質問: ソニケーション・脱クロスリンク後のクロマチンdnaの断片をbioanalyzerで見ていますが、断片の分布のカーブが2つ低分子側と高分子側に現れます。2番目(高分子側、500~1500 bp以上)に現れるピークは何ですか?
回答: bioanalyzerでサンプルを検定するとしばしば高分子側に2番目のピークが現れます。 この2番目のピークは通常対数スケール表示に伴うピークで、500 bp以上のx軸のデータが圧縮表示されることによって、高分子側の低くなだらかなピークが大きなピークとして視覚的に表示されます。 また、低分子量の分子と異なり、高分子量の分子のほうがシグナルを強く発するため、高分子側のピークが強調される傾向もあります。 bioanalyzerのソフトウェアはピーク面積を分子数で表示する機能を有しており、これを使用すれば2番目のピークは通常かなり改善されます。 よって、2番目のピークは通常ライブラリー調製に影響は与えません。 また、ライブラリー調製時には低分子側の断片のほうが効率良く取り込まれるため、高分子の断片は調製中に大部分が取り込まれずに除去されます。 アガロースゲル電気泳動ではこのような断片長、およびsds・タンパク質・共沈剤などの不純物に由来する誤検出が少ないため、diagenodeではクロマチンdna断片のサイズ確認にはアガロースゲル電気泳動の使用を推奨しております。 ! figure 5. アガロースゲルおよびbioanalyzerを用いた断片化クロマチンdnaのサイズ評価。 hela細胞をホルムアルデヒドで固定し、染色体をdiagenodeのプロトコルに従って調製した。 サンプルを、picoruptorの30サイクルon / 30秒offで1.5 ml picoruptor microtubes with caps(c30010016)を用いて超音波処理し、アガロースゲル(図a)、またはbioananlyzer、high sens agilent dnaキット(図b)によって測定した。 500bp以下および500bp超のフラグメント含有量を全表面積のパーセンテージとして算出した(図c)。図dはモル濃度として計算されたフラグメント含有量を示す(bioanalyzerトレースのみ)。