Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2005-154 (Year: 2005, Number: 154)
Era: 2004-2010
Section: 3. számú melléklet az 56/2005. (XI. 29.) EüM–KvVM–BM együttes rendelethez
Paragraph Index: 70

1. MÓDSZER Ez a vizsgálati módszer egyenértékû az OECD TG 420 (2001) módszerrel. 1.1. Bevezetés Az akut toxicitás megállapítására szolgáló hagyományos módszerek esetében a vizsgálat végpontját az állatok elpusztulása jelenti. A Brit Toxikológiai Társaság 1984-ben új megközelítést javasolt az akut toxicitás vizsgálatára, amely egy sor rögzített nagyságú dózis beadásán alapul (1). Ennél a megközelítésnél nem az állatok elpusztulása jelenti a vizsgálat végpontját, hanem a rögzített nagyságú dózisok valamelyikénél megfigyelt egyértelmû mérgezési tünetekre támaszkodtak. Az Egyesült Királyságban (2) és nemzetközileg (3) végzett in vivo validálási vizsgálatok után az eljárást 1992-ben hagyták jóvá mint vizsgálati módszert. Ezt követõen egy vizsgálati sorozat (4) (5) (6) keretében matematikai modellek segítségével megvizsgálták a rögzített dózisú eljárás statisztikai tulajdonságait. Az in vivo és a modell vizsgálatok együttesen igazolták, hogy az eljárás reprodukálható, kevesebb kísérleti állatra van szükség hozzá, és kevesebb szenvedést okoz, mint a hagyományos módszerek, továbbá hasonló módon képes minõsíteni az anyagokat, mint az egyéb akut toxicitási vizsgálati módszerek. Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelelõbb vizsgálati módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (7) található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is tartalmaz a B.1a. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezésével kapcsolatosan. A módszer egyik alapelve, hogy a fõ vizsgálatban csak közepesen toxikus dózisokat alkalmaznak, és hogy kerülni kell az olyan dózisok alkalmazását, amelyek várhatóan letálisak. Nincs szükség továbbá olyan dózisok alkalmazására sem, amelyek korróziós vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullás közelében lévõ állatokat vagy azokat, amelyek nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutatják, humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy kell figyelembe venni õket a vizsgálati eredmények értelmezésekor, mint azokat az állatokat, amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítõ iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévõ vagy súlyosan szenvedõ állatok exterminálására vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmutatóban (8) találhatók. A módszer adatokat szolgáltat az anyag veszélyes tulajdonságairól és lehetõvé teszi, hogy az anyagot az akut toxicitást okozó anyagok besorolására szolgáló Vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének egyetemes harmonizált rendszere (Globally Harmonised System, GHS) szerint minõsítsék és sorolják be (9). A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése elõtt a vizsgálandó anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal elvégzett in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei; szerkezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai és az anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggyõzõdjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szempontjából, és elõsegíti majd a megfelelõ kezdõdózis kiválasztását. 1.2. Fogalommeghatározások »Akut orális toxicitás«: a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán belül többszöri dózisának szájon át történõ beadását követõen jelentkezõ káros hatások. »Késleltetett elhullás«: egy állat 48 órán belül nem hull el, illetve nem tûnik elhullásközeli állapotban lévõnek, de késõbb, a 14 napos megfigyelési idõszak során elpusztul. »Dózis«: a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (pl. mg/kg) fejezik ki. »Nyilvánvaló toxicitás«: a vizsgálandó anyag beadását követõen jól látható mérgezési tüneteket leíró általános kifejezés [a példákat lásd a (3) hivatkozásban], amelynél a következõ legmagasabb rögzített dózis esetében a legtöbb állatnál súlyos fájdalom vagy súlyos szorongás tartós jelei, elhullásközeli állapot [az ezzel kapcsolatos kritériumok a Humane Endpoints Guidance Documentben (8) szerepelnek], vagy valószínû elhullás várható. »GHS«: Vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének egyetemes harmonizált rendszere. Az OECD (emberi egészség és környezet), az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakértõi Bizottsága (fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek közötti program a vegyi anyagok helyes kezelésére (Interorganisation Programme of the Sound Management of Chemicals, IOMC) koordinál. »Közeli elhullás«: amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés idõpontja elõtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az oldalhelyzet, a fekvõhelyzet és a remegés. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)]. 2005/154/II. szám »LD50: (közepes letális dózis)«: a vizsgálandó anyag statisztikailag levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50%-ának elhullását okozza. Az LD50-értéket a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki. »Határdózis«: egy, a vizsgálhatóság felsõ határánál lévõ dózis (2000 vagy 5000 mg/kg). »Elhullásközeli állapot«: az esetleges kezelés ellenére is az elhullás közelében lévõ állapot vagy túlélésre való képtelenség. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)]. »Megjósolható elhullás«: a kísérlet tervezett vége elõtt, a jövõben egy ismert idõpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. [A további részleteket lásd Humane Endpoints Guidance Documentben (8).] 1.3. A vizsgálati módszer elve Azonos ivarba tartozó állatok csoportjainak egy lépcsõzetes eljárás során 5, 50, 300 és 2000 mg/kg-os rögzített dózisok alkalmazásával kell beadni a vizsgálandó anyagot (kivételes esetben egy további, 5000 mg/kg-os rögzített dózis is alkalmazható; lásd az 1.6.2. szakaszt). A kiindulási dózist a dózisbehatároló vizsgálat alapján kell megválasztani úgy, hogy az várhatóan mérgezési tüneteket eredményezzen, de ne okozzon súlyos mérgezést vagy elhullást. A fájdalomhoz, szenvedéshez és közeli elhulláshoz társuló klinikai tüneteket és állapotot részletesen egy külön OECD Útmutató (8) ismerteti. A mérgezési tünetek megjelenésétõl vagy az elhullás bekövetkeztétõl vagy ezek elmaradásától függõen további állatcsoportok is kezelhetõk magasabb vagy alacsonyabb rögzített dózissal. Az eljárást folytatni kell, amíg meg nem találják azt a dózist, amely nyilvánvaló toxicitást vagy legfeljebb egy elhullást okoz, vagy ha a legmagasabb dózisnál nem figyelnek meg semmilyen hatást, vagy ha a legalacsonyabb dózisnál elhullanak állatok. 1.4. A vizsgálati módszer ismertetése 1.4.1. Az állatfaj kiválasztása A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általában nõstényeket használnak (7). Ennek az az oka, hogy a hagyományos LD50-vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekintése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhetõ különbség, a nõstények általában valamivel érzékenyebbek (10). Azonban ha a szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzékenysége valószínûsíthetõ, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfelelõen meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik. Általánosan használt laboratóriumi törzsekbõl származó egészséges, fiatal felnõtt állatokat kell alkalmazni. Olyan nõstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ±20%-nál többel az esetlegesen korábban kezelt állatok testtömegének átlagától. 1.4.2. Az állatok tartásának és etetésének körülményei A kísérleti állatokat 22 °C (±3 °C) hõmérsékletû helyiségben kell tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30%-nak kell lennie, illetve a takarítás idõtartamától eltekintve lehetõleg ne haladja meg a 70%-ot, a célértéknek 50 és 60% között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségû ivóvíz biztosítása mellett. Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az egy ketrecben lévõ állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az ne zavarja az egyes állatok megfigyelését. 1.4.3. Az állatok elõkészítése Az állatokat véletlenszerûen kell kiválasztani, majd egyedi azonosítóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése elõtt legalább 5 napig a ketrecükben kell tartani õket, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez. 1.4.4. A dózisok elõkészítése A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény koncentrációját változtatják. Azonban ha folyékony végterméket vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követõ kockázatértékelés szempontjából megfelelõbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítatlanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes szabályozó hatóságok ezt írják elõ. A maximálisan beadható dózistérfogatot azonban egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretétõl függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömeg-arányt: vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömeg-arány is megfontolható. A dóziskészítmény formulázásakor – ahol lehet – a vizes oldatok/szuszpenziók/emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos (pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, és harmadsorban esetlegesen más vivõanyagokban elkészített oldatok. A víztõl eltérõ vivõanyagok esetében ismerni kell a vivõanyag toxikológiai tulajdonságait. A dózisokat a beadás elõtt rövid idõvel kell elkészíteni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készítmény stabilitása az alkalmazás idõtartama alatt. 2005/154/II. szám 1.5. Eljárás 1.5.1. A dózisok beadása A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy megfelelõ intubációs kanülön át történõ táplálással kell beadni. Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkalmazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó idõtartam alatt kisebb részletekben is beadható. A kezelés elõtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A koplaltatási idõszakot követõen meg kell mérni az állatok testtömegét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni – patkány esetében 3–4 órára, egér esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás idõtartamától függõen menet közben szükség lehet arra, hogy az állatoknak táplálékot és vizet adjanak. 1.5.2. Dózisbehatároló vizsgálat A dózisbehatároló vizsgálat célja, hogy ki lehessen választani a megfelelõ kezdõdózist a fõ vizsgálathoz. A vizsgálandó anyagot az 1. mellékletben bemutatott folyamatábra szerint egymás után kell beadni egy-egy állatnak. A dózisbehatároló vizsgálat akkor fejezõdik be, amikor meghozható a döntés a fõ vizsgálatban alkalmazandó kezdõdózisról (vagy ha a legalacsonyabb rögzített dózisnál elhullás történik). A dózisbehatároló vizsgálatban a kezdõdózist a következõ rögzített dózisok közül választják ki: 5, 50, 300 és 2000 mg/kg aszerint, hogy a lehetõleg ugyanezzel az anyaggal vagy szerkezetileg rokon anyagokkal kapott in vivo vagy in vitro adatok alapján várhatóan melyik eredményez nyilvánvaló toxicitást. Ilyen információk hiányában a kezdõdózist 300 mg/kg-ban kell megállapítani. Az egyes állatok kezelése között legalább 24 órának el kell telnie. Minden állatot legalább 14 napig megfigyelés alatt kell tartani. Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét jogszabályi követelmény indokolja, megfontolás tárgyává lehet tenni egy további, 5000 mg/kg-os felsõ rögzített dózis alkalmazását (lásd a 3. mellékletet). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2000–5000 mg/kg tartomány) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószínûsége, hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelenõséggel bírnak az emberi vagy állati egészség, illetve a környezet védelme szempontjából. Olyan esetekben, amikor a dózisbehatároló vizsgálatban a legalacsonyabb rögzített dózissal (5 mg/kg) kezelt állat elhullik, az általános eljárás szerint be kell fejezni a vizsgálatot és az anyagot a GHS 1. kategóriába kell besorolni (ahogyan az az 1. mellékletben látható). Ha azonban szükség van a besorolás további megerõsítésére, az alábbiak szerinti opcionális kiegészítõ eljárás alkalmazható. Egy második állatnak is beadjuk az 5 mg/kg-os dózist. Ha ez is elhullik, akkor az megerõsíti a GHS 1. kategóriába való besorolást, és a vizsgálatot azonnal be kell fejezni. Ha a második állat életben marad, akkor legfeljebb három további állaton kell elvégezni az 5 mg/kg-os dózissal történõ vizsgálatot. Mivel nagy az elhullás kockázata, az állatok kímélete érdekében egymás után kell õket kezelni. Az egyes állatok kezelése között eltelt idõt úgy kell megválasztani, hogy elegendõ legyen annak megállapítására, hogy az elõzõleg kezelt állat valószínûleg életben marad. Ha egy második állat is elhullik, azonnal be kell fejezni a kezeléseket, és több állatnak már nem szabad beadni az anyagot. Mivel a második elhullás bekövetkezte miatt (függetlenül attól, hogy a vizsgálatok befejezéséig hány állatot kezeltek) az »A« eredményhez jutnak (legalább 2 elhulláseset), a 2. melléklet 5 mg/kg-os rögzített dózisánál érvényes besorolási szabályt kell követni (ha legalább 2 elhullás történt, akkor 1. kategória, ha legfeljebb 1 elhullás történt, akkor 2. kategória). A 4. mellékletben pedig azzal kapcsolatos útmutatást tartalmaz, hogy az új Vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének egyetemes harmonizált rendszere (GHS) bevezetéséig az anyagokat hogyan kell az EU-rendszer szerinti kategóriákba besorolni. 1.5.3. Fõ vizsgálat 1.5.3.1. Az állatok száma és a dózisok A kezdõdózissal történõ vizsgálat utáni teendõket a 2. mellékletben található folyamatábra mutatja. Három lehetséges alternatíva létezik: vagy le kell állítani a vizsgálatot, és be kell sorolni az anyagot a megfelelõ veszélyességi kategóriába, vagy magasabb rögzített dózissal kell folytatni a vizsgálatot, vagy alacsonyabb rögzített dózissal. Az állatok védelme érdekében azonban a fõ vizsgálatban már nem szabad olyan dózissal kísérletezni, amely a dózisbehatároló vizsgálatban elhullást okozott (lásd a 2. mellékletet). A tapasztalatok azt mutatják, hogy a kezdõdózissal végzett vizsgálatok legvalószínûbb eredménye, hogy az anyagot be lehet valamilyen kategóriába sorolni és nincs szükség további vizsgálatokra. Általában összesen öt-öt, azonos ivarú állatnak kell beadni az egyes vizsgált dózisokat. Ebbõl az öt állatból egyet a dózisbehatároló vizsgálat során kezelnek az adott dózissal, és ehhez járul a további négy állat (kivéve abban a szokatlan esetben, ha a fõ vizsgálatban használt dózist nem alkalmazták a dózisbehatároló vizsgálatban). Az egyes dózisok vizsgálata közötti idõtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének idõpontja, idõtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következõ dózissal történõ kezelését nem szabad megkezdeni mindaddig, amíg meg nem bizonyosodtak arról, hogy az elõzõleg kezelt állatok életben maradnak. Szükség esetén ajánlott ez egyes dózisokkal való 2005/154/II. szám kezelések között 3 vagy 4 napos szünetet tartani, hogy meg lehessen figyelni a késleltetett toxicitást. Ennek idõtartama szükség esetén – pl. nem meggyõzõ válasz esetében – módosítható. Ha egy felsõ, 5000 mg/kg-os dózis alkalmazást is tervbe vesznek, a 3. mellékletben vázolt eljárást kell követni (lásd még az 1.6.2. szakaszt). 1.5.3.2. Határérték-vizsgálat Határérték-vizsgálatot elsõsorban olyan helyzetekben kell végezni, ha a kísérletet végzõnek olyan információi vannak, amelyek szerint a vizsgálandó anyag valószínûleg nem toxikus, azaz csak a hatósági határérték-dózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhetõ információ, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó anyag várhatóan toxikus, a fõ vizsgálatot kell elvégezni. Ezen iránymutatás céljára határérték-vizsgálatként a normál eljárás alkalmazásával történõ, 2000 mg/kg-os (vagy kivételes esetben 5000 mg/kg-os) kezdõdózissal végzett dózisbehatároló vizsgálat, majd ezt követõen további négy állat ugyanezzel a dózissal történõ kezelése szolgál. 1.6. Megfigyelések Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, legalább az elsõ 30 percben, azután az elsõ 24 órában rendszeres idõközönként, amelynek során különös figyelemmel kell õket kísérni az elsõ 4 órában, majd ezt követõen naponta, összesen 14 napon át, kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálatból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés idõtartamát azonban nem szabad mereven meghatározni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és idõtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megszûnésének idõpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek inkább késleltetve jelentkeznek (11). Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében önálló adatsort vesznek fel. Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szükség. Meg kell figyelni a bõr és a szõrzet, a szemek és a nyálkahártyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma elõfordulására is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alapelveket és követelményeket is figyelembe kell venni (8). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lévõ állatokat, illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehetõ legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás idõpontját is. 1.6.1. Testtömeg Röviddel a vizsgálandó anyag beadása elõtt és legalább egy héttel utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtömeg-változást ki kell számítani és fel kell jegyezni. A vizsgálat végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd humánus módon exterminálni kell õket. 1.6.2. Kórbonctani vizsgálat Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni (azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden állat esetében az összes makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegyezni. A kezdõdózis beadása után legalább 24 óráig túlélõ állatok esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos információk nyerhetõk.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/26d18afd3335f9e39211d188f5f0154594a09258/dokumentumok/0a7c03030150447d3a33f0c38728a9fa2952eaf3/letoltes