Apaf1

Apaf1 (ראשי תיבות באנגלית של Apoptotic protease activating factor 1 – גורם משפעל פרוטאז אפופטוטי 1) הוא גן המקודד לחלבון ציטופלזמי היוצר את מכלול האפופטוזום, יחד עם ציטוכרום c ועם dATP. מכלול זה מהווה את אחד ממרכזי הבקרה החשובים ביותר של האפופטוזה - הוא קושר ומבקע את החלבון פרוקספאז 9, משחרר אותו בצורתו הבוגרת והפעילה, וכך מפעיל את המסלול האפופטוטי הפנימי המסתיים במוות מכוון של התא. גן זה ממוקם בבני אדם בכרומוזום 12, והוא הומולוג לגן CED4 אצל C. elegans. החלבון Apaf-1 בנוי בצורת Y, ומשקלו המולקולרי נע בטווח שבין 133.3-141.8 קילודלטון בין האיזופורמים השונים (למעט האיזופורם Apaf1ALT).‏ Apaf-1 מורכב מדומיין CARD המשמש לגיוס קספאזות בקצה האמיני שלו, מדומיין NOD מרכזי ומדומיין WD40. לשחבור החליפי תפקיד חשוב בבקרת ביטוי הגן Apaf1 ובתפקודיו התאיים. שחבור חליפי של ה-mRNA של Apaf1 יכול ליצור אקסון נוסף בעל 11 חומצות אמינו בקצה האמיני של החלבון בין דומיין CARD לדומיין NOD, או/ו אקסון שני הכולל חזרה נוספת של רצף WD40 בת 43 חומצות אמינו בין החזרה החמישית והשישית בדומיין WD40 בקצה הקרבוקסילי של החלבון. עד כה דווחו לפחות על 6 איזופורמים של Apaf1: ‏Apaf1XL, ‏Apaf1L, ‏Apaf1M,‏ Apaf1S,‏ Apaf1XS ו-Apaf1ALT. האיזופורם Apaf1XL הוא האיזופורם העיקרי שמבוטא אצל יונקים; גודלו 142 קילודלתון והוא מורכב מ-1,248 חומצות אמינו, והוא כולל את 2 האקסונים הנוספים - הן זה שבצד האמיני והן זה שבצד הקרבוקסילי. דומיין CARD (‏Caspase Activation and Recruitment Domain) מורכב מ-100 (בקירוב) שיירי חומצת האמינו הראשונים של Apaf-1, ומתפקד כאתר הגיוס של פרוקספאז 9 באמצעות יצירת אינטראקציית CARD-CARD יחד עם דומייני CARD אחרים המצויים אצל פרוקספאז 9. המבנה התלת־ממדי של Apaf-1 ושל האפופטוזום האנושי נחקר ונקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ובאמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן; לדומיין CARD של Apaf-1 מבנה גלובולרי ארוז היטב, והוא מורכב מצרור של 6 סלילי המקופל בצורת מפתח יווני (Greek key), הידועה גם בשם "קיפול המוות". פני השטח של הסלילים H1/H1'/H4 מורכב משיירי חומצות אמינו בסיסיות - ליזין וארגינין (Arg6 ,Arg13 ,Lys42 ,Lys58 ,Lys62 ו-Lys63), הגורמים לפני השטח להיות קעורים, בה בשעה שהצד הנגדי של החלבון (סלילים H2/H3/H5/H6) הוא בעיקרו חומצי ומורכב בעיקר מחומצות האמינו אספרטט וגלוטמט (Asp27, Asp32 ,Asp64 ,Asp66 ,Glu40 ,Glu41 ו-Glu78), הגורמים לפני השטח להיות קמורים. מחקרים בהם נעשה שימוש במוטגנזה מכוונת הצביעו על כך שהשיירים Asp27 על סליל H2 ו-Glu40 על סליל H3, אשר יוצרים את ליבת פני השטח החומציים בדומיין ה-CARD של APAF-1, מעורבים ביצירת אינטראקציית CARD-CARD עם קספאז 9; מוטציה של אחד משיירים אלו לחומצת האמינו אלנין הפסיקה לחלוטין את היכולת ליצור אינטראקציה כזו. לעומת זאת, מוטציות ב-4 השיירים הבסיסיים Arg13,‏ Lys42,‏ Lys58 ו-Lys62 שמרכיבים את הצד הטעון חיובית של דומיין CARD ב-APAF-1, והחלפתן לאלנין, לא השפיעו על יצירת האינטראקציה בין APAF-1 לבין קספאז 9. מכאן שלסלילים H2 ו-H3 יש תפקיד חשוב בזיהוי וביצירת האינטראקציה עם קספאז 9. מלבד הפונקציה של גיוס קספאז 9, לדומיין CARD ב-APAF-1 יש גם יכולת ליצור קשרי CARD-CARD רבים נוספים עם קספאז 9, המשחקים תפקיד חשוב באיקטובה של הקספאז. דומיין NOD (‏Nucleotide-binding Oligomerization Domain) מעורב באוליגומריזציה ובקשירת נוקליאוטידים של APAF-1, ומורכב ממספר חלקים: דומיין קשירת נוקליאוטידים (NBD) - בעל ארכיטקטורה של סנדוויץ' α/β תלת שכבתי, באופן שבמרכז יש 5 משטחי בטא מקבילים (β1-β5) המכוסים מ-2 הצדדים ב-4 סלילי אלפא. דומיין זה קושר dATP או ATP, הדרושים ליצירת קומפלקס האפופטוזום. HD1 (‏Helical domain 1) - דומיין המכיל מספר סלילי אלפא קצרים, הכוללים את α16-α19. WHD (‏winged-helix domain) - ממוקם בין HD1 ל-HD2, והוא דומיין המצוי בדרך כלל בפקטורי שעתוק של אוקריוטיים. HD2 (‏Helical domain 2) - דומיין הכולל 8 סלילי אלפא ובעל קונפורמציה של סופר הליקס (סופר סליל) בעל סיבוב ימני. דומיין WD40 משמש בתפקיד בקרה ב-APAF-1, ובעל יכולת של אוטו-אינהיביציה (יכולת עיכוב עצמית) באמצעות שינוי קונפורמציה של החלבון. כאשר נוצרת אינטראקציה בין דומיין WD40 לבין ציטוכרום c, חל שינוי קונפורמציה באופן שמאפשר את גיוסו של קספאז 9. באופן טיפוסי, הדומיין מורכב ממספר חזרות של רצף בן 44 - 60 חומצות אמינו, המקופלות יחד ליצירת דומיין. רצף זה בנוי למעשה מ-3 רצפים: רצף שמור בליבה, שמאוגף בקצה האמיני שלו על ידי 11 - 24 דיפפטידים של GH (גליצין-היסטידין) ובקצה הקרבוקסילי שלו מדיפפטידים של WD (טריפטופן-חומצה אספרטית). הדומיין מורכב מ-2 מבנים של "β-propeller" (דמוי פרופלור) המכונים WD1 ו-WD2. המבנה של β-propeller מכיל בדרך כלל 4 - 8 "להבים", ובמקרה של Apaf1, הדומיין מורכב מ-2 β-propeller א-סימטריים, שאחד מהם מכיל 7 להבים (WD1) והשני 8 להבים (WD2). ‏WD1 משתרע על פני שיירי חומצות האמינו 608 - 910, ואילו WD2 משתרע על השיירים 593 - 598 ו-921 - 1249. המבנה של ה-β-propeller הוא מאוד קשיח ולכן שינויי קונפורמציה אצלו מוגבלים מאוד. שני ה-β-propeller ממוקמים ב-Apaf1 בחלק העליון של דומיין NOD, כאשר WD2 ממוקם מעל דומיין HD2, ו-WD2 יוצר קשר עם הדומיינים HD2 ו-NBD. המבנה התלת-מימדי של האפופטוזום האנושי, מבט מלמעלה ומבט מהצד. החלק הצבוע במג'נטה - דומיין CARD המבנה האטומי של האפופטוזום האנושי. מרכיביו של Apaf1 מתוארים בפרוטרוט גורמי עקה תוך-תאיים כגון נזקי דנ"א, קרינת על סגול (UV) ועוד, עלולים לגרום לשחרור של ציטוכרום c מהמיטוכונדריה לציטופלזמה ובסופו של דבר למוות תאי מתוכנת במסלול האפופטוטי. בציטופלזמה, מולקולות ציטוכרום c נקשרות למולקולות Apaf1, ובעקבות אינטראקציה זו וההחלפה של ADP ב-ATP, ‏Apaf1 משנה את המבנה הרבעוני שלו למבנה הפטמרי (אוליגומר) וכך מסוגל לגייס מולקולות של פרוקספאז 9 (בצורתן הבלתי פעילה). הקומפלקס שנוצר נקרא אפופטוזום, ומשמש כפלטפורמה תאית לאקטיבציה של פרוקספאז 9 במסלול הפנימי של האפופטוזה. קספאז 9 בתורו מאקטב את הקספאזות ה"מוציאות לפועל" (executioner caspases) -‏ 3, 6 ו-7, שלהן עשרות רבות של מטרות חלבוניות הקשורות לשלד התא, לתיקון נזקי דנ"א ועוד, אותן הן מבקעות ומפסיקות את פעילותן ובכך מוציאות לפועל את מסלול האפופטוזה. האפופטוזום מורכב מ-7 מולקולות של Apaf1, להן 7 דומייני CARD. ל-Apaf1 דרושים ציטוכרום c ו-dATP לאוליגומריזציה שלו וליצירת האפופטוזום. Apaf1 אמנם נקשר לציטוכרום c גם בהיעדר dATP או ATP, אך אינו יכול לעבור אוליגומריזציה וליצור את קומפלקס האפופטוזום. הביטוי של Apaf1 בתא הוא נמוך, ועל כן הוא הגורם המגביל בתהליך יצירת האפופטוזום ובהפעלת המסלול האפופטוטי. הבקרה על הביטוי של Apaf1 נעשית בשלבי השעתוק והתרגום. האזור הלא מתורגם בקצה 5' של ה-mRNA המקודד ל-Apaf1 מכיל קומפלקס רנ"א בעל אלמנט מבני המכונה IRES - אזור אליו הריבוזום יכול להיקשר באופן ישיר, ללא תלות בסריקה מכיוון ה-5' ("סריקה ללא תלות ב-cap"). הסריקה הרגילה של הריבוזום ("סריקה תלוית-cap") פוחתת בעקבות תנאי עקה כגון היפוקסיה, הלם אוסמוטי, הלם חום ועוד, ומנגנון ה-IRES פועל להתחלת סינתזה של החלבון על מנת לשמור על ריכוז קבוע של Apaf1 בתא. עלייה בביטוי של Apaf1 נגרמת על ידי פקטור השעתוק E2F1, שלו תפקיד חשוב בהגברת הביטוי של גנים הקשורים לשכפול דנ"א ולבקרה על שלב S במחזור התא. נוסף על כך, Apaf1 הוא מטרה ישירה של "שומר הגנום" p53, היכול להגביר את שעתוקו. מלבד תפקידו החשוב במסלול האפופטוטי, ל-Apaf1 יש גם השפעה על מחזור התא בעקבות נזק לדנ"א שנגרם על ידי עקה גנטוקסית. 4 האיזופורמים העיקריים של Apaf1: ‏Apaf1XL, ‏Apaf1L, ‏Apaf1M ו-Apaf1S מתווכים עיכוב של מחזור התא בעקבות עקה גנטוקסית ובאמצעות אקטיבציה של Chk1. לצורך תפקיד א-אפופטוטי זה נדרשת טרנסלוקציה של Apaf1 לגרעין התא במהלך השלבים G1-S; הטרנסלוקציה מתבצעת על ידי הקינאזות ATM ו-ATR (המאוקטבים בעקבות נזק לדנ"א). טרנסלוקציה לגרעין של Apaf1 על ידי ATR מתרחשת בתגובה לגלי על סגול קצרים (UV-C) וכן בתגובה לציספלאטין, ואילו על ידי ATM בתגובה לקרינת גמא. לאחר אקטובם של ATR/ATM, הללו מעלים את רמות הזרחון של Apaf1, דבר המתבטא בשינויים קונפורמטיביים שמביאים לתעדוף יצירת אינטראקציה בין Apaf1 ל-Nup107. ‏Nup107 מורכב מ-9 תת-יחידות ומהווה חלק מה-NPC (נקב הגרעין), שתפקידו לתווך מעבר מקרומולקולות בין הציטופלזמה והגרעין. האינטראקציה בין Nup107 ל-Apaf1 דרך דומיין NBD שלו גורמת להצטברות של Apaf1 בציטופלזמה לאחר עקה גנטוקסית. לאחר כניסתו של Apaf1 לגרעין התא מתרחשת אקטיבציה של Chk1, אשר לו תפקיד בבקרת מחזור התא, בעצירת מחזור התא ובתיקון נזקי דנ"א. למספר רב של חלבונים יש את היכולת להיקשר ישירות ל-Apaf1 וכך לבקר את יצירת האפופטוזום, בהם למשל: חלבוני עקת חום (HSP) - ביטוין של תת-המשפחות HSP27,‏ HSP70 ו-HSP90 עולה כתוצאה מחשיפה לריבוי "אותות מוות", כגון נזקי דנ"א, קרינת UV, עקת ER, עקת חום ועוד, ותפקידן להגן על התאים מפני אפופטוזה. כך HSP90 נקשר לדומיין WD40 של Apaf1, ולא מאפשר את האוליגומריזציה עם ציטוכרום c ואת יצירת האפופטוזום. לעומת זאת, עלייה בביטויו של HSP70 מאפשרת לו להיקשר ישירות לדומיין CARD של Apaf1 ולמנוע את גיוס פרוקספאז-9, וכמובן את יצירת האפופטוזום; ניתן לראות עלייה בבטויו של HSP70 במגוון של גידולים סרטניים, דהיינו חלבון זה הוא בעל פוטנציאל אונקוגני. מאידך, בתנאים ובריכוזים תוך-תאיים שונים, HSP70 (יחד עם החלבונים PHAPI ו-CAS) יכול לשמש בתפקיד פרו-אפופטוטי ולסייע למסלול זה, ולהגביר את יכולת קשירת ה-ATP של Apaf1. חלבוני HSP יכולים למנוע אפופטוזה גם במנגנונים שאינם תלויי קישור ל-Apaf1; ‏HSP27, למשל, אינו נקשר ישירות ל-Apaf1, אלא מתחרה איתו על הקישור לציטוכרום c, ובכך מונע את יצירת האפופטוזום. Aven - חלבון מעכב אפופטוזה השמור אצל יונקים, ומצוי ברקמות רבות בגוף אך בעיקר בלב, בכליות, בשרירי שלד, בכבד, בלבלב ובאשכים. Aven יכול להיקשר לדומיין CARD של Apaf1, וכך למנוע את שפעולו של קספאז 9 על ידי האפופטוזום. יש לציין שבשמרים נמצא כי Aven יוצר אינטראקציה גם עם החלבון האנטי-אפופטוטי Bcl-xL ומייצב אותו. APIP - חלבון המצוי בריכוזים גבוהים ברקמת הלב ובשרירי השלד, אשר באפשרותו לעכב שפעול של קספאז 9 ולמנוע את התקדמות המסלול הפנימי של האפופטוזה. הוא יכול לעשות זאת ב-2 אופנים: האחת, תלוית-Apaf1, ובה APIP מתחרה עם קספאז 9 על הקישור לדומיין CARD של Apaf1; והשנייה, שאינה תלוית-Apaf1, ובה APIP משרה שפעול קבוע של AKT ושל ERK1/2, אשר נקשרים ישירות לקספאז 9 ומונעים את שפעולו. PARCS HCA66 - בקר חיובי של Apaf1, הנקשר לדומיין ה-NBD שלו. באפשרותו לקדם משמעותית אפופטוזה תלוית-Apaf1 על ידי העלאת כמות האפופטוזומים הפעילים בתא. GRCh38: Ensembl גרסה 89: ENSG00000120868 - Ensembl, מאי 2017 GRCm38: Ensembl גרסה 89: ENSMUSG00000019979 - Ensembl, מאי 2017 "Human PubMed Reference:". "Mouse PubMed Reference:". Shakeri, Raheleh, Asma Kheirollahi, and Jamshid Davoodi. "Apaf-1: regulation and function in cell death." Biochimie 135 (2017): 111-125. Qin, Hongxu, et al. "Structural basis of procaspase-9 recruitment by the apoptotic protease-activating factor 1." Nature 399.6736 (1999): 549. .Riedl, Stefan J., et al. "Structure of the apoptotic protease-activating factor 1 bound to ADP" Nature 434.7035 (2005): 926. Smith, Temple F., et al. "The WD repeat: a common architecture for diverse functions.". Trends in biochemical sciences 24.5 (1999): 181-185. Cain, Kelvin, Shawn B. Bratton, and Gerald M. Cohen. "The Apaf-1 apoptosome: a large caspase-activating complex". Biochimie 84.2-3 (2002): 203-214. Saleh, Ayman, et al. "Cytochrome c and dATP-mediated oligomerization of Apaf-1 is a prerequisite for procaspase-9 activation." Journal of Biological Chemistry 274.25 (1999): 17941-17945. Coldwell, Mark J., et al. "Initiation of Apaf-1 translation by internal ribosome entry." Oncogene 19.7 (2000): 899. Zermati, Yael, et al. "Nonapoptotic role for Apaf-1 in the DNA damage checkpoint." Molecular cell 28.4 (2007): 624-637. Beere, Helen M., et al. "Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome." Nature cell biology 2.8 (2000): 469. Kim, Hyun-Eui, et al. "PHAPI, CAS, and Hsp70 promote apoptosome formation by preventing Apaf-1 aggregation and enhancing nucleotide exchange on Apaf-1." Molecular cell 30.2 (2008): 239-247. Bruey, Jean-Marie, et al. "Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c." Nature cell biology 2.9 (2000): 645. Chau, B. Nelson, et al. "Aven, a novel inhibitor of caspase activation, binds Bcl-xL and Apaf-1." Molecular cell 6.1 (2000): 31-40. Cho, Dong-Hyung, et al. "Induced inhibition of ischemic/hypoxic injury by APIP, a novel Apaf-1-interacting protein." Journal of Biological Chemistry 279.38 (2004): 39942-39950. Cho, D. H., et al. "Suppression of hypoxic cell death by APIP-induced sustained activation of AKT and ERK1/2." Oncogene 26.19 (2007): 2809. Piddubnyak, Valeria, et al. "Positive regulation of apoptosis by HCA66, a new Apaf-1 interacting protein, and its putative role in the physiopathology of NF1 microdeletion syndrome patients." Cell death and differentiation 14.6 (2007): 1222.