Publication: Magyar Közlöny
Issue: MK-2003-42 (Year: 2003, Number: 42)
Era: 1990-2004
Section: 10. számú melléklet a 44/2003. (IV. 26.) FVM rendelethez
Paragraph Index: 1864

5. Eljárás Megjegyzés: Az E-vitamin érzékeny a (UV) fényre és oxidációra. Valamennyi mûveletet fény (sötét üvegedényt, vagy alufóliával bevont üvegedényt használjunk) és oxigén (nitrogén gáz átáramoltatása) kizárása mellett végezzük. Az extrakció alatt a folyadék feletti levegõt nitrogénnel kell eltávolítani (a túlnyomás elkerülése érdekében lazítsuk meg idõnként a dugót). 5.1. A minta elõkészítése Õröljük meg a mintát úgy, hogy az áthulljon az 1 mm-es lyukbõségû szitán, ügyelve arra, hogy ezalatt a minta ne melegedhessen fel. Az õrlést közvetlenül a minta bemérése és szappanosítása elõtt végezzük, máskülönben E-vitamin veszteség lehet. 5.2. Szappanosítás A minta E-vitamin tartalmától függõen mérjünk 0,01 g pontossággal 2–25 g-ot 500 ml-es sima aljú, vagy kónikus lombikba (4.2.1.). Adjunk hozzá egymást követõen, a lombik forgatása közben, 130 ml etanolt (3.1.), megközelítõen 100 mg BHT-t (3.13.), 2 ml nátriumaszkorbát oldatot (3.5.) és 2 ml nátriumszulfid oldatot (3.6.). Helyezzük a hûtõt (4.3.) a lombikra és merítsük a lombikot a mágneskeverõvel felszerelt vízfürdõbe (4.7.). Kevertessük és melegítsük forrásig, és forraljuk 5 percig úgy, hogy az oldószer visszacsepegjen. Majd a hûtõn (4.3.) keresztül adjunk hozzá 25 ml káliumhidroxid oldatot (3.4.) és lassú nitrogén áramoltatás mellett melegítsük további 25 percig, hogy forrjon úgy, hogy a hûtõbõl az oldószer (refluxáljon) visszacsepegjen. Ezután öblítsük a hûtõt 20 ml körüli vízzel, és hûtsük a lombik tartalmát szobahõmérsékletûre. 5.3. Extrahálás Tegyük a szappanosítási oldatot veszteség nélkül, összesen 250 ml vízzel átöblítve 1000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.), vagy az extraháló készülékbe (4.8.). Öblítsük a szappanosításhoz használt lombikot egymást követõen 25 ml etanollal (3.1.) és 100 ml petroléterrel, (3.2.) és tegyük az öblítõ oldószereket az elválasztó tölcsérbe, vagy az extraháló készülékbe. Az egyesített oldatban a víz és etanol aránya 2:1 kell, hogy legyen. Rázzuk erõteljesen két percig, és hagyjuk ülepedni két percig. 5.3.1. Extrahálás elválasztó tölcsért (4.2.3.) használva Amikor a rétegek szétváltak (lásd Megfigyelések 7.3.) tegyük a petroléteres fázist egy másik elválasztó tölcsérbe (4.2.3.). Ismételjük meg ezt az extrakciót kétszer, 100 ml petroléterrel (3.2.), és kétszer, 50 ml petroléterrel (3.2.). Mossuk az elválasztó tölcsérben egyesített petroléteres extraktumokat kétszer 100 ml víz adaggal, gyengéden átforgatva (hogy elkerüljük az emulzió képzõdést), és ezután ismételjük további 100 ml víz adagokkal addig, míg a mosó víz fenolftaleinre (3.7.) nézve színtelen marad (négyszer átmosva általában elegendõ). A víznyomok eltávolítására szûrjük a mosott extraktumot száraz, fázis elválasztásra alkalmas redõs szûrõpapíron (4.4.) 500 ml-es mérõlombikba (4.2.2.). Öblítsük az elválasztó tölcsért és a szûrõt 50 ml petroléterrel (3.2.), töltsük jelig petroléterrel (3.2.) és jól rázzuk össze. 5.3.2. Extrahálás, extraháló készüléket (4.8.) használva Amikor a fázisok szétváltak, (lásd Megfigyelések 7.3.) tegyük az üveg henger (4.8.1.) dugója helyére a betéttel ellátott csiszolatos feltétet, (4.8.2.) és helyezzük az állítható csõ U-alakú alsó végét úgy, hogy az éppen a határfelület felett legyen. A feltét oldalcsövén nitrogénnyomást alkalmazva szállítsuk a felsõ petroléteres réteget 1000 ml-es elválasztó tölcsérbe (4.2.3.). Tegyünk 100 ml petrolétert (3.2.) az üveg hengerbe, dugjuk be a dugóval és erõteljesen rázzuk össze. Hagyjuk, hogy a fázisok szétváljanak, és a fentiek szerint jutassuk a felsõ fázist az elválasztó tölcsérbe. Ismételjük meg az extrakciós eljárást további 100 ml petroléterrel (3.2.), majd kétszer 50 ml petroléter (3.2.) adagokkal, és tegyük a petroléteres fázisokat a választó tölcsérbe. Mossuk az egyesített petroléteres extraktumokat az 5.3.1.-ben leírtak szerint és folytassuk a mûveleteket az ott leírtaknak megfelelõen. 5.4. A minta oldat elkészítése a HPLC-s méréshez Pipettázzunk a petroléteres oldatból (5.3.1., vagy 5.3.2.) ismert mennyiséget 250 ml-es körte formájú lombikba. Desztilláljuk az oldószert a maradék még éppen nedves állapotáig rotadeszttel (4.1.) csökkentett nyomást alkalmazva, 40 °C-nál nem magasabb vízfürdõ hõmérsékleten. Nitrogén gáz bejuttatásával állítsuk vissza az atmoszférikus nyomást, és vegyük le a lombikot a rotadesztrõl. Távolítsuk el az oldószer maradékot nitrogén gáz (3.10.) beáramoltatással, és azonnal oldjuk ismert térfogatra (10–100 ml) metanolban (3.3.) (a DL-α-tokoferol koncentráció 5–30 µg/ml kell, hogy legyen), a jelre töltés elõtt szûrjük, ha szükséges. 5.5. Folyadékkromatográfiás mérés Mérjük az E-vitamin koncentrációját UV detektorral (325 nm) vagy fluoreszcens detektorral, (gerjesztés: 325 nm, emisszió: 475 nm) fordított fázisú C18 oszlopon történõ elválasztás után. Injektáljunk az 5.4. szerinti metanolos oldatból aliquot mennyiséget (pl. 20 µl) és eluáljuk a mozgófázissal (3.8.). Ugyanabból a mintaoldatból többször injektálva számítsuk ki a mintaoldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságot (területet) és a kalibráló oldatból (5.6.2) többször injektálva számítsuk ki a kalibráló oldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságot (területet). Folyadékkromatográfiás (HPLC) körülmények A kromatografálás feltételeiként az alábbiak ajánlottak; más kikötés szerint is eljárhatunk feltéve, hogy egyenértékû eredményt ad. Folyadékkromatográfiás oszlop (4.5.1.): 250 mm × 4 mm, C18, 5, vagy 10 µm szemcse-méretû töltet, vagy egyenértékû Mozgó fázis (3.8.): metanol (3.3.) és víz elegye pl. 980 + 20 (v+v) Áramlási sebesség: 1–2 ml/perc Detektor (4.5.2.): UV detektor (292 nm), vagy fluoreszcens detektor (gerjesztés: 295 nm/emisszió 330 nm) 5.6. Kalibrálás (DL-α-tokoferyl acetát, vagy DL-α-tokoferol) 5.6.1. DL-α-tokoferyl acetát standard 5.6.1.1. Standard munkaoldat elkészítése Pipettázzunk 25 ml DL-α-tokoferyl acetát alap oldatot (3.10.1.) 500 ml-es sima aljú, vagy kónikus lombikba (4.2.1.), és hidrolizáljuk az 5.2.-ben leírtak szerint. Extraháljuk egymást követõen petroléterrel (3.2.) az 5.3. szerint és töltsük 500 ml-re petroléterrel. Pároljuk az oldat 25 ml-ét rotadeszttel (lásd 5.4.) még éppen nedves állapotig, távolítsuk el az oldószer maradékot nitrogén (3.9.) áramoltatással, és oldjuk a maradékot 25,0 ml metanolban (3.3.). Az oldat névleges koncentrációja 45,5 µg DL-α- tokoferol/ml, amely azonos 50 µg DL-α-tokoferyl acetát/ml értékkel. A standard munka oldatot frissen a használat elõtt kell elkészíteni. 5.6.1.2. A kalibráló oldatok és a kalibrációs görbe elkészítése Pipettázzunk 1,0; 2,0; 4,0 és 10,0 ml-t a standard munka oldatból 20 ml-es mérõlombikokba és töltsük jelig metanollal (3.3.), rázzuk össze. Az oldatok névleges koncentrációja rendre 2,5; 5,0; 10.0 és 25,0 µg/ml DL-α-tokoferyl acetát, azaz 2,28; 4,55; 9,10 és 22,8 µg/ml DL-α-tokoferol. Injektáljunk többször 20-20 µl-t a kalibráló oldatok mindegyikébõl, és számítsuk ki az átlagos csúcsmagasságokat(területeket). Az átlagos csúcsmagasságokat (területeket) használva készítsük el a kalibrációs görbét. 5.6.1.3. DL-α-tokoferyl acetát alap oldat (3.10.1.) spektrofotometriás (4.6.) UV hitelesítése Hígítsunk 5 ml DL-α-tokoferyl acetát alap oldatot (3.10.1.) 25 ml-re etanollal, és vegyük fel az oldat UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.), etanollal (3.1.) szemben 250 és 320 nm között. Az abszorbancia maximuma 284 nm-nél kell, hogy legyen. 1% E = 43,6 284 nm-nél, etanolban 1 cm Ennél a hígításnál 0,84 és 0,88 közötti abszorbancia értéket kell, hogy mérjünk. 5.6.2. DL-α-tokoferol standard 5.6.2.1. A standard munka oldat elkészítése Pipettázzunk 2,0 ml-t a DL-α-tokoferol alap oldatból (3.11.1.) 50 ml-es mérõlombikba, töltsük jelig metanollal (3.3.). Az oldat névleges koncentrációja 40 µg DL-α-tokoferol/ml, amely egyenértékû 44,0 µg DL-α-tokoferyl acetáttal ml-enként. A standard munka oldatot frissen, a használat elõtt kell elkészíteni. 5.6.2.2. A kalibráló oldatok és a kalibrációs görbe elkészítése Pipettázzunk 1,0; 2,0; 4,0 és 10,0 ml standard munka oldatot 20 ml-es mérõlombikokba, töltsük jelig metanollal (3.3.), és rázzuk össze. Az oldatok névleges koncentrációja 2,0; 4,0; 8,0 és 20,0 µg/ml DL-α-tokoferol, azaz 2,20; 4,40; 8,79 és 22,0 µg/ml DL-α-tokoferyl acetát. Injektáljunk többször 20-20 µl-t a kalibráló oldat mindegyikébõl, és határozzuk meg az átlagos csúcsmagasságokat (területeket). Az átlagos csúcsmagasságokat (területeket) használva ábrázoljuk a kalibrációs görbét. 5.6.2.3. DL-α-tokoferol alap oldat (3.11.1.) spektrofotometriás (4.6.) UV hitelesítése Hígítsunk 2,0 ml DL-α-tokoferol oldatot (3.11.1.) 25 ml-re etanollal és vegyük fel az oldat UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.) etanollal (3.1.) szemben 250 és 320 nm között. Az abszorbancia maximumának 292 nm-nél kell lenni: 1% E = 75,8 292 nm-nél, etanolban mérve 1 cm Ennél a hígításnál 0,6 abszorbancia értéket kell, hogy kapjunk.

Source: https://magyarkozlony.hu/hivatalos-lapok/69b88ec8e02037a8d3637eee652ef17e0ba2ad2b/dokumentumok/e4451c379dbc96be3daac423580de092693182bb/letoltes