質問: q-4. バックグラウンドが高い
回答: a-4. 一次抗体が非特的結合を起こしている:モノクローナル抗体やアフィニティ精製された抗体を使用して下さい。5%ミルクでブロッキングして下さい。一次抗体の希釈は,ミルク(2~5%)またはnacl(0.15~0.5m)で調節して下さい。抗体濃度を小さくしてみて下さい。二次抗体が非特異的結合を起こしている:二次抗体とコントロールを混合した試料を,ゲルに泳動して下さい。もしバンドが出てしまった場合は,違う二次抗体を使用して下さい。ブロッキングが不十分である:5%スキムミルク,0.1~0.5% tween 20,0.15~0.5m nacl in 25mm tris (ph 7.4)のブロッキングバッファーを使用して下さい。インキュベーション時間を長くして下さい。シグナルの出方に応じて,ミルク濃度を上下に調節して下さい。ブロッキングを4°Cでオーバーナイトさせると,界面活性剤が低い温度では効果的でないため,ブロッキング効率を下げる可能性があります。目的タンパク質中にスキムミルク成分が含まれてしまっている:ミルクの代わりに3%bsaに置き換えてみて下さい。スキムミルクにビオチンが混入してしまっており,アビジン/ストレプトアビジンと使用できない。:ミルクの代わりに3%bsaに置き換えてみて下さい。igy抗体がミルクタンパク質を認識してしまっている:ミルクの代わりに3%bsaに置き換えてみて下さい。洗浄が不十分である:洗浄回数を増やしてみて下さい。メンブレンの洗浄バッファー中のtween 20濃度を上げてみてください(0.1~0.5%)。一次抗体が非特的結合を起こしてい:抗体希釈液および洗浄バッファー中のnacl濃度を,減らしてみて下さい(0.15~0.5m)。フィルムの露光が過剰:露光時間を減らしてみて下さい。