סיווג לנספילד

סיווג לנספילד (באנגלית: Lancefield grouping, או Lancefield classification) היא שיטה סרולוגית שמיושמת במיקרוביולוגיה קלינית על מנת למיין חיידקים במשפחת Streptococcaceae על סמך השוני בהרכב האנטיגנים הסוכריים על גבי הדופן הפפטידוגליקנית של המינים השונים במשפחה. השיטה פותחה בשנת 1933 על ידי המיקרוביולוגית האמריקאית רבקה לנספילד (Rebecca Lancefield) אשר עסקה רבות, במהלך הקריירה שלה, במחקר אודות חיידקים ממשפחת ה-Streptococcaceae - חיידקים גראם-חיוביים שמצויים בבני אדם ובבעלי חיים כחלק מהפלורה הטבעית, אולם שעלולים במקרים מסוימים לגרום לזיהומים ולמחלות. שיטה זאת, אשר אינה לוקחת בחשבון את המאפיינים הביוכימיים הייחודיים ואת סוג ועוצמת ההמוליזה של כל מין חיידק במשפחה, הייתה לאחד ההישגים הידועים ביותר של לנספילד. פיתוח שיטת לנספילד לסיווג כללה את הזרקתם של מיני חיידקים שונים במשפחת ה-Streptococcaceae, שעברו אינאקטיבציה (נטרול) בפורמלין לתוך ארנבות. בתגובה לכך החלה מערכת החיסון שלהן לייצר נוגדנים ייחודיים כנגד המרכיב הסוכרי שהתבטא על גבי הדופן הפפטידוגליקנית של כל מין של חיידק בו השתמשו להזרקה. בשלב הבא הפיקה לנספילד את הנסיוב מתוך הארנבות (שהכיל את אותם הנוגדנים הייחודיים) והגיבה אותו ישירות עם חיידקים מהמשפחה המדוברת שגדלו על מצעי אגר. ערבוב במבחנה של החיידקים עם נסיוב ארנבות, הוביל לייצור תצמידי אנטיגן-נוגדן ולאגרגציה שנראתה לעין, אשר העידה על תגובה חיובית. באופן זה סווגו חיידקי משפחת ה-Streptococcaceae ל-20 קבוצות המסומנות באותיות הלועזיות A-H, ו-K-V. כאשר מתבוננים כיום בסיווג זה ניתן מיד להבחין כי חיידקים אשר משויכים לקבוצות D ו-Q אינם נמנים כלל במשפחה הטקסונומית Streptococcaceae. זאת משום שבשנת 1984 הועברו חיידקי הסוג ‏Enterococcus למשפחה נפרדת בשם Enterococcaceae. ברם מטעמים היסטוריים הוחלט להשאירם תחת סיווג לנספילד. השימוש בסיווג לנספילד נהוג כיום בהרבה מעבדות מיקרוביולוגיות בעולם על מנת לזהות את חיידקי ה-Streptococcaceae, שצמחו על גבי מצעי האגר מתוך דגימות קליניות, באמצעות ערכות אגלוטינציה מסחריות. בערכות מסוג זה מצופים חרוזי לטקס בנוגדנים ייחודיים כנגד הקבוצות הפתוגניות השכיחות בקליניקה (לרוב קבוצות A, B, C, D, F, G), שהופקו מתוך חיות מעבדה, ואלה מעורבבים עם חיידקים חשודים בתרבית עד להופעת אגרגציה שמעידה על זיהוי חיובי. להלן השיטה הנפוצה לביצוע סיווג לנספילד בשיטת חרוזי הלטקס ובאמצעות אנזים הפקה: באמצעות כלי מתאים (פיפטה, טפי וכדומה) יש למקם מספר טיפות של אנזים הפקה בתוך מבחנה נקייה. באמצעות מחט בקטריולוגית יש להרים מספר מושבות של חיידקים חשודים, מבודדים, נקיים וטריים מעל צלחת פטרי (24 שעות לאחר זריעה על מצע אגר) ולערבב אותם בעדינות בתוך אנזים ההפקה עד ליצירת תערובת הומוגנית. את המבחנה יש להדגיר במשך 10–15 דקות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס (בפרק זמן זה מזרז אנזים ההפקה את חשיפתם של האנטיגנים הסוכריים על פני הדופן הפפטידוגליקנית, על מנת שיהיו זמינים יותר לחרוזי הלטקס). באמצעות כלי מתאים (פיפטה, טפי וכדומה) יש לערבב בעדינות את התערובת מבלי להקציפהּ ולמקם טיפה אחת על גבי זכוכית נושאת, או מכסה צלחת פטרי. יש למקם טיפה מתוך כל בקבוקון שמסופק בערכה המסחרית, ושמכיל את חרוזי הלטקס המצופים באנטיגנים ייחודיים, ובאמצעות מחט בקטריולוגית, או קיסם עץ נקי, יש לערבב בעדינות את שתי הטיפות. אם כעבור מספר שניות ניתן להבחין בהיווצרות אגלוטינציה כנגד קבוצת לנספילד אחת ספציפית, אזי התרחש זיהוי מדויק של אותה הקבוצה. אם כעבור למעלה מדקה לא ניתן להבחין בהיווצרות אגלוטינציה כנגד קבוצת לנספילד ספציפית, אזי לא מדובר בחיידק אשר שייך לאחת הקבוצות שנבדקו. יש לציין כי קיימות ערכות מסחריות בהן מחליפים ריאגנטים כימיים את אנזים ההפקה. שימוש בריאגנטים אלה חוסך את זמן ההדגרה של התערובת באינקובטור. להלן ההערות לביצוע סיווג לנספילד בשיטת חרוזי הלטקס: הופעת אגלוטינציה כנגד קבוצת לנספילד אחת ספציפית מעידה על זיהוי מדויק, אולם קבלת אגלוטינציה כנגד מספר קבוצות לנספילד במקביל אינה מעידה על זיהוי מדויק, אלא על תגובה בלתי ספציפית אשר יכולה לנבוע מגורמים שונים, כאשר השכיחים ביותר הם: גיל המושבות הנבדקות ו/או איסוף של מספר מיני חיידקים למבחן באמצעות המחט הבקטריולוגית. לפיכך לא מומלץ להשתמש במושבות חיידקים מעבר ל-24 שעות אחרי הזריעה על מצעי האגר, שכן תהליכי ההזדקנות במושבה עלולים להוביל לקבלת תוצאות שגויות חיוביות (False positive). שימוש במושבות מעבר ל-24 שעות מעלה גם את הסבירות לקבלת תוצאות שגויות שליליות (False negative). אין לחכות להתייבשות הטיפות בעת ביצוע המבחן, שכן התייבשות הטיפות תגרום להופעת משקעים שעלולים להוביל לפענוח שגוי של המבחן כחיובי. ייתכן מצב שבו לא ניתן יהיה לראות בבירור את תוצאות האגלוטינציה. הסיבה לכך נובעת, על פי רוב, מלקיחה דלה מדי של המושבות החשודות מהאגר. במצב זה יש להיעזר בזכוכית מגדלת. מינים שונים של חיידקים, שאינם שייכים למשפחת ה-Streptococcaceae, עלולים לתת תוצאת אגלוטינציה בלתי ספציפית שתתפרש כחיובית שגויה במידה ויבדקו בשיטת לנספילד. מבין חיידקים אלה ניתן למנות את הבאים: Escherichia coli, מיני Klebsiella ו-Pseudomonas וכן החיידק Listeria monocytogenes (שעלול לתת תגובה חיובית עם נוגדנים כנגד קבוצה B ו/או G). לפיכך אין להשתמש בסיווג זה מחוץ למשפחת Streptococcaceae (למעט חיידקי Enterococcaceae) ובמידת הצורך יש לשלול חיידקים אשר דומים ל-Streptococcaceae בתרבית, טרם ביצוע מבחן הסיווג, באמצעות שיטות ביוכימיות (דוגמת מבחן קטלאז), ו/או צביעת גראם. לסיווג לנספילד מספר חסרונות בולטים. העדר רזולוציה מספקת - את מרבית החיידקים ששייכים למשפחת ה-Streptococcaceae לא ניתן לאפיין לרמת המין על ידי ביצוע סיווג לנספילד, היות שקיימים מספר מינים שחולקים אנטיגנים סוכריים זהים. כך למשל החיידק Streptococcus dysgalactiae עלול להכיל אנטיגנים סוכריים מקבוצה A, C, G ו-L ואילו החיידק Streptococcus anginosus עלול להכיל אנטיגנים סוכריים מקבוצה A, C, G ו-F. סטרפטוקוקים מחוץ לסיווג לנספילד - החיידקים Streptococcus pneumoniae, ‏Streptococcus mitis ו-Streptococcus mutans אינם מכילים אנטיגנים סוכריים ייחודיים על גבי הדופן שלהם ולפיכך אינם ניתנים לסיווג בשיטת לנספילד כלל. על מנת להתגבר על החסרונות הללו יש צורך לבצע מבחנים ביוכימיים נוספים, או מולקולריים על מנת לזהות את המין הספציפי של החיידק. להלן הסיווג של חיידקי משפחת Streptococcaceae ו-Enterococcaceae לפי שיטת לנספילד: Streptococcus מבחן CAMP סיווג לנספילד בשיטת חרוזי לטקס באמצעות ריאגנטים כימיים של חברת Thermo Fisher Scientific, סרטון באתר יוטיוב Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller. Medical microbiology (5th ed.), 2005. Elsevier Mosby. p.237. ISBN 978-0323033039. ‏Lancefield grouping of clinically relevant beta-hemolytic streptococci. Lancefield RC. (1933). A Serological differentiation of human and other groups of hemolytic Streptococci. The Journal of Experimental Medicine. 31;57(4):571-95. PMID 19870148. Karl H. Schleifer, Renate Kilpper-Bälz. (1984). Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 34:31-34. DOI:10.1099/00207713-34-1-31. ‏ Thermo Fisher Scientific - Streptococcal grouping kit. ‏Hardy Diagnostics - StrepPRO™ grouping kit. Infections due to the Streptococcus anginosus (Streptococcus milleri) group. Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller. Medical microbiology (5th ed.), 2005. Elsevier Mosby. p.250. ISBN 978-0323033039. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer KH., Stackebrandt E. The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria, Volume 4 (3rd ed.). 2006. Springer, p.110. ISBN 978-038725494. ‏Taxonomic Listing of Bacteria. Jorgensen JH., Pfaller MA., Carrol KC., Landry ML., Funke G., Richter SS., Warnock DW. Manual of Clinical Microbiology (11th ed.). ASM Press. 2015. p.384. ISBN 978-1-555817381. Kromker V., Reinecke F., Paduch JH., Grabowski N. (2014). Bovine Streptococcus uberis Intramammary Infections and Mastitis. Clinical Microbiology: open Access. 3(4)1-7. Calandra GB, Nugent KM, Cole RM. (1975). Preparation of protoplasts of group H streptococci (Streptococcus sanguis). Applied Microbiology. 29(1):90-3. PMID 803288. Stephen Berger. GIDEON Guide to Medically Important Bacteria. GIDEON Informatics, Inc, Los Angeles, California, USA. 2015, pp.1668, 1674. ISBN 978-1498804295. Williams RE. (1956). Streptococcus salivarius (vel hominis) and its relation to Lancefield's group K. The Journal of Pathology and Bacteriology. 72(1):15-25. PMID 13367973. Tomida J, Sauer S, Morita Y, Ezaki T, Kawamura Y. (2011). Streptococcus fryi sp. nov., a novel species with Lancefield group M antigens. FEMS Microbiology Letters. 314(1):95-100. PMID 21091531. Shattock PM, Mattick AT. (1943). The serological grouping of Streptococcus lactis (group N) and its relationship to Streptococcus faecalis. The Journal of Hygiene. Sep;43(3):173-88. PMID 20475672. Stephen Berger. GIDEON Guide to Medically Important Bacteria. GIDEON Informatics, Inc, Los Angeles, California, USA. 2015, p.955. ISBN 978-1498804295. Marth EH., Mitscherlich E. Microbial survival in the Environment - Bacteria and Rickettsiae Important in Human and Animal Health (1st ed.). 1984. Springer-Verlag. p.498. ISBN 978-3642699764. Patel R, Keating MR, Cockerill FR 3rd, Steckelberg JM. (1993). Bacteremia due to Enterococcus avium. Clinical Infectious Diseases. 17(6):1006-11. PMID 8110922. Stephen Berger. GIDEON Guide to Medically Important Bacteria. GIDEON Informatics, Inc, Los Angeles, California, USA. 2015, p.711. ISBN 978-1498804295. Gottschalk M. (2004). Porcine Streptococcus suis strains as potencial source of infections in humans: an underdiagnosed problem in North America?. Journal of Swine Health and Production. 12(4):197-199.