質問: 免疫染色の原理について 免疫染色の原理について 仕事で、免疫染色をすることになりました。 文献で調べてみたところ、プロトコルは手に入りましたが、いくつか原理が分からないところがありました。 ・ブロッキングについて 1次抗体を反応させる前に、他種の血清を切片にかけて、標的タンパク以外のタンパクをブロックして、非特異反応を防ぐ、とのことですが、そもそもなぜ他種の血清をかけるとブロッキングになるのでしょうか? 抗体の非特異反応とは、標的タンパクのエピトープに似た分子構造を持つタンパクが他にあればそこに抗体が結合してしまう反応と解釈しているのですが、他種血清をかけることで標的以外のタンパクがブロックされるという原理が分からないです。 例えばヒトの口内粘膜上のtlrを抗ヒトtlrマウスモノクローナルiggを1次抗体として染めるとして、この試料を、例えばカエル血清で処理するとなぜ、非特異反応を防げるのでしょうか? カエル血清に、ヒトtlrと1次抗体の結合だけを保護し、tlrに類似するエピトープを持つタンパクと抗体の反応を抑制するなどというピンポイントな機能があるとは思えないないです。 実際にはtlr以外を染める場合でもカエル血清は有効とのことですし(カエルでなくてもヒトと類似するタンパクを持っていない生物の血清であればいいそうですが)。 ・試料を過酸化水素水で処理する理由 dab法ではdabと過酸化水素とhrpで標識した2次抗体を発色しますが、この反応の非特異的な発色を防ぐために、試料中のもともとあったペルオキシダーゼを失活するために過剰な過酸化水素水で試料を処理するとありました。 ペルオキシダーゼはミトコンドリアの水素伝達系で生じた過酸化水素やフリーラジカルを分解する酵素とのことですが、過酸化水素を分解する酵素が、過酸化水素で失活するものなのでしょうか?過剰であれば壊れるのでしょうか? 酵素は反応を促進させるものであって酵素自体は反応の際に構造は変化しないと記憶しているのですが。 また、過酸化水素は有機系の高分子を破壊するものと思っていましたが、標的タンパクを変性させる可能性はないのでしょうか? 知識がないもので、的外れなことや間違ったことを書いているかもしれませんが、よろしくお願いします。
回答: あ、あと、 >標的タンパクを変性させる可能性はないのでしょうか? 変性することはあるかもしれません。しかし、それが抗体によって認識されなくなるかということとは、別問題です、 なぜなら、それはエピトープがどのようなものかによるからです。 ただ、抗体が認識する領域はタンパク質のうちで、数個のアミノ酸からなるそのことを考慮するとどうでしょうか・・・ 結局、そのタンパク質によるということで、免疫染色に支障がでるかもしれないし、でないかもしれないという結論になります。 ただ、抗体を購入したときのデータシートには、どのような用途に使える抗体かということが、明記してあると思います。 免疫組織化学に使えるかどうか、それによって判断するといいと思います 。