ספירת חיידקים

ספירת חיידקים היא הערכה כמותית של מספר החיידקים בנפח ידוע של נוזל או הערכה של מספר יחידות יוצרות מושבות (Colony-forming unit) המכונה CFU על מצעים מוצקים על בסיס אגר. ספירת חיידקים מתבצעת בשיטות שונות, אשר לכל אחת מהן יש יתרונות וחסרונות הנובעים ממשך ביצוע הבדיקה ומורכבותה, פשטותה, דיוקה, והעלויות הכרוכות בביצוע הבדיקה. בחלק מהשיטות, נספרות יחידות חיות בלבד ובחלקן כלל היחידות החיות והמתות. ספירת חיידקים היא כלי חשוב בתעשיית מזון ומשקאות, תרופות וקוסמטיקה, במעבדות מחקר ודיאגנוסטיקה, ולצורכי ניטור היגיינה סביבתית. השיטה הטורבידימטרית (Turbidimetry) היא שיטה שבה סופרים חיידקים בתמיסה על ידי מדידת עכירות התמיסה. המדידה מבוצעת במכשיר הקרוי ספקטרופוטומטר. השיטה מבוססת על מדידת עוצמת קרן אור העוברת דרך תמיסה המכילה חיידקים הקרויה תרחיף. חיידקים בתרחיף יוצרים תמיסה קולואידלית. מידת מעבר אור נראה לעין, המכונה טרנסמיסיה, בתמיסה קולואידית, מושפע מריכוז החלקיקים בה. ככל שריכוז החלקיקים גבוה יותר כך יורדת כמות האור העוברת בתמיסה. הערך ההפוך של טרנסימיסיה מכונה עכירות. בשיטה הטורבידימטרית, בונים גרף כיול של בליעת אור נראה לעין באורך גל של 650nm כנגד ריכוז חיידקים ידוע. בתהליך הבדיקה מכינים תרחיף אחיד של חיידקים בפאזה הלוגריתמים (Bacterial growth) במי-מלח מעוקרים. מודדים את עוצמת הבליעה של הדגימה, ובעזרת עקומת הכיול מתרגמים את הקריאה לריכוז חיידקים בתמיסה. גרף הכיול מותאם בנפרד לכל סוג של חיידקים על פי המבנה שלהם: מתגים גרם חיוביים, מתגים גרם שליליים, נקדים (קוקים), ויבריונים וכד. יתרונות השיטה בהיותה פשוטה, מהירה, זולה ובלתי הרסנית. חסרונות השיטה הן באי יכולתה להבחין בין חלקיקים דוממים לחיידקים, ולכן, נדרשת הקפדה על הכנת תרחיף אחיד ונקי מחלקיקים זרים. אין הבחנה בין חיידקים חיים לחיידקים מתים. השיטה מחייבת קריאה בתחום הליניארי של גרף הכיול. ספירה מיקרוסקופית (Direct microscopic count DMC) היא ספירה ישירה של חיידקים בדוגמה נוזלית. הבדיקה כוללת הכנה של תרחיף אחיד של חיידקים וביצוע מספר ספירות בתא ספירה (Hemocytometer) בעל נפח ידוע. הספירה מבוצעת בעזרת מיקרוסקופ אופטי. התוצאה של הספירה היא חישוב הממוצע של מספר קריאות, מוכפל במיהול התמיסה המקורית ומחולק לנפח התא. יתרונות השיטה טמונים במהירות קבלת התוצאות, נוחותה ומחירה הזול. השיטה מאפשרת להבחין בין חלקיקים שונים וזיהומים ואין פגיעה פיזית בתרחיף. חסרונות השיטה הם חוסר היכולת להבחין בין חיידקים חיים ומתים, וההקפדה הנידרשת על בהכנת תמיסה הומוגנית. הספירה מייצגת נפחים קטנים מאוד של התרחיף לכן יש להקפיד על קריאות חוזרות על מנת להבטיח סטיית תקן נמוכה של הספירות. חסרון נוסף, החיידקים במיקרוסקופ אור נראים שקופים, עובדה המקשה על הספירה. שיטה מדויקת יותר לספירת חיידקים היא ספירה ישירה על מצע מוצק (Plate count Agar - PCA), ספירה חיה שבה נעשית זריעה ממיהולים שונים של תרחיף החיידקים על פני מצעים מוצקים. בשיטה זו נדרשת הקפדה על פיזור אחיד של האינוקולום על פני המצע המוצק. לאחר הדגרה בתנאים המתאימים נספרות המושבות והתוצאה מוכפלות בפקטור המיהול של התמיסה. יתרונות השיטה הם היכולת לספר חיידקים חיים, והיכולת להבדיל בין סוגי חיידקים שונים. חסרונות השיטה הם תהליך ארוך ויקר מבחינת הציוד והחומרים, תלות במצע ובזמן ההדגרה, הקפדה על תנאים אופטימליים לגידול החיידק, אפשרויות לזיהום מצע, וכן ייתכן שמקור המושבה הוא בצבר של חיידקים ולא בחיידק אחד. הספירה מבוצעת על ידי זריעה ופיזור אחיד של האינוקולום (Inoculum) על פני המצע המוצק והדגרתו בטמפרטורות המומלצות בשיטת העבודה. היות שחיידקים גדלים בצברים, אין לדעת אם מושבה נוצרה על ידי חיידק אחד או על ידי צבר של חיידקים, כמו שרשראות או אשכולות, ולכן הספירה מבוטאת בערך CFU (Colony-forming unit) ביחידת משקל (גרם) או ביחידת נפח (מיליליטר). שיטת הזריעה הישירה PCA (Plate Count Agar) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לספירת חיידקים בתעשיות המזון, ובתעשיית מוצרי הרוקחות והקוסמטיקה. שיטת הספירה הישירה היא כלי דיאגנוסטי אמין על ידי שימוש במצעים דיאגנוסטיים-סלקטיביים (Growth medium). יתרונות השיטה הם ספירה היא של חיידקים חיים בלבד, והאפשרות לספירה דיאגנוסטית דיפרנציאלית על ידי אבחון מורפולוגי, אימונולוגי, ביוכימי וגנטי. חסרונה בהיותה ממושכת, תוצאותיה מתקבלות כעבור יום או יותר בהתאם לתנאים האופטימליים של הגידול. היות שהחיידקים יוצרים צברים של קוקים ושרשראות, הרי שהספירות מבטאות יחידות יוצרות מושבה. הספירה מוגבלת לספירה של מושבות בין 30–300 מושבות על צלחת הפטרי. מצעים אלה משמשים לזיהוי חיידקים פתוגניים שונים. בשיטת השפיכה (Pour Plate Method - PPM) יוצקים נפח של 1 מיליליטר של הדוגמה הנבדקת, ועליה יוצקים את מצע האגר. השיטה מאפשרת ספירה בנפח דוגמה של 1 מיליליטר בעוד בשיטה הקודמת הנפח המרבי לזריעה הוא 0.1 מיליליטר. השיטה מתאימה לספירה כללית של חיידקים בדוגמית, ואינה מתאימה לספירה לצורכי דיאגנוזה, מכיוון שלצורכי אבחון יש צורך במושבה על פני המצע המוצק. בשתי השיטות, משתמשים במכשיר לספירת חיידקים על ידי ספירה מדויקת של המושבות. ספירת מושבות החיידקים על פני האגר המוצק בשיטת ה-PCA או בתוך האגר בשיטת ה-PPM נעשית במכשיר לספירת חיידקים (Colony counter). ספירת חיידקים בשיטת MPN (Most Probable Number) מיועדת לספירת חיידקים בדוגמיות קרקע, במזון, במשקאות ובמים עם ריכוז נמוך יחסית של חיידקים. השיטה מבוססת על זריעת דוגמאות ומיהוליהן העשרוניים במצעים נוזליים והערכה על פי שיקולים סטטיסטיים. ספירת חיידקים בשיטת הסינון דרך ממברנה (Membrane filtration) היא שיטה תקנית לספירת חיידקים במים. השיטה מאפשרת לרכז חיידקים מדוגמאות מים גדולות על ידי סינונן דרך פילטר בעל חרירים בגודל 0.45 מיקרונים. לאחר הסינון, מניחים את הפילטר על צלחות פטרי המכילות מצעים סלקטיביים שונים המאפשרים ספירה ודיאגנוזה של חיידקים פתוגניים שעלולים להימצא במים וחיידקים מקבוצת הקוליפורמים שהם חיידקים אינדיקטורים (Indicator Bacteria) למגע עם הפרשות צואתיות. ספירת חיידקים בשיטת צלחות מגע (Contact plates) מיועדת לבקרת ניקוי וחיטוי פסי ייצור במפעלים. בדיקת משטחי עבודה וידיים של עובדים במפעלים, בתי חולים, ומקומות הסעדה, מאפשרת בדיקת יעילות תהליכי ניקיון וחיטוי. בדיקת היעילות מתבצעת על ידי הצמדת צלחות מגע על המשטחים הנבדקים לפני ואחרי ניקוי וחיטוי. בדיקת ידיים של עובדי מפעלים מאפשרת מעקב ושמירה על היגיינה נאותה. Stephen T. Abedon, Counting Microbes ספירת חיידקים, באתר אנציקלופדיה בריטניקה (באנגלית) ספירת חיידקים, באתר, Standard Methods for the examination of Water and Wastewater 2024 (באנגלית) Turbidimetry - an overview | ScienceDirect Topics, www.sciencedirect.com Difference Between Optical Density & Absorbance, Sciencing (באנגלית) Direct Microscopic Count (DMC) Advantage, Disadvantage., microbiologynote.com, ‏2020-08-07 (באנגלית אמריקאית) Center for Food Safety and Applied Nutrition, BAM Chapter 3: Aerobic Plate Count, FDA, 16 June 2021 Frederick Kavanagh, Official methods of analysis of the AOAC, 13th ed. Edited by WILLIAM HORWITZ. The Association of Official Analytical Chemists, 1111 N. 19th St., Arlington, VA 22209. 1980. 1038pp. 22 × 28cm. 2.4kg. Price $78.00, Journal of Pharmaceutical Sciences 70, 1981-04, עמ' 468 doi: 10.1002/jps.2600700437 Sang-Hyun Park, Sangryeol Ryu, Dong-Hyun Kang, Development of an Improved Selective and Differential Medium for Isolation of Salmonella spp, Journal of Clinical Microbiology 50, 2012-10, עמ' 3222–3226 doi: 10.1128/JCM.01228-12 N.D. Cowell, HISTORY OF FOOD MICROBIOLOGY, Elsevier, 1999, עמ' 1066–1071 E. Windle Taylor, N. P. Burman, C. W. Oliver, Use of the membrane filter in the bacteriological examination of water, Journal of Applied Chemistry 3, 2007-05-04, עמ' 233–240 doi: 10.1002/jctb.5010030508 A P Dufour, E R Strickland, V J Cabelli, Membrane filter method for enumerating Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology 41, 1981-05, עמ' 1152–1158 doi: 10.1128/aem.41.5.1152-1158.1981 Ellis Solaiman, Ioannis Sfyrakis, Carlos Molina-Jimenez, Dynamic Testing and Deployment of a Contract Monitoring Service, Proceedings of the 5th International Conference on Cloud Computing and Services Science, SCITEPRESS - Science and and Technology Publications, 2015 doi: 10.5220/0005453704630474