質問: PCR法(ポリメラーゼ連鎖反応)、RT‐PCR法について詳しく知りたいので教えて下さい。とくに、原理、方法、どのような試薬を使うかです。よろしくお願いします。
回答: 内容 PCR法 DNAの一部を増殖させる RT-PCR法 RNAの一部を増殖させる。 原理 DNAの特定部位を2種類のプライマーを使い、アニ-リング、塩基の作成、2重構造の分離、を繰り返し増殖させる。DNAのこの繰り返しは、温度によって操作します。DNAの切り離しとアニ-リングは温度でできますが、塩基の作成は酵素(DNAポリメラーゼ)を使うのですが、熱に弱い欠点があったが、高熱菌の酵素を使用する事で、この操作が可能になった。 RT-PCRは、RNAは非常に脆いので(RNaseにより分解しやすい)、これを一度逆転写酵素を使い、DNAにしてこれを元にPCRを行なう。 方法 1 特定する部位(DNA配列)上にある塩基配列を調べ。これをもとに2種類(FrontとRevrese)の塩基配列を作成する。作成は理化学研究所など業者がやってくれる。1つ約2~3万円ぐらい。 2 特定したいDNAを大腸菌、もしくは細胞から回収する。今は便利になって簡単に出来ます。回収キットを売ってます。 3 DNA断片、各プライマー、塩化マグネシウム、Taq(酵素)、dNTPs(塩基の各部分、アデニン、チミン、グアニン、シトシンが入ったもの)、あとPCRを行なってくれる機械(かなり高額)が必要です。 4 反応をさせて出来あがり。反応温度の一例は、参考URLを参照してください。DNAの長さにより、伸長時間を長くさせます。 温度は時と場合により人為的に変化させるので一概にこの温度ではないです。 PCRは、特定したいDNAがあるかを確認したり、実験に成功しているか(遺伝子組換えをさせた時)を確認にするのに使用したり、確かDNA解析を行なう為にも使用します。 RT-PCRを使う利点は、DNAは余分な情報も含まれていますが、スプライシングがされたあとのRNAは、使用する情報しか含まれていませんので、これを解析する事は、特定したいたんぱく質の構造を知る手がかりにもなります。 以上昔、行っていた実験をうる覚えで書きましたので、今はまた違った効率の良い方法があると思います。 参考URL: