退火温度为引物和模板结合时候的温度参数,当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度,它是影响PCR特异性的较重要因素。在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞,这就使PCR后期的过程成为可能。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。