מיקרוסקופיה קונפוקלית

מיקרוסקופיה קונפוקלית היא טכניקה לדימות אופטי המאפשרת לצפות בחתכים אופקיים דקים ביותר, בעובי קרוב לאורך גל האור הנראה (מאות ננומטרים), של עצמים קטנים, תוך הגברת הניגודיות (קונטרסט) והרזולוציה של התמונה המתקבלת. באמצעות טכניקה זו ניתן גם ליצור הדמיה תלת־ממדית של העצם. השיטה מתבססת על מיקרוסקופ אופטי בעל חריר זעיר (pinhole) המאפשר רק לאור שמגיע מנקודה מוגדרת בעצם (ממישור פוקאלי צר), להגיע לגלאי האור. באמצעות סריקה של מישור שלם, מתקבל חתך אופקי דק של הדוגמה הנבחנת תחת המיקרוסקופ. השיטה, שהומצאה על ידי מרוין מינסקי ב-1957, נמצאת בשימוש נרחב במחקר ביולוגי על ידי סימון דגימות בסמנים פלורצנטיים, וכן בבדיקת רכיבים אלקטרוניים זעירים כגון מוליכים למחצה. במיקרוסקופ רגיל, כל האור שעובר דרך הדוגמה נאסף דרך עדשה אל הגלאי. החסרון בשיטה זו הוא שגם אור שהוחזר דרך עצם מחוץ למישור המוקד יגיע לעינית, ובצורה לא ממוקדת. מסיבה זו, התמונה שנוצרת מטושטשת מעט. במיקרוסקופ קונפוקלי לעומת זאת, הדגימה נסרקת פיקסל אחר פיקסל: מקור האור (קרן לייזר אחת או מספר קרני לייזר באורכי גל ידועים) ממוקד באמצעות עדשה כך שיואר רק נפח קטן מאוד מהדוגמה, אשר מהווה פיקסל בודד בתמונה שתתקבל. בדגימות ביולוגיות אור זה מעורר סמנים פלאורוסנטיים באובייקט הפולטים אור באורך גל שונה מזה הנכנס. האור שמוחזר מהדוגמה נאסף על ידי עדשת האובייקטיב, מועבר דרך מראה דיכרואית (המעביר את קרן הלייזר המקורית ומחזיר אור באורכי גל אחרים) אל עבר גלאי. חריר קטן שמוצב לפני הגלאי מאפשר רק לאור שהוחזר ממישור צר באובייקט המישור הפוקאלי. הקרן העוברת בחריר נקלטת במכפילור ומתורגמת לאות דיגיטלי המייצג פיקסל בודד. כדי לקבל חתך אופקי של הדוגמה, מתבצעת סריקה של מישור שלם באמצעות מראות המבוקרות על ידי מחשב, ומאפשרת לקבל תמונה באיכות ובניגודיות גבוהה. בניגוד למיקרוסקופ רגיל, אי אפשר לראות את הדגימה בעינית, אלא רק על מסך מחשב אשר מרכיב את כל הסריקות לכדי תמונה אחת. ככל שמשך הסריקה ארוך יותר, כך עולה איכות התמונה. כדי ליצור הדמיה תלת־ממדית של העצם, המיקרוסקופ סורק בזה אחר זה מישורים בעומקים שונים. תוכנת מחשב מרכיבה מאוסף המישורים תמונה תלת־ממדית המאפשרת לבחון את העצם בכל חתך נבחר. קיימים שלושה סוגים עיקריים של מיקרוסקופים קונפוקליים: מיקרוסקופ קונפוקלי בסריקת לייזר - שימושי במיוחד בדגימות פלורצנטיות, כיוון שאור מונוכרומטי מביא לפלואורסצנציה מדויקת יותר ואלומה ממוקדת יותר. במיקרוסקופ אור רגיל, הרזולוציה של התמונה מוגבלת בשל תבנית העקיפה של האור המוחזר מהדגימה. גודלה של תבנית זו תלויה באורך הגל של האור ובמפתח הנומרי (numerical aperture) של העדשה. אולם, במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, מכיוון שהדגימה נסרקת פיקסל אחר פיקסל שמיקומם ידוע, אפשר להקטין את החריר ולמדוד את עוצמת האור שמתקבלת, למשל, רק מתבנית העקיפה מסדר ראשון. במקרה זה, נאמר שהמיקרוסקופ מכוון ליחידת איירי אחת (airy unit). ככל שנקטין את החריר נקבל תמונה ברזולוציה טובה יותר, אך חלק קטן והולך מעוצמת האור יגיע לגלאי. סריקת הדגימה מביאה לתמונה ברזולוציה וניגודיות גבוהות, אך האיכות מושגת על חשבון איטיות הסריקה והחשיפה הארוכה של הדוגמה לאור. במקרה של דגימות פלורוצנטיות, חשיפה ארוכה מביאה לדעיכה בכמות הפלורצנציה מהדגימה. מסיבה זו, קשה לצלם אותה דוגמה מספר רב של פעמים באותה איכות, ובפרט קשה לצלם סרט הדורש עשרות צילומים בודדים. מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסק מסתובב (דיסק ניפקוב) - מתאים לצילום סרטים או דוגמאות הדורשות חשיפה קצרה מאוד. במיקרוסקופ זה, דיסק מחורר (דיסק ניפקוב) מוצב בין מקור האור, למשל הלייזר, לבין לדוגמה. באמצעות סיבוב מהיר של הדיסק, הדוגמה מוארת רק לפרקי זמן קצרים ביותר. עם זאת, איכות כל תמונה בודדת בשיטה זו נמוכה מסריקה באמצעות סריקת לייזר. מיקרוסקופ בעל מערך מתכנת - סורק את הדגימה בכמה נקודות בו זמנית בתבנית חצי-אקראית, ומשתמש בגלאים לאור שעובר דרך החריר, כלומר ממוקד כמו במיקרוסקופ קונפוקלי רגיל, וגם לאור ששחזר מחוץ למישור המוקד כמו במיקרוסקופ אור רגיל. מיקום מושכל של הגלאי יחד עם עיבוד של הנתונים הנאספים מהגלאים מאפשרים סריקה מהירה ואיכותית יותר. התעשייה והמחקר הביולוגיים עושים שימוש נרחב במיקרוסקופיה קונפוקלית, וכיום קיים מיקרוסקופ קונפוקלי כמעט בכל האוניברסיטאות בארץ. דגימות ביולוגיות כגון תאים או רקמות מתאימות במיוחד למיקרוסקופיה מסוג זה, כיוון שהן לעיתים קרובות שקופות למחצה, וכיוון שניתן לסמן ביו-מולקולות שונות כגון חלבונים ו-DNA, באמצעות חומרים פלורצנטיים. המיקרוסקופ הקונפוקלי מאפשר לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה של אותן מולקולות בתוך או בין התאים. גם במדע החומרים נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לבחינת תכונות של חומרים שונים, אך במידה פחותה יותר. ברפואה, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בעיקר בסריקה של הקרנית. הסריקה מאפשרת גילוי מוקדם של מחלות עיניים ובקרה לפני ואחרי ניתוחים. אנגלית The VivaScope - the world's first in vivo clinical confocal microscope! (לינק שבור) Virtual CLSM (Java-based) Another CLSM simulator (Java required) Multiphoton fluorescence microscopy SVI-wiki on 3D microscopy Comprehensive layman's review of CLSM(הקישור אינו פעיל) עברית שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי במחקר, באתר מוזיאון המדע בירושלים Patel DV, McGhee CN (2007). "Contemporary in vivo confocal microscopy of the living human cornea using white light and laser scanning techniques: a major review". Clin. Experiment. Ophthalmol. 35 (1): 71–88. doi:10.1111/j.1442-9071.2007.01423.x. PMID 17300580. Verveer PJ, Hanley QS, Verbeek PW, Van Vliet LJ, Jovin TM (1998). "Theory of confocal fluorescence imaging in the programmable array microscope (PAM)". Journal of Microscopy. 139 (3): 192–198.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link)