質問: 蛍光分析の測定誤差について ある本(*)で 蛍光分析の分光分析に対する長所が 以下のように述べられています。 「吸光分析では、リングボムエラーによる制限で、線形性を保つ領域が限定される。・・(中略)・・。しかし、蛍光分析は、幅広い範囲でエラーが一定である。・・・・」 前半の、リングボムエラーの部分は理解できるのですが、後半の、蛍光分析では幅広い範囲でエラーが一定というところがわかりません。 私の考えでは、以下のように、蛍光強度測定でも、リングボムエラー同様の誤差が生じてしまうと思えてならないのですが・・ f=i*φ(1-exp(cεd)) (f:蛍光強度、i:励起光強度、φ:発光効率、c:蛍光体濃度、ε:吸光係数、d:セル長) ⇒δc/c=-1/(εdiφ)*1/{(1-f/iφ)log(1-f/iφ)} どなたか、おわかりの方がいらっしゃいましたら教えてください。 関連するwebページ・書籍などがありましたら教えてください。 お手数ですが、よろしくお願いいたします。 * guilbault, g.g. (ed.) 1990 practical fluorescence 2nd, marcel dekker, new york, p.26
回答: 一応、装置を作る側の元プロです。分析化学を専門とする者ではない(化学屋では なく物理屋!)ので、とんちんかんな回答かも知れませんが。 "蛍光光度法"でも、質問者さんが「同様の誤差が生じてしまうと思えてならない」と 言っておられるように、励起光の吸収過程においては"吸光光度法"と同様の話になり ます。しかし、"吸光光度法"で扱う試料の吸収量(i.e.試料濃度×吸収係数)の範囲と、 "蛍光光度法"で扱う試料の吸収量(同)の範囲は大きく違うのではないでしょうか? (蛍光分析の方がはるかに高感度で、試料の吸収量としては非常に小さいはず) つまり、"吸光光度法"で扱う吸収現象はlambert-beerの法則通り、測光値が濃度に 対して指数関数で規定される訳で、生の測光値(absではなく%t)の対数を取って abs(吸光度)にして検量線を作りますよね。これに対し、"蛍光光度法"で扱う吸収現象 はもっとずっと小さな値の領域で、x<<1 につき 1-exp(-x)≒x で近似される領域では ないですか? そうすると、最終的な蛍光発光強度は「試料濃度に直に正比例」する 直線領域となり、濃度vs測光値(蛍光強度)でリニアな検量線が引けます。 このことは、"蛍光光度法"でも濃度が過大になると非線形になることで分かります。 更に濃度が大きくなると、励起光はセル中(極端な場合にはセルから中に入ったごく 表層部分のみ)で全て吸収され尽くしてしまい、それ以上蛍光強度は増えません。 例えば、分光蛍光光度計の装置校正に使う高濃度ローダミンb溶液などはこの状態 で使用します。 生の測光値と試料濃度の関係が素直なので、迷光や装置の縦軸分解能・再現性など の影響も素直で「検量線の直線範囲が広い」ということにつながるのではないで しょうか?