Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2004-13 (Year: 2004, Number: 13)
Era: 2004-2010
Section: 7. számú melléklet a 6/2004. (II. 10.) ESZCSM rendelethez
Paragraph Index: 716

7. számú melléklet a 6/2004. (II. 10.) ESZCSM rendelethez A kozmetikai termékekben lévõ 2-fenoxietanol, 1-fenoxipropán-2-ol, metil-, etil-, propil-, butil- és benzil-4-hidroxibenzoát azonosítása és mennyiségi meghatározására vonatkozó vizsgálati módszerek 2-FENOXIETANOL, 1-FENOXIPROPÁN-2-OL, METIL-, ETIL-, PROPIL-, BUTIL- ÉS BENZIL-4-HIDROXIBENZOÁT AZONOSÍTÁSA ÉS MEGHATÁROZÁSA KOZMETIKAI TERMÉKEKBEN A. AZONOSÍTÁS 1. Cél és alkalmazási terület Ez a módszer egy vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) eljárás, amely a B. szakaszban leírt vizsgálati módszerrel együttesen lehetõvé teszi a 2-fenoxietanol, 1-fenoxipropán-2-ol, metil-, etil-, propil-, butil- és benzil-4-hidroxibenzoát azonosítását a kozmetikai termékekben. 2. A módszer alapelve A tartósítószereket acetonnal vonjuk ki a megsavanyított vizsgálati mintából. Szûrés után az acetonos oldatot vízzel elegyítjük, és lúgos közegben a zsírsavakat kalcium sóik formájában csapadékként leválasztjuk. A lúgos aceton/víz elegybõl dietil-éterrel kivonjuk a lipofil anyagokat. Savanyítás után a tartósítószereket dietil-éterrel kivonjuk. A dietiléteres kivonat egy részét szilikagéllel bevont vékonyréteg lemezre cseppentjük. A lemez futtatása után a kapott kromatogramot UV fény alatt vizsgáljuk meg, és a foltokat Millon reagenssel tesszük láthatóvá. 3. Reagensek 3.1. Általános követelmény Minden reagensnek analitikai tisztaságúnak kell lennie. A felhasznált víz desztillált víz, vagy legalább ezzel egyenértékû tisztaságú víz legyen. 3.2. Aceton 3.3. Dietil-éter 3.4. n-pentán 3.5. Metil-alkohol 3.6. Ecetsav (Jégecet) 3.7. Sósav oldat, 4 mol/l 3.8. Kálium-hidroxid oldat, c(KOH) = 5 mol/l 3.9. Kalcium-klorid dihidrát (CaCl2.2H2O) 3.10. Detektáló szer: Millon reagens A Millon reagens (higany(II)-nitrát 69820 Fluka (készen, a kereskedelemben beszerezhetõ oldat) 3.11. 2-Fenoxietanol 3.12. 1-Fenoxipropán-2-ol 3.13. Metil 4-hidroxibenzoát (metilparaben) 3.14. Etil 4-hidroxibenzoát (etilparaben) 3.15. n-Propil 4-hidroxibenzoát (propilparaben) 3.16. n-Butil 4-hidroxibenzoát (butilparaben) 3.17. Benzil 4-hidroxibenzoát (benzilparaben) 3.18. Referencia oldatok Készítsünk 0,1%-os (m/v) oldatokat mindegyik referencia oldatból (3.11., 3.12., 3.13., 3.14., 3.15., 3.16. és 3.17.) metanollal. 3.19. Futtatószer Elegyítsünk 88 térfogatrész n-pentánt (3.4.) 12 térfogatrész ecetsavat (jégecet) (3.6.). 4. Eszközök Szokásos laboratóriumi berendezés, és: 4.1. 60 ºC hõmérséklet tartására alkalmas vízfürdõ 4.2. Futtató kád (szûrõpapír bevonat nélkül) 4.3. Ultraibolya fényforrás, 254 nm 4.4. Vékonyréteg lemezek, 20 x 20 cm, 0,25 mm 60F254 szilikagéllel bevonva, koncentráló zónával (Merck 11798, Darmstadt, vagy ezzel egyenértékû) 4.5. Maximum 105 ºC hõmérséklet tartására alkalmas szárítószekrény 4.6. Meleglevegõs hajszárító 4.7. Gyapjú festõhenger, hossza kb. 10 cm, külsõ átmérõje kb. 3,5 cm. A gyapjúréteg vastagsága 2-3 mm. Nyírjuk le a gyapjút, ha szükséges. Lásd az 5.2. alatti megjegyzést. 4.8. 50 ml-es üvegcsõ csavaros kupakkal. 4.9. Elektromos fûtõlap termosztátos hõmérséklet-szabályozóval. Hõmérséklet-beállítás: kb. 80 oC. A fûtõlapot fedjük le egy 20 × 20 cm-es, kb. 6 mm vastagságú alumínium lemezzel, az egyenletes hõeloszlás érdekében. 5. Eljárás 5.1. Mintaelõkészítés Mérjünk be hozzávetõlegesen 1 g mintát egy 50 ml-es csavaros tetejû üvegcsõbe (4.8.). Adjunk hozzá négy csepp sósavat (3.7.) és 40 ml acetont. Erõsen lúgos termékeknél, mint amilyen a pipereszappan, 20 csepp sósav oldatot kell adagolni. Zárjuk le a csövet, óvatosan melegítsük fel az elegyet kb. 60 oC-ra, hogy elõsegítsük a tartósítószerek kivonását az acetonos fázisba, majd rázzuk erõsen egy percig. Mérjük meg az oldat pH-ját pH-indikátorpapírral, és állítsuk be < 3 értékre sósav oldattal. Ismét erõsen rázzuk egy percig. Hûtsük le az oldatot szobahõmérsékletre, és szûrjük át egy szûrõpapíron egy Erlenmeyer lombikba. Töltsünk 20 ml szûrletet egy 200 ml-es Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 60 ml vizet és keverjük meg. Állítsuk be a pH-t körülbelül 10-es értékre káliumhidroxiddal (3.8.) úgy, hogy a pH mérésére indikátorpapírt használunk. Adjunk hozzá 1 g kalcium-klorid-dihidrátot (3.9.) és rázzuk fel erõsen. Szûrõpapíron szûrjük át egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 75 ml dietil-étert tartalmaz, és rázzuk erõsen egy percig. Hagyjuk szétválni a fázisokat, és a vizes réteget gyûjtsük össze egy 200 ml-es Erlenmeyer lombikba. Indikátorpapír segítségével állítsuk be a vizes oldat pH-ját hozzávetõlegesen 2-re sósav oldattal. Ezt követõen adjunk hozzá 10 ml dietil-étert, és rázzuk erõsen egy percig. Hagyjuk szétválni a fázisokat, és a dietil-éteres rétegbõl 2 ml-t töltsük át egy 5 ml-es mintatartó ampullába. 5.2. Vékonyréteg kromatográfia (TLC) Tegyünk egy TLC lemezt (4.4.) a megmelegített alumínium lapra (4.9.). Minden referencia oldatból (3.18.) kb. 10 ì l-t, a mintaoldatból (5.1.) pedig 100 ì l-t vigyünk fel a TLC lemez koncentrációs zónájának alapvonalára. Ha szükséges, használhatunk légáramot az oldószer párolgásának elõsegítésére. Vegyük le a TLC lemezt a melegítõlapról, és hagyjuk lehûlni szobahõmérsékletre. Töltsünk 100 ml elõhívó oldószert (3.19.) egy futtató kádba (4.2.). Tegyük a TLC lemezt azonnal a telítetlen kádba, és szobahõmérsékleten végezzük a futtatást addig, amíg az oldószer front mintegy 15 cm-re eltávolodik az alapvonaltól. Vegyük ki a lemezt az futtató kádból, és szárítsuk meg meleg levegõáramban egy meleglevegõs hajszárító segítségével. Vizsgáljuk meg a lemezt UV fény (4.3.) alatt, és jelöljük be a foltok helyét. Melegítsük a lemezt 30 percig egy szárítószekrényben (4.5.) 100 oC-on a felesleges ecetsav eltávolítása érdekében. A tartósítószereket Millon reagenssel (3.10.) tegyük láthatóvá a kromatogramon úgy, hogy a festõhengert (4.7.) belemerítjük a reagensbe, és addig görgetjük a TLC lemezen, ameddig az egyenletesen benedvesedik. Megjegyzés: vagylagosan a foltok úgy is láthatóvá tehetõk, hogy egy csepp Millon reagenst viszünk fel minden, UV fény alatt kijelölt foltra. A 4-hidroxibenzoesav észterek piros foltokként, míg az 2-fenoxipropanol és az 1 fenoxipropán-2-ol sárga foltokként jelennek meg. Megjegyezzük ugyanakkor, hogy maga a 4-hidroxibenzoesav, amely a mintában tartósítószerként vagy a parabének bomlástermékeként jelen lehet, ugyancsak vörös foltként fog megjelenni. Lásd a 7.3. és 7.4. pontot. 6. Azonosítás Számítsuk ki az Rf értéket minden egyes foltra. Hasonlítsuk össze a mintaoldatra kapott foltokat és a referencia oldatokra kapott foltok Rf értékével, valamint az UV sugárzás, és a láthatóvá tett színük intenzitása szempontjából. Ebbõl következtetések vonhatók le a tartósítószerek azonosságára vonatkozóan. Ha úgy tûnik, hogy parabének vannak jelen, akkor a B. szakaszban leírt HPLC vizsgálatot kell végrehajtani. Hasonlítsuk össze a TLC-vel és a nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) kapott eredményeket, hogy megerõsítsük a 2-fenoxietanol, az 1fenoxipropán-2-ol és a parabének jelenlétét. 7. Megjegyzések 7.1. A Millon reagens mérgezõ volta miatt ezt a reagenst a leírt eljárásoknak megfelelõen kell használni. Permetezése nem ajánlott. 7.2. Hidroxil-csoportokat tartalmazó egyéb vegyületek is kelthetnek színt Millon reagenssel. N. de Krujif, M. A. H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi és A. Schouten (1987): Determination of preservatives in cosmetic products I: Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatography 410, 395-411.) cikkében számos tartósítószerre vonatkozó színtáblázat és a TLC eljárás a használatával kapott Rf értékekre vonatkozó táblázatok találhatóak. 7.3. A következõ táblázatban felsorolt Rf-értékek a vizsgálatban kapható értékek azonosítására szolgálnak: Vegyület Rf Szín 4-hidroxibenzoesav metil-parabén etil-parabén propil-parabén butil-parabén benzil-parabén 2-fenoxietanol 1-fenoxipropán-2-ol piros piros piros piros piros piros sárga sárga 7.4. A 4-hidroxibenzoesav és metil-parabén vagy a benzil-parabén és etil-parabén esetén nem kapunk szétválást. Ezeknek a vegyületeknek az azonosítását úgy kell elvégezni, hogy a B. szakaszban leírt HPLC vizsgálat értékeit és a mintára kapott retenciós idõket egybevetjük az referencia oldatok retenciós idõivel. B. MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁS 1. Cél és alkalmazási terület Ez a módszer alkalmas a 2-fenoxietanol, 1-fenoxipropán-2-ol, metil 4-hidroxibenzoát, etil-4-hidroxibenzoát, propil-4-hidroxibenzoát, butil-4-hidroxibenzoát és benzil-4-hidroxibenzoát kozmetikai termékekben történõ mennyiségi meghatározására. 2. Fogalommeghatározás Az e módszerrel meghatározott tartósítószerek mennyiségét tömegszázalékban fejezzük ki. 3. Alapelv A mintát kénsav hozzáadásával megsavanyítjuk, majd etil-alkohol és víz elegyével szuszpendáljuk. Miután a keveréket gyengén melegítettük a lipid fázis megolvasztása és a kvantitatív kivonás elõsegítése céljából, a keveréket megszûrjük. A szûrletben lévõ tartósítószereket fordított fázisú HPLC-vel határozzuk meg, belsõ standardként izopropil-4-hidroxibenzoátot használunk. 4. Reagensek 4.1. Általános rész Minden reagensnek analitikai és HPLC tisztaságúnak kell lennie ott, ahol erre szükség van. A felhasznált víz desztillált víz, vagy legalább ezzel megegyezõ tisztaságú víz legyen. 4.2. Abszolút etil-alkohol 4.3. 2-fenoxietanol 4.4. 1-fenoxipropán-2-ol 4.5. Metil-4-hidroxibenzoát (metil-parabén) 4.6. Etil-4-hidroxibenzoát (etil-parabén) 4.7. n-propil-4-hidroxibenzoát (propil-parabén) 4.8. Izopropil-4-hidroxibenzoát (izopropil-parabén) 4.9. n-butil-4-hidroxibenzoát (butil-parabén) 4.10. Benzil-4-hidroxibenzoát (benzilparabén) 4.11. Tetrahidrofurán 4.12. Metil-alkohol 4.13. Acetonitril 4.14. Kénsav oldat c(H2SO4) = 2 mol/l 4.15. Etil-alkohol/víz elegy Keverjünk össze kilenc térfogatrész etil-alkoholt (4.2.) és egy térfogatrész vizet. 4.16. Belsõ standard oldat Pontosan mérjünk be 0,25 g izopropil-parabént (4.8.), töltsük át egy 500 ml-es mérõlombikba, oldjuk fel és töltsük fel a jelig etil-alkohol/víz eleggyel (4.15.). 4.17. Mozgó fázis: tetrahidrofurán/víz/metil-alkohol/acetonitril elegy Keverjünk össze 5 térfogatrész tetrahidrofuránt, 60 térfogatrész vizet, 10 térfogatrész metil-alkoholt és 25 térfogatrész acetonitrilt. 4.18. Tartósítószerek törzsoldata Pontosan mérjünk be 0,2 g 2-fenoxietanolt, 0,2 g 1-fenoxipropán-2-ol-t, 0,05 g metilparabént, 0,05 g etil-parabént, 0,05 g propil-parabént, 0,05 g butil-parabént és 0,025 g benzil-parabént egy 100 ml-es mérõlombikba, oldjuk fel és töltsük jelig etil-alkohol/víz eleggyel. Hûtõszekrényben tartva az oldat egy hétig stabil. 4.19. Tartósítószerek standard oldatai A törzsoldatból (4.18.) töltsünk át 20,00 ml-t, 10,00 ml-t, 5,00 ml-t, 2,00 ml-t és 1,00 ml-t egy-egy 50 ml-es mérõlombikba. Minden mérõlombikhoz adjunk 10 ml belsõ standard oldatot (4.16.) és 1,0 ml kénsav oldatot (4.14.), majd töltsük fel a jelig etil-alkohol/víz eleggyel. Ezeket az oldatokat frissen kell készíteni. 5. Eszközök Hagyományos laboratóriumi felszerelés és: 5.1. 60±1 ºC fenntartására alkalmas vízfürdõ 5.2. Nagynyomású folyadék-kromatográf 280 nm hullámhosszú UV detektorral 5.3. Analitikai oszlop Rozsdamentes acél, 25 cm × 4,6 mm belsõ átmérõ (vagy 12,5 cm × 4,6 mm belsõ átmérõ), Nucleosil 5C18 vagy ezzel egyenértékû töltettel töltve (lásd a 10.1. pontot) 5.4. 100 ml-es üvegcsövek csavaros kupakkal 5.5. Forrkõ, 2-4 mm méretû vagy ezzel egyenértékû 6. Eljárás 6.1. Mintaelõkészítés 6.1.1. A minta elõkészítése belsõ standard hozzáadása nélkül Mérjünk be körülbelül 1 g-nyi mintát egy 100 ml-es csavaros tetejû üvegcsõbe. Pipettázzunk 1,0 ml kénsav oldatot (4.14.) és 50,0 ml etil-alkohol/víz elegyet (4.15.) a csõbe. Adjunk hozzá körülbelül 1 g forrkövet (5.5.), zárjuk le a csövet és rázzuk erõsen addig, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. Rázzuk legalább egy percig. Tegyük a csövet öt percre vízfürdõbe (5.1.), és tartsuk 60 ± 1 ºC-on a tartósítószerek etil-alkoholos fázisba történõ kivonásának elõsegítése céljából. Azonnal hûtsük le a csövet hideg vízáramban és tartsuk a kivonatot hûtõszekrényben egy órán keresztül. Szûrjük le a kivonatot szûrõpapíron keresztül. Töltsünk át körülbelül 2 ml kivonatot egy 5 ml-es mintatartó küvettába. Tartsuk a kivonatot hûtõszekrényben és 24 órán belül végezzük el a HPLC-s meghatározást. 6.1.2. A minta elõkészítése belsõ standard hozzáadásával Mérjünk be három tizedes pontossággal 1±0,1 g mintát egy 100 ml-es csavaros tetejû üvegcsõbe. Pipettázzunk 1,0 ml kénsav oldatot és 40,0 ml etil-alkohol/víz elegyet a csõbe. Adjunk hozzá körülbelül 1 g forrkövet (5.5.) és pontosan 10,00 ml belsõ standard oldatot. Zárjuk le a csövet, és rázzuk erõsen addig, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. Rázzuk legalább egy percig. Tegyük a csövet öt percre vízfürdõbe (5.1.), és tartsuk 60±1 ºC-on a tartósítószerek etil-alkoholos fázisba történõ kivonásának elõsegítése céljából. Azonnal hûtsük le a csövet hideg vízáramban és tartsuk a kivonatot hûtõszekrényben egy órán keresztül. Szûrjük le a kivonatot szûrõpapíron keresztül. Töltsünk át körülbelül 2 ml kivonatot egy 5 ml-es mintatartó küvettába (vakoldat). Tartsuk a kivonatot hûtõszekrényben, és 24 órán belül végezzük el a HPLC-s meghatározást. 6.2. Nagynyomású folyadék-kromatográfia (HPLC) 6.2.1. Kromatografálási feltételek: – Mozgó fázis: tetrahidrofurán/víz/metil-alkohol/acetonitril elegy (4.17.) – Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc – A detektálás hullámhossza: 280 nm 6.2.2. Kalibrálás Minden tartósítószer standard oldatából (4.19.) inyjektáljunk 10 ì l-t. A kapott kromatogramokból határozzuk meg a vizsgált tartósítószer standard oldat csúcsmagasságának a belsõ standard csúcsmagasságához viszonyított arányát. Ábrázoljuk görbén az egyes tartósítószerekhez tartozó csúcsmagasságok arányát az egyes standard oldatok koncentrációjának függvényében. 6.2.3. Mennyiségi meghatározás Fecskendezzünk 10 ì l belsõ standard nélküli mintaoldatot (6 .1.1.) a kromatográfba, és vegyük fel a kromatogramot. Fecskendezzünk az egyik tartósítószer standard oldatból (4.19.) 10 ì l–t, és vegyük fel a kromatogramot. Hasonlítsuk össze a kapott kromatogramokat. Ha a minta kivonat (6.1.1.) kromatogramján nincs csúcs, vagy a csúcs nem válik szét nagyjából ugyanannál a retenciós idõnél, mint az izopropil-parabének (ajánlott belsõ standard), akkor folytassuk azzal, hogy fecskendezzünk be 10 ì l belsõ standardot tartalmazó minta kivonatot (6.1.2.). Vegyük fel a kromatogramot, és mérjük meg a csúcsmagasságokat. Ha zavaró csúcsot találunk a minta kivonatának kromatogramján ugyanannál a retenciós idõnél, mint az izopropil-parabén, akkor egy másik megfelelõ belsõ standardot kell választani. Ha a vizsgált tartósítószerek egyike hiányzik a kromatogramról, akkor ez a tartósítószer használható fel belsõ standardként. Számítsuk ki a vizsgált tartósítószerek csúcsmagasságainak a belsõ standard csúcsmagasságaihoz viszonyított arányát. Gyõzõdjünk meg arról, hogy kalibrálásnál a felhasznált belsõ standardokra lineáris görbét kaptunk-e. Gyõzõdjünk meg arról, hogy a tartósítószerek standard oldatára és a mintaoldatra kapott kromatogramok kielégítik-e a következõ elvárásokat: A csúcsszétválásánál a leggyengébben szétvált párnak legalább 0,90-nek kell lennie. csúcsszétválás p = f/g

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/53f83b22112ddee3ba432e293c5a4a07160629ad/dokumentumok/1147f0c2e2ee62fd0d72848b53190fba47bc78de/letoltes