質問: q-3. cas9/nickase 発現ベクターをパッケージングしたウイルスの力価が非常に低くなってしまいました。
回答: a-3. 以下の点が原因として考えられます。1) hek293t 細胞の密度が高すぎる,または低すぎるため,トランスフェクション効率が低くなった可能性があります。トランスフェクションの際に,プレート中の細胞密度が50 ~ 80%になるように調節して下さい。2) 293t 細胞の品質が悪かったため,偽ウイルス粒子の産生が不十分であった可能性があります。以下の点を参考に,生育条件の最適化を行って下さい。・増殖培地を再確認して下さい。・細胞の継代数が20 回以上でないことを確認して下さい。・細胞がマイコプラズマ感染していないことを確認して下さい。・ 細胞を増殖させすぎていないか確認して下さい(培養を対数増殖期に維持するため,細胞密度を90%以上にしないようにして下さい)。3) 偽ウイルス粒子を含む細胞培養上清の回収タイミングが早すぎた,または遅すぎた可能性があります。培養上清は少なくとも2 度回収して下さい(トランスフェクション後48 時間および72 時間の時点)。回収した上清を合わせて,ウイルスの濃縮を行って下さい。peg 沈殿によるウイルス粒子濃縮用試薬 peg-it reagent(#lv810a-1, #lv825a-1)の使用をお勧めします。4) 使用しているcas9/nickase レンチベクターが,パッケージング効率の限界に近づいている可能性があります。レンチウイルスシステムにおけるパッケージングでは,レンチベクターの5'ltr-3'ltr 間は8.5 kb までが限界です(cas9/nickase ベクターは8 kb までが限界)。cdna インサートのサイズが2 kb 以上になると,パッケージング効率は著しく低下します(cas9/nickase ベクターでは,4 kb までのインサートサイズをパッケージング可能)。3 kb を組み込んだ場合は,1 kb の場合に比べ,パッケージング効率が1/10 以下になることがあります。これを回避するためには,パッケージングする細胞のプレート数を増やして,十分量のcas9/nickase ウイルスを得られるようにして下さい。