אימונוהיסטוכימיה

אימונוהיסטוכימיה (Immunohistochemistry) היא שיטה בביולוגיה לאיתור ולמיקום חלבונים בחתך של רקמה. איתור החלבון נעשה על ידי קישור של נוגדנים ספציפיים, והצפייה בו תחת מיקרוסקופ אור מתאפשרת על ידי אנזימים הגורמים לתגובת צבע. אימונוהיסטוכימיה משמשת כאמצעי לאבחון מחלות סרטניות וגם כשיטת מחקר המאפשרת איתור חלבונים שונים ברקמות שונות ובחינת השפעתם על הפתוגנזה של מחלות שונות. הגורמים המקובלים ליצירת תגובת הצבע הם האנזימים פרוקסידאז של חזרת (Horseradish peroxidase או HRP) או אלקליין פוספטאז (alklaline phosphatase). תגובה בין האנזימים לסובסטרט מסיס וחסר צבע יוצרת צבע בלתי מסיס הצובע את האזורים שבהם מצוי החלבון הנבדק. השיטה המקובלת ביותר ברפואה ובמחקר הרפואי מבוססת על צביעה בעזרת שני נוגדנים: נוגדן ספציפי לחלבון הנבדק (נוגדן ראשוני) ונוגדן ספציפי לנוגדן הראשוני, המצומד כימית לאנזים (נוגדן שניוני). השלבים הם כדלהלן: קיבוע הרקמה - רקמה שהוצאה מאדם, בעל חיים או צמח נחשפת לחומר מקבע, לרוב פורמלין, ולאחר מכן לפרפין נוזלי חם. עם קירורו, הפרפין נקרש ובכך מאפשר את חיתוך הרקמה לפרוסות דקות. לרוב נפרסת הרקמה בחתכים בעובי 5 מיקרון. הפרוסות נספחות לזכוכית נושאת. כדי למנוע קילוף הפרוסה מן הזכוכית, מצופה הזכוכית בחומר הטוען אותה במטען חשמלי חיובי (המושך את קרומי התאים הטעונים שלילית). דה-פרפינציה - הפרפין מוסר מן הרקמה בעזרת חשיפה לקסילן ולריכוזים שונים של אתנול. חשיפת אנטיגן - הקיבוע עלול לגרום לקשרי צילוב המפריעים לזיהוי האנטיגן על ידי הנוגדן. כדי למנוע את הבעיה ניתן לחשוף את האנטיגן על ידי הרתחת הדוגמה למשך 10 - 20 דקות בבופר (לרוב בופר ציטרט). ניתן לחשוף אנטיגנים גם על ידי אנזימים פרוטאוליטים (חותכי חלבונים) שונים כמו טריפסין או כימוטריפסין, שימוש באנזימים אלו מצריך כיול כיוון שחשיפת יתר עלולה להרוס את החלבון הנבדק. חסימת פרוקסידאז אנדוגני - כאשר משתמשים באנזים פרוקסידאז (HRP) יש להפסיק תחילה את פעילות האנזים המצוי באופן טבעי ברקמה (הפרוקסידאז האנדוגני). ניתן לחסום את פעילות האנזים על ידי חשיפתו לתמיסת מי חמצן (פראוקסיד). נוגדן ראשוני - הרקמה נחשפת לנוגדן ראשוני בעל ספציפיות לאנטיגן מסוים, לרוב הנוגדן הוא חד-שבטי המיוצר בעכבר או רב-שבטי המיוצר בארנבת. נוגדן שניוני - הרקמה נחשפת לנוגדן שניוני בעל ספציפיות לחלק הקבוע של הנוגדן הראשוני. לנוגדן השניוני מצומד אנזים הגורם לתגובת צבע כאשר הוא בא במגע עם סובסטרט מתאים. סובסטרט - הצביעה הספציפית מתקבלת כתוצאה מחשיפה של הכרומוגן - חומר מסיס ולרוב חסר צבע שאחרי פעילות של אנזים הופך לבעל צבע ובלתי מסיס. הכרומוגנים העיקריים המשמשים בצביעות אימונוהיסטוכימיות הוא (DAB (3,3’-diaminobenzidine הנותן צבע חום או (AEC (3-amino-9-ethylcarbazole הנותן צבע אדום. צביעת ניגוד (Counterstain) - כדי להבחין בתאים נהוג לצבוע אותם בעזרת צבע ניגוד הצובע את כל התאים באופן לא ספציפי. צבע הניגוד המקובל מבוסס על המטוקסילין Hematoxylin הצובע בכחול את גרעין התא. ייבוש (דהידרציה) והדבקת זכוכית מכסה - לרוב הדבק המשמש להדבקת הזכוכית המכסה מבוסס על ממס אורגני שאינו מתערבב במים, לפיכך יש להוציא את כל הנוזלים המימיים לפני הדבקת הזכוכית במכסה, ניתן להוציא נוזלים אלו על ידי העברת רקמה בסדרה של כהלים בריכוזים עולים ולבסוף בקסילן. לאחר ייבוש הדוגמה ניתן להדביק זכוכית מכסה ולצפות בדוגמה במיקרוסקופ אור. קישור ביוטין-סטרפאבידין - במקום נוגדן שניוני מצומד ב-HRP ניתן להשתמש בנוגדן שניוני שעבר ביוטינילציה, הצמדת מולקולות ביוטין. בשלב הבא מוסף סטרפאבידין מצומד לאנזימי HRP. שינויים אלו בפרוטוקול מאפשרים קישור של יותר אנזימי HRP לכל נוגדן שניוני, ולכן הצביעה חזקה יותר. סימון נוגדן ראשוני - ניתן לצמד HRP באופן ישיר לנוגדן הראשוני ולכן אין צורך בנוגדן שניוני. היתרונות בשיטה הוא הורדת רקע כתוצאה מקישור לא ספציפי של נוגדן שניוני וחיסכון בזמן. החיסרון הוא שצימוד אנזים לנוגדן מייקר מאוד את עלות הנוגדן, לכן סימון נוגדן ראשוני משמש בעיקר לבדיקות רפואיות נפוצות במעבדות רפואיות גדולות. בגרסה נדירה יותר של אימונוהיסטוכימיה, סימון הנוגדן נעשה בעזרת חומרים פלואורסצנטיים כגון FITC. לפי שיטה זו ניתן לסמן שני חלבונים שונים בעזרת שני צבעים שונים ובנוסף, על ידי שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ניתן לצפות באברוני תא קטנים (כגון גולג'י או וסיקולות שונות) שאינם נראים בעזרת מיקרוסקופ אור רגיל המשמש לאימונוהיסטוכימיה בצבע. לשם כך, במקום נוגדן שניוני מצומד לאנזים HRP, נעשה שימוש בנוגדן שניוני מצומד למולקולה פלואורסצנטית. צביעת ניגוד נעשית בדרך כלל על ידי שימוש ב-DAPI, חומר פלואורסצנטי המסמן DNA, ולכן גרעין התא מסומן על ידו בכחול. ניתן להבחין בצביעה פלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי. מיקרוסקופים אלו מקרינים את הדוגמה באור מקוטב או בקרן לייזר מונוכרומטית. כתוצאה מכך פולטות המולקולות הפלואורסצנטיות אור באורך גל שונה מזה הנקלט בהן. על ידי סדרה של מסננים ניתן לראות רק את האור הנפלט מן המולקולות הפלואורסצנטיות וכך לסמן את התאים הנושאים את האנטיגן. יתרון הצביעה הפלואורסצנטית הוא בכך שניתן לסמן מספר אנטיגנים על ידי שימוש במספר חומרים פלואורסצנטיים, בנוסף, בעזרת סימון פלואורסצנטי ניתן להבחין באברונים קטנים שאינם מובחנים בצביעה אימונוהיסטוכימית רגילה. אימונוהיסטוכימיה משמשת לאבחון מחלות סרטניות שונות כיוון שהמצאות חלבונים שונים אופיינית למחלות שונות. בנוסף, במחלות מסוימות אבחון רמת הביטוי של חלבונים ספציפיים ברקמת גידול מאפשר התאמת הטיפול האפקטיבי ביותר לחולה. לדוגמה, חולת סרטן השד שתאי הגידול הסרטני שלה מבטאים קולטנים לאסטרוגן יכולה להיות מטופלת בהורמונים אנלוגיים לאסטרוגן כמו טמוקסיפן. פרוטוקול בעברית לאימונוהיסטוכימיה עולם האימונוסיסטוכימיה פרוטוקולים, גלריות וייעוץ באימונוהיסטוכימיה והיסטוכימיה פרוטוקול און-ליין פרוטוקולים לאימונוהיסטוכימיה