質問: いつもありがとうございます。今回は制限酵素が2種の場合の質問なのですが・・・・。使う塩基配列は先ほど質問したものと同じでMus musculusのCDS領域197から775をクローニングしたいのですが、
回答: A1 その理解でよいかと。 他に同じ条件を満たす酵素があるなら、色々な組み合わせを考えても良いと思います。 A2 insertも入るでしょうが、BamHIで切ったvectorのself ligationが増えるかと思います。 BamHIで切ったvectorをさらにphosphatase処理して、、、という手間をかけてself ligationを減らしても、 発現vectorに入れる場合ですと、意図した向きに入るかどうかという面倒がさらに待ってます。 A3 定性的には、その理解で良いかと。 十分量のvectorをBamHI, SalIで消化しておきましょう。 入念にいきたいのなら、ゲルに流して切り出しまでしておくと、insert+のplasmidが取れやすいでしょう。 具体的に「ひっつける」のはligationのkitなどでやるのが簡便かと。 軽視する方もおられるようですが、vector:insertの比に留意されることをお勧めします。