אימונואסיי

אימונואסיי (Immunoassay) היא סוג בדיקה ביוכימית המודדת את נוכחותן או ריכוזן של מקרומולקולות או מולקולות קטנות בתמיסה, באמצעות השימוש בנוגדנים (בדרך כלל) או באנטיגנים (לפעמים). המולקולה המזוהה באמצעות אימונואסיי מכונה אנליט (Analyte), והיא במקרים רבים חלבון, על אף שייתכנו סוגי חומרים אחרים, ובלבד שהם יגיבו לנוגדנים או לאנטיגנים. אנליטים בנוזלים ביולוגיים כגון סרום או שתן נמדדים לעיתים קרובות באמצעות אימונואסיי למטרות מחקר רפואי או למטרות בדיקות מעבדה רפואית. אימונואסיי עשוי להגיע בתצורות ובווריאציות שונות. ניתן לבצע בדיקות אימונואסיי במספר שלבים תוך הוספת מגיבים (ריאגנטים) שאותם שוטפים או מפרידים בשלבי בדיקה שונים. מבחני אימונואסיי רב שלביים מכונים לעיתים אימונואסיי מפריד או אימונואסיי הטרוגני. בדיקות אימונואסיי מסוימות ניתן לבצע בפשטות על ידי ערבוב מגיבים עם הדגימה, תוך ביצוע מדידה פיזיקלית. בדיקות כגון אלה קרויות בדיקות אימונואסיי הומוגניות או לעיתים נדירות יותר אימונואסיי לא מפריד. לעיתים קרובות משתמשים בבדיקות אימונואסיי בכילים (קליברטורים), שהם תמיסות הידועות כמכילות את  האנליט הנבדק, בריכוז ידוע בדרך כלל. השוואה בין התגובות של הדגימה הנבדקת כנגד תגובת הכיל מאפשרת פענוח עוצמת האות במונחים של נוכחות או ריכוז של האנליט בדגימה. באימונואסיי מסתמכים על היכולת של נוגדן לזהות ולקשור מולקולה מסוימת בתוך מה שעלול להיות תערובת מורכבת המכילה סוגים שונים של מולקולות. המולקולה אליה נקשר הנוגדן מכונה באימונולוגיה אנטיגן והשטח על אנטיגן אשר אליו נקשר הנוגדן נקרא אפיטופ. במקרים מסוימים של בדיקות אימונואסיי יכול האנטיגן לשמש לזיהוי נוכחות של נוגדנים, המזהים אנטיגן, בתמיסה. במילים אחרות, בחלק מבדיקות האימונואסיי עשוי האנליט להיות נוגדן ולא אנטיגן. בנוסף לקשירה של נוגדן אל האנטיגן שלו, תכונת המפתח השנייה של כל אימונואסיי הוא יצירת אות (סיגנל) הניתן למדידה בתגובת הקישור. ברוב בדיקות האימונואסיי, מעורב קישור כימי של סמן כלשהו הניתן לגילוי לנוגדנים או לאנטיגנים. קיים מספר גדול של סמנים שונים באימונואסיי המודרני, והם מאפשרים דרכי זיהוי באמצעים שונים. סמנים רבים משמשים לזיהוי כיוון שהם פולטים קרינה, מייצרים שינוי בצבע בתמיסה, זורחים (פלואורסצנציה) תחת אור, או פולטים אור (לומינסנציה). האימונואסיי הראשון נזקף לזכותם של רוזלין זוסמן יאלו וסולומון ברזון בשנת 1950. יאלו קבלה פרס נובל על עבודתה בפיתוח האימונואסיי הראשון בשנת-1977, והפכה בכך לאישה האמריקאית השנייה שזכתה בפרס. האימונואסיי הפך להרבה יותר פופולרי ופשוט לביצוע כאשר התפתחו טכניקות קישור כימיות של אנזימים לנוגדנים שפורסמו בשנות ה -1960 המאוחרות. בשנת 1983 המיר פרופסור אנתוני קמפבל באוניברסיטת קרדיף יוד רדיואקטיבי ששימש באימונואסיי עם אקרידינום אסתר שמייצר הארה: כמילומינסצנציה (chemiluminescence). סוג זה של אימונואסיי נמצא כיום בשימוש, בכ-100 מיליון בדיקות מעבדה רפואית בכל שנה ברחבי העולם, מה שמאפשר לקלינאים למדוד מגוון רחב של חלבונים, פתוגנים ומולקולות אחרות בדגימות דם. עד שנת 2012, נאמדו רווחי תעשיית האימונואסיי המסחרי בכ 17 מיליארד דולאר אמריקני, ונחשבו אז כבעלי סיכויי צמיחה שנתית בטווח של כ-2 עד 3 אחוזים. בתבחיני אימונואסיי שונים משתמשים במגוון רחב של סמנים שונים על מנת לאפשר זיהויים של נוגדנים ואנטיגנים. הסמנים מקושרים בדרך כלל באופן כימי או מצומדים אל הנוגדן או אל האנטיגן הרצוי. אחד הסמנים הפופולריים ביותר באימונואסיי הוא השימוש באנזימים. באימונואסיי שבהם משתמשים באנזימים מכונים ELISA [אליזה] (- enzyme-linked immunosorbent) או לפעמים בפשטות אימונואסיי אנזימטי (EIAs). אנזימים המשמשים ב ELISA מסוימים כוללים פראוקסידז (HRP), אלקלין פוספטאז (AP), או גלוקוז אוקסידאז. אנזימים אלה מאפשרים לעיתים קרובות זיהוי מאחר שהם מייצרים שינויי צבע בנוכחות מגיבים (סובסטרטים) מסוימים. במקרים מסוימים, אנזימים אלה נחשפים לחומרים כימיים הגורמים להם לייצר אור או כמילומינסצנציה. ניתן לשלב איזוטופים רדיואקטיביים כסמנים באימונואסיי ואז הם קרויים רדיואימונואסיי (RIA). קרינה רדיואקטיבית הנפלטת מקומפלקס נוגדן-אנטיגן קשור ניתן לגילוי בקלות, וברמת רגישות גבוהה באמצעות שיטות מקובלות. הרדיואימונואסיי פותחו כאימונואסיי המוקדמים יותר, אולם הם מוצאים בהדרגה מהמחזור ומוחלפים בסוגי אימונואסיי אחרים, בשל הקשיים הבטיחותיים וסיכוני קרינה רדיואקטיבית לסביבה ולעובדי המעבדה שעובדים עמם, כפי שהוצג בעבודות אחדות. גישה חדשה בבדיקות אימונואסיי כוללת שילוב של תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בזמן אמת (RT qPCR), עם טכניקות אימונואסיי מסורתיות. הן מכונות תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת אימונוקוונטיטטיביות (immunoquantitative PCR -iqPCR) הסמן שבשימוש בבדיקות אלה הוא ה-DNA. סמנים פלואורוגניים כמו פיקואריתרין (phycoerythrin) משמשים במספר בדיקות אימונואסיי מודרניים. מיקרו מערכי חלבון הם סוג של אימונואסיי שלעיתים קרובות משתמשים בהם בסמנים פלואורוגניים. מספר סמנים פועלים על עקרון אלקטרוכמילומינסצנטי (Electrochemiluminescent), שבהם הסמן פולט אור נראה בתגובה לזרם חשמלי. בעוד שבדרך כלל משתמשים בסוג של סמן באימונואסיי, קיימים סוגי בדיקות אשר בהם אין הסתמכות על סמנים, ובמקום זאת משתמשים בשיטות זיהוי שאינן מצריכות שינוי או צירוף סמנים לרכיבי הבדיקה. שיטת תהודה פלסמונית מקומית (SPR) הוא דוגמה של טכניקה כזו. שמשמשת בגילוי ובמדידת קישור בין נוגדנים ואנטיגנים. עוד סוג של אימונואיסיי ללא סמנים מבוצע באמצעות מדידת השינוי בהתנגדות על אלקטרודה, כאשר אנטיגן נקשר אליה. ניתן להפעיל אימונואסיי במספר תצורות שונות. בדרך כלל, יכלל אימונואסיי באחת מתוך הקטגוריות הבאות, תלוי באופן הפעולה שלו: באימונואסיי הומוגני, תחרותי, אנליטיים לא מסומנים בדגימה, מתחרים באנליט מסומן בקשירה לנוגדן. מודדים אז את כמות האנליט הבלתי מסומן. תאורטית ככל שיש יותר אנליט בדגימה, כן יתחרה בכמות גדולה יותר של אנליט מסומן ולכן כמות האנליט המסומן החופשי, יחסי לכמות האנליט בדגימה. כמו באימונואסיי הומוגני, תחרותי, אנליט לא מסומן בדגימה, מתחרה עם אנליט מסומן בקשירה לנוגדן. בבדיקה הטרוגנית האנליט המסומן, הבלתי קשור, מופרד או נשטף החוצה, ושארית האנליט המסומן הקשור יימדד. תאורטית ככל שיש יותר אנליט בדגימה, כן יתחרה בכמות גדולה יותר של אנליט מסומן ולכן כמות האנליט המסומן החופשי יחסי לכמות האנליט בדגימה. האנליט הלא ידוע בדגימה נקשר לנוגדנים מסומנים. נוגדנים מסומנים לא קשורים נשטפים החוצה, והנוגדנים המסומנים הקשורים נמדדים. עוצמת האות עומדת ביחס ישר לכמות האנליט הלא ידוע. האנליט הלא ידוע בדגימה נקשר לאתר הנוגדן, ואז נוגדנים מסומנים נקשרים לאנליט. כמות הנוגדן הקשור באתר נמדד לאחר מכן. ריכוז זה יעמוד ביחס ישר לריכוזו של האנליט, כיון שנוגדנים מסומנים, לא יתקשרו לאנליט כאשר האנליט אינו נוכח בדגימה הלא ידועה. סוג זה נקרא גם מבחן סנדוויץ' שכן האנליט "כלוא" בין שני נוגדנים. מגוון רחב של בדיקות מעבדה רפואית הן בדיקות אימונואסיי, הן מכונות בהקשר זה אימונודיאגנוסטיקה. בדיקות הריון ביתיות הן למעשה סוג של אימונואסיי, אשר מזהות את סמן ההריון - גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). דוגמאות נוספות אחרות של אימונואסיי במעבדה רפואית כוללות בדיקות המודדות את רמות CPK-MB שהוא סמן של מחלות לב, אינסולין כדי להעריך היפוגליקמיה, בדיקות אימונואסיי לזיהוי ולמדידה כמותית של תרופות (ראו טכניקת אימונואסיי באנזים מוכפל לפרטים נוספים), ואנטיגן ספציפי לגילוי סרטן הערמונית. אימונואסיי משמשים לגילוי סמים במעבדות לבדיקת ספורטאים, לגילוי הורמון גדילה אנושי רקומביננטי (rhGH, rGH, hGH, GH) אסורה בדגימות דם עבור. אימונואסיי פוטואקוסטי מודד אותות אקוסטיים בתדר נמוך שנוצרים על ידי סמני חלקיקי ננו (nanoparticle) של מתכת. בהארה על ידי אור מאופנן בשיטת גל תהודה פלסמונית מקומית, נוצר אות אקוסטי, הניתן למדידה באמצעות מיקרופון. האימונואסיי הפוטואקוסטי יכול ניתן ליישום לבדיקות זרימה לטרלית, אשר משתמשים בחלקיקי ננו קוואידליים. ELISA MELISA CEDIA Immunoscreening בדיקות זרימת לטרלית. אימונואסיי מגנטי רדיואימונואסיי אימונואסיי של סיב אופטי מקיף (SOFIA) אימונו אסיי מבוסס על CD/DVD תגובת שרשרת פולימראז באגלוטינציה מדיה וקבצים בנושא אימונואסיי בוויקישיתוף "The Immunoassay Handbook", 3rd Edition, David Wild, Ed., Elsevier,2008 Yetisen A. K. (2013). "Paper-based microfluidic point-of-care diagnostic devices". Lab on a Chip. 13 (12): 2210–2251. doi:10.1039/C3LC50169H. Rall JE. Lequin R (2005). "Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)". Clin. Chem. 51 (12): 2415–8. doi:10.1373/clinchem.2005.051532. PMID 16179424. Prof Anthony Campbell - MA PhD, Cardiff University, נבדק ב-29 בדצמבר 2012 {{citation}}: (עזרה) "NPS Focus", Rainbow makers, Royal Society of Chemistry (RSC), 2003, נבדק ב-29 בדצמבר 2012 {{citation}}: (עזרה) Carlson, Bruce (15 בפברואר 2014). "Seizing Immunoassay Opportunities". Gen. Eng. Biotechnol. News. Vol. 34, no. 4. pp. 12–13. {{cite news}}: (עזרה) Susan J. Landers (3 באפריל 2006). "ELISA test marks 35 years of answering medical questions". American Medical News. נבדק ב-9 בדצמבר 2012. {{cite news}}: (עזרה) "Rosalyn Sussman Yalow". America.gov. 27 באפריל 2008. נבדק ב-26 ביוני 2010. {{cite web}}: (עזרה) Rajkovic; El-Moualij (2006). "Immunoquantitative real-time PCR for detection and quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin B in foods". Applied and Environmental Microbiology. 72 (10): 6593–9. doi:10.1128/AEM.03068-05. PMC 1610299. PMID 17021210. Gofflot; El (2004). "Immuno-quantitative polymerase chain reaction for detection and quantitation of prion protein". Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 25 (3): 241–58. doi:10.1081/ias-200028044. PMID 15461386. "Luminex xMAP Technology". Millipore Corporation. נבדק ב-13 בדצמבר 2012. {{cite web}}: (עזרה) Chatterjee; Sitaraman (2008). "Protein microarray on-demand: a novel protein microarray system". PLOS ONE. 3: e3265. Bibcode:2008PLoSO...3.3265C. doi:10.1371/journal.pone.0003265. PMC 2533396. PMID 18813342. "Electrogenerated Chemiluminescence". Annual Review of Analytical Chemistry. 2: 359–85. 2009. Bibcode:2009ARAC....2..359F. doi:10.1146/annurev-anchem-060908-155305. PMID 20636067. J. B. González-Díaz; et al. (2008). "Plasmonic Au/Co/Au nanosandwiches with Enhanced Magneto-Optical Activity". Small. 4 (2): 202–5. doi:10.1002/smll.200700594. PMID 18196506. Georgios Tsekenis (2008). "Label-free immunosensor assay for myelin basic protein based upon an ac impedance protocol". Analytical Chemistry (journal). 80 (6): 2058–62. doi:10.1021/ac702070e. Goldys, Ewa, . Fluorescence Applications in Biotechnology and Life Sciences. Wiley-Blackwell., p. 311. ISBN 0470083700. Retrieved 11 December 2012. "ELISA for Home Pregnancy Test". אורכב מ-המקור ב-2017-09-21. נבדק ב-11 בדצמבר 2012. {{cite web}}: (עזרה) Butler, SA (2001). "Detection of early pregnancy forms of human chorionic gonadotropin by home pregnancy test devices". Clinical Chemistry (journal). 47 (12): 2131–6. PMID 11719477. Twyman, SA (2001). "Immunoassays, applications: Clinica" (PDF). Encyclopedia of Analytical Science. 4: 317–324. אורכב מ-המקור (PDF) ב-2012-03-24. נבדק ב-11 בדצמבר 2012. {{cite journal}}: (עזרה) Tsivou M; Kioukia-Fougia N; Lyris E; Aggelis Y; Fragkaki A; Kiousi X; Simitsek Ph; Dimopoulou H; Leontiou I-P (2006). "An overview of the doping control analysis during the Olympic Games of 2004 in Athens, Greece". Analytica Chimica Acta. 555: 1–13. doi:10.1016/j.aca.2005.08.068. "A photoacoustic immunoassay for biomarker detection". Biosensors and Bioelectronics. 85: 261–66. 2016. doi:10.1016/j.bios.2016.05.028. PMID 27183276. "Nanoparticle-based photoacoustic analysis for highly sensitive lateral flow assays". Nanoscale. 8: 19204–19210. 2016. doi:10.1039/C6NR05312B. PMID 27834971.