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Titolo: Il reattivo di Nessler

Ciao a tutti,
stamattina ho provato a determinare l'azoto ammoniacale con il metodo
spettrofotometrico che usa il reattivo di Nessler. Circa un anno fa ero
riuscito a fare una curva di taratura accettabile, oggi invece un
disastro completo. Vorrei capire cosa e' successo. Tutti i matracci con
le soluzioni per la retta di taratura avevano un colore giallino
abbastanza simile. Allo spettrofotometro (a 420 nm) la cosa e' stata
confermata dalle misure di assorbanza. Mi e' venuto un dubbio: il
reattivo di Nessler e' stabile nel tempo oppure perde la sua capacita'?
Di che colore si presenta solitamente? Puo' essere conservato in frigo?
Chiedo queste cose perche' la soluzione (in forma gia' preparata) era di
colore aranciato. L'altra possibilita' e' che il cloruro di ammonio non
era cloruro di ammonio, ma la cosa avrebbe dell'incredibile.
Poi avrei altre domande. C'e' qualche esperto del metodo che puo'
aiutarmi?
Grazie
mrg     

non è che in giro per il laboratorio c'era ammoniaca?
il saggio è molto sensibile e basta avere i contenitori sporchi o in
giro un po' di cloruro di ammonio o utilizzata prima dell'ammoniaca e
la calibrazione viene piatta.  
ciao

 ciao
Ci ho pensato, ma 8 matracci che reagiscono allo stesso modo anche se il
NH4Cl e' in concentrazione diversa mi fanno pensare che una delle
sostanze reagenti non ha reagito. Poi la calibrazione e' stata fatta
anche contro un bianco di solo acqua ed i risultati sono i medesimi.

 anche contro un bianco di solo acqua ed i risultati sono i medesimi.
I medesimi in che senso?
Cio�, il bianco di acqua demineralizzata contenente 1 cc di reattivo
di Nessler era diventato giallo come le soluzioni dei matracci che 
contenevano
(o avrebbero dovuto contenere) concentrazioni variabili di ammoniaca
(da 0,1 a 1 ppm NH3), oppure le soluzioni tarate di NH3 a diversa
concentrazione sono rimaste incolori come il bianco?
(Il reattivo di Nessler conferisce all'acqua esente da NH3 solo una
impercettibile colorazione giallina e oltre 1 ppm NH3 la colorazione
� cos� intensa, fino a precipitazione, al punto che la calibrazione non
risulta pi� affidabile. Interferenze anche gravi sono causate dalla
presenza di idrazina o di durezza, ma presumo che, almeno per la
curva di calibrazione, sia stata usata acqua demineralizzata)
Nino 

 Nino 
Per fare una verifica ho azzerato il colorimetro con acqua (la stessa
usata per le diluizioni), ma senza Nessler. Usando la medesima cuvetta
al quarzo ho trovato la stessa misura di assorbanza per tutti i matracci
delle soluzioni per la retta di taratura. Da qui mi e' venuta l'idea che
o il Nessler non ha reagito oppure non ho messo cloruro di ammonio.
Ricordavo un Nessler incolore ed invece appare arancione. Potrebbe
essersi deteriorato in questi mesi lasciatoin frigo? 

Dipende da quanto il frigo viene aperto e dal recipiente dove viene
conservato (scuro). La soluzione di reagente di Nessler é molto
stabile (fino ad un anno) ma molto sensibile alla luce.
Molto piú instabile il cloruro di ammonio, la soluzione poi non dura
piú di due settimane in frigo.
Zille

 piú di due settimane in frigo.
Il cloruro di ammonio l'ho preparato ex-novo dal sale, che pero' era
conservato in un contenitore non proprio ottimale. In quella forma
potrebbe non essere molto stabile?

 essersi deteriorato in questi mesi lasciatoin frigo?
Quando è nuovo, il reattivo di Nessler è giallino chiaro. Alla luce, 
scurisce,
ma anche quando si presenta arancione è ancora efficace e produce
colorazione in presenza di ammoniaca. 

 potrebbe non essere molto stabile?
Mi autoquoto: il reattivo di Nessler puo' essere conservato per alcuni
anni al fresco, e' di colore giallino, ma puo' dar origine ad un
precipitato perche' trattasi di soluzione satura. In particolre quello
che ho usato risulta arancione quando agitato altrimenti e' giallino.
Cmq reagisce sicuramente perche' messo in contatto con abbondanti
quantita' di cloruro di ammonio viene sviluppato colore molto intenso.
L'errore che commettevo non dipendeva da me ma dal procollo usato che
presentava un errore di stampa (una diluizione troppo spinta per il
sale).
Una domanda: ma se si usano sempre gli stessi reagenti e solventi tutte
le volte la retta di taratura va ripetuta ogni volta? a rigor di logica
direi di si'. 

 direi di si'.
No.
Va controllata (un punto, a concentrazione possibilmente mediana della 
curva,
cioè a 0,3-0,5 ppm NH3) periodicamente, dipende dalla frequenza con cui
si fanno le analisi di routine dell'ammoniaca, es. ogni 6 mesi se si fanno
analisi settimanali.
Va ovviamente ripetuto tutto se l'analisi si esegue molto raramente o
su campioni molto diversi (come salinità e/o torbidità). 

 sale).
Benedetta gente... ora si usano "i protocolli..."
Una volta, i miei analisti i calcoli se li dovevano fare da soli,
i sali da pesare per le soluzioni standard e le quantità
di reattivi per la preparazione di acidi e basi a determinate
concentrazioni... 

 concentrazioni... 
I protocolli servono per due motivi: 1) non sono un chimico ed e' meglio
che non mi metta a fare troppi calcoli; potrebbe uscirne qualcosa di
innovativo. Nell'arte. 2) perche' permettono ad un ricercatore o ad un
analista di ripetere abbastanza similmente l'analisi. Quando si fa
l'analisi delle acque alla ricerca di una sostanza e' meglio
standardizzare i procedimenti. A volte la cosa e' addirittura richiesta
per legge.

 E io, cosa ti avevo detto?
In effetti, l'errore e' stato quello di fidarsi :-)

 concentrazioni...
Bé in veritá in calcoli te li devi fare anche adesso in molti casi. Il
problema sono i "kit" che hanno le soluzioni giá pronte e il
protoccolo diventa una mera ricetta da seguire alla lettera con il
risultato che se usi, per esempio nell'estrazione del DNA, un
microorganismo differente perché dotato di una capsula piú spessa il
kit non ti funziona ....
Zille

la difficoltà principale sta nel sapere cosa si sta facendo.
certo che una norma o un protocollo che sia sbagliato è cosa grave.
finchè si chiacchiera va bene tutto ma quando si scrive (in via
ufficiale) è bene ricontrollare.
una cosa che mi ha sempre aiutato e mi ha salvato da grossi guai è il
metodo delle aggiunte, se ipotizzo 1 ppm e ne aggiungo un altro devo
ottenere 2 ppm, non 11 o 101 ne' 1,1. questo serve quando i calcoli di
diluizione sono rognosi.
sui kit non mi pronuncio, servono a fare analisi negli acquari non di
certo per analisi delle acque soggette a leggi e prescrizioni.
buona serata

 buona serata
!?! Mi riferivo ai kit di biologia molecolare e grazie a dio che ci
sono altrimenti per estrarre e purificare DNA o fare una
trasformazione ai miei batteri ci mettevo un mese invece di una
settimana.
Comunque quello che volevo dire é che in laboratorio bisogna sempre
mantenere uno spirito critico e sopratutto pensare a quello che si sta
facendo. Nel caso dei miei ostici cianobatteri capsulati per esempio
ho aggiunto un passaggio con banho a 60ºC e agitazione con glass beats
e il problema si é risolto.
Buona serata anche a te
Zille


no, no, infatti una cosa è lo std interno, che serve a stabilizzare il
segnale ecc ecc.
un'altra cosa è il metodo delle aggiunte che come dici correttamente
tu serve per determinare una concentrazione incognita e/o un effetto
matrice
il mio suggerimento si riferisce ad una aggiunta quantificata X
dell'analita, se il risultato della mia precedente analisi è Y, dopo
aggiunta e analisi devo ottenere X+Y.
è solo una verifica della correttezza delle diluizioni in gioco ma
spesso è questo il passo scivoloso dove si commettono gli errori più
grossolani (tipo 10 volte il valore corretto).
costa nulla, è veloce, non è necessario essere precisissimi ma evita
grossolane figure di cacca.
ciao

 direi di si'.
ma guarda, questo è una scelta molto personale..
a rigor di logica la curva va rifatta ogni santa volta perchè il coeff
di estinzione
molare varia di volta in volta...
io ho lavorato in spettrofotometria per le proteine:
1) la curva la facevo tutti i giorni
2) i nostri vicini di laboratorio ne avevano una da millenni, hanno
usato quella
da quando ho memoria e l'hanno cambiata una volta che a una
studentessa era uscita più carina...
dipende proprio dalla puntigliosità, ma come mi hanno ben inquadrato
io la curva la rifarei ogni volta :P
anche perchè i nostri vicini da lab erano quelli che purificavano una
proteina e una volta che cadde sul bancone la risucchiarono con le
pipettatrici XD

 ha scritto nel messaggio 
news:1jh1yyb.v276r91ivtqgwN%devich...@margit.it...

Quanto tu dici mi fa sospettare che il reattivo è vecchio di almeno un anno. 
Il reattivo è deperibile e va conservato in bottiglia scura.
Io non perderei del  tempo inutilmente, ma preparerei del Nessler fresco.
Ciao
e.b.