoa-Vorlage

text: Diese Vorlage sah vor, dass das Reich eine Garantie im Interesse der Disconto-Gesellschaft übernehmen sollte, die das infolge von Handelsunternehmungen in Samoa bankrotte Hamburger Handelshaus von Johan Cesar Godeffroy übernehmen sollte. Die Aktionäre dieser neu zu gründenden Auffanggesellschaft sollten durch die Staatsgarantie auf die Dauer von zwanzig Jahren mit einer jährlichen Dividende von bis zu 4,5 Prozent rechnen dürfen.


title: Samoa-Vorlage

text: Der Bundesrat stimmte der Vorlage am 15. April 1880 zu, jedoch entschied der Reichstag am 27. April schließlich anders. Dennoch kann die Samoa-Vorlage als der Beginn der offiziellen deutschen Kolonialpolitik unter Bismarck betrachtet werden.


title: Kirsten Boie

text: Kirsten Boie (* 19. März 1950 in Hamburg) ist eine deutsche Schriftstellerin und Literaturwissenschaftlerin aus Hamburg.


title: Kirsten Boie

text: Boie besuchte ab 1960 das Elise-Averdieck-Gymnasium und legte an dieser Mädchenschule das Abitur ab. Sie studierte an der Universität Hamburg Deutsch und Englisch und schloss mit dem Staatsexamen ab, bevor sie in Literaturwissenschaft über die frühe Prosa von Bertolt Brecht promoviert wurde. Von 1978 bis 1983 unterrichtete sie am Gymnasium Oldenfelde. Auf eigenen Wunsch wechselte sie an eine Gesamtschule und unterrichtete an der Gesamtschule Mümmelmannsberg in Hamburg. Dort empfand sie die Konfrontation mit den unterschiedlichen Lebensbedingungen der Schüler und die Auswirkung auf deren Entwicklung als „Schlüsselerfahrung“. Mit der Adoption ihres ersten Kindes musste sie auf Verlangen des vermittelnden Jugendamtes die Lehrertätigkeit aufgeben. Weil aber zu ihrem Lebensentwurf immer beides gehört hatte, Familie und Beruf, fing sie an zu schreiben. 1985 erschien ihr erstes Buch "Paule ist ein Glücksgriff", das sofort ein Erfolg wurde.


title: Kirsten Boie

text: Beliebt sind vor allem zahlreiche von ihr verfasste Reihen wie die "Geschichten aus dem Möwenweg", "Lena" (ein Mädchen im Grundschulalter), "Juli" (ein Junge im Kindergartenalter) oder "King-Kong". Sie hat rund einhundert Bücher veröffentlicht, die in diverse Sprachen übersetzt wurden. Viele Fortsetzungen ihrer Buchreihen entstanden nach Erhalt von Leserpost, weil ihre Leser wissen wollten, wie die Geschichten weitergehen.


title: Kirsten Boie

text: Viele ihrer Texte erschienen als Audiofassungen. Einige platzierten sich auf der hr2-Hörbuchbestenliste (u. a. "Nella-Propella", "Seeräubermoses" und "Wir Kinder aus dem Möwenweg") bzw. auf der Bestenliste des Preises der deutschen Schallplattenkritik "(Der kleine Ritter Trenk", "Alhambra)".


title: Kirsten Boie

text: Ihre Reihe "Ritter Trenk" wurde als Zeichentrickserie und Kinofilm adaptiert. Ebenso wie "Der kleine Ritter Trenk" lief "Wir Kinder aus dem Möwenweg" als Animationsserie bei KiKA.


title: Kirsten Boie

text: 2006/07 erhielt Boie einen Lehrauftrag an der Carl-von-Ossietzky-Universität Oldenburg. Seit 2017 ist sie Mitglied im PEN-Zentrum Deutschland.


title: Kirsten Boie

text: Kirsten Boie war Schirmherrin des Kinderbuchhauses in Hamburg.


title: Kirsten Boie

text: "(Chronologisch nach Reihenbeginn)"


title: Kirsten Boie

text: "(Chronologisch nach Erstveröffentlichung)"


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die quantitative Echtzeit-PCR oder engl. real-time quantitative PCR (kurz "qPCR" oder "Real Time Detection PCR", kurz "RTD-PCR") ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht und zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA ermöglicht. Die qPCR wird gelegentlich auch uneindeutig zur reversen Transkription mit nachfolgender q-PCR (im selben Ansatz) als "qRT-PCR" oder "RT-qPCR" bezeichnet.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR-Zyklus in Echtzeit (engl. "real time") erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Am Ende eines Laufs (der aus mehreren Zyklen besteht) wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen. Nur in der exponentiellen Phase der PCR (die wenige Zyklen in einem Lauf dauert) ist die korrekte Quantifizierung möglich, da während dieser Phase die optimalen Reaktionsbedingungen herrschen. Diese Methode unterscheidet sich somit von anderen quantitativen PCR-Methoden (qPCR), die erst nach Ablauf der PCR eine quantitative Auswertung (z. B. Kompetitive PCR), meist unter Einbeziehung einer gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR-Fragmente, vornehmen.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die quantitative Echtzeit-PCR kann auch für andere Zwecke verwendet werden, z. B. zur Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Merkmalsausprägungen.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Für die qPCR wird manchmal die Abkürzung RT-PCR oder qRT-PCR verwendet. Dies führt aber zu Verwechslungen, da diese Abkürzung bereits für die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die einfachste Möglichkeit der Quantifizierung der PCR-Produkte ist die Nutzung von DNA-Farbstoffen (z. B. Ethidiumbromid oder SYBR Green I). Diese Fluoreszenzfarbstoffe lagern sich in die DNA ein (interkalieren) bzw. binden an die kleine Furche der doppelsträngigen DNA ( "minor groove binder"), wodurch die Fluoreszenz dieser Farbstoffe ansteigt. Die Zunahme der gefärbten Target-DNA korreliert daher mit der Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus. Die Messung findet am Ende der Elongation in jedem Zyklus statt.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden kann. Außerdem können keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden. Den ersten Nachteil kann man ausgleichen, indem man nach abgelaufener PCR eine Schmelzkurvenanalyse durchführt, anhand derer die Fragmentlänge(n) und dadurch die Spezifität bestimmt werden kann.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird die DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50 °C → 95 °C). Bei einer für das Fragment spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der Doppelstrang zu zwei einzelsträngigen Molekülen. Dabei wird ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green I) freigesetzt und eine Änderung der Fluoreszenz registriert. Die Schmelzkurve und die Schmelztemperatur eines dsDNA-Fragmentes sind im Wesentlichen abhängig von der Länge und Basenzusammensetzung des DNA-Fragmentes. Die Schmelzkurvenanalyse kann eingesetzt werden, um Auskunft über die Spezifität der PCR-Reaktion zu erhalten. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung möglich. Eine weitere Verwendung der Schmelzkurvenanalyse ist der Vergleich und die Unterscheidung unterschiedlicher PCR-Produkte (unterschiedliche DNA-Sequenz, eventuell unterschiedliche Fragmentgröße) bezüglich ihres Schmelzverhalten. Die Darstellung der Schmelzkurve erfolgt in vielen Fällen durch das Auftragen des Absolutwertes der ersten Ableitung des Fluoreszenzsignals (y-Achse) gegen die Temperatur (x-Achse). Die dadurch dargestellten Schmelzkurven-Peaks sind charakteristisch für ein jeweiliges PCR-Produkt und die Schmelzkurvenanalyse dient somit einer qualitativen Untersuchung des PCR-Produktes. Die Höhe (oder ein anderes Merkmal) der Schmelzkurven-Peaks ist kein Parameter zur Quantifizierung der DNA-Menge.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) auszunutzen. Ein Donor-Fluorochrom (Reporter – im Zusammenhang mit TaqMan-Sonden), das durch eine Lichtquelle angeregt wird, gibt einen Teil seiner Energie an ein in ausreichender Nähe befindliches Akzeptor-Fluorochrom (bzw. einen "dark" Quencher – im Zusammenhang mit TaqMan Sonden) ab. Nimmt der Abstand zwischen Akzeptor und Donor zu, so nimmt FRET und somit das Fluoreszenzsignal des Akzeptors ab, während das des Donors zunimmt. Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, bietet aber die Vorteile der hohen Spezifität des Assays.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die einfachste Möglichkeit der Nutzung des FRET zur Quantifizierung von Nukleinsäuren besteht in der Verwendung von LightCycler-Sonden. Zwei verschiedene, jeweils mit einem FRET-Donor bzw. FRET-Akzeptor (hier Reporter) markierte Oligonukleotide, die nebeneinander an die Ziel-Sequenz binden und damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe bringen, können als Sonden für die Quantifizierung der PCR-Produkte eingesetzt werden. Die Messung findet am Ende der Annealing-Phase in jedem Zyklus statt. Auch hier kann sich eine Schmelzkurvenanalyse anschließen.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Das FRET-Prinzip kommt ebenfalls beim LoopTag-Sondensystem zum Einsatz. Dieses System besteht aus dem Vorwärtsprimer, an dessen 5‘-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und der Fluoreszenz-Akzeptor gekoppelt ist. Der andere Teil ist die Detektionssonde (LoopTag-Sonde), an die am 3‘-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und der Donor gekoppelt ist. Die LoopTag-Sonde hybridisiert mit ihrem 5‘-Ende spezifisch an der Zielsequenz und am 3‘-Ende spezifisch am verlängerten Vorwärtsprimer. Die sequenzunspezifischen Nukleotidsequenzen der Detektionssonde und des Vorwärtsprimers hybridisieren unter Ausbildung einer Sonden-Primer-Schleife miteinander und bilden einen Stamm. Durch die daraus resultierende räumliche Nähe der endständigen Farbstoffe (Donor/Sonde, Akzeptor/Primer) kann der Energietransfer erfolgen.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Eine weitere häufig genutzte Möglichkeit des FRET besteht in der Anwendung einer Sonde, die an einem Ende mit einem Quencher, am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (z. B. TAMRA und FAM) markiert wurde (Double-Dye-Oligos, TaqMan-Sonde). Wenn die Taq-Polymerase, die zusätzlich zur Polymeraseaktivität eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt, die Sonde während der Synthese des Gegenstranges am 5'-Ende abbaut, entfernen sich dadurch Quencher und Fluorophor voneinander, und eine steigende Reporter-Fluoreszenz kann gemessen werden. Die Messung findet am Ende der Elongation in jedem Zyklus statt.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Eine weitere Möglichkeit der Echtzeit-Quantifizierung von PCR-Produkten unter Ausnutzung des FRET bietet die Nutzung von Molecular Beacons als Sonden. Molecular Beacons sind Oligonukleotide, die sowohl mit einem Reporter-Fluorophor als auch mit einem Quencher gekoppelt sind. Die Nukleotide am 5'-Ende der Sonde sind zu denen am 3'-Ende komplementär, so dass sich eine für Molecular Beacons charakteristische Sekundärstruktur ausbilden kann. In diesem als "stem loop" (Haarnadelstruktur) bezeichneten Zustand zeigt der Reporter durch seinen geringen Abstand zum Quencher keine Fluoreszenz. Durch Anlagerung der Schleifen-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz während eines PCR-Zyklus wird der Abstand zwischen Quencher und Reporter vergrößert. Eine Reporter-Fluoreszenz kann somit beobachtet werden.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Scorpion-Primer sind komplexe Oligonukleotide, welche die Eigenschaften von Real-Time-PCR-Sonden und PCR-Primern in einem (Uni-Scorpion) oder zwei Molekülen (Bi-Scorpion) vereinigen. Ähnlich den Molecular Beacons besitzen sie eine charakteristische Sekundärstruktur mit einer selbstkomplementären Schaft-Region, deren Enden mit einem Reporter-Fluorophor und einem Quencher modifiziert wurden. Zusätzlich tragen diese Sonden am 3'-Ende einen PCR-Primer. Während eines PCR-Zyklus kann mit steigender DNA-Konzentration eine Reporter-Fluoreszenz durch Anlagerung der Loop-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz und damit vergrößerten Abstand zwischen Quencher und Reporter beobachtet werden.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Lux-Primer sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonucleotide, deren Fluoreszenzintensität von ihrer jeweiligen chemischen Umgebung abhängt. Werden diese Primer während einer PCR in eine DNA eingebaut, kann eine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Lanthanoid-markierte Sonden sind an ihrem 5'-Ende mit einem Lanthanoid wie Europium oder Terbium markiert und mit einem Oligonukleotid hybridisiert, das am 3'-Ende mit einem Quencher markiert ist.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Verschiedene Rechenmodelle werden für die Quantifizierung herangezogen, wobei meistens ein Referenz-Gen (z. B. GAPDH, Actin, Tubulin) mitgemessen wird, um einen relativen Menge-Vergleich durchzuführen (relative Quantifizierung). Andere, weitaus kompliziertere Methoden sollen eine absolute Quantifizierung ermöglichen, bei der die genaue Anzahl der in der Probe vorhandenen Templates bestimmt werden kann.


title: Real Time Quantitative PCR

text: In der ersten Phase der Amplifikation einer PCR ist die Templatemenge begrenzt und die Wahrscheinlichkeit, dass sich Template, Primer und Polymerase treffen nicht optimal, während in der dritten Phase der Amplifikation die Menge der Produkte (DNA, Pyrophosphat, Monophosphatnukleotide) derart ansteigt, dass es zur Hemmung durch diese kommt, häufiger Produktfragmente miteinander hybridisieren, die Substrate langsam verbraucht werden und letztlich die Polymerasen und Nukleotide durch die Hitze langsam zerstört werden. Ein exponentieller und daher quantifizierbarer Anstieg findet sich nur in der Phase dazwischen. Exponentiell bleibt eine PCR bei 12 bis 400 Ausgangskopien für ca. 30 Zyklen, bei 200 bis 3200 für 25 Zyklen und bei anfänglich 3200 bis 51200 für höchstens 20 Zyklen. Um immer am Anfang der exponentiellen Phase messen zu können, wird häufig der Ct-Wert (engl. "cycle threshold" für Schwellenwert-Zyklus) bzw. der Cp-Wert (engl. "crossing point") verwendet, der den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmals signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die Effizienz kann auf verschiedene Arten berechnet werden, die sich in ihrem Ergebnis leicht unterscheiden. Die einfachste Art ist folgende:


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die Effizienz E kann mit Hilfe der Steigung m einer Standardkurve berechnet werden. Dazu wird ein cDNA-Verdünnungsansatz (z. B. 100 %, 10 %, 1 %, 0,1 %) für eine qPCR verwendet, und die jeweiligen Ct-Werte für die grafische Erstellung einer Kurve genutzt. Eine lineare Regressionsgerade durch die Kurve besitzt die Steigung -m (bei Auftragung mit ansteigender DNA-Konzentration).


title: Real Time Quantitative PCR

text: Eine Steigung m von −3,32 würde somit eine Effizienz von 1 (100 %) bedeuten, d. h. eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus, eine Steigung von −3,58 eine Effizienz von 0,9 (90 %). Die Formel liefert sinnvolle Werte unter 100 % nur für Steigungswerte kleiner als −3,32.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Eine absolute Quantifizierung ist aufwändig und die Ergebnisse fragwürdig, daher wird diese Art der Quantifizierung selten durchgeführt. So muss u. a. die Effizienz der reversen Transkription, die zwischen 5 und 95 % liegen kann, bestimmt werden, z. B. durch Verwendung synthetisierter RNA bekannter Menge.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Hierfür wird eine interne Kontrolle benötigt. Eine interne Kontrolle kann ein Gen-Transkript sein, dessen Signal verwendet wird, um Variationen in der Ausgangsmenge der eingesetzten RNA auszugleichen. Dafür werden z. B. Haushaltsgene verwendet. Der Mengenvergleich mit den Haushaltsgenen wird als Normierung bezeichnet. Weil die Gesamtanalyse auf diesem Signal beruht, ist die Wahl der internen Kontrolle ein wichtiger Aspekt des Experiments.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die ideale interne Kontrolle ist leicht zu detektieren, und deren Expression sollte nicht während des Zellzyklus, zwischen Zelltypen oder als Antwort auf die experimentelle Behandlung (z. B. Stress, Medikamente, Krankheit) variieren.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Es besteht eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung zwischen dem Logarithmus der eingesetzten Menge und dem Ct. Ist die Ausgangsmenge bekannt, kann eine Standardkurve durch Auftragen des Logarithmus der Ausgangsmenge gegen den Ct konstruiert werden. Durch die Geradengleichung


title: Real Time Quantitative PCR

text: kann an der Standardkurve für jede unbekannte Probe der Logarithmus der Kopienzahl bestimmt werden. Alle Proben werden normiert, indem die errechnete Kopienzahl des Targetgens durch die Kopienzahl der internen Referenz geteilt wird:


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die unterschiedliche Expression zweier Proben relativ zueinander lässt sich als Quotient darstellen und ergibt eine n-fache Expression:


title: Real Time Quantitative PCR

text: Die unterschiedliche Expression wird als n-fache Expression mit Hilfe des ΔΔCt-Wertes angegeben. Wichtig bei diesem Verfahren ist eine gleiche Effizienz der beiden beteiligten PCR-Reaktionen. Es werden hierbei zunächst die Ct-Werte von Zielgen und Referenz voneinander abgezogen (ΔCt), um anschließend die Differenz zwischen den beiden ΔCt-Werten der einzelnen Gruppen (z. B. krank/gesund, mit/ohne Wirkstoff) zu bilden (ΔΔCt-Wert). Der dadurch erhaltene Wert wird in die Gleichung n-fache Expression (Gruppe A zu Gruppe B) = 2 eingesetzt.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Um die Genauigkeit der relativen Quantifizierung zu verbessern, sind verschiedene, teils auf der ΔΔCt-Methode basierende Ansätze entwickelt worden.Vorteile dieser neuen, überwiegend noch nicht marktreifen Methoden liegen in der genaueren Analyse und geringeren Varianz der PCR-Ergebnisse. Bei einigen Methoden wird die Effizienz in jedem einzelnen Probenansatz berücksichtigt und ermöglicht so eine "single tube"-Analyse.


title: Real Time Quantitative PCR

text: Ein Experiment ist wertlos, wenn man es nicht wiederholen kann. Hierfür ist es absolut notwendig die Versuchsbedingungen konstant zu halten. Dabei ist hier nicht nur die Konsistenz der Assay-Qualität (Primer, Sonden, Polymerase, Puffer etc.) zu berücksichtigen, auch die Geräte müssen den Anforderungen genügen. Beispielsweise ist bei Block-Systemen (96- oder 384-Wells) die so genannte Homogenität das große Kriterium. Die Assays müssen in jedem Well des Blocks und zudem auf Blöcken baugleicher Geräte gleich gut laufen. Weiterhin darf sich im zeitlichen Verlauf diese Homogenität nicht verändern. Um sicherzustellen, ob man mit dem Gerät im Labor sichere Experimente durchführen kann, sollte man in regelmäßigen Abständen entsprechende Kontrollen durchführen (einige Modelle neigen extrem zum Altern). Dabei wird ein Assay in vielen Replikaten über den gesamten Block verteilt analysiert. Das Ergebnis sollte im Idealfall überall gleich sein. Jetzt sollte dem Experimentator bewusst sein, inwieweit Abweichungen auch relevante Auswirkungen haben können. Diese Abweichungen lassen sich nicht mittels teurer Wiederholungen ausgleichen, da diese ebenso konstant wiederholt werden würden.


title: Wachstafel

text: Die Wachstafel (lateinisch "tabula cerata") ist eine in der Regel hochrechteckige Schreibtafel aus Holz (auch aus Elfenbein oder Metall), die ein- oder beidseitig mit Wachs beschichtet ist. Sie war von der Antike bis in das Mittelalter verbreitet, in wenigen Regionen sogar bis zum Anfang des 20. Jahrhunderts in Gebrauch. Die Schrift wurde mit einem Griffel (Stilus) in die Wachsfläche eingekratzt.


title: Wachstafel

text: Mehrere Wachstafeln konnten mit einfachen Scharnieren zu einem Wachstafelbuch (Kodex) verbunden werden. Ein zweiteiliges Wachstafelbuch wird als Diptychon, ein dreiteiliges als Triptychon, ein vielteiliges als Polyptychon bezeichnet. Diese Bezeichnungen werden ebenso auf Kodizes aus ungewachsten Tafeln angewandt.


title: Wachstafel

text: Wachstafeln waren schon früh bei antiken Griechen, Römern und Etruskern in Gebrauch. Die früheste Erwähnung eines Wachstafeldiptychon findet sich im 5. Jahrhundert v. Chr. beim griechischen Historiker Herodot. Bereits der Dichter Homer lässt in der Ilias (8. oder 7. Jahrhundert v. Chr.) eine Botschaft in einem Diptychon übermitteln, erwähnt aber nicht das Material der Schreibfläche. In der Geschichte des Bellerophon gibt ihm Proitos, der König von Tiryns, der ihn des Ehebruchs mit seiner Gattin Anteia verdächtigte, eine Tafel mit, die seinen Schwiegervater auffordert, ihn zu töten:


title: Wachstafel

text: Hölzerne Schreibtafeln aus jüngerer Zeit wurden an der Westküste Kleinasiens gefunden.


title: Wachstafel

text: Wachstafeln wurden in der Antike für Aufzeichnungen beinahe jeder Art verwendet: Notizen, Schularbeiten, Rechnungen und andere Geschäftsunterlagen. Wachstafelbücher konnten versiegelt werden und eigneten sich daher als Brief, der vom Empfänger gelöscht (vgl. Stilus) und auf derselben Wachsfläche beantwortet werden konnte (Belege u. a. bei Cicero, Seneca, Augustinus). Originale Wachstafeln sind in großer Zahl gefunden worden. Solche mit erhaltener Beschriftung stammen u. a. aus den vom Vesuv 79 n. Chr. verschütteten Städten. In Pompeji fanden sich 153 Wachstafeln mit geschäftlichen Aufzeichnungen des Bankiers Lucius Caecilius Iucundus. Nicht weit von Pompeji, in Murecine, sind die Wachstafeln einer weiteren Bankiersfamilie ausgegraben worden. Diese Schriftstücke sind wichtige Zeugnisse der römischen Rechts- und Wirtschaftsgeschichte. Auch literarische Texte sind auf Wachstafeln überliefert: auf Wachstafeln des 3. Jahrhunderts n. Chr. aus Palmyra (Syrien) in der Universität Leiden (Niederlande), den nach ihrem Entdecker H. van Assendelft de Coningh sogenannten Tabulae Assendelftianae, sind Ausschnitte aus dem Werk des Fabeldichters Babrios (2. Jahrhundert n. Chr.) erhalten.


title: Wachstafel

text: In der Spätantike können Diptychondeckel aus Elfenbein mit figürlichen Schnitzereien von hohem künstlerischem Wert verziert sein. Sie waren als wertvolle Geschenke beliebt. Insbesondere die Konsuln pflegten derartige Kostbarkeiten bei Amtsantritt zu verschenken (sog. Konsulardiptychen). Zahlreiche Elfenbeindiptychen der Spätantike sind erhalten geblieben, weil sie im Mittelalter als Bucheinbände wiederverwendet wurden.


title: Wachstafel

text: Kirchenhistorisch wurden im Mittelalter Wachstafeln (hier: "Diptycha ecclesiastica") benutzt, um Namenslisten von Lebenden und Verstorbenen zu führen, für die gebetet oder deren gedacht wurde.


title: Wachstafel

text: Einige mittelalterliche Belege für Wachstafelbücher (dann häufig mit halbrundem oberen Teil) finden sich beispielsweise in der Manessischen Liederhandschrift; exemplarisch soll hier auf die Darstellung des Gottfried von Straßburg in derselben verwiesen sein.


title: Wachstafel

text: Meist bestanden Wachstafelbücher aus Buchen- oder Pinienholz, seltener aus Eiche oder Ahorn. Luxusexemplare bestanden aus Elfenbein, Gold, Silber oder anderen Metallen. Es wird vermutet, dass das englische „book“ auf das angelsächsische „boc“ (Buche) zurückzuführen ist.


title: Wachstafel

text: In die eigentliche Tafel war auf einer oder auf beiden Seiten eine der Tafelform folgende Vertiefung geschnitten. Diese Vertiefung war bei erhaltenen Funden zwischen einem und drei Millimetern tief und zumeist mit Rillen oder Einkerbungen am Boden der Vertiefung versehen. Diese meist rautenförmig angeordneten Rillen am Boden hatten den Sinn, das Wachs besser in der Vertiefung haften zu lassen.


title: Wachstafel

text: Die Tafeln selbst wurden häufig einfach rechteckig oder mit einer halbrunden Oberseite hergestellt. Einfache Versionen trugen keine oder kaum Verzierungen, andere waren auf der Außenseite reich verziert (insbesondere Schnitzereien), bei Prunkstücken hin bis zu Einlegearbeiten aus Bein oder Elfenbein oder Beschlag mit Blattgold.


title: Wachstafel

text: Aus praktischen Gesichtspunkten (um die Wachsschicht und das Geschriebene zu schützen) wurden in der Regel zwei, in selteneren Fällen auch mehr Tafeln wie zu einem Buch zusammengebunden. Dabei wurden die Tafeln so miteinander verbunden, dass die mit Wachs versehenen Seiten der Wachstafeln aufeinander zu liegen kamen. Die Verbindung der einzelnen Tafeln wurde im einfachsten Fall durch zum Beispiel eingebohrte und eingeklebte Lederbänder oder aufgenagelte Lederstreifen als Scharnier hergestellt, in aufwändigeren Fällen auch durch Metallscharniere.


title: Wachstafel

text: Die Größe der Wachstafelbücher variierte von kleinen, zum Beispiel ca. A6 großen „Notizbüchlein“, die auch als solche genutzt und dementsprechend mit herumgetragen wurden. Andere, eher stationär genutzte Exemplare, wie die oben erwähnten "Diptycha ecclesiastica", erreichten nahezu A3-Größe und bestanden zum Teil aus mehr als 20 „Seiten“.


title: Wachstafel

text: Bei kleineren Exemplaren wurde in einigen Fällen offenbar eine Rille in die das Wachs umgebende Einfassung geschnitten, um im zusammengeklappten Zustand den Stilus aufzunehmen, der durch das Schließen des Wachstafelbuches dann auch nicht mehr herausfallen konnte.


title: Wachstafel

text: Einige Exemplare wurden auch mit Kerben für eine Schnürung versehen. Durch eine Verschnürung konnten die Wachstafelbücher auch wie ein Brief verschickt werden. Die Schnürung konnte noch versiegelt werden, wobei insbesondere in römischer Zeit Siegelkapseln als Schutz für das Siegel fungierten.


title: Wachstafel

text: "Beispiel:" Nowgoroder Kodex


title: Wachstafel

text: Bienenwachs wurde erhitzt und mit weiteren Zusätzen vermengt, welche die Viskosität des Wachses verbesserten, bzw. einem ungewollten Verflüssigen des Wachses bei hochsommerlichen Temperaturen vorbeugten. Hierzu wurden dem Wachs zum Teil mehrere weitere Zusätze beigegeben, zum Beispiel Leinöl, Talg oder Terpentin, sowie Baumharz oder seltener auch Holzteer.


title: Wachstafel

text: Eine typische Zusammensetzung einer Wachsmischung war


title: Wachstafel

text: Als Färbemittel für das Wachs wurde zumeist Ruß (schwarze bis tiefschwarze Färbung) oder Birkenpech, seltener aber auch Farbpigmente für dunkelgrüne Färbungen oder beispielsweise Auripigment (für eine tiefgelbe Färbung) verwandt. Vorherrschend waren jedoch dunkle Färbungen.


title: Wachstafel

text: Die noch flüssige Wachsmischung wurde hiernach zum Erkalten in die Vertiefungen der Tafeln eingefüllt. Zum Auftragen des Wachses und zum Glätten der gesamten Oberfläche auch nach ausführlichem Gebrauch konnten Wachsspachtel verwendet werden.


title: Wachstafel

text: Der Stilus für eine Wachstafel ist ein einfacher Stift, der an einer Seite angespitzt ist und am hinteren Ende eine T-förmige Verbreiterung oder eine spachtelartige Abflachung besitzt, mit der eine beschriebene Wachstafel wieder glattgezogen und das Geschriebene somit ausgelöscht werden konnte.


title: Wachstafel

text: Der Stilus wurde aus Knochen, Elfenbein oder Metall hergestellt, seltener auch aus Glas oder verschiedenen Hölzern. Für die römische Zeit überwiegen Funde aus Eisen (zum Teil mit Buntmetalleinlagen), Bronzestili und Knochenstili scheinen weitaus seltener. Holzstili sind kaum in Funden nachweisbar – das kann aber mit schlechteren Erhaltungschancen zusammenhängen.


title: Volvulus

text: Als Volvulus, allgemein auch Darmverschlingung oder Darmverdrehung genannt, versteht man in der Medizin eine Drehung eines Abschnittes des Verdauungstraktes um seine mesenteriale Achse. Durch die Drehung wird die Blutversorgung zum betroffenen Abschnitt des Verdauungstraktes, die im Mesenterium verläuft, eingeschränkt. Es kann zum Darmverschluss bis hin zum Untergang des betroffenen Abschnittes (Darmgangrän) kommen. Ein Verdacht auf einen akuten Volvulus im Kindesalter stellt aus diesem Grund einen kinderchirurgischen Notfall dar.


title: Volvulus

text: Am häufigsten tritt er an Caecum und Sigmoid auf. Im Dünndarmbereich tritt der Volvulus meist als Folge einer Malrotation auf.


title: Volvulus

text: Im Kindesalter findet man in allen Altersgruppen eine gleiche Inzidenz, allerdings sind bei Neugeborenen unter 30 Tagen Komplikationen im Sinne eines Darmunterganges (Gangrän) häufiger.


title: Volvulus

text: Der Volvulus kann bereits vorgeburtlich auftreten. Aus einer derartigen Situation kann dann aufgrund des Unterganges von Darmanteilen eine Darmatresie resultieren. Die Diagnose wird anhand der Klinik und Röntgenaufnahmen des Abdomens (ggf. mit Kontrastmittel), neuerdings auch mittels Ultraschall, gestellt. Die Diagnosefindung insbesondere im Neugeborenenalter kann schwierig sein, da die Klinik lediglich eine Schwellung des Bauches zeigt, und das Röntgenbild unspezifisch sein kann.


title: Volvulus

text: Beim Volvulus des Colon sigmoideum findet sich bedingt durch eine massive Überblähung dieses Darmanteils häufig ein so genanntes Kaffeebohnenzeichen (engl. Coffee-bean sign), bei dem eine aufsteigende Schlinge dicht an eine absteigende gelegt ist, so dass sich die Kontur einer übergroßen Kaffeebohne ergibt. Bei bereits stattgehabter Perforation findet sich im Röntgenbild so genannte „freie Luft“.


title: Volvulus

text: Die Diagnose eines chronisch-rezidivierenden Volvulus kann sich ebenfalls als sehr schwierig erweisen, da sie nur im akuten Schub gestellt werden kann.


title: Volvulus

text: Wichtigste Differentialdiagnose zum akuten Volvulus ist die Invagination.


title: Volvulus

text: Die Behandlung besteht in der schnellstmöglichen Wiederherstellung der richtigen Lage des entsprechenden Darmabschnittes. Bei Verdacht auf Volvulus (außer Sigmoid – s. u.) erfolgt eine zügige Operation, da bei bestehender Unterversorgung mit Blut ein rascher Untergang dieses Abschnittes des Verdauungstraktes erfolgen kann. Der wieder zurückgedrehte Darm oder Magen beim Magenvolvulus wird ggf. noch fixiert. Sind Teile bereits so geschädigt, dass mit einer Wiederherstellung der Funktion nicht zu rechnen ist, werden diese Anteile entfernt. Gegebenenfalls muss vorübergehend ein Enterostoma angelegt werden.


title: Volvulus

text: Bei einem Volvulus des Sigmoids ohne Peritonitis kann die Derotation mit einer vorsichtig über den After eingebrachten Sonde und einem Einlauf versucht werden. Ist dies nicht erfolgreich, erfolgt ebenfalls eine Operation.


title: Volvulus

text: Bei nachgewiesenem chronischem Volvulus kann versucht werden, mittels Operation den betroffenen Abschnitt des Verdauungstraktes ziehharmonikaartig zu falten und die Falten mit Nähten zu fixieren (Dünndarmplikation nach Noble) bzw. die gefalteten Schlingen mit Nähten (etwa nach der Methode von Childs) am Mesenterium zu fixieren.


title: Volvulus

text: Insbesondere beim Vorliegen eines akuten Dünndarmvolvulus kann es zum Untergang größerer Darmanteile kommen, die zu einem Kurzdarmsyndrom mit unter Umständen lebenslangen Folgen führen kann.


title: Leichtschaumgenerator

text: Ein Leichtschaumgenerator (auch Leichtschaumgerät) dient der Erzeugung von Leichtschaum als Löschmittel für die Bekämpfung von Bränden durch die Feuerwehr. Das Gerät besteht aus einem Lüfter ähnlich einem Überdruckbelüfter, einem Wasserzugang und einer Lutte, mit dem man den Leichtschaum verteilen kann. Neuerdings existiert auch eine Variante, bei der nur die Luft vom Ventilator durch die Lutten gedrückt wird, erst am Ende dieser Leitung befindet sich das Gerät zur Schaumerzeugung (Sieb und Anschluss Schaummittel-Wasser-Gemisch).


title: Leichtschaumgenerator

text: Wegen der extrem hohen Verschäumungszahl von Leichtschaum lässt sich nicht mehr das bei Schwer- und Mittelschaumrohren angewandte Injektorprinzip durchführen, vielmehr ist dazu ein spezielles Aggregat, der sogenannte „Leichtschaumgenerator“, erforderlich.


title: Leichtschaumgenerator

text: Über einen handelsüblichen Zumischer, der im Allgemeinen mit einem Gerät verbunden ist, wird ein Wasser- /Schaummittel-Gemisch hergestellt und dann einem Düsensystem zugeführt. Die Düsen sprühen das Gemisch auf ein grobmaschiges Siebgewebe, das zwecks Vergrößerung seiner Fläche auch im Zick-Zack verspannt sein kann. Die auf das Gewebe auftreffenden Flüssigkeitströpfchen bilden aufgrund ihrer geringen Oberflächenspannung zwischen den Gewebemaschen feine Häutchen, die aber sogleich durch einen kräftigen, gegen das Gewebe gerichteten Luftstrom in Form von Schaumbläschen abgelöst werden. Der Vorgang entspricht genau dem Prinzip des bekannten, aus einem kleinen gestielten Ring bestehenden Kinderspielzeuges, mit dem sich nach Benetzen mit Seifenlösung durch Gegenpusten Seifenblasen erzeugen lassen.


title: Leichtschaumgenerator

text: Beim Leichtschaumgenerator wird der Luftstrom durch einen motorgetriebenen Ventilator erzeugt. Der Luftstrom drückt den Schaum über großdimensionierte Schläuche, sogenannte Lutten, von 700 bis 2.500 mm Ø zur Verbrauchsstelle. Das Angebot an Leichtschaumgeneratoren verschiedener Art und Größe ist im Augenblick so umfangreich, dass an dieser Stelle nur ein allgemeiner Überblick gegeben werden kann. Die angegebenen Verschäumungszahlen liegen bei 1.000, seltener bei 500 bzw. 333. Verschiedene Generatoren sind auch (mittels Zusatzgerät) von VZ 1.000 auf 500 bzw. 333 umstellbar. Die Durchflussmengen gehen von 50 über 100, 180, 200, 400, 450 bis 600 l/min und sind bei einzelnen Geräten auch variierbar. Als Antriebsaggregate für das Gebläse (Ventilator) wird häufig ein Elektromotor, ein Ottomotor, ein Dieselmotor und in seltenen Fällen auch ein Wassermotor verwendet. Leichtschaumgeneratoren werden als tragbare, als Karren fahrbare, auf Anhängern montiert oder ortsfest installierte Geräte geliefert.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle Form der Lichtmikroskopie. Sie beruht auf dem physikalischen Effekt der Fluoreszenz. Wenn fluoreszierende Stoffe mit Licht bestimmter Wellenlängen angeregt werden, strahlen sie Licht anderer, längerer Wellenlängen ab (Stokes-Verschiebung).


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird das erzeugte, vergrößerte Bild des untersuchten Objekts nur durch abgestrahltes (emittiertes) Licht erzeugt. Farbfilter verhindern, dass Anregungslicht auf das Bild gelangt. Fluoreszenzmikroskopische Bilder sind dann informativ, wenn nicht das ganze mikroskopische Präparat gleichmäßig fluoresziert, sondern wenn nur einige Strukturen leuchten. Diese Strukturen erzeugen helle Signale vor dunklem Hintergrund.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Jedes fluoreszierende Molekül im Präparat kann dabei als neue Lichtquelle angesehen werden. Liegt die Intensität der von diesen Molekülen abgestrahlten Fluoreszenz über der Nachweisgrenze, können mit der Fluoreszenzmikroskopie auch Strukturen nachgewiesen werden, die weit kleiner sind als die Auflösungsgrenze des Mikroskops. Die Auflösungsgrenze wird bei der klassischen Fluoreszenzmikroskopie aber nicht überwunden, da bei kleinem Abstand zwar ein Nachweis möglich ist, aber keine Aussage darüber, ob das Signal von einer oder von mehreren Strukturen hervorgerufen wird. In dieser Hinsicht besteht Ähnlichkeit zur Dunkelfeldmikroskopie.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Neben der klassischen gibt es zahlreiche weiterentwickelte Spezialformen der Fluoreszenzmikroskopie. Hierzu gehören beispielsweise die konfokale Laserscanningmikroskopie und die Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie. Ab den 1990er-Jahren wurden verschiedene Verfahren entwickelt, die tatsächlich eine deutlich verbesserte Auflösung ermöglichen. Diese sogenannten Höchstauflösungs- oder Superresolution-Verfahren sind ebenfalls fluoreszenzmikroskopischer Art.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ein fluoreszierendes Molekül hat ein Elektron, das durch Absorption eines Photons von einem energiearmen "Grundzustand" (S) in einen energiereicheren, "angeregten Zustand" (S) übergehen kann. Sowohl S als auch S haben mehrere Unterzustände, die sich jeweils im Gehalt der Schwingungsenergie (auch: Vibrationsenergie) des Elektrons unterscheiden. Der Energieunterschied zwischen dem Ausgangs-Schwingungszustand innerhalb von S und dem erreichten Schwingungszustand in S entspricht genau dem Energiegehalt des absorbierten Photons.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Fällt das Elektron auf einen Grundzustand zurück, wird ein Photon ausgesendet. Diese Lichtemission erfolgt wenige Nanosekunden nach der Absorption – das ist die Fluoreszenz. Damit sie zustande kommt, muss zwischen S und S ein deutlicher Unterschied im Energiegehalt liegen und es dürfen keine weiteren Energieniveaus dazwischen liegen, da angeregte Elektronen sonst über nichtstrahlende Prozesse in den Grundzustand zurückkehren.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Da sowohl der Grundzustand S als auch der angeregte Zustand S mehrere Unterzustände haben, können nicht nur Photonen mit genau einem bestimmten Energiegehalt absorbiert oder emittiert werden, sondern auch Photonen mit ähnlichen Energiegehalten. Da sich der Energiegehalt eines Photons umgekehrt proportional zu seiner Wellenlänge verhält, bedeutet das, dass ein fluoreszierender Stoff durch einige ähnliche Wellenlängen angeregt wird: Man spricht vom "Anregungsspektrum". Genauso strahlt er einige ähnliche Wellenlängen ab, das "Emissionsspektrum".


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Das Abstrahlen der Fluoreszenz geschieht grundsätzlich vom niedrigsten angeregten Energieniveau aus (Kasha-Regel). Wird das Elektron durch die Absorption des Anregungsphotons auf einen höheren angeregten Zustand gehoben, so gelangt es zunächst durch nichtstrahlende Energieabgabe auf das niedrigste angeregte Energieniveau, bevor es zur Emission eines Photons kommt. Dies hat für die Fluoreszenzmikroskopie mehrere wichtige Konsequenzen:


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Stoffe, die fluoreszieren, werden als Fluorophore bezeichnet. Fluorophore, die verwendet werden um Präparate anzufärben, werden als Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluorochrome bezeichnet. Wenn ein Präparat von selbst fluoresziert, wird dies als Autofluoreszenz, Eigenfluoreszenz oder Primärfluoreszenz bezeichnet. Viele Pflanzen haben in verschiedenen Teilen sehr starke Autofluoreszenz, zum Beispiel Samenpflanzen in den hölzernen Teilen ihrer Sprossachsen. Das Chlorophyll in den Chloroplasten der grünen Pflanzenzellen ist stark rot fluoreszierend. Tierische Zellen fluoreszieren im Vergleich dazu nur schwach, jedoch noch stark genug, um Fluoreszenzmarkierungen unter Umständen zu verschleiern. Die Hauptquellen hier sind Flavine, die in den Mitochondrien vorkommen und Lipofuscin in den Lysosomen. Das Coenzym NADPH zeigt ebenfalls Autofluoreszenz.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Eine in einem Präparat mit Fluorochromen künstlich erzeugte Fluoreszenz ist eine Sekundärfluoreszenz. Der Prozess, der dazu führt, heißt Fluoreszenzmarkierung. Gute Fluorochrome vereinigen mehrere Eigenschaften: (1) Sie haben eine hohe Wahrscheinlichkeit ein Photon zu absorbieren, das heißt, sie haben einen hohen Absorptionskoeffizienten. (2) Die meisten der absorbierten Photonen führen tatsächlich zur Emission eines Flureszenzphotons (hohe Quanteneffizienz). Beides zusammen führt zu einer großen Helligkeit. (3) Fluorochrome sollten ein geringes Bleichen aufweisen, das heißt, dass sie sich oft anregen lassen, ohne zerstört zu werden. (4) Außerdem sollten Fluorochrome in einem möglichst schmalen Bereich des Lichtspektrums fluoreszieren, damit möglichst viele Fluorochrome mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben gleichzeitig verwendet werden können, um unterschiedliche Strukturen anzufärben.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Wenn sich die Anregungs- und Emissionsspektren zweier Fluorochrome stark überlappen, dann können diese nicht voneinander unterschieden werden. Beispielsweise haben Fluorescein, Grün fluoreszierendes Protein, Spectrum Green und eine Reihe weiterer kommerziell erhältlicher Farbstoffe sehr ähnliche Spektren, so dass sie anhand ihrer Fluoreszenzfarbe nicht unterschieden werden können. Wenn verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe nebeneinander eingesetzt werden sollen, um verschiedene Strukturen anzufärben, müssen diese Farbstoffe unterschiedliche Spektren haben. Typischerweise regt UV-Licht blau fluoreszierende Fluorochrome an, blaues Licht grüne Fluorochrome und grünes Licht rote Fluorochrome. Diese drei Farbkanäle lassen sich also verwenden, um im gleichen Präparat unterschiedliche Strukturen darzustellen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Damit ist die Zahl der gleichzeitig nachweisbaren Farben jedoch nicht erschöpft. Acht verschiedene Fluorochrome wurden bereits parallel eingesetzt. Dazu verwendete man DAPI als blau fluoreszierende Gegenfärbung für DNA sowie sieben weitere Farbstoffe, die an Gensonden für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekoppelt wurden: Diethylaminocoumarin (Deac), Spectrum Green und die Cyanin-Farbstoffe Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 und Cy7. Die meisten Fluoreszenzmikroskope haben drei bis fünf Farbkanäle.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei der „normalen“ Lichtmikroskopie, der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie, wird das Bild durch Licht erzeugt, welches das Präparat durchstrahlt. Dies ist bei der Fluoreszenzmikroskopie nicht der Fall. Hier wird das Bild durch Fluoreszenzlicht erzeugt, das erst im Präparat entsteht. Das Anregungslicht, welches das Präparat bestrahlt, wird dagegen durch spezielle Filter von der Bilderzeugung ausgeschlossen. Da sich Fluoreszenzlicht unter normalen Bedingungen gleichmäßig in alle Raumrichtungen ausbreitet, ist es daher grundsätzlich egal, ob das Anregungslicht von oben, von unten oder von der Seite kommt. Tatsächlich wurden alle drei Varianten umgesetzt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Zu Beginn der Fluoreszenzmikroskopie, in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts, wurden Durchlicht-Fluoreszenzmikroskope gebaut. Sie sind heute nur noch von historischem Interesse (siehe Abschnitt Geschichte unten). Durch die Verfügbarkeit Dichroitischer Spiegel (auch: dichroitischer Strahlteiler) wurde es ab etwa 1970 möglich, Auflicht-Fluoreszenzmikroskope zu bauen, bei denen das Anregungslicht über das Objektiv in das Präparat eingestrahlt wird. Sie werden auch Epifluoreszenzmikroskope genannt, nach griechisch für „auf“. Seit Ende des 20. Jahrhunderts wird dieser Bautyp fast ausschließlich verwendet. Die seitliche Beleuchtung findet bei einem spezialisierten Fluoreszenzmikroskop Anwendung, dem Lichtscheibenmikroskop (siehe unten).


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Im Vergleich zu Durchlicht-Hellfeldmikroskopen haben Epifluoreszenzmikroskope eine zusätzliche Auflicht-Beleuchtungsachse für das Fluoreszenz-Anregungslicht. Das zu beobachtende Objekt wird durch das Objektiv beleuchtet. Die folgende Nummerierung bezieht sich auf die Schemazeichnung.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die drei genannten Filter sind in heutigen Fluoreszenzmikroskopen oft in einen gemeinsamen Block eingebaut. Dieser befindet sich bei aufrechten Mikroskopen in der optischen Achse über dem Objektiv. Bei inversen Fluoreszenzmikroskopen befindet er sich entsprechend unter dem Objektiv. Bei Geräten mit Unendlich-Optik liegt er im Unendlichraum zwischen Objektiv und Tubuslinse. Die Erzeugung der Fluoreszenz im Präparat ist kein effektiver Prozess: Nur ein Bruchteil des Anregungslichts wird von den Fluoreszenzfarbstoffen absorbiert. Um trotzdem helle, mit dem Auge sichtbare Signale erzeugen zu können, sind daher sehr hohe Leuchtstärken erforderlich.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Typischerweise sind Fluoreszenzmikroskope mit Quecksilberdampflampen, Halogenmetalldampflampen, Xenon-Gasentladungslampen oder, seit dem 21. Jahrhundert, mit LED-Lampen ausgestattet. Die meisten Lichtquellen leuchten über das gesamte sichtbare Spektrum sowie im ultravioletten Bereich. Die für das jeweils zu untersuchende Fluorochrom erforderlichen Wellenlängen werden durch einen entsprechenden Filter ausgewählt und alle anderen unterdrückt. Während früher Farbfilter aus gefärbtem Glas zum Einsatz kamen, werden heute oft Interferenzfilter verwendet. Interferenzfilter sind jedoch deutlich teurer, so dass gefärbtes Glas immer noch zur Anwendung kommt. Für Anregungs- und Emissionsfilter können beide Typen verwendet werden. Der dichroitische Strahlteiler kann nur als Interferenzfilter hergestellt werden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Interferenzfilter bestehen aus einer Glasscheibe, auf die mehrere dünne Materialschichten aufgetragen werden. Zwischen den Schichten entstehen Interferenzen, so dass bestimmte Wellenlängen durchgelassen werden, andere aber gespiegelt werden. Im Gegensatz zu farbigem Glas wird das Licht also nicht absorbiert. Durch die Wahl geeigneter Materialien und Schichtdicken können Filter für unterschiedliche Wellenlängen hergestellt werden. Licht, das in unterschiedlichen Winkeln auf Interferenzfilter auftrifft, legt unterschiedlich lange Strecken in den jeweiligen Schichten zurück. Daher ändern sich die Filtereigenschaften in Abhängigkeit vom Einfallswinkel des Lichts. Ein Interferenzfilter muss deswegen im vorgesehenen Winkel im Mikroskop eingebaut werden, um richtig zu funktionieren.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Von der Funktionsweise her werden Kurzpass-, Langpass- und Bandpass-Filter unterschieden. Kurzpassfilter lassen Licht "bis zu" einer bestimmten Wellenlänge durch. Ein KP480 würde also Licht bis zu 480 nm durchlassen und Licht längerer Wellenlängen blockieren. Im Gegensatz dazu lassen Langpass-Filter Licht "ab" einer bestimmten Wellenlänge durch, ein LP520 also Licht mit Wellenlängen länger als 520 nm. Bandpass-Filter lassen nur einen bestimmten Abschnitt des Spektrums durch. Ein Bandpassfilter mit der Bezeichnung 525/50 lässt ein spektrales Fenster von 50 nm passieren, dessen Mitte bei 525 nm liegt, also ein Fenster von 500–550 nm. Die Eigenschaften eines Filters werden meist nur auf den sichtbaren Bereich und direkt angrenzende spektrale Bereiche bezogen. Es kann daher sein, dass zum Beispiel ein Bandpassfilter für den sichtbaren Bereich im Infrarot wieder durchlässig wird. Dies kann bei Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung (siehe unten) zu Problemen führen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Mit Interferenzfiltern lassen sich auch komplexere spektrale Eigenschaften realisieren. Beispielsweise kann ein Filter mehrere spektrale Fenster durchlassen, die Bereiche dazwischen aber blockieren (Multi-Bandpass). Auch dichroitische Strahlteiler, die mehrere spektrale Bereiche spiegeln und dazwischen liegende Bereiche durchlassen, sind machbar (Multi-Dichroic). Dadurch wird es möglich, mehrere Fluoreszenzkanäle gleichzeitig zu sehen. Manche Lichtquellen können sehr schnell zwischen verschiedenen Anregungswellenlängen hin und herschalten, zum Beispiel einige LED-Geräte. Unter Verwendung eines Multi-Dichroics und eines Multi-Bandpassfilters als Emissionsfilter können verschiedene Fluoreszenzkanäle sehr schnell abwechselnd verwendet werden, da keine Filter bewegt werden müssen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: In Epifluoreszenzmikroskopen sind Anregungsfilter, Strahlteiler und Emissionsfilter meist zu Filterblöcken zusammengefasst. Von einem Kanal zum anderen werden dabei alle drei Filter gemeinsam ausgetauscht, indem man entweder einen Schieber verschiebt, in dem Kombinationen für drei bis vier Farben enthalten sind, oder indem ein Rad gedreht wird, auf dem mehrere Filterwürfel für jeweils einen Kanal montiert sind.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: In manchen Laserscanningmikroskopen, die mit Fluoreszenz funktionieren, wird die Funktion von Anregungsfiltern oder Strahlteilern durch Akustooptische Modulatoren (AOM, auch: "acousto-optical tunable filter" (AOTF) oder "acousto-optical beam splitter" (AOBS)) ersetzt. Der Emissionsfilter kann ersetzt werden, indem das Fluoreszenzlicht, das in diesen Geräten nur von einem Punkt kommt, vor der Detektion spektral aufgetrennt wird und dann nur gewünschte Teile des Spektrums detektiert werden. Eine solche Auftrennung wird mit einem Prisma oder einem Beugungsgitter erreicht.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Präparate mit heller Fluoreszenz im für das menschliche Auge gut sichtbaren Bereich bis etwa 620 nm Wellenlänge können direkt durch das Okular betrachtet werden. Zur Dokumentation werden Kameras eingesetzt. Während früher fotografischer Film verwendet wurde, fand Ende des 20. Jahrhunderts eine Umstellung auf elektronische Kameras statt. Häufig werden CCD-Kameras verwendet, die Schwarzweißbilder aufnehmen. Durch den Verzicht auf Farbfilter in der Kamera können alle Pixel jede Farbe aufnehmen, das Bild wird heller, als es bei Farbkameras der Fall wäre. Welche Farbe von der Kamera tatsächlich aufgenommen wird, wird durch den vorgeschalteten Emissionsfilter festgelegt. Verschiedenfarbige Fluoreszenzfarbstoffe in einem Präparat werden nacheinander aufgenommen und können im Computer übereinander gelegt werden. Dabei kann den jeweiligen Farbstoffen eine beliebige Farbe zugeordnet werden, wahlweise ihre natürliche Farbe oder eine andere, letzteres etwa um Farben besser zu kontrastieren.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Fluoreszierende Moleküle lassen sich nicht beliebig oft anregen, da sie durch das Anregungslicht zerstört werden können. Der als Photobleichung bezeichnete Prozess geschieht je nach Photostabilität der fluoreszierenden Präparate schneller oder langsamer. Für ein einzelnes fluoreszierendes Molekül ist Ausbleichen dann mehr oder weniger wahrscheinlich.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ein Molekül im angeregten Zustand kann nicht nur durch Fluoreszenz wieder in den Grundzustand (S) übergehen. Eine zweite Möglichkeit ist die Innere Umwandlung, bei der die Energie beim Übergang in den Grundzustand in Wärme umgewandelt wird. Eine dritte ist das Ausbleichen, bei der es zur Zerstörung des Farbstoffs durch photochemische Reaktionen kommt. Diese Reaktionen hängen mit den Spin-Zuständen der Elektronen zusammen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die Elektronen eines Fluorochroms befinden sich normalerweise in einem Singulett-Zustand, in dem alle Elektronen des Moleküls Spin-gepaart sind. Daher wird der Grundzustand auch als S, der „normale“ angeregte Zustand als S bezeichnet (siehe Abbildung mit Energiediagramm). Wie oben beschrieben haben S und S mehrere Unterzustände, die sich im Energieniveau jeweils wenig unterscheiden. Zusätzlich gibt es aber weitere, noch energiereichere angeregte Zustände, die im Energieniveau deutlich höher liegen als S. Sie werden als S, S und so weiter bezeichnet. Auch diese haben mehrere Unterzustände. Durch ein energiereiches Photon kann ein Molekül aus dem Grundzustand auch in einen dieser Zustände befördert werden. Das Absorptionsspektrum zeigt dann bei Wellenlängen mit dem entsprechenden Energiegehalt ein lokales Maximum (siehe Abbildung der Spektren). Das Fluoreszenzspektrum bleibt aber gleich, da das Fluoreszenz-Photon immer vom niedrigsten angeregten Zustand ausgesandt wird (siehe auch oben).


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Neben den Singulett-Zuständen kommen auch Triplett-Zustände vor. Der energieärmste Triplett-Zustand wird als T bezeichnet (siehe Energiediagramm), energiereichere als T, T und so weiter. Der Übergang von einem Singulett- in einen Triplett-Zustand wird als Intersystem Crossing bezeichnet. Bei diesem Übergang muss sich der Spin eines Elektrons umdrehen, so dass dann ein ungepaartes Set von Elektronenspins vorliegt. Die Wahrscheinlichkeit hierfür ist normalerweise gering, steigt aber deutlich, wenn sich das Molekül in einem der höheren angeregten Zustände befindet, also S oder höher. Um die Wahrscheinlichkeit für einen Übergang zu den Triplett-Zuständen zu minimieren, sollte die Anregung nach S oder höher nach Möglichkeit vermieden werden, denn aus Triplett-Zuständen kann keine Fluoreszenz entstehen, und diese Zustände sind langlebig.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Aus dem Triplett-Zustand kann das Elektron seine Energie entweder als Wärme abgeben, um wieder in den Grundzustand zu gelangen, oder es gibt ein Photon ab. Dieses Photon entsteht deutlich später nach der Anregung als Fluoreszenz, es handelt sich um Phosphoreszenz.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Aus dem Triplett-Zustand heraus kann das Fluorochrom aber auch zerstört werden, also Ausbleichen. Im Gegensatz zu den angeregten Singulett-Zuständen ist die Verweildauer im Triplett-Zustand deutlich länger, daher ergibt sich hier eher die Möglichkeit mit anderen Molekülen der Umgebung chemisch zu reagieren. Hat der Fluoreszenzfarbstoff chemisch reagiert, ist das Reaktionsprodukt in der Regel nicht fluoreszierend und der Farbstoff ist ausgebleicht. Von besonderer Bedeutung ist die Reaktion mit molekularem Sauerstoff, O, da dieser einen Triplett-Grundzustand hat und Triplett-Triplett-Reaktionen sehr effektiv ablaufen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bleichen kann daher verringert werden, wenn Sauerstoff aus dem Präparat entfernt wird. Dies kann durch sogenannte Antifade-Substanzen (englisch für Antibleichmittel) erreicht werden, die reduzierende Wirkung haben. Zum Einsatz kommen Antioxidantien, zum Beispiel para-Phenylamin-Diamin, DABCO oder Gallate. Ganz lässt sich das Bleichen jedoch nicht verhindern. Daher ist es wichtig, für die Fluoreszenzmarkierung Fluorochrome auszuwählen, die möglichst photostabil sind.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die im vorigen Abschnitt beschriebenen Reaktionen treten auch bei der Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen oder Organen auf. Hier kommt es nicht nur zum Ausbleichen, sondern die bei der Reaktion mit Sauerstoff entstehenden reaktiven Sauerstoffspezies können in einer Nachfolgereaktion zelluläre Komponenten schädigen und so zum Tod der Zelle führen. Auch hier kann die Zugabe von reduzierenden Stoffen helfen, etwa Ascorbinsäure oder Trolox.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Kurzwelliges Licht, besonders UV-Licht, kann Zellen aber auch direkt schädigen, ohne dass Fluoreszenz hervor gerufen wird. Dies stellt ein Problem bei Lichtquellen mit breitem Spektrum und hohem UV-Anteil dar, wie bei Quecksilberdampflampen. Der hohe UV-Anteil der Lichtquelle kann durch Filter nicht vollständig blockiert werden. Die Verwendung von UV-freien Lichtquellen wie LED, Lasern oder Halogenlampen ist daher für Lebendbeobachtungen von Vorteil.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Beide Probleme verringern sich, wenn die Belichtung für die jeweilige Fragestellung so gering wie möglich gehalten wird. Hierzu können auch besonders empfindliche Kameras oder andere Detektoren beitragen. Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies kann verringert werden, wenn das Aufsuchen des Bildbereichs (Zellen) und das Fokussieren nicht mit Fluoreszenz, sondern mit Hellfeld, Phasenkontrast, Differentialinterferenzkontrast oder vergleichbaren Verfahren erfolgt und die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung dadurch auf ein Minimum beschränkt wird.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Neben den genannten phototoxischen Effekten kann es bei zu hohen Konzentrationen der für die Fluoreszenzmarkierung verwendeten Substanzen zur direkten Vergiftung der Zellen kommen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Als ' (englisch für durchbluten) oder ', also Übersprechen, wird es bezeichnet, wenn bei einer Mehrfachmarkierung ein Signal auch im benachbarten Farbkanal zu sehen ist. Das langwellige Ende des Emissionsspektrums der meisten Fluorochrome fällt nur sehr langsam gegen Null ab. Daher kommt es bei gleichzeitiger Anregung und Detektion von im Spektrum benachbarten Fluorochromen häufig zum Übersprechen, beispielsweise eines grünen Fluorochroms in den benachbarten orangefarbenen Kanal. Dies kann verhindert oder zumindest vermindert werden, wenn enge Bandpass-Filter verwendet werden und/oder die Farbstoffe nicht gleichzeitig, sondern nacheinander angeregt werden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: In den Biowissenschaften wird Fluoreszenzmikroskopie vielfältig eingesetzt. Manche zu untersuchende Objekte sind von selbst fluoreszierend. Dies wird als Autofluoreszenz bezeichnet. Beispielsweise haben Pflanzen Chlorophylle und andere Pigmente, die natürlicherweise fluoreszieren. Autofluoreszenz ist aber häufig unerwünscht, da sie als Hintergrundfluoreszenz das Erkennen von künstlichen Fluoreszenzen erschwert.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Für biomedizinische Anwendungen ist eine Vielzahl von Methoden für die Fluoreszenzmarkierung entwickelt worden. Manche Fluoreszenzfarbstoffe binden auf Grund ihrer chemischen Eigenschaften direkt an die zu untersuchende Struktur. In diese Gruppe fallen beispielsweise DNA-Farbstoffe wie DAPI, Acridinorange und Hoechst 33342 oder Membranfarbstoffe wie Nilrot oder DiI. Einige solcher Farbstoffe können auch lebende Zellen anfärben.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: In anderen Fällen wird ein nicht-fluoreszierendes Molekül, das an die zu untersuchende Struktur bindet, chemisch mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Beispiele für diesen Ansatz sind die Immunfluoreszenz, bei der Fluoreszenz-markierte Antikörper verwendet werden, die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, eine Technik zum mikroskopischen Nachweis von größeren DNA-Abschnitten, oder die Färbung von Aktin mit fluoreszenzmarkiertem Phalloidin.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Proteine können gentechnisch mit einem fluoreszierenden Protein wie GFP fusioniert werden. Aus dem fluoreszenzmikroskopischen Bild können anschließend Rückschlüsse auf die Verteilung und Anordnung des untersuchten Proteins in der lebenden und meist fixierten Zelle gezogen werden, (etwa im Zellkern, im Cytoplasma, Zellmembran-gebunden oder nach außen exportiert) beziehungsweise Zellbestandteile durch ihre spezifischen Proteine visualisiert werden (wie Aktinfilamente durch Aktin oder Mikrotubuli durch Tubulin). Auch Interaktionen von Proteinen untereinander sind beobachtbar, wenn diese mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen fusioniert werden. Fluoreszierende Proteine können auch unter Kontrolle eines Zelltyp-spezifischen Promotors exprimiert werden, um bestimmte Zelltypen zu identifizieren.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Eine weitere Gruppe bilden Sonden, deren Fluoreszenzverhalten sich in Abhängigkeit vom Zustand Ihrer Umgebung ändert. Calcium-abhängige Farbstoffe wie Aequorin, Fura-2, Furaptra, Calcein und Indo-1 können Schwankungen der Konzentration an Calciumionen in einer Zelle anzeigen. Mit spannungsabhängigen Farbstoffen oder den Reporterproteinen VSFP oder PROPS können Spannungsänderungen in einer Zelle dargestellt werden. Mit Redox-sensitiven Reporterproteinen wie roGFP, rxYFP oder HyPer können Redox-Potentiale verfolgt werden. Fluoreszierende pH-Indikatoren können unterschiedliche pH-Werte in einer Zelle sichtbar machen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Im Gegensatz zu den Lebenswissenschaften werden in den Materialwissenschaften selten Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt. Die Anwendung von Fluoreszenzmikroskopie beschränkt sich meist auf Fälle, in denen das Material autofluoreszent ist. So sind manche Bestandteile von Verbundwerkstoffen fluoreszierend und können von anderen nicht fluoreszierenden Bestandteilen unterschieden werden. Zur besseren Darstellung der Gegebenheiten kann in einem Konfokalmikroskop Fluoreszenz mit Reflexion kombiniert werden. Dadurch lassen sich etwa in glasfaser-verstärkten Verbundwerkstoffen fluoreszierende Bindemittel (Grundpolymer) von nicht fluoreszierenden Fasern unterscheiden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Organische Fasern in Papier, Holz oder Bast wurden in etlichen Studien untersucht, um deren Anordnung oder Zusammensetzung zu bestimmen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Auch verschiedene Typen von Solarzellen können fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden. Häufig kommt dabei konfokale Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, auch in Kombination mit konfokaler Reflexions-Mikroskopie. In organischen Solarzellen kann der Verlust von fluoreszierenden organischen Komponenten untersucht werden, der durch Oxidation mit in die Zelle eingedrungenem Sauerstoff verursacht wird; vorausgesetzt die Abbauprodukte sind nicht fluoreszierend. In Perowskit-Solarzellen wurde analysiert, welchen Einfluss Licht auf die Bildung der gleichnamigen Perowskit-Schicht hat. Obwohl etliche Mineralien fluoreszieren, wird Fluoreszenzmikroskopie in der Petrologie wenig genutzt. Eine bemerkenswerte Ausnahme sind Untersuchungen von Kohle und von organischen Einschlüssen in Sedimenten. Reine Mineralien sind meist nicht fluoreszierend, eine Fluoreszenz kann aber durch verschiedene anorganische oder organische Verunreinigungen hervorgerufen werden. Solche gesteinsbildenden Komponenten von Kohle, die einen organischen Ursprung haben, werden als Mazerale bezeichnet. Eine Untergruppe sind die lipidreichen Liptinite. Diese fluoreszierenden Bestandteile können besonders gut an polierten Oberflächen mikroskopisch von nicht-fluoreszierenden anorganischen Bestandteilen unterschieden werden. Während der Kohleentstehung ändern sich die fluoreszenten Eigenschaften, so dass sich Materialien aus verschiedenen Lagerstätten unterscheiden lassen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei der Lichtscheibenmikroskopie (; auch Lichtblattmikroskopie oder "single plane illumination microscopy", SPIM) wird das Anregungslicht von der Seite als "Lichtscheibe" beziehungsweise "Lichtblatt" eingestrahlt. Dies kann durch ein zweites Objektiv oder eine entsprechende Zylinderlinse geschehen, das oder die senkrecht zum Beobachtungsobjektiv steht und eine eng begrenzte Ebene des Präparats ausleuchtet. Nur in dieser ausgeleuchteten Scheibe wird Fluoreszenz erzeugt und diese Ebene wird im Beobachtungsobjektiv scharf gestellt. In anderen Ebenen wird also keine unscharfe Hintergrundfluoreszenz erzeugt, die bei normaler Fluoreszenzmikroskopie zu einer Verminderung des Kontrasts führt. Das Verfahren erlaubt es, die axiale Auflösung eines normalen Fluoreszenzmikroskops zu verbessern, wenn das Lichtblatt dünner als die Schärfentiefe des Beobachtungsobjektivs ist. Die seitliche Beleuchtung des Untersuchungsobjekts ähnelt der Anordnung im Spaltultramikroskop.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei konfokalen wie auch bei Zwei-Photonen-Mikroskopen wird das Präparat abgerastert: Das Anregungslicht wird auf einen Punkt fokussiert, die Fluoreszenz von diesem Punkt gelangt zum Detektor. Der Punkt wird über das Präparat bewegt und die jeweils gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden in einem Steuerungscomputer zu einem Bild zusammengesetzt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie entsteht im Beleuchtungskegel über und unter der Schärfeebene ebenfalls Fluoreszenz. Diese gelangt jedoch nicht zum Detektor, da sie von einer Lochblende (engl. "pinhole") in der Zwischenbild-Ebene blockiert wird. Durch das Blockieren dieser Hintergrundfluoreszenz tritt das Signal in der Schärfeebene gegenüber dem Hintergrund besser hervor als in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie. Auf Grund dieser deutlich kontrastreicheren Bilder sind konfokale Mikroskope in der biologischen Forschung weit verbreitet.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ein Fluoreszenzfarbstoff kann statt durch Absorption "eines" Photons auch durch eine Zwei-Photonen-Absorption angeregt werden. Voraussetzung dafür ist, dass diese beiden Photonen quasi gleichzeitig am Fluoreszenzfarbstoff eintreffen, und dass beide zusammen den richtigen Energiegehalt haben, um ein Elektron des Farbstoffes auf ein angeregtes Energieniveau zu heben. Beide Bedingungen können erfüllt werden, wenn zur Anregung ein gepulster Laser verwendet wird, der, je nach anzuregendem Fluoreszenzfarbstoff, Wellenlängen zwischen 700 und 1200 nm mit hoher Intensität erzeugt, und dieses Licht durch das Objektiv auf einen Punkt fokussiert wird. Die Photonendichte ist dann so hoch, dass eine ausreichende Wahrscheinlichkeit, dass zwei Photonen gleichzeitig am fluoreszierenden Molekül eintreffen, gegeben ist. Im Gegensatz zur Konfokalmikroskopie, wo das Auslesevolumen beschränkt wird, ist hier das Anregungsvolumen limitiert. Längerwelliges Licht hat eine höhere Eindringtiefe in biologische Gewebe, da es von diesen weniger stark absorbiert und auch weniger stark gestreut wird. Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie wird daher eingesetzt, um tiefer in Gewebe einzudringen, als dies mit anderen Verfahren möglich ist. Zusammen mit Methoden, die nicht auf Fluoreszenz beruhen, wird dieses Verfahren als Multiphotonenmikroskopie oder Nicht-lineare Mikroskopie bezeichnet.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (abgekürzt FCS nach englisch "fluorescence correlation spectroscopy") ist zwar eine fluoreszenzmikroskopische Methode, bei ihr wird jedoch kein Bild erzeugt. In einem Konfokalmikroskop wird der Anregungslaser nicht über das Präparat gerastert, sondern auf einer Stelle geparkt. Es wird somit ein sehr kleines Volumen über einen längeren Zeitraum beobachtet. Bewegen sich fluoreszierende Moleküle in dieses Volumen hinein oder hinaus, so ändert sich die gemessene Helligkeit. Anhand einer solchen Messreihe kann beispielsweise bestimmt werden, wie schnell Moleküle in einer Lösung diffundieren. Da die Diffusionsgeschwindigkeit unter anderem von der Größe abhängt, lässt sich beispielsweise untersuchen, ob ein fluoreszenzmarkiertes Protein an ein zweites, ebenfalls in der Lösung vorhandenes Protein bindet und sich dadurch langsamer bewegt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Als Auflösung wird in der Mikroskopie der Abstand bezeichnet, den zwei Strukturen haben müssen, um als getrennte Strukturen wahrgenommen zu werden. Ernst Abbe hat im 19. Jahrhundert als erster verstanden, dass diese Auflösung fundamental durch Beugung begrenzt ist. Diese Grenze wird daher als Abbe-Limit bezeichnet. Sie kann mit entsprechenden Formeln genau berechnet werden und liegt für gute Mikroskope bei Verwendung von Ölimmersion und in Abhängigkeit von der Wellenlänge bei etwa 200 nm.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Das Abbe-Limit galt lange als unüberwindbar. Ab der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts wurden jedoch einige mikroskopische Verfahren entwickelt, deren Auflösung besser ist als vom Abbe-Limit vorhergesagt. Das mit Abstand älteste dieser Verfahren ist die Konfokalmikroskopie (siehe auch den Abschnitt Auflösung im Artikel Konfokalmikroskop.) Die theoretische Verbesserung liegt jedoch nur beim Faktor Wurzel von 2 ≈ 1,41. Aus praktischen Gründen kann auch dieser nicht erreicht werden. In den 1980er-Jahren wurde die TIRF-Mikroskopie () vorgeschlagen. Mit ihr werden ausschließlich Fluoreszenzfarbstoffe im Präparat angeregt, die sich sehr nah am Deckglas befinden. Ist das Präparat, zum Beispiel lebende Zellen, in wässrigem Medium, so dringt die Anregung vom Deckglas ausgehend nur in eine Schicht von 100–200 nm Dicke ein. Die Schichtdicke ist damit deutlich geringer als es beugungsbedingt mit normaler Mikroskopie möglich wäre. Dadurch ergibt sich ein deutlich höherer Kontrast, da nur wenig Material zur Fluoreszenz angeregt wird. Diese spezielle Form der Anregung wird erreicht, indem das Präparat in einem Winkel angestrahlt wird, der so groß ist, dass an der Kante vom Deckglas zum wässrigen Medium Totalreflexion auftritt und der Lichtstrahl somit gar nicht in das Präparat eindringt. An der Kante tritt jedoch eine evaneszente Welle auf, die zur Anregung führen kann, die sich aber mit zunehmender Entfernung vom Deckglas sehr schnell abschwächt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Während „Auflösung“ per Definition den Mindestabstand zwischen "zwei" Strukturen bezeichnet, kann man die genaue Position "eines" Objekts sehr genau messen. Fluoreszenzmikroskopisch kann man daher das Abbe-Limit umgehen, wenn man die genaue Position von Objekten in verschiedenen Farbkanälen bestimmt und danach den Abstand zwischen diesen misst. Diese Technik wurde in den 1990er-Jahren entwickelt und später als Spektrale Präzisions-Distanz-Mikroskopie (SPDM) bezeichnet. Zwar ließen sich mit ihr Abstände von kleinen fluoreszierenden Strukturen bis auf etwa 70 nm genau messen. Sie führt jedoch nicht zu einer generellen Auflösungsverbesserung, da jeder der aufgenommenen Farbkanäle für sich der Beugung unterliegt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ende des 20. und Anfang des 21. Jahrhunderts sind jedoch einige Methoden entwickelt worden, mit denen eine generelle Verbesserung möglich ist. Sie werden gemeinschaftlich im Englischen als "superresolution microscopy", manchmal auch als "nanoscopy" bezeichnet. Allen ist gemeinsam, dass sie auf Fluoreszenzmikroskopie beruhen. Drei dieser Verfahren haben eine gewisse Verbreitung erfahren und sind kommerziell erhältlich: STED, strukturierte Beleuchtung und Lokalisationsmikroskopie. Daneben gibt es weitere Verfahren, die sich nicht gegen die genannten behaupten konnten, oder die bisher nur von einzelnen Gruppen angewendet werden. Einige Verfahren werden auf Grund von gemeinsamen Eigenschaften als RESOLFT-Mikroskopie zusammengefasst.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie wurde von der Zeitschrift "Nature Methods" zur Methode des Jahres 2008 gekürt."Method of the Year 2008." In: "Nature Methods", 6, 2009, S. 1, . William Moerner, Eric Betzig und Stefan Hell erhielten 2014 den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung einiger dieser Methoden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei der STED-Mikroskopie () wird die Beugungsgrenze deutlich überwunden. Der Anregung eines beugungsbegrenzten Volumens im Präparat folgt eine ringförmige Abregung durch Licht längerer Wellenlänge. Dabei fallen die angeregten Moleküle im Bereich der Abregung über stimulierte Emission wieder in den Grundzustand. Das Fluoreszenz emittierende Volumen verkleinert sich dadurch wesentlich und die Auflösung des Mikroskops erhöht sich.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei der strukturierten Beleuchtung oder 3D-SIM-Mikroskopie (englisch "structured illumination microscopy") werden nicht alle Fluorochrome angeregt, sondern nur ein Teil des Präparats in Form einer bestimmten ‚Struktur‘, einem Streifenmuster. Bei der Überlagerung des bekannten Beleuchtungsmusters mit der unbekannten Fluorochrom-Verteilung im Präparat entstehen Moiré-Effekte, deren Größe über der Auflösungsgrenze liegt, selbst wenn die unbekannte Struktur kleiner ist. Durch Verschiebung und Verdrehung des Beleuchtungsmusters lässt sich durch die zusätzliche Information aus den Moiré-Mustern der jeweiligen Bilder durch Computerberechnung ein endgültiges Bild mit bis zu zweifach erhöhter Auflösung erzeugen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Als Lokalisationsmikroskopie (englisch "localization microscopy") werden mikroskopische Verfahren zusammengefasst, die auf einem gemeinsamen Grundprinzip beruhen: Während bei klassischer Fluoreszenzmikroskopie alle Fluorochrome gleichzeitig angeregt werden, werden sie hier zeitlich nacheinander angeregt, so dass immer nur ein kleiner Teil von ihnen leuchtet. Von einer Schärfeebene werden viele Bilder hintereinander gemacht, oft über Tausend. In jedem dieser Bilder wird nun die genaue Position der jeweils leuchtenden Fluorochrome bestimmt und diese Position wird in das endgültige Bild übertragen. Die Verfahren unterscheiden sich in der Methode, wie die einzelnen Farbstoffmoleküle ein- und ausgeschaltet werden, also zum „Blinken“ gebracht werden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die Photoactivated Localization Microscopy (PALM) beruht auf Varianten des Grün Fluoreszierenden Proteins, die sich mit Licht bestimmter Wellenlängen ein- und ausschalten lassen. STORM und dSTORM verwenden geeignete Fluoreszenzfarbstoffe, die in bestimmten Pufferlösungen nur selten fluoreszieren. Ground State Depletion (GSD) beruht darauf, dass sich zu jedem Zeitpunkt die Mehrzahl der Fluorochrome in einem nicht fluoreszierenden Triplett-Zustand befindet, der durch starke Lichtanregung erzeugt werden kann. DNA-Paint beruht auf einer vorübergehenden Bindung von kurzen, einsträngigen DNA-Molekülen an komplementäre Zielmoleküle.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: 4Pi-Mikroskopie war die erste kommerziell verfügbare Superresolution-Technik, ist jedoch heute nicht mehr verfügbar. Eine weitere Technik ist Vertico-SMI, die in Heidelberg entwickelt wurde.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Nach der Anregung verbleibt ein fluoreszierender Stoff eine kurze Zeitspanne im angeregten Zustand, bevor er das Fluoreszenzlicht abstrahlt. Die Dauer dieser Zeitspanne variiert für einen konkreten Stoff in einem bestimmten Bereich, so dass eine mittlere Fluoreszenzlebensdauer für einen jeweiligen Stoff bestimmt werden kann. Sie liegt im Nanosekundenbereich, beispielsweise für Fluorescein bei 3,25 ns, für Texas Red bei 3,41 ns und für Eosin bei 1,1 ns. Wenn die Fluoreszenzanregung im mikroskopischen Präparat mit einem gepulsten oder modulierten Laser erfolgt und spezielle Detektoren verwendet werden, dann lässt sich mittels spezieller Messverfahren die Zeitspanne bestimmen, nach welcher die Fluoreszenz am Detektor eintrifft. Nicht nur durch ihre Farbe, sondern auch durch ihre Lebenszeit können daher Fluoreszenzfarbstoffe voneinander unterschieden werden. Dies wird in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (englisch "fluorescence lifetime imaging microscopy", FLIM) ausgenutzt. Gepulste und modulierte Laser gibt es im sichtbaren Wellenlängenbereich für die Anregung mit einem Photon. FLIM kann aber auch in Kombination mit Multi-Photonen-Anregung (siehe oben) verwendet werden, für die ohnehin gepulste Laser erforderlich sind.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Beim Förster-Resonanzenergietransfer (manchmal auch: Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer) wird die Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffs, des Donors, nicht durch Fluoreszenz abgegeben, sondern direkt auf einen anderen Fluoreszenzfarbstoffs (Akzeptor) übertragen. Dies ist möglich, wenn erstens Donor und Akzeptor weniger als 10 nm voneinander entfernt sind und zweitens die Emissionsenergie des Donors der Anregungsenergie des Akzeptors entspricht. Das Emissionsspektrum des Donors muss also mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors überlappen. Beispielsweise kann ein grün fluoreszierender Farbstoff als Donor für einen orange fluoreszierenden Akzeptor dienen. Ein weiteres Beispiel ist das cyan fluoreszierende Protein CFP als Donor für das gelb fluoreszierende Protein YFP.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Tritt FRET auf, so wird trotz Anregung des Donors von diesem keine Fluoreszenz ausgesendet, stattdessen kann die Fluoreszenz des Akzeptors beobachtet werden. Die FRET-Effizienz nimmt mit der sechsten Potenz des Abstands zwischen Donor und Akzeptor ab. Das Auftreten von FRET zeigt daher die direkte Nachbarschaft der beiden an, mit einer Genauigkeit, die weit unter der Auflösungsgrenze liegt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei FRAP (engl. "fluorescence recovery after photobleaching") wird ein fluoreszenzmarkiertes Molekül in einer lebenden Zelle in einem Teilbereich der Zelle durch kurzfristige, starke Lichteinwirkung absichtlich gebleicht, meist durch einen fokussierten Laserstrahl. Anschließend wird beobachtet, wie schnell Moleküle aus dem nicht gebleichten Teil der Zelle in den gebleichten Teil zurückkehren. Über die ermittelte Diffusionsgeschwindigkeit können Rückschlüsse auf das Bindungsverhalten des Moleküls gezogen werden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bei FLIP (engl. "fluorescence loss in photobleaching") wird dagegen ein Bereich der Zelle kontinuierlich gebleicht. Es wird beobachtet, wie schnell die Fluoreszenz im nicht gebleichten Teil der Zelle abnimmt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Die ersten fluoreszenzmikroskopischen Beobachtungen waren zufällig und ein Ärgernis. August Köhler, Mitarbeiter beim Mikroskophersteller Carl Zeiss, wollte die lichtmikroskopische Auflösung steigern. Die Auflösung hängt von der Wellenlänge ab, daher baute er ein Mikroskop für UV-Licht, um dessen kürzere Wellenlänge zu nutzen. Das damit erzeugte Bild war zwar für die Augen nicht sichtbar, konnte aber fotografisch aufgefangen werden. Er stellte dabei fest, dass


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Bereits früh war Köhler also bewusst, dass die bei der UV-Mikroskopie störende Fluoreszenz auch nützliche Anwendungen ermöglichen könnte.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Das erste kommerziell erhältliche Fluoreszenzmikroskop wurde von Oskar Heimstädt entwickelt, der beim Wiener Mikroskopbauer Karl Reichert das Rechen- und Konstruktionsbüro leitete. Es wurde von Reichert persönlich 1911 auf der Versammlung der Deutschen Naturforscher und Ärzte vorgestellt. Im gleichen Jahr veröffentlichte Heimstädt eine Arbeit mit dem Titel „Das Fluoreszenzmikroskop“ in der Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: UV-Licht war für die Fluoreszenzanregung gut geeignet, da es für das Auge nicht sichtbar und somit kein Sperrfilter erforderlich war. Eine gute Anregung erforderte, dass von der Lichtquelle kein sichtbares, aber möglichst viel UV-Licht zum Präparat gelangte. Ein geeigneter Anregungsfilter wurde kurz zuvor, 1910, von Hans Lehmann bei Zeiss entwickelt. Er bestand aus einer Filterküvette, die entlang der optischen Achse aus zwei Kammern bestand. Die drei Wände waren aus Jenaer Blau-Uviolglas, eine Kammer wurde mit gesättigter Kupfersulfat-Lösung, die andere mit verdünnter Nitrosodimethylanilin-Lösung gefüllt. Das so erzeugte Anregungslicht wurde als „gefiltertes Ultraviolett“ bezeichnet. Da normales Glas UV-Licht absorbiert, wurde wenig später ein Kondensor aus Quarz eingesetzt, um hohe Beleuchtungsstärken zu erhalten. Es entstand jedoch ein neues Problem: Die Glaslinsen im Objektiv fingen an zu fluoreszieren. Daher setzte Lehmann einen Dunkelfeldkondensor ein: So wurde das Anregungslicht am Objektiv vorbei geleitet und auch Reste von sichtbarem Licht aus der Lichtquelle im mikroskopischen Bild wurden vermieden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Über die Möglichkeiten und Zukunftsaussichten der Fluoreszenzmikroskopie schrieb Heimstädt


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ebenfalls 1911 wurde von Michail Tswett die Fluoreszenz der Chloroplasten beschrieben. Stanislaus von Prowazek veröffentlichte 1913 die erste Arbeit, in der mit Fluoreszenzfarbstoffen gearbeitet wurde, namentlich mit Eosin und Neutralrot.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ein Jahr nach dem Reichert’schen Fluoreszenzmikroskop wurde auf der Versammlung deutscher Naturforscher und Ärzte 1912 das von Lehmann entwickelte Zeiss’sche „Lumineszenzmikroskop“ vorgestellt. Eine Dunkelfeld-Beleuchtung führt zu einer verringerten Numerischen Apertur und somit zu einer verringerten Auflösung. Daher setzte Lehmann auf eine normale Hellfeldbeleuchtung mit UV-Licht. Um zu verhindern, dass UV-Licht ins Auge drang, setzte er auf einen UV-blockierenden Glasfilter aus Euphosglas, der als Deckglas verwendet wurde. Der Filter musste zwischen Präparat und Objektiv liegen, um Fluoreszenzanregung im Objektiv zu vermeiden, daher war keine andere Position für den Filter möglich. Der Kondensor hatte Quarz-Linsen, die verwendeten Objektträger waren aus Bergkristall, um UV-Durchlässigkeit zu gewährleisten. Die empfohlene Standardvergrößerung lag bei 62× (inklusive Okularvergrößerung), 300× sollte nicht überschritten werden. Die Fluoreszenz-Zusatzausstattung, also ohne das eigentliche Mikroskop, kostete mit der billigsten Anregungslichtquelle, einer von Hand regulierbaren Bogenlampe, etwa 500 Mark. Hinzu kamen 4,50 M für einen 0,5 mm dicken 30×25 mm Bergkristall-Objektträger und eine Mark pro Euphosglas-Deckglas. Neben Schwarzweiß-Fotografien konnten auch Farbbilder mit dem Autochromverfahren erstellt werden.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: In der Anfangszeit der Fluoreszenzmikroskopie wurden fast ausschließlich autofluoreszente Objekte betrachtet. Auch Max Haitinger, zunächst Privatforscher in Weidling bei Wien, später an der Universität Wien, begann mit der Untersuchung der Fluoreszenz von Wein und Obstweinen. Ab 1933 entwickelte er jedoch Fluoreszenzfärbungen, die er als „Fluorochromierungen“ bezeichnete. Von ihm stammen die Begriffe Sekundärfluorszenz für zu erzeugende Signale und Primärfluoreszenz für im Präparat von selbst vorhandene. Auch die Bezeichnung Fluorochrom für einen Fluoreszenzfarbstoff wurde von ihm eingeführt. Als Fluorochrome setzte er erst Pflanzenextrakte ein und später eine Reihe von Chemikalien. Dadurch gelang es ihm, Dünnschnitte von tierischen und menschlichen Geweben anzufärben, so dass sich auch Histologen für die Fluoreszenzmikroskopie zu interessieren begannen. Da nur sehr geringe Konzentrationen der Fluorochrome benötigt wurden, waren auch Lebendfärbungen möglich, die hauptsächlich in der Botanik angewendet wurden. Mit Auramin O gelang die Färbung von Tuberkulose-Bakterien. Auch Mehrfachfärbungen waren möglich. Eine erste Abhandlung veröffentlichte Haitinger 1934, sein Buch „Fluorescenzmikroskopie – Ihre Anwendung in der Histologie und Chemie“ erschien 1938.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Haitinger arbeitete eng mit der Firma Reichert zusammen, um deren Fluoreszenzmikroskop zu verbessern. Das neue Modell „Kam F“ wurde ab 1931 verkauft. Auch dieses hatte eine Bogenlampe mit Eisenelektroden als Lichtquelle, da diese einen vergleichsweise hohen UV-Anteil zwischen 300 nm und 400 nm hatte. Trotzdem benötigte er bis zu 20 Minuten Belichtungszeit für seine Fotografien. Für schwache Vergrößerungen nennt er Belichtungszeiten mit Kohlebogenlampen von einer bis zehn Minuten. Die Nitrosyldimethylanilin-Lösung in der Anregungsfilter-Küvette konnte durch Nickeloxid-haltige Schwarzglasfilter ersetzt werden. Die Kupfersulfat-Lösung, die den verbleibenden Rotanteil im Anregungslicht filterte, wurde erst Anfang der 1940er-Jahre durch blaue Glasfilter ersetzt. Die Beleuchtung erfolgte durch einen Hellfeldkondensor mit normalem Glas; es hatte sich gezeigt, dass Quarzglas hierfür nicht erforderlich ist. Das verbleibende Anregungslicht wurde am Okular blockiert, indem ein Sperrfilter aus 1 mm dickem gelben Glas aufgesetzt wurde. Falls ein farbloser Sperrfilter benötigt wurde, konnte stattdessen eine Küvette mit einer 5 mm dicken Schicht Natriumnitrit-Lösung verwendet werden. Deckgläser aus Euphosglas waren dank des gelben Sperrfilters nicht mehr nötig, auch zeigte sich, dass normale Objektträger geeignet waren. Dadurch sanken die laufenden Kosten erheblich. In seinem Buch von 1938 beschreibt Haitinger auch Auflicht-Beleuchtungen für die Fluoreszenzmikroskopie von undurchsichtigen Gegenständen (Epikondensor von Zeiss-Jena, Epilum der Optischen Werke C. Reichert-Wien (siehe Schemazeichnung), Ultropak von E. Leitz-Wetzlar und Univertor von E. Busch-Rathenow). Sie sind jedoch nicht mit heutiger Auflichtfluoreszenzanregung mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers vergleichbar. Als Anwendungsbeispiele nennt er die Untersuchung von Nahrungsmitteln, Drogen und Farbstoffen sowie Erstuntersuchungen von Präparaten, von denen Dünnschliffe hergestellt werden sollen. Als „ganz besonders wertvoll“ bezeichnet er Auflichtbeleuchtungen für Studien am lebenden Tier.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Um 1940 brachte Osram Quecksilberhöchstdrucklampen auf den Markt, für die bald bei Zeiss und unter Mitentwicklung von Haitinger bei Reichert (Lux UV und Lux UW) Beleuchtungseinrichtungen ins Programm genommen wurden. Neben der wesentlich vereinfachten Handhabung und einer größeren Helligkeit gaben diese Lampen nicht nur einzelne Linien ab, sondern ein kontinuierliches Spektrum, mit der sich alle fluoreszierenden Stoffe anregen ließen. Auch produzierten sie keine unangenehmen Dämpfe wie Eisenbogenlampen. Vergleichbare Lampen sind auch heute noch in Verwendung.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: In den 1940er-Jahren begann sich Farbdiafilm zur Dokumentation durchzusetzen. Trotz aller Fortschritte lagen die Belichtungszeiten meist noch im zweistelligen Minutenbereich.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ein Durchbruch für die Fluoreszenzmikroskopie war die Einführung der Immunfluoreszenz. 1942 veröffentlichten Albert Hewett Coons und Kollegen die Kopplung von Fluorescein-Isocyanat an Antikörper. Mit seiner hellen grünen Fluoreszenz hob sich dieses Fluorochrom besser von der bläulichen Autofluoreszenz vieler Gewebe ab als das zuvor probierte Anthracen-Isocyanat. Die Antikörper waren gegen Pneumokokken gerichtet, die so in Mausgeweben fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden konnten. Die Kopplung der Antikörper war jedoch technisch anspruchsvoll und die Konjugate waren instabil.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Siegfried Strugger stellte fest, dass manche bekannten herkömmlichen Farbstoffe auch fluoreszieren, so etwa Neutralrot und Rhodamin B. Auch Acridinorange führte er in die Fluoreszenzmikroskopie ein. In einem Buch beschrieb er 1949 detailliert die Möglichkeiten der Fluoreszenzanregung mit blauem Licht statt mit UV. Strugger nutzte Auflichtbeleuchtung, um den Fluss von Wasser in Pflanzen zu verfolgen.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Eine wesentliche Verbesserung der Immunfluoreszenz gelang 1958 J. L. Riggs und Kollegen, indem sie Isothiocyanate statt Isocyanaten verwendeten. Einer anderen Arbeitsgruppe war zwischenzeitlich ein Zwei-Farben-Nachweis mit Fluorescein-Isocyanat und dem orange fluoreszierenden Rhodamin B-Isocyanat gelungen. Riggs und seinen Mitstreitern gelang nun die Markierung von Antikörpern mit den deutlich stabileren Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Rhodamin B-isothiocyanat.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Noch in den 1950er-Jahren wurde Fluoreszenzmikroskopie ausschließlich mit UV, violettem oder blauem Anregungslicht durchgeführt. Dies änderte sich erst mit der durch den Niederländer Johan Sebastiaan Ploem vorangetriebenen Einführung von Interferenzfiltern in den 1960er-Jahren. Die ersten, die einen dichroitischen Strahlteiler in der Mikroskopie einsetzten, waren die Russen Brumberg und Krylova im Jahr 1953. Die auf Russisch veröffentlichte Arbeit blieb jedoch im Westen unbekannt und wurde erst später „wiederentdeckt“.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Angetrieben durch die Entwicklung zahlreicher Antikörper für Immunfluoreszenzen entstand ein Bedarf an Fluorochromen unterschiedlicher Farben. Diese ließen sich jedoch durch die herkömmliche Verwendung mit UV-Licht oft nur schlecht anregen. Um 1962 begann Ploem eine Zusammenarbeit mit den Schott-Werken in Mainz zur Entwicklung dichroitischer Strahlteiler, die blaues oder grünes Licht reflektierten. Schott stellte zuvor schon viele der in der Fluoreszenzmikroskopie gebräuchlichen Glasfilter her. Die Firma Leitz lieferte Ploem eine Opak-Auflichtbeleuchtung mit einem halbdurchlässigen, farbunabhängigen Spiegel. Diese wurde an der Universiteit van Amsterdam umgebaut und erhielt einen Schieber mit vier Positionen für dichroitische Strahlteiler zur Anregung mit UV, Violett, Blau und Grün, so dass die jeweilige Anregungswellenlänge bequem ausgewählt werden konnte. Erstmals erfolgte die Anregung damit wie heute üblich durch das Objektiv. Durch die Wahl von schmalbandigen Interferenzfiltern für blaues beziehungsweise grünes Anregungslicht konnten außerdem die in der Immunfluoreszenz häufig verwendeten Farbstoffe FITC (grün fluoreszierend) und Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC; orange fluoreszierend) nahe an ihrem Absorptionsmaximum angeregt werden, ohne gleichzeitig große Mengen Autofluoreszenz durch überflüssige Anregungswellenlängen auszulösen. Seine Ergebnisse veröffentlichte Ploem in mehreren Arbeiten ab 1965.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Im Anschluss entwickelte Leitz den PLOEMOPAK, eine Einrichtung, auf der vier Strahlteiler durch Rotation abwechselnd in den Strahlengang eingeschwenkt werden konnten. Spätere Versionen wurden um Sperrfilter und Anregungsfilter ergänzt bis schließlich um 1972 eine Variante auf den Markt kam, die vier Fluoreszenzfilterwürfel mit je einem Anregungsfilter, Strahlteiler und Sperrfilter enthielt. Die Würfel konnten durch den Anwender ausgetauscht werden, um sie den jeweils verwendeten Fluorochromen anzupassen. Damit war die Entwicklung des Epifluoreszenzmikroskops, wie es heute noch verwendet wird, im Prinzip abgeschlossen. Es sollte jedoch noch etliche Jahre dauern, bis sich dieser Bautyp allgemein durchsetzte. Britische Mikroskopie-Lehrbücher von 1975 und 1977 erwähnen ausschließlich die Möglichkeit der UV-Anregung und Durchlichtbeleuchtung. Ein späteres von 1982 meinte, dass die Beleuchtung für gewöhnlich mit einem Dunkelfeldkondensor erfolge, beschrieb aber auch die Auflichtbeleuchtung mit dichroitischem Strahlteiler und stellte diese als die lichtempfindlichere vor. Die Möglichkeit, durch den Austausch aller Filter Fluorochrome wie FITC und Rhodamin nacheinander nachweisen zu können, wurde ebenfalls erwähnt.


title: Fluoreszenzmikroskopie

text: Ein westdeutsches Lehrbuch von 1985 beschrieb alle drei Möglichkeiten, Durchlicht-Hell- und -Dunkelfeld sowie Auflicht-Hellfelderregung durch das Objektiv, schrieb letzterer besonders einfache Einstellung (da kein Kondensor benötigt wird) sowie hohe Anregungsintensität bei ausgezeichnetem Kontrast zu und erwähnte die Möglichkeit, Filterblöcke schnell auszutauschen. Als Hersteller solcher Systeme wurden Leitz, Olympus, Reichert, Zeiss und Jena genannt, womit wohl der VEB Carl Zeiss Jena gemeint war. Ein Lehrbuch von 1988 erwähnte zwar die älteren Methoden, stellte dann aber fest: „Moderne Fluoreszenzmikroskope arbeiten nach dem Prinzip der Auflicht-Hellfeldanregung“ mit dichroitischer Teilerplatte. Im Weiteren hieß es: „Die meisten Mikroskophersteller bieten Einrichtungen für die Durchlicht- und Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie an“.


title: Lennox-Gastaut-Syndrom

text: Das Lennox-Gastaut-Syndrom (LGS), auch unter dem Synonym Lennox-Syndrom bekannt, ist eine meist schwer behandelbare Form von Epilepsie, die bei Kindern in der Regel in der Zeit zwischen dem zweiten und sechsten Lebensjahr beginnt, mit häufigen und verschiedenen Anfallstypen einhergeht und deren Ursache in einer ursächlich vielfältigen Schädigung des Gehirns besteht, die entweder vorgeburtlich (pränatal), während der Geburt (perinatal) oder nachgeburtlich (postnatal) entstanden ist.


title: Lennox-Gastaut-Syndrom

text: Benannt wurde das Syndrom nach dem US-amerikanischen Neurologen und Epileptologen William G. Lennox (Boston/USA) und dem französischen Neuroanatom, Neurologen, klinischen Neurophysiologen und Epileptologen Henri Gastaut (Marseille/Frankreich), die diese Form der Epilepsie in den 1950er und 1960er Jahren erstmals eingehend unter wissenschaftlichen Gesichtspunkten beschrieben und sich intensiv mit ihrer Erforschung und Abgrenzung zu anderen Formen der Epilepsie befassten. Gastaut stützte sich dabei u. a. auch auf die Doktorarbeit seiner Mitarbeiterin Charlotte Dravet.


title: Lennox-Gastaut-Syndrom

text: Schätzungsweise 5 von 100 Kindern mit Epilepsie haben ein LGS, wobei Jungen prozentual gesehen häufiger betroffen sind als Mädchen. Während ein Teil der Kinder vor dem Auftreten der Anfälle keine Auffälligkeiten zeigte, hatte der andere Teil bereits eine Form von Epilepsie, die dann in das LGS übergegangen ist. Bei durchschnittlich einem von fünf Kindern mit LGS war vor dessen Auftreten ein West-Syndrom (symptomatisch) diagnostiziert worden, das durch BNS-Krämpfe kennzeichnet und nicht selten innerhalb des zweiten Lebensjahres in ein LGS übergeht.