노스웨스턴 블롯

노스웨스턴 블롯(영어: northwestern Blot)은 웨스턴 블롯과 노던 블롯의 하이브리드 분석 기술로 RNA와 단백질 간의 상호작용을 분석하는데 필요한 분석법이다. 웨스턴 블롯은 겔 전기 영동법에 의해 분리된 단백질을 나이트로셀룰로스 막으로 전달하고, 관심 단백질을 검출하는 데 사용한다. 특정 표적 단백질을 포함하는 막의 밴드를 보고 파악한다. 노던 블롯은 관심있는 RNA(또는 분리된 전령 RNA)를 탐지하여 유전자 발현을 연구하는 데 사용된다. 노스웨스턴 블랏은 두 기술을 결합하며, 나이트로셀룰로스 막에 고정된 단백질과 상호작용하는 RNA를 식별한다. 노스웨스턴 블롯을 시행하는 것은 RNA 결합 단백질을 겔 전기영동으로 분리하는 것을 포함하는데, 이것은 분자량과 전하에 따라 RNA 결합 단백질을 분리한다. 개별 샘플은 여러 샘플을 동시에 분석하기 위해 아가로스 또는 폴리아크릴라미드 겔(일반적으로 SDS-PAGE)에 로딩할 수 있다. 겔 전기 영동이 완료되면 RNA 결합 단백질이 나이트로셀룰로스 막에 전달된다. 새로 옮겨진 블롯은 차단 용액에 담근다. 무지방 우유와 소 혈청 알부민(BSA)이 일반적인 차단 완충제다. 이 차단 용액은 나이트로셀룰로스 막에 대한 1차 항체 및 2차 항체의 비특이적 결합을 방지하는 데 도움이 된다. 차단 용액이 블롯과 적절한 접촉 시간을 가지면 특정 경쟁 RNA를 적용하여 상온에서 배양할 수 있는 시간을 준다. 이 시간 동안, 경쟁자 RNA는 블롯 위에 있는 샘플의 RNA 결합 단백질에 결합한다. 이 과정에서 배양 시간은 적용되는 경쟁 RNA의 농도에 따라 달라질 수 있다. 그러나 배양 시간은 일반적으로 1시간이다. 배양이 완료된 후, 블럭은 용액의 RNA를 희석시키기 위해 세척할 때마다 최소 3회 이상 세척한다. 일반적인 세척 버퍼에는 PBS(Phosphate Buffered Saline) 또는 10% TWEEN-20 용액이 포함된다. 제대로 하지 않은 세척은 블롯 발생의 명확성에 영향을 미친다. 세척이 완료되면 일반적으로 X선에 의해 블롯이 디벨롭된다. X선이나 자기 방사법을 이용하여 블롯을 디벨롭한 후 결과를 분석하여 단백질을 추가로 연구하기 위해 관심있는 RNA 결합 단백질의 대략적인 크기와 농도를 결정할 수 있다. 블롯에 있는 RNA 결합 단백질의 위치와 농도는 결과에 영향을 줄 수 있으며, 개발 후 밴드가 나타나는 경우도 있다. 이 밴드들은 연구자들이 관심 있는 RNA 결합 단백질의 크기와 농도를 결정하는데 도움을 줄 수 있다. 단백질의 대략적인 크기가 알려지면 원래 샘플은 크로마토그래피 기계로 실행해 크기별로 분리할 수 있다. 또 단백질이 분리되면 트립신(trypsin)으로 분해가 가능하며, 질량 분광법을 활용해 펩타이드를 배열해 특정 단백질의 정체성을 파악할 수 있다. 노스웨스턴 블롯의 장점은 RNA를 결합하는 특정 단백질의 신속한 검출과 그 단백질들의 대략적인 분자량을 알 수 있다. 노스웨스턴 블롯은 비용을 적게 들여 식별된 단백질을 검출할 수 있게 한다. 이 블롯은 일반적으로 연구의 첫 번째 단계로, 분자량이 알려지면 크로마토그래피와 같은 다른 방법을 통해 추가 연구를 가능하게 하기 때문이다. 노스웨스턴 블롯 또 다른 장점은 그것이 동족 리간드의 발현 라이브러리 구축에 도움을 준다는 것이다. 단점은 RNA 결합 특성이 좋지 않은 일부 RNA-단백질 상호작용은 이 기법으로 검출되지 않을 수 있다는 것이다. 또한 블로킹 절차는 3시간에서 5시간까지 걸릴 수 있다. 절차를 올바르게 수행하지 않으면 식별된 단백질의 불분명한 블롯을 초래할 수 있다. 또 단백질은 분리되어 나이트로셀룰로스 막으로 옮겨진 후에 행해야 한다. 또한 단백질이 겔에서 혼합되는 하나의 폴리펩타이드나 두 개의 서브 유닛으로 구성되어야 한다는 것이다. 서던 블롯 웨스턴 블롯 노던 블롯 이스턴 블롯 사우스웨스턴 블롯 겔 전기 영동법 SDS-PAGE 크로마토그래피 Rapley, R (2000). 《The Nucleic Acid Protocols Handbook》. Totowa, NJ: Humana Press Inc. 783쪽. ISBN 978-0-89603-459-4.  Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). “Identification of proteins binding specifically to the 3'-untranslated region of granulocyte/macrophage-colony stimulating factro mRNA” (PDF). 《Nucleic Acids Research》 25 (12): 2417–2423. doi:10.1093/nar/25.12.2417. PMC 146745. PMID 9171094. 2014년 5월 7일에 확인함.  Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (1998년 7월 21일). “Activities of adenovirus virus-associated RNAs: Purification and characterization of RNA binding proteins”. 《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》 95 (15): 8514–9. Bibcode:1998PNAS...95.8514L. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. PMC 21107. PMID 9671709.  C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). 《Use of non-radioactive detection method for north- and southwestern blot》. Methods in Molecular Biology 536. 441–9쪽. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_44. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378081.  Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (May 1995). “Spnr, a Murine RNA-binding Protein That Is Localized to Cytoplasmic Microtubules”. 《The Journal of Cell Biology》 129 (4): 1023–1032. doi:10.1083/jcb.129.4.1023. PMC 2120489. PMID 7744952.  Stohlman, S A; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J Deans (1988). “Specific interaction between coronavirus leader RNA and nucleocapsid protein”. 《Journal of Virology》. 11 62 (11): 4288–95. PMC 253863. PMID 2845141. 2019년 9월 13일에 원본 문서 (PDF)에서 보존된 문서. 2014년 3월 25일에 확인함.  Thangasamy, Saminathan. “Northwestern Blot of Protein-RNA Interaction from Young Rice Panicles”. 2014년 3월 26일에 확인함.  Perdew, Gary (2008년 8월 17일). 《Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms》. Springer. 129쪽. ISBN 9781597452281.  Gary H. Perdew; Jack P. Vanden Heuvel; Jeffrey M. Peters (2008). 《Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms》. Springer. 129쪽. ISBN 9781597452281.  Smith, Christopher W.J. (1998). 《RNA-Protein Interactions : A Practical Approach: A Practical Approach》. Oxford University Press. 187쪽. ISBN 9780191591624.  Waldo, Cohen (1991년 8월 16일). 《Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology》. Academic Press. 186쪽. ISBN 9780080863290.  Nicholson, Allen W. (2001). 《Ribonucleases, Part A: Functional Roles and Mechanisms of Action: Functional Roles and Mechanisms of Action》. Academic Press. 409쪽. ISBN 9780080496917.