質問: プライマー シークエンスする前に行うpcrと、ただ断片を増幅させるpcrでは同じプライマーを用いてはいけないのですか?また、シークエンス用のプライマーの濃度を薄くするのは、シークエンスの邪魔にならないようにするためなのですか? 初歩的な質問ですが、宜しくお願いしますm(__)m
回答: mizu_atsuさんの言う通り制限酵素でサブクーローンすればユニバーサルプライマーだけで読めますね。 ただ、私はそういう方法はしたことありません。確かにプライマーが変れば条件は変ってきます。しかし、プライマーのtmをある程度同じになるようなデザインをしてあげれば、大きく反応条件がずれる事はありません。それと、必ずしも、ちょうど良い制限酵素サイトが読みたい配列内に有るとも限りません。そういうタンパクはいっぱいあります。マイナーな制限酵素を買う方がお金がかかります。 幸運な事に私の所属していたラボは、それなりにお金があり、プライマーの外注をためらう事はありませんでした。使用していた遺伝子の配列も読み易い配列だったのかもしれません(超好熱菌の遺伝子をクローニングして配列を読んだ時も問題ナシでしたけど)。 サブクーローンはステップが増える分、時間と労力が必要です。急を要するなら自分でデザインしたプライマーでやった方が確実に早いです。ちなみに私が使ってたシーケンサーはabiの377と310です。 所属するラボの経済状況や周りの人がどうやって配列を呼んでいるのかを聞いてみたらいかがでしょう? それぞれのラボの方針というのもあると思いますよ。