Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2004-21 (Year: 2004, Number: 21)
Era: 2004-2010
Section: a 20/2004. (II. 27.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 418

5. A vizsgálat módja 5.1. Általános tudnivalók 5.1.1. Végezzünk vakpróbát egy referenciamintán annak ellenõrzésére, hogy sem metil-benzokvát, sem interferáló anyagok nincsenek jelen. 5.1.2. A mintában találhatóval azonos mennyiségû metil-benzokvát hozzáadásával dúsított referenciaminta analízisével végezzünk visszanyerési próbát. 15 mg/kg-os szintre történõ dúsításhoz, adjunk 600 ml standard törzsoldatot (3.7.1.) 20 g referenciamintához, mindezt keverjük el, majd 10 percet várjunk, mielõtt folytatnánk a mûveletet az extrakcióval (5.2.). Megjegyzés: e módszer alkalmazásában a referenciaminta a mintával azonos fajtájú takarmány legyen, és abban az analízis során metil-benzokvát ne legyen kimutatható. 5.2. Extrakció Mérjünk ki az elõkészített mintából 0,01 g pontossággal 20 g-ot, és öntsük át egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikba. Adjunk hozzá 100,0 ml metánszulfonsav-oldatot (3.4.), és rázzuk mechanikus rázógépben (4.1.) 30 percig. Szûrjük át az oldatot szûrõpapíron, és tegyük félre a szûrletet a folyadékfolyadék elválasztáshoz (5.3.). 5.3. Folyadék-folyadék elválasztás Egy 100 ml sósavoldatot (3.5.) tartalmazó 500 ml-es elválasztótölcsérbe öntsünk át 25,0 ml-t az 5.2. lépésben nyert szûrletbõl. Adjunk hozzá 100 ml diklórmetánt (3.1.) a tölcsérhez, és rázzuk egy percen keresztül. Engedjük, hogy a rétegek elváljanak egymástól, és az alsó réteget (a diklórmetánt) eresszük bele egy 500 ml-es gömblombikba. Ismételjük meg a vizes fázis extrakcióját még kétszer, további 40.40 ml diklórmetánnal, majd vegyítsük az elsõ kivonattal a gömblombikban. A rotációs, vékonyfilmes bepárlókészüléken (4.2.), csökkentett nyomás és 40 °C hõmérséklet mellett teljes száradásig pároljuk be a diklórmetán kivonatot. Oldjuk fel a maradékot 20.25 ml metil-alkoholban (3.2.), zárjuk le az üveget, és tartsuk meg az egész kivonatot az ioncserélõ kromatográfiához (5.4.). 5.4. Ioncserélõ kromatográfia 5.4.1. A kationcserélõ oszlop elõkészítése Az üvegoszlop (4.3.) alsó végébe illesszünk egy kis üvegvatta dugót. Készítsünk a kezelt kationcserélõ mûgyanta (3.6.) 5,0 grammjából és 50 ml sósavból (3.5.) egy elegyet, majd öntsük bele az üvegoszlopba, majd hagyjuk, hogy leülepedjen. Engedjük ki a felesleges savat, hogy még éppen ellepje a gyanta felszínét, és addig mossuk az oszlopot vízzel, amíg a szüredéken végzett lakmuszteszt semleges nem lesz. Öntsünk át 50 ml metil-alkoholt (3.2.) az oszlopra, és hagyjuk, hogy leszivárogjon a gyanta felszínén. 5.4.2. Oszlopkromatográfia Az (5.3.) pontban készített mintakivonatot pipettázzuk óvatosan az oszlop tetejére. A gömblombikot két adag, 5-10 ml mennyiségû metil-alkohollal (3.2.) öblítsük, és öntsük ezen mosófolyadékot is rá az oszlopra. Futtassuk le a kivonatot a gyanta felszínén, és mossuk az oszlopot 50 ml metil-alkohollal, ügyelve arra, hogy az átfolyási sebesség ne haladja meg az 5 ml/percet. Öntsük el a szüredéket. Eluáljuk az oszlopról a metil-benzokvátot 150 ml metánszulfonsav-oldattal (3.4.), majd vegyük fel az eluátumot egy 250 ml-es gömblombikban. 5.5. Folyadék-folyadék elválasztás 5.5.1. Egy 1 l-es elválasztótölcsérbe öntsük át az (5.4.2.) lépésben nyert eluátumot. Az Erlenmeyerlombikot 5.10 ml metil-alkohollal (3.2.) öblítsük, és a mosófolyadékot öntsük össze az elválasztó tölcsér tartalmával. Adjunk hozzá 300 ml sósavoldatot (3.5.) és 130 ml diklórmetánt (3.1.). Rázzuk egy percen keresztül, és engedjük, hogy a fázisok elváljanak egymástól. Az alsó réteget (a diklórmetánt) eresszük bele egy 500 ml-es gömblombikba. Ismételjük meg a vizes fázis extrakcióját még kétszer, további 70-70 ml diklórmetánnal, és ezen kivonatokat öntsük össze a gömblombikban lévõ elsõ kivonattal. 5.5.2. A rotációs, vékonyfilmes bepárlókészüléken (4.2.), csökkentett nyomás és 40 °C hõmérséklet mellett teljes száradásig pároljuk be a diklórmetán kivonatot. Oldjuk fel a maradékot megközelítõleg 5 ml metil-alkoholban (3.2.), és öntsük az oldatot teljes mennyiségben egy 10 ml-es mérõlombikba. Öblítsük el még kétszer a lombikot 1.2 ml metil-alkohollal, majd öntsük a mérõlombikba. Töltsük fel jelig metil-alkohollal, és keverjük el. Egy aliquot részt szûrjünk át egy membránszûrõn (4.6.). Ezt az oldatot tegyük el a HPLC meghatározáshoz (5.6.). 5.6. HPLC meghatározás 5.6.1. Paraméterek Az alábbi vizsgálati feltételek csak iránymutatóként szolgálnak, ettõl eltérõ feltételeket is lehet használni, amennyiben azok ezzel egyenértékû eredményt adnak. – folyadékkromatográfiás oszlop (4.4.1.), – HPLC mobil fázis: metil-alkohol és víz keveréke (3.3.), – átáramlási sebesség: 1-1,5 ml/min, – észlelési hullámhossz: 265 nm, – befecskendezett mennyiség: 20.50 µl. A 4,0 µg/ml anyagot tartalmazó kalibráló oldat (3.7.3.) többszöri befecskendezésével ellenõrizzük a kromatográfiás rendszer stabilitását, míg a csúcsok magassága vagy görbe alatti területe, illetve a retenciós idõk stabilakká nem válnak. 5.6.2. Kalibrációs görbe Fecskendezzük be többször egymás után az egyes kalibráló oldatokat (3.7.3.), és mérjük meg az egyes koncentrációkra esõ csúcsok magasságát (görbe alatti területét). A kalibráló oldatok átlagos magassága vagy területe legyen az ordináta tengelyen, a megfelelõ koncentrációk pedig µg/mlben az abszcisszán, és ennek alapján szerkesszünk kalibrációs görbét. 5.6.3. Mintaoldat Ugyanolyan mennyiségû oldatot használva, mint amennyit a kalibrációs oldatokhoz használtunk, fecskendezzük be a mintakivonatot (5.5.) egymás után többször és határozzuk meg a metilbenzokvátcsúcsok átlagos magasságát (területét).

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/50ffa5371bd67ade8e8b08959aa12136de225c3b/dokumentumok/f23f4f92c4f8dc35e1c0a8f3f93e865a1d7603fe/letoltes