質問: 活性型beta-cateninのwestern gsk3βでリン酸化されてユビキチン化される前の活性型βカテニン(active beta-catenin; abc)のwesternについてお聞きしたいことがあります。 論文によってはwhole cell lysateでabc(非phosphorylation型βカテニン抗体)を用いてますがバンドが綺麗でないうえに、細胞質で単にphosphorylationを免れたのか、それとも核内にいるwntを活性化する転写因子なのか鑑別できません。 実際、自分も15-25μgをloadingしてabc抗体を用いてもバンドが出ませんでした。 一方で核分画を取ってきてwesternするときれいにバンドが、普通のβカテニン認識抗体で出ます。もちろんリン酸化されていないフォームのはずです。 少ない経験で恐縮ですが、それでも敢えて前者の方法を取る論文が多いのはなぜか、そのメリットがあれば是非ご意見を頂けると幸いです。
回答: 質問を以下のように読み替えて回答します。 (1)「別に非リン酸化型抗体を使わなくても、核にあるβカテニンは非リン酸化型であるはずだから、遠心分離して得た核分画で普通のβカテニン抗体を使用しても活性型βカテニンを検出しているはずだ」 →非リン酸化型βカテニンが核へ移行して転写活性を示すからと言って、細胞を破砕して得た核分画にあるβカテニンが必ず非リン酸化であるという証拠は? そのような知見があるのでしたら別にトピ主さんの手法でもかまわないと思います。 (2)「細胞全体を調べるより、核中のβカテニンを調べた方が、より転写活性を表しているはずだ」 →確かにその通りですね。でもリン酸化を免れたβカテニンが、細胞質で蓄積してから核へ移行して転写活性を示すんですから、別にwhole cell lysate中の活性型βカテニン量の多い少ないを調べる事に問題はないと思います。核分画をわざわざ調べても手間が増えるだけで結果は同じだと思うし。 (3)非リン酸化型抗体を使うとバンドが出にくい、クリアに出ないのになぜ使用するのか。 →「このバンドは確かに非リン酸化型のβカテニンである」と言うために、非リン酸化型抗体を使うのは、当然の手法じゃないでしょうか。 それと、非リン酸化型抗体でバンドが出ないのは感度が低いからですよね。 抗体量を増やすとか、ブロッティングや反応時間を長くするとか、それなりに検証はしてみましたか? (文献の、バンドがクリアでないというのも、感度を上げようとしたための副作用的なものと推測しますが、違うでしょうか)