ריצוף אקסום

ריצוף אקסומים, הידוע גם כ-whole exome sequencing ריצוף אקסום שלם (WES), הוא טכניקה גנומית לריצוף כל האזורים המקודדים לחלבונים של גנים בגנום (המכונה אקסום). תהליך הריצוף מורכב משני שלבים: השלב הראשון הוא לבחור רק את אזורי ה-DNA המקודדים לחלבונים. אזורים אלה ידועים כאקסונים – לבני אדם יש כ-180,000 אקסונים, המהווים כ-1% מגנום האדם, או קרוב ל-30 מיליון זוגות בסיסים. השלב השני הוא ריצוף ה-DNA האקסוני באמצעות כל טכנולוגיית ריצוף DNA בתפוקה גבוהה. המטרה של גישה זו היא לזהות וריאנטים גנטיים שמשנים את רצפי החלבון, ולעשות זאת בעלות נמוכה בהרבה מריצוף גנום שלם. כיוון שווריאנטים אלו יכולים לגרום הן למחלות מנדליות והן למחלות פוליגניות נפוצות, כגון מחלת אלצהיימר, לריצוף אקסומים שלם יש שימוש במחקר אקדמי וגם כאבחון קליני. ריצוף אקסומים יעיל במיוחד בחקר מחלות מנדליות נדירות, מכיוון שהוא דרך יעילה לזהות את הווריאנטים בכל הגנים של הנבדק. מחלות אלו נגרמות לרוב על ידי וריאנטים גנטיים נדירים ביותר שקיימים רק במספר זעיר של פרטים; לעומת זאת, טכניקות כמו מערכי SNP יכולות לזהות רק וריאנטים גנטיים משותפים השייכים לפרטים רבים באוכלוסייה הכללית. בעבר, בדיקות גנטיות קליניות נבחרו על סמך ההצגה הקלינית של המטופל (כלומר התמקדו בגן אחד או במספר קטן הידוע כקשור לתסמונת מסוימת), או סקרו רק סוגים מסוימים של וריאנטים (למשל הכלאה גנומית השוואתית ). אך הבדיקות סיפקו אבחנות גנטיות סופיות בפחות ממחצית מכלל החולים. שיטות העשרה של target-ים מאפשרות ללכוד באופן סלקטיבי אזורים גנומיים מעניינים מדגימת DNA לפני שמבצעים את הריצוף. מספר אסטרטגיות להעשרת target-ים פותחו מאז פותח המקור של שיטת הברירה הגנומית הישירה (DGS) בשנת 2005. למרות שתוארו טכניקות רבות ללכידה ממוקדת, רק כמה מהן הורחבו ללכידת אקסומים שלמים. אסטרטגיית העשרת היעד הראשונה ( target enrichment strategy) שיושמה על רצף שלם של אקסומים הייתה שיטת הלכידה ההיברידית מבוססת מערך בשנת 2007, אך ה'לכידה בפתרון' צברה פופולריות בשנים האחרונות. מיקרו - מערכים(Microarrays) המכילים אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים עם רצפים מהגנום האנושי עוזרים לקבע את האזור הגנומי בו אנו מעוניינים על גבי משטח. מפרקים DNA גנומי כך שנוצרים שברים דו-גדיליים. השברים עוברים שינוי בקצוות כדי לייצר קצוות קהים כדי שיתחברו לרצפים אוניברסליים מתווספים. שברים אלה עוברים הכלאה לאוליגו במיקרו-מערך. שברים שלא התחברו נשטפים והשברים הרצויים נתפסים רצפים האוניברסליים שהוספנו. לאחר מכן, השברים שנשארו מוגברים באמצעות PCR. Roche NimbleGen היה הראשון לקחת את טכנולוגיית DGS המקורית ולהתאים אותה לריצוף הדור הבא(next-generation sequencing). הוא פיתח את מערך ה-Sequence Capture Human Exome 2.1M כדי ללכוד ~180,000 אקסונים מקודדים. שיטה זו גם חוסכת בזמן וגם חסכונית בהשוואה לשיטות מבוססות PCR. מערך לכידה Agilent ומערך הכלאה גנומי השוואתי הן שיטות נוספות שניתן להשתמש בהן ללכידה היברידית של רצפי הtargrt. המגבלות בטכניקה זו כוללות את הצורך בחומרה יקרה וכן בכמות גדולה יחסית של DNA. כדי ללכוד אזורים גנומיים שאנו מעוניינים בהם באמצעות לכידה בתמיסה, נצטרך מאגר של אוליגונוקלאוטידים (פרובים) מסונתזים ומותאמים אישית המשולבים בתמיסה לדגימת DNA גנומי פרגמנטי. הפרובים (המסומנים בחרוזים) יוצרים הכלאה סלקטיבית לאזורים הגנומיים המעניינים אותנו ולאחר מכן ניתן למשוך את החרוזים (כיום כולל את שברי ה-DNA המעניינים) ולשטוף אותם כדי לנקות החומרים העודפים הבלתי רצויים. לאחר מכן, מסירים את החרוזים וכך נוכל לרצף את הפרגמנטים היוצרים רצף DNA סלקטיבי של אזורים גנומיים (למשל, אקסונים) שיש לנו בהם עניין (target-ים). שיטה זו פותחה כדי לשפר את שיטת העשרת הtargrt-ים תוך לכידת הכלאה. בלכידת נוזל (בניגוד ללכידה היברידית) יש עודף פרובים של target-ים על פני הכמות הנדרשת. גודל הtarget (אזור המטרה בגנום) האופטימלי הוא כ-3.5 מגה-בסיסים ומניב כיסוי מצוין של אזורי המטרה. השיטה המועדפת תלויה במספר גורמים: מספר זוגות בסיסים באזור אותו אנו מעוניינים לרצף, תכונות הרידים באזור, הציוד בבית וכו'. קיימות פלטפורמות ריצוף של הדור הבא(Next Generation Sequencing) רבות זמינות, לאחר מתודולוגיות רצף Sanger הקלאסיות. פלטפורמות אחרות כוללות את Roche 454 sequencer ומערכות Life Technologies SOLiD, Life Technologies Ion Torrent ו-Illumina Genome Analyzer II (לא בשימוש) והמכשירים הבאים מסדרת Illumina MiSeq, HiSeq ו-NovaSeq, בכולם ניתן להשתמש על מנת לרצף אקסומים באופן מקביל ומאסיבי. מערכות NGS "רידים קצרים" אלו מתאימות במיוחד לנתח קטעים קצרים יחסית של רצף DNA, כפי שנמצא באקסונים אנושיים. Ng SB, Turner EH, Robertson PD, Flygare SD, Bigham AW, Lee C, Shaffer T, Wong M, Bhattacharjee A, Eichler EE, Bamshad M, Nickerson DA, Shendure J (10 בספטמבר 2009). "Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes". Nature. 461 (7261): 272–276. Bibcode:2009Natur.461..272N. doi:10.1038/nature08250. PMC 2844771. PMID 19684571. {{cite journal}}: (עזרה) Sarah B Ng; Kati J Buckingham; Choli Lee; Abigail W Bigham; Holly K Tabor; Karin M Dent; Chad D Huff; Paul T Shannon; Ethylin Wang Jabs; Deborah A Nickerson; Jay Shendure (2010). "Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder". Nature Genetics. 42 (1): 30–35. doi:10.1038/ng.499. PMC 2847889. PMID 19915526. Wang, D. G.; Fan, J. B.; Siao, C. J.; Berno, A.; Young, P.; Sapolsky, R.; Ghandour, G.; Perkins, N.; Winchester, E. (1998-05-15). "Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome". Science. 280 (5366): 1077–1082. Bibcode:1998Sci...280.1077W. doi:10.1126/science.280.5366.1077. ISSN 0036-8075. PMID 9582121. Rauch, A; Hoyer, J; Guth, S; Zweier, C; Kraus, C; Becker, C; Zenker, M; Hüffmeier, U; Thiel, C; Rüschendorf, F; Nürnberg, P (1 אוק' 2006). "Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation". American Journal of Medical Genetics Part A. 140 (19): 2063–74. doi:10.1002/ajmg.a.31416. PMID 16917849. {{cite journal}}: (עזרה) Stavros Basiardes; Rose Veile; Cindy Helms; Elaine R. Mardis; Anne M. Bowcock; Michael Lovett (2005). "Direct Genomic Selection". Nature Methods. 1 (2): 63–69. doi:10.1038/nmeth0105-63. PMID 16152676. Teer, J. K.; Mullikin, J. C. (12 באוגוסט 2010). "Exome sequencing: the sweet spot before whole genomes". Human Molecular Genetics. 19 (R2): R145–R151. doi:10.1093/hmg/ddq333. PMC 2953745. PMID 20705737. {{cite journal}}: (עזרה) Emily H. Turner; Sarah B. Ng; Deborah A. Nickerson; Jay Shendure (2009). "Methods for Genomic Partitioning". Annu Rev Genom Hum Genet. 10 (1): 30–35. doi:10.1146/annurev-genom-082908-150112. PMID 19630561. Mertes F, Elsharawy A, Sauer S, van Helvoort JM, van der Zaag PJ, Franke A, Nilsson M, Lehrach H, Brookes AJ (2011). "Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing" (PDF). Brief. Funct. Genomics. 10 (6): 374–386. doi:10.1093/bfgp/elr033. PMC 3245553. PMID 22121152. Choi M, Scholl UI, Ji W, Liu T, Tikhonova IR, Zumbo P, Nayir A, Bakkaloğlu A, Ozen S, Sanjad S, Nelson-Williams C, Farhi A, Mane S, Lifton RP (10 בנובמבר 2009). "Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing". Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (45): 19096–19101. Bibcode:2009PNAS..10619096C. doi:10.1073/pnas.0910672106. PMC 2768590. PMID 19861545. {{cite journal}}: (עזרה) Kahvejian A, Quackenbush J, Thompson JF (2008). "What would you do if you could sequence everything?". Nature Biotechnology. 26 (10): 1125–1133. doi:10.1038/nbt1494. PMC 4153598. PMID 18846086. Lira Mamanova; Coffey, Alison J; Scott, Carol E; Kozarewa, Iwanka; Turner, Emily H; Kumar, Akash; Howard, Eleanor; Shendure, Jay; Turner, Daniel J; et al. (בפברואר 2010). "Target-enrichment strategies for nextgeneration sequencing". Nature Methods. 7 (2): 111–118. doi:10.1038/nmeth.1419. PMID 20111037. {{cite journal}}: (עזרה)