ריצוף SOLiD

ריצוף SOLiD (באנגלית: Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection; ריצוף באמצעות קשירה וזיהוי של אוליגונוקלאוטידים) היא טכנולוגיית Next Generation לריצוף DNA שפותחה על ידי Applied Biosystems והייתה זמינה מסחרית מאז 2008. טכנולוגיה זו משתמשת בקידוד דו בסיסי (2 base encoding) על מנת לרצף ולא על ידי סינתיזה ומאפשרת הפקה של כ-100 ריצופים בקריאה אחת. שיטה זו, יחד עם שיטות דומות אחרות (כגון Roche-454 pyrosequencing ו-Solexa system), הוזילה משמעותית את עלויות הריצוף. העלות ירדה מ־0.01 דולר לבסיס בשנת 2004 לכמעט פי 100 פחות בשנת 2006. יתרה מזאת, קיבולת הריצוף גדלה מ-1,000,000 בסיסים למכונה ליום בשנת 2004 ליותר מ-5,000,000,000 בסיסים למכונה ליום בשנת 2009. בנוסף, קיימים למעלה מ-30 פרסומים שמתארים את השימוש בה לראשונה: בהצבת נוקלאוזום מפרסום של Valouev et al, אנליזת ביטוי גנים ברמת השעתוק של תאי גזע מפרסום של Cloonan et al, אנליזה של תעתיק שלם של תא בודד מפרסום של Tang et al ולבסוף ריצוף מחדש של גנים אנושיים מפרסום של McKernan et al. אולם שיטה זו ושיטות דומות לה (כלומר שמבוססות על ריצוף על ידי ליגציה) דווחו כבעלי בעיות בריצוף של רצפים פלינדרומים. כאמור, שיטה זו מבוססת על ריצוף קידוד דו בסיסי. קידוד זה מתבסס על ליגציה, זיווג בסיסים. הרעיון מאחורי השיטה הוא שבהינתן רצף נוקליאוטידים שברצוננו לרצף, תתבצע היברידיזציה בינו לבין אוליגונוקליאוטיד (פרוב) בעל תבנית ידועה באורך 8 בסיסים כך שבכל פעם ירוצפו 2 נוקליאוטידים (למשל: *-AANNNZZZ, כאשר N= יכול להיות כל אחד מ-4 הבסיסים, Z= מייצג בסיס לא ספציפי וה* מייצגת פלואורסצנציה). התבנית מאפשרת למעשה את ההיברידיזציה של בדיוק 2 בסיסים באופן הבא - חלק הNNN מאפשר את הליגציה של 2 הבסיסים ב-256 קומבינציות אפשריות של אותם 2 בסיסים ואחריהם 3 בסיסים כלשהם (4*4*4*4 = NN*N*N*N, כאשר אנו לא מתייחסים לפרמוטציה הפנימית של 2 הבסיסים). חלק ה-ZZZ הם נוקליאוטידים לא ספציפיים, כך שהם יעזרו להתחברות אבל הם לא ספציפיים לנוקליאוטידים כלשהם, וגם הם אילו שקשורים למולקולת הפלואורסצנציה. כפי שניתן לראות בשני האיורים המצורפים משמאל, ישנן 16 פרמוטציות אפשריות של זוג בסיסים לריצוף, ולכל פרמוטציה יש צבע פלואורסצנטי תואם (אדום, כחול, ירוק או צהוב) או במילים אחרות - לכל צבע יש 4 פרובים מתאימים. התהליך של שיטה זו מחולק לארבעה שלבים: בהינתן דגימת דנ"א שהיא רצף המטרה שברצוננו לרצף, מכינים ספריית מקטעים בעזרת פרגמנטציה (יצירת מקטעי דנ"א מדגימת הדנ"א) על ידי שיטות שונות כמו: Nebulization, Sonication או Digestion. הטכנולוגיה מאפשרת שני סוגי ספריות - ספריות רצף יחיד (Single Fragment Library) וספריות דו-רצפים (Mate-Paired Library). כל מקטע דנ"א יהיה מחובר לאדפטורים,P1 וP2, הראשון בתחילת המקטע והשני בסוף המקטע, והם למעשה רצפי נוקליאוטידים ידועים שבהמשך יעזרו להבין מה היא נקודת ההתחלה והסוף של רצף המטרה. הכוונה בMate-Paired Library היא שיש אפשרות למקבל את הריצוף כך ששני מקטעי רצפים באורכים ידועים יהיו מחוברים לשלושה אדפטרים. לבסוף, בספריה משתמשים כדי להכין אוכלוסיות בידיים משובטים בשלב הבא. כל ביד מורכב מהרבה מקטעי דנ"א שמשלימים לאדפטור P1 מה שכמובן מאפשר את ההיברידיזציה בין הביד לבין מקטעי הדנ"א שהכנו בשלב הקודם. כמות הבידים גדולה בהרבה מכמות מקטעי הדנ"א - מה שמאפשר ברמה הסטטיסטית שכל מקטע דנ"א יקשר לביד משלו. לאחר מכן, מתבצע PCR על כל ביד, כך שכל ביד יהיה משובט באותו מקטע דנ"א. מתוך כל הבידים מסננים החוצה את הבידים הריקים שלא נקשרו למקטע דנ"א כך שנשאר רק עם הבידים שכן התחברו למקטע דנ"א ועברו הכפלה בPCR. מהלך זה נעשה על ידי הוספה של בידיים שעשויים מפוליסטרין שנקשרים לאדפטר P2 (כך אוספים את הבידים הנחוצים) ובצנטריפוגה מסננים את הבידים הריקים. בשלב זה פרימר נקשר לאדפטר P1 ואחריו נקשר הפרוב בתבנית של אחת מ-256 האפשרויות. לאחר מכן, אנזים ליגאז מחבר את הקשרים הכימיים בין הפרוב למקטע רצף המטרה במידה ותואמים. ואז חיישן קולט, מודד ומקליט את הפלואורסצנציה שנוצרה באותו חיבור על פי מולקולת הפלואורסצנציה שקשורה לחלק הZZZ של הפרוב. לאחר מכן, חלק הZZZ של הפרוב נחתך מה שמאפשר לפרוב הבא להתחבר בליגציה. וכך נעשה פרוב אחר פרוב עד סוף מקטע הדנ"א. את שלב זה מבצעים חמש פעמים בסה"כ, כאשר בארבע הפעמים הבאות הפרימר מתקזז בבסיס אחד בכל פעם. זאת משום שיש לנו מדד פלואורסצנציה עבור כל נוקליאוטיד חמישי (עקב חלק הNNN בכל פרוב). ניתוח רצף המטרה מתבצע על ידי קידוד דו-בסיסי. בעזרת הטבלה של צבעי הבסיסים והידיעה של רצף האדפטור P1 ניתן לנתח את רצף המטרה בסיס אחרי בסיס. כדי לוודא שאכן זהו רצף המטרה, ניתן לנתח באותו אופן גם מהצד של האדפטור P2. אחד החסרונות הידועים של השיטה הוא ברצפים פלינדרומים. הדבר מתבטא כאשר הרצף הפלינדרומי הוא חד גדילי ואז יש לו נטייה להתחבר לעצמו וליצור לולאות, Stem-loops. כך הפרובים לא יוכלו להקשר למקטעי רצפים אילו ולא יהיה ניתן לרצף אותם. חסרון נוסף הוא אם וכאשר ישנה טעות אחת בשלב הריצוף (שלב הליגציה) אז תוצאת ניתוח הרצף תהיה שונה לגמרי מרצף המטרה המקורי, משום שכל ניתוח של בסיס תלוי בניתוח של הבסיס הקודם וצבעו. פלטפורמת SOLiD מניבה 60 ג'יגה-בסיסים של נתוני דנ"א בכל ריצה. בשל מערכת הקידוד הדו-בסיסי הטכנולוגיה מציעה 99.94% של דיוק. בנוסף, טכנולוגיה זו אינה מונעת על ידי הומופולימרים בניגוד למערכת Roche 454 FLX ולכן אזורים חוזרניים גדולים וקשים של הומופולימרים הם כבר לא בעיה לרצף. ריצוף גנום שלם ביטוי גנים Targeted Resequencing ניתוח Small RNA ChIP ההבדלים היחידים בתהליך ריצוף SOLiD עבור כל יישום הם בשלב הראשון של הכנת ספריית קטעי הדנ"א ובשלב האחרון של ניתוח הנתונים. אילומינה Valouev, Anton; Ichikawa, Jeffrey; Tonthat, Thaisan; Stuart, Jeremy; Ranade, Swati; Peckham, Heather; Zeng, Kathy; Malek, Joel A.; Costa, Gina; McKernan, Kevin; Sidow, Arend. "A high-resolution, nucleosome position map of C. elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning". Genome Research. 18 (7): 1051–1063. doi:10.1101/gr.076463.108. ISSN 1088-9051. PMC 2493394. PMID 18477713. Cloonan, Nicole; Forrest, Alistair R. R.; Kolle, Gabriel; Gardiner, Brooke B. A.; Faulkner, Geoffrey J.; Brown, Mellissa K.; Taylor, Darrin F.; Steptoe, Anita L.; Wani, Shivangi; Bethel, Graeme; Robertson, Alan J. "Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing". Nature Methods. 5 (7): 613–619. doi:10.1038/nmeth.1223. ISSN 1548-7105. PMID 18516046. Tang, Fuchou; Barbacioru, Catalin; Wang, Yangzhou; Nordman, Ellen; Lee, Clarence; Xu, Nanlan; Wang, Xiaohui; Bodeau, John; Tuch, Brian B.; Siddiqui, Asim; Lao, Kaiqin. "mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell". Nature Methods. 6 (5): 377–382. doi:10.1038/nmeth.1315. ISSN 1548-7105. PMID 19349980. McKernan, Kevin Judd; Peckham, Heather E.; Costa, Gina L.; McLaughlin, Stephen F.; Fu, Yutao; Tsung, Eric F.; Clouser, Christopher R.; Duncan, Cisyla; Ichikawa, Jeffrey K.; Lee, Clarence C.; Zhang, Zheng. "Sequence and structural variation in a human genome uncovered by short-read, massively parallel ligation sequencing using two-base encoding". Genome Research. 19 (9): 1527–1541. doi:10.1101/gr.091868.109. ISSN 1088-9051. PMC 2752135. PMID 19546169. Huang, Yu-Feng; Chen, Sheng-Chung; Chiang, Yih-Shien; Chen, Tzu-Han; Chiu, Kuo-Ping. "Palindromic sequence impedes sequencing-by-ligation mechanism". BMC Systems Biology. 6 (Suppl 2): S10. doi:10.1186/1752-0509-6-S2-S10. ISSN 1752-0509. PMC 3521181. PMID 23281822.