שחבור חליפי

שחבור חליפי (באנגלית: Alternative splicing) היא תופעה המתרחשת כחלק מתהליך התעתוק וההבשלה של מולקולת ה-RNA, במסגרת תהליך השחבור. במהלך השחבור עשויות להיווצר מתעתוק גן יחיד (ממולקולת pre-mRNA אחת) מולקולות mRNA שונות, כתוצאה משחבור צירוף אקסונים שונה של אותו הגן. לדוגמה, מולקולות pre-mRNA שתועתקו מאותו גן יכולות לעבור תרגום לחלבונים בעלי פונקציה ומבנה שונים, על אף שמקורן באותו רצף. שחבור חליפי מגדיל את השונות הגנטית הקיימת בגנום ותורם למורכבותו. במשך שנים רבות שלטה ההיפותזה כי ככל שאורגניזם מורכב יותר ("גבוה" יותר אבולוציונית) מספר הגנים בגנום שלו גדול יותר. מורכבות הגנום האנושי ביחס לאורגניזמים אחרים העלתה השערה, כי הגנום האנושי מכיל יותר מ-100,000 גנים. השערה זו הופרכה לאחר ריצוף הגנום, אז התגלה כי ישנם כ-32,000 גנים מקודדים לחלבון בלבד. כיום מספר הגנים המקודדים לחלבון מוערך בכ-20,000. בהוספת הגנים שאינם מקודדים לחלבון סך הגנים המוערך הוא כ-47,000. ממצא זה אינו מתיישב עם הידע על כמות החלבונים ורצפי ה-RNA הלא מקודדים בגוף האדם וכן את ההיפותזה ששלטה בעבר "גן אחד חלבון אחד". הפער מצביע על כך שמספר הרצפים שמתבטאים בגנום האנושי מושפע רבות משחבור חליפי. ב-1977 התגלה בנגיפי האדנו שגנים מורכבים מאקסונים ואינטרונים. גילוי זה הוביל את וולטר גילברט ושותפיו למחשבה, שאקסונים יכולים להתחבר בצירופים שונים בתהליך השחבור, ובכך ליצור מולקולות mRNA שונות של אותו גן. בראשית שנות ה-80 הוערך כי כ-5% מהגנים של אורגניזמים בעלי גרעין מסדר אבולוציוני גבוה (higher eukaryotes), עוברים שחבור חליפי. כיום ישנו תיעוד של תוצרי שחבור חליפי ב-40%–60% מהגנים בגנום האנושי, ומוערך כי יותר מ-74% מהגנים הם בעלי תוצרי שחבור חליפי. תופעה זו מתרחשת באורגניזמים רבים, ממערכות ומחלקות שונות כגון: צמחים, תולעים, חרקים, דגים, מכרסמים ופרימטים. ישנם חמישה סוגים עיקריים של אירועי שחבור חליפי. אירועי שחבור יכולים להתרחש פעם אחת או יותר בלוקוס (אתר כרומוזומלי מסוים)(אנ'). אירועים מורכבים של שחבור חליפי בלוקוס כוללים יותר מסוג אחד של תוצרי שחבור חליפי. דילוג על אקסון (Exon skipping - ES) - אקסון אחד אינו עובר שחבור למולקולת הmRNA. אתר שחבור חליפי '5 (Alternative splice site 5’ - ASS5) - ישנם שני אתרי שחבור שונים לאותו אקסון בקצה ה'5 של מולקולת ה-RNA. אתר שחבור חליפי '3 (Alternative splice site 3’ – ASS3) - ישנם שני אתרי שחבור שונים לאותו אקסון בקצה ה'3 של מולקולת ה-RNA. אקסונים שאינם משוחברים בו זמנית (Mutually exclusive exons - MXE) - אקסונים שונים משוחברים בטרנסקריפטים שונים. שימור אינטרון (Intron retention - IR) - אינטרון משוחבר במסגרת מולקולת הmRNA הבשלה בנוסף ישנם שני אירועי שחבור המתרחשים בקצוות הרצף ומנגנון השחבור החליפי שלהם שונה: אקסון ראשון חליפי (Alternative promoters/ Alternative first exons - AFE) - שוני באקסון הקיצוני ביותר בקצה '5. אקסון אחרון חליפי (Alternative Polyadenylation/ Alterative last exons - ALE) - שוני באקסון הקיצוני ביותר בקצה '3. רצפים לא מקודדים מתועתקים (long non-coding RNA, micro RNAs) משתתפים בתהליכים רבים, כגון עריכת רצפי DNA ו-RNA, מסלולי איתות תאיים ובקרת ביטוי גנים. ככל הנראה, הם אחראיים למרבית השוני הפנוטיפי בין מינים ופרטים. בניגוד לרצפים מקודדים, כמעט כל אקסון שאינו מקודד לחלבון עובר שחבור חליפי, ונוצרים טרנסקריפטים רבים לכל מולקולת pre‑mRNA. במחקר שנעשה בבני אדם ועכברים נמצא שחלק מהאקסונים הלא מקודדים שעוברים שחבור חליפי זהים בין האורגניזמים. ממצא זה מצביע על כך שהבקרה על מנגנון השחבור של רצפים אלו שמור אבולוציונית. דוגמה ל-RNA לא מקודד ידוע הוא XIST (אנ') שמשתתף בהשתקת מקטעים על כרומוזום X הלא פעיל בתאי נקבה ביונקים. לגן זה יש לפחות שני טרנסקריפטים ידועים בבני אדם. ייתכן שההבדל בין הטרנסקריפטים משפיע על הליך ההשתקה. בעבר גרסו כי שחבור חליפי מתרחש לרוב באזורים לא מתורגמים שנמצאים לפני הרצף המתורגם (5UTR). ממצאים ראשוניים הובילו לדעה שלשחבור חליפי אין השפעה על הרצף המתורגם, ועל כן גם על הפונקציה של החלבון שמתורגם ממנו. כיום, מחקרים מצביעים על כך ש-70–88% מהשחבור החליפי המתרחש בגנים מקודדי חלבון בגנום האנושי גורם לשינוי בתוצר החלבוני. השוני לרוב מתבטא בהחלפה של חומצה אמינית (אחת או יותר) בחלבון, ונגרם על ידי מוטציות בהן מוחדר מקטע (insertion) או ישנו חסר של מקטע (deletion) שאינן משנות את מסגרת הקריאה אך גורמות לשוני ביחידות הפונקציונליות של החלבון. רק כ-19% מהתוצר החלבוני של שחבור חליפי נגרם כתוצאה משינוי במסגרת הקריאה. בנוסף, שחבור חליפי יכול לשמש כ"מתג הפעלה" (on-off switch) לביטוי גן כאשר קודון הסיום (stop codon) מופיע מוקדם ביחס לתוצרי שחבור אחרים. מחקר שנעשה ב-50 גנים בהם תואר שחבור חליפי שנבחרו בצורה אקראית, הראה כי יותר מ-75% מהם מעורבים בתקשורת תאית ותהליכי רגולציה. המערכות הביולוגיות בהן מצוי היצוג הגבוה ביותר בקבוצת הגנים הזו היו האימונולוגית והעצבית. ממצא זה לא מצביע בהכרח על חשיבות השחבור החליפי במערכות אלו לעומת מערכות אחרות, אך יכול לרמוז על חשיבותו במערכות מורכבות בהן עיבוד המידע עשוי להשתנות בזמנים או כתגובה למצבים פיזיולוגיים שונים. שחבור חליפי לרוב עובר בקרה ספציפית כתלות בסוג התא בו הוא מתבצע או בשלב התפתחותי מסוים. במערכת העצבים ובתהליך המוות התאי המבוקר (אפופטוזה) הוכח כי ישנו תיאום של שינויים בדפוסי השחבור החליפי בין מולקולות pre-mRNA רבות המשתתפות באותם תהליכים. בחירת אתר השחבור צריכה להיות מבוקרת ברמת הזמן והמיקום בו מתרחש ההליך. זיהוי אתר השחבור משלב אינטראקציות רבות שתורמות בין היתר גם ליצירת קומפלקס חלבוני, המבצע את חיתוך ה-pre-mRNA, ונקרא ספלייסוזום. אתרי שחבור בצד '5 ובצד '3 של מולקולות ה-RNA, שמהווים את הגבול בין כל אקסון ואינטרון, מוגדרים על ידי רצף אחיד (קונצנזוס). רצפי הקונצנזוס שמורים במהלך האבולוציה (הבסיסים השמורים ביותר הם GU בקצה ה'5 ו-AG בקצה ה'3 של האינטרון). בין רצפי הקונצנזוס בקצוות האינטרון, מצוי רצף נוסף שנקרא 'רצף הסתעפות' (branch point), המכיל את הנוקלאוטיד אדנין (A). רצף זה מאפשר יצירת מבנה דמוי לולאה (lariat) שנוצר בעקבות אינטראקציות עם חלבונים קושרי RNA מהספלייסוזום, בין רצף הGU מהקצה ה'3 של האינטרון ל-A מהbranchpoint. הקצה ה'3 מתנתק מהאינטרון, נוצרת לולאה ואז מתרחש הניתוק של הקצה ה'5. מנגנון בחירת אתר השחבור בעת שחבור חליפי אינו ידוע לחלוטין. מחקרים רבים תומכים בכך שהבחירה נעשית בשילוב של מספר גורמים. אותות שחבור שונים, זיקת מרכיבי הספלייסוזום לרצף הקונצנזוס, אלמנטי ויסות (כגון מתילציה וזרחון), חלבונים קושרי RNA שונים והאינטראקציות ביניהם משפיעים על בחירת אתר חיתוך אחד על פני משנהו כתלות בתנאים פיזיולוגיים. ההסתברות לשחבור גבוהה יותר בהתאם ל'חוזק' של אתר השחבור והיחס בין כמות אתרי השחבור וכמות המולקולות קושרות ה-RNA (מולקולות RNA-binding) שעוברות איתו אינטראקציה, לדוגמה מולקולת U1 שמהווה חלק מהספלייסוזום. אתר שחבור מסווג כ"חזק" או "חלש" בהתאם לדמיון שלו למוטיב הקונצנזוס של השחבור. ישנם משתנים נוספים שיכולים להשפיע על ההסתברות לשחבור, ולגרום להעדפת שחבור באתר "חלש" יחסית. פקטורי RNA וחלבונים עלולים למסך על חוזקו של אתר מסוים ולהטות את ההסתברות לטובת שחבור באתר ה"חלש". שלבי הרכבת הספלייסוזום וזיהוי אלמנטי הקונצנזוס בשני קצוות האינטרון הם בין המוקדים החשובים ביותר לבקרה על השחבור. גורם בקרתי חשוב נוסף הוא מתילציה על גבי רצף ה-DNA שמשפיעה על בחירת האקסון במנגנון השחבור ועל הבקרה של התהליך כולו. באקסונים להם יש שחבור חליפי אחוז ה-GC גבוה מאוד ביחס לאקסונים אחרים. נוצרים בהם יותר אתרי CpG עליהם מתרחשת מתילציה. אחד הגורמים הידועים לכך הוא חלבון קושר DNA שנקרא CTCF. כאשר אתר הקישור שלו על ה-DNA אינו ממותל, CTCF נקשר לפני האקסון החליפי ויוצר מחסום שלא מאפשר תעתוק מהיר וגורם לשעתוק האקסון החליפי. כאשר האתר ממותל נמנע הקישור של CTCF השעתוק מתבצע מהר יותר וישנו דילוג על האקסון החליפי. פגם בבקרה על תהליך השחבור מעורב בכ-15% מהמחלות הגנטיות, המחלות נגרמות עקב מוטציה שהורסת אתר שחבור פונקציונלי או יוצרת אתר חיתוך חדש. לדוגמה, שחבור לא נכון של אקסון 18 בגן BRCA1(אנ') ידועה כאחד הגורמים להתפתחות סרטן השד והשחלות. שחבור דיפרנציאלי הוא מצב בו קיים שוני בטרנסקריפטים המתועתקים מאותו הגן או ביחס ביניהם במצבים שונים. השוני יכול להתבטא ברקמות שונות, שלבים התפתחותיים שונים, כתלות במין (מגדר), במצב בריאותי או בעקבות טיפול כלשהו. במינים שונים של Drosophila הוכח שיש שוני ברמת הביטוי של טרנסקריפטים שונים במגוון גנים ברקמות שונות, שלבים התפתחותיים שונים ובין מינים. שוני בריכוז של איזופורם (טרנסקריפט שעבר תרגום לחלבון) (אנ') אשר מתורגם לחלבון מסוים, יכול להשפיע רבות על התהליכים המושפעים מפעילות החלבון. דוגמה לכך מגיעה מניסויים שנערכו על הגן APP (אנ'). גן זה מבוטא בעיקר במוח וככל הנראה עוזר בכיוון הגירת תאי עצב. לגן לפחות שלושה איזופורמים מתועדים. במחלת אלצהיימר יש ירידה דרסטית בפעילות החלבון עמילואיד בטא שמתורגם מאחד האיזופורמים של APP (איזופורם APP695). בניסוי שנערך בעכברים נראה, כי בעליה בריכוז תוצר שחבור חליפי אחר, על חשבון APP695, גדל הסיכוי לפיתוח מחלות אלצהיימר. שינוי ביחסי טרנסקריפטים יכול להשפיע על תהליכים רבים בהם מוות תאי, חדירה לרקמות ויצירת גרורות בתהליך הסרטני. מדיה וקבצים בנושא שחבור חליפי בוויקישיתוף Barmak Modrek, Christopher Lee, A genomic view of alternative splicing, Nature Genetics 30, 2002-01, עמ' 13–19 doi: 10.1038/ng0102-13 Pennisi E., Human genome project. and the gene number is...?, science {{{מחבר}}}, The Sequence of the Human Genome, Science 291, 2001-02-16, עמ' 1155.4–1155 doi: 10.1126/science.291.5507.1155d Saey T, A recount of human genes ups the number to at least 46,831, Sci News, ‏2018 Legrain, Pierre Aebersold, Ruedi Archakov, Alexander Bairoch, Amos Bala, Kumar Beretta, Laura Bergeron, John Borchers, Christoph H. Corthals, Garry L. Costello, Catherine E. Deutsch, Eric W. Domon, Bruno Hancock, William He, Fuchu Hochstrasser, Denis Marko-Varga, György Salekdeh, Ghasem Hosseini Sechi, Salvatore Snyder, Michael Srivastava, Sudhir Uhlén, Mathias Wu, Cathy H. Yamamoto, Tadashi Paik, Young-Ki Omenn, Gilbert S., The Human Proteome Project: Current State and Future Direction, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology John S. Mattick, Igor V. Makunin, Non-coding RNA, Human Molecular Genetics 15, 2006-04-15, עמ' R17–R29 doi: 10.1093/hmg/ddl046 J. Sambrook, Adenovirus amazes at Cold Spring Harbor, Nature 268, 1977-07, עמ' 102–104 doi: 10.1038/268101a0 Walter Gilbert, Why genes in pieces?, Nature 271, 1978-02, עמ' 501–501 doi: 10.1038/271501a0 P Sharp, Split genes and RNA splicing, Cell 77, 1994-06-17, עמ' 805–815 doi: 10.1016/0092-8674(94)90130-9 J. M. Johnson, Genome-Wide Survey of Human Alternative Pre-mRNA Splicing with Exon Junction Microarrays, Science 302, 2003-12-19, עמ' 2141–2144 doi: 10.1126/science.1090100 Glen Acosta, David P. Freidman, Kathleen A. Grant, Scott E. Hemby, Alternative Splicing of AMPA Subunits in Prefrontal Cortical Fields of Cynomolgus Monkeys Following Chronic Ethanol Self-Administration, Frontiers in Psychiatry 2, 2012 doi: 10.3389/fpsyt.2011.00072 Yeo GW, Van Nostrand E, Holste D, Poggio T, Burge CB, Identification and analysis of alternative splicing events conserved in human and mouse, Proc Natl Acad Sci U S A Jianguo Lu, Eric Peatman, Wenqi Wang, Qing Yang, Alternative splicing in teleost fish genomes: same-species and cross-species analysis and comparisons, Molecular Genetics and Genomics 283, 2010-04-10, עמ' 531–539 doi: 10.1007/s00438-010-0538-3 A. K. Ramani, J. A. Calarco, Q. Pan, S. Mavandadi, Genome-wide analysis of alternative splicing in Caenorhabditis elegans, Genome Research 21, 2011-02-01, עמ' 342–348 doi: 10.1101/gr.114645.110 K. Hoshijima, K. Inoue, I. Higuchi, H. Sakamoto, Control of doublesex alternative splicing by transformer and transformer-2 in Drosophila, Science 252, 1991-05-10, עמ' 833–836 doi: 10.1126/science.1902987 Naeem H. Syed, Maria Kalyna, Yamile Marquez, Andrea Barta, Alternative splicing in plants – coming of age, Trends in Plant Science 17, 2012-10, עמ' 616–623 doi: 10.1016/j.tplants.2012.06.001 Barbara Rizzacasa, Elena Morini, Sabina Pucci, Michela Murdocca, LOX-1 and Its Splice Variants: A New Challenge for Atherosclerosis and Cancer-Targeted Therapies, International Journal of Molecular Sciences 18, 2017-01-29, עמ' 290 doi: 10.3390/ijms18020290 Qi-An Sun, Francesca Zappacosta, Valentina M. Factor, Peter J. Wirth, Heterogeneity within Animal Thioredoxin Reductases: EVIDENCE FOR ALTERNATIVE FIRST EXON SPLICING, Journal of Biological Chemistry 276, 2001-02-02, עמ' 3106–3114 doi: 10.1074/jbc.M004750200 Eddo Kim, Amir Goren, Gil Ast, Alternative splicing: current perspectives, BioEssays 30, 2008-01, עמ' 38–47 doi: 10.1002/bies.20692 John S Mattick, Non‐coding RNAs: the architects of eukaryotic complexity, EMBO reports 2, 2001-11, עמ' 986–991 doi: 10.1093/embo-reports/kve230 Ira W. Deveson, Marion E. Brunck, James Blackburn, Elizabeth Tseng, Ting Hon, Universal alternative splicing of noncoding exons, dx.doi.org, ‏2017-05-10 Erdogan Memili, Young-Kwon Hong, Duk-Hwan Kim, Sara D. Ontiveros, Murine Xist RNA isoforms are different at their 3′ ends: a role for differential polyadenylation, Gene 266, 2001-03, עמ' 131–137 doi: 10.1016/s0378-1119(01)00353-5 A. A. Mironov, Frequent Alternative Splicing of Human Genes, Genome Research 9, 1999-12-01, עמ' 1288–1293 doi: 10.1101/gr.9.12.1288 Z. Kan, E. C. Rouchka, W. R. Gish, D. J. States, Gene Structure Prediction and Alternative Splicing Analysis Using Genomically Aligned ESTs, Genome Research 11, 2001-05-01, עמ' 889–900 doi: 10.1101/gr.155001 Christopher W.J Smith, Juan Valcárcel, Alternative pre-mRNA splicing: the logic of combinatorial control, Trends in Biochemical Sciences 25, 2000-08, עמ' 381–388 doi: 10.1016/s0968-0004(00)01604-2 B. Modrek, Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes, Nucleic Acids Research 29, 2001-07-01, עמ' 2850–2859 doi: 10.1093/nar/29.13.2850 Z.-H. Jiang, J. Y. Wu, Alternative Splicing and Programmed Cell Death, Experimental Biology and Medicine 220, 1999-02-01, עמ' 64–72 doi: 10.3181/00379727-220-44346 Paula J Grabowski, Splicing Regulation in Neurons: Tinkering with Cell-Specific Control, Cell 92, 1998-03, עמ' 709–712 doi: 10.1016/s0092-8674(00)81399-9 Robin Reed, Initial splice-site recognition and pairing during pre-mRNA splicing, Current Opinion in Genetics & Development 6, 1996-04, עמ' 215–220 doi: 10.1016/s0959-437x(96)80053-0 A. N. Brooks, J. L. Aspden, A. I. Podgornaia, D. C. Rio, Identification and experimental validation of splicing regulatory elements in Drosophila melanogaster reveals functionally conserved splicing enhancers in metazoans, RNA 17, 2011-10-01, עמ' 1884–1894 doi: 10.1261/rna.2696311 Hanzhen Sun, Lawrence A. Chasin, Multiple Splicing Defects in an Intronic False Exon, Molecular and Cellular Biology 20, 2000-09-01, עמ' 6414–6425 doi: 10.1128/mcb.20.17.6414-6425.2000 Benoit Chabot, Directing alternative splicing: cast and scenarios, Trends in Genetics 12, 1996-11, עמ' 472–478 doi: 10.1016/0168-9525(96)10037-8 Christopher W.J Smith, Juan Valcárcel, Alternative pre-mRNA splicing: the logic of combinatorial control, Trends in Biochemical Sciences 25, 2000-08, עמ' 381–388 doi: 10.1016/s0968-0004(00)01604-2 X. ROCA, Determinants of the inherent strength of human 5' splice sites, RNA 11, 2005-05-01, עמ' 683–698 doi: 10.1261/rna.2040605 Arianne J. Matlin, Francis Clark, Christopher W. J. Smith, Understanding alternative splicing: towards a cellular code, Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 2005-05, עמ' 386–398 doi: 10.1038/nrm1645 Galit Lev Maor, Ahuvi Yearim, Gil Ast, The alternative role of DNA methylation in splicing regulation, Trends in Genetics 31, 2015-05, עמ' 274–280 doi: 10.1016/j.tig.2015.03.002 Michael Krawczak, Jochen Reiss, DavidN. Cooper, The mutational spectrum of single base-pair substitutions in mRNA splice junctions of human genes: Causes and consequences, Human Genetics 90, 1992-09 doi: 10.1007/bf00210743 Thomas A. Cooper, William Mattox, The Regulation of Splice-Site Selection, and Its Role in Human Disease, The American Journal of Human Genetics 61, 1997-08, עמ' 259–266 doi: 10.1086/514856 Hong-Xiang Liu, Luca Cartegni, Michael Q. Zhang, Adrian R. Krainer, A mechanism for exon skipping caused by nonsense or missense mutations in BRCA1 and other genes, Nature Genetics 27, 2001-01, עמ' 55–58 doi: 10.1038/83762 S.Y. Chang, T.F. Yong, C.Y. Yu, M.C. Liang, Age and gender-dependent alternative splicing of P/Q-type calcium channel EF-hand, Neuroscience 145, 2007-03, עמ' 1026–1036 doi: 10.1016/j.neuroscience.2006.12.054 Michael B. Tropak, Paul W. Johnson, Robert J. Dunn, John C. Roder, Differential splicing of MAG transcripts during CNS and PNS development, Molecular Brain Research 4, 1988-09, עמ' 143–155 doi: 10.1016/0169-328x(88)90006-x A.R. Kornblihtt, K. Umezawa, K. Vibe-Pedersen, F.E. Baralle, Primary structure of human fibronectin: differential splicing may generate at least 10 polypeptides from a single gene., The EMBO Journal 4, 1985-07, עמ' 1755–1759 doi: 10.1002/j.1460-2075.1985.tb03847.x Lauren Gibilisco, Qi Zhou, Shivani Mahajan, Doris Bachtrog, Alternative Splicing within and between Drosophila Species, Sexes, Tissues, and Developmental Stages, PLOS Genetics 12, 2016-12-09, עמ' e1006464 doi: 10.1371/journal.pgen.1006464 R. SANDBRINK, C. L. MASTERS, K. BEYREUTHER, APP Gene Family Alternative Splicing Generates Functionally Related Isoformsa, Annals of the New York Academy of Sciences 777, 1996-01, עמ' 281–287 doi: 10.1111/j.1749-6632.1996.tb34433.x Gerhard König, Michael Salbaum, Otmar Wiestler, Walter Lang, Alternative splicing of the βA4 amyloid gene of Alzheimer's disease in cortex of control and Alzheimer's disease patients, Molecular Brain Research 9, 1991-02, עמ' 259–262 doi: 10.1016/0169-328x(91)90010-u Carthage J. Smith, Didier Wion, Philippe Brachet, Nerve growth factor-induced neuronal differentiation is accompanied by differential splicing of β-amyloid precursor mRNAs in the PC12 cell line, Molecular Brain Research 10, 1991-07, עמ' 351–354 doi: 10.1016/0169-328x(91)90095-f A. Srebrow, The connection between splicing and cancer, Journal of Cell Science 119, 2006-06-06, עמ' 2635–2641 doi: 10.1242/jcs.03053 Julian P Venables, Roscoe Klinck, ChuShin Koh, Julien Gervais-Bird, Cancer-associated regulation of alternative splicing, Nature Structural & Molecular Biology 16, 2009-05-17, עמ' 670–676 doi: 10.1038/nsmb.1608