Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2002-108 (Year: 2002, Number: 108)
Era: 1990-2004
Section: a 68/2002. (VIII. 15.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 280

3. Virológiai vizsgálat 3.1. Szövettenyészet és tápoldat BF—2 vagy RTG—2 vagy EPC vagy FHM sejteket megfelelõ tápoldatban (Eagle MEM vagy ezek módosításai, 10% magzati borjúsavó és megfelelõ mennyiségû antibiotikum kiegészítés mellett), 30 ˚C-on 20% fedettségig kell tenyészteni. Ha a szövettenyészet zárt kémcsövekben van, ajánlott a tápoldat bikarbonátos pufferezése. A nyitott rendszerekben való szövettenyésztés esetén Tris-HCl (23 mM) és Na-bikarbonát (6 mM) puffer alkalmazható. A pH értéknek 7,6 + /—0,2 értéket kell biztosítani. A szövetmintával történõ beoltáshoz fiatal szövettenyészetet kell alkalmazni (4—48 órás tenyészet), amelynek aktív szaporodásban kell lennie, és nem képezhet összefüggõ sejtréteget. 3.2. A szövettenyészetek beoltása Az antibiotikummal kezelt szerv szuszpenziót két hígításban kell a szövettenyészetre leoltani (elsõdleges hígítás és ennek 1:10 arányú hígítása, aminek eredménye a szövetminta 1:100, illetve 1:1000 mértékû hígítása, a homológ interferencia-megelõzés érdekében). Legalább két szövettenyészetet kell leoltani. A leoltási minta mennyiségének és a tápoldat mennyiségének 1:10 arányúnak kell lennie. Minden hígításhoz és minden sejtvonalhoz legalább 2× 2 cm sejtterületet (ami egy 24 vályús szövettenyésztõ lemezen 1 vályúnak felel meg) kell használni. Ajánlott a szövettenyésztõ lemezek használata, de azonos vagy nagyobb szövetfelületek szintén elfogadhatók. 3.3. A szövettenyészetek inkubálása A leoltott szövettenyészeteket 15 ˚C-on 7—10 napig kell inkubálni. Ha a tápoldat színe vörösrõl sárgára változik, a tápoldat pH-jának megváltozását jelezve, a pH-t steril bikarbonát oldattal vagy ennek megfelelõ oldattal módosítani kell, a sejteknek a vírussal szembeni fogékonysága megõrzése céljából. Legalább hathavonta, vagy ha a szövettenyészet csökkent fogékonyságának gyanúja felmerül, a VHS és IHN vírus lefagyasztott törzseivel titrálást kell végezni a szövettenyészetek vírusfertõzéssel szembeni fogékonyságának ellenõrzésére. Az ajánlott eljárást az I. 4. pont ismerteti. 3.4. Mikroszkópos vizsgálat A leoltott szövettenyészeteket rendszeresen ellenõrizni kell (hetente legalább háromszor) a citopatogén hatás szempontjából 40—150× nagyítással. Ha citopatogén ha- 2002/108. szám tást észlelnek, azonnal meg kell kezdeni az I. 4. pontban leírt módon a vírusazonosítási eljárást. 3.5. Továbboltás Ha az elsõdleges leoltás után 7—10 nap alatt nem alakult ki citopatogén hatás, továbboltást kell végezni az elsõdleges leoltásnál alkalmazott méretû új szövettenyészetre. Az elsõdleges szövettenyészet szövetfolyadék (felülúszó) minden szövettenyészetébõl/vályújából egyenlõ mennyiséget szövetvonal szerint kell összeönteni 7—10 nappal az elsõdleges leoltás után. Az elegymintákat homológ sejtvonalakra kell leoltani hígítatlanul és 1:10-es hígításban (végsõ hígítás 1:10 és 1:100) az I. 3.2. pontban leírtak szerint. Más módszer szerint az elsõdleges szövettenyészet tápoldatának 10%-os mintáját közvetlenül az új szövettenyészetre lehet leoltani (vályúból vályúba történõ továbboltás). A leoltást megelõzheti az I. 2.3. pontban leírt módon a megfelelõ hígítású IPN vírus elleni szérummal végzett inkubálás. A beoltott szövettenyészeteket ezután 7—10 napig 15 ˚C-on inkubálják az I. 3.4. pontban leírt megfigyelés mellett. Ha toxikus citopatogén hatás jelentkezik az inkubálás elsõ három napján, újabb átoltást lehet végezni, de a sejteket ekkor 7 napig kell inkubálni és újból át kell oltani további 7 napos megfigyelés céljából. Ha a toxikus citopatogén hatás három nap után jelentkezik, a sejtek egyszer passzálhatók és inkubálhatók az eredeti leoltástól számított 14 napos megfigyelési idõre. Az inkubálás utolsó 7 napján nem jelentkezhet toxikus jelenség. Ha az antibiotikum kezelés ellenére bakteriális fertõzöttség jelentkezik, a továbboltást 2000—4000 g-vel 15—30 percig 2—5 ˚C-on végzett centrifugálásnak kell megelõznie és/vagy a felülúszót alacsony fehérjekötésû szûrõmembránnal lehet szûrni. Emellett a továbboltási eljárás ugyanaz, mint a toxikus citopatogén hatás esetén.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/d5d58498e1ab7841b427cb4caa66f7af7beea701/dokumentumok/6238aa8868606e1794f1b737427f72033d8f51a4/letoltes