וקטור ביטוי

וקטור ביטוי (expression vector) הוא פלסמיד או וירוס המיועד לביטוי גנים בתאים. הווקטור משמש להחדרת גן ספציפי לתא מטרה (תא מאחסן), ומשתמש במנגנון של התא לסינתזת חלבונים כדי לייצר את החלבון המקודד על ידי הגן. וקטורי ביטוי הם הכלים הבסיסיים בביוטכנולוגיה לייצור חלבונים לצורך מחקר ותעשיית המזון והתרופות. תהליך הכנסת וקטור הביטוי לתוך תא מאחסן נקרא טרנספורמציה או טרנספקציה. המטרה של וקטור ביטוי היא ייצור יעיל של חלבון, וניתן להשיג זאת על ידי ייצור של כמות משמעותית של RNA שליח (mRNA) יציב, אשר לאחר מכן יתורגם לחלבון על ידי התא המאחסן. וקטור הביטוי מהונדס כך שיכיל רצפים רגולטורים הפועלים כאזורי enhancer ו-promoter שמובילים לשעתוק יעיל של הגן הנישא על וקטור. הביטוי של חלבון עשוי להיות מבוקר באופן הדוק – החלבון מיוצר בכמות משמעותית רק בעת הוספת מולקולת משרה (inducer). לחלופין החלבון יכול להתבטא באופן קבוע (קונסטיטיוטיבי) עם פרומוטור המתאים למטרה זו, שלא דורש מולקולת משרה כדי לסנתז מולקולות RNA שליח. Escherichia coli משמש בדרך כלל כתא מאחסן לייצור חלבון, אך ניתן להשתמש בסוגי תאים אחרים. דוגמה לשימוש בוקטור ביטוי היא ייצור אינסולין, המשמש לטיפול בחולי סוכרת. בנוסף לאלמנטים מיוחדים לביטוי, המצוינים למטה, לוקטורי ביטוי יש תכונות בסיסיות של וקטורי ביולוגיה מולקולרית, כגון מקור שכפול, סמן (selectable marker) ואתר מתאים להחדרת גן כמו אתר השיבוט המרובה (multiple cloning site). ניתן להעביר את הגן המשובט מוקטור שיבוט מיוחד לוקטור ביטוי, אם כי ניתן לשבט גן ישירות לוקטור ביטוי. תהליך השיבוט (זאת אומרת, הכנת פלסמיד הביטוי) מבוצע גם כן ב-Escherichia coli. וקטורים המשמשים לייצור חלבון באורגניזמים שאינם E.coli עשויים להכיל, בנוסף למקור שכפול מתאים ב-E. coli (המשמש לשלב שיבוט הפלסמיד), אלמנטים אחרים המאפשרים לשמור אותם באורגניזם אחר. וקטורים אלה נקראים shuttle vectors. וקטור ביטוי חייב להיות בעל אלמנטים הדרושים לביטוי גנים. אלה כוללים פרומוטור, רצף מתאים להתחלת תרגום נכון, כגון אתר קישור ריבוזום וקודון התחלה, קודון סיום ורצף סיום שעתוק. כיוון שישנם הבדלים במנגנוני סינתזת חלבונים, לדוגמה, בין פרוקריוטים לאאוקריוטים, וקטורי הביטוי חייבים לכלול את האלמנטים המתאימים לביטוי החלבון לפי המאחסן הנבחר. לדוגמה, לוקטורי ביטוי פרוקריוטים יהיו רצף של Shine-Dalgarno באתר התחלת התרגום שלו לקשירה של ריבוזומים, בעוד שוקטורי ביטוי אאוקריוטים יכילו את רצף הקונצנזוס של קוזאק. מכיוון שרצף הפרומוטור יוזם את השעתוק הוא מהווה את נקודת הבקרה לביטוי של הגן המשובט. הפרומוטורים המשמשים וקטורי הביטוי בדרך כלל ניתנים לשרירה (induction), כלומר סינתזת החלבון תתחיל רק על פי דרישה וכאשר מוסיפים מולקולות משרה (inducer) כגון IPTG. אולם ביטוי גנים עשוי להיות גם קונסטיטיוטיבי (כלומר חלבון מתבטא כל הזמן). רמה נמוכה של סינתזת חלבון עשויה להתרחש אפילו בוקטורי ביטוי עם פרומוטורים מבוקרים היטב. לאחר הביטוי של החלבון, ייתכן שיהיה צורך לנקות את החלבון המבוטא; עם זאת, הפרדת החלבון הרצוי משאר חלבוני התא המאחסן יכולה להיות תהליך ממושך. כדי להקל על תהליך ניקוי זה, ניתן להוסיף תג לבידוד החלבון המשובט. תג זה יכול להיות תג היסטידין (His), רצפי פפטידים, או חלבוני היתוך כגון גלוטתיון S-transferase או חלבון קושר מלטוזה. חלק מחלבוני היתוך אלה עשויים גם לעזור להגביר את המסיסות של חלק מהחלבונים המבוטאים. חלבוני היתוך אחרים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק עשויים לשמש כמדווח לזיהוי גנים משובטים מוצלחים, או שהם עשויים לשמש לחקר ביטוי חלבון בהדמיה תאית. וקטורי ביטוי מסוימים עשויים לכלול אלמנטים נוספים לטרנספורמציה או להחדרת DNA לכרומוזום המאחסן, למשל גנים vir לטרנספורמציה של צמחים, ואתרים של האנזים אינטגראז לאינטגרציה כרומוזומלית. וקטורים מסוימים עשויים לכלול רצף מטרה שעשוי לכוון את החלבון המבוטא למיקום ספציפי כגון המרחב הפריפלסמי של חיידקים, או לאברונים שונים בתאים אאוקריוטים כמו הגרעין, המיטוכונדריה והרשת האנדופלסמטית. ניתן להשתמש בתאים של אורגניזמים שונים כדי לבטא את חלבון המטרה של הגן, ולפיכך וקטור הביטוי המשמש יכלול אלמנטים ספציפיים לשימוש באורגניזם המסוים. האורגניזם הנפוץ ביותר לייצור חלבון הוא החיידק Escherichia coli. עם זאת, לא כל החלבונים יכולים להתבטא בהצלחה ב-E. coli, או להתקפל בצורה הנכונה או לכלול שינויים פוסט-תרגום כגון גליקוזילציות, ולכן ניתן להשתמש במערכות אחרות. תא מאחסן נפוץ לוקטור ביטוי חלבונים רבים הוא Escherichia coli שכן ייצור חלבון הטרולוגי (חלבון המיוצר בתא שלא מייצר אותו באופן טבעי) ב-E. coli הוא פשוט ונוח יחסית, כמו גם מהיר וזול. מספר רב של פלסמידים לביטוי E. coli זמינים גם עבור מגוון רחב של צרכים. חיידקים אחרים המשמשים לייצור חלבון כוללים Bacillus subtilis. רוב החלבונים ההטרולוגים מתבטאים בציטופלזמה של E. coli. עם זאת, לא כל החלבונים הנוצרים עשויים להיות מסיסים בציטופלזמה, וחלבונים מקופלים בצורה שגויה הנוצרים בציטופלזמה יכולים ליצור אגרגטים בלתי מסיסים הנקראים inclusion bodies. חלבונים בלתי מסיסים כאלה ידרשו קיפול מחדש, תהליך שלא בהכרח כולל תפוקה גבוהה של החלבון. חלבונים בעלי קשרי דיסולפיד לרוב אינם מסוגלים להתקפל כראוי בשל הסביבה המחזרת בציטופלזמה אשר מונעת יצירת קשר שכזה, ופתרון אפשרי הוא לכוון את החלבון לחלל הפריפלסמי על ידי שימוש ברצף אותות N-טרמינלי. אפשרות נוספת היא לתמרן את סביבת החיזור של הציטופלזמה. גם מערכות מתוחכמות יותר מפותחות כיום, המאפשרות ביטוי של חלבונים שנחשבו בעבר בלתי אפשריים ב-E. coli, כגון חלבונים מסוכרים. הפרומטורים המשמשים לוקטורים אלו מבוססים בדרך כלל על הפרומוטור של אופרון הלקטוז או פרומוטור T7, והם עוברים רגולציה בדרך כלל על ידי האופרטור lac. פרומוטורים אלו עשויים להיות גם הכלאיים של פרומוטורים שונים, לדוגמה, ה-Tac-Promoter הוא הכלאה של <i id="mwig">trp</i> ו-lac. רוב הפרומוטורים הנפוצים של lac או נגזרי lac מבוססים על המוטנט <i id="mwkQ">lac</i> UV5 שאינו רגיש לדיכוי קטבוליטים. מוטנט זה מאפשר ביטוי של חלבון בשליטה של פרומוטור lac כאשר מצע הגידול מכיל גלוקוז מכיוון שגלוקוז יעכב את ביטוי הגנים אם נעשה שימוש בפרוטור lac מסוג wildtype. נוכחות של גלוקוז עדיין עשויה לשמש להפחתת ביטוי הרקע באמצעות עיכוב שיורי במערכות מסוימות. דוגמאות לוקטורי ביטוי E. coli הן סדרת ה-pGEX של וקטורים שבהם משתמשים ב-Glutathione S-transferase כשותף היתוך וביטוי גנים נמצא בשליטה של פרומוטר tac וסדרת pET של וקטורים המשתמשים בפרומוטר T7. ניתן לבטא בו זמנית שני חלבונים שונים או יותר ב-E. coli באמצעות פלסמידים שונים. עם זאת, כאשר משתמשים בשני פלסמידים או יותר, כל פלסמיד צריך להשתמש בסלקציה אנטיביוטית אחרת וכן במקור אחר של שכפול, אחרת ייתכן שאחד הפלסמידים לא יישמר ביציבות. פלסמידים רבים מבוססים על רפליקון ColE1 ולכן אינם תואמים זה לזה; על מנת שפלסמיד מבוסס ColE1 יתקיים במקביל עם אחר באותו תא, השני יצטרך להיות משכפול אחר, למשל פלסמיד מבוסס רפליקון p15A כמו סדרת הפלסמידים pACYC. גישה נוספת תהיה להשתמש בוקטור בודד של שני ציסטרונים או לעצב את רצפי הקידוד במקביל כמבנה דו-או פולי-ציסטרוני. שמרים נפוץ לייצור חלבון הוא Pichia pastoris. דוגמאות לוקטור ביטוי שמרים "בפיצ'יה" הן סדרת הווקטורים pPIC, והווקטורים הללו משתמשים בפרומוטור AOX1 שניתן להשרה עם מתנול. הפלסמידים עשויים להכיל אלמנטים להחדרת DNA זר לגנום השמרים ורצף האותות להפרשת החלבון המבוטא. חלבונים עם קשרי דיסולפיד וגליקוזילציה יכולים להיות מיוצרים ביעילות בשמרים. שמרים נוספים המשמשים לייצור חלבון הם Kluyveromyces lactis, והגן מתבטא בעזרת וריאנט של פרומוטור הלקטאז החזק LAC4. Saccharomyces cerevisiae נמצא בשימוש נרחב במיוחד למחקרי ביטוי גנים בשמרים, למשל במערכת דו-היברידית של שמרים לחקר האינטראקציה בין חלבון לחלבון. הווקטורים המשמשים במערכת דו-היברידית של שמרים מכילים שותפי היתוך לשני גנים משובטים המאפשרים שעתוק של גן מדווח כאשר יש אינטראקציה בין שני החלבונים המובעים מהגנים המשובטים. Baculovirus, וירוס בצורת מוט אשר מדביק תאי חרקים, משמש כווקטור הביטוי במערכת זו. קווי תאים של חרקים שמקורן ב-Lepidopterans (עש ופרפרים), כגון Spodoptera frugiperda, משמשים כמאחסנים. קו תאים שמקורו בלופר הכרוב מעוררת עניין במיוחד, שכן היא פותחה לצמיחה מהירה וללא הסרום היקר הדרוש בדרך כלל כדי להגביר את צמיחת התאים. וקטור המעבורת נקרא bacmid, וביטוי גנים נמצא בשליטה של פרומוטור חזק pPolh. Baculovirus שימש גם עם קווי תאים יונקים במערכת BacMam. Baculovirus משמש בדרך כלל לייצור גליקופרוטאינים, אם כי הגליקוזילציות עשויות להיות שונות מאלה שנמצאות בבעלי חוליות. באופן כללי, הוא בטוח יותר לשימוש מאשר וירוס יונקים שכן יש לו טווח של תאים מאחסנים מוגבל. וקטורי ביטוי צמחיים רבים מבוססים על פלסמיד Ti של Agrobacterium tumefaciens. בווקטורי ביטוי אלה, DNA שיוחדר לצמח משובט לתוך ה-T-DNA, קטע של DNA שבצדו רצף חוזר ישיר של 25 bp בשני קצותיו, ואשר יכול להשתלב בגנום הצמח. ה-T-DNA מכיל גם את הסמן הניתן לבחירה. ה-Agrobacterium מספק מנגנון לטרנספורמציה, אינטגרציה של גנום הצמח, והפרומטרים של הגנים "הוויריים" שלו עשויים לשמש גם עבור הגנים המשובטים. דאגות לגבי העברת חומר גנטי חיידקי או ויראלי לתוך הצמח, לעומת זאת, הובילו להתפתחות של וקטורים הנקראים וקטורים תוך-גניים לפיהם נעשה שימוש בשווי ערך פונקציונלי של גנום הצמח, כך שאין העברה של חומר גנטי ממין זר לתוך הצמח. נגיפים צמחיים עשויים לשמש כווקטורים מכיוון ששיטת Agrobacterium אינה פועלת עבור כל הצמחים. דוגמאות לווירוס צמחי בשימוש הן וירוס פסיפס טבק (TMV), וירוס תפוחי אדמה X, וירוס פסיפס cowpea. החלבון עשוי להתבטא כהיתוך לחלבון המעיל של הנגיף והוא מוצג על פני השטח של חלקיקים נגיפיים שנאספו, או כחלבון לא מאוחה המצטבר בתוך הצמח. ביטוי בצמח באמצעות וקטורים צמחיים הוא לעיתים קרובות קונסטיטיוטיבי ופרומוטור קונסטיטיוטיבי נפוץ בוקטורי ביטוי צמחיים הוא פרומוטור 35S של וירוס פסיפס כרובית (CaMV). וקטורי ביטוי יונקים מציעים יתרונות ניכרים לביטוי של חלבוני יונקים על פני מערכות ביטוי חיידקיות – קיפול נכון, שינויים לאחר תרגום ופעילות אנזימטית רלוונטית. זה עשוי להיות גם רצוי יותר ממערכות איקריוטיות אחרות שאינן יונקות, לפיהן החלבונים המבוטאים עשויים שלא להכיל את הגליקוזילציות הנכונות. זה שימושי במיוחד בייצור חלבונים הקשורים לממברנה הדורשים מלווים לקיפול ויציבות נאותים וכן מכיל שינויים רבים לאחר תרגום. החיסרון, לעומת זאת, הוא התשואה הנמוכה של המוצר בהשוואה לוקטורים פרוקריוטיים, כמו גם האופי היקר של הטכניקות המעורבות. הטכנולוגיה המסובכת שלה, והזיהום הפוטנציאלי בנגיפים של בעלי חיים של ביטוי תאי יונקים, הציבו גם מגבלה על השימוש בה בייצור תעשייתי בקנה מידה גדול. ניתן להשתמש בקוי תאים יונקים מתורבתים כגון שחלת האוגר הסיני (CHO), COS, כולל קווי תאים אנושיים כגון HEK ו-HeLa לייצור חלבון. וקטורים עוברים טרנספקציה לתוך התאים וה-DNA יכול להשתלב בגנום על ידי רקומבינציה הומולוגית במקרה של טרנספקציה יציבה, או שהתאים עשויים לעבור טרנספקציה זמנית. דוגמאות לוקטורי ביטוי יונקים כוללות את הווקטורים האדנו-ויראליים, ה-pSV וסדרת ה-pCMV של וקטורי פלסמיד, וקטורים של חיסונים ורטרו-ויראליים, וכן baculovirus. הפרומוטורים של ציטומגלווירוס (CMV) ו-SV40 משמשים בדרך כלל בוקטורי ביטוי יונקים כדי להניע את ביטוי הגנים. ידוע גם פרומוטר לא ויראלי, כגון פרומוטר התארכות (EF)-1. ליזט (נוזל הכולל את התכולה של תאים) של תאי E. coli המכיל את הרכיבים התאיים הנדרשים לתעתוק ותרגום משמשים בשיטה זו "במבחנה" לייצור חלבון. היתרון של מערכת כזו הוא שהחלבון עשוי להיות מיוצר הרבה יותר מהר מאלה המיוצרים in vivo (בתוך התא), מכיוון שאינו דורש זמן לגידול התאים, אך הוא גם יקר יותר. ניתן להשתמש בוקטורים המשמשים לביטוי E. coli במערכת זו, אם כי זמינים גם וקטורים שתוכננו במיוחד עבור מערכת זו. תמציות תאים אוקריוטיות עשויות לשמש גם במערכות אחרות ללא תאים, למשל, מערכות ביטוי ללא תאי נבט חיטה. יוצרו גם מערכות נטולות תאים יונקים. שימוש בוקטור ביטוי הוא כיום השיטה הרווחת במעבדות לייצור חלבונים למחקר. רוב החלבונים מיוצרים ב-E. coli, אך עבור חלבונים בעלי גליקוזילציה ואלה עם קשרי דיסולפיד, מייצרים בשמרים, ב baculovirus ובמערכות יונקים. רוב התרופות החלבוניות מיוצרות כיום באמצעות וקטורי ביטוי. תרופות פפטידים וחלבונים אלה עשויים להיות הורמונים, חיסונים, אנטיביוטיקה, נוגדנים ואנזימים. החלבון הרקומביננטי האנושי הראשון, אינסולין, המשמש לניהול מחלת הסכרת, הוצג בשנת 1982. שימוש בטכנולוגית הביטוי בתרביות תאים מאפשר יצור תרופות פפטידים וחלבונים אלה, שחלקן היו נדירות בעבר או קשות להשגה, בכמות גדולה, ובנוסף, מפחית את הסיכונים של מזהמים כמו וירוסים, רעלים ופריוניים. דוגמאות מהעבר כוללות זיהום פריון בהורמון גדילה המופק מבלוטות יותרת המוח שנקטפו מגווי אדם, שגרם למחלת קרויצפלד-יעקב בחולים שקיבלו טיפול בגמדות, מזהמים ויראליים בגורם קרישה VIII שבודדו מדם אנושי, והעברת מחלות ויראליות כגון הפטיטיס ואיידס. סיכון כזה מצטמצם או מוסר לחלוטין כאשר החלבונים מיוצרים בתאי מאחסן לא אנושיים. בשנים האחרונות נעשה שימוש בוקטורי ביטוי להחדרת גנים ספציפיים לצמחים ובעלי חיים כדי לייצר אורגניזמים מהונדסים גנטית. בחקלאות, למשל, נעשה שימוש בוקטורי ביטוי להחדרת מולקולת פרקורסור (מולקולה מקדימה) לוויטמין A, בטא-קרוטן, לצמחי אורז. מוצר זה נקרא אורז מוזהב. דוגמה נוספת היא החדרת גן לצמחים המייצר קוטל חרקים, הנקרא רעלן Bacillus thuringiensis או רעלן Bt אשר מפחית את הצורך של חקלאים ליישם קוטלי חרקים מכיוון שהוא מיוצר על ידי האורגניזם עצמו. בנוסף משתמשים בוקטורי ביטוי להארכת הבשלות של עגבניות על ידי שינוי הצמח כך שייצר פחות מהכימיקל הגורם לעגבניות להירקב. ישנן מחלוקות בנוגע לשימוש בוקטורי ביטוי להנדסה גנטית של יבולים בשל העובדה שייתכנו סיכונים בריאותיים לא ידועים, סכנות סביבתיות, אפשרויות של חברות לרשום פטנטים על גידולי מזון מהונדסים גנטית וחששות אתיים. עם זאת, טכניקה זו נמצאת בשימוש ונחקרת רבות. בעלי חיים מהונדסים יוצרו כדי לחקור תהליכים ביוכימיים של בעלי חיים ומחלות אנושיות, או לייצור תרופות וחלבונים אחרים (כגון נוגדנים). חלבון פלואורסצנטי ירוק משמש לעיתים כתג שגורם לבעלי חיים להאיר ברגע שהתאים שלתאים שלהם חדר הווקטור, ונוצל באופן מסחרי כדי לייצר את GloFish הפלואורסצנטי. ריפוי גנטי הוא טיפול מבטיח למספר מחלות שבהן גן "נורמלי" הנישא על ידי וקטור, מוחדר לגנום, כדי להחליף גן "לא תקין" או להשלים את ביטוי הגן. בדרך כלל נעשה שימוש בוקטורים ויראליים, אך מפותחות שיטות החדרה אחרות שאינן ויראליות. הטיפול עדיין נחשב אופציה מסוכנת בשל שימוש בוקטור נגיפי שיכול לגרום לתופעות לוואי, למשל לגרום למוטצית insertion שעלולה להוביל לסרטן. עם זאת, ישנה התקדמות במחקר עם תוצאות מבטיחות. שיבוט מולקולרי Transcription factors (article), Khan Academy (באנגלית) RW Old, SB Primrose (1994). "Chapter 8: Expression E. coli of cloned DNA molecules". Principles of Gene Manipulation. Blackwell Scientific Publications. ISBN 9780632037124.{{cite book}}: תחזוקה - ציטוט: שימוש בפרמטר authors (link) Michelle E. Kimple, Allison L. Brill, and Renee L. Pasker (24 בספטמבר 2013). "Overview of Affinity Tags for Protein Purification". Current Protocols in Protein Science. 73 (Unit-9.9): 9.9.1–9.9.23. doi:10.1002/0471140864.ps0909s73. ISBN 9780471140863. PMC 4527311. PMID 24510596. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Erik Snapp (ביולי 2005). "Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology". Current Protocols in Cell Biology. Chapter 21:21.4.1-21.4.13. 27: 21.4.1–21.4.13. doi:10.1002/0471143030.cb2104s27. PMC 2875081. PMID 18228466. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: location (link) Georgeta Crivat and Justin W. Taraska (בינואר 2012). "Imaging proteins inside cells with fluorescent tags". Trends in Biotechnology. 30 (1): 8–16. doi:10.1016/j.tibtech.2011.08.002. PMC 3246539. PMID 21924508. {{cite journal}}: (עזרה) Protein Targeting – Nucleus, Mitochondria and Chloroplasts Burgess RR (2009). "Refolding solubilized inclusion body proteins". Methods in Enzymology. 463: 259–82. doi:10.1016/S0076-6879(09)63017-2. ISBN 9780123745361. PMID 19892177. Julie Lobstein, Charlie A Emrich, Chris Jeans, Melinda Faulkner, Paul Riggs, and Mehmet Berkmen (2012). "SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm". Microbial Cell Factories. 11: 56. doi:10.1186/1475-2859-11-56. PMC 3526497. PMID 22569138.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Wacker M, Linton D, Hitchen PG, Nita-Lazar M, Haslam SM, North SJ, Panico M, Morris HR, Dell A, Wren BW, Aebi M (2002). "N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli". Science. 298 (5599): 1790–1793. Bibcode:2002Sci...298.1790W. doi:10.1126/science.298.5599.1790. PMID 12459590. Huang CJ, Lin H, Yang X (2012). "Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements". J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (3): 383–99. doi:10.1007/s10295-011-1082-9. PMID 22252444. Germán L. Rosano1, and Eduardo A. Ceccarelli (2014). "Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges". Frontiers in Microbiology. 5: 172. doi:10.3389/fmicb.2014.00172. PMC 4029002. PMID 24860555. Dubendorff JW, Studier FW (1991). "Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor". Journal of Molecular Biology. 219 (1): 45–59. doi:10.1016/0022-2836(91)90856-2. PMID 1902522. deBoer H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983). "The tac promoter: a functional hybrid derived from trp and lac promoters". Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 80 (1): 21–25. Bibcode:1983PNAS...80...21D. doi:10.1073/pnas.80.1.21. PMC 393301. PMID 6337371.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Silverstone AE, Arditti RR, Magasanik B (1970). "Catabolite-insensitive revertants of lac promoter mutants". Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 66 (3): 773–9. Bibcode:1970PNAS...66..773S. doi:10.1073/pnas.66.3.773. PMC 283117. PMID 4913210. Robert Novy; Barbara Morris. "Use of glucose to control basal expression in the pET System" (PDF). InNovations: 6–7. Smith DB, Johnson KS (1988). "Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase". Gene. 67 (1): 31–40. doi:10.1016/0378-1119(88)90005-4. PMID 3047011. "GST Gene Fusion System" (PDF). Amersham Pharmacia biotech. Addgene: Vector Database – pGEX-1, www.addgene.org pET Bacterial Recombinant Protein Expression Vector | VectorBuilder, en.vectorbuilder.com Nicola Casali; Andrew Preston (2003-07-03). E. coli Plasmid Vectors: Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. Vol. No.: 235. p. 22. ISBN 978-1-58829-151-6. Schoner BE, Belagaje RM, Schoner RG (1986). "Translation of a synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli". Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (22): 8506–10. Bibcode:1986PNAS...83.8506S. doi:10.1073/pnas.83.22.8506. PMC 386959. PMID 3534891. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000). "Recombinant protein expression in Pichia pastoris". Molecular Biotechnology. 16 (1): 23–52. doi:10.1385/MB:16:1:23. PMID 11098467. "Pichia pastoris Expression System" (PDF). Invitrogen. Paul A. Colussi, Christopher H. Taron, Kluyveromyces lactis LAC4 promoter variants that lack function in bacteria but retain full function in K. lactis, Applied and Environmental Microbiology 71, 2005-11, עמ' 7092–7098 doi: 10.1128/AEM.71.11.7092-7098.2005 Fields S, Song O (1989). "A novel genetic system to detect protein-protein interactions". Nature. 340 (6230): 245–6. Bibcode:1989Natur.340..245F. doi:10.1038/340245a0. PMID 2547163. Mckenzie, Samuel (26 בפברואר 2019). "The Baculovirus Expression Vector System (BEVS)". news-medical.net. {{cite web}}: (עזרה) HINK, W. F. (1970-05-02). "Established Insect Cell Line from the Cabbage Looper, Trichoplusia ni". Nature (באנגלית). 226 (5244): 466–467. Bibcode:1970Natur.226..466H. doi:10.1038/226466b0. ISSN 1476-4687. PMID 16057320. Zheng GL, Zhou HX, Li CY (2014). "Serum-free culture of the suspension cell line QB-Tn9-4s of the cabbage looper, Trichoplusia ni, is highly productive for virus replication and recombinant protein expression". Journal of Insect Science. 14 (1): 24. doi:10.1093/jis/14.1.24. PMC 4199540. PMID 25373171. "Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniques" (PDF). Invitrogen. Kost, T; Condreay, JP (2002). "Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors". Trends in Biotechnology. 20 (4): 173–180. doi:10.1016/S0167-7799(01)01911-4. PMID 11906750. Walden R, Schell J (1990). "Techniques in plant molecular biology--progress and problems". European Journal of Biochemistry. 192 (3): 563–76. doi:10.1111/j.1432-1033.1990.tb19262.x. PMID 2209611. George Acquaah (16 באוגוסט 2012). Principles of Plant Genetics and Breeding. John Wiley & Sons Inc. ISBN 9781118313695. {{cite book}}: (עזרה) M Carmen Cañizares; Liz Nicholson; George P Lomonossoff (2005). "Use of viral vectors for vaccine production in plants". Immunology and Cell Biology. 83 (3): 263–270. doi:10.1111/j.1440-1711.2005.01339.x. PMC 7165799. PMID 15877604. Adelaide university, Chapter 4: vector construction and development of transgenic plants Fütterer J.; Bonneville J. M.; Hohn T (במאי 1990). "Cauliflower mosaic virus as a gene expression vector for plants". Physiologia Plantarum. 79 (1): 154–157. doi:10.1111/j.1399-3054.1990.tb05878.x. {{cite journal}}: (עזרה) Benfey PN, Chua NH (1990). "The Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter: Combinatorial Regulation of Transcription in Plants" (PDF). Science. 250 (4983): 959–66. Bibcode:1990Sci...250..959B. doi:10.1126/science.250.4983.959. PMID 17746920. Kishwar Hayat Khan (2013). "Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications". Adv Pharm Bull. 3 (2): 257–263. doi:10.5681/apb.2013.042. PMC 3848218. PMID 24312845. Berkner KL (1992). "Expression of heterologous sequences in adenoviral vectors". Current Topics in Microbiology and Immunology. 158: 39–66. doi:10.1007/978-3-642-75608-5_3. ISBN 978-3-642-75610-8. PMID 1582245. Hruby, DE (1990). "Vaccinia virus vectors: new strategies for producing recombinant vaccines". Clin Microbiol Rev. 3 (2): 153–170. doi:10.1128/cmr.3.2.153. PMC 358149. PMID 2187593. Kim DW1, Uetsuki T, Kaziro Y, Yamaguchi N, Sugano S (1990). "Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system". Gene. 91 (2): 217–23. doi:10.1016/0378-1119(90)90091-5. PMID 2210382.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Vinarov DA, Newman CL, Tyler EM, Markley JL, Shahan MN (2006). "Chapter 5:Unit 5.18. Wheat Germ Cell-Free Expression System for Protein Production". Current Protocols in Protein Science. Vol. Chapter 5. pp. 5.18.1–5.18.18. doi:10.1002/0471140864.ps0518s44. ISBN 9780471140863. PMID 18429309. Brödel AK1, Wüstenhagen DA, Kubick S (2015). "Cell-free protein synthesis systems derived from cultured mammalian cells". Structural Proteomics. Methods in Molecular Biology. Vol. 1261. pp. 129–40. doi:10.1007/978-1-4939-2230-7_7. ISBN 978-1-4939-2229-1. PMID 25502197.{{cite book}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Shayne Cox Gad (2007). Handbook of Pharmaceutical Biotechnology. John Wiley & Sons. p. 693. ISBN 978-0-471-21386-4. Alexander Dorozynski (2002). "Parents sue over contaminated human growth hormone". British Medical Journal. 324 (7349): 1294. doi:10.1136/bmj.324.7349.1294/b. PMC 1123268. PMID 12039815. Shayne Cox Gad (2007-05-25). Handbook of Pharmaceutical Biotechnology. John Wiley & Sons. p. 738. ISBN 978-0-471-21386-4. Bogdanich W, Koli E (2003-05-22). "2 Paths of Bayer Drug in 80's: Riskier One Steered Overseas". The New York Times: A1, C5. PMID 12812170. "bionetonline.org". אורכב מ-המקור ב-2010-06-17. נבדק ב-2010-06-12. Ian Sample (17 באוקטובר 2003). "Doctors discover why gene therapy gave boys cancer". Guardian. {{cite news}}: (עזרה) Sarah Boseley (30 באפריל 2013). "Pioneering gene therapy trials offer hope for heart patients". Guardian. {{cite news}}: (עזרה) Fischer, A.; Hacein-Bey-Abina, S.; Cavazzana-Calvo, M. (2010). "20 years of gene therapy for SCID". Nature Immunology. 11 (6): 457–460. doi:10.1038/ni0610-457. PMID 20485269.