Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2004-13 (Year: 2004, Number: 13)
Era: 2004-2010
Section: 6. számú melléklet a 6/2004. (II. 10.) ESZCSM rendelethez
Paragraph Index: 711

6. számú melléklet a 6/2004. (II. 10.) ESZCSM rendelethez A kozmetikai termékekben lévõ benzoesav, 4-hidroxibenzoesav, szorbinsav, szalicilsav és propionsav, valamint hidrokinon, hidrokinon monometil-éter, hidrokinon monoetil-éter és hidrokinon monobenzil-éter azonosítására és mennyiségi meghatározására vonatkozó vizsgálati módszerek I. BENZOESAV, 4-HIDROXIBENZOESAV, SZORBINSAV, SZALICILSAV ÉS PROPIONSAV AZONOSÍTÁSA ÉS MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA KOZMETIKAI TERMÉKEKBEN 1. Cél és alkalmazási terület Ez a módszer a kozmetikai termékekben lévõ benzoesav, 4-hidroxibenzoesav, szorbinsav, szalicilsav és propionsav azonosítására és mennyiségi meghatározására alkalmas. Külön eljárások írják le ezeknek a tartósítószereknek az azonosítását; a propionsav meghatározását; valamint a 4-hidroxibenzoesav, szalicilsav, szorbinsav és benzoesav meghatározását. 2. Fogalommeghatározás Az e módszerrel meghatározott benzoesav, 4-hidroxibenzoesav, szalicilsav, szorbinsav és propionsav mennyiségét a szabad savak tömegszázalékában kifejezzük ki. A. AZONOSÍTÁS 1. Alapelv A tartósítószerek sav/bázis kivonását követõen a kivonatot vékonyréteg kromatográfiával (TLC) elemezzük, a derivatizációt a mérés napján végezzük el. Az eredményektõl függõen az azonosítást nagynyomású folyadék-kromatográfiával (HPLC) erõsítjük meg, vagy propionsav esetében gázkromatográfiával (GC). 2. Reagensek 2.1. Általános rész Minden reagensnek analitikai tisztaságúnak kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy legalább azzal egyenértékû tisztaságú víznek kell lennie. 2.2. Aceton 2.3. Dietil-éter 2.4. Acetonitril 2.5. Toluol 2.6. n-Hexán 2.7. Folyékony paraffin 2.8. 4 M-os sósav 2.9. Kálium-hidroxid 4 M-os vizes oldata 2.10. Kalcium-klorid, CaCl2 2H2O 2.11. Lítium-karbonát, Li2CO3 2.12. 2-bróm-2’-acetonafton 2.13. 4-hidroxibenzoesav 2.14. Szalicilsav 2.15. Benzoesav 2.16. Szorbinsav 2.17. Propionsav 2.18. Referenciaoldatok Készítsünk 0,1%-os (m/v) (100 mg/100 ml) oldatokat mind az öt tartósítószerbõl (2.13–2.17.) dietil-éterrel. 2.19. Derivatizáló reagens 2-bróm-2’-acetonafton (2.12.) 0,5%-os (m/v) acetonitriles oldata (2.4.) (50 mg/10 ml). Ezt az oldatot hetente kell készíteni, és hûtõszekrényben kell tárolni. 2.20. Katalizátor oldat Lítium-karbonát (2.11) 0,3%-os vizes oldata (300 mg/100 ml). Ezt az oldatot frissen kell készíteni. 2.21. Futtató szer Toluol (2.5.) / aceton (2.2.) (20:0,5 v/v) 2.22. Folyékony paraffin (2.7.) / n-hexán (2.6.) (1:2 v/v) 3. Eszközök Szokásos laboratóriumi felszerelés 3.1. 60 oC hõmérséklet tartására alkalmas vízfürdõ 3.2. Elõhívó kád 3.3. Ultraibolya fényforrás, 254 és 366 nm 3.4. Vékonyréteg lemezek, Kieselgel 60, fluorescens indikátor nélkül, 20 × 20 cm, rétegvastagság 0,25 mm, 2,5 × 20 cm-es koncentráló zónával (Merck 11845 vagy ezzel egyenértékû) 3.5. 10 ì l-es mikrofecskendõ 3.6. 25 ì l-es mikrofecskendõ 3.7. Maximum 105 ºC hõmérséklet tartására alkalmas szárítószekrény 3.8. 50 ml-es üvegcsövek csavaros kupakkal 3.9. Szûrõpapír 90 mm átmérõvel, Schleicher és Schull, 5892 Weissband vagy ezzel egyenértékû 3.10. Univerzális pH indikátorpapír, pH 1-11 3.11. 5 ml-es üveg mintatartó ampullák 3.12. Rotációs bepárló (Rotavapor vagy ezzel egyenértékû) 3.13. Fõzõlap 4. Eljárás 4.1. Mintaelõkészítés Mérjünk be hozzávetõlegesen 1 g mintát egy 50 ml-es csavaros kupakú üvegcsõbe (3.8.). Adjunk hozzá négy csepp 4 M-os sósavat (2.8.) és 40 ml acetont (2.2.). Erõsen lúgos termékeknél, mint amilyen a mosdószappan, 20 csepp 4 M-os sósavat (2.8.) kell adagolni. Indikátorpapírral (3.10) ellenõrizzük, hogy a pH 2 körüli értékû legyen. Zárjuk le a csövet és rázzuk erõsen egy percig. Ha szükség van a tartósítószerek acetonos fázisba történõ egyszerûbb kivonásának elõsegítésére, enyhén melegítsük a keveréket körülbelül 60 ºC-ra, hogy a folyadékfázist beolvasszuk. Hûtsük le az oldatot szobahõmérsékletre és szûrjük át szûrõpapíron (3.9.) egy Erlenmeyer lombikba. Töltsünk 20 ml szûrletet 200 ml-es Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 20 ml vizet és keverjük össze. 4 M-os kálium-hidroxiddal (2.9.) állítsuk be a keverék pH-ját körülbelül 10-es értékre úgy, hogy a pH mérésére indikátorpapírt (3.10.) használunk. Adjunk hozzá 1 g kalcium-kloridot (2.10.) és rázzuk fel erõsen. Szûrõpapíron (3.9) szûrjük át 250 ml-es Erlenmeyer lombikba, ami 75 ml dietil-étert (2.3.) tartalmaz és rázzuk erõsen egy percig. Hagyjuk szétválni, és a vizes réteget vigyük át egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikba. Öntsük el az éteres réteget. Indikátorpapír (3.10.) segítségével a vizes oldat pH-ját 4 M-os sósavval (2.8.) állítsuk be körülbelül pH 2-re. Adjunk hozzá 10 ml dietil-étert (2.3.), dugjuk be a lombikot és rázzuk erõsen egy percig. Hagyjuk szétválni, és az éteres réteget töltsük át egy rotációs bepárlóba (3.12.). Öntsük ki a vizes réteget. Párologtassuk az éteres réteget csaknem szárazra, és a maradékot újra oldjuk fel 1 ml dietil-éterben (2.3.). Töltsük az oldatot a mintatartó ampullába (3.11.). 4.2. Vékonyréteg kromatográfia Minden kromatografálásra kerülõ referencia- és mintaoldat esetében (3.5.) egy fecskendõvel vigyünk fel hozzávetõlegesen 3 ì l l ítium-karbonát oldatot (2.20.) a TLC lemez (3.4.) koncentrációs zónájának alapvonalára, egyenlõ távolságokban és szárítsuk hideg levegõáramban. Hogy a foltokat annyira kis területen tartsuk, amennyire csak lehet, tegyük át a TLC lemezt egy 40 ºC-ra melegített fõzõlapra (3.13.). Egy mikrofecskendõvel (3.5.) vigyünk fel 10 ì l-t minden egyes referencia oldatból (2.18.) és mintaoldatból (4.1.) a lemez alapvonalára, pontosan azokra a foltokra, ahova a lítium-karbonát oldatot is felvittük. Végül vigyünk fel körülbelül 15 ì l derivatizáló reagenst (2.19) (2-bromo-2-acetonafton oldat) megint pontosan azokra a foltokra, ahová a referencia- és mintaoldatokat és a lítium-karbonát oldatot is felvittük. Tegyük a lemezt 80 ºC-os szárítószekrénybe (3.7.) 45 percig. Lehûlés után – szûrõpapír bevonat használata nélkül – tegyük a lemezt egy olyan futtató kádba (3.2.), amelyet elõtte 15 percig telítettünk a 2.21 futtató szerrel (toluol/aceton) és addig futtassuk, amíg az oldószer front 15 cm-es magasságig ér el ( ez körülbelül 80 percet vesz igénybe). Szárítsuk meg a lemezt hideg levegõáramban és vizsgáljuk meg a kapott foltokat UV fényben (3.3). A gyenge foltok fluoreszkálásának növelése érdekében a TLC lemezt be lehet mártani folyékony paraffin/ n-hexán keverékbe (2.22.). 5. Azonosítás Határozzuk meg minden egyes folt Rf értékét. Hasonlítsuk össze a minták Rf értékét és az UV sugárzás alatti intenzitását a referencia oldatokéval.. Ezen adatok segítségével azonosíthatjuk a tartósítószereket, vagy következtethetünk jelenlétükre. Hajtsuk végre a B. fejezetben leírt HPLC vizsgálatot. Amennyiben propionsav jelenlétét tapasztaljuk, akkor a C. fejezetben leírt GC vizsgálatot végezzük el és hasonlítsuk össze a kapott retenciós idõket a referencia oldatok retenciós idõivel. Vessük össze a TLC-vel, HPLC-vel vagy GC-vel kapott eredményeket és az összesített eredmények alapján véglegesen azonosítsuk a mintában jelen lévõ tartósítószereket. B. BENZOESAV, 4-HIDROXIBENZOESAV, SZORBINSAV ÉS SZALICILSAV MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA 1. Alapelv Savanyítást követõen a mintát etil-alkohol és víz elegyével kivonjuk. Szûrés után a tartósítószereket nagynyomású folyadék-kromatográfiával (HPLC) határozzuk meg. 2. Reagensek 2.1. Minden reagensnek analitikai és HPLC- tisztaságúnak kell lennie ott, ahol ez szükséges. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy legalább ezzel egyenértékû tisztaságú víznek kell lennie. 2.2. Abszolút etil-alkohol 2.3. 4-hidroxibenzoesav 2.4. Szalicilsav 2.5. Benzoesav 2.6. Szorbinsav 2.7. Nátrium-acetát (CH3COONa.3H2O) 2.8. Ecetsav (á)420 = 1,05 g/ ml 2.9. Acetonitril 2.10. 2 M-os kénsav 2.11. Kálium-hidroxid 0,2 M-os vizes oldata 2.12. 2-metoxibenzoesav 2.13. Etil-alkohol/víz keverék Keverjünk össze kilenc térfogatrész etil-alkoholt (2.2.) és egy térfogatrész vizet (2.1.) 2.14. Belsõ standard oldat Készítsünk egy olyan oldatot, ami hozzávetõlegesen 1 g 2-metoxibenzoesavat (2.12.) tartalmaz 500 ml etil-alkohol/víz elegyben (2.13.) 2.15. Mozgó fázis a HPLC-hez 2.15.1. Acetát puffer: 1 liter vízhez adjunk 6,35 g nátrium-acetátot (2.7.) és 20,0 ml ecetsavat, majd keverjük össze. 2.15.2. A mozgó fázist úgy készítsük el, hogy keverjünk össze kilenc térfogatrész acetát puffert (2.15.1.) egy térfogatrész acetonitrillel (2.9.) 2.16. Tartósítószer törzsoldat Pontosan mérjünk be 0,05 g 4-hidroxibenzoesavat (2.3.), 0,2 g szalicilsavat (2.4.), 0,2 g benzoesavat (2.5.) és 0,05 g szorbinsavat (2.6.) egy 50 ml-es mérõlombikba és töltsük fel jelig etil-alkohol/víz eleggyel (2.13.). Tároljuk ezt az oldatot hûtõszekrényben. Az oldat egy hétig megfelelõ. 2.17. Tartósítószerek standard oldata Töltsünk 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 és 0,50 ml törzsoldatot (2.16.) egy sorozat 20 ml-es mérõlombikba. Minden lombikba adjunk 10,00 ml belsõ standard oldatot (2.14.) és 0,5 ml 2 M-os kénsavat. Töltsük fel a jelig etilalkohol/víz eleggyel (2.13.). Ezeket az oldatokat frissen kell készíteni. 3. Eszközök Szokásos laboratóriumi felszerelés, ha nincs külön meghatározva, valamint: 3.1. Vízfürdõ 60 ºC-ra beállítva 3.2. Nagynyomású folyadék-kromatográf változtatható hullámhosszú UV detektorral és 10 ì les befecskendezõ hurokkal 3.3. Analitikai oszlop Rozsdamentes acél, 12,5-25 cm, belsõ átmérõ 4,6 mm, Nucleosil 5C18-al vagy ezzel egyenértékû töltetû 3.4. 90 mm átmérõjû szûrõpapír, Schleicher és Schull, 5892 Weissband vagy ezzel egyenértékû 3.5. 50 ml-es üvegcsövek csavaros kupakkal 3.6. 5 ml-es üveg mintatartó ampullák 3.7. 2-4 mm méretû üveggyöngy, vagy homogenizálás céljára ezzel azonosanyag (pl. horzsakõ) 4. Eljárás 4.1. Mintaelõkészítés 4.1.1. A minta elõkészítése belsõ standard hozzáadása nélkül Mérjünk be 1 g-nyi mintát egy 50 ml-es csavaros fedelû üvegcsõbe (3.5.). Pipettával csepegtessünk 1,00 ml 2 M-os kénsavat (2.10.) és 40,0 ml etil-alkohol/víz elegyet (2.13.) a csõbe. Adjunk hozzá kb. 1 g üveggyöngyöt (3.7.), zárjuk le a csövet és rázzuk erõsen legalább egy percig, míg homogén szuszpenziót nem kapunk. Ahhoz, hogy a tartósítószerek az etanolos fázisbavaló kivonását elõsegítsük, tegyük a csövet pontosan 5 percre 60 ºC-os vízfürdõbe (3.1.). Azonnal hûtsük le a csövet hideg vízáramban és tartsuk a kivonatot 5 ºC-on egy órán keresztül. Majd szûrjük le szûrõpapíron (3.4.) keresztül. Töltsünk át körülbelül 2 ml kivonatot egy mintatartó ampullába (3.6.) és tartsuk 5 ºC-on. A HPLC-s meghatározást 24 órán belül végezzük el . 4.1.2. A minta elõkészítése belsõ standard hozzáadásával Mérjünk be három tizedes pontossággal 1±0,1 g mintát egy 50 ml-es csavaros fedelû üvegcsõbe (3.5.). Pipettával adjunk hozzá 1,00 ml 2 M-os kénsavat (2.10.) és 30,0 ml etilalkohol/víz elegyet (2.13.). Adjunk hozzá körülbelül 1 g üveggyöngyöt (3.7.) és 10,00 ml belsõ standard oldatot (2.14.). Zárjuk le a csövet és rázzuk erõsen legalább egy percig, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. Ahhoz, hogy elõsegítsük a tartósítószerek kivonását az etanolos fázisba, tegyük a csövet pontosan 5 percre 60 ºC-os vízfürdõbe (3.1.). Azonnal hûtsük le a csövet hideg vízáramban, és tartsuk a kivonatot 5 ºC-on egy órán keresztül. Majd szûrjük le szûrõpapíron (3.4.) keresztül. Töltsünk át körülbelül 2 ml kivonatot egy mintatartó ampullába (3.6.) és tartsuk 5 ºC-on. A HPLC-s meghatározást 24 órán belül végezzük el. 4.2. Nagynyomású folyadék-kromatográfia Mozgó fázis: acetonitril/acetát puffer (2.15.) Az oszlopon átára mló mozgó fázis ára mlási sebességét állítsuk be 2,0±0,5 ml/perc értékre. A detektor hullámhosszát állítsuk 240 nm-re. 4.2.1. Kalibrálás Minden tartósítószer standard oldatból (2.17.) fecskendezzünk 10-10 ì l-t a folyadékkromatográfiás készülékbe (3.2.). A kromatogramokból minden oldatra határozzuk meg a vizsgált tartósítószer csúcsmagasságának a belsõ standard csúcsmagasságához viszonyított arányát. Az egyes tartósítószerekhez tartozó csúcsmagasságok arányát ábrázoljuk az egyes standard oldatok koncentrációjának függvényében. Gyõzõdjünk meg arról, hogy a kalibrációs eljárás során lineáris görbét kaptunk a standard oldatokra vonatkoztatva. 4.2.2. Mennyiségi meghatározás Fecskendezzünk 10 ì l minta kivonatot (4.1.1.) a folyadék-kromatográfiás készülékbe (3.2.), és vegyük fel a kromatogramot. Fecskendezzünk 10 ì l tartósítószer standard oldatot (2.1.7.), és vegyük fel a kromatogramot. Hasonlítsuk össze a kapott kromatogramokat. Ha a 2-metoxibenzoesavéval (ajánlott belsõ standard) nagyjából megegyezõ retenciós idõnél a minta kivonat (4.1.1.) kromatogramján úgy tûnik, hogy nincs csúcs, akkor fecskendezzünk 10 ì l belsõ standarddal ellátott minta kivonatot (4.1.2.) a folyadékkromatográfiás készülékbe, és vegyük fel a kromatogramot. Ha a 2-metoxibenzoesavéval nagyjából megegyezõ retenciós idõnél zavaró csúcsot találunk a minta kivonat (4.1.1.) kromatogramján, akkor egy másik megfelelõ belsõ standardot kell választani. (Ha a vizsgált tartósítószerek egyike hiányzik a kromatogramról, akkor ez a tartósítószer használható fel belsõ standardként.) Gyõzõdjünk meg arról, hogy a standard oldatra és a mintaoldatra kapott kromatogramok kielégítik a következõ elvárásokat: – A csúcsszétválásánál a leggyengébben szétvált párnak legalább 0,90-nek kell lennie. (A csúcsszétválás definícióját lásd az 1. ábrán).

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/53f83b22112ddee3ba432e293c5a4a07160629ad/dokumentumok/1147f0c2e2ee62fd0d72848b53190fba47bc78de/letoltes