Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2003-42 (Year: 2003, Number: 42)
Era: 1990-2004
Section: 10. számú melléklet a 44/2003. (IV. 26.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 1714

5. Vizsgálati eljárások 5.1. A vizsgálati minta elõkészítése A vizsgálati mintát 0,5 mm lyukátmérõjû darálón megõröljük. A túlságosan nedves mintákat vagy 50 °C-nál nem magasabb hõmérsékleten légszáraz állapotba hozzuk, vagy liofilizátorban szárítjuk ki a darálást megelõzõen. A magas zsírtartalmú mintákat petroléterrel (3.12.) zsírtalanítani kell a darálást megelõzõen. 5.2. Szabad aminosavak meghatározása takarmány-elõkeverékekben és takarmánykeverékekben Mérjünk be a vizsgálati mintából 0,1 mg-os pontossággal a becsült aminosav tartalom alapján 1–5 gnyi mennyiséget. Adjunk hozzá 100,0 ml extraháló elegyet (3.21.). Rázassuk az elegyet 60 percen keresztül. Miután leülepedett, pipettázzunk ki az elegybõl 10,0 ml-nyit a felülúszóból egy 100 ml-es fõzõpohárba és adjunk hozzá 5,0 ml szulfo-szalicilsav oldatot (3.22.). Kevertessük az elegyet mágneskeverõn 5 percen keresztül. Ezután szûrjük vagy centrifugáljuk le az oldatot. Vegyünk ki a szûrletbõl 10,0 ml-t egy 100 ml-es fõzõpohárba, állítsuk be a pH-ját 2,2-re nátrium-hidroxid oldattal (3.18.). Ezután az oldatot vigyük át a megfelelõ térfogatú mérõlombikba, 100 ml-enként tegyünk hozzá 1,0 ml belsõ standard oldatot (3.27.3.), majd töltsük jelig citrát pufferrel (3.24.). Az oldatot az (5.4.) fejezetben leírtak alapján kromatografáljuk. Ha a mintaoldat aznap nem kerül mérésre, hûtõben 5 °C alatt kell tárolni. 5.3. A kötött és szabad aminosavak együttes meghatározása 5.3.1. Oxidáció Mérjünk be 0,1 mg pontossággal 0,1–1 g közötti mennyiséget a mintából (5.1.) az aminosav analizátorunk, illetve a hidrolízis körülményeink lehetõsége alapján az alábbi hidrolizáló edényekbe: – 100 ml-es gömblombikba (4.1.) nyitott terû hidrolízis (reflux) esetén (5.3.2.3.) – 250 ml-es gömblombikba (4.1.) nyitott terû hidrolízis (reflux) esetén, ha az analizátor csak alacsony Na+ ionkoncentráció esetén mûködik megfelelõen (5.3.3.1.) – 100 ml-es zárósapkás üvegedénybe, zártterû hidrolízis esetén (5.3.2.4.) A minta bemérendõ mennyiségét úgy számítjuk ki, hogy a bemért mintamennyiség nitrogén tartalma 10 mg körül legyen, valamint a nedvesség tartalom ne haladja meg a 100 mg-ot. Helyezzük a mintát tartalmazó hidrolizáló edényt 0 °C-os jeges vízfürdõbe, adjunk hozzá 5 ml oxidáló elegyet (3.23.), amit egy lapított végû üvegbot segítségével keverünk el egyenletesen. Parafilmmel zárjuk le az edényt úgy, hogy az üvegbot maradjon benne, és helyezzük a jeges vízfürdõvel együtt 0 °C-os hûtõszekrénybe, ahol 16 órán keresztül végezzük az oxidációt. A 16 óra letelte után kivesszük a jeges fürdõbõl az edényt, és az oxidálószer feleslegét 0,84 g nátrium-diszulfit (3.4.) hozzáadásával semlegesítjük. Az oxidált minta ezután hidrolizálható (5.3.2.1.). 5.3.2. Hidrolízis 5.3.2.1. Oxidált minták hidrolízise Az oxidált mintákhoz (5.3.1.) hozzáadunk 25 ml hidrolizáló elegyet (3.20.), amivel hozzáadás közben beöblítjük az edény falára, valamint az üvegbotra tapadt részecskéket. A hidrolizáló berendezésünktõl függõen vagy az (5.3.2.3.) vagy az (5.3.2.4.) pontok szerint folytatjuk le a hidrolízist. 5.3.2.2. Nem oxidált minták hidrolízise Mérjünk be 0,1 mg pontossággal 0,1–1 g közötti mennyiséget a vizsgálandó mintából (5.1.) az aminosav analizátorunk, illetve a hidrolízis körülményeink lehetõsége alapján az alábbi hidrolizáló edényekbe: – 100 ml-es gömblombikba (4.1.) nyitott terû hidrolízis (reflux) esetén (5.3.2.3.) – 250 ml-es gömblombikba (4.1.), ha az analizátor csak alacsony Na+ ionkoncentráció esetén mûködik megfelelõen (5.3.3.1.) – 100 ml-es zárósapkás üvegedénybe zárt terû hidrolízis esetén (5.3.2.4.) A minta bemérendõ mennyiségét úgy számítjuk ki, hogy a bemért mintamennyiség nitrogén tartalma 10 mg körül legyen, valamint a nedvesség tartalom ne haladja meg a 100 mg-ot. Adjunk a bemért mintához 25 ml hidrolizáló elegyet (3.20.), amivel itassuk át teljesen a szilárd mintarészt. A hidrolizáló berendezésünktõl függõen vagy az (5.3.2.3.) vagy az (5.3.2.4.) pontok szerint folytatjuk le a hidrolízist. 5.3.2.3. Nyitott terû hidrolízis (reflux) Az elõzõek szerint kezelt mintához (5.3.2.1.) vagy (5.3.2.2.) adjunk 2–3 db üveggyöngyöt és a visszafolyós hûtõvel ellátott berendezésben forraljuk az elegyet 23 órán keresztül. A hidrolízis befejezésekor a visszafolyó hûtõ belsõ felületére tapadt szemcséket, oldatcseppeket 5 ml citrát puffer (3.24.) segítségével öblítsük vissza a hidrolizáló edénybe. Az eljárást az (5.3.3.) pont szerint folytatjuk. 5.3.2.4. Zártterû hidrolízis Az (5.3.2.1.) vagy (5.3.2.2.) fejezetek szerint elõkészített mintákat 110 °C-os szárítószekrénybe helyezzük. A hidrolízis elsõ órájában az üvegcse csavaros kupakját csak lazán helyezzük az üvegre, nehogy a keletkezõ gázok miatt olyan nagy túlnyomás keletkezzék, hogy az üvegcse felrobbanjon. Egy óra elteltével szorosan lezárjuk az üveget a kupakkal, majd innen számítva 22 órán keresztül hidrolizáljuk az elegyet. A hidrolízis végeztével hûtsük le a hidrolizátumot. Attól függõen, hogy bepárlás nélkül, vagy bepárlás után állítjuk be az oldat pH-ját, 250 ml-es fõzõpohárba vagy 250 ml-es bepárló lombikba mossuk át citrát pufferrel (3.24.) az elegyet. A pH állítás az (5.3.3.) pont alapján történik. 5.3.3. A pH beállítása A pH állításának módszere attól függ, hogy az aminosav analizátor tudja-e elemezni a magas Na+ ion tartalmú oldatokat avagy sem. A kétféle módszer közül az egyik a bepárlás utáni (5.3.3.1.), a másik a közvetlen (5.3.3.2.) pH állítás. 5.3.3.1. pH állítás alacsony Na+ ion koncentráció igénye esetén A bepárlandó mintaoldathoz 2,0 ml belsõ standard oldatot (3.27.3), valamint 2 csepp 1-oktanolt (3.15.) adunk. A bepárlást forgó filmbepárlóban 40 °C-on vákuum alatt végezzük. A mintát 5–10 ml-re pároljuk be, majd a maradék oldat pH-ját nátrium-hidroxid oldattal (3.18.) 2,20ra állítjuk. A továbbiakban a (5.3.4.) pontban leírtak szerint folytatjuk az elõkészítést. 5.3.3.2. pH állítás magas Na+ ion koncentráció lehetõsége esetén A hidrolizátumhoz (5.3.2.3.) vagy (5.3.2.4.) szerint hidrolizált óvatosan keverés közben hozzáadunk 17 ml 7,5 mol/l-es nátrium-hidroxid oldatot (3.17.), ügyelve arra, hogy a minta hõmérséklete ne haladja meg a 40 °C-ot. Ezután pontosan beállítjuk a pH-t 2,20-ra, az 1 mol/l-es nátrium-hidroxid oldat (3.18.) segítségével. A továbbiakban a (5.3.4.) fejezetben leírtak szerint folytatjuk az elõkészítést. 5.3.4. A hidrolizátum véghígítása A pH = 2,20-re beállított hidrolizátumot (5.3.3.1.) vagy (5.3.3.2.) citrát puffer (3.24.) segítségével átmossuk egy 200 ml-es mérõlombikba, majd ugyanezzel a pufferrel jelig töltjük. Amennyiben a hidrolizátumhoz nem adtuk még hozzá a belsõ standardot, akkor a jelig töltés elõtt pipettázzunk a lombikba 2,0 ml norleucin oldatot (3.27.3.). A mintaoldatot kromatografáljuk (5.4.). Amennyiben az elemzést más napon végezzük, az oldatot hûtõben 5 °C alatt tároljuk. 5.4. Kromatográfiás mérés Az extraktumokat vagy hidrolizátumokat az injektálás elõtt 0,2 µm-es membránszûrõn szûrjük. 5.4.1. Folyadékkromatográfiás mérés 5.4.1.1. Vizsgálati paraméterek Elválasztó pufferek, ninhidrin színreagens, elválasztási program. Az aminosav analizátor gyártója által javasolt, vagy egyénileg kidolgozott pufferek, elválasztó programok, reagens oldat. Kromatográfiás oszlop: Szulfonált polisztirol-divinil-benzol alapú kationcserélõ töltettel töltött oszlop. Detektálás hullámhossza: 570 nm valamennyi aminosavra, kivétel prolin 440 nm. 5.4.2. Méréstechnikai irányelvek – A minta és a kalibrációs standard minél hasonlóbb legyen aminosav koncentrációját, és ion koncentrációját tekintve. A bepárlás nélküli pH = 2,2-re állított mintákhoz a NaCl-al dúsított standard kalibrációs oldatot (3.27.4.) használjuk. – A minta kromatografálásából kapott aminosav csúcsok magassága a standard megfelelõ csúcsaihoz képest a 30–200%-os tartományon belül legyen. – Elválasztási kritérium, hogy a treonin/szerin átlapoló csúcspár esetén a völgypont alapvonaltól mért magasságának és a kisebbik csúcs magasságának az aránya nem lehet nagyobb, mint 2:10. A többi csúcspárra ez az érték nem lehet nagyobb, mint 1:10. – A kromatográfiás rendszernek képesnek kell lennie a lizint elválasztani a lizin környékén jelentkezõ hidrolízis során képzõdõ „mûtermékektõl”, valamint az esetlegesen jelenlevõ ornitintõl.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/69b88ec8e02037a8d3637eee652ef17e0ba2ad2b/dokumentumok/e4451c379dbc96be3daac423580de092693182bb/letoltes