Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2005-154 (Year: 2005, Number: 154)
Era: 2004-2010
Section: 8. számú melléklet az 56/2005. (XI. 29.) EüM–KvVM–BM együttes rendelethez
Paragraph Index: 239

(1) hivatkozásban. E módszert úgy dolgozták ki, hogy annak megfelelõ kiigazításával egy vegyület egyedi kórszövettani és viselkedési neurotoxicitásának igazolására vonatkozó sajátos elvárásoknak is megfeleljen, és tegye lehetõvé a neurotoxikus válaszok jellemzését és számszerûsítését. A neurotoxicitást korábban azonosnak tekintették az idegbántalmakkal (neuropátia), beleértve az idegkórtani bántalmakat vagy idegmûködési zavarokat, így például rohamokat, bénulást vagy remegést. Bár az idegbántalmak a neurotoxicitás fontos megnyilvánulási formáit jelentik, ma már világos, hogy az idegrendszeri toxicitásnak számos olyan jele van (pl. a mozgáskoordináció csökkenése, érzékelési zavarok, tanulási és memóriazavarok), amelyek neuropátiás vagy más típusú vizsgálatokban esetleg nem jelennek meg. E neurotoxicitási vizsgálati módszert úgy alakították ki, hogy alkalmas legyen a jelentõsebb viselkedés-neurológiai és idegkórtani hatások felnõtt rágcsálókban történõ kimutatására. Bár a viselkedésbeli hatások még morfológiai változások hiányában is tükrözhetik az élõ szervezetekre gyakorolt káros hatásokat, nem minden viselkedésbeli változás specifikus az idegrendszerre. Így tehát minden megfigyelt változást az ezzel összefüggõ kórszövettani, hematológiai vagy biokémiai adatokkal, valamint egyéb típusú szisztémás toxicitásra vonatkozó adatokkal összefüggésben kell értékelni. Az e módszerrel végzett és a neurotoxikus válaszok jellemzését, valamint számszerûsítését célzó vizsgálat specifikus kórszövettani és viselkedésvizsgálati eljárásokat is magában foglal, amelyek további elektrofiziológiai és/vagy biokémiai vizsgálatokkal is alátámaszthatók (1) (2) (3) (4). A neurotoxikus anyagok egy sor célpontra hathatnak az idegrendszeren belül, és hatásmechanizmusuk is igen sokféle lehet. Mivel nem létezik egyetlen olyan vizsgálatsorozat sem, amelynek segítségével az összes anyag esetében meghatározható lenne a neurotoxikus potenciál, szükség lehet más, a megfigyelt vagy várt neurotoxicitás típusára specifikus in vivo vagy in vitro vizsgálatokra is. Ez a vizsgálati módszer arra is felhasználható, hogy az OECD Neurotoxicitási Vizsgálati Stratégiák és Módszerek Útmutatójában (1) megfogalmazott iránymutatással összefüggésben olyan vizsgálatokat is lehessen általa tervezni, amelyek célja, hogy általuk tovább lehessen jellemezni vagy növelni a dózis-válasz összefüggés számszerû meghatározásának érzékenységét annak érdekében, hogy jobban meg lehessen becsülni a nem észlelhetõ káros hatás szintjét, vagy igazolható legyen a vegyület ismert vagy feltételezett veszélyessége. Olyan vizsgálatok is tervezhetõk például, amelyek segítségével meghatározható(k) vagy értékelhetõ(k) a neurotoxicitási mechanizmus(ok), vagy kiegészíthetõk a rendelkezésre álló, alap viselkedés-neurológiai és neuropathológiai megfigyelési eljárások alkalmazásával kapott adatok. Az ilyen vizsgálatok esetében nem szükséges olyan adatok gyûjtését megismételni, amelyeket az e módszernél ajánlott stan- 2005/154/II. szám dard eljárások alkalmazásával kapnának meg, ha az ilyen adatok már rendelkezésre állnak, és azokat nem tartják szükségesnek a vizsgálat eredményeinek értelmezéséhez. Ez a neurotoxicitási vizsgálat – akár önállóan, akár más vizsgálatokhoz kapcsolódva végzik – olyan információkat szolgáltat, amelyek: – meghatározhatják, hogy a vizsgálandó vegyület tartós vagy visszafordítható hatásokat gyakorolt-e az idegrendszerre; – hozzájárulhatnak a kémiai vegyülettel történõ expozícióval járó idegrendszeri elváltozások jellemzéséhez, illetve az ezek hátterében álló mechanizmusok megismeréséhez; – meghatározhatják a dózis- és idõ-válasz összefüggéseket a nem észlelhetõ káros hatás szint becsléséhez (amelyet a vegyület biztonsági kritériumainak megállapításához lehet felhasználni). Ennél a vizsgálati módszernél a vizsgálandó anyagot orálisan adagolják. Más (pl. a dermális vagy inhalálásos) beadási módok esetenként megfelelõbbek lehetnek, amelyek használata esetén szükség lehet a javasolt eljárások módosítására is. A beadási mód kiválasztásával kapcsolatos megfontolások a humán expozíciós profiltól és a rendelkezésre álló toxikológiai és kinetikai adatoktól függenek. 1.2. Fogalommeghatározások »Káros hatás«: a normálhoz viszonyított bármilyen, a kezelés okozta elváltozás, amely csökkenti az élõ szervezet túlélésre, szaporodásra vagy környezethez való alkalmazkodásra való képességét. »Dózis«: a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist tömegegységben (g, mg), vagy a vizsgálandó anyag tömegének és a vizsgált állat tömegegységének hányadosában (pl. mg/kg), vagy a táplálékban lévõ állandó koncentrációban (ppm) fejezik ki. »Adagolás«: általános meghatározás, amely a dózist, valamint az adagolás gyakoriságát és idõtartamát foglalja magában. »Neurotoxicitás«: az idegrendszer szerkezetét vagy mûködését érintõ káros elváltozás, amelyet egy kémiai, biológiai vagy fizikai ágens jelentette expozíció idéz elõ. »Neurotoxikus anyag«: bármilyen kémiai, biológiai vagy fizikai ágens, amely neurotoxicitást tud okozni. »NOAEL«: a nem észlelhetõ káros hatás szintjének (no-observed-adverse effect level) rövidítése, amely azt a legmagasabb dózisszintet jelöli, amelynél nem figyelhetõk meg kezeléssel összefüggõ káros hatások. 1.3. A vizsgálati módszer elve A vizsgálandó vegyületet egy dózistartományon belül több dózisban adagolják orálisan laboratóriumi rágcsálók több csoportjának. Általában ismételt dózisokat kell alkalmazni, és az adagolási rend lehet 28 napos, szubkrónikus (90 napos) vagy krónikus (1 éves vagy annál hosszabb). Az ebben a vizsgálati módszerben leírt eljárások akut neurotoxicitási vizsgálatokhoz is felhasználhatók. Az állatokat olyan módon vizsgálják, hogy lehetõség legyen a viselkedési és/vagy neurológiai rendellenességek észlelésére vagy jellemzésére. Minden megfigyelési idõszakban egy sor olyan viselkedést vizsgálnak meg, amelyre hatással lehetnek a neurotoxikus anyagok. A vizsgálat végén az összes csoportból és mindkét nembõl kiválasztanak néhány állatot, amelyeknél in situ perfúziót végeznek, és amelyekbõl agyi, gerincvelõi és perifériás idegi metszeteket készítenek és vizsgálnak meg. Ha a vizsgálatot a neurotoxikus hatások megállapítását vagy jellemzését célzó önálló vizsgálatként végzik, a csoportokba tartozó, perfúzióra és ezt követõ kórszövettani vizsgálatokra (lásd 1. táblázat) fel nem használt állatokat olyan specifikus viselkedés-neurológiai, neuropathológiai, neurokémiai vagy elektrofiziológiai eljárásokhoz lehet felhasználni, amelyek kiegészíthetik az e módszer szerint szükséges standard vizsgálatokkal kapott adatokat (1). E kiegészítõ eljárások különösen akkor lehetnek hasznosak, ha empirikus megfigyelések vagy várható hatások a vegyület specifikus típusú vagy specifikus célterületre irányuló neurotoxicitását jelzik. Más esetben a fennmaradó állatok egyéb értékelések, így például a rágcsálókban végzett ismételt dózisú toxicitási vizsgálati módszerekben elõírtak céljára alkalmazhatók. Ha e vizsgálati módszer eljárásait más vizsgálati módszerek eljárásaival kombinálják, kellõ számú állatra van szükség ahhoz, hogy mindkét vizsgálat megfigyelési igényei kielégíthetõk legyenek. 1.4. A vizsgálati módszer ismertetése 1.4.1. Az állatfaj kiválasztása A preferált rágcsálófaj a patkány, bár megfelelõ indoklás esetén más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általánosan használt laboratóriumi törzsekbõl származó egészséges, fiatal felnõtt állatokat kell alkalmazni. Olyan nõstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek és nem vemhesek. Az adagolást általában az elválasztás után a lehetõ leghamarabb meg kell kezdeni, lehetõleg még az állatok hathetes koráig, de mindenképpen az elõtt, hogy elérnék a kilenchetes kort. Azonban ha a vizsgálatot más vizsgálatokkal kombinálják, a korra vonatkozó követelményeket esetleg ennek megfelelõn módosítani kell. A vizsgálat kezdetén az alkalmazott állatok közötti testtömeg-eltérés nem haladhatja meg az egyes ivarok átlagának ± 20%-át. Ha egy hosszú távú vizsgálat elõtt elõzetes vizsgálatként rövid idõtartamú ismételt dózisú vizsgálatot végeznek, mindkét vizsgálatban azonos törzsbõl és forrásból származó állatokat kell használni. 2005/154/II. szám 1.4.2. Az állatok tartásának és etetésének körülményei A kísérleti helyiség hõmérsékletének 22 °C (± 3 °C)-nak kell lennie. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30%-nak kell lennie, illetve a takarítás idõtartamától eltekintve lehetõleg ne haladja meg a 70%-ot, a javasolt átlagértéknek 50 és 60% között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Minimálisra kell csökkenteni az idõszakosan jelentkezõ erõs zajokat. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségû ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását az is befolyásolhatja, hogy ha a vizsgálandó anyagot táplálékkal adják be, akkor az megfelelõen keveredjen el az élelemmel. Az állatokat tarthatjuk egyedileg vagy azonos ivarú egyedekbõl álló kisebb csoportokban is. 1.4.3. Az állatok elõkészítése Az egészséges fiatal állatokat véletlenszerûen kell beosztani a kezelt és kontrollcsoportokba. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. Az állatokat egyedi azonosítóval kell ellátni, és a vizsgálat megkezdése elõtt legalább öt (5) napig a ketrecükben kell õket tartani, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez. 1.4.4. A beadási mód és a dózisok elõkészítése Ez a vizsgálati módszer konkrétan elõírja a vizsgálandó anyag orális alkalmazását, amely történhet szondán keresztül, táplálék vagy ivóvíz útján vagy kapszulák beadásával. Más beadási módok (pl. dermális vagy inhalálásos) is használhatók, de emiatt esetleg módosítani kell az ajánlott eljárásokat. A beadási mód megválasztása függ a humán expozíciós profiltól és a rendelkezésre álló toxikológiai vagy kinetikai információktól. A beadási mód megválasztását meg kell indokolni, továbbá meg kell jelölni az ebben a vizsgálati módszerben elõírt eljárások emiatt szükségessé vált módosításait is. Ha szükséges, a vizsgálandó anyagot megfelelõ vivõanyagban fel lehet oldani vagy szuszpendálni. Elsõsorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy szuszpenziót, és csak harmadsorban más vivõanyagokban elkészített oldatot vagy szuszpenziót. Ismerni kell a vivõanyag toxikus jellemzõit. Emellett a vivõanyag következõ jellemzõit kell figyelembe venni: a vizsgálandó anyag felszívódására, eloszlására, metabolizmusára és visszatartására gyakorolt hatások; a vizsgálandó anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemzõit; valamint az állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. 1.5. Eljárások 1.5.1. Az állatok száma és ivara Ha a vizsgálatot önálló vizsgálatként végzik, legalább 20 állatot (10 nõstényt és 10 hímet) kell alkalmazni minden egyes dózis- és kontrollcsoportban a részletes klinikai és funkcionális megfigyelések értékeléséhez. A 10 hím és 10 nõstény közül a vizsgálat végén legalább öt hímet és öt nõstényt kell kiválasztani az in situ perfúzióhoz és a részletes ideg-kórszövettani vizsgálatokhoz. Ha az adott dóziscsoportban csak korlátozott számú állatnál lehet megfigyelni neurotoxikus hatásokat, fontolóra kell venni ezeknek az állatoknak is a perfúzióra kijelöltek közé való felvételét. Ha a vizsgálatot egy ismételt dózisú toxicitási vizsgálattal egybekötve végzik, kellõ számú állatot kell felhasználni ahhoz, hogy mindkét vizsgálat célkitûzéseit meg tudják valósítani. A vizsgálatok különbözõ kombinációi esetén szükséges minimális csoportméreteket az 1. táblázat tartalmazza. Ha idõközi exterminációkat vagy a toxikus hatások visszafordíthatóságának, tartósságának vagy kezelés utáni késleltetett megjelenésének megfigyelésére gyógyulási csoportokat vagy kiegészítõ megfigyeléseket is terveznek, a kísérleti állatok számát úgy kell növelni, hogy elegendõ számú állatot biztosíthassanak a megfigyelésekhez és kórszövettani vizsgálatokhoz. 1.5.2. A kezelt és kontrollcsoportok Általában legalább három dóziscsoportot és egy kontrollcsoportot kell alkalmazni, de ha más adatok áttekintése alapján 1000 mg/testtömeg-kg/nap ismételt dózis alkalmazásakor sem várhatók hatások, akkor lehet határérték-vizsgálatot is végezni. Ha nincs megfelelõ adat erre nézve, akkor tartománybehatároló vizsgálat is végezhetõ az alkalmazandó dózisok meghatározásának elõsegítésére. Attól eltekintve, hogy a vizsgálandó anyagot nem alkalmazzák, a kontrollcsoportokban lévõ állatokat ugyanúgy kell kezelni, mint a kezelt csoportokban lévõket. Ha a vizsgálandó anyag beadásához vivõanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportnak a legnagyobb alkalmazott térfogatban kell beadni a vivõanyagot. 1.5.3. A megbízhatóság ellenõrzése A vizsgálatot végzõ laboratóriumnak adatokkal kell igazolnia, hogy el tudja végezni a vizsgálatot, illetve hogy az alkalmazott eljárások megfelelõ érzékenységûek. Az ilyen adatoknak bizonyítékkal kell szolgálniuk a megfigyelésre javasolt különféle végpontok, így például az autonóm tünetek, a szenzoros reaktivitás, a végtagok fogóereje, valamint a motoros aktivitás változásainak detektálására és adott esetben számszerûsítésére való képességet. A különbözõ típusú neurotoxicitás válaszokat kiváltó és pozitív kontrollként alkalmazható vegyületekkel kapcsolatos információk a (2) és a (9) hivatkozásban találhatók. Ha a kísérleti eljárások lényeges vonásai nem változnak, akkor korábbi adatok is felhasználhatók. Javasolt a korábbi adatok idõszakos felfrissítése. Az eljárások érzékenységének fennmaradását igazoló új adatokra akkor van szükség, ha a vizsgálat vagy az eljárások valamely lényegi elemét a vizsgálatot végzõ laboratórium megváltoztatta. 2005/154/II. szám 1.5.4. A dózisok kiválasztása A dózisszinteket a vizsgálandó vegyülettel vagy rokon anyagokkal kapcsolatban esetlegesen rendelkezésre álló korábbi toxicitási és kinetikai adatok figyelembevételével kell meghatározni. A legnagyobb dózist azt a célt szem elõtt tartva kell megválasztani, hogy a neurotoxikus hatásokat vagy egyértelmû szisztémás toxikus hatásokat váltson ki. Ezt követõen úgy kell csökkenõ sorrendben kiválasztani a kisebb dózisokat, hogy meg lehessen határozni a dózissal összefüggõ válaszokat, illetve a legkisebb dózisnál a nem észlelhetõ káros hatás szintjét (NOAEL). A dózisszinteket elvben úgy kell beállítani, hogy meg lehessen különböztetni az idegrendszerre gyakorolt elsõdleges toxikus hatásokat a szisztémás toxicitással összefüggõ hatásoktól. Gyakran optimális a két-három intervallum alkalmazása, és nagyon nagy intervallumok (pl. 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazása esetén gyakran elõnyös a dózisok közé egy negyedik vizsgálati csoportot is beiktatni. Ha létezik a humán expozícióra vonatkozóan elfogadható becslés, akkor ezt is figyelembe kell venni. 1.5.5. Határérték-vizsgálat Ha egy egyetlen, legalább 1000 mg/testtömeg-kg/nap dózis alkalmazásával történõ, az itt ismertetett eljárások szerint elvégzett vizsgálat nem idéz elõ észlelhetõ neurotoxicitást és ha a szerkezetileg és/vagy metabolizmus szempontjából rokon vegyületekkel kapcsolatos adatok alapján nem várható toxicitás, a három dózisszint alkalmazásával történõ teljes vizsgálatot esetenként szükségtelen elvégezni. A várható humán expozíció nagyobb orális dózis alkalmazását teszi esetenként szükségessé a határérték-vizsgálatban. Más típusú beadási módok, így például inhalálás vagy dermális alkalmazás esetén a vizsgálandó anyag fizikai-kémiai tulajdonságai gyakran elõre jelezhetik a lehetséges expozíciós szint maximumát. Akut orális vizsgálat elvégzéséhez a határérték-vizsgálat során alkalmazott dózisnak legalább 2000 mg/kg-nak kell lennie. 1.5.6. A dózisok beadása A vizsgálandó anyag dózisait legalább 28 napon át naponta, azaz heti hét napon át kell adagolni az állatoknak; ötnapos adagolási rend vagy rövidebb expozíciós idõszak alkalmazását megfelelõen indokolni kell. Ha a vizsgálandó anyagot szondán át adagolják, a dózist lehetõleg egyszerre kell egy gyomorszondán vagy megfelelõ intubációs kanülön át beadni az állatnak. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadék adható be, a kísérleti állatok méretétõl függ. A térfogat nem lehet 1 ml/100 g testtömeg-aránynál nagyobb. Vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömeg-arány is alkalmazható. Az irritáló vagy korróziós hatású anyagok kivételével, amelyek esetében a magasabb koncentrációk általában súlyosabb hatásokat okoznak, minimálisra kell csökkenteni a térfogatbeli eltéréseket, amihez a koncentrációt kell úgy beállítani, hogy minden dózisszinten állandó térfogatot lehessen biztosítani. A táplálékkal vagy ivóvízzel bejuttatott anyagok esetében fontos, hogy a vizsgálandó anyag mennyisége ne zavarja a normál táplálkozást vagy vízháztartást. Ha a vizsgálandó anyagot a táplálékkal juttatják be, vagy a táplálékbeli koncentrációt (ppm), vagy pedig az állat testtömegére számított dózist kell állandó értéken tartani, és meg kell adni, hogy melyik alternatívát alkalmazzák. A szondával bejuttatott anyagok esetében a dózist mindig a nap hasonló idõszakában kell beadni, és szükség szerint újra és újra be kell állítani ahhoz, hogy az állat testtömegéhez viszonyítva állandó értéken lehessen tartani a dózist. Ha egy hosszú távú vizsgálat elõtt elõzetes vizsgálatként ismételt dózisú vizsgálatot végeznek, mindkét vizsgálatban hasonló takarmányt kell alkalmazni. Akut vizsgálatok esetén ha a dózist nem lehet egyszerre bejuttatni, akkor egy legfeljebb 24 órás idõtartam alatt részletekben is beadható. 1.6. Megfigyelések 1.6.1. A megfigyelések és vizsgálatok gyakorisága Ismételt dózisú vizsgálatok esetében a megfigyelési idõszaknak az egész kezelési idõszakot le kell fednie. Akut vizsgálatok esetében a kezelés után 14 napig kell még megfigyeléseket végezni. A mellékcsoportokba tartozó és a kezelés utáni idõszakban expozíció nélkül tartott állatok esetében a megfigyeléseknek ezt az idõszakot is le kell fedniük. A megfigyeléseket kellõ gyakorisággal kell végezni, hogy az esetleges viselkedési és/vagy neurológiai rendellenességek észlelésének valószínûsége a lehetõ legnagyobb legyen. A megfigyeléseket lehetõleg mindig a nap azonos szakában kell végezni, és ehhez figyelembe kell venni azt is, hogy a várt hatások a dózis beadása után mikor érik el a maximumukat. A klinikai megfigyelések és funkcionális vizsgálatok gyakoriságát a 2. táblázatban foglaltuk össze. Ha a kinetikai adatok vagy más, korábbi vizsgálatokban kapott adatok szerint más idõpontokat kellene alkalmazni a megfigyelésekhez, vizsgálatokhoz vagy megfigyelések utáni idõszakokhoz, alternatív kísérleti programot kell követni a kinyerhetõ információk maximalizálása érdekében. A kísérleti program ilyen jellegû módosításait meg is kell indokolni. 1.6.1.1. Az általános egészségi állapot és a megbetegedések/elhullások megfigyelése Az állatok egészségi állapotát legalább naponta egyszer, a megbetegedéseket és elhullásokat pedig naponta kétszer gondosan meg kell figyelni. 1.6.1.2. Részletes klinikai megfigyelések Az elsõ expozíciót megelõzõen egy alkalommal (az egyeden belüli összehasonlításokhoz), majd ezt követõen a vizsgálat teljes idõtartamától függõen különbözõ idõközönként (lásd 2. táblázat) részletes klinikai megfigyeléseket kell végezni az erre a célra kiválasztott összes állaton (lásd 1. táblázat). A gyógyulási mellékcsoportok részletes klinikai megfi- 2005/154/II. szám gyeléseit a gyógyulási idõszak végén kell elvégezni. A részletes klinikai megfigyeléseket a ketrecen kívül, egy standard porondon kell végezni. Az észleléseket egy olyan pontozási rendszer segítségével kell gondosan felvenni, amely a megfigyelés során végzett minden egyes mérés esetében kritériumokat vagy pontozási skálákat is magában foglal. A vizsgáló laboratóriumnak világosan meg kell határoznia az alkalmazott kritériumokat vagy skálákat. Törekedni kell arra, hogy minimálisak legyenek a kísérleti körülmények közötti (a kezeléssel szisztematikusan nem összefüggõ) eltérések, és hogy a megfigyeléseket az aktuális kezelést nem ismerõ, képzett megfigyelõk végezzék. A megfigyeléseket ajánlatos megtervezetten végezni, amelynek során minden állatra vonatkozóan és minden megfigyelési idõpontban világosan meghatározott (a normál »tartomány« meghatározását is magában foglaló) kritériumokat kell szisztematikusan alkalmazni. A »normál tartományt« megfelelõen dokumentálni kell. Minden megfigyelt tünetet fel kell jegyezni. Ha megoldható, a megfigyelt tünetek erõsségét is fel kell jegyezni. A klinikai megfigyelések többek között a bõr, a szõrzet, a szemek, a nyálkahártyák változásaira, szekrétumok és exkrétumok, valamint az autonóm aktivitás megjelenésére (pl. könnyezés, szõrmeredezés, pupillaméret, szokatlan légzési mintázat és/vagy szájon át történõ légzés, szokatlan vizelés vagy székletürítés és elszínezõdött vizelet) irányulnak. Rögzíteni kell továbbá a testhelyzettel, aktivitási szinttel (pl. a standard porond csökkent vagy fokozott felderítése) és a mozgáskoordinációval kapcsolatos összes szokatlan választ is. A járás (pl. kacsázás, ataxia), a testtartás (pl. púpos tartás) és a megfogás, elhelyezés vagy más környezeti ingerekkel szembeni reaktivitás megváltozását, valamint a rángásos vagy görcsös mozgásokat, görcsös vonaglásokat vagy remegéseket, sztereotípiákat (pl. túlzott tisztálkodást, szokatlan fejmozgásokat, ismétlõdõ körbejárást) vagy bizarr viselkedést (pl. harapást vagy túlzott nyalogatást, öncsonkítást, hátrafelé menést, hangadást) vagy agressziót is fel kell jegyezni. 1.6.1.3. Funkcionális vizsgálatok A részletes klinikai megfigyelésekhez hasonlóan az expozíció elõtt, majd azt követõen rendszeres idõközönként funkcionális vizsgálatokat is kell végezni az erre kiválasztott összes állaton (lásd 1. táblázat). A funkcionális vizsgálatok gyakorisága is a teljes vizsgálat idõtartamától függ (lásd 2. táblázat). A 2. táblázatban megadott megfigyelési idõszakok mellett az extermináláshoz a lehetõ legközelebbi idõpontban a gyógyulási mellékcsoportokban is funkcionális vizsgálatokat kell végezni. A funkcionális vizsgálatok során meg kell figyelni a különféle [pl. hallási, látási és proprioceptív (5) (6) (7)] ingerekre adott szenzoros reaktivitást, és el kell végezni a végtagok fogóerejének (8), valamint a motoros aktivitásnak a vizsgálatát (9). A motoros aktivitást olyan automata berendezéssel kell mérni, amely az aktivitáscsökkenés és az aktivitásnövekedés kimutatására is képes. Ha egy másik meghatározott rendszert alkalmaznak, akkor annak kvantitatívnak kell lennie, és igazolni kell annak érzékenységét és megbízhatóságát is. Minden berendezés esetében ellenõrizni kell, hogy idõben megbízhatóan, illetve az egyes berendezések egymáshoz képest konzisztensen mûködnek-e. A követendõ eljárásokkal kapcsolatban a további részletek a vonatkozó hivatkozásokban találhatók. Ha nincsenek olyan adatok (pl. szerkezet-aktivitási, epidemiológiai adatok vagy más toxikológiai vizsgálati adatok), amelyek potenciális neurotoxikus hatásokat jeleznének, fontolóra kell venni specializáltabb vizsgálatok végzését a szenzoros és motoros mûködés vagy a tanulás és a memória tanulmányozására, e lehetséges hatások részletesebb vizsgálata érdekében. A specializáltabb vizsgálatokkal és alkalmazásukkal kapcsolatban további információk az (1) hivatkozásban találhatók. Kivételes esetben ki lehet hagyni a funkcionális vizsgálatból azokat az állatokat, amelyeknél a toxicitás jelei olyan mérvûek, hogy már zavarják az adott vizsgálatot. Meg kell indokolni, amennyiben az ilyen állatokat kizárják valamely funkcionális vizsgálatból. 1.6.2. Testtömeg és táplálék/vízfogyasztás A legfeljebb 90 napig tartó vizsgálatok esetében minden állat testtömegét legalább hetente egyszer meg kell mérni, továbbá legalább hetente a táplálékfogyasztást is ellenõrizni kell (illetve, ha a vizsgálandó anyagot az ivóvízzel adják be, akkor annak fogyasztását is). A hosszú távú vizsgálatok esetében az állatok testtömegét az elsõ 13 hét során legalább hetente egyszer, majd azt követõen legalább négyhetente meg kell mérni. Az elsõ 13 hét során a táplálékfogyasztást (illetve, ha a vizsgálandó anyagot az ivóvízzel adjuk be, akkor annak fogyasztását is) legalább hetente, majd azt követõen körülbelül háromhavonta kell megmérni, kivéve, ha az egészségi állapot változásai vagy testtömeg-változások azt másképp szabják meg. 1.6.3. Szemészeti vizsgálatok A 28 napnál hosszabb vizsgálatok esetében lehetõleg minden állaton, de legalább a nagy dózissal kezelt és a kontrollcsoportokba tartozó állatokon a vizsgálandó anyag adagolásának megkezdése elõtt, illetve a vizsgálat legvégén szemtükör vagy ezzel egyenértékû és megfelelõ eszköz alkalmazásával szemészeti vizsgálatokat kell végezni. Ha szemelváltozást tapasztalnak, vagy ha a klinikai tünetek alapján ez szükségesnek látszik, minden állatot meg kell vizsgálni. A hosszú távú vizsgálatok esetében a 13. héten is szemészeti vizsgálatot kell végezni. Nem kell szemészeti vizsgálatot végezni, ha ilyen adatok más, hasonló idõtartamú és hasonló dózisszintek mellett történõ vizsgálatokból már rendelkezésre állnak. 2005/154/II. szám 1.6.4. Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok Ha a neurotoxicitási vizsgálatot ismételt dózisú szisztémás toxicitási vizsgálattal kombinálva végzik, a szisztémás toxicitási vizsgálat vonatkozó módszerében elõírtaknak megfelelõen hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatokat is végezni kell. A mintavételt úgy kell végrehajtani, hogy minimális legyen a potenciális viselkedés-neurológiai hatások kockázata. 1.6.5. Kórszövettani vizsgálatok A neuropathológiai (idegkórtani) vizsgálatot úgy kell megtervezni, hogy egészítse ki és bõvítse a vizsgálat in vivo fázisában tett megfigyeléseket. Ivaronként és csoportonként legalább 5 állatból (lásd az 1. táblázatot és a következõ bekezdést) szövetmintát kell venni, amelyet azután általánosan elfogadott perfúziós és fixálási technikák alkalmazásával in situ fixálni kell [lásd a (3) hivatkozás 5. fejezetét és a (4) hivatkozás 50. fejezetét]. Minden makroszkóposan megfigyelhetõ változást fel kell jegyezni. Amennyiben a vizsgálatot önálló vizsgálatként végzik el a neurotoxicitás szûrése vagy a neurotoxikus hatások jellemzése céljából, a többi állat vagy specifikus viselkedés-neurológiai (10) (11), neuropathológiai (10) (11) (12) (13), neurokémiai (10) (11) (14) (15) vagy elektrofiziológiai (10) (11) (16) (17) eljárásokhoz használható fel, amelyek kiegészíthetik az itt ismertetett eljárásokat és vizsgálatokat, vagy növelhetik a kórszövettani vizsgálatok alanyainak számát. E kiegészítõ eljárások különösen akkor lehetnek hasznosak, ha empirikus megfigyelések vagy a várható hatások specifikus típusú vagy specifikus célterületre irányuló neurotoxicitást jeleznek (2) (3). Más esetben a fennmaradó állatok az ismételt dózisú toxicitási vizsgálati módszerben leírt rutin patológiai értékelésekhez is felhasználhatók. A paraffinba ágyazott mintákat megszokott festési eljárással, például hematoxilin-eozin festékkel (H&E) kell megfesteni, és mikroszkópos vizsgálatokat kell végezni. Perifériás neuropátiák megfigyelése vagy gyanúja esetén mûanyagba ágyazott perifériás idegszövetmintákat is vizsgálni kell. Egyes klinikai tünetek további helyek vizsgálatát vagy speciális festési eljárások alkalmazását tehetik szükségessé. A további vizsgálati helyekkel kapcsolatban útmutatás a (3) és (4) hivatkozásban található. Hasznos lehet továbbá, ha speciális festéseket alkalmaznak konkrét patológiai változások kimutatásához (18). A központi és a perifériás idegrendszerbõl származó reprezentatív metszeteket szövettani vizsgálatoknak kell alávetni [lásd a (3) hivatkozás 5. fejezetét és a (4) hivatkozás 50. fejezetét]. A vizsgált területek általában a következõk: az elõagy, a nagyagy központi része, ezen belül a hippokampuszt keresztmetszet, a középagy, a kisagy, a híd, a nyúltvelõ, a szem a látóideggel és a retinával együtt, a gerincvelõ a nyaki és ágyéki duzzanatnál, a dorzális ideggyökér-ganglionok, a dorzális és ventrális ideggyökérrostok, a proximális ülõideg, a proximális sípcsonti ideg (a térdnél) és a sípcsonti ideg lábikraizom-ágai. A gerincvelõbõl és a perifériás idegekbõl készített metszeteknek mind keresztirányú vagy haránt-, mind hosszanti metszeteket tartalmazniuk kel. Figyelmet kell szentelni az idegrendszer érhálózatának is. Meg kell vizsgálni egy vázizommintát is, különösen a lábikraizomét. Különös figyelmet kell fordítani a központi és perifériás idegrendszernek azokra a sejtes és rostos struktúrájú és mintázatú területeire, amelyekre különösen hatást gyakorolnak a neurotoxikus anyagok. A toxikus anyag által tipikusan elõidézett neuropathológiai elváltozásokkal kapcsolatban a (3) és a (4) hivatkozásban található útmutatás. Ajánlatos a szövetmintákat lépcsõzetesen megvizsgálni, ami azt jelenti, hogy elõször a nagy dózissal kezelt csoportokból származó metszeteket hasonlítjuk össze a kontrollcsoportból származókkal. Ha az ezekbõl a csoportokból származó mintákban nem láthatók neuropathológiai elváltozások, nincs szükség további vizsgálatra. Ha azonban neuropathológiai elváltozásokat észlelnek a nagy dózissal kezelt csoportokban, a köztes és kis dózisú csoportokból származó, potenciálisan érintett szövetekbõl készített mintákat is kóddal kell ellátni, majd egymás után meg kell vizsgálni õket. Ha a kvalitatív vizsgálatok során bizonyítékot találnak valamilyen neuropathológiai elváltozásra, akkor az ilyen elváltozást mutató idegrendszeri területeken egy második vizsgálatot is el kell végezni. Az összes dóziscsoportban minden potenciálisan érintett területrõl metszeteket kell készíteni, amelyeket véletlenszerûen kódokkal kell ellátni, és a kód ismeretének hiányában ugyancsak véletlenszerûen kell õket megvizsgálni. Minden lézió esetében fel kell jegyezni azok gyakoriságát és súlyosságát. Miután minden dóziscsoportban kiértékelték az összes területet, vissza lehet fejteni a kódot, és a dózis-válasz összefüggések megállapítása érdekében statisztikai elemzést lehet végezni. Ismertetni kell az egyes léziók súlyosságának fokozatait. A neuropathológiai leleteket a viselkedési megfigyelésekkel és mérésekkel, továbbá a korábbi és párhuzamosan végzett szisztémás toxicitási vizsgálatokból származó adatokkal összefüggésben kell értékelni.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/26d18afd3335f9e39211d188f5f0154594a09258/dokumentumok/0a7c03030150447d3a33f0c38728a9fa2952eaf3/letoltes