מבחן אוקסידאז

מבחן אוקסידאז (באנגלית: Oxidase test) הוא אחד מהמבחנים הביוכימיים המקובלים במיקרוביולוגיה שמיועד לשם ביצוע הבחנה ראשונית בין סוגים שונים של מיקרואורגניזמים בכלל וחיידקים בפרט. המבחן מתבסס על יכולתו (או אי-יכולתו) של מיקרואורגניזם לחמצן, באמצעות האנזים ציטוכרום C אוקסידאז (Cytochrome C oxidase) תרכובות ארומטיות מסוימות, בהן משתמשים במהלך המבחן, לקבלת שינוי צבע הנראה לעין. את המבחן מבצעים בדרך כלל על גבי רצועות של נייר סופג שספוגות בחומר מחזר (שיטה עקיפה), או בטפטוף ישיר של החומר המחזר על גבי מושבה (שיטה ישירה). מבחן אוקסידאז כשלעצמו אינו מספיק, במרבית המקרים, כדי לקבוע בצורה חד משמעית את סוג המיקרואורגניזם הנבדק. אולם שילובו עם מבחנים ביוכימיים נוספים (מבחן קטלאז, מבחן אוראז, מבחן קואגולאז ועוד) מעלה את יכולת הזיהוי של הסוגים. אנזימי אוקסידאז הם קבוצה של אנזימים שמזרזים תגובות חמצון-חיזור בתאים. ציטוכרום C אוקסידאז הוא אנזים מרכזי בשרשרת מעבר האלקטרונים במיטוכונדריה של יצורים איקריוטיים ועל גבי קרום התא של יצורים פרוקריוטיים, בהם חל חיזור של חמצן למים. אנזימי אוקסידאז מפורסמים נוספים ששייכים לקבוצה הם: מונואמין אוקסידאז, ציטוכרום P450 אוקסידאז וקסנתין אוקסידאז. להלן שתי השיטות הנפוצות לביצוע מבחן אוקסידאז על כל שלביהן. באמצעות כלי מתאים (פיפטה, טפי וכדומה) יש להרטיב את רצועת הנייר הסופג ב-Kovács oxidase reagent ‏(1% TMPD - ‏tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) ולהמתין עד להתייבשותו. באמצעות מחט בקטריולוגית, או קיסם עץ סטרילי יש להרים מושבת חיידקים מבודדת, נקייה וטרייה מעל צלחת פטרי (18-24 שעות לאחר זריעה על מצע אגר) ולמרוח אותה בעדינות על גבי רצועת נייר סופג שספוגה ב-TMPD. יש להמתין לשינוי צבע הנייר. וריאציה אחרת של השיטה העקיפה כוללת רצועות נייר סופג, או דסקיות ספוגים מבעוד מועד ב-TMPD. אם משתמשים בחומרים מסוג זה, תחילה יש להרטיבם במספר טיפות מים מזוקקים, או סליין ומיד אחר כך למרוח את מושבת החיידקים. אם כעבור מספר שניות ניתן להבחין בהופעת צבע כחול-סגול, אזי המיקרואורגניזם שנבדק יקרא אוקסידאז-חיובי. אם כעבור מספר שניות לא ניתן להבחין בהופעת צבע כחול-סגול, אזי המיקרואורגניזם שנבדק יקרא אוקסידאז-שלילי. באמצעות כלי מתאים (פיפטה, טפי וכדומה) יש למקם 1-2 טיפות TMPD, או Gordon and McLeod oxidase reagent ‏(1% DMPD - ‏dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) ישירות על גבי מושבת חיידקים מבודדת, נקייה וטרייה מעל צלחת פטרי (18-24 שעות לאחר זריעה על מצע אגר). יש להמתין לשינוי צבע המושבה. TMPD - אם כעבור מספר שניות ניתן להבחין בהופעת צבע כחול-סגול, אזי המיקרואורגניזם שנבדק יקרא אוקסידאז-חיובי. DMPD - אם כעבור 10-30 דקות ניתן להבחין בהופעת צבע אדום, או לאחר שעה ניתן להבחין בצבע שחור, אזי המיקרואורגניזם שנבדק יקרא אוקסידאז-חיובי. אם כעבור מספר שניות לא ניתן להבחין בהופעת צבע כחול-סגול (TMPD), או כעבור שעה לא ניתן להבחין בהופעת צבע שחור (DMPD), אזי המיקרואורגניזם שנבדק יקרא אוקסידאז-שלילי. יש להשתמש במושבות בנות 18-24 שעות בלבד לאחר זריעה על מצע אגר, שכן מושבות צעירות או זקנות מדי עלולות להוביל לקבלת תוצאות שגויות. אין להשתמש במושבות חיידקים שגדלו על אגרים בהם מתרחש תהליך של תסיסת סוכרים (לדוגמה, אגר MacConkey, אגר TCBS). זאת משום שהתססה של סוכרים גורמת לירידה ברמת החומציות של האגר, וירידה מתחת ל-pH=5.1 תוביל לפגיעה בציטוכרום C אוקסידאז ולקבלת תוצאות שליליות שגויות (False negative). במיקרואורגניזמים להם פעילות אוקסידאז חלשה, יש להמתין 90-120 שניות עד להופעת צבע כחול-סגול (TMPD). אין להמתין מעבר לטווח זמן זה, שכן הדבר עלול להוביל לקבלת תוצאות חיוביות שגויות (False positive). את החומר המחזר יש לשמור בכלי אטום לאור בקירור ואין להשתמש בו מעבר לתאריך התפוגה. את רצועות הנייר הסופג והדסקיות שספוגות בחומר מחזר יש לשמור בכלי אטום לאור. חשיפה ממושכת לאור עלולה לגרום להתפרקות החומר המחזר, דבר שעלול להוביל לקבלת תוצאות שגויות שליליות. חיידקים שמבטאים את האנזים ציטוכרום C אוקסידאז, כחלק משרשרת מעבר האלקטרונים על גבי קרום התא, נעזרים במולקולות ‏NADH בתור תורם אלקטרונים בתהליך. במילים אחרות, מולקולת NADH משמשת כחומר מחזר בתהליך, וציטוכרום C אוקסידאז מזרז את מעבר האלקטרונים הללו. בשלב האחרון של שרשרת מעבר האלקטרונים מעביר ציטוכרום C אוקסידאז את האלקטרונים אל מולקולה קולטת, על פי רוב חמצן, ליצירת מים. במהלך מבחן אוקסידאז תרכובות ארומטיות מחזרות (DMPD, TMPD) תורמות את האלקטרונים ולמעשה מחליפות, בצורה מלאכותית, את מולקולות NADH. התרכובות הארומטיות מהוות אינדיקטורים במהלך המבחן בכך שחמצונם גורם לשינוי בצבעם לכחול-סגול, או לאדום-שחור. כל החיידקים שהם אוקסידאז-חיוביים הם חיידקים אירוביים. אין זה אומר שחיידקים אלה הם אירובים אובליגטוריים. חיידקים שהם אוקסידאז-שליליים לא בהכרח אנאירוביים אובליגטוריים. חיידקים אלה יכולים להיות הן אירוביים והן אנאירוביים, שכן משמעות התוצאה "אוקסידאז-שלילי" רומזת רק שהחיידקים לא מבטאים את האנזים ציטוכרום C אוקסידאז. חיידקים אלה משתמשים, ככל הנראה, באנזימי אוקסידאז אחרים על מנת לזרז את מעבר האלקטרונים בשלב הזרחון החמצוני. להלן רשימה של מספר סוגים שכיחים של חיידקים נפוצים המחולקים לפי מבחן אוקסידאז. מבחן קטלאז זרחון חמצוני מגוון סרטונים המתארים ביצוע של מבחן אוקסידאז באתר Youtube Oxidase test: Principle Procedure and oxidase positive organisms. Oxidase Test Protocol. Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller. Medical microbiology (5th ed.). Elsevier Mosby. 2005, p.14. ISBN 978-0323033039.