Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2003-42 (Year: 2003, Number: 42)
Era: 1990-2004
Section: 10. számú melléklet a 44/2003. (IV. 26.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 1939

5. Eljárás 5.1. A minta elõkészítése (Lásd a „Megjegyzések” rész 1. pontját.) Õröljük meg a mintát úgy, hogy teljes mennyisége átessen az ISO R 565. számú ajánlás szerinti 1 mm-es lyukbõségû szitán. 5.2. Extrakció 50 g õrölt, homogenizált mintát vigyünk 500 ml-s Erlenmeyer lombikba (4.6.). Adjunk hozzá 25 g Kieselguhr-t (3.14.), 25 ml vizet és 250 ml kloroformot (3.2.). Dugaszo1juk be a lombikot, rázzuk vagy keverjük 30 percig a megfelelõ készülékkel (4.2.), majd szûrjük át redõs szûrõpapíron (4.3.). A szûrlet elsõ 10 ml-ét öntsük e1, a következõ 50 ml-t gyûjtsük össze. 5.3. Oszlopkromatográfiás tisztítás A kromatográfiás oszlop (4.4.) alsó végébe helyezzünk gyapotvatta (3.9.) dugót, töltsük fel az oszlopot kétharmad részig kloroformmal (3.2.), és szórjunk bele 5 g nátriumszulfátot (3.10.). Ellenõrizzük, hogy a nátriumszulfát réteg felülete egyenes-e, majd szórjunk az oszlopba kis részletekben 10 g szilikagélt (3.8.). Minden egyes részlet hozzáadása után keverjük fel óvatosan, hogy a levegõbuborékokat eltávolítsuk. Hagyjuk állni 15 percig, majd óvatosan adjunk hozzá 25 g nátriumszulfátot (3.10.). Hagyjuk az oldószert lefolyni egészen addig, amíg annak szintje éppen a nátriumszulfát réteg felszíne fölött helyezkedik el. Az 5.2. szerint összegyûjtött extraktot keverjük el 100 ml n-hexánnal, és az elegy teljes mennyiségét vigyük az oszlopra. Hagyjuk az elegyet lecsöpögni egészen addig, amíg a folyadék szintje éppen a nátriumszulfát réteg felszíne fölé ér. Öntsünk az oszlopra 100 ml dietilétert, és ismét hagyjuk lecsöpögni. A fenti mûveletek alatt figyeljünk arra, hogy az oszlop ne száradjon ki. Az eluátumokat elöntjük. A toxint az oszlopról 150 ml kloroform-metanol eleggyel (3.7.) eluáljuk, az eluátum teljes mennyiségét összegyûjtjük. 50 °C-t meg nem haladó hõmérsékleten inert gáz (3.11.) áramban, rotációs bepárló készüléke (4.5.) csaknem szárazra pároljuk. A bepárlási maradékot kloroform (3.2.) segítségével veszteség nélkül vigyük át 10 ml-es osztott kémcsõbe. Töményítsük be az oldatot inert gázáramban (3.11.), majd állítsuk be a térfogatát 2 ml-re kloroformmal (3.2.). 5.4. Vékonyréteg kromatográfia A standard oldat és a minta kivonat alábbi mennyiségeit cseppentsük fel a VRK lemezre (4.8.), az alsó szélétõl 2 cm-re. A foltok egymástól 2 cm-re legyenek. – 10, 15, 20, 30 és 40 µl standard aflatoxin B1 oldat (3.16.); – az 5.3. pont szerint nyert minta kivonat 10 µl-e + ugyanarra a helyre 20 µl standard oldat (3.16.); – az 5.3. pont szerint nyert minta kivonat 10 és 20 µl-e. A lemezt az egyik futtató eleggyel (3.18.) kromatografáló kádban, sötét helyen kifejlesztjük. A futtatóelegy kiválasztásához a kvalitatív standard oldat (3.17.) 25 µl-ét használva megvizsgáljuk, hogy melyik eleggyel érhetõ el az aflatoxin B1 és B2 szétválása. Kifejlesztés után a lemezt elszívó fülke alatt állni hagyjuk, hogy az oldószerek elpárologjanak, majd UV-fénybe (365 nm) helyezzük, a lámpától kb. 10 cm-re. Az aflatoxin B1 foltjai kéken fluoreszkálnak. 5.5. Mennyiségi meghatározás A meghatározást vizuálisan vagy fluorodenzitométerrel végezzük az alábbiak szerint: 5.5.1. Vizuális kiértékelés: Határozzuk meg az aflatoxin B1 mennyiségét a minta kivonatában úgy, hogy a minta foltok fluoreszcenciájának erõsségét összevetjük a standard oldat által adott foltok fluoreszcenciájának erõsségével. Ha szükséges, interpolá1junk. Az egymásra cseppentett standard oldat és mintaoldat által adott folt fluoreszcenciájának erõsebbnek kell lennie, mint a l0 µl minta oldat által adott folt fluoreszcenciája, és nem szabad, hogy egynél több folt legyen észlelhetõ. Ha a minta 10 µl-ének fluoreszcenciája erõsebb, mint a standard oldat 40 µl-e által mutatott fluoreszcencia, akkor a kivonatot kloroformmal (3.2.) 10-szeresére vagy 100-szorosára hígítjuk, és a vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatot a hígított kivonattal megismételjük. 5.5.2. Fluorodenzitometriás meghatározás: Az aflatoxin B1 foltok fluoreszcenciájának erõsségét fluorodenzitométerrel (4.22) mérjük 365 nm gerjesztési és 443 nm emissziós hullámhosszon. A minta kivonatban lévõ aflatoxin Bl mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a kivonat foltjának intenzitását az aflatoxin B1 standard oldat foltjainak intenzitásához viszonyítjuk. 5.6. Az aflatoxin B1 azonosságának bizonyítása A minta kivonatban lévõ aflatoxin B1 azonosságát az alábbi megerõsítõ eljárásokkal kell bizonyítani: 5.6.1. Kénsavas kezelés Permetezzük be kénsavval (3.13) az 5.4. szerint kapott kromatográfiás lemezt. Az aflatoxin B1 foltok UV-fényben észlelhetõ kék fluoreszcenciája sárgászöld színûre változik. 5.6.2. Kétdimenziós kromatográfia aflatoxin B1-hemiacetál képzéssel Megjegyzés: az alábbi mûveleteket az 1. ábra pontos követésével kell elvégezni. 5.6.2.1 Az oldatok felvitele Húzzunk két egyenes vonalat a lemez (4.8.) két szomszédos oldalával párhuzamosan (mindegyik oldalon 6 cm-re a lemez két szélétõl), ez lesz a kifejlesztési magasság határvonala. Mikrofecskendõvel cseppentsük fel az alábbi oldatokat a lemezre: – az A pontra: a minta 5.3. pont szerint tisztított kivonatából olyan mennyiséget, ami kb. 2,5 ng aflatoxin B1-et tartalmaz; – a B és C pontra a standard oldat (3.16.) 10, illetve 25 µl-ét. 5.6.2.2. A kromatogram kifejlesztése Elõször az I. irányban fejlesztjük ki a lemezt sötét helyen, amíg az oldószer front a megjelölt határvonalat eléri. A futtató elegy (3.18.1.) 1cm magasan álljon a kádban, a kád légtere nem telített. Vegyük ki a lemezt a kádból, hagyjuk sötét helyen, szobahõmérsékleten 5 percig. Permetezzük be sósavval (3.12.) 2,5 cm-es sávban az A és B pontok környezetét (a 3. ábrán látható bevonalkázott rész) úgy, hogy a lemez többi részét üveglappal beborítva védjük a permettõl. A sósavas kezelést addig folytatjuk, míg az érintett sáv sötét színûvé válik. Hagyjuk reagálni 10 percig sötét helyen, majd szárítsuk meg szobahõmérsékleten, levegõáramban. Ezt követõen fejlesztjük ki a lemezt a II. irányban, sötét helyen, a megjelölt határig. A futtató elegy (3.18.1.) 1 cm magasan álljon a kádban, a kád légtere nem telített. Vegyük ki a lemezt és hagyjuk szobahõmérsékleten megszáradni. 5.6.2.3. A kromatogram értelmezése Vizsgáljuk meg a kromatogramot és állapítsuk meg, hogy észlelhetõk-e az alábbiak:

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/69b88ec8e02037a8d3637eee652ef17e0ba2ad2b/dokumentumok/e4451c379dbc96be3daac423580de092693182bb/letoltes