שיטת סנגר

שיטת סנגר לריצוף DNA מבוססת על חיבור סלקטיבי של דידאוקסינוקליאוטיד (dideoxynucleotide) המונע את המשך התארכות שרשרת ה-DNA בתהליך שכפול הנעשה על ידי DNA פולימראז במבחנה. השיטה מוסחרה לראשונה על ידי חברת Applied Biosystems בשנת 1986. מאז שהשיטה פותחה על ידי פרדריק סנגר ועמיתיו בשנת 1977 ועד היום (2021), זוהי שיטת הריצוף הנפוצה ביותר, ועליה מתבססות גם חלק משיטות הדור החדש לריצוף בתפוקה גבוהה. על אף פיתוחן של שיטות אלו, שיטת סנגר עודנה נמצאת בשימוש נרחב מכיוון שהטכנולוגיה מאפשרת קריאות ארוכות יותר (1000~ בסיסים) ואמינות גבוהה יותר. לעיתים משתמשים בשיטת סנגר כדי לאמת ריצופים משיטות אחרות. שיטה זו זיכתה את סנגר, יחד עם וולטר גילברט ועם פול ברג, בפרס נובל השני שלו בכימיה בשנת 1980. שיטת סנגר מבוססת על תהליך שכפול DNA. כדי לשכפל רצף DNA במבחנה, יש לספק DNA חד גדילי, תחל (מקטע DNA קצר המשלים לרצף ה-DNA אותו מרצפים), DNA פולימראז, נוקליאוטידים (ידוע בראשי התיבות dNTP, deoxynucleotide triphosphate) ובנוסף נוקליאוטידים שעברו שינוי כימי המונע חיבור של נוקליאוטידים נוספים לאחריהם – דידאוקסינוקליאוטיד (ידוע בראשי התיבות ddNTP, di-deoxynucleotide triphosphate). השינוי הוא שבעמדה 3' מוחלפת קבוצת ההידרוקסיל הדרוש ליצירת קשר פוספודיאסטרי בין שני נוקליאוטידים במימן, מה שגורם ל-DNA פולימראז לעצור את תהליך השכפול בנקודה זו. ה-ddNTP מסומן בצורה רדיואקטיבית או פלואורסצנטית. תגובת השכפול נערכת בארבע מבחנות שונות המכילות תחל מתויג, DNA פולימראז, DNA חד גדילי, ובנוסף כל ארבעת הנוקליאוטידים ללא שינוי כימי (דידאוקסינוקליאוטידים), ואחד מארבעת הנוקליאוטידים בעלי השינוי הכימי (ddATP, ddTTP, ddGTP או ddCTP), כאשר הנוקליאוטיד הרגיל נמצא בריכוז פי מאה מאשר ה-ddNTP (לדוגמה, 0.5 מילימולר dTTP לעומת 0.005 מילימולר ddTTP). בצורה כזו נוצרים העתקים של גדיל ה-DNA המקורי באורכים שונים, כאשר בכל פעם שמתווסף נוקליאוטיד ללא קבוצת ההידרוקסיל התגובה נעצרת. לאחר ביצוע כמה סבבים של תגובת השכפול, מבצעים דנטורציה ל-DNA והרצה בג'ל אלקטרופורזה, בארבע באריות סמוכות, ומפתחים את הג'ל לפי סוג הסימון שהיה על ה-ddNTP. בתמונה משמאל, הג'ל פותח בצורה רדיוגרפית, והפסים השחורים מסמנים את התחל הנמצא בראש כל אחד ממקטעי DNA באורכים שונים שנוצרו עקב חסימת השכפול שנוצר על ידי ה-ddNTP. מהמיקום היחסי של הפסים בג'ל בארבעת הבאריות ניתן להסיק מהו רצף ה-DNA המקורי. מגבלות השיטה כוללות מצבים של זיווג התחל למקום לא ספציפי ב-DNA, ויצירה של מבנים שניוניים ב-DNA הפוגע בהפרדה בין המקטעים השונים. אמינות הקריאה יורדת אם ישנן מספר הופעות ברצף עוקב של אותו הבסיס. שימוש בסמן פלואורסצנטי מאפשר קריאה אופטית מהירה, זולה ופשוטה יותר לניתוח ולאוטומציה. התאמות מסוגים אלו נעשו על ידי לירוי הוד ועמיתים, מה שאפשר את המעבר לשיטות מהדור החדש לריצוף בתפוקה גבוהה. ניתן לרכוש מארזים המכילים את ארבע המבחנות הנדרשות עם החומרים הדרושים לתגובה, והמשתמש צריך להוסיף את גדיל ה-DNA הרצוי יחד עם תחל המתאים לו. במקום השימוש בתחל מתוייג, ניתן להשתמש בצבען פלואורסצנטי המתייג את קצה ה-3' של ה-ddNTP ומאפשר איחוד של ארבע המבחנות הנפרדות למבחנה אחת בלבד. בשיטה זו, כל אחד מארבעת הדידאוקסינוקליאוטידים מסומן בצבען פלואורסצנטי אחר (ראו תמונה), כך שהם פולטים אור באורכי גל שונים זה מזה. הפלט המתקבל בשיטה זו הוא גרף של פליטות האור של התיוגים, כפי שמוצג בתמונה משמאל. שיטה זו מאפשרת מהירות גבוהה יותר, והתאמה יותר טובה לאוטומציה, ולכן זוהי השיטה המרכזית לריצוף בשיטת סנגר. מגבלות השיטה כוללות השפעות הנובעות מחיבורים שונים של התיוג הפלואורסצנטי, כך שרמת מדידת האור הנמדדת אינה שוויונית. נעשו שיפורים שונים באמצעות שימוש ב-DNA פולימראזות שונים ובתיוגים שונים, מה שהניח את היסודות לשיטות מהדור החדש לריצוף בתפוקה גבוהה. מכונות ריצוף יכולות לרצף במקביל 384 רצפים שונים בהרצה אחת, ועד 24 ריצות ביום אחד. רצפי ה-DNA מופרדים לפי אורכם באמצעות שימוש באלקטרופורזה קפילרית, והפלט המתקבל הוא כרומטוגרפיה. אחת המגבלות העיקריות של ריצוף לפי שיטת סנגר היא איכות הקריאה הנמוכה בקצוות ה-DNA. קריאת עשרות הנוקליאוטידים הראשונים (15–40~) נפגמת עקב קישור התחל באזור. יעילות ה-DNA פולימראז הולכת ופוחתת, כך שלאחר כמה מאות בסיסים האיכות יורדת. אמינות הקריאה יורדת במידה וישנן מספר הופעות ברצף עוקב של אותו הבסיס. ריצוף DNA פרדריק סנגר מדיה וקבצים בנושא שיטת סנגר בוויקישיתוף ארז גרטי, ריצוף DNA, במדור "מאגר המדע" באתר של מכון דוידסון לחינוך מדעי, 5 ספטמבר 2009 DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, המאמר שפרסמו ב-1977 ב-PNAS בריטי קיבל פרס נובל לכימיה בפעם השניה, מעריב, 15 באוקטובר 1980 ראו כיווניות (ביולוגיה)