מבחן קואגולאז

מבחן קואגולאז (באנגלית: Coagulase test) הוא אחד מהמבחנים הביוכימיים המקובלים במיקרוביולוגיה שמיועד לשם ביצוע הבחנה ראשונית בין סוגים ומינים שונים של חיידקים. במיקרוביולוגיה קלינית משתמשים במבחן זה, בדרך כלל, על מנת לבצע הבחנה של חיידקי Staphylococcus aureus מיתר החיידקים השייכים לסוג Staphylococcus. המבחן מתבסס על יכולתו (או אי-יכולתו) של מיקרואורגניזם להפוך פיברינוגן, באמצעות האנזים קואגולאז, לפיברין ובכך לגרום להקרשה של פלזמה הנראית לעין. את המבחן מבצעים בדרך כלל על גבי זכוכית נושאת של מיקרוסקופ, או בתוך מבחנה. קואגולאז הוא אנזים מקבוצת הפרוטאזות, שמסונתז על ידי מספר מיקרואורגניזמים, שביכולתו להפוך את החלבון פיברינוגן לפיברין ולגרום בכך לקרישת הדם. בחלק מחיידקים בסוג Staphylococcus ניתן למצוא שני איזופורמים של האנזים: קואגולאז קשור (Bound coagulase, נקרא גם Clumping factor), וקואגולאז מופרש-חופשי(Free-secreted coagulase, נקרא גם Staphylocoagulase). לשני האיזופורמים אופן פעילות שונה ונוכחותם מהווה גורם אלימות מרכזי בחיידקים שמסנתזים אותם. להלן אופן פעולת הקואגולאז על שני האיזופורמים שלו בחיידקים מהסוג Staphylococcus: קואגולאז קשור - קואגולאז קשור הוא חלק מקבוצת חלבונים אשר נקראים MSCRAMMs ‏(Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules), להם תפקיד מרכזי באדהזיה של חיידקים. חלבונים אלה מאפשרים לחיידקים להצמד אחד לשני ולרקמות תאים, דבר שמהווה שלב מקדים ביצירת ביופילם ובחיידקים פתוגניים להתחלת התחלואה. לקואגולאז זה זיקה גבוהה מאוד למולקולות פיברינוגן, דבר שמוביל ליצירת תצמידי חיידק-פיברינוגן ולאגרגציה תלוית פיברינוגן של חיידקים עם מרכיבי הדם, דוגמת טסיות. קואגולאז חופשי-מופרש - מבחינה ביוכימית מגיב הקואגולאז החופשי בדם עם הצורה הבלתי פעילה של החלבון פרותרומבין ויוצר בכך קומפלקס שנקרא סטפילותרומבין (Staphylothrombin). יצור קומפלקס זה מאפשר את חיתוכו של פיברינוגן לפיברין, דבר שמוביל לקרישת הדם ולאגרגציה של טסיות. בחיידקים מהמין Staphylococcus aureus פועלים שני האיזופורמים הללו בסינרגיה: חיידקים אלה קושרים אליהם מולקולות של פיברינוגן באמצעות האיזופורם הקשור ויוצרים אגרגטים תלויי פיברינוגן עם טסיות. במקביל מופרשים האיזופורמים החופשיים שיוצרים תצמידי סטפילותרומבין. קומפלקסי סטפילותרומבין יוצרים מעטפת פיברינית סביב תאי החיידקים. יצירת מעטפת פיברינית סביב החיידקים בזרם הדם מגנה עליהם בפני פעילות מערכת החיסון של המאכסן, בכך שהיא מקשה על תהליך הפגוציטוזה ועל אופסוניזציה של נוגדנים. בהמשך לנאמר חשוב לציין שקיימים זנים של Staphylococcus aureus שאינם מייצרים קואגולאז כלל. להלן שתי השיטות הנפוצות לביצוע מבחן קואגולאז על כל שלביהן: באמצעות כלי מתאים (פיפטה, טפי וכדומה) יש למקם שתי טיפות סליין על גבי הזכוכית הנושאת. טיפה אחת לביצוע המבחן עצמו וטיפה שנייה לביצוע ביקורת שלילית. באמצעות מחט בקטריולוגית, או קיסם עץ סטרילי יש להרים מושבת חיידקים מבודדת, נקייה וטרייה מעל צלחת פטרי (24 שעות לאחר זריעה על מצע אגר) ולמרוח אותה בעדינות בתוך טיפת סליין שמיועדת לבדיקה עצמה עד ליצירת תערובת הומוגנית. באמצעות כלי מתאים (פיפטה, טפי וכדומה) יש למקם שתי טיפות פלזמה שמסופקות בערכה מסחרית (לרוב משתמשים בפלזמה של ארנבת בתוספת נוגד הקרישה EDTA), את האחת בתוך תמיסת הסליין שמעורבבת עם מושבת החיידקים ואת השנייה בתוך טיפת הסליין ללא החיידקים שמיועדת לביקורת שלילית. באמצעות מחט בקטריולוגית או קיסם עץ סטרילי יש לערבב בעדינות את שתי הטיפות. אם כעבור 5-10 שניות ניתן להבחין בהיווצרות של אגלוטינציה, אזי המיקרואורגניזם שנבדק יקרא קואלגולאז-חיובי. אם כעבור 5-10 שניות לא ניתן להבחין בהיווצרות של אגלוטינציה, אזי המיקרואורגניזם שנבדק יהיה חשוד לקואגולאז-שלילי. במצב זה יש צורך לבצע את מבחן הקואגולאז בשיטת המבחנה. שיטה זאת מיועדת לבדוק את נוכחות האיזופורם הקשור של הקואגולאז. באמצעות כלי מתאים (פיפטה, טפי וכדומה) יש להרים 2-3 מושבות חיידקים מבודדות, נקיות וטריות מעל צלחת פטרי (24 שעות לאחר זריעה על מצע אגר) ולטבול אותן בתוך 0.5 מיליליטר פלזמה של ארנבת. יש לערבב את המושבות עם הפלזמה שבמבחנה עד ליצירת תערובת הומוגנית. את המבחנה יש להדגיר במשך 4 שעות בטמפרטורה של 35-37 מעלות צלזיוס. לאחר 4 שעות יש לבדוק את המבחנה לאיתור קריש פיברין הנראה לעין. במידה ונוצר קריש פיברין הנראה לעין, אזי המיקרואורגניזם שנבדק יקרא קואגולאז-חיובי. במידה ולא נוצר קריש פיברין הנראה לעין, יש להמשיך להדגיר את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 20 שעות נוספות: במידה ונוצר קריש פיברין הנראה לעין, אזי המיקרואורגניזם יקרא קואגולאז-חיובי. במידה ולא נוצר קריש פיברין הנראה לעין, אזי המיקרואורגניזם יקרא קואגולאז-שלילי. שיטה זאת מיועדת לבדוק את נוכחות האיזופורם החופשי של הקואגולאז והיא מהווה אסמכתה סופית לקביעת נוכחותו של האנזים בחיידק הנבדק. קבלת תוצאה חיובית במבחן הזכוכית הנושאת מספיקה אמנם על מנת לקבוע כי המיקרואורגניזם הנבדק הוא קואגולאז-חיובי, אולם יש לזכור כי שיטה זאת מיועדת לבדוק את נוכחות האיזופורם הקשור של הקואגולאז. לפיכך מומלץ לבצע את המבחן גם בשיטת המבחנה. קבלת אגלוטינציה במבחן הזכוכית הנושאת בטיפת הביקורת השלילית מעידה על אגלוטינציה עצמית (Autoagglutination). לפיכך לא ניתן להסתמך על תוצאות שיטה זאת ויש צורך לבצע את המבחן בשיטת המבחנה. קבלת תוצאה שלילית בשיטת המבחנה מעידה אמנם על כך שהחיידק אינו מייצר קואגולאז, אולם מבחינה מיקרוביולוגית לא ניתן לשלול בוודאות מוחלטת קבלת תוצאה שלילית שגויה (False negative) ומקרים בהם מדובר בזני Staphylococcus aureus שלא מייצרים קואגולאז כלל. לכן במצב זה מומלץ לשלב ביצוע מבחנים ביוכימיים ומולקולריים נוספים לשם הזיהוי. קבלת תוצאה חיובית חזקה, בשתי השיטות, רומזת אמנם על כך שהחיידק המדובר הוא, ככל הנראה, Staphylococcus aureus, אולם יש לזכור כי מינים אחרים בסוג Staphylococcus וכן חיידקים מסוימים בסוגים אחרים ידועים כמייצרי קואגולאז. לכן על מנת לקבוע בצורה חד משמעית את סוג ומין החיידק יש לשלב ביצוע מבחנים ביוכימיים ומולקולריים נוספים. לא מומלץ להשתמש במושבות ישנות מעבר ל-24 שעות אחרי זריעה על מצע אגר, שכן תהליכי הזדקנות במושבה עלולים להוביל לקבלת תוצאות שליליות שגויות. אין לחכות להתייבשות הטיפות בעת ביצוע שיטת הזכוכית הנושאת, שכן התייבשות הטיפות תגרום להופעת משקעים שעלולים להוביל לפענוח שגוי של המבחן כחיובי (False positive). ייתכן מצב שבו לא ניתן יהיה לראות בבירור את תוצאות האגלוטינציה בעת ביצוע שיטת הזכוכית הנושאת. במצב זה יש להיעזר בזכוכית מגדלת. שיטת המבחנה מהווה אסמכתה סופית לנוכחותו של הקואגולאז בחיידק הנבדק. אולם בדיקה בשיטה זאת עלולה להמשך עד 24 שעות. יכולת הבחנה מהירה של חיידקים ממין Staphylococcus aureus במעבדה מיקרוביולוגית קלינית נמצאת בחשיבות עליונה. לכן מפאת חיסכון בזמן מעדיפות מעבדות מיקרוביולוגיות קליניות רבות להשתמש במבחן קואגולאז מהיר בשיטת אגלוטינציה עם חרוזי לטקס. שיטה זאת משלבת בתוכה את איתורם של הקואגולאז הקשור וכן חלבונים ייחודיים אחרים ל-Staphylococcus aureus, דוגמת חלבון A ‏(Protein A). בשיטה זאת מתקבלת תוצאה מהירה גם במקרים בהם מדובר בזנים שלא מייצרים קואגולאז כלל. Staphylococcus: Staphylococcus aureus Staphylococcus delphini Staphylococcus hyicus Staphylococcus intermedius Staphylococcus lutrae Staphylococcus pseudintermedius Staphylococcus schleiferi Yersinia: Yersinia pestis Staphylococcus aureus מגוון סרטונים המתארים ביצוע של מבחן קואגולאז באתר Youtube ‏Coagulase test protocol. Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller. Medical microbiology (5th ed.). Elsevier Mosby. 2005, p.223. ISBN 978-0323033039. Miajlovic H, Loughman A, Brennan M, Cox D, Foster TJ. (2007). Both complement- and fibrinogen-dependent mechanisms contribute to platelet aggregation mediated by Staphylococcus aureus clumping factor B. Infection and Immunity. Jul;75(7):3335-43. PMID 17438032. Vanassche T, Kauskot A, Verhaegen J, Peetermans WE, van Ryn J, Schneewind O, Hoylaerts MF, Verhamme P. (2012). Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thrombosis and Haemostasis. Jun;107(6):1107-21. PMID 22437005. ‏Coagulase Test: Principle, procedure and interpretation. Moreillon P, Entenza JM, Francioli P, McDevitt D, Foster TJ, François P, Vaudaux P. (1995). Role of Staphylococcus aureus coagulase and clumping factor in pathogenesis of experimental endocarditis. Infection anf Immunity. Dec;63(12):4738-43. PMID 7591130. ‏Possible virulence determinants expressed in the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Personne P, Bes M, Lina G, Vandenesch F, Brun Y, Etienne J. (1997). Comparative performances of six agglutination kits assessed by using typical and atypical strains of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. May;35(5):1138-40. PMID 9114395. Sasaki T, Tsubakishita S, Tanaka Y, Sakusabe A, Ohtsuka M, Hirotaki S, Kawakami T, Fukata T, Hiramatsu K. (2010). Multiplex-PCR method for species identification of coagulase-positive staphylococci. Journal of Medical Microbiology. Mar;48(3):765-9. PMID 20053855. ‏Coagulase - US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH).