פרימאז

DNA פרימאז (באנגלית: DNA primase) הוא אנזים המעורב בשכפול של DNA והוא סוג של פולימראז רנ"א (באנגלית: RNA polymerase). מזרז את הסינתזה של קטע RNA קצר (או DNA בחלק מהאורגניזמים) הנקרא פריימר משלים לתבנית ssDNA (DNA חד-גדילי). לאחר התארכות זו, פיסת ה-RNA מוסרת על ידי אקסונוקלאז 5' ל־3' ומוחלפת מחדש עם DNA. בחיידקים (באנגלית:Bacteria), הפרימאז נקשר להליקאז ה-DNA ויוצר קומפלקס הנקרא פרימוזום (באנגלית:Primosome). הפרימאז מופעל על ידי הליקאז, ואז הוא מסנתז פריימר RNA קצר באורך של כ־11 ± 1 נוקליאוטידים, אליו ניתן להוסיף נוקליאוטידים חדשים באמצעות DNA פולימראז. פרימאזות ארכיאליות ואאוקריוטות הן חלבונים הטרודימריים עם יחידת בקרה אחת גדולה ויחידה קטליטית אחת קטנה. מקטעי ה- RNA מסונתזים תחילה על ידי פרימאז ואז מוארכים על ידי DNA פולימראז. ואז ה- DNA פולימראז יוצר קומפלקס חלבון עם שתי יחידות משנה פרימאזות ליצירת קומפלקס אלפא של פולימרז ופרימראז (באנגלית:alpha DNA Polymerase primase complex) הפרימאז הוא אחד הפולימראזים המועדים לטעויות ואיטיות ביותר. פרימאזות באורגניזמים כגון E.coli מסנתזות סביב 2000 עד 3000 פריימרים בקצב של פריימר אחד לשנייה. פרימאז משמש גם כמנגנון עצירה כדי למנוע מהגדיל המוביל להתקדם יתר על המידה מהגדיל בפיגור על ידי עצירת התקדמות מזלג השכפול. השלב הקובע בקצב בפרימאז הוא כאשר נוצר הקשר הפוספודיאסטר הראשון בין שתי מולקולות של RNA. מנגנוני השכפול נבדלים בין חיידקים ווירוסים שונים כאשר הפרימאז מתחבר קוולנטית להליקאז בנגיפים כמו חיידק T7. בנגיפים כמו נגיף הרפס סימפלקס (HSV-1), פרימאז יכול ליצור קומפלקסים עם ההליקאז. באותם נגיפים קומפלקס הפרימאזה-הליקאז משמש כדי לפתוח את ה-dsDNA (גדילי כפול) ומסנתז את הכגיל המתעכב באמצעות פריימרים של RNA. רוב הפריימרים המסונתזים על ידי פרימאז הם באורך של שניים עד שלושה נוקלאוטידים. ישנם שני סוגים עיקריים של פרימאזות: DnaG שנמצא ברוב החיידקים, ו-AEP קיצור של Archaeo-Eukaryote Primase מייצג משפחת על של פרימאזות שנמצאות במחלקות של ארכאיות ואיקריוטות. בעוד שפרימאזות חיידקיות (מסוג DnaG) מורכבות מיחידת חלבון אחת (מונומר) ומסנתזות פריימרים של רנ"א, פרימאזות AEP מורכבות בדרך כלל משתי יחידות פרימאז שונות (הטרודימר) ומסנתזות פריימרים דו-חלקיים עם מרכיבי ה-RNA וה- DNA. אף על פי שהן דומות מבחינה תפקודית, שתי משפחות העל הראשוניות התפתחו עצמאית זו מזו. מבנה הקריסטל של הפרימאז ב-E. coli עם ליבה המכילה חלבון DnaG נקבע בשנת 2000. מתחם ה-DnaG וה- primase הוא בצורת קשיו ומכיל שלושה תת-תחומים. תת-הדומיין המרכזי יוצר קפל טופרים (באנגלית: toprim fold) שעשוי מתערובת חמישה יריעות בטא ושישה סלילי אלפא. קיפול הטופרים משמש לאינזימים רגולטורים ומחייבים מתכות. הפרימאז משתמש בתחום פוספוטרנספר לתאום העברה של מתכות, מה שמבדיל אותו מפולימראזות אחרות. יחידות המשנה הצדדיות מכילות מסוף NH2 ו-COOH העשוי מסלילי אלפא ויריעות בטא. מסוף NH2 מקיים אינטראקציה עם אתר קישור המכיל אבץ ואזור מסוף COOH אשר מתקשר עם DnaB-ID. הקפל של טופרים נמצא גם בטופואיזומרז ובפרימזה / הליקאז של המיטוכרונדריה. כמה פריזאות דמויי DnaG (דמויות חיידקים) נמצאו בגנום ארכיאלי. פרימאזות של אוקריוטה וארכיאות נוטות להיות דומות יותר זו לזו, מבחינת מבנה ומנגנון, מאשר לפניות חיידקיות. משפחת העל AEP קיצור של - Archaeo-Eukaryote Primase, אשר רוב יחידות המשנה הקטליטיות האוקריוטה וארכיאות שייכות אליהן, הוגדרה לאחרונה כמשפחת פרימאז-פולימראז כהכרה בתפקידים רבים אחרים שמילאו האנזימים במשפחה זו. סיווג זה מדגיש גם את המקורות הרבים של האינזימים המשתיכים ל-AEP; משפחת העל מוכרת כעת כחלק החסר במעבר בין פונקציות RNA ו-DNA. פרימאזות ארכיאליות ואיקריוטות הן חלבונים הטרודימרים עם יחידת בקרה אחת גדולה (PRIM2 אנושי, p58) ותת יחידת קטליטית קטנה אחת (PRIM1 אנושית, p48 / p49). יחידת המשנה הגדולה מכילה מקבץ 4Fe – 4S (ברזל וגופרית) מקצה ה-N, אשר לעיתים מפוצל בארכיות מסוימות כ-PriX / PriCT. יחידת המשנה הגדולה (יחידת הבקרה) מעורבת בשיפור הפעילות והספציפיות של יחידת המשנה הקטנה. לדוגמה, הסרת החלק המתאים ליחידת המשנה הגדולה בחלבון היתוך PolpTN2 גורמת לאנזים איטי יותר עם פעילות תעתיק הפוך. למשפחת ה-AEP של הפרימרז-פולימראזות תכונות מגוונות מעבר לייצור תחליים בלבד. בנוסף להכנת פרימר לפלרמור ה-דנ"א במהלך שכפול, לאנזימים של AEP יכולות להיות פונקציות נוספות בתהליך שכפול הדנ"א, כגון פילמור של דנ"א או רנ"א, טרנספרז סופנית (באנגלית:Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)), סינתזת מעבר (באנגלית:TLS), תיקון DNA לא הומולוגי (באנגלית:NHEJ) ואולי בהפעלה מחדש מזלגות שכפול תקועים. פרימאזות בדרך כלל מסנתזות פריימרים מריבונוקליאוטידים (באנגלית:NTP); עם זאת, לפרימאזות עם יכולות פולימראז יש גם זיקה לדאוקסיריב-נוקלאוטידים (באנגלית:dNTP). פרימאזות עם פונקציונליות טרנספרז סופנית מסוגלים להוסיף נוקלאוטידים לקצה 3 'של גדיל DNA ללא תלות בתבנית ומשמשות לעיתים ליצירת השונות בנוגדנים (רקומבינצית VDJ). אנזימים אחרים המעורבים בשכפול דנ"א, כגון הליקאזות, עשויים גם הם להפגין פעילות פרימאז. PrimPol אנושי (ccdc111) בעל פונקציות של פרימאז ופולימראז, כמו פרימאזות ארכיאליות רבות; מציג פעילות טרנספרז סופנית בנוכחות היסוד מנגן; ומשחק תפקיד משמעותי בסינתזת מעבר (באנגלית:TLS) ובהפעלת מחדש של מזלגות שכפול תקועים. PrimPol מגויסת באופן פעיל לאתרים פגומים באמצעות האינטראקציה שלה עם RPA, חלבון מתאם המאפשר שכפול ותיקון DNA. ל-PrimPol תחום אצבעות אבץ הדומה לזה של כמה פרימאזות נגיפיות, שהוא חיוני לסינתזת מעבר ולפעילות הפרימאז ועשוי לווסת את אורך הפריימר. שלא כמו ברוב הפרימאזות, PrimPol מסוגל באופן ייחודי להתחיל שרשראות DNA עם dNTP. ל- PriS, יחידת המשנה הקטנה של הפרימאזות הארכאית, יש תפקיד בסינתזת מעבר (TLS) ויכול לעקוף פגמים נפוצים של DNA. ברוב הארכאות חסרות הפולימראזות המתמחות המבצעות TLS אשר נמצאות באאוקריוטים ובחיידקים. PriS לבדו מסנתז באופן מועדף מחרוזות DNA; אך בשילוב עם PriL, מוגברת פעילות יחידת המשנה הגדולה של RNA פולימראז. ב- Sulfolobus solfataricus ארכאה טרמופילית, ה-פרימאז PriSL, שהוא הטרודימר, יכול לשמש כ- פרימאז, פולימראז וטרנספרז סופי. PriSL נחשב ליזום סינתזת הפריימר עם NTPs ואז הוא עבור להשתמש ב-dNTP. האנזים יכול לפלמר שרשראות רנ"א או דנ"א, כשגדילי הדנ"א מגיעים עד 7000 נוקלאוטידים (7 קילו-בתים). מוצע כי פונקציונליות מרובה זו עשויה להיות מאפיין נפוץ של פרימאזות ארכיאליות. פרימאזות רב-תכליתיות של AEP מופיעות גם בחיידקים ובקטריופאג' המדביקים אותם. הם יכולים להציג פונקציות רבות עוד יותר מעבר לפילמור. ליגאז די' בבקטריה - LigD Bacterial (The DNA ligase D) מעורב בעיקר במסלול NHEJ. יש לו פונקציית AEP סופר-פולימראז / פרימאז, פונקציית 3'-פוספואסטרז ותחום ליגאז. הוא מסוגל לעשות פונקציות של פולימראז, DNA ו-RNA ופעילות טרנספראז סופנית. פונקציית הפילמור של - DNA יכולה לייצר גדילים באורך של 7000 נוקלאוטידים (7 קילו-בתים), ואילו פונקציית הפילמור של - RNA מייצר גדילים באורך של עד 1 קילו-בייט. את אנזימי AEP וניתן למצוא אותם מקודדים באלמנטים גנטיים ניידים כולל וירוסים / פאגים ופלסמידים. הם משתמשים בהם כחלבון שכפול יחיד או בשילוב עם חלבונים אחרים הקשורים לשכפול, כגון הליקאזות, ולעיתים נדירות, פולימראזות DNA. בעוד שנוכחות AEP בנגיפים אוקריוטים וארכיאאליים הייתה צפויה מכיוון שהם משקפים את המארחים שלהם, נגיפי החיידקים והפלסמידים מקודדים באותה תדירות גם אנזימי ממשפחת העל - AEP כפי שהם עושים את הפרימות של משפחת DnaG. מגוון רב של משפחות AEP נראה גם בפלסמידים חיידקיים שונים על ידי סקרי גנומיקה השוואתיים. ההיסטוריה האבולוציונית שלהם אינה ידועה כרגע, מכיוון שאלה שנמצאו בחיידקים ובקטריופאגים נראים שונים מאוד מאלו ההומולוגים הארכיאו-אוקריוטיים כפי שהיה אמור להיות אם הם היו נוצרים מהעברת גנים אופקית לאחרונה. הליקאז דמוי MCM בזן Bacillus cereus ATCC 14579 (BcMCM) הוא הליקאז SF6 המשולב עם פרימאז AEP. לאנזים פונקציות פרימאז ופולימראז בנוסף לתפקוד הליקאז. הגן המקודד לו נמצא בפרופאג'. הליקאז זה נושא הומולוגיה ל-ORF904 של פלסמיד pRN1 מ-Sulfolobus islandicus, בעל תחום של פרימאז ופולימרז AEP . נגיף החיסון D5 ו-HSV Primase הם דוגמאות גם לאיחוי פרימאז הליקאז מסוג - AEP-helicase. PolpTN2 הוא פרימאז ארכאי שנמצא בפלסמיד TN2. שילוב של תחומים הומולוגיים ל-PriS ול- PriL, והוא מציג הן פעילות של פרימאז ו-DNA פולימראז, כמו גם פונקציה של טרנספרז סופני. בניגוד לרוב הפרימאזות, PolpTN2 יוצר פריימרים המורכבים אך ורק מ-dNTP. באופן לא צפוי, כאשר היכולת מן האנזים הדמוה ה-PriL נעלמה, PolpTN2 יכול היה גם לסנתז DNA בתבנית ה-RNA, כלומר, שימש כפולימראז DNA תלוי RNA שעתוק במהופך (באנגלית: reverse transcriptase). אפילו לפרימאזות של DnaG יכולות להיות פונקציות נוספות. הבקטריופאג' T7 gp4 הוא מיזוג של פרימאז והליקאז מסוג - DnaG primase-helicase, ומבצע את שתי הפונקציות בשכפול. מדיה וקבצים בנושא פרימאז בוויקישיתוף Overview article on primase structure and function (1995) Proteopedia: Helicase-binding domain of Escherichia coli primase Proteopedia: Complex between the DnaB helicase and the DnaG primase Bocquier AA, Liu L, Cann IK, Komori K, Kohda D, Ishino Y (במרץ 2001). "Archaeal primase: bridging the gap between RNA and DNA polymerases". Current Biology. 11 (6): 452–6. doi:10.1016/s0960-9822(01)00119-1. PMID 11301257. {{cite journal}}: (עזרה) Baranovskiy AG, Zhang Y, Suwa Y, Babayeva ND, Gu J, Pavlov YI, Tahirov TH (בפברואר 2015). "Crystal structure of the human primase". The Journal of Biological Chemistry. 290 (9): 5635–46. doi:10.1074/jbc.M114.624742. PMC 4342476. PMID 25550159. {{cite journal}}: (עזרה) Griep MA (באוגוסט 1995). "Primase structure and function". Indian Journal of Biochemistry & Biophysics. 32 (4): 171–8. PMID 8655184. {{cite journal}}: (עזרה) Keck JL, Roche DD, Lynch AS, Berger JM (במרץ 2000). "Structure of the RNA polymerase domain of E. coli primase". Science. 287 (5462): 2482–6. doi:10.1126/science.287.5462.2482. PMID 10741967. {{cite journal}}: (עזרה) Lee JB, Hite RK, Hamdan SM, Xie XS, Richardson CC, van Oijen AM (בפברואר 2006). "DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication" (PDF). Nature. 439 (7076): 621–4. doi:10.1038/nature04317. PMID 16452983. {{cite journal}}: (עזרה) Cavanaugh NA, Kuchta RD (בינואר 2009). "Initiation of new DNA strands by the herpes simplex virus-1 primase-helicase complex and either herpes DNA polymerase or human DNA polymerase alpha". The Journal of Biological Chemistry. 284 (3): 1523–32. doi:10.1074/jbc.M805476200. PMC 2615532. PMID 19028696. {{cite journal}}: (עזרה) Keck JL, Berger JM (בינואר 2001). "Primus inter pares (first among equals)". Nature Structural Biology. 8 (1): 2–4. doi:10.1038/82996. PMID 11135655. {{cite journal}}: (עזרה) Pavlína Řezáčová, Dominika Borek, Shiu F. Moy, Andrzej Joachimiak, Crystal structure and putative function of small Toprim domain-containing protein from Bacillus stearothermophilus, Proteins 70, 2008-02-01, עמ' 311–319 doi: 10.1002/prot.21511 Aravind L, Leipe DD, Koonin EV (בספטמבר 1998). "Toprim--a conserved catalytic domain in type IA and II topoisomerases, DnaG-type primases, OLD family nucleases and RecR proteins". Nucleic Acids Research. 26 (18): 4205–13. doi:10.1093/nar/26.18.4205. PMC 147817. PMID 9722641. {{cite journal}}: (עזרה) Hou L, Klug G, Evguenieva-Hackenberg E (במרץ 2013). "The archaeal DnaG protein needs Csl4 for binding to the exosome and enhances its interaction with adenine-rich RNAs". RNA Biology. 10 (3): 415–24. doi:10.4161/rna.23450. PMC 3672285. PMID 23324612. {{cite journal}}: (עזרה) Lao-Sirieix SH, Bell SD (בדצמבר 2004). "The heterodimeric primase of the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus possesses DNA and RNA primase, polymerase and 3'-terminal nucleotidyl transferase activities". Journal of Molecular Biology. 344 (5): 1251–63. doi:10.1016/j.jmb.2004.10.018. PMID 15561142. {{cite journal}}: (עזרה) Iyer LM, Koonin EV, Leipe DD, Aravind L (2005). "Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members". Nucleic Acids Research. 33 (12): 3875–96. doi:10.1093/nar/gki702. PMC 1176014. PMID 16027112. Guilliam TA, Keen BA, Brissett NC, Doherty AJ (באוגוסט 2015). "Primase-polymerases are a functionally diverse superfamily of replication and repair enzymes". Nucleic Acids Research. 43 (14): 6651–64. doi:10.1093/nar/gkv625. PMC 4538821. PMID 26109351. {{cite journal}}: (עזרה) Gill S, Krupovic M, Desnoues N, Béguin P, Sezonov G, Forterre P (באפריל 2014). "A highly divergent archaeo-eukaryotic primase from the Thermococcus nautilus plasmid, pTN2". Nucleic Acids Research. 42 (6): 3707–19. doi:10.1093/nar/gkt1385. PMC 3973330. PMID 24445805. {{cite journal}}: (עזרה) Kazlauskas D, Sezonov G, Charpin N, Venclovas Č, Forterre P, Krupovic M (במרץ 2018). "Novel Families of Archaeo-Eukaryotic Primases Associated with Mobile Genetic Elements of Bacteria and Archaea". Journal of Molecular Biology. 430 (5): 737–750. doi:10.1016/j.jmb.2017.11.014. PMC 5862659. PMID 29198957. {{cite journal}}: (עזרה) Wan L, Lou J, Xia Y, Su B, Liu T, Cui J, Sun Y, Lou H, Huang J (בדצמבר 2013). "hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity". EMBO Reports. 14 (12): 1104–12. doi:10.1038/embor.2013.159. PMC 3981091. PMID 24126761. {{cite journal}}: (עזרה) García-Gómez S, Reyes A, Martínez-Jiménez MI, Chocrón ES, Mourón S, Terrados G, Powell C, Salido E, Méndez J, Holt IJ, Blanco L (בנובמבר 2013). "PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells". Molecular Cell (באנגלית). 52 (4): 541–53. doi:10.1016/j.molcel.2013.09.025. PMC 3899013. PMID 24207056. {{cite journal}}: (עזרה) Sanchez-Berrondo J, Mesa P, Ibarra A, Martínez-Jiménez MI, Blanco L, Méndez J, Boskovic J, Montoya G (בפברואר 2012). "Molecular architecture of a multifunctional MCM complex". Nucleic Acids Research. 40 (3): 1366–80. doi:10.1093/nar/gkr831. PMC 3273815. PMID 21984415. {{cite journal}}: (עזרה) Keen BA, Jozwiakowski SK, Bailey LJ, Bianchi J, Doherty AJ (במאי 2014). "Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol". Nucleic Acids Research. 42 (9): 5830–45. doi:10.1093/nar/gku214. PMC 4027207. PMID 24682820. {{cite journal}}: (עזרה) Jozwiakowski SK, Borazjani Gholami F, Doherty AJ (בפברואר 2015). "Archaeal replicative primases can perform translesion DNA synthesis". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7): E633-8. doi:10.1073/pnas.1412982112. PMC 4343091. PMID 25646444. {{cite journal}}: (עזרה) Barry ER, Bell SD (בדצמבר 2006). "DNA replication in the archaea". Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (4): 876–87. doi:10.1128/MMBR.00029-06. PMC 1698513. PMID 17158702. {{cite journal}}: (עזרה) Lao-Sirieix SH, Pellegrini L, Bell SD (באוקטובר 2005). "The promiscuous primase". Trends in Genetics (באנגלית). 21 (10): 568–72. doi:10.1016/j.tig.2005.07.010. PMID 16095750. {{cite journal}}: (עזרה) Kazlauskas D, Krupovic M, Venclovas Č (ביוני 2016). "The logic of DNA replication in double-stranded DNA viruses: insights from global analysis of viral genomes". Nucleic Acids Research. 44 (10): 4551–64. doi:10.1093/nar/gkw322. PMC 4889955. PMID 27112572. {{cite journal}}: (עזרה) Lipps G, Weinzierl AO, von Scheven G, Buchen C, Cramer P (בפברואר 2004). "Structure of a bifunctional DNA primase-polymerase". Nature Structural & Molecular Biology. 11 (2): 157–62. doi:10.1038/nsmb723. PMID 14730355. {{cite journal}}: (עזרה)