מערכת שינוי הגבלה

מערכת שינוי הגבלה (מערכת RM, restriction modification) מצויה בחיידקים ובאורגניזמים פרוקריוטיים אחרים, ומספקת הגנה מפני DNA זר, כמו זה שנושאים בקטריופאגים. לחיידקים יש אנזימי הגבלה, הנקראים גם אנדונוקלאזים של הגבלה, שמבקעים DNA דו-גדילי בנקודות ספציפיות למקטעים. את המקטעים האלה מפוררים לאחר מכן אנדונוקלאזים אחרים. גורם זיהומי כגון בקטריופאג מכניס לעיתים DNA זר, והמערכת הזו מונעת זיהום על ידי הרס ה-DNA הזר הזה. לרבע מהחיידקים המוכרים יש מערכות שינוי הגבלה ומתוכם לכמחצית יש יותר מסוג אחד של מערכת. הרצפים שאנזימי ההגבלה מכירים הם קצרים מאוד, ולכן החיידק עצמו יכיל כמעט בוודאות חלק מהם בגנום שלו. על מנת למנוע הרס של ה-DNA שלו-עצמו על ידי אנזימי ההגבלה, מתווספות קבוצות מתיל. אסור ששינויים אלה יפריעו לזיווג בסיסי ה-DNA, ולכן, בדרך כלל רק כמה בסיסים ספציפיים משתנים בכל גדיל. אנדונוקלאזים מבקעים קשרים פוספודיאסטרים פנימיים/לא קיצוניים. הם עושים זאת רק לאחר זיהוי רצפים ספציפיים ב-DNA שהם בדרך כלל באורך 4–6 זוגות בסיסים, ולעיתים קרובות פלינדרומיים. מערכת שינוי ההגבלה התגלתה לראשונה על ידי סלבדור לוריא ומרי הומאן (Human) ב-1952 וב-1953. הם מצאו שניתן לשנות בקטריופאג הגדל בתוך חיידק נגוע, כך שעם שחרורם והדבקה מחדש של חיידק קשור, הגדילה של הבקטריופאג מוגבלת (מעוכבת). בשנת 1953, ז'אן וייגל (Weigle) וג'וזפה ברטאני (Bertani) דיווחו על דוגמאות דומות של שינוי המבוקר על ידי המארח באמצעות מערכת בקטריופאגים שונה. מחקרים של דייזי רולן-דוסואה (Roulland-Dussoix) וורנר ארבר ב-1962 וחוקרים נוספים לאחר מכן, הביאו להבנה שההגבלה נובעת מהתקפה ופירוק של ה-DNA של הבקטריופאג המשתנה על ידי אנזימים ספציפיים של החיידקים המקבלים. עבודה נוספת של המילטון או. סמית' בודדה את HinDII, הראשון מקבוצת האנזימים הידועים כיום כאנזימי הגבלה, בעוד דניאל נתנס הראה שניתן להשתמש בו למיפוי הגבלה. כאשר אנזימים אלו בודדו במעבדה הם יכלו לשמש למניפולציה מבוקרת של DNA, ובכך לספק את הבסיס לפיתוח הנדסה גנטית. ורנר ארבר, דניאל נתנס והמילטון סמית' זכו בפרס נובל לפיזיולוגיה או רפואה בשנת 1978 על עבודתם בנושא הגבלה. יש ארבע קטגוריות של מערכות לשינוי הגבלה: סוג I, סוג II, סוג III וסוג IV, כולן עם פעילות אנזים הגבלה ופעילות מתילאז (אנזימי מתילציה, פרט לסוג IV שאין לו פעילות מתילאז). הם נקראו לפי סדר הגילוי, אם כי המערכת מסוג II היא הנפוצה ביותר.[דרוש מקור] מערכות מסוג I הן המורכבות ביותר, והן מורכבות משלושה פוליפפטידים: R (הגבלה), M (שינוי) ו-S (ספציפיות). הקומפלקס המתקבל יכול גם לבקע את ה-DNA ולעשות לו מתילציה. שתי התגובות מצריכות ATP, ולעיתים קרובות מתרחש ביקוע במרחק ניכר מאתר הזיהוי. תת-יחידת ה-S קובעת את הספציפיות של ההגבלה וגם של המתילציה. החישוף מתרחש במרחקים משתנים מרצף הזיהוי, כך שרצועות נפרדות אינן ניתנות לצפייה בקלות על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.[דרוש מקור] מערכות מסוג II הן הפשוטות והנפוצות ביותר. במקום לעבוד כקומפלקס, המתילטרנספראז והאנדונוקלאז מקודדים כשני חלבונים נפרדים ופועלים באופן עצמאי (אין חלבון ספציפי). שני החלבונים מזהים את אותו אתר זיהוי, ולכן מתחרים על פעילות. המתילטרנספראז פועל כמונומר, ועושה מתילציה לדופלקס לגדיל אחד בכל פעם. האנדונוקלאז פועל כהומודימר (צורה של מבנה רביעוני), מה שמקל על ביקוע שני הגדילים. ביקוע מתרחש במיקום מוגדר קרוב לרצף הזיהוי או בתוכו, וכך מייצר שברים נפרדים במהלך אלקטרופורזה של ג'ל. מסיבה זו, מערכות מסוג II משמשות במעבדות לניתוח DNA ושיבוט גנים.[דרוש מקור] למערכות מסוג III יש חלבונים מסוג R (res) ו-M (mod) שיוצרים קומפלקס של שינוי ופירוק. חלבון M, עם זאת, יכול לעשות מתילציה בעצמו. מתילציה מתרחשת רק על גדיל אחד של ה-DNA, בניגוד לרוב המנגנונים הידועים האחרים. ההטרודימר (צורה של מבנה רביעוני) שנוצר על ידי חלבוני R ו-M מתחרה בעצמו על ידי שינוי והגבלת אותה תגובה. זה גורם לעיכול לא שלם. מערכות מסוג IV אינן מערכות שינוי הגבלה אמיתיות מכיוון שהן מכילות רק אנזים הגבלה ולא מתילאז. בניגוד לסוגים האחרים, אנזימי הגבלה מסוג IV מזהים וחותכים רק DNA שונה. למנינגוקוקוס (Neisseria meningitidis) יש מספר מערכות אנדונוקלאזות הגבלה מסוג II המועסקות בטרנספורמציה גנטית טבעית. טרנספורמציה גנטית טבעית היא תהליך שבו תא חיידקי מקבל יכול לקלוט DNA מתא חיידקי תורם שכן ולשלב את ה-DNA הזה בגנום שלו על ידי רקומבינציה. מחקר מוקדם על מערכות שינוי הגבלה התמקד בתועלת לחיידקים בהגנה על עצמם מפני DNA פולש של בקטריופאג או DNA זר אחר, אך כיום ידוע שניתן להשתמש במערכות אלו גם כדי להגביל את ה-DNA המוכנס על ידי טרנספורמציה טבעית מחברים אחרים של אותו מין, או ממינים קשורים.[דרוש מקור] במנינגוקוקוס, יכולת התמרה היא תהליך מפותח ומורכב שבו חלבונים מרובים על פני החיידק, בממברנות ובציטופלזמה, מקיימים אינטראקציה עם ה-DNA המתמיר הנכנס. מערכות לשינוי הגבלה נמצאות בשפע בחיידק זה. יש לו מספר מערכות אנדונוקלאזות הגבלה מסוג II. מערכות שינוי ההגבלה שבו משתנות בספציפיות בין קלאדים שונים. הספציפיות הזו מספקת מחסום יעיל נגד חילופי DNA בין הקלאדים. לוריא התייחס להתנהגות מגבלה כזו כ"מקרה קיצוני של חוסר ידידותיות". הגבלה-שינוי נראית כמניע עיקרי של בידוד מיני ויצירת מין במנינגוקוקוס. קוגנט ומיידן (Caugant and Maiden) הציעו כי מערכות הגבלה-שינוי במנינגוקוקוס עשויות לפעול כדי לאפשר החלפה גנטית בקרב קרובי משפחה תוך הפחתה (אך ללא מניעה מוחלטת) של החלפה גנטית בין מנינגוקוקים השייכים לקומפלקסים שונים של שיבוטים שונים, ולמינים קשורים.[דרוש מקור] מערכות שינוי הגבלה יכולות לפעול גם כאלמנטים גנטיים אנוכיים, ולכפות על התא את תחזוקתן באמצעות הרג תאים לאחר הפרדה. כמה נגיפים פיתחו דרכים לחתור תחת מערכת שינוי ההגבלה, בדרך כלל על ידי שינוי ה-DNA שלהם, על ידי הוספת קבוצות מתיל או גליקוזיל אליו, וכך חסימת אנזימי ההגבלה. נגיפים אחרים, כמו בקטריופאג'ים T3 ו-T7, מקודדים חלבונים המעכבים את אנזימי ההגבלה.[דרוש מקור] כדי לנטרל את הונגיפים הללו, חלק מהחיידקים פיתחו מערכות הגבלה אשר מזהות ומנתקות רק DNA שונה, אך אינן פועלות על ה-DNA הבלתי שונה של המארח. חלק מהפרוקריוטים פיתחו סוגים רבים של מערכות לשינוי הגבלה.[דרוש מקור] מערכות שינוי הגבלה נמצאות בשפע יותר במינים "מופקרים", שבהם הן מבססות נתיבים מועדפים של חילוף גנטי בתוך ובין שושלות עם מערכות שינוי הגבלה קשורות. מכיוון שהרפרטואר או הספציפיות של מערכות שינוי הגבלה בשושלות חיידקים משתנים במהירות, השטפים המועדפים של העברה גנטית בתוך מינים צפויים להשתנות ללא הרף, וליצור רשתות תלויות זמן של העברת גנים.[דרוש מקור] (א) שיבוט: ניתן לשבט מערכות שינוי הגבלה לתוך פלסמידים ולבצע בהם ברירה מלאכותית עקב העמידות שמספק אנזים המתילציה. ברגע שהפלסמיד יתחיל להשתכפל, אנזים המתילציה יתחיל להיות מיוצר ויעשה מתילציה של ה-DNA של הפלסמיד, וכך יגן עליו מפני אנזים הגבלה ספציפי.[דרוש מקור] (ב) פולימורפיזמים של אורך מקטע הגבלה: אנזימי הגבלה משמשים גם לניתוח ההרכב של ה-DNA בהתייחס לנוכחות או היעדר מוטציות המשפיעות על הספציפיות של ביקוע אנזימי הגבלה. כשגני פרא ומוטנטים מנותחים על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה שונים, תוצרי אלקטרופורזת הג'ל משתנים באורכם, בעיקר כי גנים מוטנטים לא מתפצלים בדפוס דומה כמו גנים פראיים בנוכחות מוטציות שהופכות את אנזימי ההגבלה ללא ספציפיים לרצף המוטנטי.[דרוש מקור] נראה שהסיבה לכך היא שאנזימי ההגבלה התפתחו באבולוציה בהתאמה לגנים, וכאשר גנים עוברים מוטציה בלי שלאבולוציה יש מספיק זמן להתאים את אנזימי ההגבלה לגנים המוטנטיים, אנזימי ההגבלה לא יכולים לעבוד על המוטנטים. מערכת שינוי ההגבלה אצל החיידקים הוצעה כמודל להמצאת חיסונים וטיפולים של גנים אנטי-ויראליים אנושיים או גנומיים מאחר שמערכת זו מגינה מגינה על חיידקים על ידי הגבלת הטרופיזם של בקטריופאגים. המחקר הוא על אנזימי הגבלה ו-ZFN (חלבוני אבץ) שיכולים לפצל את ה-DNA של נגיפים אנושיים שונים, כולל HSV-2, פפילומה בסיכון גבוה ונגיף האיידס HIV-1, במטרה לגרום למוטגנזה של מטרה ולסטיות של נגיפים שמדביקים בני אדם. הגנום האנושי מכיל שרידים של גנומים רטרו-ויראליים שהושבתו ונרתמו למען רווח עצמי. המנגנונים להשתקת רטרו-אלמנטים גנומיים פעילים L1 על ידי שלושת מנגנוני התיקון prime repair exonuclease 1 (TREX1) ו-Excision Repair Cross Complementing 1 (ERCC) מחקים את פעולתן של מערכות שינוי ההגבלה בחיידקים, ואת חיבור הקצה הלא הומולוגי (NHEJ) העוקב אחר השימוש ב-ZFN ללא תבנית תיקון. התקדמות גדולה היא יצירת אנזימי הגבלה מלאכותיים על ידי קישור תחום המחשוף של הדנ"א של אנזים ההגבלה FokI עם מערך של חלבונים קושרים ל-DNA, או מערכי אצבעות אבץ (zinc finger), המכונים נוקלאזות אצבעות אבץ (ZFN). אלה הם כלים רבי עוצמה לעריכת הגנום המארח בשל סגוליות הרצף המשופרת שלהם. הם עובדים בזוגות, הדימריזציה שלהם מתווכת במקום, באתר, באמצעות תחום אנזים ההגבלה FoKI. כל מערך אצבעות האבץ מסוגל לזהות 9–12 זוגות בסיסים, מה שמייצר 18–24 עבור הזוג. מרווח של 5–7 זוגות בסיסים (bp) בין אתרי המחשוף משפר עוד יותר את הספציפיות של ZFN, מה שהופך אותם לכלי בטוח ומדויק יותר שניתן ליישם על בני אדם. נערך ניסוי קליני שלב I של אצבעות אבץ לביטול ממוקד של הקולטן המשותף CCR5 ל-HIV-1. מערכות שינוי הגבלה הן שחקנים מרכזיים באינטראקציה הקו-אבולוציונית בין אלמנטים גנטיים ניידים (MGEs) והמארחים שלהם. גנים שמקודדים מערכות שינוי הגבלה נעים בין גנומים פרוקריוטיים בתוך אלמנטים גנטיים ניידים כגון פלסמידים, פרופגים (גנום של בקטריופאג), רצפי החדרה/טרנספוזונים, אלמנטים מצומדים אינטגרטיביים (ICEs) ואינטגרונים. עם זאת, לאחרונה נמצא כי ישנן מעט מערכות שינוי הגבלה בפלסמידים, חלקן בפרופאגים ואף אחת בפאגים. מצד שני, כל האלמנטים הגנטיים הניידים הללו מקודדים מספר רב של גנים בודדים של מערכות שינוי הגבלה, בעיקר MTases (DNA methyltransferase, דנ"א של אנזימים שעושים מתילציה). לאור זאת, סביר להניח שניידות מערכת שינוי הגבלה עשויה להיות פחות תלויה באלמנטים גנטיים ניידים ויותר תלויה, למשל, בקיומן של נקודות חמות קטנות של אינטגרציה גנומית. ייתכן גם שמערכות שינוי הגבלה מנצלות לעיתים קרובות מנגנונים אחרים כגון טרנספורמציה טבעית, שלפוחיות, ננו-צינוריות, סוכני העברת גנים או התמרה כללית על מנת לעבור בין גנומים.[דרוש מקור] מתילציה אנזים הגבלה מערכת החיסון Luria SE, Human ML (1952). "A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses". J. Bacteriol. 64 (4): 557–69. doi:10.1128/JB.64.4.557-569.1952. PMC 169391. PMID 12999684. Luria SE (1953). "Host-induced modifications of viruses". Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18: 237–44. doi:10.1101/sqb.1953.018.01.034. PMID 13168990. Salvator E Luria. A Slot Machine, A Broken Test Tube: An Autobiography. Harper & Row, New York: 1984. Pp. 228. מסת"ב 0-06-015260-5 (USA and Canada) BERTANI G, WEIGLE JJ (1953). "Host controlled variation in bacterial viruses". J. Bacteriol. 65 (2): 113–21. doi:10.1128/JB.65.2.113-121.1953. PMC 169650. PMID 13034700. DUSSOIX D, ARBER W (1962). "Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. II. Control over acceptance of DNA from infecting phage lambda". J. Mol. Biol. 5: 37–49. doi:10.1016/S0022-2836(62)80059-X. PMID 13888713. Nathans D, Smith HO (1975). "Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of dna molecules". Annu. Rev. Biochem. 44: 273–93. doi:10.1146/annurev.bi.44.070175.001421. PMID 166604. Rodic, A; Blagojevic, B; Zdobnov, E; Djordjevic, M; Djordjevic, M (24 בפברואר 2017). "Understanding key features of bacterial restriction-modification systems through quantitative modeling". BMC Systems Biology. 11 (Suppl 1): 377. doi:10.1186/s12918-016-0377-x. PMC 5333194. PMID 28466789. {{cite journal}}: (עזרה) Wilson G (1991). "Organization of Restriction-Modification Systems". Nucleic Acids Research. 19 (10): 2539–2566. doi:10.1093/nar/19.10.2539. PMC 328170. PMID 2041731. Wilson G (1991). "Restriction and Modification Systems". Annual Review of Genetics. 25: 585–627. doi:10.1146/annurev.ge.25.120191.003101. PMID 1812816. Loenen WA (2013). "The other face of restriction: modification-dependent enzymes". Nucleic Acids Research. 42 (1): 56–69. doi:10.1093/nar/gkt747. PMC 3874153. PMID 23990325. Budroni S, Siena E, Dunning Hotopp JC, Seib KL, Serruto D, Nofroni C, Comanducci M, Riley DR, Daugherty SC, Angiuoli SV, Covacci A, Pizza M, Rappuoli R, Moxon ER, Tettelin H, Medini D (2011). "Neisseria meningitidis is structured in clades associated with restriction modification systems that modulate homologous recombination". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (11): 4494–9. Bibcode:2011PNAS..108.4494B. doi:10.1073/pnas.1019751108. PMC 3060241. PMID 21368196. Claus H, Friedrich A, Frosch M, Vogel U (2000). "Differential distribution of novel restriction-modification systems in clonal lineages of Neisseria meningitidis". J. Bacteriol. 182 (5): 1296–303. doi:10.1128/jb.182.5.1296-1303.2000. PMC 94415. PMID 10671450. Ambur OH, Frye SA, Nilsen M, Hovland E, Tønjum T (2012). "Restriction and sequence alterations affect DNA uptake sequence-dependent transformation in Neisseria meningitidis". PLOS ONE. 7 (7): e39742. Bibcode:2012PLoSO...739742A. doi:10.1371/journal.pone.0039742. PMC 3388099. PMID 22768309. Caugant DA, Maiden MC (2009). "Meningococcal carriage and disease--population biology and evolution". Vaccine. 27 Suppl 2 (4): B64–70. doi:10.1016/j.vaccine.2009.04.061. PMC 2719693. PMID 19464092. Kusano K (1995). "Restriction-Modification Systems as Genomic Parasites in Competition for Specific Sequences". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (24): 11095–11099. Bibcode:1995PNAS...9211095K. doi:10.1073/pnas.92.24.11095. PMC 40578. PMID 7479944. Oliveira, Pedro H.; Touchon, Marie; Rocha, Eduardo P.C. (2016-05-17). "Regulation of genetic flux between bacteria by restriction–modification systems". Proceedings of the National Academy of Sciences (באנגלית). 113 (20): 5658–5663. Bibcode:2016PNAS..113.5658O. doi:10.1073/pnas.1603257113. ISSN 0027-8424. PMC 4878467. PMID 27140615. Wayengera M (2003). "HIV and Gene Therapy: The proposed [R-M enzymatic] model for a gene therapy against HIV". Makerere Med J. 38: 28–30. Wayengera M, Kajumbula H, Byarugaba W (2007). "Frequency and site mapping of HIV-1/SIVcpz, HIV-2/SIVsmm and Other SIV gene sequence cleavage by various bacteria restriction enzymes: Precursors for a novel HIV inhibitory product". Afr J Biotechnol. 6 (10): 1225–1232. Schiffer JT, Aubert M, Weber ND, Mintzer E, Stone D, Jerome KR (2012). "Targeted DNA mutagenesis for the cure of chronic viral infections". Journal of Virology. 86 (17): 8920–36. doi:10.1128/JVI.00052-12. PMC 3416169. PMID 22718830. Manjunath N, Yi G, Dang Y, Shankar P (2013). "Newer gene editing technologies toward HIV gene therapy". Viruses. 5 (11): 2748–66. doi:10.3390/v5112748. PMC 3856413. PMID 24284874. Stetson DB, Ko JS, Heidmann T, Medzhitov R (2008). "Trex1 prevents cell intrinsic initiation of autoimmunity". Cell. 134 (4): 587–598. doi:10.1016/j.cell.2008.06.032. PMC 2626626. PMID 18724932. Gasior SL, Roy-Engel AM, Deininger PL (2008). "ERCC1/XPF limits L1 retrotransposition". DNA Repair. 7 (6): 983–989. doi:10.1016/j.dnarep.2008.02.006. PMC 2483505. PMID 18396111. Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (בפברואר 1996). "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (3): 1156–60. Bibcode:1996PNAS...93.1156K. doi:10.1073/pnas.93.3.1156. PMC 40048. PMID 8577732. {{cite journal}}: (עזרה) Tebas P, Stein D, Tang WW, Frank I, Wang SQ, Lee G, et al. (2014). "Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV". N Engl J Med. 370 (10): 901–910. doi:10.1056/NEJMoa1300662. PMC 4084652. PMID 24597865. Oliveira, PH; Touchon, M; Rocha, EPC (2014). "The interplay of restriction-modification systems with mobile genetic elements and their prokaryotic hosts". Nucleic Acids Res. 42 (16): 10618–10631. doi:10.1093/nar/gku734. PMC 4176335. PMID 25120263.