質問: 酵素活性の比較 いつもお世話になっています。 動物組織から精製したタンパク質について酵素活性を測定しています。 酵素はモノアミンオキシダーゼという酵素で、基質はbenzylamine hydrochloride です。 緩衝液にはk-phosphate ph7.4を用いています。 250nmの吸光度変化を測定し酵素活性を求めているのですが、吸光度はリニアに変化しており、きちんと測定できているように思います。 しかし、結果が思うようではありません。 コントロールでもうまくいかないのです。 これは計算方法も間違っているのではないかと思い質問しました。 精製前のタンパク質と精製後のタンパク質の酵素活性を測定し比較する場合、mg proteinあたりの酵素活性を求めて比較するということで良いのですか? それとも、タンパク質のtotal volumeをかけてtotal同士を比較するものなのでしょうか。 どなたかご教授お願いいたします。
回答: >教授だけという世にも稀なラボで、教授もこの測定について知らず 医学部、薬学部、理学部、家政学部、などなら、学生時代に生化学を学び、実習しているので、学部としては心理系かと。これは、モノアミンオキシダーゼ(通常maoと略す、以下mao)からの推定で、maoには聞き覚えがあり、薬理学で、アドレナリンの代謝に関与していたと、というのが35年前の記憶です。 そんなことはどうでも良いのですが、一番良いのは、近くの大学の上記の学部の教員、院生に聞くことです。学生では、生化学の部屋ならokですが。 >units/ml、total units、units/mg、あとrecovery(%) units/mlは、サンプル(この場合は、酵素を含む溶液)1ml当たりの活性の単位。測定値から、そのまま計算します。units/mlの計算時に、吸光度が高すぎて希釈した(精製度か高くなると、希釈しないと測定できないのが普通)場合は、その希釈倍数を掛け算する。 total unitsは、全活性で、 units/mlに全液量mlを掛け算した数値。 units/mgは、比活性で、活性をタンパク量で割った値。タンパク量は、アルブミンを標準液として、検量線を描き、280nmで測定して求めます。タンパク濃度が薄いときは、フォーリン-ローリー法を用いるのが一般的です。この値が、高くなるように精製を進めます。 recovery(%)は、高いほどよいのですが、高くすると、比活性は低くなります。比活性を高くしようとすると、この回収率は、どうしても低くなります。比活性を高くすることを優先しますが、そうすると回収率が低くなり、ジレンマに陥ります。そこが酵素屋さんの腕の見せ所、ということになります。