טביעת רגל של DNA

טביעת רגל של DNA (באנגלית: DNA footprinting) היא שיטה לחקירת קישור חלבונים ספציפיים לרצף על DNA במבחנה. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד אינטראקציות בין חלבון ל- DNA הן מחוץ לתאים והן בתוך התאים. ויסות השעתוק נחקר רבות, ובכל זאת יש הרבה דברים שלא ידועים. גורמי שעתוק וחלבונים נלווים הקושרים פרומוטורים, אינזימים המקדמים להנעת שעתוק (פקטורי שעתוק) או לדחיקתם הם יסודיים להבנת הוויסות הייחודי של שעתוק ספציפיים בתוך הגנום. טכניקות כמו טביעת רגל של DNA מסייעות להבהיר אילו חלבונים נקשרים לאזורי ה-DNA הקשורים ועוזרות לפענח את מורכבות השליטה בשעתוק. בשנת 1978 פיתחו דייוויד גלאס ואלברט שמיץ את טכניקת טביעת הרגל ב- DNA כדי לחקור את הספציפיות הקושרת של חלבון הדיכאון הלאק. במקור זה היה שינוי בטכניקת הרצף הכימי של מקסם-גילברט. היישום הפשוט ביותר של טכניקה זו הוא להעריך אם חלבון נתון נקשר לאזור העניין בתוך מולקולת DNA. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מגבירה (מכפילה) ומתייגת את אזור העניין המכיל אתר קישור לחלבונים פוטנציאלי, באופן אידיאלי אורך המקטע להגברה הוא בין 50 ל 200 זוגות בסיס. מוסיפים את החלבון הפוטנציאלי לחלק מ- DNA התבנית שהוגבר וחלק משאירים ללא חלבון, לשם השוואה מאוחרת יותר. מוסיפים חומר המעכל DNA ל2 המבחנות (עם וללא החלבון). חומר זה הוא כימיקל או אנזים שיחתוך במקומות אקראיים באופן עצמאי ברצף. התגובה צריכה להתרחש מספיק זמן כדי לחתוך כל מולקולת DNA במקום אחד בלבד. חלבון הקושר אזור באופן ספציפי בתוך תבנית ה- DNA יגן על ה- DNA אליו הוא קשור מפני חומר המחשוף. מריצים את שתי הדגימות זו לצד זו על ידי אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד. החלק של תבנית ה- DNA ללא חלבון ייחתך במקומות אקראיים, וכך כאשר הוא מופעל על ג'ל, ייצור חלוקה כמו סולם לא יהיה "חורים" חלקים ריקים בסולם. תבנית ה- DNA עם החלבון תביא להפצת סולם עם שבירה בתוכו מקטעים ריקים/חסרים, זוהי - "טביעת הרגל", באזורים אלו ה- DNA מפני החומר המעכל. הערה: ניתן להריץ רצף DNA כימי של מקסם-גילברט לצד הדגימות על ג'ל הפוליאקרילאמיד כדי לאפשר חיזוי של המיקום המדויק של אתר קשירת הליגנד. תבנית ה- DNA מתוייגת בקצה 3 'או 5', תלוי במיקום האתר / ים הקישור לתווית. תוויות שניתן להשתמש בהן הן: רדיואקטיביות (radioactivity) ותווית זרחנית (fluorescence) . לרוב משתמשים בתווית רדיואקטיביות לתיוג שברי DNA לניתוח טביעת רגליים (DNA footprinting), שכן השיטה פותחה במקור מטכניקת הרצף הכימי של מקסם-גילברט. תיוג רדיואקטיבי רגיש מאוד ואופטימלי להדמיית כמויות קטנות של DNA. תיוג פלואורסצנטי הוא שיטה מתקדמת יותר העדיפה בשל הסכנות שבשימוש בכימיקלים רדיו. עם זאת, לעיתים קשה יותר להשתמש בשיטה הפלואורסצנטית מכיוון שהיא לא תמיד רגישה מספיק בכדי לזהות את הריכוזים הנמוכים של גדילי ה- DNA המשמשים בניסויים לזיהוי טביעת רגל DNA. ניתן לבחור במגוון ריאגנטים לחיתוך. ריאגנט רצוי הוא נייטרלי ברצף, קל לשימוש וקל לשליטה. אין ריאגנטים זמינים העומדים בכל התקנים הללו, כך שניתן לבחור סוכן מתאים, בהתאם לרצף ה- DNA והליגנד שמעניין אותך. ריאגנטים החיתוך הבאים מתוארים בפירוט: DNase I הוא חלבון גדול המתפקד כ-אנדונוקלא'ז (באנגלית:endonuclease) כפול גדיל. הוא קושר את התעלה הקטנה של ה- DNA ומבקע את עמוד השדרה הפוספודיאסטר. זהו ריאגנט חיתוך טוב לטביעת רגל של DNA (באנגלית:DNA footprinting) מכיוון שגודלו מאפשר לעכב אותו פיזית בקלות. לפיכך סביר יותר שהפעולה שלו תחסם על ידי חלבון קשור ברצף DNA. בנוסף, אנזים DNase I נשלט בקלות על ידי הוספת EDTA כדי לעצור את התגובה. עם זאת ישנן מגבלות בשימוש ב- DNase I. האנזים אינו חותך DNA באופן אקראי; פעילותו מושפעת ממבנה ה- DNA והרצף המקומי ולכן מביאה ליצירת סולם לא אחיד. זה יכול להגביל את הדיוק של חיזוי אתר הקישור של חלבון למולקולת ה- DNA. צורת חיתוך נוספת היא על ידי שימוש ברדיקלים של הידרוקסיל הנוצרים מתגובת פנטון, הכוללת חיזור Fe2 + עם H2O2 ליצירת מולקולות הידרוקסיל חופשיות. מולקולות הידרוקסיל אלה מגיבות עם עמוד השדרה של ה- DNA, וכתוצאה מכך הוא נשבר. בשל גודלם הקטן, לטביעת הרגל המתקבלת על ידי ה- DNA יש רזולוציה גבוהה. בניגוד ל- DNase I אין להם תלות ברצף וגורמים לסולם המופץ בצורה הרבה יותר שווה. ההיבט השלילי של שימוש ברדיקלים של הידרוקסיל כריאגנט חיתוך הוא שהם משתמשים זמן רב יותר בגלל תגובה איטית יותר. שיטת חיתוך נוספת היא להשתמש בהקרנה אולטרה סגולה (UV) לריגוש חומצות גרעין וליצירת פעולות פוטו (באנגלית:Photoreactions), מה שמביא לבסיסים פגומים בגדיל ה- DNA. פעולות פוטו יכולות לכלול: הפסקות של גדילים בודדים, אינטראקציות בין גדילי DNA או בתוכו, תגובות עם ממיסים, או קישורים צולבים עם חלבונים. לתהליך העבודה של שיטה זו יש שלב נוסף, לאחר שטופלו גם ה- DNA המוגן והלא מוגן שלך, מבצעים PCR לגדילים החתוכים. ההכפלה תסתיים עם הגעה לבסיס פגום, וכך כאשר תוצרי ה- PCR מופעלים זה לצד זה על ג'ל; רצף ה- DNA המוגן יראה רצועה נוספת שבה היה ה- DNA מקושר בין חלבון קשור. היתרונות בשימוש ב- UV הם שהוא מגיב מהר מאוד ולכן יכול לתפוס אינטראקציות שרק רגעיות. בנוסף זה יכול להיות מיושם על ניסויים in vivo, כי UV יכול לחדור קרומי תאים כך שניתן להשתמש בתאים שלמים ולא רק בDNA נקי (in vivo). חסרון הוא שקשה לפרש את הג'ל, מכיוון שהחלבון הקשור אינו מגן על ה- DNA, הוא רק משנה את פעולות התצלום בסביבה. טביעת רגל in vivo היא טכניקה המשמשת לניתוח האינטראקציות בין חלבון ל- DNA המתרחשות בתא בנקודת זמן נתונה. DNase I יכול לשמש כריאגנט חיתוך אם קרום התא היה פגוע. עם זאת ריאגנט החיתוך הנפוץ ביותר המשמש הוא הקרנת UV מכיוון שהוא חודר לקרום התא מבלי לשבש את מצב התא (אין צורך בפגיעה בממברנה התא) וכך ניתן לבצע אינטראקציות בהתאם לשינויים תאיים. ברגע ש- DNA נפגע על ידי UV, ניתן לסנן את התאים ולטהר את ה- DNA לצורך ניתוח אזור מעניין. PCR בתיווך תיוג היא שיטה חלופית לטביעת רגל תוך תאית. לאחר שנעשה שימוש בריאגנט חיתוך על ה- DNA הגנומי, וכתוצאה מכך מתקבלים גדילים בודדים, וה- DNA מבודד, הקישור של החלבון הנוסף על נקודות השבירה. מהווה את האזור המוגבר בין המקשר לפריימר ספציפי לגן, וכאשר מריצים אותו על ג'ל פוליאקרילאמיד, תהיה לו טביעת רגל במקום בו נקשר חלבון. ניתן להשתמש בטביעת רגל תוך תאית בשילוב עם אימונופרסיפיטציה (באנגלית:immunoprecipitation) כדי להעריך את הספציפיות לחלבון במקומות רבים ברחבי הגנום. את ה- DNA הקשור לחלבון העניין משקיעים ביחד עם נוגדן לחלבון זה (אימונופרסיפיטציה), ואז ניתן להעריך את קשירת האזור הספציפי באמצעות טכניקת טביעת הרגל של ה- DNA. ניתן לשנות את טכניקת טביעת הרגל של ה- DNA כדי להעריך את חוזק הקישור של חלבון לאזור של DNA. באמצעות ריכוזים משתנים של החלבון לניסוי טביעת רגל, ניתן לראות את מראה טביעת הרגל כאשר הריכוזים גדלים ואז ניתן לאמוד את הזיקה המחייבת חלבונים. כדי להתאים את טכניקת טביעת הרגל לשיטות זיהוי מעודכנות, שברי ה- DNA המסומנים מזוהים על ידי מכשיר אלקטרופורזה נימי במקום על ידי הרצה בג'ל פוליאקרילאמיד. אם קטע ה- DNA המיועד לניתוח מיוצר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), פשוט לקשר בין מולקולה פלואורסצנטית כמו קרבוקסיפלואורסצ'ין (FAM) לפריימרים. בדרך זו, השברים המיוצרים על ידי עיכול DNaseI יכילו FAM ויהיו ניתנים לזיהוי על ידי מכונת האלקטרופורזה הנימית. בדרך כלל, תקני גודל עם תווית carboxytetramethyl-rhodamine (ROX) מתווספים גם לתערובת השברים שניתחו. אתרי קישור לפקטורי שעתוק זוהו בהצלחה בדרך זו. ריצוף הדור הבא, ריצוף מתקדם (Next-generation sequencing) אפשר גישה רחבה לגנום לזיהוי טביעת רגל DNA. מבחני כרומטין פתוחים כגון DNase-Seq ו- FAIRE-Seq הוכיחו שהם מספקים את המיפוי של פקטורים רגולטורים עבור סוגי תאים רבים. עם זאת, מבחנים אלה דורשים כמה ניתוחים ביואינפורמטיקה במורד הזרם על מנת לספק עקבות DNA של הגנום. ניתן לסווג את כלי החישוב המוצעים בשתי מחלקות: גישות מבוססות פילוח (segmentation-based) ומוקדות אתרים . שיטות מבוססות פילוח מבוססות על יישום מודלים של מרקוב מוסתר או שיטות חלון הזזה כדי לפלח את הגנום לאזור כרומטין פתוח / סגור. דוגמאות לשיטות כאלה הן: HINT, שיטת Boyle ושיטת Neph . לעומת זאת, שיטות ממוקדות אתרים, מוצאות טביעות רגל בהתחשב בפרופיל הכרומטין הפתוח סביב אתרי קשירה הנחזים-למוטיב (motif-predicted), כלומר אזורים רגולטוריים שנחזו באמצעות מידע מקדים על רצף DNA- חלבון (מקודדים במבנים כגון מטריצת משקל מיקום). דוגמאות לשיטות אלה הן שיטת CENTIPEDE ו- Cuellar-Partida. נוקלאוזום קוד היסטונים HINT Website CENTIPEDE Website Galas, D; Schmitz, A (1978). "DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity". Nucleic Acids Research. 5 (9): 3157–70. doi:10.1093/nar/5.9.3157. PMC 342238. PMID 212715. Hampshire, A; Rusling, D; Broughton-Head, V; Fox, K (2007). "Footprinting: A method for determining the sequence selectivity, affinity and kinetics of DNA-binding ligands". Methods. 42 (2): 128–140. doi:10.1016/j.ymeth.2007.01.002. PMID 17472895. LeBlanc B and Moss T. (2001) DNase I Footprinting. Methods in Molecular Biology. 148: 31–8. Zaychikov E, Schickor P, Denissova L, and Heumann H. (2001) Hydroxyl radical footprinting. Methods in Molecular Biology. 148: 49–61. Becker, M.M.; Wang, J.C. (1984). "Use of Light for Footprinting DNA in vivo". Nature. 309 (5970): 682-687. doi:10.1038/309682a0. Axelrod, J.D.; Majors, J (1989). "An Improved Method for Photofootprinting Yeast Genes In Vivo Using Taq Polymerase". Nucleic Acids Res. 17 (1): 171-183. doi:10.1093/NAR/17.1.171. PMC 331543. Becker, M.M.; Wang, Z.; Grossmann, G.; Becherer, K.A. (1989). "Genomic Footprinting in Mammalian Cells With Ultraviolet Light". PNAS. 86 (14): 5315-5319. doi:10.1073/PNAS.86.14.5315. Geiselmann J and Boccard F. (2001) Ultraviolet-laser footprinting. Methods in Molecular Biology. 148:161-73. Becker, M.M.; Wang, J.C. (1984). "Use of Light for Footprinting DNA in vivo". Nature. 309 (5970). doi:10.1038/309682a0. Ephrussi, A.; Church, G.M.; Tonegawa, S.; Gilbert, W. (1985). "B Lineage-Specific Interactions of an Immunnoglobulin Enhancer With Cellular Factors In Vivo". Science. 227 (4683): 134-140. doi:10.1126/science.3917574. Dai S, Chen H, Chang C, Riggs A, Flanagan S. (2000) Ligation-mediated PCR for quantitative in vivo footprinting. Nature Biotechnology. 18:1108–1111. Zaret, K (1997). "Editorial". Methods. 11 (2): 149–150. doi:10.1006/meth.1996.0400. PMID 8993026. Kovacs, Krisztian A.; Steinmann, Myriam; Magistretti, Pierre J.; Halfon, Olivier; Cardinaux, Jean-Rene (2006). "C/EBPβ couples dopamine signalling to substance P precursor gene expression in striatal neurones". Journal of Neurochemistry. 98 (5): 1390–1399. doi:10.1111/j.1471-4159.2006.03957.x. PMID 16771829. L. Song, G. E. Crawford, DNase-seq: A High-Resolution Technique for Mapping Active Gene Regulatory Elements across the Genome from Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Protocols 2010, 2010-02-01, עמ' pdb.prot5384–pdb.prot5384 doi: 10.1101/pdb.prot5384 Giresi, PG; Kim, J; McDaniell, RM; Iyer, VR; Lieb, JD (יוני 2007). "FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin". Genome Research. 17 (6): 877–85. doi:10.1101/gr.5533506. PMC 1891346. PMID 17179217. {{cite journal}}: (עזרה) Gusmao, EG; Dieterich, C; Zenke, M; Costa, IG (אוג' 2014). "Detection of Active Transcription Factor Binding Sites with the Combination of DNase Hypersensitivity and Histone Modifications". Bioinformatics. 30 (22): 3143–51. doi:10.1093/bioinformatics/btu519. PMID 25086003. {{cite journal}}: (עזרה) Boyle, AP; et al. (מרץ 2011). "High-resolution genome-wide in vivo footprinting of diverse transcription factors in human cells". Genome Research. 21 (3): 456–464. doi:10.1101/gr.112656.110. PMC 3044859. PMID 21106903. {{cite journal}}: (עזרה) Neph, S; et al. (ספט' 2012). "An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints". Nature. 489 (7414): 83–90. Bibcode:2012Natur.489...83N. doi:10.1038/nature11212. PMC 3736582. PMID 22955618. {{cite journal}}: (עזרה) Pique-Regi, R; et al. (מרץ 2011). "Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data". Genome Research. 21 (3): 447–455. doi:10.1101/gr.112623.110. PMC 3044858. PMID 21106904. {{cite journal}}: (עזרה) Cuellar-Partida, G; et al. (ינו' 2012). "Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites". Bioinformatics. 28 (1): 56–62. doi:10.1093/bioinformatics/btr614. PMC 3244768. PMID 22072382. {{cite journal}}: (עזרה)