Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2002-108 (Year: 2002, Number: 108)
Era: 1990-2004
Section: a 68/2002. (VIII. 15.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 285

d) tápoldat önmagában (pozitív kontroll). Minden vírus felülúszó-szérum keverékbõl legalább két szövettenyészetet kell 50 µl-rel beoltani és 15 ˚C-on inkubálni. A citopatogén hatást az I. 3.4. pontban leírtak szerint kell ellenõrizni. Egyes VHS vírus törzsek nem reagálnak a neutralizációs tesztben. Az ilyen izolátumokat immunfluoreszcenciával vagy ELISA-val kell azonosítani. Alternatív módon más bevált neutralizációs próba is használható. 4.3. Immunfluoreszcencia Minden vírus izolátum azonosításához 24 órás tenyésztés után legalább nyolc fedõlemeznyi vagy azzal azonos méretû, 60—90%-os borítású sejtmennyiségre van szükség. Erre a célra az EPC sejtek ajánlottak, mert erõsen tapadnak az üvegfelülethez, de más sejtvonalak (BF—2, RTG—2 vagy FHM) szintén használhatók. Amikor a sejtek leülepedtek az üveg felületére (a beoltás után kb. egy órával), vagy ha a sejteket maximum 24 óráig tenyésztették ezeken a felületeken, az azonosításra váró vírussal beoltják a sejteket. Négy szövettenyészetet oltanak be 1:10 térfogat hígítással és négy szövettenyészetet 1:100 térfogat hígítással. A beoltott szövettenyészeteket 20—30 óráig 15 ˚C-on inkubálják. Az inkubálás után a szövettenyészeteket kétszer lemossák szérummentes Eagle MEM tápoldattal, 80% jéghideg acetonban fixálják, és a kétrétegû indirekt fluoreszcens ellenanyag módszerrel festik. Az elsõ reagens réteg referencia minõségû monoklonális vagy poliklonális ellenanyag. A második réteg fluorokrómmal konjugált antiszérum az elsõ rétegben használt ellenanyag ellen. Minden egyes megvizsgált antiszérum esetén legalább egy nagy dózisú és egy kis dózisú beoltott szövettenyészetet kell vizsgálni. A teszthez megfelelõ negatív és pozitív kontrollokat kell beállítani. Ajánlott a FITC vagy TRITC fluorokróm alkalmazása. A megfestett szövettenyészeteket glicerines konyhasó oldat felhasználásával fedõlemezzel kell borítani. Beesõ ultraibolya fényben kell a mintákat vizsgálni. Az okulárnak 10—12× nagyításúnak, az objektívnek 25—40× nagyításúnak kell lennie > 0,7 illetve > 1,3 numerikus apertúrával. A fenti immunfluoreszcenciás technika példaként szerepel. Más, igazolt hatékonyságú immunfluoreszcenciás technikákat (figyelembe véve a szövettenyészet, fixálás és referencia minõségû ellenanyag alkalmazását) is lehet alkalmazni. 2002/108. szám 4.4. ELISA A mikrotitráló lemezek vályúit egy éjszakán át a referencia minõségû tisztított immunglobulin frakció ellenanyagaival fedik. A lemezek PBS-Tween—20 pufferes mosása után, az azonosításra váró vírust kettes vagy négyes léptékû hígítással a vályúkhoz adják, és 37 ˚C-on 60 percig inkubálják a fedõ ellenanyaggal. A PBS-Tween—20-as pufferrel való mosás után, a fedõ ellenanyagnak megfelelõ specificitású biotinilezett ellenanyagot adnak a vályúkhoz, és 20 ˚C-on 60 percig inkubálják. A fenti mosás megismételése után a tormaperoxidázzal konjugált streptiviridint adnak a vályúkhoz, és 20 ˚C-on egy órán át inkubálják. Az utolsó mosás után, a megkötött enzimet megfelelõ ELISA szubsztrát (OPD vagy más) hozzáadása után láthatóvá teszik. A fenti biotin-avidin alapú ELISA csak példa. Más, ellenõrzött hatékonyságú ELISA megoldás is lehetséges. 1A Táblázat Az övezetek és a nem-mentes övezetekben lévõ halgazdaságok ellenõrzése és mintavételezése a VHS és/vagy IHN mentes státusz megadása elõtti kétéves ellenõrzési idõszakra (a 3. számú melléklet I. pontjának megfelelõen) Kontinentális zónák és halgazdaságok Évenkénti klinikai vizsgálatok száma (két év) Évenkénti laboratóriumi vizsgálatok száma (két év) Vírus jelenlétére irányuló laboratóriumi vizsgálat1 növendékhalak száma (szerv anyag) tenyészhalak száma (petefészek folyadék)

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/d5d58498e1ab7841b427cb4caa66f7af7beea701/dokumentumok/6238aa8868606e1794f1b737427f72033d8f51a4/letoltes