高柠檬酸合酶 在生物化學領域高柠檬酸合酶Homocitrate synthase是一種可催化高柠檬酸羟基三羧酸合成的酶催化如下化学反应 乙酰CoA  HO  α酮戊二酸  displaystyle rightleftharpoons  R羟基三羧酸  CoA 在一些真菌和特定古生菌中高柠檬酸合酶摧化赖氨酸生物合成中的第一步也是关键的一步反应高柠檬酸合酶是由两个相同的亚基组成靠氮和碳末端的域交换稳定结构氮末端的催化域由TIM桶折叠组成底物在二价金属离子的协助下通过氢键与活性部位相连碳末端结构域由αβ结构组成在高柠檬酸合酶与一个底物结合后一个由碳末端结构域组成的盖子模序阻碍了底物与相邻单体活性部位的结合在酶结合两个底物分子后这个盖子模序就消失了这说明酶可以通过改变表面的柔性来调节底物与活性部位的结合无论在体内还是体外活性位点的变异导致底物与酶结合的减弱与酸碱催化活性的减弱 一些物种通过不同的代谢途径合成赖氨酸在植物和大部分细菌中赖氨酸是通过二氨基庚二酸盐途径合成的酵母和其他真菌包括人类寄生虫和一些特定的古生菌利用氨基己二酸途径合成赖氨酸因为人不能合成赖氨酸所以抑制真菌氨基己二酸途径的小分子可以作为广谱抗真菌药物这在临床上有很大的应用潜力特别对于免疫缺陷的患者比如艾滋病癌症器官移植患者他们感染真菌的概率很高 氨基己二酸途径包括八步酶反应高柠檬酸合酶催化第一步反应也是关键的一步反应它的功能是将乙酰辅酶A上的乙酰基转移到酮戊二酸上同时形成辅酶A和高柠檬酸动力学研究表明这个反应是有序双双反应酮戊二酸首先与酶结合再与乙酰辅酶A 结合完成反应后依次释放产物辅酶A和高柠檬酸推测它的反应机理和三羧酸循环中柠檬酸合酶的催化机理相似都是通过酶的酸碱催化实现混合羟醛的克莱森缩合通过分析结核分枝杆菌的异丙基苹果酸合酶的晶体结构可以更好的理解高柠檬酸合酶的作用机理两种酶属于同一家族催化的反应也类似异丙基苹果酸合酶催化亮氨酸合成途径中的一步反应即催化异戊酸和乙酰辅酶A生成异丙基苹果酸和辅酶A根据异丙基苹果酸合酶的结构对高柠檬酸合酶的lys进行了突变和动力学的研究结果显示谷氨酸组氨酸催化二连体负责第一步催化反应中乙酰辅酶A乙酰基的去质子化但是因为缺少高柠檬酸合酶的晶体数据无法确定负责催化和结合的残基也就无法获知其催化和调节机制 Bulfer S L获得了从裂殖酵母中提取的高柠檬酸合酶的结晶以及两个不同酶底物复合物的结晶一种酶底物复合物的晶体结构中有一个盖子模序它阻碍了底物靠近TIM桶中的活性位点调控底物与酶的结合稳态动力学分析和活性位点突变显示盖子残基对结合和催化的影响 扩增从裂殖酵母基因获得的高柠檬酸合酶基因然后转移到载体pHIS上这个载体在氮末端有his 标签并包含烟草花叶病毒蛋白酶裂解位点突变体通过QuikChange直接位点突变工具包实现突变并由DNA测序予以确定  mM异丙基 D硫代半乳糖苷诱导高柠檬酸合酶在大肠杆菌Rosetta中过量表达在摄氏度条件下培养过夜细胞用超声波处理后加入mg溶菌酶裂解裂解液用CoII的固定化金属亲和层析柱用于结晶或ZnII交换的固定化亲和金属层析纯化用于动力学研究上样之前首先用pHmM磷酸缓冲液包含mM NaClmM巯基乙醇的上样缓冲液平衡用mM的咪唑溶液线性洗脱His标签在用pHmM磷酸盐缓冲液包含mMNaCl和mM巯基乙醇透析过夜时被烟草花叶病毒蛋白酶除去烟草花叶病毒蛋白酶用ml 亲和层析柱作用一小时除去高柠檬酸合酶用凝胶过滤层析Superdex 进一步纯化用pHmM tris 包含mM NaCl mM三 羧乙基膦的溶液洗脱纯化后蛋白用SDSPAGE检测纯度在一些情况下高柠檬酸合酶在凝胶过滤前用mMEDTA处理以除去金属离子突变型高柠檬酸合酶纯化过程和野生型相同 硒甲硫高柠檬酸合酶用Doublie描述的方法制备纯化方法同野生型硒甲基原酶的结晶在 mM HEPESpH   mM 醋酸镁聚乙二醇 摄氏度mgml 硒甲基原酶的条件下进行得到了衍射数据并进行了优化在优化过程中发现高柠檬酸合酶并不是一个完美的二聚体由于晶体学二重轴被强制地适应二聚体分子二重轴的准对称性掩盖了两个单体之间的微小差异高柠檬酸合酶与底物结合盖子模序呈现关闭状态晶体是通过 mgml EDTA处理高柠檬酸合酶后在mM ZnII和  mM底物存在条件下获得的而高柠檬酸合酶与底物结合盖子模序呈的关闭状态的晶体是在 mgmL高柠檬酸合酶 和 mM底物条件下生长的 高柠檬酸合酶包含个残基通过硒甲硫单波长异常衍射达到埃的分辨率用分子置换达到优化晶体的目的达到了埃的分辨率有两种不同的盖子模序覆盖活性位点分别称为开和关构象在关构象中盖子模序在电子密度图中清晰可见并阻塞了活性位点在开构象中这个盖子模序消失了活性位点暴露在溶剂中此外酶可与有两种二价金属离子结合硒甲硫固定相晶体的同步辐射X射线荧光扫描发现有钴的存在这是在CoII 金属亲和层析纯化步骤中引入的和锌结合的高柠檬酸合酶底物复合物中关的盖子模序是通过用EDTA螯合钴离子然后在结晶过程中加入mM的锌离子实现的在动力学研究中使用的酶是通过ZnII 金属亲和层析纯化的这是因为高分辨率电感耦合等离子体质谱的结果说明天然的酶含有的锌 高柠檬酸合酶的晶体结构显示该酶是由一个紧密相连的同型二聚体组成单体是由氮末端的催化域和碳末端的螺旋折叠混合域组成氮末端域残基由一个标准的TIM桶组成还包含一些二级结构单元的插入酶和底物的复合物中氮末端残基形成一个短的β股在TIM桶内一些短的α螺旋分布 高柠檬酸合酶的碳末端有两个不同的亚域构成由一个两股的反平行β折叠一个两股平行的β折叠和三个连续的螺旋构成 催化是通过多醛克莱森缩合反应进行的首先酮戊二酸和乙酰辅酶A与酶的有序结合在酶上形成三元复合物乙酰辅酶A的乙酰基团在碱的催化下去质子化形成烯醇化物这个烯醇化物作为亲核试剂攻击酮戊二酸的二号碳原子在酸催化下生成醇盐的中间化合物随后在水分子的作用下硫酯键被水解生成辅酶A和高柠檬酸