اپتوژنتیک

اپتوژنتیک به پیشرفت تکنیک‌های تصویر برداری در قرن اخیر، مطالعه و بررسی عملکردهای مغزی را سرعت بخشیده‌است و تکنولوژی اپتوژنتیک قدمی است به سوی بررسی‌های دقیق‌تر. روش‌ها و ابزار تک مولفه‌ای قابل اعتماد که بتوانند تنها یک اپسین (ترکیبی که شامل بخش پروتئینی شبکیه می‌باشد) را هدف قرار بدهند و هم چنین میزان حساسیت نوری از عناصر مهم در این روش هستند که امکان مطالعه عملکرد دقیق و خاص سیستم عصبی را ایجاد می‌کنند.
اپتوژنتیک همان‌طور که از اسمش پیداست استفاده همزمان از اپتیک و ژنتیک برای تشخیص عملکرد سلول‌های خاص در بافت‌های زنده می‌باشد. به طور مثال ژنهای اپسینی- میکروبی می‌توانند برای کنترل نوری عملکردهای تعریف شده‌ای در مجموعه‌ای از سلول‌های عصبی استفاده شوند. برای اپتوژنتیک نیاز است به ۱) وسایل مهندسی که بتوانند به طور دقیق سلولهای خاص را هدف قرار دهند)۲ تکنولوژی انتقال نور و ۳)روش‌های کنترل اپتیکی با قابلیت بازخوانی سریع اطلاعات (مانند ارگان‌های فلورسنت یا شاخص‌های ژنتیکی کدگذاری شده، ثبت الکتریکی، سیگنال fMRI یا آنالیز کمیتی رفتارها).
تاریخچه
ردپای مفاهیم اولیه به کارگیری اپتوژنتیک به دهه ۱۹۷۰ برمی گردد. در سال ۱۹۷۹، Crikc Francis با توجه به پیچیدگی مغز پستانداران دریافت که الکترودها نمی‌توانند به طور واضح بین انواع مختلف سلولها تفاوت قائل شوند و چالش بزرگ عصب شناسی نیاز به کنترل دقیق یک سلول خاص بدون تاثیرگذاری بر روی سلولهای دیگر می‌باشد. اوپیشنهاد کرد که استفاده از نور می‌تواند ابزار مناسبی باشد، اما درباره چگونگی آن هیچ ایده‌ای نداشت. چند سال قبل از این تاریخ در تحقیقی کاملا جداگانه اپسین‌هایی کشف شدند که به نور به صورت تک مولفه‌ای و. با وجود این که اپسین‌های میکروبی به خوبی شناسایی شده بودند و پاسخ تک مولفه‌ای آن‌ها به نور ثابت گردیده بود اما به دلایل مختلفی از قبیل وجود فرض‌هایی چون کم بودن جریان فوتونی و کند بودن آن برای کنترل موثر، ضعیف بودن پروتئینهای میکروبی غشایی یا سمی بودن آن‌ها و مهم‌تر از همه این فرض که عامل‌های خارجی اضافه شده باید به تمام بافت‌های مورد آزمایش اضافه گردند سبب توقف بیشتر تحقیقات در این زمینه شد. تا این که در تابستان ۲۰۰۵ گروه بزرگی از اپسین‌های میکروبی انتقال دهنده یون‌ها شناخته شدند که همگی ثابت می‌کردند امکان کنترل اپتیکی نورون‌ها در پستانداران وجود دارد و می‌توان از این اپسین‌ها به عنوان ابزاری در اپتوژنتیک استفاده کرد. همچنین با پی بردن به وجود رتینوید در مقادیر زیاد در بافت‌های اولیه و در شبکیه، خیلی زود کشف شد که مغز پستانداران بالغ و قطعا سایر بافت‌های ستون فقرات دارای میزان کافی از ژن‌های میکروبی اپسینی برای تعریف استراتژی تک مولفه‌ای می‌باشد. واکنش نشان می‌دادند.
تعریف
اپتوژنتیک به طور ساده به معنای برانگیختگی نوری یا بازداری نوری سلول‌های هدف نیست، بلکه اپتوژنتیک باید دستور انجام دادن یا ندادن یک فعالیت خاص را به سلول برساند؛ بنابراین به دقتی از مرتبه میلی ثانیه نیاز می‌باشد و این میزان از دقت باید قابل استفاده در سیستم‌های سالم مانند مغز پستانداران که آزادانه حرکت می‌کنند؛ باشد. تمام تلاش‌های اولیه برای کنترل اپتیکی شامل روش‌هایی بود که محدودیت‌های زیادی به همراه داشت از قبیل چند مولفه‌ای بودن، ویژگی زمانی بالا یا نیاز به تابش نور فرابنفش با شدت بالا که همگی سبب می‌شد تا نتوان این روش‌های را در پستانداران به کار گرفت. ژنهای اپسینی تک مولفه‌ای نیز در ابتدا با وجود بهتر بودن، هنوز هم مشکلاتی را به همراه داشتند از عدم کنترل کافی گرفته تا ایجاد مسمویت و چالش‌های موجود برای رساندن نور به بافت زنده؛ بنابراین برای انجام این فرایند نیاز به تکنولوژی‌های پیشرفته‌ای بود، که در طی چند سال و با پیشرفت‌های مهندسی بسیاری از آن‌ها برطرف گردید.
در حال حاضر طیف گسترده‌ای از ابزارها برای چهار عمل اصلی برانگیختگی سریع، بازداری سریع، تلفیق دوگانه و کنترل سیگنال‌های بیوشیمیایی درون سلولی؛ در نورون‌ها و سایر انواع سلولی، به عنوان ابزار اپتوژنتیک، در اختیار عصب شناسان می‌باشد. این مجموعه از ابزار اپتوژنتیک که حاصل مهندسی مولکولی و تلاش‌های ژنومیک می‌باشد امکان ایجاد تغییرات آزمایشگاهی برای دستیابی به ۱) اثرات فیزیولوژیکی دلخواه ۲) ویژگی‌های جنبشی مدولاسیون وابسته به نور ۳) و طول موج مورد نیاز، توان و گستردگی فضایی پالس نوری را می‌دهد.
هدف‌گیری اپسین‌ها
از آنجا که ابزارهای اپتوژنتیکی پیوسته از لحاظ ایمنی و بازدهی در حال بهینه شدن هستند، یک آزمایش عصب شناسی موفق نیازمند روش متناسب هدف گیری بافت زنده با ابزار اپتوژنتیک می‌باشد. روش‌های معمول رساندن ابزار اپتوژنتیک به بافت زنده عبارتند از
هدف گیری از طریق توزیع میکروبی
هدف گیری تصویری
هدف گیری حیوانات از طریق ترانس ژنتیک
هدف گیری زمانی – مکانی.
انتقال نور
شکل ۱ رساندن نور به بافت
جریان نوری ناشی از یک پالس نوری در نورون به عوامل مختلفی از قبیل ویژگی اپسین مورد استفاده، طول موج نور، شدت و مدت تابش نور و حتی تاریخچه تابش‌ها (به طور مثال اگر تعداد سلول‌های حساس به نور در ابتدا کمتر باشد یا تعداد کمتری به حالت تطابقی سیاه بازگردند میزان پاسخ عبوری به نور اولیه کمتر خواهد بود گرچه در حالت پایه ممکن است جریان فوتون‌ها ثابت باقی بماند) بستگی دارد. در تمام حالت‌ها میزان جذب فوتون‌های یک طول موج خاص متناسب با جریان محلی فوتون هاست و در طراحی وسایل رساننده نور برای فعال سازی رودوپسین این مهمترین پارامتر برای اندازه‌گیری و کنترل است. میزان عبور نور در بافت‌های بیولوژیکی وابسته به میزان جذب و پراکندگی است و پراکندگی در چربی غلاف عصب نقش مهمی در بافت مغز دارد. همچنین هر چه طول موج بیشتر باشد پراکندگی کاهش می‌یابد و میزان نفوذ نور بیشتر خواهد بود. در آزمایش‌هایی که نیاز به تابش بر روی چند منطقه می‌باشد یا منطقه مورد نظر دور از محل تصویربرداری است، می‌توان از یک منبع نوری جفت شده با فیبر نوری که بر روی یک بازوی میکرومکانیکی قرار دارد برای تابش روی بافت استفاده کرد. لیزرها نیز می‌توانند در سرراه نوری میکروسکوپ جفت شوند و از لحاظ اپتیکی میدان دید را گسترش دهند.
منابع نوری
شکل ۲ رساندن نور به بافت و ثبت تک مولفه‌ای سیگنال
لیزرها: به دلیل داشتن یک پهنای طیفی باریک(nm1>) می‌توانند گزینه بسیار مناسبی باشند. چراکه می‌توانند بر روی طول موج لازم برای فعال سازی یک ابزار خاص تنظیم شوند و همچنین بسیاری از لیزرها می‌توانند تا فرکانس‌های کیلوهرتز تنظیم گردند. باریکی پهنای طیفی و دیورژانس کم، لیزرها را برای هدایت از طریق ادوات اپتیکی مانند محدود کننده‌های الکتریکی، تقسیم‌کننده‌ها، آیینه‌ها برای جفت کردن چند لیزر و به خصوص استفاده از آن‌ها در فیبرهای نوری که نیازمند نور کانونی شده در محدوده‌ای از اندازه (m400- 50) با یک زاویه کم برای بهینه‌ترین حالت جفت شدگی هستند؛ مناسب می‌کند. در آزمایش‌های فیزیولوژیکی استفاده از لیزرهای دیودی و حالت جامد (پمپ شده دیودی) مناسب‌تر می‌باشد.
LEDها: منبع دیگری هستند که برای برخی آزمایش‌ها مناسب می‌باشند.LEDها پهنای طیفی کم مورد نظر را دارا می‌باشند، به راحتی برای فرکانس‌های مورد نیاز تنظیم می‌شوند، ساده و ارزان هستند و به ابزار الکترونیکی پیچیده برای کنترل نیاز ندارند. اما زمانی که از آن‌ها در نزدیکی بافت‌ها استفاده می‌شود ایجاد گرمای ثانویه در بافت باید در نظر گرفته شود. منابع نوری قدیمی با طیف گسترده مورد استفاده در میکروسکوپ‌ها نیز می‌توانند با قراردادن فیلترهای کوچک کننده پهنای طیفی و محدود کننده‌ها در آزمایش‌ها اپتوژنتیک به کار روند. مزیت مهم این منابع نسبت به لیزرها و LEDها امکان انتخاب دلخواه طول موج و پهنای باند تابش از طریق فیلترها می‌باشد.
بازخوانی اطلاعات
یکی از مزیت‌های کلیدی اپتوژنتیک ثبت همزمان سیگنال‌های الکتریکی است که امکان ترکیب شدن با تحریک کننده‌های نوری را دارا می‌باشند. راه‌های ساده بسیاری برای اطمینان از اینکه LFDها فعالیت نورون‌ها را نشان می‌دهند وجود دارد؛ مانند کاهش سطح فلزی، استفاده از الکترودهای شیشه‌ای، استفاده از ریزسیم‌های نیکروم به جای میکروالکترودهای تنگستنی. همچنین باید توجه داشت که ثبت داده از منطقه مورد آزمایش شامل اپسین می‌باشد یا از مناطقی که خالی از اپسین هستند. زمانی که سیستم رساننده نور و ثبت الکتریکی در یک دستگاه جمع شوند به آن اپترود گفته می‌شود که شامل ترکیب فیبرهای نوری و الکترودهای فلزی یا کاوشگرهای سیلیکنی برای ضبط چند- منطقه‌ای در جانداران بیدار دارای حرکت می‌باشد.
تاثیرها
پیشرفت‌های اپتوژنتیک دریچه جدیدی را نه تنها در عصب شناسی که در سایر بخش‌ها مانند ماهیچه‌ها، رگ‌های شریانی و رشد سلول‌های جنینی باز کرده‌است. همچنان که به مدل سازی بیماری‌هایی چون پارکینسون، اضطراب، انحطاط شبکیه، تنفس و افسردگی کمک بسیاری کرده‌است. دقت زمانی که به وسیله استفاده از نور در روش اپسین – میکروبی تک مولفه‌ای فراهم می‌گردد، مهمترین ویژگی این روش می‌باشد. در واقع رخ دادن یک عملکرد خاص در یک سلول ویژه در میان جمعیت سلولها در یک زمان مشخص بسیار مهم می‌باشد. همچنین وجود گروه بزرگی از ابزارهای اپتوژنتیکی به خواص الکتریکی و بیوشیمیایی خاص سبب پیشرفت‌های زیادی در دستیابی به اهداف مورد نظر در اپتوژنتیک گشته‌است.