質問: q-3. バンドが過剰に出ている
回答: a-3. 一次抗体が非特的結合を起こしている:一次抗体の希釈濃度を低くして下さい。ゲルに泳動させるタンパク質量を減らして下さい。モノクローナル抗体やアフィニティ精製された抗体を使用して下さい。二次抗体が非特異的結合を起こしている:二次抗体とコントロールを混合した試料を,ゲルに泳動して下さい。もしバンドが出てしまった場合は,違う二次抗体を使用して下さい。モノクローナル抗体やアフィニティ精製された抗体を使用して下さい。一次抗体または二次抗体が非特的結合を起こしている:0.1~0.5% tween 20を,一次抗体もしくは二次抗体に添加して下さい。ブロッティングバッファー中に2%スキムミルクを使用し,抗体の希釈液として使用して下さい。シグナルの出方に応じて,濃度を上下に調節して下さい。洗浄回数を増やしてみて下さい。抗体希釈液および洗浄バッファー中のnacl濃度を,減らしてみて下さい(0.15~0.5m)。メンブレンの洗浄バッファー中のtween 20濃度を上げてみてください(0.1~0.5%)。試料のタンパク質がアグリゲーションしている:dtt量を増やして(20~100 mm dtt),タンパク質のジスルフィド結合を完全に還元して下さい。また,十分にボイルして下さい(5~10分)。試料を遠心し,凝集物を泳動しないようにして下さい。試料のタンパク質が分解されてしまっている:試料の凍結融解の回数を最小限にして下さい。試料を保存する前に,プロテイナーゼ阻害物質を添加して下さい。新鮮な試料を用意して下さい。試薬がコンタミネーションしている:各バッファーに微粒子や微生物のコンタミネーションがないことを確認して下さい。新しいバッファーを調製して下さい。