کشت یاخته

یاخته‌های بافت پوششی کشت یافته
کشت یاخته ( کشت سلول ) به فرایند کشت یاخته‌های پروکاریوتی یا یوکاریوتی در یک محیط کشت، گفته‌می‌شود. این اصطلاح بیشتر در مورد کشت یاخته‌های جانوران پر یاخته‌ای کاربرد دارد.
در این فرایند که در آن یاخته‌ها در شرایط کنترل شده، و به‌طور کلی در خارج از محیط طبیعی خود رشد داده می‌شوند شرایط کشت یاخته‌ای برای هر گونه از یاخته‌ها می‌تواند متفاوت باشد، اما محیط مصنوعی کشت از ظرف و محیط مناسبی که مواد مغذی ضروری مانند (اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، مواد معدنی)، و فاکتورهای رشد، و هورمون تشکیل شده، و گازهای (CO ۲ )، و (O ۲ )، و تنظیم محیط فیزیوتراپی و مواد شیمیایی (محلول بافر، فشار اسمزی، دما) را فراهم آورده‌است. اکثر یاخته‌ها برای رشد به یک سطح یا یک بستر مصنوعی (کشت چسبنده یا تک لایه) نیاز دارند در حالی که برخی دیگر توان رشد به صورت شناور آزاد در محیط کشت را دارند.
کشت سلول فرآیندی است که طی آن سلول‌ها تحت شرایط کنترل شده و بیرون از محیط طبیعی شان رشد داده می‌شوند. شرایط کشت برای هر نوع سلول متفاوت است، اما به‌طور کلی محیط‌های مصنوعی حاوی مواد مغذی ضروری (آمینواسیدها، قندها، ویتامین‌ها، مواد معدنی)، فاکتورهای رشد، هورمون‌ها و گازها (co 2 ، o 2 ) است. (بنگرید کشت سوسپانسیون سلولی)
این محیط مصنوعی، شرایط فیزیکی وشیمیایی (pH بافر، فشار اسمزی، دما) را نیز تنظیم می‌کند. بیشتر سلول‌ها برای این که رشد کنند باید به یک سطح متصل شوند در حالی که برخی سلول‌های دیگر می‌توانند به صورت شناور (سوسپانسیون) و بدون نیاز به اتصال به سطح در محیط کشت رشد کنند.
اصطلاح «کشت سلول» به کشت دادن سلول‌های مشتق شده از یوکاریوت‌های چندسلولی مخصوصا سلول‌های حیوانی اشاره می‌کند، در مقابل انواع دیگری از کشت‌ها نیز مانند کشت بافت گیاهی، قارچ و کشت میکروب‌ها نیز وجود دارند. در اواسط قرن بیستم برخی از تکنیک‌های آزمایشگاهی به منظور حفظ و نگهداری از لاین‌های سلولی اهمیت و توسعه بیشتری یافت.
مفاهیم کشت سلولی پستانداران
جداسازی سلول‌ها
سلول‌ها می‌توانند با چندین روش برای کشت آزمایشگاهی (ex vivo) جداسازی شوند. سلول‌ها را می‌توان به آسانی از خون استخراج و خالص‌سازی کرد. با این حال، تنها سلول‌های سفید قادر هستند در محیط کشت رشد کنند. سلول‌های تک هسته‌ای می‌توانند بوسیله هضم آنزیمی از بافت‌های صاف آزاد شوند. از جمله مهم‌ترین آنزیم‌های مورد استفاده می‌توان به کلاژناز، تریپسین یا پروناز اشاره کرد که ماتریکس خارج سلولی را می‌شکنند.
یک روش دیگر به منظور کشت سلول، قرار دادن قطعاتی از بافت در محیط کشت است. در این روش سلول‌هایی که قادر به رشد در محیط کشت هستند، توسعه می‌یابند. این روش به عنوان کشت ریزنمونه نیز شناخته می‌شود.
سلول‌هایی که به‌طور مستقیم از خود فرد (هدف) کشت داده می‌شوند به عنوان سلول‌های پرایمری شناخته می‌شوند. اکثر کشت‌های سلولی بجز آنهایی که از تومور گرفته می‌شوند، طول عمر محدودی دارند.
یک لاین سلولی نامیرا می‌تواند با ایجاد جهش تصادفی یا هدفمند (مانند بیان مصنوعی ژن تلومراز) به‌طور نامحدودی تکثیر گردد و به عنوان نماینده‌ای از انواع سلولی خاص پایه ریزی شود.
حفظ و نگهداری سلول‌ها در محیط کشت
اکثر سلول‌های پرایمری پس از این که تا حد خاصی افزایش پیدا کردند، با حفظ ثبات سلولی تحت فرایند پیری قرار گرفته و تقسیم سلولی در آن‌ها متوقف می‌شود.
سلول‌ها در یک انکوباتور سلولی با دما و مخلوط گازی مناسب (به‌طور معمول دمای ۳۷ درجه و %۵ co2 برای سلول‌های حیوانی) کشت داده می‌شوند. شرایط کشت برای هر نوع سلول متفاوت است.
ترکیب محیط کشت می‌تواند از نظر pH، غلظت گلوکز، فاکتورهای رشد و دیگر مواد مغذی با یکدیگر متفاوت باشد. محیط‌های کشت اغلب حاوی فاکتورهای رشدی مانند سرم خون حیواناتی همچون سرم جنین گاوی (FBS)، سرم گوساله گاوی، سرم اسب یا سرم بز هستند.
یکی از مهم‌ترین عوارض استفاده از مواد مشتق شده از خون در کاربردهای بیوتکنولوژی پزشکی، آلوده شدن محیط کشت به ویروس‌ها و پریون‌ها می‌باشد. راه حل‌های جایگزین شامل یافتن منابع خون حیوانی از کشورهایی با کمترین خطر مانند ایالات متحده آمریکا، استرالیا و نیوزلند و همچنین استفاده از کنستانتره‌های مغذی تمیز مشتق شده از سرم از محل کل سرم‌های حیوانی برای کشت سلولی است.
تعدادی از سلول‌ها مانند سلول‌های موجود در جریان خون می‌توانند بدون هیچ اتصالی به سطح در سوسپانسیون رشد کنند. همچنین برخی از لاین‌های سلولی تغییریافته قادر هستند که در کشت‌های سوسپانسیون زنده بمانند. سلول‌های چسبنده، به منظور این که رشد کنند باید به سطحی مانند پلاستیک کشت بافت یا میکروکریر (ریزحامل) متصل شوند. این سطوح ممکن است به منظور افزایش ویژگی اتصال و فراهم‌سازی مواد لازم برای رشد و تمایز، با اجزای ماتریکس خارج سلولی (مانند کلاژن و لامینین) آرایش یافته باشند. بیشتر سلول‌های مشتق شده از بافت‌های جامد، چسبنده هستند.
کاربردهای کشت سلول
کشت توده‌ای لاین‌های سلول حیوانی اساس تولید واکسن‌های حیاتی و دیگر محصولات زیست فناوری هستند. کشت سلول‌های بنیادی به منظور افزایش تعداد سلول‌ها و تمایز آن‌ها به انواع مختلف سلول‌های سوماتیک برای پیوند انجام می‌شود.
همچنین از سلول‌های بنیادی مولکول‌ها و اگزوزوم‌هایی آزاد می‌شوند که در درمان بیماری‌ها کاربرد دارند. استفاده از این مولکول‌ها و اگزوزوم‌ها یکی دیگر از اهداف کشت سلول‌های بنیادی است. آنزیم‌ها، هورمون‌های مصنوعی، زیست ایمن‌ها (آنتی بادی‌های مونوکلونال، اینترلوکین‌ها، لنفوسیت‌ها) و عناصر ضدسرطان همگی از محصولات زیستی‌اند که بوسیله فناوری دی ان ای نوترکیب و با کشت سلول‌های حیوانی بدست آمده‌اند.
با این که بسیاری از پروتئین‌های ساده می‌توانند از طریق rDNA در کشت‌های باکتریایی تولید شوند، در حال حاضر بیشتر پروتئین‌های پیچیده که نیازمند گلیکوزیلاسیون هستند در سلول‌های حیوانی ساخته می‌شوند. یک مثال مهم از چنین پروتئین‌های پیچیده‌ای اریتروپویتین است. هزینه رشد کشت سلول‌های حیوانی زیاد است بنابراین تحقیقات حاضر بدنبال تولید چنین پروتئین‌های پیچیده‌ای در سلول‌های حشرات و گیاهان عالی هستند.
کشت یاخته‌های جانوری
برای کشت یاخته‌های جانوری از محیط کشت ویژه‌ای استفاده می‌شود. معمولا یاخته‌های جانوری را در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و در انکوباتورهای دی‌اکسید کربن‌دار کشت می‌دهند.
کشت یاخته‌های جانوری باید در محیط کاملا گندزدوده‌شده انجام شود. چون رشد یاخته‌های جانوری بسیار کندتر از رشد باکتریها و مخمرها است و امکان آلودگی وجود دارد. برای جلوگیری از رشد باکتری‌ها گاهی از آنتی‌بیوتیکهایی مانند پنیسیلین، استرپتومایسین یا جنتامایسین استفاده می‌شود. محیط‌های کشت اختصاصی برای رشد یاخته‌های مشخص نیز وجود دارد. مانند محیط کشتی که در آن فقط هپاتوسیت‌ها رشد می‌کنند یا محیط کشت‌هایی که فقط یاخته‌های عصبی که تقسیم نمی‌شوند، می‌توانند زنده بمانند.
برای اینکه یاخته‌ها در محیط کشت به خوبی تکثیر یابند، لازم است تراکم آنه در محیط کشت کم باشد. برای این منظور باید هر چند وقت یکبار، یاخته‌ها را به محیط کشت‌های تازه جابجا کرد. در صورتی‌که تراکم یاخته‌ها بالا رود، بعلت ممانعت تماسی تکثیر یاخته‌ها متوقف شده و یاخته‌ها وارد مرحله تمایز می‌شوند.
یاخته‌ها از نظر نحوه کشت یافتن در محیط کشت به دو دسته تقسیم می‌شوند:
۱- یاخته‌های وابسته به بستر (به انگلیسی:Anchorage dependent): این یاخته‌ها برای اینکه بتوانند تکثیر شوند، باید به سطحی متصل شده باشند. این یاخته‌ها بر روی محیط کشت آنقدر تکثیر می‌شوند تا به صورت تک لایه، تمام سطح محیط کشت را فرا گیرند. پس از آن بعلت اثر فرایند ممانعت تماسی تکثیر یاخته‌ها، متوقف می‌شود. یاخته‌های تراریختشده بعلت اینکه پروتئینهای سطحی خود (که در ممانعت تماسی نقش دارند) را از دست داده‌اند، می‌توانند به صورت چند لایه رشد کنند.
برای کشت یاخته‌های وابسته به بستر، به بسترهای خاصی نیاز است. شیشه بعلت دارا بودن بار منفی بهترین سطح برای اتصال یاخته‌ها است. از سطوح پلاستیکی (دارای بار مثبت)، در صورتی‌که به کمک اشعه‌های یونیزه‌کننده، بار زدایی شوند نیز می‌توان استفاده کرد. یاخته‌ها به کمک پروتئین‌های سطحی خود مانند: اینتگرین‌ها، فیبرونکتین، کلاژن و لامینین به این سطوح متصل می‌شوند.
یاخته‌های وابسته به بستر را همچنین می‌توان بر روی سطوح معلق کشت داد. برای این منظور گاهی از گلوله‌های کلاژن، پلی استایرن، سفادکس، ژلاتین یا پلی اکریل آمید، به عنوان سطحی برای اتصال یاخته‌ها استفاده می‌شود. این گلوله‌ها در محیط کشت مایع معلق می‌شوند.
برای اینکه یاخته‌ها بهتر به سطوح متصل شوند، می‌توان این سطوح را با کلاژن، فیبرونکتین، پرونکتین، انتاکتین، هپاران سولفات و.. پوشاند. همچنین می‌توان برای رشد اختصاصی یاخته‌ها از مواد خاصی استفاده کرد. برای مثال برای رشد اختصاصی کوندروسیت‌ها از کوندرونکتین استفاده می‌شود.
۲- یاخته‌های غیروابسته به بستر (Anchorage Independent) : این یاخته‌ها برای تکثیر و زنده ماندن لازم نیست قبلا به سطحی متصل شده باشند. مانند یاخته‌های بنیادی هپاتوسیتی یا رده‌های یاخته‌های تراریخته‌شده.