質問: 分光光度計での対照について 分光光度計を用いてnadhの吸高度を測定したのですが、蒸留水でautozeroした後、対照として蒸留水ではなく、tris-hcl緩衝液ph8.0を使用しました。サンプルには臓器より得たldhと蒸留水、nadh溶液、ピルビン酸ナトリウム溶液が入っています。サンプルにも蒸留水が入っているのになぜ、対照には緩衝液を用いたのでしょうか。蒸留水でも測定は可能なのでしょうか。教えてください!!!
回答: 分光光度計は光の吸収を測るわけですが、マイナスの対数をとる(計算法は分析化学の教科書を見てください)ので、値が大きいほうが光がさえぎられていることを示します。それで、100%光が透過するのが0と定義されているのですが、それは空気ではなく通常は蒸留水を光が透過したときを100%透過=吸光度0と定義しています。蒸留水でautozeroするのはそういうわけです。 さて、”高級な”吸光度計つまり、分光光度計では2つのキュベットを同時にセットすることができるようになっていますが、両方を用いた場合、吸光度の値は、「サンプル-対照」を示すようにできています。酵素試験の場合は、反応液が汚いことが多い(臓器からのタンパクなどの持ち越しや、基質を発色させる液に色がついてしまっている)ので、もともとついている色の分を引かなくてはなりません。また、キュベット(セル)そのものにも吸光度があります。そこで、大きく分けると次のような方法でもともとついている色を補正します。 1.分光光度計の2つのセルのサンプル側に酵素と基質、対象側は酵素を抜いて測定する。すると1回の測定で基質の自家分解が補正された値が得られる。 2.対照側は固定しておいて、酵素反応と自家分解を別々に測って、後で引く。つまり(酵素反応と緩衝液)(自家分解と緩衝液)の組み合わせで測ったとして、(酵素反応-緩衝液)-(自家分解-緩衝液)で計算すると緩衝液の分は相殺されます。 したがって、対照側に入れるものは(吸光度が低いものなら)何でも良いわけです。どちらのやり方をとるにせよ、サンプルをセットする前に0あわせをしっかりしておくこと、サンプルに対して、何を補正しなくてはならないかをしっかり把握しておくことが大切です。 ただし、これは一般論で実験の種類によって補正の仕方にいろいろなノウハウがある場合がありますので、資料をよく読んで実験を行って下さい。