質問: q-1. ecm細胞接着アッセイの操作方法は?
回答: a-1. ■colorimetric format(#cba-070/cba-070-5)1.滅菌環境下で,ecmプレートを10分間,室温で温める。2.無血清培地に0.1~1.0×10^6cells/mlの細胞含む懸濁液を調製する。この際,刺激物質または阻害物質を細胞懸濁液に直接添加することができる。3.細胞懸濁液150μlを各ウェルの内側に添加する(ネガティブコントロールとしてbsaをコートしたウェルを含む)。4.細胞培養用のインキュベーター中で30~90分間インキュベートする。5.各ウェルから培地を注意深く廃棄または吸引する。この際,各ウェルを乾燥させないようにする。次いで各ウェルをpbs 250μlで4~5回,穏やかに洗浄する。6.各ウェルからpbsを吸引し,cell stain solution 200μlを添加する。室温で10分間インキュベートする。7.各ウェルからcell stain solutionを廃棄または吸引する。各ウェルを脱イオン水500μlで4~5回洗浄する。8.最終洗浄液を廃棄し,ウェルを乾燥させる。9.各ウェルにextraction solution 200μlを添加し,次いでオービタルシェーカー上で10分間インキュベートする。10.各抽出試料150μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移し,プレートリーダーによりod560の吸光度を測定する。■fluorometric format(#cba-071/cba-071-5)1.滅菌環境下で,ecmプレートを10分間,室温で温める。2.無血清培地に0.1~1.0×10^6 cells/mlの細胞含む懸濁液を調製する。この際,刺激物質または阻害物質を細胞懸濁液に直接添加することができる。3.細胞懸濁液150μlを各ウェルの内側に添加する(ネガティブコントロールとしてbsaをコートしたウェルを含む)。4.細胞培養用のインキュベーター中で30~90分間インキュベートする。5.各ウェルから培地を注意深く廃棄または吸引する。この際,各ウェルを乾燥させないようにする。次いで各ウェルをpbs 250μlで4~5回,穏やかに洗浄する。6.cyquant gr dyeをlysis bufferを用いて1:300に希釈し,十分量の1×lysis buffer/cyquant gr dye solutionを調製する(調製例:色素4μlを4×lysis buffer 300μlと900μlのdh2oに添加する)。7.細胞を含む各ウェルに1×lysis buffer/cyquant gr dye solution 200μlを添加する。振とうしながら室温下で20分間インキュベートする。8.各抽出試料150μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移し,蛍光プレートリーダー(励起 480 nm/蛍光 520 nm)により蛍光強度を測定する。