Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2005-154 (Year: 2005, Number: 154)
Era: 2004-2010
Section: 2. számú melléklet az 56/2005. (XI. 29.) EüM–KvVM–BM együttes rendelethez
Paragraph Index: 27

1. MÓDSZER Ez a vizsgálati módszer egyenértékû az OECD TG 423 (2001) módszerrel. 1.1. Bevezetés Az itt ismertetett akut toxikus osztály módszer (1) egy lépcsõzetes eljárás, amelyben lépésenként három azonos ivarú állatot használnak. Az elhullási aránytól és/vagy az állatok elhullásközeli állapotától függõen átlagosan 2–4 lépésre lehet szükség a vizsgálandó anyag akut toxicitásának megítéléséhez. Az eljárás reprodukálható, nagyon kevés állatot kell használni hozzá, és hasonló módon lehet vele minõsíteni az anyagokat, mint a többi akut toxicitás vizsgálati módszerrel. Az akut toxikus osztály módszer rögzített dózisokkal végzett biometriai vizsgálatokon (2) (3) (4) (5) alapul, amelyek megfelelõen el vannak választva egymástól, hogy lehetõvé tegyék az anyag besorolási és veszélyfelmérési célokra történõ minõsítését. Az 1996-ban jóváhagyott módszert széles körben validálták a szakirodalomból vett in vivo LD50-adatokkal szemben mind nemzeti (6), mind pedig nemzetközi (8) szinten. Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelelõbb vizsgálati módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (8) található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is tartalmaz a B.1c. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezésével kapcsolatosan. Nincs szükség a vizsgálandó anyagok olyan dózisokban történõ alkalmazására, amelyek korróziós vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullásközeli állapotban lévõ állatokat vagy azokat, amelyek nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutatják, humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy kell figyelembe venni õket az eredmények értelmezésekor, mint azokat az állatokat, amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítõ iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévõ vagy súlyosan szenvedõ állatok exterminálására vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmutatóban (9) találhatók. A módszer elõre meghatározott dózisok alkalmazásán alapul, és a kapott eredmények lehetõvé teszik, hogy az anyagot az akut toxicitást okozó anyagok besorolására szolgáló Vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének egyetemes harmonizált rendszere (GHS) szerint minõsítsük és soroljuk be (10). A módszer elvben nem alkalmas az LD50 pontos kiszámítására, de lehetõvé teszi azoknak az expozíciós tartományoknak a meghatározását, amelyeknél letalitás várható, mivel a fõ végpont ebben a vizsgálatban is az állatok egy részének elhullása. Ez a módszer csak akkor teszi lehetõvé az LD50-érték meghatározását, ha legalább két dózis 0%-nál magasabb, de 100%-nál alacsonyabb elhullási arányt eredményez. A vizsgálandó anyagtól függetlenül az elõre meghatározott dózisok alkalmazása és a kifejezetten a különféle állapotokban megfigyelt állatok számához kötõdõ besorolás növeli a laboratóriumok által készített jelentések egységességét és a vizsgálatok ismételhetõségét. A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése elõtt a vizsgálandó anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal elvégzett in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei; szerkezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai; valamint az anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggyõzõdjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szempontjából, és elõsegíti majd a legmegfelelõbb kezdõdózis kiválasztását. 1.2. Fogalommeghatározások »Akut orális toxicitás«: a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán belül többszöri dózisának szájon át történõ beadását követõen jelentkezõ káros hatások. »Késleltetett elhullás«: egy állat 48 órán belül nem hull el vagy nem tûnik elhullásközeli állapotban lévõnek, de késõbb, a 14 napos megfigyelési idõszak során elpusztul. »Dózis«: a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki. »GHS«: Vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének egyetemes harmonizált rendszere. Az OECD (emberi egészség és környezet), az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakértõi Bizottsága (fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek Közötti Program a Vegyi Anyagok Helyes Kezelésére (IOMC) koordinál. »Közeli elhullás«: amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés idõpontja elõtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az oldalhelyzet, a fekvõhelyzet és a remegés. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)]. 2005/154/II. szám »LD50 (közepes letális orális dózis)«: a vizsgálandó anyag statisztikailag levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50%-ának elhullását okozza. Az LD50-értéket a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki. »Határdózis«: egy, a vizsgálhatóság felsõ határánál lévõ dózis (2000 vagy 5000 mg/kg). »Elhullásközeli állapot«: az esetleges kezelés ellenére is elhullás közelében lévõ állapot vagy túlélésre való képtelenség. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)]. »Megjósolható elhullás«: a kísérlet tervezett vége elõtt, a jövõben egy ismert idõpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)]. 1.3. A vizsgálat elve A vizsgálat alapelve, hogy a lépésenként minimális számú állatot alkalmazó lépcsõzetes eljárás alapján elegendõ információ nyerhetõ a vizsgálandó anyag akut toxicitásáról ahhoz, hogy be lehessen azt sorolni. Az anyagot szájon át és a meghatározott dózisok egyikét alkalmazva adják be a kísérleti állatok egy csoportjának. Az anyagot lépcsõzetes eljárással vizsgálják, ahol minden lépésben három azonos ivarú (általában nõstény) állatot használnak. A kezelt állatokban az anyaggal összefüggõ elhullás vagy annak hiánya határozza meg a következõ lépést, azaz: – nincs szükség további vizsgálatra, – további három állat vizsgálata történik ugyanazzal a dózissal, – további három állat vizsgálata történik a következõ nagyobb vagy kisebb dózissal. A vizsgálati eljárás további részletei az 1. mellékletben találhatók. A módszer alkalmazásával döntést lehet hozni arról, hogy a vizsgálandó anyag a rögzített LD50-határértékek segítségével megállapított toxicitási osztályok melyikébe sorolható be. 1.4. A módszer ismertetése 1.4.1. Az állatfaj kiválasztása A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általában nõstényeket használnak (9). Ennek az az oka, hogy a hagyományos LD50-vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekintése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhetõ különbség, a nõstények általában valamivel érzékenyebbek (11). Azonban ha a szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzékenysége valószínûsíthetõ, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfelelõen meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik. Általánosan használt laboratóriumi törzsekbõl származó egészséges, fiatal felnõtt állatokat kell alkalmazni. Olyan nõstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ±20%-nál többel az esetlegesen korábban kezelt állatok testtömegének átlagától. 1.4.2. Az állatok tartásának és etetésének körülményei A kísérleti állatokat 22 °C (±3 °C) hõmérsékletû helyiségben kell tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30%-nak kell lennie, illetve a takarítás idõtartamától eltekintve lehetõleg ne haladja meg a 70%-ot, a célértéknek 50 és 60% között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségû ivóvíz biztosítása mellett. Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az egy ketrecben lévõ állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az ne zavarja az egyes állatok megfigyelését. 1.4.3. Az állatok elõkészítése Az állatokat véletlenszerûen kell kiválasztani, majd egyedi azonosítóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése elõtt legalább 5 napig a ketrecükben kell tartani õket, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez. 1.4.4. A dózisok elõkészítése A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény koncentrációját változtatják. Ha azonban egy folyékony végterméket vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követõ kockázatértékelés szempontjából megfelelõbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítatlanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes hatóságok ezt írják elõ. A maximálisan beadható dózistérfogatot azonban egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretétõl függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömeg-arányt: vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömeg-arány is megfontolható. A dóziskészítmény formulázása tekintetében – ahol lehet – a vizes oldatok/szuszpenziók/emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos (pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, és harmadsorban esetlegesen más vivõanyagokban elkészített oldatok. A víztõl eltérõ vivõanyagok esetében ismerni kell a vivõanyag toxikológiai tulajdonságait. A dózisokat a beadás 2005/154/II. szám elõtt rövid idõvel kell elkészíteni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készítmény stabilitása az alatt az alkalmazás idõtartama alatt. 1.5. Eljárás 1.5.1. A dózisok beadása A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy megfelelõ intubációs kanülön át történõ táplálással kell beadni. Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkalmazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó idõtartam alatt kisebb részletekben is beadható. A kezelés elõtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A koplaltatási idõszakot követõen meg kell mérni az állatok testtömegét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni – patkány esetében 3–4 órára, egér esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás idõtartamától függõen menet közben szükség lehet arra, hogy az állatoknak táplálékot és vizet adjanak. 1.5.2. Az állatok száma és a dózisok Minden lépésben három állatot kell alkalmazni. A kezdõdózist az 5, 50, 300 és 2000 mg/testtömeg-kg-os négy rögzített dózis közül kell kiválasztani. Azt a dózist kell kezdõdózisként kiválasztani, amelyiknél a legvalószínûbb, hogy a kezelt állatok egy részénél elhullást okoz. Az 1. mellékletben látható folyamatábrák ismertetik az egyes kezdõdózisok esetén követendõ eljárást. A 4. melléklet pedig azzal kapcsolatosan ad iránymutatást, hogy a Vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének egyetemes harmonizált rendszere (GHS) bevezetéséig hogyan kell az EU-rendszer szerint elvégezni a besorolást. Ha a rendelkezésre álló információ alapján a legmagasabb kezdõdózis (2000 mg/testtömeg-kg) valószínûleg nem okoz elhullást, akkor határérték-vizsgálatot kell végezni. Ha a vizsgálandó anyagról nincs információ, állatjóléti okokból a 300 mg/testtömeg-kg-os kezdõdózis alkalmazása javasolt. Az egyes dózisok vizsgálata közötti idõtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének idõpontja, idõtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következõ dózissal történõ kezelését nem szabad megkezdeni mindaddig, amíg meg nem gyõzõdnek arról, hogy az elõzõleg kezelt állatok életben maradnak. Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét szabályozási hatósági követelmények indokolják, megfontolás tárgyává lehet tenni egy további, 5000 mg/kg-os felsõ dózis alkalmazását (lásd a 2. mellékletet). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2000–5000 mg/kg) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószínûsége, hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelenõséggel bírnak az emberi vagy állati egészség vagy a környezet védelme szempontjából. 1.5.3. Határérték-vizsgálat Határérték-vizsgálatot elsõsorban olyan helyzetekben kell végezni, ha a kísérletet végzõnek olyan információi vannak, amelyek szerint a vizsgálandó anyag valószínûleg nem toxikus, azaz csak a hatósági határérték-dózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban információ hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhetõ, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó anyag várhatóan toxikus, a fõ vizsgálatot kell elvégezni. Végezhetõ határérték-vizsgálat egyetlen, 2000 mg/testtömeg-kg-os dózissal, összesen hat (lépésenként háromhárom) állat alkalmazásával. Kivételes esetben végezhetõ határérték-vizsgálat egyetlen, 5000 mg/kg-os dózissal is, amikor összesen három állatot alkalmaznak (lásd a 2. mellékletet). A vizsgálandó anyaggal összefüggõ elhullás esetén szükséges lehet a következõ alacsonyabb dózissal tovább folytatni a vizsgálatokat. 1.6. Megfigyelések Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, legalább az elsõ 30 percben, azután az elsõ 24 órában rendszeres idõközönként, amelynek során különös figyelemmel kell õket kísérni az elsõ 4 órában, majd ezt követõen naponta, összesen 14 napon át, kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálatból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés idõtartamát azonban nem szabad mereven meghatározni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és idõtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megszûnésének idõpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek inkább késleltetve jelentkeznek (12). Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell úgy, hogy minden állat esetében önálló adatsort kell felvenni. Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szükség. Meg kell figyelni a bõr és a szõrzet, a szemek és a nyálkahártyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma elõfordulására is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alapelveket és követelményeket is figyelembe kell venni (9). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lévõ álla- 2005/154/II. szám tokat, illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehetõ legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás idõpontját is. 1.6.1. Testtömeg Röviddel a vizsgálandó anyag beadása elõtt és legalább egy héttel utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtömeg-változást ki kell számítani, és rögzíteni kell. A vizsgálat végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd humánus módon exterminálni kell õket. 1.6.2. Kórbonctani vizsgálat Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni (azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden egyes állat esetében minden makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegyezni. A kezdõdózis beadása után legalább 24 óráig túlélõ állatok esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos információk nyerhetõk.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/531ab852c9c8e6fbf551815ecfee8739e812b126/dokumentumok/ee337623f7c24e3a6c53e0c5b26de1b66206f086/letoltes