質問: in vitroのkdアッセイについて invitroの結合実験でkdをとっています。現在とれてきたデータが本当に飽和したスペシフィックなものと判断可能かがわからないのでアドバイスをいただきたく思います。 具体的には、1.5mltubeに25pmolのgstプロテインをgshビーズにくっつけて、そこに 10pmolから(反応系1ml) 600pmolのmbpタンパク質を加えています。 バインディングは100pmol程度の濃度(100nm)から飽和に達して、その結合量は飽和した状態で 600fmol(つまり結合比は最大で100対2程度) になります。 このデザインではフリーのリガンドタンパク質に対して結合しているタンパク質が1000対1程度になるのですが、このような比になっているグラフは論文で見たことがありません。 勿論ビーズにくっつけるタンパク質を増やせば結合量も増えていきますが、 200pmol程度ビーズにくっつけたときは、同様の濃度域で結合が飽和せずバインディングするものが増えていく傾向にあります。 ポジティブに考えればこれは、ノンスペが増えたせいだともとれるのですが、、、 アドバイスをいただきたく思います
回答: b/f分離はきちんと出来ていますか?