Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2003-42 (Year: 2003, Number: 42)
Era: 1990-2004
Section: 10. számú melléklet a 44/2003. (IV. 26.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 1895

5. Vizsgálati eljárások Megjegyzés: A halofuginon szabad bázis formájában nem stabil lúgos közegben és etilacetát oldatban. 30 percnél tovább nem maradhat etilacetátban. 5.1. Általános megjegyzések a visszanyerés (recovery) vizsgálatához 5.1.1. A „blank” takarmány fogalma: A visszanyerési (recovery) vizsgálathoz lehetõség szerint olyan halofuginon mentes takarmány mintát használjunk, amely összetételében nagyon hasonló a vizsgálati mintához, és a kromatogramon nincsenek a halofuginon csúcsjelét zavaró csúcsok. 5.1.2. A visszanyerési vizsgálat elvégzése (recovery test) A blank minta extrakcióhoz bemért mennyiségéhez adjunk annyi halofuginont, hogy a vizsgálati mintának megfelelõ halofuginon koncentrációt kapjunk. 3 mg/kg-os halofuginon szintet pl. a következõképpen állíthatunk be. Pipettázzunk 300 µl-nyi standard törzsoldatot (3.6.1.) az extraháló edény aljára, majd mérjünk rá 10 g-ot a blank mintából. Keverjük össze az edényben a mintát a folyadékkal és hagyjuk állni kb. 10 percig, majd végezzük el az extrakciót (5.2.). Amennyiben nem áll rendelkezésre blank takarmány (5.1.1.), a visszanyerési vizsgálatot az ún. standard addíció módszerével végezzük el. A vizsgálati mintához annyi standard oldatot adunk, hogy annak halofuginon tartalma a duplája legyen annak, ami várhatóan jelen van a mintában. A mintát, valamint ezt a dúsított mintát extraháljuk (5.2.), majd mérjük (5.3.). A visszanyerést a két vizsgálat eredményének ismeretében kiszámolhatjuk. 5.2. Extrakció 0,1 g pontossággal mérjünk be 10 g mintát egy 200 ml-es centrifugacsõbe. Adjunk hozzá 0,5 g nátrium-aszkorbátot (3.10.), 0,5 g EDTA-t (3.13.) és 20 ml vizet és keverjük össze. A csövet 5 percre 80 °C-os vízfürdõbe helyezzük. Miután szobahõmérsékletre hûtöttük, 20 ml nátriumkarbonát oldatot (3.15.) adunk hozzá és összekeverjük. Azonnal hozzáadunk 100 ml etilacetátot és 15 másodpercig, kézzel erõteljesen rázzuk. Ezután meglazítjuk a dugót és három percre ultrahangos fürdõbe (4.1.) helyezzük. Két percig centrifugáljuk, majd az etilacetátos fázist üvegszûrõn (4.6.) keresztül egy 500 ml-es rázótölcsérbe leöntjük. A minta extrakcióját az etilacetát egy második 100 ml-es adagjával megismételjük. Az egyesített extraktumokat egy percig mossuk 50 ml nátriumkloriddal telített nátrium-karbonát oldattal (3.16.), majd a vizes fázist félre teszzük. A szerves fázist 1 percig extraháljuk 50 ml sósavval (3.17.). Az alsó savas réteget egy 250 ml-es rázótölcsérbe engedjük. A szerves fázist 1,5 percig újra extraháljuk a sósav további 50 milli-literével és egyesítjük az elsõ extraktummal. Az egyesített savas extraktumot hozzávetõ-legesen 10 másodpercig mossuk 10 ml etilacetát (3.4.) erõteljes hozzákeverésével. A vizes fázis teljes mennyiségét egy 250 ml-es gömblombikba visszük, és a szerves fázist félre tesszük. Forgó filmbepárló (4.2.) segítségével eltávolítjuk az etilacetát maradékát a savas oldatból. A vízfürdõ hõmérséklete nem haladhatja meg a 40 °C-ot. 25 mbar körüli vákuum alatt az etilacetát maradéka 5 percen belül eltávozik 38 °C-on. 5.3. A mintaoldat tisztítása 5.3.1. Az Amberlite oszlop készítése: Minden egyes mintához külön XAD-2 oszlopot kell készíteni. Metanol (3.8.) segítségével 10 g elõkészített Amberlite-ot (3.19.) egy üveg oszlopba (4.6.) viszünk. A gyanta ágy tetejéhez egy kis üveggyapotdugót helyezünk. A metanolt leeresztjük az oszlopról és a gyantát 100 ml vízzel mossuk. Amikor a vízszint eléri a gyantaágy tetejét, megállítjuk az áramlást. Hagyjuk kondicionálódni az oszlopot kb. 10 percig a felhasználás elõtt. Az oszlopot ne hagyjuk leszáradni. 5.3.2. A minta oldat tisztítása: Az extraktumot (5.2.) kvantitatíve az elõkészített Amberlite oszlopra (5.3.1.) visszük és eluáljuk, az eluátumot félretesszük. Az elúció áramlási sebessége nem haladhatja meg a 20 ml/perc-et. A gömblombikot 20 ml sósavval (3.17.) öblítjük, és ezt használjuk a gyantaoszlop mosásához. A savas oldat maradékát levegõáram segítségével átfújjuk az oszlopon. A mosólevet félretesszük. 100 ml metanolt (3.8.) adunk az oszlopra, 5–10 ml eluátumot egy 250 mles gömblombikba gyûjtünk. 10 percig hagyjuk, hogy a maradék metanol kondicionálja az oszlopot, majd 20 ml/perc-nél nem nagyobb áramlási sebességgel folytatjuk az elúciót, az eluátumot ugyanabba a gömblombikba gyûjtve. A metanolt a forgó filmbepárlón lepároljuk, a vízfürdõ hõmérséklete nem haladhatja meg a 40 °C-ot. A mozgó fázis (3.21.) segítségével a bepárlási maradékot teljes egészében egy 10 ml-es mérõlombikba visszük. A mozgó fázissal jelig töltjük és összerázzuk. Az oldatot membránszûrõn (4.7.) átszûrjük, majd kromatografáljuk (5.4.). 5.4. Folyadékkromatográfiás mérés 5.4.1. Vizsgálati paraméterek: Az alábbi paraméterek iránymutató jellegûek, a kromatográfiás rendszertõl függõen más elválasztási paraméterek is alkalmazhatóak, amelyek megfelelõ eredményt adnak. Izokratikus elúció. Eluens oldat (3.21.): Acetonitril/NH4-acetát oldat/víz = 250 + 150 + 600 (V + V +V), pH = 4,3. Áramlási sebesség: 1,5–2 ml/perc Injektált térfogat: 40–100 µl Kromatográfiás oszlop: 150 × 4,6 mm, C18, 5 µm, vagy egyéb a célnak megfelelõ elválasztó oszlop. Detektálás hullámhossza: 243 nm.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/69b88ec8e02037a8d3637eee652ef17e0ba2ad2b/dokumentumok/e4451c379dbc96be3daac423580de092693182bb/letoltes