Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2003-42 (Year: 2003, Number: 42)
Era: 1990-2004
Section: 10. számú melléklet a 44/2003. (IV. 26.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 1854

5. Eljárás Megjegyzés: A-vitamin érzékeny a (UV) fényre és oxidációra. Valamennyi mûveletet fény (sötét üvegedényt, vagy alufóliával bevont üvegedényt használjunk) és oxigén (nitrogén gáz átáramoltatása) kizárása mellett végezzük. Az extrakció ideje alatt a folyadék feletti levegõt nitrogénnel kell eltávolítani (a túlnyomás elkerülése érdekében lazítsuk meg idõnként a dugót). 5.1. A minta elõkészítése Õröljük meg a mintát úgy, hogy az áthulljon az 1 mm-es lyukbõségû szitán, ügyelve arra, hogy ezalatt a minta ne melegedhessen fel. Az õrlést közvetlenül a minta bemérése és szappanosítása elõtt végezzük, máskülönben A-vitamin veszteség lehet. 5.2. Szappanosítás A minta A-vitamin tartalmától függõen mérjünk 0,01 g pontossággal 2–25 g-ot 500 ml-es sima aljú, vagy kónikus lombikba (4.2.1.). Adjunk hozzá egymást követõen, a lombik forgatása közben, 130 ml etanolt (3.1.), megközelítõen mg BHT-t (3.13), ml nátriumaszkorbát oldatot (3.5.) és 2 ml nátriumszulfid oldatot (3.6.). Helyezzük a hûtõt (4.3.) a lombikra, és merítsük a lombikot a mágneskeverõvel felszerelt vízfürdõbe (4.7.). Kevertessük és melegítsük forrásig, és forraljuk úgy, hogy az oldószer visszacsepegjen, 5 percig. Majd a hûtõn (4.3.) keresztül adjunk hozzá 25 ml káliumhidroxid oldatot (3.4.) és lassú nitrogén áramoltatás mellett melegítsük további 25 percig, hogy úgy forrjon, hogy a hûtõbõl az oldószer (refluxáljon) visszacsepegjen. Ezután öblítsük a hûtõt 20 ml körüli vízzel, és hûtsük a lombik tartalmát szobahõmérsékletûre. 5.3. Extrahálás Tegyük a szappanosítás utáni anyagot veszteség nélkül, összesen 250 ml vízzel átöblítve, 1000 mles választótölcsérbe (4.2.3.) vagy az extraháló készülékbe (4.8.). Öblítsük a szappanosításhoz használt lombikot egymást követõen 25 ml etanollal (3.1.) és 100 ml petroléterrel (3.2.), és tegyük az öblítõ oldószereket az elválasztó tölcsérbe, vagy az extraháló készülékbe. Az egyesített oldatban a víz és etanol aránya 2:1 kell, hogy legyen. Rázzuk erõteljesen két percig, és hagyjuk ülepedni két percig. 5.3.1. Extrahálás elválasztó tölcsért (4.2.3.) használva Amikor a rétegek szétváltak (lásd megfigyelések 7.3.) tegyük a petroléteres fázist egy másik elválasztó tölcsérbe (4.2.3.). Ismételjük meg ezt az extraktciót kétszer, 100 ml petroléterrel (3.2.), és kétszer, 50 ml petroléterrel (3.2.). Mossuk az elválasztó tölcsérben egyesített petroléteres extraktumokat kétszer 100 ml víz adaggal, gyengéden átforgatva (hogy elkerüljük az emulzió képzõdést) és ezután ismételjük további 100 ml víz adagokkal addig, míg a mosó víz fenolftaleinre (3.7.) nézve színtelen marad (négyszer átmosva általában elegendõ). A víznyomok eltávolítására szûrjük a mosott extraktumot száraz, fázis elválasztásra alkalmas redõs szûrõpapíron (4.4.) 500 ml-es mérõlombikba (4.2.2.). Öblítsük az elvá- lasztó tölcsért és a szûrõt 50 ml petroléterrel (3.2.), töltsük jelig petroléterrel (3.2.) és jól rázzuk össze. 5.3.2. Extrahálás, extraháló készüléket (4.8.) használva Amikor a fázisok szétváltak (lásd megfigyelések 7.3.) tegyük az üveg henger (4.8.1.) dugója helyére a betéttel ellátott csiszolatos feltétet (4.8.2.), és helyezzük az állítható csõ U-formájú alsó végét úgy, hogy az éppen a határfelület felett legyen. A feltét oldalcsövén nitrogén nyomást alkalmazva juttassuk a felsõ petroléteres réteget 1000 ml-es elválasztó tölcsérbe (4.2.3.). Tegyünk 100 ml petrolétert (3.2.) az üveg hengerbe, dugjuk be a dugóval és erõteljesen rázzuk össze. Hagyjuk, hogy a fázisok szétváljanak, és a fentiek szerint jutassuk a felsõ fázist az elválasztó tölcsérbe. Ismételjük meg az extraktciós eljárást további 100 ml petroléterrel (3.2.), majd kétszer 50 ml petroléter (3.2.) adagokkal és tegyük a petroléteres fázisokat a választó tölcsérbe. Mossuk az egyesített petroléteres extraktumokat az 5.3.1.-ben leírtak szerint és folytassuk a mûveleteket az ott leírtaknak megfelelõen. 5.4. A minta oldat elkészítése a HPLC-s méréshez Pipettázzunk a petroléteres oldatból (5.3.1., vagy 5.3.2.) ismert mennyiséget 250 ml-es körte formájú lombikba. Desztilláljuk az oldószert a maradék még éppen nedves állapotáig rotadeszttel (4.1.), csökkentett nyomást alkalmazva, 40°C-nál nem magasabb vízfürdõ hõmérsékleten. Nitrogén gáz bejuttatásával állítsuk vissza az atmoszférikus nyomást és vegyük le a lombikot a rotadesztrõl. Távolítsuk el az oldószer maradékot nitrogén gáz (3.10.) beáramoltatással, és azonnal oldjuk ismert térfogatra (10–100 ml) metanolban (3.3.), (az oldat A-vitamin koncentrációja 5–30 NE/ml közötti kell, hogy legyen), a jelre töltés elõtt szûrjük, ha szükséges. 5.5. Folyadékkromatográfiás mérés Az A-vitamin koncentrációját UV detektorral (325 nm) vagy fluoreszcens detektorral (gerjesz-tés: 325 nm, emisszió: 475 nm) mérjük, fordított fázisú C18 oszlopon történõ elválasztás után. Injektáljunk az 5.4. szerinti metanolos oldatból aliquot mennyiséget (pl. 20 µl) és eluáljuk a mozgófázissal (3.9). Ugyanabból a mintaoldatból többször injektálva számítsuk ki a mintaoldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságot (területet), és a kalibráló oldatból (5.6.2.) többször injektálva számítsuk ki a kalibráló oldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságot (területet). Folyadékkromatográfiás (HPLC) körülmények A kromatografálás feltételeiként az alábbiak ajánlottak; más kikötés szerint is eljárhatunk feltéve, hogy egyenértékû eredményt ad. Folyadékkromatográfiás oszlop (4.5.1.): 250 mm × 4 mm, C18, 5, vagy 10 µm szemcseméretû töltet, vagy egyenértékû Mozgó fázis (3.9.): metanol (3.3.) és víz elegye pl. 980 + 20 Áramlási sebesség: 1–2 ml/perc Detektor (4.5.2.): UV detektor (325 nm), vagy fluoreszcens detektor (gerjesztés: 325 nm/emisszió: 475 nm) 5.6. Kalibrálás 5.6.1. Standard munkaoldat elõkészítése Pipettázzunk 20 ml A-vitamin acetát alapoldatot (3.11.1.), vagy 20 ml A-vitamin palmitát alapoldatot (3.12.1.) 500 ml-es kónikus lombikba (4.2.1.) és hidrolizáljuk az 5.2. pontban leírtak szerint, de BHT hozzáadása nélkül. Ezt követõen extraháljuk petroléterrel (3.2.) az 5.3.-ban leírtak szerint és töltsük 500 ml-re petroléterrel (3.2.). Ezen extrakt 100 ml-ét pároljuk rotadeszttel (lásd 5.4.) még éppen nedves állapotig, távolítsuk el az oldószer maradékot nitrogén átáramoltatással (3.10.) és oldjuk a maradékot 10,0 ml metanolban (3.3.). Az oldat névleges koncentrációja 560 NE A-vitamin milliliterenként. A pontos tartalmat az 5.6.3.3. szerint meg kell határozni. A standard munkaoldatot frissen a használat elõtt kell elkészíteni. Pipettázzunk 2 ml-t a frissen készített standard munkaoldatból 20 ml-es mérõlombikba, töltsük jelig metanollal (3.3.) és rázzuk össze. A hígított standard munkaoldat névleges koncentrációja 56 NE Avitamin milliliterenként. 5.6.2. A kalibráló oldatok és a kalibrációs görbe elkészítése Pipettázzunk 1,0; 2,0; 5,0; és 10,0 ml hígított standard munkaoldatot 20 ml-es mérõlombikokba, töltsük jelig metanollal (3.3.) és rázzuk össze. Az oldatok névleges koncentrációja 2,8; 5,6; 14,0 és 28,0 NE A-vitamin milliliterenként. 5.6.3. A standard oldatok spektrofotometriás (UV) hitelesítése 5.6.3.1. A-vitamin acetát alapoldat Pipettázzunk 2,0 ml-t az A-vitamin acetát alapoldatból (3.11.1.) 50 ml-es mérõlombikba (4.2.2.) és töltsük jelig 2-propanollal (3.8.). Az oldat névleges koncentrációja 56 NE A-vitamin milliliterenként. Pipettázzunk 3,0 ml-t ebbõl a hígított A-vitamin acetát oldatból ml-es mérõlombikba és töltsük jelig 2-propanollal (3.8.). Az oldat névleges koncentrációja 6,72 NE Avitamin/ml. Vegyük fel spektrofotométeren (4.6.) az oldat UV spektrumát 2-propanollal (3.8.) szemben, 300–400 nm között. Az abszorbancia maximuma 325–327 nm között kell, hogy legyen. A-vitamin tartalom számítása NE A-vitamin /ml = E326 × 19,0 1% A-vitamin acetát E = 1530, 326 nm-nél, 2-propanolban 1 cm 5.6.3.2. A-vitamin palmitát alapoldat Pipettázzunk 2,0 ml-t az A-vitamin palmitát alapoldatból (3.12.1.) 50 ml-es mérõlombikba (4.2.2.) és töltsük jelig 2-propanollal (3.8.). Az oldat névleges koncentrációja NE A-vitamin/ml. Pipettázzunk 3,0 ml-t ebbõl a hígított A-vitamin palmitát oldatból 25 ml-es mérõlombikba és töltsük jelig 2-propanollal (3.8). Az oldat névleges koncentrációja 6,72 NE Avitamin/ml. Vegyük fel spektrofotométeren (4.6.) az oldat UV spektrumát 300–400 nm között, 2-propanollal szemben. Az abszorbancia maximuma 325–327 nm között kell, hogy legyen. A-vitamin tartalom számítása: NE A-vitamin/ml = E326 × 19,0 1% A-vitamin palmitát E = 957, 326 nm-nél, 2-propanolban 1 cm 5.6.3.3. A-vitamin standard munkaoldat Pipettázzunk 3,0 ml-t az 5.6.1. szerint elõkészített, hígítatlan A-vitamin standard munkaoldatból 50 ml-es mérõlombikba (4.2.2.) és töltsük jelig 2-propanollal (3.8.). Pipettázzunk 5,0 ml-t ebbõl az oldatból 25 ml-es mérõlombikba és töltsük jelig 2-propanollal (3.8.). Az oldat névleges A-vitamin tartalma 6.72 NE A-vitamin/ml. Vegyük fel az oldat UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.) 300– 400 nm között, 2-propanollal (3.8.) szemben. Az abszorbancia maximuma 325–327 nm között kell, hogy legyen. A-vitamin tartalom számítása: A-vitamin NE/ml = E325 × 18,3 1% A-vitamin alkohol E = 1821 325 nm-nél 2-propanolban 1 cm

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/69b88ec8e02037a8d3637eee652ef17e0ba2ad2b/dokumentumok/e4451c379dbc96be3daac423580de092693182bb/letoltes