質問: 吸光度を用いたdna濃度定量法について dna溶液のabs=260nm、280nm、320nmの波長を測定し、dnaの濃度定量を行ったですが、abs260/abs280の値が1.7より低く、dnaの純度があまり高くありませんでした。この場合、従来の吸光度計算(abs260の値×50 ug/ml×希釈倍率)で精度の高いdna濃度計算結果が得られるのでしょうか? dna純度が低い場合の吸光度でのdna濃度定量法があれば教えてください!!
回答: >pcrによって増幅した約700bpのdna断片 pcr産物であれば、残ったdntpやプライマーなどがあるので、吸光度では全く定量性がありません。 カラム精製すれば、大分ましになるでしょうけれども、目的外のバンドがあった場合にはそれも測定してしまいます。 (アガロースゲルではシングルバンドでも、pageで見ると非特異なバンドが多数見えることがあります) 濃度の簡単な定量法は、濃度が既知の適当なマーカー(λ/hindiiiなど)をいっしょに流し、そのバンドの濃さから見る方法です。 もし、バンドの濃さがマーカーの濃さの範囲から外れるようであれは、希釈系列を作って見ます。 コダックのソフトというのがバンドのintensityを測ることが出来るのか分かりません。 例えば、画像として保存して,nih imageで定量することが出来ます。 ただ、今回のような目的であれば、目で見てどのバンドと同じ濃さなのかを見たほうが早いし、その精度で十分なはずです。 >僕の研究室のプロトコール 実験の目的は、そのdna断片がライゲーションされたベクターを作ることですか? それとも、研究室のプロトコール通りの操作をすること自体が目的なのですか? 役に立たないプロトコルに従っていると、無駄な実験をすることになりますよ。 100ng分位をアガロースゲルで流して切り出し(収率50%で50ng) ↓ 制限酵素処理してもう一度切り出し(収率50%で25ng) ↓ ライゲーション で、例えば1ng分のインサートがライゲーションされて5ng分位のベクターが出来れば、普通にトランスフォーメーション(10^8cfu/ug)すれば理論上は10万個以上のコロニーが取れます。 ライゲーションされたのが1pg分であっても、100個以上のコロニーが取れます。 5ugを用意するのであれば、pcrを50ul分もすれば増やせるでしょうけれども、 こんなたくさんのdnaをきれいに電気泳動するためには幅の広いコームのゲルを用意しないといけませんし、回収の手間も試薬代もかかります。