質問: 電気泳動について 電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、タンパク質をバンドとして出現させた際に、近くのバンド同士が接近しすぎていて、あいまいになってしまった際に、そのあいまいになってしまっている個所のゲルを切り出して、再度SDS-PAGEをすることは可能でしょうか。 また、どのようにして一度ゲルの中にバンドとして出現したタンパクを抽出?精製?するのでしょうか。 語彙の使い方等で、不適切な箇所があるかもしれませんが、ご存知の方、ご回答よろしくお願いします。
回答: >どのようにして一度ゲルの中にバンドとして出現したタンパクを抽出?精製?するのでしょうか。 これは染色法によります。銀染色などだとたぶん無理です。 酢酸酸性中でCBB染色なら、切り出したバンドをもう一度泳動するときのサンプルバッファー(pH 6.8Tris/HCl,他)に平衡化するまでつけて(時間は切り出したゲル片の大きさ次第)もう一度クシ穴に押し込めば(少しゲルを砕くと押し込みやすい)OK です。電圧をかければタンパク質はゲルから勝手に出て、スタッキングゲルに入っていきます。 >近くのバンド同士が接近しすぎていて、あいまいになってしまった際に、そのあいまいになってしまっている個所のゲルを切り出して、再度SDS-PAGEをすることは可能でしょうか。 分子量が接近している、つまり泳動位置がほとんど重なっているタンパク質を分離するにはどうするかということですね。 易しくて確実なのはゲルを長くすることです。長さ8cm位のゲル板を使っていますかね? 長さ16cmとか30cmとかのゲル作れませんか? それで泳動すれば努力しないで解決します。 大きなガラス板がないときは、うまくいくかどうかはやってみないと分かりませんが、色々試すしかありません。他の方が言われている2次元電気泳動などもあります。普通は、等電点電気泳動を先にしますが、SDS電気泳動をやってから等電点も可能です。上と同様に切り出したゲルをそのまま2次元電気泳動用の時の1次元目のサンプルバッファー(SDSが先の時は6M尿素は必須、でTritonもあった方がよい)で平衡化してから、等電点電気泳動を行います。タンパク質は上と同様に勝手にゲルから出て行きます。 SDS電気泳動の変法を使う。例えばゲルに尿素(6Mとか)を加えておくと泳動位置が変化することがあります。