質問: q-19. slicegolgi kitによるゴルジ染色・免疫染色の二重染色の方法を教えて下さい。
回答: a-19. まず浮遊条件下で固定切片のゴルジ染色を行い,その後免疫染色を行います。長期間組織を固定液や浸透液に浸すと,抗原エピトープが妨げられてしまいます。明瞭な染色結果を得るためには,できるだけ短時間で組織を固定し,2~3日で浸透処理を行って下さい。また,免疫染色には高感度なアビジン-hrp検出システムを使って下さい。bioenno社のdab-kitおよびdab-co kitを下記の方法で使用することで明瞭な結果が得られます。1)実験動物を生理食塩水とbioenno社の固定液(キット構成品または別売りfixative kit (#003780))で20~25分灌流処理する。脳を摘出し,0.1 mのpb(ph 7.4)で保存した後,室温(~22°C)で切片を作製する(~50μm)。切片は0.1 m pb(ph 7.4)中に回収する。かん流をうまく行えなかった場合は,組織を1~3時間後固定する。2) 室温で浮遊切片をslicegolgi kitを用いてゴルジ染色する。2~3日間浸透処理した切片を0.01 m pbs-tで洗浄し,染色(2~4分),後染色(~1分)を行う。 ※浸透に5~7日間必要な場合は,免疫染色は難しくなります。3) 切片をpbs-tで数分洗浄し,h2o2 (30% h2o2 30μl+pbs-t 10 ml)で20分間処理し,再度pbs-tで洗浄する。4) 免疫染色の実施:切片を一次抗体とともに一晩インキュベーションした後,pbs-tで10~15分洗浄し,ビオチン標識二次抗体とアビジン-ビオチン複合体で処理する。h2o2を含むdabまたはdab-コバルトにより発色させる。※ビオチン標識一次抗体を使用した場合,ビオチン標識二次抗体は不要。5) 切片をマウント,乾燥,脱水・透徹し,非水溶性の封入剤でカバーする。