فلوسایتومتر

فلوسایتومتر دستگاهی است برای بدست آوردن فنوتایپ و خصوصیات سلول‌ها، که بر اساس پراکنده سازی نور توسط سلول‌های تحت آزمایش و انتشار فلورسانس از آنها استوار است. نشر فلورسانس یا با استفاده مستقیم از مواد رنگ کننده فلورسنت یا ترکیبی از رنگ فلورسنت با آنتی بادی‌های مونوکلونال حاصل می‌شود. این آنتی بادی‌های کونژوگه با فلورسانس می‌توانند مولکول‌های سطحی یا ترکیبات داخلی سلول‌ها را ردیابی کرده و به آنها متصل شوند و شناسایی انواع سلول‌های موجود در یک جمعیت سلولی متنوع را توسط فلوسایتومتری امکان‌پذیر می‌سازند. این روش اساسا توسط ایمونولوژیست‌هایی ابداع شد که تلاش می‌کردند جمعیت‌های خالص سلول‌ها را از یکدیگر جدا کرده و پس از تکثیر آنها در محیط کشت سلولی، نقش مجزای هر سلول را در سیستم ایمنی بررسی نمایند. دستگاه‌های اولیه قادر بودند فقط یک یا دو رنگ فلورسانس را تجزیه و تحلیل کنند اما امروز دستگاه‌هایی عرضه شده‌اند که قادرند یازده رنگ فلورسانس را به طور هم‌زمان ردیابی و تجزیه و تحلیل کنند.
امروزه استفاده از تکنولوژی‌های مدرن روز، برای افزایش سرعت انجام کارها و سهولت انجام آنها روز به روز در حال گسترش است. در دهه اخیر فلوسایتومتری به ابزاری ضروری در تشخیص لوسمی‌های خونی در انسان تبدیل شده است. فلوسایتومتری به طور معمول برای شناخت رده سلولی، تحلیل یا تجزیه بافت سلولی بالغ و تشخیص هتروژنیستی در میان جمعیت سلول‌های توموری استفاده می‌شود. در دهه اخیر استفاده از این روش در آزمایشگاه‌های کلینیکی و همچین تشخیص انواع سرطان به طور چشمگیری افزایش یافته است.
تاریخچه
تاریخچه فلوسایتومتری به آزمایش‌های آندرو مولداوان در سال ۱۹۳۰ بر می‌گردد که دستگاهی را با استفاده از سلول فتو الکتریک طراحی کرد که سلول‌های در حال عبور از میانه لوله موئینه‌ای بر روی صفحه اسلاید میکروسکوپ را شمارش می‌کرد. اولین مقاله مربوط به فلوسایتومتری به سال ۱۹۳۴ بر می‌گردد که توسط ایشان در مجله Science چاپ شد. نویسنده در این مقاله به شمارش سلول‌های خونی در یک لوله موئینه توسط یک سنسور فتوالکتریک اشاره کرده است.
در سال ۱۹۷۰ اولین سیستم فلوسایتومتری توسط فی. وی. آ. جی تولید، و وارد بازار شد که قابلیت اصلی آن تجزیه و تحلیل DNA و بررسی مقادیر آن بود. پس از آن شمارشگرهای افتراقی با اساس فلوسایتومتریک را وارد بازار شد. منابع نوری به کار رفته در این سیستم‌ها لامپ‌های تنگستنی هالوژنی بودند. در سال ۱۹۷۲ هرزنبرگ و همکارانش اولین دستگاه جداکننده سلول براساس فلورسنس را ابداع کردند. این دستگاه اساسا یک فلوسایتومتر بود که پس از آنالیز سلولی قادر به جداسازی سلول‌های مورد بررسی بود. در سال ۱۹۹۵ امکان اندازه‌گیری حداقل ۵ پارامتر در ۲۵۰۰۰ سلول در ثانیه به طور معمول به منظور بالا بردن تشخیص و مدیریت حالت‌های متفاوت بیماری‌ها و تشخیص بیماری‌ها استفاده شد. در سال ۲۰۰۳ دستگاه‌های پرسرعت با استفاده از تکنولوژی دیجیتالی معرفی شدند.
اصول آزمایش
نمونه سلولی مورد آنالیز به صورت پخش یکنواخت در آمده و توسط مایع ایزوتونیک تحت فشار وارد ستون باریکی که از مایع شیت پر شده است می‌گردد. محلول شیت اطراف مجرای باریک را احاطه کرده و نمونه مورد آنالیز به صورت یک جریان مرکزی از وسط محلول شیت به صورت سلول‌های تک تک و پشت سر هم در می‌آید. سرعت عبور ممکن است به۱۰ متر در ثانیه برسد. برای شناسایی نشانگرهای سطحی، نمونه مورد آنالیز با آنتی بادی‌های مونوکلونال اختصاصی که با یکی از فلوروکروم‌ها نشاندار شده‌اند مجاور می‌گردد. چنانچه واکنشی صورت گرفته باشد سطح سلول دارای خاصیت فلورسانس شده و با جذب نور لیزر برانگیخته و طول موج بلندتری بازتاب می‌کند. نور بازیافتی در زوایای مختلف مورد سنجش قرار می‌گیرد.
حساسیت جداسازی سلول‌ها بستگی به شکل و شدت نور لیزر دارد. قطر پرتو لیزر حدود ۶۵۰ میکرومتر بوده که توسط عدسی‌هایی در مسیر آن، که دارای قطر باریک می‌باشدبا سلول برخورد می‌کند. اندازه‌گیری پراکندگی یا پخش نور لیزر در طول محور پرتو تابش یا از پیش رو بستگی به اندازه سلول دارد. آنالیز بازیافت نور فلورسانس بعد از برخورد با نور لیزر در زوایای جانبی و زاویه ۹۰ درجه خصوصیاتی از وضعیت آنتی ژنی و محتویات درون سلولی را ارائه می‌دهد.
تهیه سلول برای فلوسایتومتری
برای انجام هر نوع فلوسایتومتری ابتدا باید سلولها را آماده کرد به طوری که سلول‌ها به صورت تکی درآمده و در محیط مناسبی معلق شده باشند. روش‌های مختلفی برای تهیه سلول وجود دارند و روش انتخاب شده به نوع سلول مورد ارزیابی بستگی دارد. پس از تهیه سوسپانسیون مناسب، سلول‌ها باید با مواد فلورسانس رنگ شوند یا با آنتی بادی‌های کونژوگه با فلوروکروم نشاندار شوند. روش نشاندار کردن تحت تاثیر فاکتورهای زیادی قرار می‌گیرد از جمله میزان اختصاصی بودن آنتی بادی و غلظت آنتی ژن در سطح یا داخل سلول، مناسب بودن غلظت آنتی بادی مورد استفاده و به کار بردن کنترل‌های مثبت و منفی مناسب در آنالیز سلول‌ها.
فلوسایتومترها باید بتوانند نور لیزر پراکنده شده یا فلورسانس نشر شده از یک سلول منفرد را در میان انواع سلول‌ها با حساسیت بالایی ردیابی کنند و بدین منظور سلول‌ها باید در محیط مایع به صورت سوسپانسیون یکنواختی درآیند. محیط اطراف سلول‌ها معمولا به صورت ایزوتونیک با pH برابر ۳/۷ و غلظت سلولی بین ۱۰ ۵ تا ۱۰ ۶ سلول در هر میلی لیتر تهیه می‌شود و تحت چنین شرایطی سلول‌ها به صورت یک به یک از مقابل محور تابش نور لیزر عبور خواهند کرد. معمولا حجم کمی از نمونه (۲/۰ تا ۱ میلی لیتر) برای آنالیز لازم است ولی «حداقل حجم مورد نیاز از نمونه» به کثرت سلول‌های مورد نظر در میان انواع سلول‌های موجود در نمونه نیز بستگی دارد و اگر درصد سلول‌های تحت بررسی، نسبت به سایر سلول‌های موجود پایین باشد لازم است ابتدا برای حذف بخشی از سلول‌های ناخواسته اقدام شود. قطر سلول‌های ارزیابی شده باید در محدوده ۱ تا۳۰ میکرون باشد و فلوسایتومترهای معمولی برای ارزیابی ذرات کوچکتر از۱میکرون حساسیت لازم را ندارند، از طرفی وجود ذرات درشت از ۳۰ میکرون موجب انسداد جریان مایع در دستگاه خواهد شد. فلوسایتومترهای معمولی برای استفاده و آنالیز سلول‌های خونی طراحی شده‌اند زیرا پلاکت‌های خون حدود ۱میکرون قطر دارند و قطر سلول‌های خونی نیز ۶ تا ۱۲میکرون می‌باشند. با این حال سلول‌هایی از منشا بافت‌های دیگر (مثل بافت‌های لنفوئیدی و سلول‌های کشت شده) را نیز می‌توان با فلوسایتومترهای معمولی آنالیز کرد. با این شرط که آنها باید از همدیگر و از بسترشان جدا شوند و به صورت سوسپانسیون سلول‌های منفرد در آیند و هر گونه توده سلولی باید قبل از آنالیز حذف شود. عاملی که فلوسایتومتری را به عنوان یک تکنیک فوق‌العاده در مطالعات کلینیکی در می‌آورد این است که سرعت جریان نمونه (۵ تا ۵۰ متر در ثانیه) امکان جمع‌آوری اطلاعات مربوط به ۵۰۰۰ تا۵۰۰۰۰ سلول را در هر ثانیه فراهم می‌نماید و حجم مورد نیاز از نمونه خون معمولا حدود ۱۰۰میکرولیتر یا کمتر می‌باشد.
قدم اول برای تهیه نمونه، گرفتن یا ساختن سوسپانسیون سلولی مناسب می‌باشد. نمونه خون در حالت معمول حاوی سلول‌های منفرد است که در پلاسمای خون به صورت معلق هستند. نمونه‌های بدست آمده از مغز استخوان را می‌توان با پی پت کردن مکرر به صورت سوسپانسیون سلول‌های منفرد در آورد. در نمونه‌های تهیه شده از بافت‌های جامد و لنفوئیدی، اتصالات سلول به سلول یا سلول به بستر باید شکسته شود و سلول‌ها کاملا آزاد شوند. قدم دوم این است که تا زمان آنالیز نمونه، خصوصیات و عملکرد سلول‌های تحت بررسی باید در حالت طبیعی و دست نخورده حفظ شوند. برای برخی از انواع سلول‌ها (مثلا آنتی ژن‌های اختصاصی رده سلولی در لنفوسیت‌های در حال استراحت) این کار نسبتا ساده است و استفاده از روش‌های مختلف معمولا در این مورد نتایج یکنواختی به بار می‌آورد. اما برای برخی سلول‌های دیگر مثل آنتی ژن‌های CD62p در پلاکت‌ها و CD11b در نوتروفیل‌ها که سریعا تغییر می‌یابند نگهداری سلول‌ها مشکل آفرین خواهد بود و روش‌های مختلف تهیه و نگهداری سلول در این موارد ممکن است به نتایج متفاوتی ختم شود.
فاکتورهای موثر در انتخاب روش تهیه سلول
بدیهی است که وقتی برخی خصوصیات سلولی و عملکردهای آن (نظیر سنجش زنده بودن سلول‌ها بوسیله دفع رنگ، توانایی فاگو سیتوز و سیتوتوکسیسیته و پاسخ به آگونیست‌ها در حالت کشت آزمایشگاهی) بررسی می‌شوند ضروری است سلول‌ها به صورت زنده به کار برده شوند و در محیط فیزیولوژیک رقیق شوند و هر چه سریعتر مورد آزمایش قرار گیرند. با این حال دلیلی وجود ندارد از سلول‌های زنده برای ارزیابی برخی خصوصیات دیگر سلولی نظیر بیان آنتی ژن‌های اختصاصی رده سلول یا مولکول‌های چسبندگی استفاده نشود به شرطی که بتوان آنها را در وضعیت ثابتی که تغییر قابل توجه در ساختمان و حیات سلولی ایجاد نشود نگهداری کرد. در عین حال استفاده از سلول‌های زنده این مزیت را دارد که آنها نسبت به سلول‌های فیکس شده یا مرده به مقدار کمتری با آنتی بادی‌ها از طریق غیر اختصاصی متصل می‌شوند. بافر نمکی فسفات (PBS): اغلب اوقات سلول‌ها قبل از آنالیز به مدت کوتاهی در شرایط آزمایشگاهی نگهداری می‌شوند در این صورت می‌توان از بافر فسفات نمکی برای تهیه سوسپانسیون سلولی استفاده کرد. اما اگر قرار است سلول‌ها مدت طولانی‌تری را قبل از آنالیز سپری کنند بهتر است در محلول‌های دیگری که دارای بافر مناسب، از نظر یونی ایزوتونیک، حاوی پروتئین و از نظر نمکی نزدیک به حالت فیزیولوژیک هستند نگهداری شوند.
اگر سلول‌ها (مثل ماکروفاژها، نوتروفیل‌ها و پلاکت‌ها) تمایل به چسبیدن به یکدیگر یا به سطوح پلاستیکی دارند با استفاده از محیطی که فاقد یون‌های دو ظرفیتی مثل Ca2+و Mg2+ و نیز حاوی ۵ میلی مول EDTA می‌باشد می‌توان آنها را به صورت سوسپانسیون نگه داشت. با این حال فقدان یونهای دو ظرفیتی و وجود EDTA برای ادامه حیات سلول‌ها مضر می‌باشند. چه به صورت زنده و چه به صورت فیکس شده بهتر است سول‌ها را مدت کوتاهی قبل از استفاده تهیه نمود و برای به حداقل رساندن رشد و تکثیر میکروب‌ها آنها را در دمای ۴درجه نگهداری نمود. همچنین تهیه سوسپانسیون سلولی و محلول رنگ کننده باید تحت شرایط استریل انجام گیرد. اگر BSAو یا FBS به محیط‌های ساده‌ای مثل PBS و HBSS اضافه می‌شوند باید محلول تهیه شده از نظر وجود توده‌های پروتئینی بررسی شوند مخصوصا اگر آنالیز سلول‌های کوچکتری مثل پلاکت‌ها مدنظر باشد این توده‌های پروتئینی خطای قابل توجهی ایجاد می‌کنند و بهتر است محلول پروتئینی از فیلترهای با سایز۲۵صدم میکرون عبور داده شود تا ذرات پروتئینی گرفته شوند.
آماده‌سازی قبلی نمونه برای دسته‌بندی بسیار مهم است. در واقع، دسته‌بندی موفق تقریبا به طور کامل به کیفیت نمونه استفاده شده بستگی دارد. تهیه سوسپانسیون سلول‌ها یا ذرات انفرادی، پیش نیاز اصلی برای فلوسایتومتری است. هنگامی که سلول‌های مورد استفاده به طور طبیعی به حالت سوسپانسیون وجود دارند (مثل سلول‌های خونی یا سلول‌هایی که در محیط کشت به صورت سوسپانسیون رشد می‌کنند) تهیه چنین سوسپانسیونی آسان است اما وقتی سلول‌ها از منشا کشت‌های چسبنده یا سلوهای بافت جامد باشند تهیه سوسپانسیون سلول‌های منفرد کمی مشکل است. به هر حال، چندین روش کاملا ارزیابی شده برای آماده‌سازی
نمونه‌های جداساز جریانی بیان می‌شوند.
نفوذپذیر کردن و ردیابی محتویات داخل سلولی
گاهی اوقات لازم است ترکیبات داخل سلولی را ردیابی یا اندازه‌گیری کرد مثل توالی DNA، آنزیم‌ها، گلیکوپروتئین‌های داخل سلولی که قرار است در سطح سلول عرضه یا ترشح شوند (مثل سایتو کایین‌ها) فاکتورهای نسخه برداری یا تنظیمی مثل سایکلین‌ها و P53 و اجزای ساختمانی مثل رشته‌های اکتین. اگر اجزای داخلی سلول قرار است از طریق immunolabeling ردیابی شوند باید غشا پلاسمایی (و شاید غشای ساختمان‌های درونی سلول) (قبلا یا در حین رنگ آمیزی) برای عبور آنتی بادی‌های نشاندار شده نفوذپذیر گردند. در عین حال، آنتی ژن باید در داخل سلول باقی‌مانده و آنتی ژنیسیته و خصوصیات انکسار نوری سلول نیز ثابت بماند. معمولا سلول‌ها با فرمالدئید ثابت می‌شوند که می‌تواند غشا را پایدار کرده و به طور همزمان، نفوذپذیری آن را نیز افزایش دهد ولی برای نفوذپذیری بیشتر باید از معرف‌های دیگری استفاده شود. فرم آلدهید اضافی حتما باید از محیط سلولی حذف شود مثلا با استفاده از گلایسین و برای به حداقل رساندن اتصال غیر اختصاصی آن به آنتی ژن‌های داخل سلولی، BSA یا شیر خشک کم چربی به محلول اضافه می‌شود؛ و اگر سلول‌ها برای اسیدنوکلئیک رنگ آمیزی می‌شوند می‌توان از ثابت کننده‌های لخته کننده مثل متانول هم استفاده کرد. عوامل نفوذپذیر کننده شایع عبارتند از ساپونین و دترجانت‌های غیر یونی و ساپونین‌ها نواحی آبگریز بزرگی دارند که به نواحی کلسترولی غشاهای سلولی داخل می‌شوند و کمپلکسی را تشکیل می‌دهند که دارای قطری حدود ۱۲ تا ۱۵نانومتر می‌باشند و ماکرومولکول‌ها را قادر می‌سازند از آن طریق به سیتوپلاسم وارد شوند. غشای پلاسمایی دست نخورده باقی می‌ماند اما چون سوراخ ایجاد شده در غشا برگشت‌پذیر است و سلول‌های نفوذپذیر شده با ساپونین فقط در حضور ساپونین برای آنتی بادی‌ها نفوذپذیر هستند لذا موقع نشاندار کردن سلول، باید در محلول آنتی بادی، ساپونین را نیز گنجاند. ساپونین نمی‌تواند غشاهای فاقد کلسترول را نفوذپذیر کند (نظیر غشا داخلی هسته و غشاهای میتوکندری‌ها). دترجنت‌های غیر یونی دناتور کننده ضعیف پروتئین هستند و به غشاهای سلولی و دیگر غشاهای داخلی سلولی وارد شده و هم لیپیدها و هم پروتئین‌های داخل غشایی را حل می‌کنند. در غلظت‌های پایین سلول را نفوذپذیر می‌کنند اما در غلظت‌های بالاتر باعث لیز شدن سلول شده و محتویات سیتوپلاسم بیرون می‌ریزد. متاسفانه روش واحدی که بتواند برای نفوذپذیر کردن انواع سلولها کارایی داشته باشد وجود ندارد و اغلب رنگ پذیری غیر اختصاصی بالایی در داخل سلول دیده می‌شود. بهترین روش برای استفاده در مورد یک آنتی ژن خاص، عبارت است از تعیین غلظت مناسب ثابت کننده به دترجنت، مدت رنگ آمیزی و دما که بایستی با آزمایش‌های مقایسه‌ای آنها را مناسب سازی کرد.
شناسایی سلول‌های خونی انسان با فلوسایتومتری
سلول‌ها معمولا براساس بیان آنتی ژن‌های سطحی خود شناسایی می‌شوند. مثلا سلول‌های T حاوی مولکلو لهای CD3 در سطح خود هستند و با استفاده از مولکول‌های CD4 و CD8 می‌توان دو گروه مجزای این سلول‌ها را شناسایی کرد. اغلب زیر گروه‌های اصلی سلول‌های موجود در خون انسان آنتی ژن‌های اختصاصی و مربوط به خود را بیان می‌کنند که می‌تواند اسباب شناسایی آنها قرار گیرد. مثلا CD19 فقط در سلول‌های B وجود دارد و CD56 فقط در سلول‌های کشنده طبیعی یافت می‌شود. اما شناسایی منوسیت‌ها و سلول‌های دندریتیک با منشا میلوئید، به آسانی امکان‌پذیر نیست. بهترین خصوصیتی که فعلا می‌توان از آن برای شناسایی همه منوسیت‌ها در خون محیطی استفاده کرد رنگ آمیزی استرآز غیر اختصاصی می‌باشد. عملا، از آنتی ژن CD14 به عنوان مارکر سطحی منوسیت‌ها استفاده می‌شود اما بیان آن در برخی منوسیت‌ها خیلی کم است. اکثر منوسیت‌هایی که بیان CD14 در آنها پایین است معمولا در سطح خود گیرنده شماره ۳ ناحیه FCگاما را بیان می‌کنند. در مطالعه منوسیت‌های CD16+ برای تفکیک آنها از سلول‌های NK باید از آنتی بادی ضد CD56 هم استفاده گردد زیرا سلول‌های NK نیز در سطح خود CD16 را بیان می‌کنند. سلول‌های گرانولوسیت هم از نظر CD16 مثبت هستند اما آنها در نمودار رسم شده با استفاده از خصوصیات تفرق نوری به راحتی از منوسیت‌های تفکیک می‌گردند. چون همه منوسیت‌های انسانی حاوی CD4در سطح خود هستند به صورت جایگزین می‌توان از مولکول CD4 برای شناسایی منوسیت‌ها استفاده کرد. منوسیت‌ها در نمودار dot plot به راحتی از سلول‌های CD4+T قابل تفکیک هستند و می‌توان برای اطمینان بیشتر از مولکول CD3نیز استفاده کرده و سلول‌های CD3+ را از آنالیز کنار گذاشت. با این وجود، مولکول CD4توسط اغلب زیر گروه‌های سلول‌های دندریتیک نیز بیان می‌شود بنابراین، تفکیک آنها بدون استفاده از آنتی بادی‌های اضافی مشکل خواهد بود.