○品川参考人　動物衛生研究所プリオン病研究センターの品川です。
　私は、皆様のお手元にあります資料をもとに、我が国のＢＳＥの検査、診断についてお話をいたします。
　資料一の図の方をごらんください。
　ＢＳＥなどプリオン病の病原体であるプリオンは、宿主の正常なプリオンたんぱくが特異な構造に変化した異常プリオンたんぱく質から構成されております。このようなプリオン病の特殊な事情から、診断上に問題が出てまいります。
　一つは、プリオン自身の遺伝子がないために通常の感染症のように高感度で遺伝子を検出するＰＣＲ法というようなものが使えませんし、プリオンが宿主のたんぱくに由来するために抗体がつくられません。このために血清診断を行うということもできません。また、正常なプリオンたんぱくと異常プリオンたんぱく質が混在しておりまして、これを通常の抗体では区別ができないということがあり、酵素処理など特別な処理を行うことによって両者を区別するという診断上の制約があります。
　それでは、次の図をごらんください。この図は、表になっておりますが、各種のＢＳＥの検査の比較を行ったものであります。
　臨床診断法といいますのは、発症していることが条件となります。時間はかかりませんが、診断を行う経験者の個人差が大きく判定に影響してまいります。
　それから、病理組織学診断は、潜伏期や初期の段階では病変がないかごく軽微なために診断ができない、あるいは不確かな場合があります。さらに、他の原因で類似の病変が形成されるというようなこともあります。
　異常プリオンたんぱく質、ＰｒＰＳｃを検出する方法は、特異性が高く、潜伏期からの診断も可能です。方法としまして、免疫組織化学と免疫生化学的な方法があります。免疫組織化学は、免疫学的に異常プリオンたんぱく質を組織標本上に褐色沈殿として可視化させます方法で、病変とのかかわりもわかるというような上で有用な方法です。ただ、標準化をするとか感度比較を行うということが免疫生化学検査よりも難しいということがあります。
　ウエスタンブロット法は、使用する抗体、検出用の基質が改良されまして、感度は動物を使うバイオアッセーに次いで高くなりました。さらに、パターンから非特異反応を区別することができます。
　ＥＬＩＳＡ法は、スクリーニング検査に用いられておりますように、比較的多数の検体を扱え、感度も高いのですが、発色の程度で判定しますので、非特異反応の区別が困難であるという欠点があります。
　バイオアッセーは、実験動物などに脳内接種を行って発症を観察する伝達試験であり、これは時間と経費がかかり、通常の研究では行われておりません。牛と実験動物の間には種の壁がありまして、ＢＳＥの場合、マウスを用いますとＥＬＩＳＡ法とほぼ同じ程度の感度しか得られません。プリオンたんぱく質遺伝子を牛型に改変した遺伝子改変マウスを使った場合、これは感度が高いのですが、それでもなお二百日以上要します。
　その次の図は、我が国で実施されておりますＢＳＥの検査を写真で示したものでありまして、ただいまの説明と重複いたしますので、ごらんになっていただくだけで結構です。説明は省略させていただきます。
　その次の図、これはＢＳＥの検査のための採材部位について示したものであります。
　英国における長年の羊スクレーピーの研究とＢＳＥの研究から、感染個体によるばらつきがほとんどなく、延髄のかんぬき領域に異常プリオンたんぱく質が蓄積するということが明らかにされました。そこでこの領域が使われているのであります。
　右上の図は、牛の頭部を縦割りにした図でして、頭と体を切り離してできる大孔、この部分から延髄を容易に取り出すことができます。下の図は、取り出した延髄の部分の模式図でして、四角く線で囲った部分がありますが、この部分がかんぬき領域です。このかんぬき領域の部分を輪切りにしますと左の図のようになりまして、非常に多くの神経核が存在します。とりわけ迷走神経背側核、孤束核など、四角く枠にくくって大きく書いてありますが、このような部分の神経核に比較的早期からプリオンが蓄積してまいります。このために、検査はこの領域を対象として行われております。
　次の図をごらんください。これはウエスタンブロット法の模式図を示したものです。
　まず、試料の中に混在します正常プリオンたんぱく質を酵素で分解する前処理を行った後に、ＳＤＳを主とした変性剤などで溶解しました組織抽出液あるいは組織たんぱく液、こういうようなものをポリアクリルアミドゲルの上に加えまして、電気泳動によってポリアクリルゲル中に分子量の大きさによって分散させます。次いで特殊なＰＶＤＦ膜に電気的に転写いたしまして、さらにこの膜をたんぱく溶液に浸して、ブロッキングと呼びますが、その後に特異抗体と反応させ、最終的に反応物の所在を抗体に結合させました酵素の反応である光によって知り、特異パターンを得る方法です。
　次の図をごらんください。この図は、ＥＬＩＳＡ法、プラテリアですが、このものとウエスタンブロット法の感度比較を行ったものです。
　我が国で摘発されましたＢＳＥの二つの症例の脳乳剤を正常の牛の脳乳剤で希釈いたしまして、希釈したものからそれぞれＥＬＩＳＡ法及びウエスタンブロット法用の試料を作製いたしました。そして、それぞれから異常プリオンたんぱく質が検出される範囲がどこであるかを比較したものです。
　左の方がＥＬＩＳＡ法の成績でして、四角くくくった図の中の下の方に線があります。この線がカットオフ値と呼ばれるものでして、この線の上の値であれば陽性、線から下は陰性ですが、ＢＳＥの検査の場合は、このカットオフ値のマイナス一〇％までを陰性とせずに確認検査を行います。
　そこの四角くくくった中の右下の方に千倍希釈のところがあります。十マイクログラムの脳に相当するところです。この矢印の反対の右の方を見ていきますと、ウエスタンブロットで八マイクログラム、おおよそ同じところになります。ＥＬＩＳＡ法では陰性ですが、ウエスタンブロット法では明瞭にバンドが確認できますし、さらに、その隣の二マイクログラムのところでも、ウエスタンブロット法では三本のバンドがうっすら観察することができます。
　本実験は感染症研究所の山河博士が行われたものですが、この方法では少なくともＥＬＩＳＡ法より五十倍以上の感度が得られております。我が国でＢＳＥ検査が始まった時点では、ウエスタンブロット法はＥＬＩＳＡに比べて十六倍高いという程度でありました。
　次の図をごらんください。繰り返しともなりますが、日本のＢＳＥ検査をもう一度まとめました。
　まず、検査の対象となる試料をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングをいたしまして、陽性と陰性で、陰性と判定できないというようなものを選び出します。
　これらのものを免疫組織化学及び病理組織学的、さらにウエスタンブロット法で確認検査を行います。
　検査の判定は、専門家から構成されます委員会が行います。この委員会は、判定以外に、検査にかかわる抗体だとか方法についての改良も検討いたしますし、それらの方法を検査に使用していいかどうかという承認も行っております。
　判定基準としまして、免疫組織化学あるいはウエスタンブロット法のいずれか、あるいは両方で異常プリオンたんぱく質が検出された場合を陽性とします。病理組織所見は参考程度です。
　これらの成績は、スクリーニング検査から確認検査まで、我が国では公表いたしております。
　さらに、検査で重要なことは、一番下のところに書いてありますが、検査精度を保証するということであります。我が国では、このために、免疫組織化学を行う場合には、ＢＳＥ陽性及び陰性対照の組織切片を同時に反応させます。ウエスタンブロット法の場合には、使用する抗体と反応することがわかっておりますスクレーピー感染マウス脳から作製されました標準試料を希釈しまして同時に解析を行います。対照あるいは標準試料の反応が適切であれば、調べようとする材料、披検試料の判定を行います。これらが満たされない場合は再検査となります。
　最後の図をごらんください。先ほども出てまいりましたが、日本で見つかっておりますＢＳＥ感染若齢牛の判定について説明を若干いたしたいと思います。
　我が国では、ウエスタンブロット法によって二例の若齢牛がＢＳＥ感染陽性というふうに判定されました。これらの症例は免疫組織化学が陰性であり、異常プリオンたんぱく質は少量でした。それで、このような陽性の判定に対して、感染性があるかないか不明であるとか、免疫組織化学が陰性であるなどということから、判定保留、灰色というような意見があるということも仄聞しておりますが、そのような意見は間違っております。
　図左の上下の写真は若齢牛の検査時のものです。ちょっと見づらいかもしれませんが、ＥＬＩＳＡ乳剤試料というのがあります。これは検査のときにＥＬＩＳＡ検査を行った残りの試料を示しておりますが、上下いずれの場合もここのところに明瞭に異常プリオンたんぱく質の蓄積を示すバンドが見られ、我が国の診断基準では紛れもなく陽性であります。
　異常プリオンたんぱく質は、プリオン感染あるいはプリオン病の動物あるいは人からしか検出できておりません。しかし、しばらく前まで、異常プリオンたんぱく質は病原体そのものというにはまだ十分の証拠がないという意見などもありました。このようなことが前記の異論の根拠となっているのかもしれません。
　右側に示しましたように、最近、試験管内で正常プリオンたんぱく質あるいは組み換えプリオンたんぱく質を使用しまして異常プリオンたんぱく質をつくり出し、これらが感染性を持つということを二つの研究グループが明らかにしました。すなわち、異常プリオンたんぱく質はプリオン病の病原体そのものであるという証拠が示されたわけであります。これらの研究成績は、異常プリオンたんぱく質が検出されればプリオンの感染陽性という我が国の判定基準の正しさを支持するものでありまして、二頭の若齢牛の判定は間違っていないということを示しているものであります。
　以上で、私の話を終わらせていただきます。