מיקרוסקופיית שדה אפל

מיקרוסקופיית שדה אפל (dark-field microscopy) היא שיטת מיקרוסקופיה בה האור הנכנס לתוך המיקרוסקופ הוא האור המפוזר מהדגם, ולא האור המוחזר או העובר, כך שהרקע שמסביב לדגם נראה חשוך. השימוש בשיטה זו הוא בעיקר במיקרוסקופים אופטיים, אולם ניתן ליישמה גם במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM). מיקרוסקופ מעביר: ברוב המיקרוסקופים האופטיים, הדגם מואר מצידו האחד כך שחלק מהאור מתפזר, חלקו נבלע וחלקו עובר דרך הדגם אל צידו השני, ומשם לתוך עדשת האובייקטיב. מיקרוסקופ מחזיר: כידוע על פי חוקי ההחזרה של האור, זווית הפגיעה שווה לזווית ההחזרה. על-פי עיקרון זה, אם האור המאיר את הדגם הנמדד מגיע מתוך עדשת האובייקטיב - רובו יוחזר בחזרה לתוך העדשה, למעט חלק מהאור שהתפזר או נבלע בדגם. בשני סוגי המיקרוסקופים המתוארים לעיל, עבור דגמים קטנים, רוב האור (מהרקע) יגיע אל האובייקטיב, ואילו חלק קטן מהאור (מהדגם) יתפזר/יבלע כך שבאזור בו נמצא הדגם התמונה אמורה להיות חשוכה יותר. מכיוון שכושר ההפרדה (רזולוציה) של המיקרוסקופ מוגבל (כפי שגילה הפיזיקאי הגרמני ארנסט אבה), וכל נקודת אור נראית לאחר מעבר במערכת אופטית ככתם שקוטרו כחצי אורך גל בקירוב בעקבות פונקציית ההרחבה לנקודה (PSF), ייתכנו מצבים בהם הדגם או פרטים קטנים בתוכו, קטנים מגבול הרזולוציה כך שיהיה קשה מאוד או אפילו בלתי אפשרי להבחין בהם, מכיוון שכל נקודות אור שסביב האזור החשוך יראו ככתמים גדולים יותר, וכך הם "יכסו" את האזור החשוך. בחלק הימני של איור 2 ניתן לראות בשחור ולבן את החלקיק כפי שהיה נראה במיקרוסקופ שדה בהיר לולא הייתה פונקציית ההרחבה, ואילו בצהוב ניתן לראות את התמונה המתקבלת בפועל במיקרוסקופ, כאשר במקרה זה לא נוכל לראות את החלקיק כלל. בנוסף, קשה מאוד לראות דגמים שלהם ניגודיות נמוכה, מכיוון שהם יראו בהירים על רקע בהיר. בעזרת שדה אפל, דגמים אלו יראו בהירים על רקע כהה (ראו למטה בתמונה 1). על-מנת לפתור את הבעיה, ניתן להשתמש במיקרוסוקופיית שדה אפל. בשיטה זו האור המאיר את הדגם מגיע בזווית כך שאינו נכנס לתוך האובייקטיב, גם במקרה של מיקרוסקופ מחזיר (ראו איור 1) וגם במקרה של מיקרוסקופ מעביר. האור היחידי שיכנס אל תוך האובייקטיב הוא חלק מהאור המפוזר מהדגם, כך שבתמונה המתקבלת הרקע הוא חשוך לגמרי ורק באזור שבו נמצא הדגם נראה אור. גם בשיטה זו אי-אפשר לעבור את גבול הרזולוציה, אבל ניתן לראות בקלות חלקיקים קטנים שעוצמת האור המתפזרת מהם היא קטנה מאוד. בחלק השמאלי של איור 2 ניתן לראות בשחור ולבן כיצד חלקיק הקטן מגבול הרזולוציה היה נראה ללא ההרחבה, ובצהוב כיצד יראה בעקבות פונקציית ההרחבה, במיקרוסקופ שדה אפל. בתמונה 2 ניתן לראות צילום של כדוריות בקוטר 80 ננומטר במיקרוסקופ שדה אפל ובמיקרוסקופ שדה בהיר. השימוש במיקרוסקופיית שדה אפל נפוץ בתחומי מחקר ותעשייה שונים: ביולוגיה וביופיזיקה: פעמים רבות מסמנים מולקולות DNA או RNA, חלבונים או אזורים שונים בתא בעזרת כדוריות מתכתיות בקוטר של כמה עשרות ננו-מטרים. בעזרת מיקרוסקופ שדה בהיר, אין שום דרך להבחין בכדוריות אלו, אולם במיקרוסקופיית שדה אפל ניתן לראות אותן בקלות (ראו תמונה 2). רפואה: למרכיבי דם שונים יש ניגודיות נמוכה, כך שקשה לראותם במיקרוסקופ שדה בהיר, אבל ניתן להבחין בהם בקלות במיקרוסקופ שדה אפל. מיקרואלקטרוניקה: כאשר מסתכלים על מעגל משולב בעזרת מיקרוסקופ שדה אפל, ניתן להבחין בפרטים שאין אפשרות להבחין בהם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. על מנת ליצור את הארת השדה האפל, צריך לדאוג לאלומת אור טבעתית, כך שמרכזה חשוך (ראו תמונה 3), ויש מספר דרכים לעשות זאת: מיקרוסקופ מחזיר: ישנן שתי דרכים עיקריות ליצור הארת שדה אפל במיקרוסקופ מחזיר. הדרך הראשונה היא לשים דיסקה החוסמת את מרכז אלומת האור (ראו איור 3 למעלה), בהמשך האור מוסט לכיוון עדשת האובייקטיב בעזרת מראה חצי מחזירה או מפצל קרן. בדרך השנייה, האור מוסט לתוך האובייקטיב בעזרת מראה טבעתית (ראו איור 3 באמצע). בשתי האפשרויות האור המגיע לתוך עדשת האובייקטיב מתמקד כך שצורת אלומת האור הנוצרת היא מעין חרוט חלול שקודקודו פוגע בדוגמה עליה מסתכלים. בגלל המבנה המיוחד של עדשות אובייקטיב מסוג זה (ראו תמונה 4), האור נאסף מהדוגמה רק אל מרכז העדשה ולכן השטח האפקטיבי של העדשה קטן יותר. מסיבה זאת המִפְתָח הנומרי (numerical aperture, NA) של האובייקטיב יהיה קטן בהשוואה לאובייקטיב שדה בהיר. מיקרוסקופ מעביר: מכיוון שבמיקרוסקופ מעביר אלומת האור לא מגיעה מתוך האובייקטיב, אין צורך באובייקטיב מיוחד. את הארת השדה האפל יוצרים בעזרת דיסקה שחוסמת את מרכז אלומת האור. גם במקרה זה צורת אלומת האור הנוצרת היא חרוט חלול, כאשר הדוגמה עליה מסתכלים ממוקמת בקודקוד החרוט. זווית הראש של החרוט צריכה להיות כך שלא ייכנס אור מהאלומה לתוך האובייקטיב (ראו איור 3 למטה). מדיה וקבצים בנושא מיקרוסקופיית שדה אפל בוויקישיתוף אברהם גולדין, הארה בשדה אפל לכל דיכפין, העלון למורי הביולוגיה, חוברת ג', אייר התשמ"ח 1988, 113. המרכז לרפואה משולבת Braslavsky, I., Amit, R., Ali, B. M. J., Gileadi, O., Oppenheim, A. & Stavans, J., Objective-type dark-field illumination for scattering from microbeads. Applied Optics, 2001. 40: p. 5650-5657. Charlotte K. Omoto, Joan Folwell, Using Darkfield Microscopy To Enhance Contrast: An Easy and Inexpensive Method. http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/darkfield.html (אורכב 08.07.2009 בארכיון Wayback Machine) http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/darkfieldreflect.html (אורכב 06.12.2008 בארכיון Wayback Machine) https://web.archive.org/web/20070714110459/http://www.nanophys.kth.se/nanophys/facilities/nfl/nikon-me600/darkfield/darkfield-epi.html https://web.archive.org/web/20110301001204/http://www.serafin.ch/serafin/darkfield-microscopy