質問: プライマーの失活 teで希釈したプライマー(原液ではなく、pcrに使用するためのプライマー・フォワードとリバースを混ぜた状態)は、4°Cの条件下で失活することはあるのでしょうか?冷凍と解凍を繰り返して使用するより安全なのでしょうか?また、その際、どのくらいで失活したか、経験された方はいらっしゃいますか? どなたか教えてください。宜しくお願いします。
回答: 私も含め、ほとんどの人はフォワードとリバースのプライマーを分けて保管していると思いますが、それは別に安定性とは関係ないような気がします。 リバースだけ少し位置を変えて設計してみたりということはわりと普通にやりますし、極端な例だと極めて変異が多い領域を増やすのに、フォワードで5種類リバースで6種類くらいのプライマーを設計して「どれか当たる組み合わせを増やす」なんてこともあったりしますから、フォワードとリバースを混合して保存すると具合が悪いですよね。 また、ダイレクトシークエンスのプライマーもワーキングソリューション(pcrのために20pmol/ulとかに希釈して保管しているもの)から作ったりもしますから("原液"は極力融解しないように)、その時も混合していると具合が悪いです。 なので普通はプライマーは分けて保管することがほとんどだと思いますが、用途が単一であることが明白なら混合して保存するのもありだとは思います。 混合保存で安定性が悪くなる理由は、理屈ではちょっと思いつかないです。敢えて言えばプライマーダイマーくらいかな・・・ でもプライマーダイマーならpcrの最初の熱変性ステップで乖離するでしょうからpcrの阻害要因になるとも思えません。なるのならそれは保存できなくプライマー設計の問題という気もします。 でもまあ、理屈では考えられないことが多々起きるのがpcrですから、わざわざ混合プライマーを保存するという冒険をする気はあまりないですけど。でもそれで今までうまくいってるのならそれで良いのでは、というところです。 保存方法についても、経験上はかなり雑なことをしてもあまり問題は生じていません。 非常に頻繁に使うpcr系があり、7年の間、ずっと年に5~6回はその同じ系でrt-pcrを実施してきました。 そのプライマーは最初に"原液"から20pmol/ulのワーキングソリューションを作ったものを7年間ず~っと使ってきたわけですが、pcrを実施する度に2~3回は凍結融解していたので7年間ではかなりの回数になると思うのですが、反応性に影響は見られませんでした。 ちなみにポジコンに使っていたrnaも、20ulのteにサスペンドしたものを1ulずつ使っていったのですが、使い切るまで(つまり20回ほど凍結融解したということです)反応は落ちませんでした。rnaで落ちないんだから、dnaはよほどのことがない限り大丈夫、と思っているのですが。 ただ、別の系で2pmol/ulというかなり薄い濃度のワーキングソリューションを使わざるを得なくなっている系があるのですが、これについては使用と共にポジコンのバンドが薄くなり(これはdna)、プライマーの活性低下(他に適当な言葉が見あたらないので活性という言葉を使いますが)を疑ったことがあります。きちんとした検証はせずじまいなんですが。 温度については、とある研究機関を訪ねた際に、あるプライマーをワーキングソリューションで分けてもらったことがあります。まあ分けてもらうことも分けてあげることもわりとしょっちゅうあるのですが。 ただ、たまたまジャケットのポケットに入れただけの状態で持って帰ってきて、しかもそのまま1週間ほど忘れていたということがありました。季節は秋なんですが。 しかもそのジャケットを、プライマーをポケットに入れたまま2回ほど洗濯までしていたのですが、プライマー、ちゃんと動きました。まあさすがに作り直しはしましたが。 まあ別にそんな横着を勧めるわけではありませんが、4°C保存か凍結融解かでそれほど悩む必要もないかな、というエピソードくらいに思っていただければ幸いです。 ちなみに私なら凍結融解を選ぶでしょう。