質問: q-4. cas9/nickase 安定発現細胞株を樹立し,grna をパッケージングさせたウイルス粒子を作製し,標的細胞に感染させましたが活性がありません。
回答: a-4. 下記のような原因が考えられます。1) 標的細胞での形質導入効率が低かった可能性があります。特定の細胞(初代細胞,幹細胞,浮遊細胞など)においては,形質導入は必ずしも高効率ではありません。そのような場合は,30 ~ 50の高い感染多重度(moi)での感染や,spin-inoculation による強制的ウイルス感染をお勧めします。またt 細胞などの細胞型では,効率的な形質導入のために,g0 期から人工的に刺激を与える必要がある場合もあります。2) grna のデザインにミスがあった可能性があります。設計上の規則に従って正確にオリゴdna を合成したかどうか再確認して下さい。3) 標的dna 配列に変異の可能性があります。標的dna 配列に変異があった場合,grna 配列の認識に影響を与え,切断の失敗につながります。予め標的dna 配列の変異の存在を知ることは難しいですが,もし何度も切断が失敗するようであれば,他のgrna 配列を使用するか,grna 設計前に標的ゲノム配列の検証が必要です。4) アッセイ前の時間の長さに問題がある可能性があります。dna 標的の切断に際し,感染後最低でも72 時間経過後にアッセイを始めることを推奨しています。しかし,場合によっては,十分な切断の効果を見るため,感染後7 ~ 10 日間待った方が良いこともあります。