Resolución   798 / 2023
INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS
Fecha de publicación: 2023-12-06

INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS  Resolución 798/2023  RESOL-2023-798-APN-INASE#MEC  Ciudad de Buenos Aires, 05/12/2023  VISTO el Expediente N° EX-2023-132775133-APN-DA#INASE del Registro del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA del MINISTERIO DE ECONOMÍA y la Resolución N° RESOL-2023-744-APN-INASE#MEC de fecha 13 de noviembre de 2023 del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, y  CONSIDERANDO:  Que la Ley de Semillas y Creaciones Fitogenéticas N° 20.247 establece como objetivo garantizar la identidad y calidad de las semillas.  Que la calidad de las semillas también involucra a los aspectos relacionados con la sanidad de las mismas.  Que resulta de interés contar con una normativa referente a la habilitación y funcionamiento de laboratorios de análisis de patología de semilla físico-botánica que certificarán su sanidad.  Que la presente normativa permitirá reconocer la capacidad técnica de los laboratorios de análisis de patología de semilla físico-botánica contando con el seguimiento y control técnico del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA del MINISTERIO DE ECONOMÍA, en relación con las metodologías de ensayo y equipamiento que los laboratorios utilizarán para la identificación de patógenos en semillas.  Que la presente norma complementa la Resolución N° RESOL-2023-744-APN-INASE#MEC de fecha 13 de noviembre de 2023 del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS.  Que, debido a las características técnicas y diversidad de los ensayos fitosanitarios existentes, la habilitación por parte de los laboratorios para esta resolución es de carácter optativo a excepción de los laboratorios que deseen habilitarse para determinar Ascochyta rabiei en la especie garbanzo.  Que las condiciones que debe reunir un laboratorio y las normas para su funcionamiento dependen de los análisis y del material que pretenda analizar.  Que, a los fines de homogenizar los resultados de los ensayos de cada laboratorio, es necesaria la adecuación de la metodología de análisis e interpretación de los mismos.  Que por el Artículo 1° de la Resolución N° RESOL-2023-180-APN-INASE#MEC de fecha 4 de abril de 2023 del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA del MINISTERIO DE ECONOMÍA, y su respectivo Anexo I, se crean categorías que contemplan a los laboratorios.  Que la Dirección de Evaluación de Calidad, dependiente de la Dirección Nacional de Desarrollo de Semillas y Creaciones Fitogenéticas, la Dirección de Fiscalización, dependiente de la Dirección Nacional de Articulación Federal y la Dirección de Asuntos Jurídicos del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, han tomado la intervención técnica que les compete.  Que la COMISIÓN NACIONAL DE SEMILLAS creada por la Ley de Semillas y Creaciones Fitogenéticas N° 20.247, ha aprobado la nueva conformación del Comité Técnico de Patología de Semilla botánica según surge del Acta N° 494 en su reunión de fecha 14 de junio de 2022.  Que la COMISIÓN NACIONAL DE SEMILLAS, se ha pronunciado favorablemente según surge del Acta Nº 508, en su reunión de fecha 14 de noviembre de 2023.  Que la Dirección de Asuntos Jurídicos del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, ha tomado la intervención de su competencia.  Que la suscripta es competente para dictar el presente acto, en virtud de lo establecido en los Artículos 8º y 9º del Decreto Nº 2.817 de fecha 30 de diciembre de 1991, ratificado por la Ley Nº 25.845.  Por ello,  LA PRESIDENTA DEL DIRECTORIO DEL INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS  RESUELVE:  ARTÍCULO 1°.- Apruébanse las NORMAS DE FUNCIONAMIENTO DE LABORATORIOS DE ANÁLISIS DE PATOLOGÍA DE SEMILLA FÍSICO-BOTÁNICA, que como Anexo I (IF-2023-143481768-APN-INASE#MEC), Anexo II (IF-2023-143482430-APN-INASE#MEC) y Anexo III (IF-2023-143483271-APN-INASE#MEC) forman parte integrante de la presente resolución.  El alcance de la presente resolución abarca a los laboratorios que analicen muestras de semilla físico-botánica con el fin de informar el resultado de los análisis efectuados a un tercero, y, que, en forma optativa, deseen inscribirse en el INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, organismo descentralizado en la órbita de la SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA del MINISTERIO DE ECONOMÍA.  ARTÍCULO 2°.- Para comenzar el proceso de habilitación técnica del laboratorio, el interesado deberá presentar una nota solicitando la habilitación y los siguientes formularios debidamente completados: Solicitud de Habilitación (Anexo I-A), Alcance de la habilitación (Anexo I-B), Término de Compromiso del Director Técnico (Anexo I-C), Listado de Analistas (Anexo I-D), Detalle del Equipamiento (Anexo I-E), ante la Dirección de Evaluación de Calidad, dependiente de la Dirección Nacional de Desarrollo de Semillas y Creaciones Fitogenéticas del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS.  Toda documentación que no cumpla con los requisitos de fondo y de forma exigidos en la presente norma será devuelta (de ser identificable su autor) o desechada y se tendrá por nunca presentada.  ARTÍCULO 3°.- La habilitación del laboratorio de análisis de patología de semilla físico-botánica estará condicionada a la aceptación de la información presentada por el interesado, al título profesional del postulante al cargo de Director Técnico y la capacitación específica del mismo, a la disponibilidad del equipamiento mencionado en el Anexo II de la presente resolución, a la aprobación de la auditoría de habilitación, y al cumplimiento de los criterios y requisitos que el INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS establezca como necesarios.  ARTÍCULO 4°.- El postulante al cargo de Director Técnico deberá contar con título universitario oficial no menor de CUATRO (4) años con incumbencia profesional o grados superiores de educación (con incumbencia en la materia) y formación avalada por una institución de referencia, por ejemplo instituciones académicas o personas referentes con trayectoria en el área, y experiencia acreditable en el área técnica correspondiente al alcance de la habilitación solicitada. Al inicio de los trámites deberá presentar fotocopia del título profesional habilitante y de la matrícula profesional -de corresponder-, junto a un currículum vitae actualizado y firmado, con sus respectivos comprobantes.  De considerarlo necesario y bajo su entera responsabilidad podrá nombrar un Reemplazante Autorizado. Para esta designación deberá presentar debidamente completado ante la Dirección de Evaluación de Calidad, dependiente de la Dirección Nacional de Desarrollo de Semillas y Creaciones Fitogenéticas del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, la Designación de Reemplazante Autorizado (Anexo I-F), firmado por el autorizado y endosado por el Director Técnico.  ARTÍCULO 5°.- El Reemplazante Autorizado y los analistas deberán tener, por parte del Director Técnico, una capacitación y un entrenamiento acorde al alcance de la habilitación.  ARTÍCULO 6°.- La Dirección de Evaluación de Calidad, llevará a cabo la auditoría de habilitación y el control de los laboratorios inscriptos, estando obligado el Director Técnico a estar presente en las auditorías y a brindar al INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS toda la documentación que se requiera.  ARTÍCULO 7°.- La falta de envío de las propuestas de acciones correctivas para el levantamiento de no conformidades encontradas en la auditoría dentro del plazo establecido por el auditor, hará pasible al laboratorio de la aplicación de lo previsto por el Artículo 17.  ARTÍCULO 8º.- Una vez obtenida la habilitación técnica otorgada por la Dirección de Evaluación de Calidad, el interesado deberá proceder a su inscripción ante el Registro Nacional de Comercio y Fiscalización de Semillas (RNCyFS) dentro de los TREINTA (30) días de notificada la aprobación técnica por parte de la Dirección de Evaluación de Calidad. La habilitación del laboratorio se mantendrá vigente mientras el laboratorio cumpla los requisitos de la presente normativa, el pago de la anualidad y toda otra normativa complementaria del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS.  ARTÍCULO 9°.- En los casos que existan resultados cuestionados por las personas que solicitaron el servicio, los mismos corresponderán a la órbita de derecho privado, por lo que se deberán resolver entre el afectado y el laboratorio que hubiese realizado el servicio.  ARTÍCULO 10.- Los certificados emitidos por los laboratorios habilitados tendrán validez en el orden nacional y deberán ser confeccionados considerando los campos mínimos requeridos en el Anexo II de la presente resolución y según el alcance de habilitación. Para ser válidos, los certificados emitidos deberán contener sello y firma del Director Técnico quien se hará responsable del contenido de los mismos. Deberán estar debidamente completados no pudiendo contener borrones ni enmiendas ni ser completados a mano. Bajo responsabilidad del Director Técnico podrán ser firmados por el Reemplazante Autorizado designado.  ARTÍCULO 11.- La Dirección de Evaluación de Calidad podrá solicitar a los laboratorios copia firmada de los certificados emitidos y de cualquier registro asociado a estos.  ARTÍCULO 12.- Todos los laboratorios habilitados deberán participar de los ensayos interlaboratorios organizados por la Dirección de Evaluación de Calidad. Conjuntamente a lo anterior, la Dirección de Evaluación de Calidad podrá convocar tanto a los Directores Técnicos como a los analistas a jornadas, talleres o cursos de capacitación y actualización que estipule como obligatorios.  ARTÍCULO 13.- Toda modificación en la situación del laboratorio en cuanto a domicilio, instalaciones, Director Técnico, equipamiento o reactivos que afecten al desarrollo de ensayos, deberá comunicarse en forma fehaciente a la Dirección de Evaluación de Calidad, dentro de los TREINTA (30) días corridos de producida la modificación. La modificación no surtirá efecto hasta recibir la conformidad por parte de la Dirección de Evaluación de Calidad, es decir, el laboratorio no podrá realizar análisis ni emitir certificados hasta recibir la conformidad por parte de la Dirección de Evaluación de Calidad. Otros cambios en los datos suministrados en cualquiera de los Anexos presentados en el momento de la habilitación deberán ser informados mediante la presentación de un nuevo Anexo actualizado al momento de la auditoría o a requerimiento de la Dirección de Evaluación de Calidad.  ARTÍCULO 14.- Para que proceda el cambio de Director Técnico, el nuevo postulante al cargo deberá presentar toda la documentación requerida en los Artículos 2° y 4º, además de cumplir con los requisitos establecidos en la presente resolución. La presentación de la documentación no implica la designación automática del postulante en el cargo de Director Técnico, por lo que el laboratorio no podrá emitir certificados suscritos por el postulante hasta recibir la conformidad por parte de la Dirección de Evaluación de Calidad. En casos de acefalía en la Dirección Técnica, el laboratorio no podrá emitir certificados.  ARTÍCULO 15.- Los laboratorios de análisis de patología de semilla físico-botánica podrán habilitarse para realizar todos o algunos de los ensayos mencionados en el Anexo I-B, lo que definirá el alcance del laboratorio.  ARTÍCULO 16.- El Certificado de Habilitación Técnica emitido por la Dirección de Evaluación de Calidad deberá estar expuesto al público junto a la constancia de inscripción del Registro Nacional de Comercio y Fiscalización de Semillas (RNCyFS).  ARTÍCULO 17.- El INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS podrá advertir, apercibir, suspender o dar de baja la habilitación técnica y/o la inscripción del laboratorio en función de la ponderación de la gravedad de las siguientes faltas:  a) Incumplimiento de deberes y obligaciones emergentes de la presente norma.  b) Impedir la realización de auditorías, o que en las mismas se detecten reiteradas irregularidades, o ante el no levantamiento de las “no conformidades” detectadas dentro del plazo estipulado por el INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS.  c) Falsedad en la información y datos suministrados.  ARTÍCULO 18.- Los conceptos y casos no previstos en la presente normativa serán evaluados y resueltos por el INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS.  ARTÍCULO 19.- Regístrese, comuníquese, publíquese, dese a la Dirección Nacional del Registro Oficial y oportunamente archívese.  Silvana Babbitt  NOTA: El/los Anexo/s que integra/n este(a) Resolución se publican en la edición web del BORA -www.boletinoficial.gob.ar-  e. 06/12/2023 N° 99722/23 v. 06/12/2023   (Nota Infoleg: Los anexos referenciados en la presente norma han sido extraídos de la edición web de Boletín Oficial)  ANEXO I-A   SOLICITUD DE HABILITACIÓN      DATOS DEL LABORATORIO DE ANÁLISIS DE PATOLOGÍA DE SEMILLA FÍSICO-BOTÁNICA          DATOS DEL SOLICITANTE (RESPONSABLE LEGAL)                                                                  (Firma y aclaración del Responsable legal)   ANEXO I-B      ALCANCE DE LA HABILITACIÓN: (marcar con una 'X' las técnicas que requiera habilitación)     El abajo firmante solicita que el alcance de la habilitación a otorgar sea:    El presente formulario será válido una vez firmado por el Director Técnico.  ANEXO I-C   TÉRMINO DE COMPROMISO DEL POSTULANTE A DIRECTOR TÉCNICO     El abajo firmante declara asumir la entera responsabilidad técnica y administrativa de todos los procesos efectuados por el laboratorio para el cual se postula como Director Técnico, una vez inscripto en el Registro Nacional de Comercio y Fiscalización de Semillas (RNCyFS) del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS, comprometiéndose a ejecutar la tarea de Director Técnico de acuerdo con Resolución N°                       y con toda la legislación complementaria y directrices establecidas por el mencionado Instituto Nacional.  El presente formulario será válido una vez firmado por el Director Técnico.  ANEXO I-D     Cantidad de Analistas autorizados para ejecutar las técnicas dentro del alcance de la habilitación:                                      Fecha:                  El presente formulario será válido una vez firmado por el Director Técnico.  ANEXO I-E     (*) Para las cámaras de germinación deberá indicar las temperaturas de uso del equipo y si es alterna o constante.  Fecha:                  El presente formulario será válido una vez firmado por el Director Técnico.  ANEXO I-F      DESIGNACIÓN DE REEMPLAZANTE AUTORIZADO     Quien suscribe_________________________________________________________ D.N.I.: _________________________ en mi carácter de Director Técnico de Laboratorio de Análisis__________________________________________________ N° de Inscripción en el RNCyFS:____________, designo como Reemplazante  Autorizado a ______________________________, D.N.I.:______________________, declarando asumir la entera responsabilidad técnica por las tareas desarrolladas en el ejercicio de sus funciones. -  Se adjunta curriculum vitae actualizado del autorizado para su aprobación y fotocopia de D.N.I. -  La presente designación expira en el momento en que la Dirección de Evaluación de Calidad del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS reciba la Carta de Anulación por mí firmada y/o por parte del Responsable de la empresa o por la finalización del ejercicio de mis funciones como Director Técnico. -  Fecha:                                                                                         (Sello y Firma del Reemplazante Autorizado)   El presente formulario será válido una vez firmado por el Director Técnico.  IF-2023-143481768-APN-INASE#MEC     ANEXO II   NORMAS DE FUNCIONAMIENTO DE LABORATORIOS DE ANÁLISIS DE PATOLOGÍA DE SEMILLA FÍSICO-BOTÁNICA   GENERALIDADES  El alcance de la presente normativa es referente a las técnicas para el diagnóstico de patógenos mencionados en el Anexo I-B, que se transportan y/o transmiten a través de la semilla físico-botánica de las especies citadas en dicho Anexo.  Los laboratorios que deseen habilitarse para estos ensayos deberán enviar, a la Dirección de Evaluación de Calidad del INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS (INASE), toda la documentación mencionada en los Artículos 2° y 4°. Además, deberán contar con las condiciones ambientales, físicas y de equipamiento necesarias para el desarrollo de sus tareas. Para realizar los ensayos deberán emplear las metodologías mencionadas en el Anexo I-B y los protocolos indicados en el Anexo III.  Asimismo, se recomienda que se tengan en cuenta las normas de higiene y seguridad y aquellas referidas al descarte seguro de residuos del laboratorio.  INSTALACIONES  El área del laboratorio y cada una de sus dependencias deben ser compatibles con el volumen de muestras que se procesen y con el personal disponible. Se debe asegurar que el acceso y el uso de todas las áreas donde se efectúen análisis estén controladas apropiadamente y que la entrada de personas ajenas al laboratorio sea restringida, de manera que no se vea afectada la calidad de los análisis ni la confidencialidad de la información. Se deberá establecer una separación eficaz entre zonas vecinas cuando se desarrollen en ellas actividades incompatibles de forma que el acceso y el uso de todos los sectores sea definido y controlado, evitando comprometer la calidad de los análisis principalmente como consecuencia de contaminación cruzada. Los sectores del laboratorio estarán detallados en un croquis en escala que deberá presentarse al momento de la solicitud de habilitación.  EQUIPAMIENTO E INSUMOS  El laboratorio deberá estar provisto de todos los insumos y equipos necesarios para la correcta ejecución de los ensayos para los cuales está habilitado.  Cada equipo deberá tener una ficha técnica que contenga toda la información necesaria del mismo, así como las reparaciones, mantenimientos y calibraciones realizadas.  Todos los equipos deberán ser mantenidos en adecuado estado de funcionamiento, debiendo para ello elaborarse un plan de mantenimiento/verificación de los mismos.  Equipamiento mínimo requerido (de acuerdo al alcance solicitado):  • Microscopio óptico.  • Microscopio estereoscópico.  • Peachímetro rango de pH de 0 a 14, resolución 0,01, error +/- 0,1.  • Estufa de cultivo o cámara con luz y temperatura regulable.  • Balanzas analíticas, capacidad para pesar 120 gr., precisión 0,001 gr.  • Heladera y Freezer (-20 °C).  • Equipo para producción de agua destilada o similar (o agua destilada).  • Autoclave u olla a presión.  • Flujo laminar o recinto con tubo germicida.  • Centrífuga.  • Tamices (3.5, 2 y 1 mm de abertura).  • Hematocímetro.  • Agitador magnético.  • Cámara fotográfica.  • Implementos necesarios para realizar la división de la muestra.   Reactivos:  Los distintos reactivos empleados en los análisis de rutina deberán estar rotulados con: fecha de apertura del envase y fecha de vencimiento. Si se trata de soluciones preparadas en el laboratorio (como buffers), el rótulo deberá tener los siguientes datos: nombre de la solución, fecha de preparación, fecha de vencimiento, pH y nombre del analista que preparó la misma.  MATERIALES DE REFERENCIA  El laboratorio deberá contar con bibliografía para la identificación de patógenos en semilla físico-botánica (Claves taxonómicas, Manuales de identificación específicos, citas mencionadas en los protocolos del Anexo III).  Asimismo, se recomienda que el laboratorio arme su colección de referencia (semillas positivas para los patógenos dentro del alcance de la habilitación), con muestras de análisis que fueron dando positivas. El INASE podrá solicitar que se utilicen dichas semillas para la realización de alguno de los análisis en las auditorías.  Además, el laboratorio deberá contar con las Reglas ISTA vigentes (Capítulos 2 y 3).  PROCEDIMIENTOS, REGISTROS Y DOCUMENTOS  El laboratorio deberá mantener un sistema documental en el que consten los siguientes registros:  • Protocolos de análisis.  • Libro de ingreso de muestras.  • Boletín de análisis.  • Fotos de los análisis realizados donde se evidencien los resultados informados en el certificado.  • Certificados de análisis emitidos (copia electrónica o impresa).  • Registro de reactivos (facturas y/o remitos, fichas informativas que acompañan a los reactivos).  • Registro de equipos (listado de equipos, plan de mantenimiento, registros de controles, fichas técnicas).   Los registros no deben tener borrones. Cuando se detecten errores, los mismos deben ser salvados, no debiendo ser borrados, ni quedar ilegibles, ni eliminados y el valor correcto debe ser escrito al margen del error a salvar. Todas las alteraciones a los registros deben ser firmadas o visadas por la persona que realice la corrección.  Todos los registros, documentos y certificados emitidos deberán guardarse por un plazo de CINCO (5) años.  Libro de ingreso de muestras: se registrarán todas las muestras que ingresen al laboratorio, se haya emitido certificado o no, con número correlativo (muestras de control interno de calidad, particulares, entrenamiento, test de referencia, ensayos interlaboratorios y otras). Los campos mínimos obligatorios que debe contener este registro y que deben ser completados son: número de muestra o número de análisis, fecha de ingreso o de recepción de la muestra, remitente (solicitante), especie, análisis solicitados, fecha de emisión del certificado de análisis y observaciones.  Boletín de análisis: cada uno de los análisis realizados por el laboratorio debe estar respaldado por un Boletín de análisis. El Boletín de análisis deberá contar con la siguiente información: número de muestra o número de análisis, especie, identificación de los analistas involucrados, fecha de inicio y finalización del análisis (cuando sea aplicable). La información relativa a los análisis realizados (metodologías y resultados parciales y finales) debe ser registrada en forma clara y legible. Asimismo, se deberán tomar y almacenar fotos de los análisis realizados donde se evidencien los resultados informados en el certificado.  Informe de los resultados: los resultados de los análisis efectuados se informarán en el 'Certificado de Sanidad de Semilla Físico-Botánica'. Sólo podrán emitirse para los patógenos y técnicas de acuerdo al alcance de la habilitación. Los mismos deben contener como mínimo los siguientes datos:  Nombre del solicitante, Especie, Fecha de recepción de la muestra, Fecha de finalización de los análisis, Número de análisis, Fecha de emisión del certificado de análisis, nombre científico del patógeno, número de semillas analizadas y el método de diagnóstico utilizado (incluyendo cualquier pretratamiento físico o químico realizado en el laboratorio sobre la muestra de trabajo, que precede a la incubación, realizado sólo para facilitar el análisis).  En caso de resultado negativo (patógeno no detectado), el resultado debe informarse como 'no detectado'. En caso de resultado positivo, se deberá indicar 'detectado' como así también el porcentaje de semillas infectadas y la suma de las mismas, que indica la carga fúngica total.  Los certificados no pueden presentar borrones ni enmiendas y deben contener la correcta transcripción de los datos referentes a la muestra analizada. Para ser válidos deben contener el nombre y firma del Director Técnico y el membrete del laboratorio junto con el número de inscripción en el Registro Nacional de Comercio y Fiscalización de Semillas (RNCyFS).  MUESTRAS PARA ANÁLISIS  Para ser remitida, la muestra debe ser envasada de manera que no se altere el estado de sanidad de las semillas.  Una vez que ingresan al laboratorio, las muestras recibidas deben ser identificadas con su respectivo número de ingreso y deben ser mantenidas antes de la ejecución del análisis en condiciones adecuadas de manera de evitar eventuales alteraciones en la calidad de las mismas, debiendo ser analizadas lo antes posible.  Cuando la muestra de trabajo sea una parte de la muestra recibida, la reducción debe realizarse usando técnicas apropiadas y equipos limpios (para evitar la contaminación cruzada) y en buenas condiciones, acorde a los métodos permitidos para análisis sanitarios estipulados por ISTA en el Capítulo 2 de las Reglas.  Los análisis se deberán realizar sobre semilla pura, de acuerdo a la definición de semilla pura correspondiente al género que se analiza, según el Capítulo 3 de las Reglas ISTA.  La cantidad de semilla a utilizar será de DOSCIENTAS (200) a CUATROCIENTAS (400) semillas para el análisis de todos los patógenos según el Anexo III, a excepción de:  - OCHOCIENTAS (800) semillas para el caso de Cercospora sojina, debido a que este patógeno se suele presentar con incidencias menores al CUATRO POR CIENTO (4%).  - 100-120 g, conteniendo 2000-4000 semillas para Ustilago tritici y Ustilago nuda  - 50 g de semilla libre de soros o aglomeraciones de teliosporas para Tilletia spp. Después de su análisis, la muestra deberá ser almacenada en un lugar fresco y seco, con el fin de que los cambios en las características de la calidad de las semillas analizadas sean mínimos y poder repetir el análisis en caso de ser necesario. Deben guardarse en un archivo de semillas por el término de SEIS (6) meses contados a partir de su ingreso al laboratorio. La temperatura de conservación no debe superar los 20°C, con una tolerancia de + 3°C para variaciones eventuales. De ser necesario se deberán realizar tratamientos contra insectos, roedores y otros cuidados, para asegurar la conservación de las muestras.   AUDITORÍA DE VERIFICACIÓN INICIAL Y AUDITORÍAS DE SEGUIMIENTO  Las auditorías de verificación inicial son actividades desarrolladas por la Dirección de Evaluación de Calidad para habilitar un laboratorio. Asimismo, se realizarán auditorías de seguimiento para verificar el cumplimiento de los requisitos de la presente normativa.  La Dirección de Evaluación de Calidad acordará y comunicará al laboratorio la fecha de realización de la auditoría. El Director Técnico del laboratorio debe estar presente en el momento de la realización de las mismas.  Luego de cada auditoría, la Dirección de Evaluación de Calidad emitirá un informe en el cual se establecerá el plazo para efectuar las acciones correctivas de las no conformidades detectadas.  ENSAYOS INTERLABORATORIOS  Son actividades desarrolladas por la Dirección de Evaluación de Calidad o quien ésta designe, con el objetivo de evaluar el desempeño de los laboratorios. La Dirección de Evaluación de Calidad podrá solicitar el envío de muestras del archivo de semillas de los laboratorios, cada una de las cuales debe estar acompañada de las copias de los Certificados correspondientes, y copia de sus respectivos boletines de análisis y fotografías que evidencien los resultados, de ser requeridos. Los resultados de los análisis interlaboratorios serán comunicados al laboratorio evaluado, para que efectúe las acciones correctivas en caso de corresponder.  IF-2023-143482430-APN-INASE#MEC     ANEXO III   MÉTODO BLOTTER TEST CON CONGELAMIENTO SOBRE PAPEL   Aplicable para detectar Fusarium spp. en trigo, cebada y maíz; Drechslera tritici-repentis y Bipolaris sorokiniana de trigo y cebada; Drechslera teres en cebada; Stenocarpella maydis en maíz; Diaporthe spp., Sclerotinia sclerotiorum y Alternaria helianthi en girasol; y hongos de almacenamiento (Penicillium spp., Rhizopus spp., Mucor spp., y Aspergillus spp) en el caso de las Poáceas.  Procedimiento  Preparar bandejas plásticas para microondas (se recomienda utilizar de 16x20x5 cm) (ver Nota 1) con CUATRO (4) hojas de papel de germinación y 40 ml de agua destilada estéril (ADE) como sustrato. Separar de la muestra un mínimo de DOSCIENTAS (200) semillas (verificar en el Anexo II qué cantidad de semillas debe utilizarse en cada caso) y proceder a la desinfección superficial con hipoclorito de sodio al 1% de cloro activo (ver Nota 2) durante 1-2 minutos, luego realizar DOS (2) enjuagues sucesivos con agua destilada estéril durante 1 minuto cada uno, y finalmente orear las semillas sobre papel de filtro esterilizado. Sembrar en las bandejas en diseño 10x5 semillas. Mover las bandejas cuidadosamente. Incubar 24 h a temperatura constante de 20 °C ± 2 °C para trigo y cebada, o de 23-25 °C ± 1 °C para soja, maíz y girasol (8 h de luz y 16 h de oscuridad), seguido de 24 h a -20 °C, y luego SIETE (7) días a temperatura constante de 20 °C ± 2 °C para trigo y cebada, o de 23-25 °C ± 1 °C para soja, maíz y girasol en ciclos alternados de OCHO (8) h de luz y DIECISÉIS (16) h de oscuridad (ver Nota 3).  Observar la macromorfología en forma directa y bajo lupa binocular con aumento de 20-40X y la micromorfología, al microscopio óptico (ver Nota 4) con aumento de 200-400X, aunque algunas lupas permiten ver diversas microestructuras. De esta manera será posible la identificación de los patógenos. Se calcula la incidencia como el porcentaje de semillas que presentan el patógeno.  Nota 1: Una variante es sembrar en placas de Petri. Su uso facilita la observación bajo lupa ya que la placa entra completa en el campo visual.  Nota 2: Para preparar la solución de hipoclorito de sodio al 1% de cloro activo a partir de lavandina comercial, tener en cuenta la concentración inicial que figura en el envase y hacer la dilución correspondiente. El porcentaje de cloro activo decrece rápidamente en solución, por lo tanto, la solución de NaClO debe guardarse en oscuridad y usarse dentro de los TRES (3) días de su preparación. Es posible verificar la concentración de cloro usando tiras reactivas para cloro.  Nota 3: Los tubos de luz para la incubación pueden ser fluorescentes, LED o NUV.  Nota 4: Para realizar el preparado se podría utilizar portaobjeto y cubreobjeto o bien, portaobjeto y un trozo de cinta adhesiva transparente, utilizando agua como líquido de montaje.  Referencias  Scandiani M.M., Luque A.G. 2009. Manual: identificación de Patógenos en Semilla de Soja. Suplemento Especial N° 2. Análisis de semillas. 148 p. ISSN 1852-5024.  Mathur S.B., Kongsdal O. 2003. Common Laboratory Seed Health Testing Methods for Detecting Fungi. ISTA. 1° ed. 425 pp.  Machado J.C., Langerak C.J., Jaccoud-Filho D.S. 2002. Seed-borne fungi: A Contribution to Routine Seed Health Analysis. ISTA. 134 pp.  Limonard T. 1966. A modified blotter test for seed health. Neth. J. Pl. Path. 72:319-321.  MÉTODO BLOTTER TEST ESTÁNDAR SOBRE PAPEL   Aplicable para detectar Fusarium spp. en trigo, cebada y soja, Cercospora kikuchii y Diaporthe spp. en soja, Sclerotinia sclerotiorum en soja y girasol, y hongos de almacenamiento (Penicillium spp., Rhizopus spp., Mucor spp., y Aspergillus spp).  Procedimiento  Preparar bandejas plásticas para microondas (se recomienda utilizar de 16x20x5 cm) (ver Nota 1) con CUATRO (4) hojas de papel de germinación y entre 80 a 90 ml de agua destilada estéril (ADE) como sustrato. El volumen de ADE puede variar según la semilla a analizar. Separar de la muestra un mínimo de DOSCIENTAS (200) semillas (verificar en el Anexo II qué cantidad de semillas debe utilizarse en cada caso). En este momento se puede optar por realizar una desinfección previa, de acuerdo al objetivo. En caso de elegir esta opción, proceder a la desinfección superficial con hipoclorito de sodio al 1% de cloro activo (ver Nota 2) durante 1-2 minutos, luego realizar DOS (2) enjuagues sucesivos con ADE durante 1 minuto cada uno, y finalmente orear las semillas sobre papel de filtro esterilizado. Sembrar en las bandejas con un diseño 10x5 semillas. Mover las bandejas cuidadosamente para evitar que las semillas se corran o desordenen tocándose unas con otras. Incubar SIETE (7) días a temperatura constante de 20 °C ± 2 °C para trigo y cebada, o de 23-25 °C ± 1 °C para soja, maíz y girasol, en ciclos alternados de OCHO (8) h de luz y DIECISÉIS (16) h de oscuridad (ver Nota 3).  Observar la macromorfología en forma directa y bajo lupa binocular con aumento de 20-40X y la micromorfología, al microscopio óptico (ver Nota 4) con aumento de 200-400X aun cuando algunas lupas permiten ver algunas microestructuras como microesclerocios, acérvulas, esporodoquios, peritecios, picnidios, etc. De esta manera será posible la identificación de los patógenos. Se calcula la incidencia como el porcentaje de semillas que presentan el patógeno.  Nota 1: Una variante es sembrar en placas de Petri. Su uso facilita la observación bajo lupa ya que la placa entra completa en el campo visual.  Nota 2: Para preparar la solución de hipoclorito de sodio al 1% de cloro activo a partir de lavandina comercial, tener en cuenta la concentración inicial que figura en el envase y hacer la dilución correspondiente. El porcentaje de cloro activo decrece rápidamente en solución, por lo tanto, la solución de NaClO debe guardarse en oscuridad y usarse dentro de los TRES (3) días de preparación. Es posible verificar la concentración de cloro usando tiras reactivas para cloro.  Nota 3: Los tubos de luz para la incubación pueden ser fluorescentes, LED o NUV.  Nota 4: Para realizar el preparado se podría utilizar portaobjeto y cubreobjeto o bien, portaobjeto y un trozo de cinta adhesiva transparente, utilizando agua como líquido de montaje.  Referencias  Scandiani M.M., Formento A.N., Luque A.G. 2021. identificación de patógenos en Semillas de Trigo. 1a ed. adaptada. Vicente López, Syngenta. 160 p. ISBN 978-987-45623-2-6.  Scandiani M.M., Formento A.N., Luque A.G. 2021. identificación de patógenos en Semillas de Maíz. 1a ed. adaptada. Vicente López, Syngenta. 228 p. ISBN 978-987-45623-3-3.  Carmona M.A., Reis E.M. 2019. Patología de semillas de trigo y cebada. Detección, epidemiología y manejo. 1a ed. ampliada. Vicente López, Marcelo Aníbal Carmona. 152 p. ISBN 978-987-783¬154-2.  Scandiani M.M., Luque A.G. 2009. Manual: identificación de Patógenos en Semilla de Soja. Suplemento Especial N° 2. Análisis de semillas. 148 p. ISSN 1852-5024.  MÉTODO BLOTTER TEST CON RESTRICCIÓN HÍDRICA   Aplicable para detectar Cercospora kikuchii, Cercospora sojina y Fusarium spp. en soja, trigo, cebada y maíz.  Procedimiento  Preparar bandejas plásticas para microondas (se recomienda utilizar de 16x20x5 cm) (ver Nota 1) con CUATRO (4) hojas de papel de germinación y 40 ml de solución de NaCl (sal de mesa en concentración 11,81 g/l agua destilada, presión osmótica -1 Mpa) como sustrato. Separar de la muestra un mínimo de DOSCIENTAS (200) semillas (verificar en el Anexo II qué cantidad de semillas debe utilizarse en cada caso) y proceder a la desinfección superficial con hipoclorito de sodio al 1% de cloro activo (ver Nota 2) durante 1-2 minutos, luego realizar DOS (2) enjuagues sucesivos con agua destilada estéril durante 1 minuto cada uno, y finalmente orear las semillas sobre papel de filtro esterilizado. Sembrar en las bandejas en diseño 10x5 semillas. Mover las bandejas cuidadosamente. Incubar SIETE (7) días a temperatura constante de 20 °C ± 2 °C para trigo y cebada, o de 23-25 °C para soja, maíz y girasol, en ciclos alternados de OCHO (8) h de luz y DIECISÉIS (16) h de oscuridad (ver Nota 3).  Observar en forma directa y bajo lupa binocular con aumento de 20x-40X la macromorfología y al microscopio óptico (ver Nota 4) con aumento de 200-400X la micromorfología, aunque algunas lupas permiten ver microestructuras. De esta manera será posible la identificación de los patógenos. Se calcula la incidencia como el porcentaje de semillas que presentan el patógeno.  Nota 1: Una variante es sembrar en placas de Petri. Su uso facilita la observación bajo lupa ya que la placa entra completa en el campo visual.  Nota 2: Para preparar la solución de hipoclorito de sodio al 1% de cloro activo a partir de lavandina comercial, tener en cuenta la concentración inicial que figura en el envase y hacer la dilución correspondiente. El porcentaje de cloro activo decrece rápidamente en solución, por lo tanto, la solución de NaClO debe guardarse en oscuridad y usarse dentro de los TRES (3) días de preparación. Es posible verificar la concentración de cloro usando tiras reactivas para cloro.  Nota 3: Los tubos de luz para la incubación pueden ser fluorescentes, LED o NUV.  Nota 4: Para realizar el preparado se podría utilizar portaobjeto y cubreobjeto o bien, portaobjeto y un trozo de cinta adhesiva transparente, utilizando agua como líquido de montaje.  Referencias  Machado J. da C., Oliveira J.A., Vieira M. das G., Alves M. de C. 2003. Controle da germinação de sementes de soja em testes de sanidade pelo uso da restrição hídrica. Revista Brasileira de Sementes 25(2): 77-81.  Scandiani M.M., Luque A.G. 2009. Manual: Identificación de Patógenos en Semilla de Soja. Suplemento Especial N° 2. Análisis de semillas. 148 pp. ISSN 1852-5024.  MÉTODO DE EXTRACCIÓN DEL EMBRIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE Ustilago tritici   Este test se emplea para la detección del 'carbón volador del trigo” Ustilago tritici. Aplicable para detectar los patógenos que se encuentran infectando las semillas como micelio durmiente en el embrión de la semilla. Se considera que el tamaño conveniente para una muestra de trabajo es de unos 100-120 g, conteniendo 2000-4000 semillas. La muestra debe ser extraída al azar y debe ser representativa del lote. Se examinan un mínimo de MIL (1000) embriones.  Procedimiento  La muestra de trabajo se sumerge en un litro de solución de NaOH al 5% recientemente preparado (ver Nota 1) conteniendo 0,2 g de azul de Tripan (ver Nota 2), donde se deja por unas 22-24 h a aproximadamente 20 °C. Luego de este período de extracción, se lava la muestra con agua corriente o agua caliente para facilitar la liberación de los embriones. Para separar los restos de las semillas de los embriones se utiliza una batería de TRES (3) tamices (3.5, 2 y 1 mm de abertura). Esta extracción debe ser realizada con gran cuidado, pues los embriones de trigo son muy delicados y hay que evitar la rotura del escutelo. Una vez separados los embriones, estos son suspendidos en un líquido de partes iguales (1+1+1) de ácido láctico, glicerina y agua destilada. En estas condiciones, los embriones flotan mientras que las impurezas acompañantes bajan y son fácilmente removidas. Este proceso se repite varias veces hasta obtener una muestra de embriones razonablemente limpia. Luego se clarifican transfiriéndolos a un vaso de precipitados con ácido láctico libre de agua, se hierven durante unos TREINTA (30) segundos, y se escurren. Para la observación se utiliza glicerina como líquido de montaje; los embriones totalmente inmersos en el líquido de montaje son dispuestos en líneas para facilitar el examen y el conteo (Figura 1). Se examina cuidadosamente cada embrión bajo lupa con aumento de 18-25X con iluminación transmitida (desde abajo). El ataque puede manifestarse en distintos grados, desde la presencia de unas pocas hifas cortas hasta la invasión completa de los tejidos del escutelo (Figura 2). Se cuentan los embriones infectados y el total de embriones revisados. El porcentaje de carbón se calcula sobre el total de embriones contados (no sobre el total de embriones de la muestra).    Figura 1: Montaje de embriones en glicerina para observación en lupa. Foto: Astiz Gasso M.M.     Figura 2: A.- Embrión de trigo sin presencia del hongo; B,C,D: Muestras positivas con presencia de las hifas del hongo Ustilago tritici en diferentes zonas del embrión de trigo (Fotos M.M. Astiz Gassó).   Nota 1: Una solución de NaOH menos concentrada o una temperatura menor hacen dificultosa la extracción.  Nota 2: El azul de tripano o de tripán colorea de azul el micelio presente en los embriones infectados, ya que el micelio de U. tritici no puede detectarse sin el agregado de un colorante.  Referencias  Rennie W.J., Seaton R.D. 1975. Loose smut of barley. The embryo test as a means of assessing loose smut infection in seed stocks. Seed Science and Technology 3: 697-709.  Khanzada A.K., Rennie WJ., Mathur S.B., Neergaard P. 1980. Evaluation of two routine embryo test procedures for assessing the incidence of loose smut infection in seed samples of wheat (Triticum aestivum). Seed Science and Technology 8(3):363-370.  TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN DE Ustilago nuda   Estos métodos son aplicables para detectar Ustilago nuda en semillas de cebada. La muestra de trabajo consiste en 100-120 gramos, conteniendo 2000-4000 semillas. La muestra debe ser extraída al azar y debe ser representativa del lote. Se examinan un mínimo de MIL (1000) embriones.  1. Método de extracción del embrión  Este método se puede utilizar para detectar Ustilago nuda en semillas de cebada no tratadas y en semillas a las que se les ha aplicado un tratamiento químico.  Procedimiento  Sumergir las semillas en un litro de solución acuosa recién preparada de hidróxido de sodio (NaOH) al 5 %, y mantener a 20 °C durante VEINTICUATRO (24) h (ver Nota 1). Después de embeber, toda la muestra debe transferirse a un recipiente adecuado y ser lavada con agua tibia para separar los embriones, los que aparecen a través de los pericarpios reblandecidos. Recolectar los embriones en un tamiz con malla de 1 mm; se pueden usar tamices adicionales de mayor tamaño para recolectar trozos de endosperma y paja. Transferir los embriones a una mezcla de cantidades iguales de glicerol y agua, en la cual se puede realizar una separación adicional de embriones y paja. Luego, transferir los embriones a un vaso de precipitados que contenga 50 ml de solución de ácido láctico (con o sin azul de metileno, ver Nota 2), y limpiarlos manteniendo la solución de ácido láctico en el punto de ebullición durante aproximadamente CINCO (5) min en una campana de extracción. Transferir los embriones a glicerol fresco para su evaluación: el escutelo se vuelve más transparente cuando los embriones se dejan en glicerol durante 1-2 h, lo que facilita la evaluación.  Examinar los embriones bajo lupa con aumento de 16X-25X con una adecuada iluminación, para observar el micelio característico de U. nuda: de aproximadamente de 3 pm de grosor, de color marrón dorado, y visible sin tinción (Figura 1). El grado de infección puede variar desde la presencia de unos pocos filamentos de hifas cortas hasta la completa invasión de los tejidos del escutelo. Ocasionalmente, otros hongos distintos de U. nuda se presentan en el escutelo, pero generalmente son de color más oscuro y bastante distintos. Cuando las paredes de las células se decoloran, pueden confundirse con el micelio de U. nuda, pero esto puede verificarse mediante un examen con aumento de 50X o mayor (Figura 2).    Figura 1. Embrión infectado, micelio del carbón (S) en el escutelo.     Figura 2. Micelio del carbón en el escutelo.   2. Método de descascarado y extracción embrionaria  Este método difiere del método de extracción del embrión previamente desarrollado (Método 7-013a de las Reglas ISTA 2023) en la técnica de extracción del embrión y en el procedimiento usado para la limpieza de los embriones para examinar el micelio de Ustilago. Los dos métodos producen resultados equivalentes (ISTA, 2011). Este método no ha sido validado para la determinación de U. nuda en semilla tratada, por lo que los tratamientos a la semilla podrían afectar el desempeño.  Procedimiento  a) Descascarado  Poner la muestra de trabajo en un vaso de precipitado de vidrio con ácido sulfúrico (H2SO4) 25-37% hasta que las semillas estén cubiertas. Incubar en una estufa a 75 °C por CINCUENTA (50) min o hasta que las semillas se pongan de un color marrón mediano. Luego quitar cuidadosamente la solución de H2SO4. Enjuagar las semillas vertiendo agua en el vaso de precipitados, mezclar cuidadosamente, y eliminar el agua. Agregar agua nueva y remover las cáscaras que se sueltan al agitar con fuerza con una varilla. Remover las cáscaras eliminando cuidadosamente el agua. Si aún quedan cáscaras, añadir nuevamente agua y usar un mezclador eléctrico de mano a baja velocidad (máximo TRES (3) min), o bien continuar agitando. Repetir el procedimiento hasta que se eliminen todas las cáscaras. Tener cuidado de no perder ningún grano (semilla pelada).  b) Extracción del embrión  Colocar los granos drenados en un contenedor con solución de NaOH-NaCl. Incubar durante la noche (aproximadamente 15 h) a 22 °C ± 3 °C. Agitar la mezcla suavemente para soltar los embriones de los granos. Verter los embriones sueltos, los cuales flotan en la parte superior del líquido, en el vaso de precipitado. Repetir el procedimiento hasta que todos los embriones estén liberados. Para asegurarse de que no queden embriones restantes, poner los granos disueltos en la parte superior de un tamiz grueso combinado con un tamiz fino. El tamiz grueso debe tener una malla de aproximadamente 2,4 mm, suficiente para dejar pasar los embriones, pero retener los restos de grano. El tamiz fino debe tener una malla de 1 mm. Si hay algún embrión en el tamiz de abajo, añadir éstos al vaso de precipitado. Usando un tamiz fino, drenar la solución de NaOH-NaCl de los embriones y enjuagar con agua corriente por aproximadamente DIEZ (10) seg. Si hay una gran cantidad de paja con los embriones, agregar agua y remover la paja flotante. Drenar los embriones, ponerlos en un vaso de precipitados y cubrirlos con ácido láctico (con o sin solución de azul de metileno, ver Nota 2). Incubar durante la noche en una estufa a 75 °C ± 5 °C. Usando un tamiz fino, drenar el ácido láctico de los embriones. Los embriones pueden ponerse más transparentes al ser lavados con etanol o al ser cubiertos por algunos minutos con etanol 95 %. Finalmente, cubrir los embriones con solución de glicerol-etanol (95 %) (1:2) o glicerol puro. Examinar los embriones bajo lupa con aumento de 16-25X con una adecuada iluminación, para observar el micelio característico de U. nuda, como fue descripto para el método de extracción del embrión (Método 7-013a de las Reglas ISTA 2023).  Nota 1: Una solución más débil de NaOH o una temperatura más baja dificulta la extracción.  Nota 2: Por cada 1000 ml de ácido láctico, se agregan 0,16 g de azul de metileno.  Referencias  ISTA, 2011. Alternative embryo extraction procedure to 7-013b Ustilago nuda/Hordeum vulgare. Method Validation Reports. International Seed Testing Association, Bassersdorf, Switzerland.  Métodos 7-013a y 7-013b de las Reglas ISTA (2023).  MÉTODO DE DETECCIÓN DE Drechslera teres EN SEMILLAS DE CEBADA   Aplicable para detectar Drechslera teres en semillas de cebada. Este método no ha sido validado para la determinación del patógeno en semillas tratadas, por lo que los tratamientos a la semilla podrían afectar el desempeño del método. El tamaño mínimo de muestra debe ser CUATROCIENTAS (400) semillas.  Procedimiento  Colocar las semillas en bandejas o placas abiertas, en una capa delgada, y calentar por DOS (2) h en una estufa a 90 °C para reducir el crecimiento de saprófitos. Para preparar el sustrato, sumergir rápidamente papel de filtro en solución de azúcar (170 g de azúcar por litro de agua desionizada o agua del grifo (ver Nota 1) y drenar el exceso de solución. Perforar 50 o 100 huecos en el papel de filtro, y colocar el papel de filtro perforado en una placa con una tapa transparente de cierre hermético. Sembrar las semillas sobre el papel, una semilla por pocillo, sembrada a mano o mediante una aspiradora de conteo (si se dispone de una). Incubar las muestras por siete días, alternando períodos de luz brillante (al menos 4000 lux) de 16 a 26 °C ± 2 °C con períodos de oscuridad de 8 h a 22 °C ± 2 °C. Se debe incubar una muestra de semillas control con un nivel de infección conocido, bajo las mismas condiciones que las muestras de análisis u otro control adecuado. Finalmente, sacar las semillas y verter solución de NaOH al 1 % sobre el papel de filtro. Se utilizan aproximadamente 15 ml para un papel con CINCUENTA (50) pocillos, y el doble de esa cantidad para un papel con CIEN (100) pocillos. El pigmento de color rojo ladrillo cambiará inmediatamente a un color violeta. Contar las manchas pigmentadas de color violeta bajo una lámpara de aumento. Las manchas muy tenues (es decir, las manchas más pequeñas sin color violeta distintivo) no deben ser registradas (Figuras 1-3). Comparar con el control positivo (material de referencia).    Figura 1. Una placa luego de la incubación de las semillas.     Figura 2. Una placa luego de remover las semillas incubadas, antes de agregar la solución de NaOH.      Figura 3. Ampliación de manchas visibles en los papeles secantes, luego de agregar la solución de NaOH. Manchas tenues que no se registran (arriba) y manchas normales a ser registradas (abajo).   NOTA 1: El agua destilada no es adecuada, debido a cierta hidrólisis del azúcar que produce acidificación. La solución de azúcar no debe ser almacenada por más de una semana, y la temperatura durante el almacenamiento no debe exceder los 25 °C. Si hay alguna sospecha de crecimiento de microorganismos, la solución de azúcar no debe ser utilizada.  Referencias  Método 7-027 de las Reglas ISTA (2023).  PROTOCOLOS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO (MC) *   1. AGAR POROTO LIMA (LBA)  Aplicable para la detección de Drechslera tritici-repentis en semillas de trigo.  Preparación   Procedimiento para UN (1) litro  1. Agregar CINCUENTA (50) g de porotos lima y OCHOCIENTOS (800) ml de agua destilada en un Erlenmeyer de MIL (1000) ml.  2. Tindalizar por TREINTA (30) min.  3. Filtrar recogiendo el sobrenadante.  4. Llevar a volumen con agua destilada y calentar el agua a 60 °C.  5. Agregar de a poco el agar agar con agitación. Una técnica es tomar una alícuota de DOSCIENTOS (200) ml de líquido en un frasco con tapa, agregar 1/5 de los sólidos, cerrar la tapa, agitar y reincorporar al resto del líquido. Repetir la operación hasta introducir la totalidad del agar.  6. Mantener el calentamiento por VEINTE (20) minutos con agitación periódica. Se recomienda el uso de una varilla de vidrio.  7. Llenar CUATRO (4) frascos de TRESCIENTOS CINCUENTA (350) ml con la totalidad del medio producido, dejando las tapas a medio cerrar.  8. Esterilizar por autoclave durante VEINTE (20) minutos a 121°C.  9. Una vez frío, abrir el autoclave y cerrar fuerte los frascos.  10. Registrar los frascos con el nombre 'Medio poroto lima” y la fecha de preparación.  11. Almacenar en el lugar adecuado.  2. AGAR PAPA GLUCOSADO  Aplicable para detectar Fusarium spp. en trigo, cebada, soja y maíz; Diaporthe spp. y Scletorinia sclerotiorum en soja y girasol; Stenocarpella maydis en maíz y Ascochyta rabiei en garbanzo.  El medio agar papa glucosado (APG) se puede preparar utilizando agar papa dextrosa comercial (39 g de agar papa dextrosa en 1000 cm3 de agua destilada), o de manera casera partiendo de un extracto de papas, agar agar y glucosa.  Preparación del extracto de papa UN (1) litro:  Cortar DOSCIENTOS (200) g de papas peladas en cubos de 1 cm3. Colocar en un vaso de precipitado con SEISCIENTOS (600) ml de agua destilada. Hervir por TREINTA (30) minutos y luego filtrar con un paño. Lavar el sobrenadante con DOSCIENTOS (200) ml de agua destilada. Llevar a MIL (1000) ml con agua destilada.  Preparación del medio agar papa glucosado (APG) al 2 % UN (1) litro:  Calentar UN (1) litro de extracto de papa a 60 °C. Pesar VEINTE (20) g de agar agar y VEINTE (20) g de glucosa, y mezclar los sólidos. Agregarlos de a poco al extracto de papa, con agitación. Esterilizar por autoclave durante VEINTE (20) min a 121 °C.  Para obtener APG en otros porcentajes (por ej., al 1%), únicamente se debe modificar de manera acorde la cantidad de agar agar que se agrega a la preparación (por ej., pesar 10 g de agar agar para obtener APG al 1%).  3. PROCEDIMIENTO  Preparar grupos compuestos por un mínimo de DOSCIENTAS (200) semillas (verificar en el Anexo II qué cantidad de semillas debe utilizarse en cada caso). Realizar una desinfección superficial con una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 0,1% (ver Nota 1) durante 1-2 min. Luego enjuagar con agua desmineralizada estéril durante 1 min. Dejar secar en papel de filtro estéril. Una vez secas, las semillas se siembran en placas de Petri de vidrio de 9 cm conteniendo el medio de cultivo elegido. Incubar a la temperatura de crecimiento establecida/ideal para la especie durante CINCO (5) a SIETE (7) días en ciclos de luz y oscuridad (la duración de las etapas de luz y oscuridad varía según la especie). Después de la incubación, las semillas se observan bajo una lupa estereoscópica (60X) en búsqueda de picnidios. Se debe confirmar la presencia de conidios, observando bajo un microscopio óptico (400X).  Especificaciones por especie:  Ascochyta rabiei en semillas de garbanzo.  Se preparan placas de Petri con aproximadamente 18 ml de medio de cultivo APG al 1,7% (200 g de papas peladas y cortadas, 20 g dextrosa, 17 g agar, 1000 cm3 agua destilada). Se siembran las semillas, y se incuban a 21 °C +/- 1 °C durante siete días en ciclos de luz: oscuridad de 12 h.  Diaporthe spp. en semillas de soja.  Método validado para análisis de Sanidad de Semillas 7-016 de las Reglas ISTA (2023). Variación: uso de agar papa dextrosa acidificada (APDA) (McGee, 1992).  Preparar y autoclavar medio APG como fue explicado anteriormente. Dejar enfriar a 50 °C aproximadamente, y ajustar el pH a 4,5 con ácido láctico 85 % estéril. Si se sospecha que el ácido láctico está contaminado, esterilizar mediante filtración. Verter en placas (22 ml por placa de Petri de 9 cm) y dejar solidificar a temperatura ambiente (aproximadamente a 22 °C) durante VEINTICUATRO (24) horas antes de usar. Las placas preparadas pueden ser almacenadas a temperatura ambiente o a 4 °C hasta TRES (3) semanas.  Nota 1: Para preparar la solución de hipoclorito de sodio al 0,1% de cloro activo a partir de lavandina comercial, tener en cuenta la concentración inicial que figura en el envase y hacer la dilución correspondiente. El porcentaje de cloro activo decrece rápidamente en solución, por lo tanto, la solución de NaClO debe guardarse en oscuridad y usarse dentro de los TRES (3) días de preparación. Es posible verificar la concentración de cloro usando tiras reactivas para cloro.  * Aclaración: como alternativa podrán utilizarse los medios de cultivo que se comercializan listos para usar.  Referencias  McGee D.C. 1992. Soybean diseases: A reference source for seed technologists. APS Press, St. Paul, MN. 151 p.  Sautua F.J., Casey S.A., Zapata R.L., Scandiani M.M., Carmona M.A. 2019. A comparison of methods for the detection of Ascochyta rabiei in chickpea seeds. Summa Phytopathologica, v.45, n.2, p.197-199.  TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE Tilletia spp.   Aplicable para detectar los patógenos Tilletia controversa, T. laevis y T. tritici que se encuentran infectando las semillas a través de esporas adheridas externamente a la superficie de la semilla.  1. Inspección Directa  Los granos carbonudos infectados con Tilletia controversa son globosos y duros, en cambio aquellos que presentan T. laevis y T. tritici son pulverulentos y de forma similar a la semilla sana. Usualmente no aparecen en la semilla limpia. Las teliosporas adheridas a las semillas (que causan el cepillo negro y el típico olor a pescado debido a la trimetilamina) solo pueden observarse en semillas con alto grado de infestación. Se ha encontrado que CINCO (5) mg de soros (aglomeraciones de teliosporas) contienen aproximadamente UN MILLÓN (1.000.000) de esporas.  2. Método del Filtrado  Es otro método descripto en la hoja de trabajo del ISTA que permite determinar presencia de las esporas en la muestra y por inferencia en el lote, pero que no cuantifica, por lo que solo nos limitaremos a nombrarlo.  3. Método del Hematocímetro (Pirson, 1978)  Muestra de trabajo  CINCUENTA (50) g de semilla libre de soros o aglomeraciones de teliosporas.  Lavado  Se agitan las semillas en un erlenmeyer con CINCUENTA (50) ml de agua conteniendo 0,1 % de detergente en forma intermitente con agitador magnético, durante unos DIEZ (10) min. Si se espera un bajo nivel de contaminación, la suspensión debe concentrarse. Para esto, se centrifuga a 1800 rpm por CUATRO (4) min (Figura 1), luego se extrae con una pipeta el líquido sobrenadante (menos 0,3 ml), sin agitar el fondo del tubo para no remover el pellet formado. El sedimento se resuspende agregando 0,2 ml de agua o líquido de montaje ácido láctico + glicerol + agua destilada (1+1+1).  Examen  se llenan ambas mitades del hematocímetro. Esto se debe hacer desde el margen del cubreobjetos hasta llenar el espacio entre el cubreobjetos y la cámara, evitando que caigan gotas sobre las acanaladuras (según el tipo de hematocímetro que se esté usando). Inmediatamente colocar el cubreobjetos, cuidando que no queden burbujas y que la gota no se derrame ni se salga de la zona de conteo, ya que el excedente arrastraría las esporas generando un dato erróneo. Una vez que el espacio se encuentre correctamente lleno, las esporas dejarán de moverse. Se requiere un manipuleo rápido y cuidadoso para evitar la sedimentación de las esporas. El campo de conteo que se debe utilizar depende del tamaño de las esporas o conidios del hongo con el que se esté trabajando. Si estos son grandes, lo más convenientes es contar en los cuadrados de las esquinas (A, B, C, D) más el cuadro del centro E. Con un aumento de 250 - 400X se cuentan las esporas dentro de todo el cuadrado del hematocímetro (Figura 2). Este procedimiento se repite hasta contar DIEZ (10) veces las cámaras, y luego se calcula el promedio. Si se encuentran esporas solo fuera del cuadrado, se registra como 'menos de 1” y no 0.  El número de esporas por g de semilla se calcula de la siguiente manera:    Si la suspensión fue concentrada por centrifugación el número de esporas calculado por gramo de semilla debe ser corregido, y el número de esporas por gramo de semilla encontrado en los aglomerados de esporas debe ser agregado.  CÁMARAS DE RECUENTO GLOBULAR  1. Cámara Fuchs-Rosental: la superficie de cada grilla es de 16 mm2 y está dividida en DIECISÉIS (16) cuadraditos de 1 mm de lado, cada uno de los cuales a su vez está dividido en CUATRO (4) cuadraditos de 0,25 mm de lado. El volumen que se lee en cada uno de estos cuadraditos menores es de 0,0625 mm2 (= 0,25 mm x 0,25 mm). Esta superficie se multiplica por la altura de la columna de líquido (= “Tiefe” en alemán): 0,0625 mm2 x 0,2 mm = 0,01250 mm3. Con lo cual, si contamos las esporas presentes en 80 cuadraditos (es decir, 5 cuadrados grandes), estaremos leyendo la cantidad presente en 0,01250 x 80 = 1 mm3. Estos valores de altura de columna y superficie pueden leerse impresos en la cámara.  2. Cámara de Neubauer: tiene grillas divididas en NUEVE (9) cuadrados de 1 mm2. Los centrales tienen más subdivisiones que los de los extremos, y la columna tiene una altura de 0,1 mm. También en esta pueden leerse impresos los valores de altura (Tiefe = 0,100 mm) y superficie: 0,0025 mm2 y 0,0625 mm2.    Figura 1: Preparación de muestra de semillas de trigo.     Figura 2: Recuento de esporas con hematocímetro.   Identificación y morfología de las teliosporas de las especies de Tilletia  Las teliosporas de T. laevis (= T. foetida; Figura 3) son de color castaño oliváceo, a veces muy claras o casi hialinas, globosas, subglobosas y muy irregulares, de 19-25 μ de Ø, con episporio grueso y liso. Células estériles hialinas, globosas o subglobosas, de 12-18 μ de Ø, lisas o ligeramente reticuladas. Su cantidad varía con los ejemplares y formas fisiológicas, desde muy escasas a abundantes.    Figura 3: Teliosporas de T. laevis.   Las teliosporas de T. tritici (= T. caries; Figura 4) son de color castaño a castaño oscuro, globosas u ovaladas de 14-25 μ de Ø, con episporio reticulado con celdillas de 1-1,5 μ de Ø, a veces con aspecto cerebroide y de profundidad variable. Células hialinas estériles y globosas de 10-18 μ de Ø, con episporio no muy grueso.    Figura 4: Teliosporas de T. tritici.   Las teliosporas de T. controversa (Figura 5) son de color castaño oscuro, castaño amarillento o amarillento, globosas, subglobosas o irregulares, de 19-30 μ de Ø incluyendo la membrana hialina que la rodea; episporio reticulado de celdillas penta o hexagonales irregulares de 3-3,5 μ x 1,5-3 μ de Ø de profundidad; encerrados en una membrana hialina que sobrepasa el diámetro de las teliosporas o a veces tan estrecha que resulta imperceptible si no se observa con lente de inmersión    Figura 5: Teliosporas de T. controversa (dwarf bunt of wheat).   Referencias  Pirson H. 1978. A simple method for the detection of bunt and covered smut spores as contaminants on cereal seeds. Working group on temperate climate cereals. In the Report on the sixteenth International Workshop on Seed Pathology. Karlsruhe: ISTA-PDC, 54-57.  IF-2023-143483271-APN-INASE#MEC