אנזים הגבלה

אנזימי הגבלה (באנגלית: Restriction enzymes) הם אנזימים המסוגלים לחתוך קטעי DNA באזורים מסוימים מאוד. כל אנזים הגבלה מזהה רצף נוקלאוטידים ייחודי ב-DNA, נצמד אליו וחותך את הסליל הכפול במקום ההיצמדות. הרצף או אתר ההגבלה ייחודי לכל אנזים, ומורכב מ-4 עד 12 נוקלאוטידים: לדוגמה, אנזים ההגבלה EcoRI מזהה את הרצף הבא: 3' GAATTC 5' CTTAAG אנזימים רבים מזהים אתר מטרה פלינדרומי, כלומר אתר שבו רצף הדנ"א זהה בשני הגדילים ולכן ניתן לקריאה משני הצדדים. האנזים ייצמד אל כל מקום ב-DNA שבו קיים רצף זה. החיתוך שהאנזים מבצע יכול להתרחש במרכז הרצף (כך שברצף לעיל יתקבלו שלושה נוקלאוטידים מצד ימין ושלושה משמאל), אך במרבית המקרים הגדיל נחתך בצורה לא סימטרית, בחיתוך מדורג, דבר המביא ליצירת קצוות דביקים: 3' G|AATTC 5' CTTAA|G הקו מציין את מקום החיתוך; אופן החיתוך גם הוא ספציפי לכל אנזים הגבלה, ואינו אקראי (כלומר, האנזים EcoRI יחתוך את הרצף תמיד בצורה המוצגת לעיל). כל אנזימי ההגבלה הם סוגים של אנדונוקלאזות (אנזימים החותכים DNA באמצע הגדיל, זאת בניגוד לאקסונוקלאזות, המפרקים נוקלאוטידים מקצוות הגדיל). אנזימי הגבלה נמצאים באופן טבעי בחיידקים רבים, שם הם משמשים כמנגנון הגנה בפני בקטריופאג'ים (האנזימים חותכים את ה-DNA של הפאג' וגורמים להרס הפאג', בעוד ה-DNA של החיידק ממותל ולא מושפע מאנזים ההגבלה). שמות אנזימי ההגבלה ניתנים להם על שם החיידק שבו נמצאו: EcoRI נמצא ב-E. coli; ה-R מייצג זן ספציפי של החיידק (RY13). קיימים שלושה סוגים של אנזימי הגבלה, המסומנים באותיות II ,I ו-III; כל סוג משתמש בשיטה שונה במקצת לחיתוך ה-DNA. אנזים ההגבלה HindIII, למשל, נמצא בחיידק Haemophilus influenzae והוא אנזים מסוג III. לאנזימי ההגבלה חשיבות עליונה בביולוגיה מולקולרית, בהנדסה גנטית ובביוטכנולוגיה; גילוים חולל מהפכה של ממש בתחומים אלו. את אנזימי ההגבלה מחלקים לשלושה סוגים, המסומנים באותיות II ,I ו-III, על פי מאפיינים כמו הרכב, קופקטורים הדרושים לפעולתם, אופן החיתוך שלהם ומיקום אתר חיתוך ה-DNA שלהם ביחס לרצף המטרה. סוג I ‏(EC 3.1.21.3) – החיתוך מתבצע בריחוק מאתר ההכרה. לפעולתו נדרש ATP ו-S-אדנוזיל-L-מתיונין. פעילותם של אנזימים אלו היא הגבלה ומתילציה (EC 2.1.1.72). סוג II ‏(EC 3.1.21.4) – החיתוך מתבצע בתוך או במרחק קצר מאתר ההכרה; לפעולתם נדרש לרוב מגנזיום; פעילותם של אנזימים אלו מוגבלת כאנזים הגבלה והם לא מבצעים מתילציה. סוג III ‏(EC 3.1.21.5) – החיתוך מתבצע במרחק קצר מאתר ההכרה; לפעילותם נדרש ATP (אך הם לא מפרקים אותו); S-אדנוזיל-L-מתיונין מזרז את התגובה אך אינו נדרש; קיימים כחלק מקומפלקס עם מתיל טראנספראז (EC 2.1.1.72). אנזימי הגבלה סוג I היו הראשונים שהתגלו וזוהו לראשונה בשני גזעים שונים (K-12 and B) של E. coli. אנזימים אלו חותכים באתר שונה מאתר ההכרה, במרחק של יותר מ-1,000 זוגות בסיסים. החיתוך מתרחש בעקבות תהליך של טרנסלוקציה DNA. אתר ההכרה הוא אסימטרי ומורכב משני חלקים: אחד הכולל 3–4 נוקלאוטידים, ואחר הכולל 4–5 נוקלאוטידים – המופרדים על ידי כ-6–8 נוקלאוטידים. לאנזימים אלו פעילות מגוונת, והם מבצעים הן פעילות של חיתוך והן פעילות של מודיפיקציה של הרצף, כתלות במצב המתילציה של DNA המטרה. הקופקטורים S-אדנוזיל-L-מתיונין (AdoMet),‏ ATP ויוני מגנזיום (Mg2+‎) נדרשים לצורך פעילותם המלאה של אנזימים אלו. אנזימי הגבלה מסוג I מורכבים משלוש תת-יחידות: HsdR נדרש לצורך הגבלה (חיתוך) HsdM נדרש להוספת קבוצות מתיל ל-DNA (פעילות מתילטרנספראז) HsdS חיוני לספציפיות של אתר ההכרה (DNA-binding) בנוסף לפעילויות ההגבלה והמתילציה קיימים מספר הבדלים בין אנזימי הגבלה סוג II לאנזימי הגבלה סוג I. אנזימי סוג II טיפוסיים הם הומודימרים, אתרי ההכרה שלהם הם פלינדרומים ואינם מופרדים, ואורכם 4–8 נוקלאוטידים, החיתוך נעשה באתר ההכרה, והם לא צריכים ATP או AdoMet לפעילותם – לרוב הם צריכים רק Mg2+‎ כקופקטור. אנזימים מסוג זה הם אנזימי ההגבלה הזמינים והנפוצים ביותר. בשנות התשעים של המאה ה-20 ובתחילת שנות ה-2000, התגלו אנזימים חדשים מסוג זה שאינם עונים לקריטריונים הקלאסיים המגדירים אנזימים אלו, ובעקבות זאת הוגדרו תת-סוגים לחלוקת אנזימים מסוג זה לתת קטגוריות בהתבסס על מאפיינים טיפוסיים. תת-קבוצות אלו מיוצגות על ידי אות סיומת: אנזימי הגבלה סוג III (כדוגמת EcoP15) מזהים שני רצפים לא פלינדרומים נפרדים הפוכים. החיתוך נעשה לאחר כ-20–30 זוגות בסיסים אחרי אתר ההכרה. אנזימים אלו מכילים יותר מתת-יחידה אחת ודורשים AdoMet ו-ATP לצורך מתילציה וחיתוך, בהתאמה. הם חלק ממכניזם ההגבלה-מודיפיקציה של DNA של פרוקריוטיים אשר מגן על האורגניזם מפני פלישת DNA זר. אנזימי סוג III הם חלבונים הטרו-אוליגומטרים המורכבים משתי תת-יחידות: Mod מזהה את רצף הDNA הספציפי למערכת והיא מתילטרנספראז; ככזו היא דומה מבחינה פונקציונלית לתת יחידות M ו-S של אנזימי הגבלה סוג I. Res נדרש לצורך הגבלה, אף על פי שאין לו פעילות אנזימטית בפני עצמו. אנזימי סוג III מזהים רצף DNA קצר באורך של 5–6 זוגות בסיסים וחותכים במורד (downstream; מכיוון 5' לכיוון 3') 25-27 זוגות בסיסים. על מנת שההגבלה תתבצע נדרשים שני אתרי הכרה הפוכים. אנזימים אלו מוסיפים קבוצת מתיל רק לגדיל אחד של ה-DNA, ודי בכך כדי להגן מפני הגבלה. אנזימי הגבלה מלאכותיים נוצרים על ידי איחוד של מתחם קושר DNA טבעי או מהונדס למתחם נוקלאזי (מתחם נוקלאזי לדוגמה הוא זה של אנזים ההגבלה FokI). את אנזימי ההגבלה המלאכותיים ניתן להנדס כך שיקשרו לאתרי DNA ארוכים (עד 36 זוגות בסיסים) ולהיקשר לרצפי DNA רצויים. נוקלאזות אצבעות אבץ הם אנזימי ההגבלה המלאכותיים הנפוצים ביותר ולהם שימושים בתחום ההנדסה הגנטית, אך גם שימושים בשיבוט גנטי סטנדרטי. דוגמה אחרת לאנזימי הגבלה מלאכותיים היא כאלו המתבססים על מתחם קושר DNA של חלבוני TAL שמקורם מהחיידק Xanthomonas. לאנזימי ההגבלה חשיבות עליונה בביולוגיה מולקולרית, בהנדסה גנטית ובביוטכנולוגיה; גילוים חולל מהפכה של ממש בתחומים אלו. החשיבות נעוצה בקצוות הדביקים הנוצרים לאחר חיתוך ה-DNA. בקטע שהוצג לעיל, שבו האנזים חותך את הקטע בקצה, קיימים לאחר החיתוך חמישה נוקלאוטידים חופשיים, אשר אינם מזווגים לנוקלאוטידים אחרים; אם ייפגשו נוקלאוטידים אלו עם נוקלאוטידים מקבילים בקטע DNA אחר (כלומר, A ייפגש עם T ו-C ייפגש עם G), הרי ששני הקטעים יתחברו ליצירת סליל DNA חדש. זוהי השיטה העיקרית שבה משתמשים הביולוגים לחיבור גדילי DNA. השיטה מאפשרת השתלה של גנים בתוך הגנום הקיים של יצור מסוים, ומכאן חשיבותה הרבה. ניתן, למשל, להשתיל את הגן המייצר את ההורמון אינסולין, החיוני לחולי סוכרת, בתוך תאו של חיידק; הגן ישתלב בחומר התורשתי של החיידק, והחיידק יתחיל לייצר אינסולין. לאחר שהחיידק יתחלק (באמצעות מיטוזה), שני הצאצאים יישאו אף הם את גן האינסולין וייצרו אף הם את ההורמון. אם הגן הושתל לתוך פלסמיד, הרי שהחיידק מסוגל עתה להעביר את הגן לחיידקים אחרים באמצעות קוניוגציה. לאחר זמן קצר מתקבלת מושבת חיידקים ענקית המייצרת כמויות נכבדות של אינסולין. באמצעות אנזימי הגבלה ניתן גם לזהות קטעי DNA שהרצף שלהם ידוע. ניתן לחפש ברצף ה-DNA שאותו מעוניינים לבדוק אתרי הגבלה לאנזימים ידועים, ולבצע חיתוך בעזרת אנזימים אלו. בנוסף, חיתוך באנזימי הגבלה מאפשר שרטוט מפות הגבלה של מקטע מסוים ב-DNA, המספקות מידע חיוני ביותר למהנדסי ביוטכנולוגיה בעת הנדסה הגנטית. לאחר החיתוך מתקבלים כמה מקטעים בגדלים שונים, שניתן לנתח אותם באמצעות אלקטרופורזה. קיימים למעלה מ-3,500 אנזימי הגבלה שנחקרו, ויותר מ-600 מהם נמכרים באופן מסחרי. להלן טבלה של כמה אנזימי הגבלה מוכרים: מדיה וקבצים בנושא אנזים הגבלה בוויקישיתוף אנזים הגבלה, באתר אנציקלופדיה בריטניקה (באנגלית) Murray NE (ביוני 2000). "Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle)". Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 (2): 412–34. doi:10.1128/MMBR.64.2.412-434.2000. PMC 98998. PMID 10839821. {{cite journal}}: (עזרה) Bickle TA, Krüger DH (ביוני 1993). "Biology of DNA restriction". Microbiol. Rev. 57 (2): 434–50. PMC 372918. PMID 8336674. {{cite journal}}: (עזרה) Gigorescu A, Morvath M, Wilkosz PA, Chandrasekhar K, Rosenberg JM (2004). "The integration of recognition and cleavage: X-ray structures of pre-transition state complex, post-reactive complex, and the DNA-free endonuclease". In Alfred M. Pingoud (ed.). Restriction Endonucleases (Nucleic Acids and Molecular Biology, Volume 14). Berlin: Springer. pp. 137–178. ISBN 3-540-20502-0.{{cite book}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Pingoud A, Jeltsch A (בספטמבר 2001). "Structure and function of type II restriction endonucleases". Nucleic Acids Res. 29 (18): 3705–27. doi:10.1093/nar/29.18.3705. PMC 55916. PMID 11557805. {{cite journal}}: (עזרה) Dryden DT, Murray NE, Rao DN (בספטמבר 2001). "Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes". Nucleic Acids Res. 29 (18): 3728–41. doi:10.1093/nar/29.18.3728. PMC 55918. PMID 11557806. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Meisel A, Bickle TA, Krüger DH, Schroeder C (בינואר 1992). "Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage". Nature. 355 (6359): 467–9. doi:10.1038/355467a0. PMID 1734285. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (בפברואר 1996). "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (3): 1156–60. doi:10.1073/pnas.93.3.1156. PMC 40048. PMID 8577732. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD (בספטמבר 2010). "Genome editing with engineered zinc finger nucleases". Nat. Rev. Genet. 11 (9): 636–46. doi:10.1038/nrg2842. PMID 20717154. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF (במאי 2009). "High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases". Nature. 459 (7245): 442–5. Bibcode:2009Natur.459..442T. doi:10.1038/nature07845. PMC 2743854. PMID 19404258. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, DeKelver RC, Moehle EA, Worden SE, Mitchell JC, Arnold NL, Gopalan S, Meng X, Choi VM, Rock JM, Wu YY, Katibah GE, Zhifang G, McCaskill D, Simpson MA, Blakeslee B, Greenwalt SA, Butler HJ, Hinkley SJ, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD (במאי 2009). "Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases". Nature. 459 (7245): 437–41. Bibcode:2009Natur.459..437S. doi:10.1038/nature07992. PMID 19404259. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Ekker SC (2008). "Zinc finger-based knockout punches for zebrafish genes". Zebrafish. 5 (2): 121–3. doi:10.1089/zeb.2008.9988. PMC 2849655. PMID 18554175. Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jenkins SS, Wood A, Cui X, Meng X, Vincent A, Lam S, Michalkiewicz M, Schilling R, Foeckler J, Kalloway S, Weiler H, Ménoret S, Anegon I, Davis GD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jacob HJ, Buelow R (ביולי 2009). "Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases". Science. 325 (5939): 433. doi:10.1126/science.1172447. PMC 2831805. PMID 19628861. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Tovkach A, Zeevi V, Tzfira T (באוקטובר 2010). "Expression, purification and characterization of cloning-grade zinc finger nuclease". J Biotechnol. 151 (1): 1–8. doi:10.1016/j.jbiotec.2010.10.071. PMID 21029755. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Christian M, Cermak T, Doyle EL, Schmidt C, Zhang F, Hummel A, Bogdanove AJ, Voytas DF (באוקטובר 2010). "Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases". Genetics. 186 (2): 757–61. doi:10.1534/genetics.110.120717. PMC 2942870. PMID 20660643. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Li T, Huang S, Jiang WZ, Wright D, Spalding MH, Weeks DP, Yang B (באוגוסט 2010). "TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain". Nucleic Acids Res. 39 (1): 359–372. doi:10.1093/nar/gkq704. PMC 3017587. PMID 20699274. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D. (2007). "REBASE--enzymes and genes for DNA restriction and modification". Nucleic Acids Res. 35 (Database issue): D269–70. doi:10.1093/nar/gkl891. PMC 1899104. PMID 17202163.{{cite journal}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) R.J Roberts, 1988, Nucl Acids Res. 16(suppl):271 From p.213 Molecular Cell Biology 4th Edition by Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore and Darnell. Monty Krieger; Matthew P Scott; Matsudaira, Paul T.; Lodish, Harvey F.; Darnell, James E.; Lawrence Zipursky; Kaiser, Chris; Arnold Berk (2004). Molecular Cell Biology (5th ed.). New York: W.H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-4366-3.{{cite book}}: תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link) "Stu I from Streptomyces tubercidicus". Sigma-Aldrich. נבדק ב-2008-06-07. Shimotsu H, Takahashi H, Saito H (בנובמבר 1980). "A new site-specific endonuclease StuI from Streptomyces tubercidicus". Gene. 11 (3–4): 219–25. doi:10.1016/0378-1119(80)90062-1. PMID 6260571. {{cite journal}}: (עזרה)תחזוקה - ציטוט: multiple names: authors list (link)