質問: q-1. バンドが検出されない
回答: a-1. 使用抗体に問題がある:目的タンパク質に対して抗体のアフィニティが低い可能性があります。抗体の希釈濃度を2~4倍上げて下さい。抗体が失活している可能性があります。ドットブロットを行い,確認して下さい。目的タンパク質の量に問題がある:ゲルにアプライする総タンパク質量を増やして下さい。ウエスタンブロット以外の手法で,試料中に目的タンパク質が存在することを確認して下さい。目的タンパク質の組換え体タンパク質や目的タンパク質を発現している細胞ライセートを,ポジティブコントロールとして使用して下さい。トランスファーが不十分である:pvdfメンブレンをメタノールで十分湿らせて下さい。ニトロセルロースメンブレンをトランスファーバッファーで十分湿らせて下さい。メンブレンとゲルがしっかりと密着するようにして下さい。トランスファーが完了していない:トランスファー時間を調整して下さい。高分子量のタンパク質の場合は,長時間のトランスファーが必要な場合があります。トランスファーが完了したことを,メンブレンのponceau s染色などで確認して下さい。プレステインマーカーを泳動して,トランスファーができたことを視認して下さい。トランスファー過剰である:低分子量のタンパク質(<10 kda)をトランスファーする場合は,電圧もしくはトランスファー時間を減らしてみて下さい。等電が>9である:使用バッファーを高phのバッファーに変えてみて下さい(ph10.5のcapsなど)。交差性が異なる二次抗体を使用している:一次抗体のイムノグロブリンのタイプと,免疫動物種を確認し,適切な二次抗体を使用して下さい。抗体が古い:抗体が使用期間を過ぎていた場合は,新しい抗体を使用して下さい。抗体の保存方法を誤っている:メーカー推奨の保存条件の通りに保存し,凍結融解の回数を最小限にして下さい。アジ化ナトリウムのコンタミネーション:各バッファーにアジ化ナトリウムが混入していないことを確認して下さい。一次抗体とメンブレンのインキュベーション時間が短い:インキュベーション時間を4°Cでオーバーナイトにして下さい。