SiRNA

RNA התערבותי קטן (siRNA), המכונה לעיתים RNA התערבותי קצר או משתיק RNA הוא סוג של מולקולת RNA דו גדילי, 20-25 זוגות בסיסים באורכו. siRNA ממלא תפקידים רבים, אבל בולט ביותר במסלול ההפרעה ל-RNAi) RNA), שבו הוא מפריע לביטוי של גנים ספציפיים עם רצף נוקליאוטידים משלים. siRNA פועל גם במסלולים הקשורים ל-RNAi, למשל, כמנגנון נגיפי או בעיצוב מבנה הכרומטין של הגנום. המורכבות של המסלולים האלה נחקרת ומתגלת רק בזמן האחרון. siRNA ותפקידם בהשתקת גנים לאחר תעתיק (PTGS) בצמחים נתגלה לראשונה על ידי הצוות של דייוויד פאולקומב במעבדת סנסבורי בנוריץ', אנגליה ודווחו ב-Science בשנת 1999. תומאס תסקל ועמיתיו דיווחו ב-Nature כי siRNA מלאכותי יכול לגרום ל-RNAi בתאי יונקים. גילוי זה הוביל לפריצת דרך בעניין רתימת RNAi למחקר ביורפואי ופיתוח תרופות. יש ל-siRNA מבנה מוגדר היטב: RNA קצר (בדרך כלל 20–24 זוג בסיסים) דו-גדילי (dsRNA) עם זרחון של קצוות 5' והידרוקסילציה של קצוות 3' ושני נוקלאוטידים בולטים. אנזים הדייסר (Dicer) מזרז ייצור של siRNA מ-RNA דו-גדילי ארוך (dsRNA). מאחר שבאופן עקרוני siRNA מלאכותי עם רצף משלים יכול להשתיק כל גן, הוא נחשב לכלי חשוב לאימות תפקוד הגן ולמיקוד תרופות. לעיתים טרנספקציה של siRNA אקסוגני במטרה לגרום להשתקת גנים לא גורמת להשתקה, גם לא זמנית, בעיקר בתאים המתחלקים מהר. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי יצירת וקטור ביטוי ל-siRNA. בפלסמיד, רצף ה-siRNA משתנה, אך הוא צריך ליצור לולאה קצרה שבין שני הגדילים. תוצאת השעתוק של הרצף היא מולקולת shRNA, אשר יכולה להיות מעובדת ל-siRNA פונקציונלי על ידי האנזים Dicer. קסטות שעתוק אופייניות משתמשות בפרומוטר של RNA polymerase III (למשל U6 או H1) כדי לכוון את השעתוק של RNA גרעיני קטן (snRNAs)(ה-U6 מעורב בשחבור גנים, H1 הוא רכיב RNase של RNase P של האדם). הפעילות של siRNA ב-RNAi תלויה במידה רבה ביכולתו להיקשר לגורם ההשתקה המורכב של RISC) RNA). לאחר היקשרות דופלקס siRNA ל-RISC הוא נבקע לשני גדילים בודדים על ידי אנזים הנאנדונקלזס. רק אחד הגדילים נקשר ל-RISC, ואז כל הקומפלקס נקשר ל-mRNA הרצוי ומשתיק אותו (ההתבטאות של הגנים הוא מקודד). dsRNA יכול גם להפעיל את ביטוי הגנים, מנגנון שזכה לכינוי "הפעלת גנים מושרה של RNA קטן" (RNAa). הוכח כי dsRNA שמטרתו היא פרומוטרים של גנים מעורר הפעלת שעתוק חזקה של הגנים הקשורים. RNAa הודגם בתאי אדם בעזרת dsRNA מלאכותי, המכונה "RNA משפעל קטן" (saRNA). בשלב זה לא ידוע אם RNAa מבוטא גם באורגניזמים אחרים. היות ש-RNAi מצטלב במסלולים רבים, אין זה מפתיע שבמקרה אנו מעוררים תופעות בלתי רצויות במהלך קידום המחקר של siRNA. כאשר תאים של יונקים פוגשים RNA דו גדילי, כגון siRNA, התא עלול לטעות ולטפל בו כנגיף, וכך לגרום לתגובה חיסונית. בנוסף, כיוון ש-microRNA מווסת התבטאות גנים על ידי אינטראקציות משלימות של זוג בסיסים עם ה-mRNA הרצוי, החדרת siRNA עלולה לגרום לדיכוי המטרה באופן בלתי צפוי. החדרת הרבה מולקולות של siRNA עלולה לגרום לאירועים בלתי צפויים עקב ההפעלה של מערכת החיסון המולדת. רוב הראיות עד כה מצביעות על כך שזה כנראה תוצאה של הפעלת חיישן ה-PKR של ה-dsRNA, על אף שגן חומצה רטינואית מושרה (RIG-I) יכול להיות מעורב גם. האינדוקציה של ציטוקינים דרך קולטן TLR7 גם תוארה כסיבה. אחת השיטות המבטיחות להפחתת תופעה זו היא להמיר את ה-siRNA לתוך microRNA. תהליך של microRNA מתרחש באופן טבעי בגוף, ועל ידי רתימת מסלול אנדוגני זה, אמור להיות אפשרי להשיג את אותו דיכוי גנים בריכוזים נמוכים יחסית של siRNA. זה אמור למזער את ההשפעות הלא רצויות. אתגר נוסף לשימוש ב-siRNA לדיכוי גנים הוא פעולתו המוטעית על תאים שיש להם רצף לא משלים וחסימת התבטאות הגנים (למעשה, siRNA פועל כ-miRNA), דבר שמוביל לבעיות בעיבוד הנתונים ורעילות פוטנציאלית. עם זאת, ניתן לטפל בחלק מהבעיה על ידי תכנון ניסויי בקרה מתאימים, ועיצוב siRNA שהוא חופשי מטעיות אלה. נכון ל-2014, טכניקה כזו נמצאת בשלבי פיתוח. בהתחשבות ביכולת ה-siRNA להשתיק כל גן רצוי, פעולתו ב-RNAi יוצרת עניין רב בתחום הביולוגיה הבסיסית. ישנו שימוש הולך וגובר בו לזיהוי גנים חשובים במסלולים ביולוגיים של וירואידים. עם זאת, יישום RNAi באמצעות siRNA בבעלי חיים, במיוחד בני אדם, מציב אתגרים רבים. לפי ניסויים, siRNA מראה יעילות שונה בסוגי תאים שונים באופן שעדיין לא מובן כל כך: תאים מסוימים מגיבים היטב ל-siRNA, בעוד שתאים אחרים לא מראים תגובה ברורה (אפילו שיש טרנספקציה יעילה). MicroRNA וירואיד RNA interference Hannon, G. J.; Rossi, J. J. (2004). "Unlocking the potential of the human genome with RNA interference". Nature 431 (7006): 371–378. Bibcode:2004Natur.431..371H. doi:10.1038/nature02870. PMID 15372045. מדיה וקבצים בנושא SiRNA בוויקישיתוף RNAiAtlas, מאגר נתונים של ספריות siRNA, מטרותיהם וניתוח תוצאות Hamilton A, Baulcombe D (1999). "A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants". Science 286 (5441): 950–2. doi:10.1126/science.286.5441.950. PMID 10542148. Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836): 494–988. doi:10.1038/35078107. PMID 11373684 Bernstein E, Caudy A, Hammond S, Hannon G (2001). "Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference". Nature 409 (6818): 363–6. doi:10.1038/35053110. PMID 11201747 Daneholt, B. (2006). "Advanced Information: RNA interference". The Novel Prize in Physiology or Medicine Li LC (2008). "Small RNA-Mediated Gene Activation". RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Caister Academic Press. isbn=978-1-904455-25-7. Whitehead, K. A.; Dahlman, J. E.; Langer, R. S.; Anderson, D. G. (2011). "Silencing or Stimulation? siRNA Delivery and the Immune System". Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering 2: 77–96. doi:10.1146/annurev-chembioeng-061010-114133. PMID 22432611 Birmingham A, Anderson E, Reynolds A, Ilsley-Tyree D, Leake D, Fedorov Y, Baskerville S, Maksimova E, Robinson K, Karpilow J, Marshall W, Khvorova A (2006). "3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets". Nat Methods 3 (3): 199–204. doi:10.1038/nmeth854. PMID 16489337. Alekseev OM, Richardson RT, Alekseev O, O'Rand MG (2009). "Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP". Reproductive Biology and Endocrinology 7: 45. doi:10.1186/1477-7827-7-45. PMC 2686705. PMID 19439102.