質問: dnaを室温で放置してしまい、dnaが壊れていないか確認したいのですが・・・ 滅菌水に溶かしてあるプライマーやプラスミドなどのdnaを室温で四日間放置してしまいました。箱に入った状態です。 もうこのdnaを使うのは危険でしょうか? dnaが大丈夫かどうか確認する方法として、プラスミドは制限酵素でカットして電気泳動すれば十分でしょうか? プライマーは数サンプルをシークエンスに使って確認することを考えています。
回答: 用途や濃度(極端に低いと分解しやすい)・純度(dnaseのコンタミの程度)、溶媒(純水でなく適当なバッファーの方が安定)によると思いますが、 その程度では、実用上、問題になるほどの劣化は起こっていないでしょう。 日常的には、冷凍あるいは冷蔵で長期間保存したものや、凍結融解を繰り返したものなどを、一応大丈夫と思って使うと思いますが、室温で数日おいたものとどちらが信頼できるかといえば、微妙なところだと思います。 プラスミドは切らずにそのまま泳動して、ccc (スーパーコイル)の割合がどれくらいあるかを見た方が品質がわかると思います。プラスミドの劣化は、はまずニックが入ってoc (open circular)になり、ニックが多数できるとdouble strand breakが生じてlinearが出てきます。もっと分解が進むと低分子量のsmearが出てきます。 cccが減りocが増えた程度なら、pcrや二次クローニングなど大抵の目的には十分です(in vitro transcription、シークエンスなどではnickの入った鋳型は問題になります)。 プライマーはシークエンスできれいな波形がでるならokでしょう。分解されたプライマー(あるいは品質の悪いプライマー)だと、長さの異なるプライマーが混在するため、複数のピークが重なった波形になります。 プラスミドにせよプライマーにせよ、純水で溶解するのは保存性の上でよくありません。 dnaのストック溶液は、te、あるいはedtaを入れたくなければ薄い10 mmのtrisバッファー(ph 8程度)にしたほうがいいです。