Dyskusja:Chromatografia cieczowa

message: Autor bardzo pobieżnie potraktował temat chromatografii cieczowej, popełniając szereg błędów.
Po pierwsze: Chromatografia cieczowa to chromatografia, w której fazą ruchomą jest ciecz. Oznacza to, że fazą stacjonarną może być zarówno ciało stałe, jak i ciecz będąca w równowadze z eluentem.
Chromatografia ciecz - ciało stałe dzieli się na:
1. Planarną
2. Kolumnową
Chromatografia cieczowa planarna jest to typ chromatografii, w którym złoże, będące ciałem stałym, jest pewną powierzchnią, na którą nakładamy masze mieszaniny do rozdzielania. Ciecz następnie wnika w tę powierzchnię, powodując rozdzielanie się tych substancji pomiędzy migrującą ciecz, a powierzchnią, do której substancje adsorbują się w unikalny dla siebie sposób.
Chromatografia planarna ze względu na sposób prowadzenia jest dzielona na:
1. Chromatografię bibułową,
2. Chromatografię cienkowarstwową (TLC), w tym:
2.1 Wysokosprawną chromatografię cienkowarstwową (HPTLC).
Chromatografia planarna jest bardzo prosta w przeprowadzeniu i często trwa kilka minut. Z tego względu jest ona jedną z najczęściej stosowanych technik tzw. "połanalitycznych", czyli na szybkie oszacowanie "czego więcej - czego mniej". 
Chromatografię planarną możemy wykorzystywać zarówno do celów preparatywnych, jak i analitycznych. Nazwa "chromatografia cienkowarstwowa" bywa często myląca, gdyż warstwy dla wylewanych płytek preparatywnych, często mogą mieć kilka milimetrów grubości. Czasami nawet miejsce wprowadzania preparatu to "dziurka", którą trzeba nawiercić, lub wydłubać w złożu. Ponieważ gotowe płytki chromatograficzne są na ogół analityczne, a nie preparatywne, płytki preparatywne trzeba sobie na ogół "wylać" samemu. Niemniej jednak, dla kilku mikrogramów substancji (lub setek nanogramów) płytki analityczne lub powierzchnia bibuły są wystarczające dla preparatyki na taką skalę. Wystarczy wyciąć odpowiedni prążek z bibuły, lub zdrapać z płytki złoże do roztworu, aby wyekstrahować interesujące nas substancje. W przypadku przygotowywanych przez nas płytek preparatywnych, procedura jest, oczywiście, ta sama: należy zdrapać złoże z zaadsorbowaną substancją do odpowiedniego roztworu ekstrakcyjnego.
W przypadku analitycznego zastosowania technik planarnych, musimy dokładnie nałożyć odpowiednią ilość preparatu, a później dokładnie zmierzyć wielkość i intensywność plamy. Dawniej była to metoda jedynie przybliżona, jednakże dzisiaj, kiedy jest możliwe użycie odpowiednich metod densytometrycznych (absorpcja, fluorescencja, chemiluminescencja, rozpraszanie), technika ta stała się jak najbardziej techniką w pełni analityczną. Nie bez znaczenia taż ma wprowadzenie wysokiej klasy aplikatorów płytkowych; kalibrowanych, równych kapilar do TLC; lub też wysokiej klasy pipet automatycznych, które umożliwiają nałożenie dokładnej małej ilości na płytkę. 
Ważne też jest wprowadzenie płytek z wysokiej klasy złożem (płytki HPTLC), które umożliwiają również rozdział na złożu wysokogatunkowym. Inną sprawą jest wprowadzenie (np. przez firmę Camag) komór z gradientową kompozycją eluentu w celu wykonania gradientowego rozdzielania. Ponadto inną techniką jest OPTLC (Overpressured Thin Layer Chromatography), która umożliwia nie tylko precyzyjny gradient, lecz także szybkie rozdzielanie bez parowania rozpuszczalnika w niezwykle krótkim czasie.
Chromatografia cieczowa kolumnowa jest dzielona ze względu na ciśnienie oraz parametry rozdzielania, gdyż są to parametry w pewien sposób powiązane ze sobą. Reguła jest prosta: Im bardziej rozdrobnione złoże, tym wyższe parametry rozdzielania (większa liczba półek teoretycznych oraz wyższe rozdzielczości chromatograficzne w odniesieniu do rozdzielenia się dwóch sąsiednich pików). No, i, oczywiście, wyższe ciśnienia, bo bardziej rozdrobnione złoże stanowi większy opór w transporcie masy.
Dlatego chromatografię cieczową kolumnową dzielimy na:
 
1. LPLC – Low Pressure/Performance Liquid Chromatography – dotyczy głównie technik grawitacyjnych, często też z użyciem prostej pompy perystaltycznej,
2. MPLC – Medium Pressure/Performance Liquid Chromatography – technika umożliwiająca średnie ciśnienia (z reguły do 10 bar, rzadko kiedy do 30 bar). Jednym z wariantów jest FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography), gdzie skrót i nazwa jest własnością firmy GE Heathcare (dawniej LKB, Pharmacia, Amersham…), przy czym firmy oferują konkurencyjne sprzęty i kolumny.
3. Flash – dotyczy przede wszystkim chromatografii niskocząsteczkowej i z reguły na fazie normalnej, ale stosowane są różne techniki. Flash wyodrębnił się z LPLC. Obecne aparaty umożliwiają wkręcenie kolumny typu MPLC (powyżej) i eksperymenty MPLC. Z reguły do kilkunastu, czasem do 30, bardzo rzadko do 100 bar.
4. HPLC – High Performance/Pressure Liquid Chromatography – pierwsza technika kolumnowa LC o znaczeniu analitycznym ze względu na sprawności kolumn. Z reguły od 100 bar wzwyż.
5. UHPLC – Ultra-High Performance/Pressure Liquid Chromatography – technika ostatnich lat, do 1000 bar, a czasem i więcej. W 2004 roku firmy Waters i Flux wypuściły pierwsze modele do 1000 bar, przy czym Waters zastrzegł nazwę UPLC dla swoich produktów. Pozostałe firmy używają skrótu UHPLC. Obecnie komercyjnie dostępne aparaty umożliwiają pracę do 1500 bar (w roku 2015).
Zupełnie odrębną kwestią jest chromatografia przeciwprądowa, czyli countercurrent chromatography, CCC. Jest to chromatografia pomiędzy dwie, niemieszające się ciecze. Chromatografia przeciwprądowa (countercurrent chromatography, CCC) jest zbiorem technik bazujących na idei chromatografii pomiędzy dwiema cieczami. Ten „przeciwprąd” w nazwie jest tu z pewnych względów historycznych, ale też dlatego, że każda z obu faz może być ruchoma lub stacjonarna – wybór zależy od nas. Sama kolumna chromatograficzna tworzy się w specjalnych
urządzeniach, będących dzisiaj na ogół specjalnymi wirówkami przepływowymi, gdzie ciecze są zmuszane do tego, aby dawały proces  chromatograficzny (czyli aby uzyskać zjawisko półek teoretycznych). Idea chromatografii przeciwprądowej doczekała się bardzo wielu technologicznych realizacji (czyli konstrukcji urządzeń, w których tworzy się kolumna).
Niezależnie od samej konstrukcji tworzącej kolumnę, wszystkie te techniki bazują na tych samych fizycznych podstawach. Trzy najważniejsze kryteria, które wskazuje raport IUPAC dotyczący tej techniki, to:
1. Wymagane są dwie odrębne fazy (dwie odrębne, niemieszające się ciecze),
2. Faza wybrana przez użytkownika jako stacjonarna powinna być zatrzymana bądź
spowolniona (ang. retained) w urządzeniu formującym kolumnę,
3. Interesujące nas substancje w próbce (preparacie) powinny się rozdzielać (dzielić) pomiędzy
te dwie wybrane fazy (ciecze).
Natomiast samych technik w historii było trochę, z czego większość jest historyczna.
Na rynku ostały się dwa rodzaje technik:
1. HSCCC (high-speed countercurrent chromatography), zwana też konstrukcją hydrodynamiczną (HPCCC jest wersją HSCCC z wyższymi obrotami), oraz:
2. CPC (centrifugal partition chromatography, chromatografia pola odśrodkowego), zwana też
konstrukcją hydrostatyczną.
W systemach hydrodynamicznych ciecze się dynamicznie mieszają i wytrącają w odpowiednich strefach pracy urządzenia, natomiast w systemach hydrostatycznych jedna z cieczy jest faktycznie unieruchomiona. W związku z tym w systemach hydrostatycznych (CPC) mamy wyższą kontrolę nad fazą stacjonarną. 
Spośród technik historycznych warte uwagi są jedynie DCCC (Droplet Countercurrent Chromatography) oraz RLCCC (Rotation Locular Countercurrent Chromatography).
Zupełnie inną kwestią jest podział chromatografii (w ogóle) według zjawisk fizykochemicznych w ogóle, dla wszystkich zjawisk chromatograficznych. Chromatografię (w ogóle) dzielimy ze względu na zjawiska fizyczne występujące w interakcji rozdzielanych substancji z fazami, czyli:
1. Chromatografia podziałowa
1.1 Podział ze względu na rozpuszczalność w eluencie i w fazie stacjonarnej (w LC – dotyczy powierzchni zwilżania w przypadku złoża stałego, ale przede wszystkim technik chromatografii przeciwprądowej, gdzie pomiędzy dwie niemieszające się ciecze podział jest dominującą składową)
1.2 Podział ze względu na temperaturę wrzenia (w GC)
1.3 Podział ze względu na wielkość cząsteczek (przede wszystkim w LC – techniki SEC/GPC, ale także często w GC)
2. Chromatografia adsorpcyjna
2.1 Adsorpcja w „fazie normalnej” dzięki oddziaływaniom natury elektrostatycznej i indukcyjnej (dotyczy wszystkich typów: GC, LC, SFC)
2.2 Adsorpcja w „fazie odwróconej” dzięki ujawniającym się oddziaływaniom hydrofobowym (przede wszystkim w LC, ale może też wystąpić w SFC z modyfikatorem, lub gdy nadkrytycznym płynem jest przegrzana woda)
2.3 Wymienianie jonowe(tylko w LC)
2.4 Efekty powinowactwa (raczej w LC, rzadkie w GC, w SFC słabo zbadane)
2.4.1 Oddziaływania powinowactwa do jonów metali (IMAC)
2.4.2 Specjalne efekty skutkujące utworzenie wiązania kowalencyjnego (tzw. chromatografia kowalencyjna dwusiarczków)
2.4.3 Pozostałe efekty ze względu na unikalne kształty cząsteczek, najczęstszym przykładem jest oddziaływanie białko-ligand, ale tego typu efekty steryczno-elektrostatyczno-indukcyjne występują też w niektórych technikach GC.
Autor artykułu poruszył też pojęcie elektroforezy... Trochę to pomieszanie pojęć, bo elektroforeza to poruszanie się jonów w polu elektrycznym. Mogą występować tu dwie fazy, ale nie muszą. Natomiast (mieszanie) techniki wspólne dla elektroforezy i chromatografii istnieją. Przykładem jest chociażby technika elektrochromatografii planarnej(PEC), czy też kapilarnej elektrochromatografii (CEC), które wykorzystują złoża chromatograficzne oraz przyłożone pole elektryczne. Niemniej jednak osobiście uważam, że "włączenie do jednego wora" chromatografii cieczowej i elektroforezy jest "pomieszaniem z poplątaniem", gdyż są to odrębne techniki, które mogą być łączone we wspólnym eksperymencie, ale wcale nie muszą. Tym bardziej, że inna notacja, np. tego, co to jest porowatość, doprowadza do nieporozumień, szczególnie uciążliwych dla studentów. Porowatość w elektroforezie oznacza po prostu "przestwory" w usieciowaniu złoża żelu, podczas gdy w chromatografii oznacza wielkość porów ziaren, do których może wniknąć interesująca nas substancja. W ostatecznym rozrachunku są to jakby przeciwstawne sobie pojęcia.
Tak więc takie refleksje mi się nasunęły, kiedy czytałem to "wiekopomne wypracowanie" nt. chromatografii cieczowej.
Pozdrawiam,
HP
thread_title:  Chromatografia cieczowa