Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2005-154 (Year: 2005, Number: 154)
Era: 2004-2010
Section: 8. számú melléklet az 56/2005. (XI. 29.) EüM–KvVM–BM együttes rendelethez
Paragraph Index: 221

(8) (9). Az LLNA in vivo módszer, ennek következtében nem szünteti meg az állatok felhasználását a kontakt szenzibilizáló aktivitás vizsgálata során, de lehetõvé teszi az erre a célra szükséges állatok számának csökkentését. Az LLNA emellett lehetõvé teszi annak az eljárásnak a jelentõs finomítását, amelynek során az állatokat a kontakt szenzibilizációs vizsgálathoz felhasználják. Az LLNA azon immunológiai történések figyelmes vizsgálatán alapul, amelyeket a vegyület a szenzibilizáció indukciós fázisában stimulál. A tengerimalac-vizsgálattól eltérõen az LLNA-hoz nincs szükség indukált 2005/154/II. szám bõr-hiperszenzitivitási reakciók elõidézésére. A tengerimalac-maximizációs vizsgálattal ellentétben nincs szükség adjuváns alkalmazására sem. Az LLNA alkalmazásával tehát csökkenthetõ az állatokat érõ stressz mértéke. Az LLNA-nak a hagyományos tengerimalac-vizsgálatokkal szembeni elõnyei ellenére el kell ismerni, hogy a módszernek vannak olyan korlátai (pl. hamis negatív eredmények egyes fémeknél vagy hamis pozitív eredmények bizonyos bõrirritáló anyagoknál) (10), amelyek szükségessé teszik a hagyományos tengerimalac-vizsgálatok alkalmazását. Lásd még a Bevezetés B. részét. 1.2. A vizsgálati módszer elve Az LLNA hátterében az az alapelv áll, hogy a szenzibilizáló anyagok elsõdleges limfocita-proliferációt indukálnak abban a nyirokcsomóban, amely a vegyszer kijuttatásának helyéül szolgáló terület nyirokelvezetésérõl gondoskodik. Ez a proliferáció arányos az alkalmazott dózis nagyságával (valamint az allergén erõsségével), és egyszerû módszert biztosít a szenzibilizáció objektív és kvantitatív méréséhez. Az LLNA dózis-válasz összefüggésként méri ezt a proliferációt, ahol is a vizsgálati csoportokban mért proliferációt a vivõanyaggal kezelt csoportban mérttel hasonlítják össze. Meghatározzák a kezelt csoportokban a vivõanyaggal kezelt kontrollcsoportokban mérthez viszonyított proliferáció arányát, más néven a stimulációs indexet, amelynek legalább háromnak kell lennie ahhoz, hogy a vizsgálandó anyagot mint potenciális bõrszenzibilizálót további vizsgálatoknak vessék alá. Az itt ismertetett módszerek alapját a sejtproliferáció radioaktív jelöléssel történõ mérése képezi. Azonban más végpontok is alkalmazhatók a proliferáció vizsgálatára, feltéve, hogy azt megfelelõen megindokoljuk és tudományosan is alátámasztjuk, ezen belül teljeskörûen megadjuk a hivatkozásokat és a módszer leírását is. 1.3. A vizsgálati módszer ismertetése 1.3.1. Készítmények 1.3.1.1. Az állatok tartásának és etetésének körülményei Az állatokat egyedileg kell tartani. A kísérleti helyiség hõmérsékletének 22 °C (± 3 °C)-nak kell lennie. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30%-nak kell lennie, illetve a takarítás idõtartamától eltekintve lehetõleg ne haladja meg a 70%-ot, a célértéknek 50 és 60% között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségû ivóvíz biztosítása mellett. 1.3.1.2. Az állatok elõkészítése Az állatokat véletlenszerûen kell kiválasztani, majd egyedi azonosítóval kell ellátni (de nem valamilyen füljelzõvel), és a kezelés megkezdése elõtt legalább 5 napig a ketrecükben kell tartani õket, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez. A kezelés megkezdése elõtt minden állatot meg kell vizsgálni, és ellenõrizni kell, hogy nincsenek-e rajtuk látható bõrsérülések. 1.3.2. Kísérleti körülmények 1.3.2.1. Kísérleti állatok Ehhez a vizsgálathoz egeret kell használni. Fiatal, felnõtt, a CBA/Ca vagy a CBA/J törzsbõl származó nõstény egereket kell használni, amelyek még egyszer sem ellettek és nem is vemhesek. A vizsgálat kezdetén az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, minimális testtömegbeli eltéréssel, amely nem haladhatja meg a testtömeg-átlag 20%-át. Ha elegendõ adat áll rendelkezésre arra nézve, hogy nincsenek szignifikáns törzs- és/vagy ivarspecifikus különbségek az LLNA-válasz tekintetében, más törzsek, illetve hím állatok is alkalmazhatók. 1.3.2.2. A megbízhatóság ellenõrzése A vizsgálat megfelelõ módon történõ elvégzésének igazolására, illetve a laboratórium ez irányú kompetenciájának demonstrálására pozitív kontrollokat kell alkalmazni. A pozitív kontrollnak pozitív LLNA-választ kell kiváltania egy olyan expozíciós szint mellett, amelynél a negatív kontrollhoz viszonyítva várhatóan 3-nál magasabb stimulációs index (SI) érhetõ el. A pozitív kontrolldózist úgy kell megválasztani, hogy az indukció egyértelmû legyen, de ne eltúlzott. Erre a célra elõnyös anyagok a hexil-cinnamaldehid (CAS-szám: 101–86–0, EINECS-szám: 202–983–3) és a merkaptobenzotiazol (CAS-szám: 149–30–4, EINECS-szám: 205–736–8). Olyan körülmények is lehetségesek, amikor a fenti kritériumoknak megfelelõ más kontrollanyag is alkalmazható, feltéve, hogy azt megfelelõen megindokolják. Míg rendes körülmények között minden egyes vizsgálathoz szükség lehet egy pozitív kontrollcsoportra, esetenként a vizsgáló laboratóriumoknak elegendõ korábbi pozitív kontrolladat áll rendelkezésére ahhoz, hogy egy hat hónapos vagy még hosszabb idõszakra vonatkozóan be tudják mutatni a megfelelõ válaszreakció következetes megjelenését. Ilyen esetekben ritkábban, de legalább 6 havonta lehet szükség pozitív kontrollok alkalmazására. Bár a pozitív kontrollanyagot olyan vivõanyagban kell vizsgálni, amelyrõl ismeretes, hogy következetes választ idéz elõ (pl. aceton-olívaolaj elegy), elõfordulhat, hogy hatósági elõírások miatt egy nem standard vivõanyagot is alkalmazni kell (amelynek összetétele klinikai/kémiai szempontból fontos). Ilyen esetekben a pozitív kontroll- és e nem konvencionális vivõanyag közötti lehetséges kölcsönhatást is meg kell vizsgálni. 2005/154/II. szám 1.3.2.3. Az állatok száma, a dózisszintek és a vivõanyag megválasztása Minden dóziscsoportban legalább négy állatot kell alkalmazni, és a vizsgálandó anyagból legalább három különbözõ koncentrációt, továbbá egy negatív kontrollcsoportot, amelyet csak a vizsgálandó anyaghoz használt vivõanyaggal kezelnek, valamint adott esetben egy pozitív kontrollt is. Azokban az esetekben, amikor egyedileg kell gyûjteni az állatok adatait, dóziscsoportonként legalább öt állatot kell alkalmazni. Attól eltekintve, hogy vizsgálandó anyagot nem kapnak az állatok, a kontrollcsoportokban lévõ állatokat ugyanúgy kell kezelni, mint a kezelt csoportokban lévõket. A dózisokat és a vivõanyagot az (1) hivatkozásban található ajánlások alapján kell megválasztani. A dózisokat a 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% stb. koncentrációsorozatból kell kiválasztani. A három egymás utáni koncentráció megválasztásakor figyelembe kell venni az esetlegesen rendelkezésre álló akut toxicitási és bõrirritációs adatokat is, hogy a legmagasabb koncentráció maximális expozíciót okozzon, de ne jelentkezzen szisztémás toxicitás vagy túlzott mértékû lokális bõrirritáció (2) (11). A vivõanyagot aszerint kell kiválasztani, hogy maximális legyen a vizsgálandó anyag koncentrációja és oldhatósága, miközben a vizsgálandó anyag alkalmazásához megfelelõ oldat/szuszpenzió álljon rendelkezésre. Az ajánlott vivõanyagok a preferencia sorrendjében a következõk: aceton/olívaolaj (4:1 térfogatarány), dimetilformamid, metil-etil-keton, propilén-glikol és dimetil-szulfoxid (2) (10), de megfelelõ tudományos indoklás esetén más vivõanyagok is alkalmazhatók. Bizonyos esetekben szükség lehet arra, hogy további kontrollként egy klinikai szempontból lényeges vivõanyagot használjanak, vagy azt a kereskedelmi formulát, amelyben a vizsgálandó anyagot forgalomba hozzák. Különösen vigyázni kell arra, hogy a hidrofil anyagokat olyan vivõanyagrendszerbe építsék be, amely nedvesíti a bõrt és nem fut le azonnal. Kerülni kell tehát a teljesen vizes vivõanyagokat. 1.3.3. Vizsgálati eljárás 1.3.3.1. A kísérleti program A vizsgálathoz az alábbi kísérleti programot kell alkalmazni: – 1. nap: Határozzuk meg és jegyezzük fel minden egyes állat testtömegét. Vigyünk fel 25 µl térfogatú megfelelõ hígítású vizsgálandó anyagot, valamint a vivõanyagot önmagában vagy (adott esetben) pozitív kontrollt a fülek dorzális oldalára. – 2. és 3. nap: Ismételjük meg az 1. napon elvégzett felviteli eljárást. – 4. és 5. nap: Nincs kezelés. – 6. nap: Mérjük meg és jegyezzük fel az állatok testtömegét. Injekciózzunk 250 µl, 20 µCi (7,4 e + 8 Bq) 3H-metil-timidint tartalmazó sós foszfátpuffert (PBS) a kezelt és kontrollegerek farokvénájába. Használhatunk ehelyett 250 µl, 2 µCi (7,4 e + 7 Bq) 125I-jóddezoxiuridint és 10–5 M fluordezoxiuridint tartalmazó PBS-t is, szintén az egerek farokvénájába injektálva. Öt órával késõbb extermináljuk az állatokat. Mindegyik kísérleti csoportban az állatok fülébõl vágjuk ki a kezelt terület nyirokelvezetésérõl gondoskodó füli nyirokcsomókat és tegyük be azokat kísérleti csoportonként egy PBS-t tartalmazó edénybe (összevont kezelési csoporton alapuló megközelítés). Más esetben úgy is eljárhatunk, hogy csak az egyes állatokból kivágott nyirokcsomó-párokat tesszük egy-egy PBS-t tartalmazó edénybe (egyedi megközelítés). A nyirokcsomók meghatározásának és kipreparálásának részleteit és az ehhez kapcsolódó diagrammokat a (10) hivatkozás I. mellékletében találhatjuk meg. 1.3.3.2. A sejtszuszpenziók elkészítése Az összevont kezelési csoportokból származó vagy az egyes állatokból két oldalról vett nyirokcsomósejtekbõl (LNC) álló egysejt-szuszpenziókat kell elõállítani 200 µm-es lyukméretû, rozsdamentes acélból készült fémhálón keresztül történõ óvatos mechanikai dezintegrálással. A nyirokcsomósejteket nagy feleslegben lévõ PBS-sel kétszer át kell mosni, majd 4 °C-on 18 órán át, 5%-os triklórecetsavval (TCA) precipitálni (2). A pelleteket vagy 1 ml TCA-ban újra kell szuszpendálni és 10 ml szcintillációs folyadékot tartalmazó szcintillációs fiolákba (3H-számlálás) áttenni, vagy közvetlenül gammaszámláló csövekbe (125I-számlálás) kell átrakni. 1.3.3.3. A sejtproliferáció meghatározása (beépült radioaktivitás) A 3H-metil-timidin beépülését ß-szcintillációs számlálással mérik, percenkénti bomlás (DPM) egységekben. A 125I-jóddezoxiuridin beépülését 125I-számlálással mérik, és ugyancsak DPM-ben fejezik ki. Az alkalmazott megközelítéstõl függõen a beépülést DPM/kezelési csoport (összevont megközelítés) vagy DPM/állat (egyedi megközelítés) egységben fejezik ki. 1.3.3.4. Megfigyelések 1.3.3.4.1. Klinikai megfigyelések Naponta egyszer gondosan meg kell vizsgálni az állatokban az alkalmazás helyén kialakuló lokális irritáció vagy szisztémás toxicitás esetleges klinikai tüneteit. Minden megfigyelést szisztematikusan fel kell jegyezni, minden egyes állat esetében egyedi adatsor felvételével. 2005/154/II. szám 1.3.3.4.2. Testtömeg Ahogyan az az 1.3.3.1. szakaszban szerepel, az egyes állatok testtömegét a vizsgálat kezdetén, illetve az exterminálás tervezett idõpontjában kell megmérni. 1.3.4. Az eredmények kiszámítása Az eredményeket a stimulációs indexben (SI) fejezik ki. Az összevont megközelítés alkalmazása esetén az SI-t úgy kapják meg, hogy az egyes kezelési csoportokra esõ összevont radioaktív beépülést elosztják a vivõanyaggal kezelt kontrollcsoportra jutó összevont beépüléssel. Ennek eredményeként egy átlagos SI-érték kapnak. Az egyedi megközelítés alkalmazása esetén az SI-t úgy kapják meg, hogy minden egyes kezelt csoport és a pozitív kontrollcsoport átlagos DPM/állat-értékét elosztják az oldószerrel/vivõanyaggal kezelt kontrollcsoport átlagos DPM/állat értékével. A vivõanyaggal kezelt kontrollcsoportok átlagos SI-értéke tehát 1. Ha az SI számítására az egyedi megközelítést alkalmaznak, akkor statisztikai elemzések is végezhetõk az adatokon. A megfelelõ statisztikai elemzési módszer kiválasztásakor a vizsgálónak figyelemmel kell lennie a lehetséges variancia-egyenlõtlenségekre és más kapcsolódó problémákra, ami miatt adat-transzformációra vagy nem paraméteres statisztikai elemzésre lehet szükség. Az adatok értelmezéséhez adekvát megközelítés, ha a kezelt és vivõanyaggal kezelt kontrollállatok minden egyes adatát külön értékelik ki, majd ezekbõl a konfidenciahatárok figyelembevételével levezetik a legjobban illeszkedõ dózis-válasz görbét (8) (12) (13). A vizsgálónak azonban fel kell készülnie arra, hogy egy adott csoportban egy-egy állat válasza »kilóghat a sorból«, ami miatt más módon (pl. átlag helyett medián alkalmazásával) kell a választ mérni, vagy ki kell zárni a kilógó adatokat az elemzésbõl. A választ akkor lehet pozitívként értékelni, ha – a dózis-válasz összefüggést és adott esetben a statisztikai szignifikanciát is figyelembe véve – a stimulációs index  3 (3) (6) (8) (12) (14). Ha a kapott eredmények tisztázást igényelnek, figyelembe kell venni a vizsgálandó anyag különféle tulajdonságait, és ezen belül azt is, hogy mutat-e szerkezeti rokonságot ismert bõrszenzibilizáló anyagokkal, okoz-e erõteljes bõrirritációt, illetve hogy milyen a megfigyelt dózis-válasz összefüggés. Ezek, illetve a további megfontolások részletesebb tárgyalását lásd a (7) hivatkozásban.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/26d18afd3335f9e39211d188f5f0154594a09258/dokumentumok/0a7c03030150447d3a33f0c38728a9fa2952eaf3/letoltes