מיקרוסקופ

מִיקְרוֹסְקוֹפְּ הוא מכשיר המשמש להגדלה ויזואלית של עצמים קטנים מכדי להיראות על ידי העין ללא הגדלה. המדע החוקר עצמים שכאלה נקרא מיקרוסקופיה, ובהשאלה המונח "מיקרוסקופי" מתאר עצמים זעירים מאוד. המיקרוסקופ הנפוץ ביותר, והראשון שהומצא, הוא המיקרוסקופ האופטי. מכשיר אופטי זה מכיל עדשה אחת או יותר, ויוצר תמונה מוגדלת של עצם המונח על משטח מול העדשות. מיקרוסקופ אופטי, המבוסס על קרני האור הנראה, מוגבל להגדלה של העצם הנבחן עד פי 1,000 מגודלו המקורי, גבול ההגדלה נקבע על ידי אורך הגל של קרני האור. קיימים מיקרוסקופים שמשתמשים בסוגי קרינה אחרים להפקת תמונה, בעיקר במקרים בהם העצמים קטנים מיכולת הרזולוציה של האור הנראה, שהיא כ-0.2 מיקרון. השימוש בעדשות זכוכית קמורות וקעורות, להגדלת מראה עצמים, הביא למהפכה מדעית, מכיוון שאיפשר לראות דברים, שקודם לכן היו קטנים מדי או רחוקים מכדי לראותם בעין בלתי מזוינת. המיקרוסקופ נוצר, כנראה, לראשונה, כהתפתחות ישירה מן העדשות ששימשו כמשקפיים. המיקרוסקופ הראשון נבנה בהולנד בשנת 1590 על ידי זכריאס יאנסן (1580–1638) ואביו. אנטוני ואן לוונהוק (1632–1723) ההולנדי, היה הראשון שהשתמש במיקרוסקופ בשנת 1660 לחקר חיידקים. המיקרוסקופים שלו, היו בעלי כוח הגדלה של עד פי 270, ונחשבו על ידי רבים כטובים ביותר בזמנם לחקר מיקרואורגניזמים ותאי דם אנושיים. את מכניזם המיקוד פיתח לראשונה קאמפיני באיטליה, בשנת 1668. את המיקרוסקופ האלקטרוני, מכשיר לבחינת עצמים קטנים בגודל מיליונית המילימטר, על ידי שימוש בתכונות הגל של האלקטרונים, תכנן הנס בוש בגרמניה, בשנת 1926. המצאתו של בוש מבוססת על מחקר תאורטי, שערך ארנסט אבה (1840–1905) בשנת 1873, ואחר כך שוכללה על ידי ארנסט רוסקה ומקס קנול במכון הטכני בברלין, שם בנו את המיקרוסקופ האלקטרוני השימושי בשנת 1933. מיקרוסקופ פשוט או בשמו המדעי מיקרוסקופ אור (מירה), בניגוד למיקרוסקופ המורכב הסטנדרטי (ראו בהמשך), הוא מיקרוסקופ העושה שימוש בעדשה אחת או שתיים בלבד לצורך הגדלה. המיקרוסקופים של אנטוני ואן לוונהוק היו מורכבים מעדשה מגדילה קטנה אחת, המונחת על משטח בעל מנגנון המחזיק את התתקין הנבדק כך שלא יזוז. יכולת ההגדלה של מיקרוסקופ האור היא הגדלה של העצם עד פי 400 מגודלו המקורי. התרשים להלן מציג מיקרוסקופ מורכב. בצורתו הפשוטה ביותר, בה השתמש רוברט הוק, הייתה למיקרוסקופ זה עדשת זכוכית יחידה בעלת עומק שדה קצר עבור העצם, ועדשת זכוכית נוספת עבור העינית (אוקולר). מיקרוסקופים אלו יהיו בדרך כלל מורכבים יותר, וגם בעדשת העצם ובעינית יש יותר מעדשה אחת. העדשות המורכבות הללו מתוכננות כך שיקטינו את חוסר המיקוד. במיקרוסקופים מודרניים, מוחלפת המראה במנורה, שתפעולה נוח יותר, והיא המאפשרת גם שינוי בעוצמה. מיקרוסקופים מורכבים נכנסים לשימוש לצורך בחינת דוגמיות קטנות כיוון שיש להם עומק שדה מוגבל. לרוב, הם מסתמכים על אור העובר דרך הדוגמית מלמטה, ובדרך כלל נעשה שימוש בטכניקות מיוחדות כדי להגדיל את ניגודיות התמונה לרמות שימושיות. המיקרוסקופ הבינוקולרי תוכנן באופן שונה משני השרטוטים שלמעלה, והוא משרת מטרה שונה מעט. במיקרוסקופ זה ישנן שתי עיניות (ומכאן שמו) כדי לספק זוויות ראייה שונות מעט לכל אחת משתי העיניים. בצורה זו הוא יוצר תצוגה תלת־ממדית של העצם הנבדק. עדשה מגדילה על ידי כיפוף האור (ראו שבירה). מיקרוסקופים אופטיים מוגבלים ביכולתם להפריד פרטים על ידי תופעה אופטית שמכונה גבול העקיפה, בהתבסס על הערך המספרי של הנקב (numerical aperture (NA של המערכת האופטית ובהתבסס על אורך גל האור (L) שבו משתמשים, ישנו ערך קבוע (d) לכושר ההפרדה האופטי (רזולוציה אופטית). בהנחה שעיוותים אופטיים זניחים, ערך הרזולוציה d נתון על ידי: d = L / N A {\displaystyle d=L/NA} 0.95, ובשמן עד ל-1.5. בגלל גבול העקיפה, אפילו מיקרוסקופ האור הטוב ביותר מוגבל לרזולוציה של 0.2 מיקרומטר. עם זאת בשנים האחרונות פותחו אמצעים שמאפשרים בתנאים מסוימים להתגבר על מגבלה זו, תחום מחקר ופיתוח זה מכונה מיקרוסקופיה ברזולוצית על. השיטה עליה מבוסס מיקרוסקופ ניגוד מופעים פותחה בידי פריץ זרניקה בשנות ה-30 של המאה ה-20, עליה זכה בשנת 1953 בפרס נובל בפיזיקה. השוני במקדם השבירה בין תאים חיים לסביבתם המימית הוא לרוב זניח, ועל כן לא ניתן להבחין בתאים חיים במיקרוסקופ אור רגיל על רקע סביבתם המימית. כדי להבחין בתאים יש לצבוע אותם (staining), מה שמביא למותם. שיטה אחרת משמשת במיקרוסקופ ניגוד מופעים. במיקרוסקופ זה מנוצלות הזזות מופע קטנות בגל האור העובר דרך התא לעומת סביבתו המימית, ומתורגמות להבדלי משרעת או ניגוד, ובכך להבחין בהם. השיטה שימושית לצפייה בתאים חיים בסביבתם, במקטעי רקמה דקים ואברונים תאיים. יתרונה הגדול של מיקרוסקופיה בשיטה זו הוא ביכולתה לעקוב אחרי תהליכים תאיים בתא החי, ובין היתר, אפשרה את חקר מחזור החיים בתא. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא מיקרוסקופיית אור המאפשרת זיהוי מולקולות ספציפיות באמצעות חותם ספקטרלי ובכך מתגברת על בעיית הרקע הקיימת במיקרוסקופ אור רגיל. הוא עושה זאת על ידי שימוש במנורת הלוגן חזקה (בדרך כלל מנורת כספית) כמקור אור, מנורה כזו מספקת מגוון רחב מאוד של אורכי גל (כולל UV), כאשר המולקולה אותה נרצה לראות נצבעת מבעוד מועד בצבע פלואורסצנטי. ניתן לצבוע אברונים מסוימים בתא בצבע פלואורסצנטי. צבע זה משמש כגלאי, העשוי חומר פלואורסצנטי. על מנת להבין את התהליך דרוש הסבר קצר על חומר פלואורסצנטי. חומר פלואורסצנטי הוא חומר שכשמקרינים עליו אור באורך גל מסוים נוצרת קפיצת אלקטרון ברמה, האלקטרון מיד חוזר לרמה הקודמת שלו, והוא עושה זאת תוך כדי פליטה של קרן אור. קרן האור הנפלטת מהאלקטרון תהיה בעלת אנרגיה נמוכה יותר מזו שהקפיצה את האלקטרון – כלומר אורך הגל יהיה ארוך יותר. במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוכנס חומר פלואורסצנטי שכזה אשר נקשר/נכנס רק למולקולת מסוימות (לדוגמה לאברונים בתא) כך שרק אלו יפלטו אור באורך הגל המבוקש, כך ניתן להדגיש אברונים מסוימים מתוך הרקע. האור נכנס ממנורת הכספית למיקרוסקופ, ופוגע מיד במסנן הראשון מתוך שניים. מסנן זה מאפשר רק לאורך גל מסוים לעבור. האור שעבר אותו ממשיך לנוע עד לפגיעה במראה המסיטה אותו אל עבר קונדנסור הדוחס את האור. הקונדנסור (שמשמש מעין מגבר) מרכז את האור אל עבר הדוגמה (הרקמה לבדיקה). החומר הפלואורסצנטי בדוגמה, מקפיץ את האלקטרונים, משנה את אורך הגל לאורך גל ארוך יותר, כך שלאחר שלב זה האור יוכל לעבור את המראה (בשלב השינוי באורך הגל). האור מגיע כעת למסנן השני, המסנן רק את אורכי הגל שבין 510 לבין 530 ננומטר. הוא עושה זאת כדי לסנן החוצה אור הנפלט בצורה טבעית מהדוגמה (לדוגמה בנטרול של רדיקלים חופשיים תאים מסוימים פולטים אור באופן טבעי). פרס נובל לכימיה לשנת 2014 הוענק על התגברות על מגבלות הרזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית והורדתה לקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ערך מורחב – מיקרוסקופיה קונפוקלית הבסיס למיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא השימוש במסננים מרחביים (חרירים), המאפשרים לבטל אור שמקורו מחוץ למוקד, המפריע להיווצרות תמונה ברורה במיקרוסקופ אור רגיל. בשנים האחרונות המיקרוסקופ הקונפוקלי נחשב למבוקש, בגלל הקלות היחסית של קבלת דמויות באיכות גבוהה של דוגמאות שהוכנו לצפייה תחת מיקרוסקופ רגיל. בעוד במיקרוסקופיה רגילה, שהיא מיקרוסקופיית שדה רחב, כל הדוגמה נשטפת באור, והתמונה יכולה להראות ישירות בעין או באמצעות מצלמה, במיקרוסקופ הקונפוקלי, מקור התאורה הוא בקרני לייזר הסורקות את הדמות פיקסל אחר פיקסל. חלקי הדמות נקלטים על ידי גלאי, ומורכבים לדמות המתקבלת על צג מחשב. אמנם, ניתן לראות בשיטה זו דוגמאות שאינן צבועות, אבל עדיף להשתמש בצביעה בגלאים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מציעה מספר יתרונות שהן מעבר למיקרוסקופיה אופטית, ובכלל כך שליטה בעומק השדה, הירידה באיכות הדמות ככל שגדל המרחק מהמוקד, והיכולת לצפות בדוגמה עבה באמצעות צפייה סדרתית בחלקים דקים מתוך דוגמה עבה. כשאור בא במגע עם עצם, דוגמת העצם בו רוצים להתבונן במיקרוסקופ, נוצרות קרניים של שדה קרוב, וקרניים של שדה רחוק. אור שדה רחוק מתקדם בחלל באופן מפוזר, והוא האור שנקלט במיקרוסקופיה רגילה. במיקרוסקופ שדה-קרוב נעשה שימוש באור שדה קרוב, שנמצא סמוך לעצם במרחק שהוא פחות מאורך גל אחד של אור. האור בשדה-קרוב נושא מידע שתדירותו גבוהה, והמשרעת שלו גבוהה במרחק כמה עשרות ננומטרים מהעצם. כאשר מתרחקים מהעצם כדי מאות ננומטרים, נכנסים לטווח השדה-רחוק, המידע המרחבי שתדירותו גבוהה אובד, ובמקומו מקבלים דפוסי התאבכות. באמצעות שימוש במיקרוסקופיית שדה-קרוב, ניתן ללכוד את המידע הרב שנמצא במרחקים קצרים בלבד מהדמות. לשם כך, משתמשים במחט מצוידת בעדשה זעירה בקצה, העוברת באופן סדרתי על פני העצם, וקולטת את קרני האור המוחזרות ממנו. התמונה המתקבלת נוצרת באמצעות מחשב. בדרך כלל נהוג לסרוק דוגמאות שנצבעו באופן פלואורסצנטי, אבל ניתן לצפות גם בעצמים שאינם צבועים. ערך מורחב – מיקרוסקופיית שדה אפל מיקרוסקופ שדה אפל הוא מיקרוסקופ בו אלומת האור פוגעת בדגם בזווית, כך שרוב האור העובר (או המוחזר) ללא פיזורים לא ייכנס אל תוך עדשת האובייקטיב והאור שנאסף אל תוך האובייקטיב הוא רק האור המפוזר מהדגם. בשיטה זאת ניתן להבחין בקלות גם בעצמים קטנים מאוד שעוצמת פיזור האור מהם נמוכה, מכיוון שהם יראו ככתם בהיר על רקע כהה. ערך מורחב – מיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית מיקרוסקופ רב-פוטונים הוא מיקרוסקופ אור המבוסס על עירור (אקסטיציה, excitation) שבעזרתו מדמים לרוב רקמות חיות מבלי לפגוע בתפקודן התקין. עירור המבוסס על שני פוטונים (או יותר) הפוגעים בו-זמנית בחלבון פלואורוסצנטי משתמש באורכי גל ארוכים יותר ועל כן חודר עמוק יותר לרקמה ומאפשר לדמות אזורים שאינם נגישים כשמעוררים דוגמה עם אורכי גל קצרים יותר. ערך מורחב – מיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופ אלקטרונים הוא מכשיר לצפייה מיקרוסקופית בעל עוצמה מרובה, גם להגדלות גבוהות מאוד, וגם לכושר הפרדה עצום. המיקרוסקופים מסוג זה בשימוש כיום פועלים באחת משתי שיטות: מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אשר עובר מעל פני השטח ונוגע בהם ומיקרוסקופ הקולט אלקטרונים העוברים דרך הדגם, וזקוק לדגמים דקים ביותר. תולדות התפתחותו של מיקרוסקופ האלקטרונים (לפי שנים): 1924 – החוקר הצרפתי דה ברווי, מעלה תאוריה חדשה לגבי האלקטרונים, שהם מתנהגים כגל האור. לאחר מכן, הראה החוקר בוש, ששדות מגנטיים יכולים לשמש כעדשות. 1933 – קנול ורוסקה, חוקרים גרמנים, הציעו מיקרוסקופ אלקטרונים פשוט. 1939 – מופיע דגם מסחרי של מיקרוסקופ אלקטרונים משוכלל יותר מהקודם (100 אנגסטרם). 1942 – בארצות הברית נבנה מיקרוסקופ האלקטרונים הראשון בעל כושר הפרדה של 25 אנגסטרם. כיום מצויים מיקרוסקופי אלקטרונים באמצעותם ניתן לצפות במולקולות ואף במולקולות DNA. מיקרוסקופ האלקטרונים תורם הרבה להבנת התא הביולוגי וכן מבנים ומערכות נוספות. ערך מורחב – מיקרוסקופ מנהור סורק מיקרוסקופ מנהור סורק, או ממ"ס (Scanning Tunneling Microscope, או STM) הוא מיקרוסקופ אשר בעזרתו ניתן לבחון משטחים ברמה האטומית. המיקרוסקופ פותח בשנת 1981 במעבדות של יבמ בציריך על ידי גרד ביניג והיינריך רורר, שקיבלו על המצאתם פרס נובל לפיזיקה לשנת 1986. הרזולוציה של ממ"ס יכולה להגיע ל-0.1 ננומטר במישור האופקי ול-0.01 ננומטר בציר האנכי. בניגוד למיקרוסקופ אלקטרוני השימוש בממ"ס אינו מחייב ריק או טמפרטורות נמוכות. עם זאת, הסריקה דורשת משטח נקי מאוד וטיפ חד ומדויק. המיקרוסקופ סורק את המשטח הנבחן בעזרת חוד סורק, והסריקה מתבססת על תופעת המנהור, תופעה קוונטית של מעבר אלקטרונים דרך מחסום פוטנציאל – במקרה של המיקרוסקופ, בין קצה החוד למשטח. זרם המנהור יהיה תלוי מחד במרחק החוד מפני השטח ומאידך בצפיפות מצבים קוונטיים פנויים על המשטח. שני הגורמים מאפשרים לבחון בעזרת המיקרוסקופ את פני המשטח, וגם להבחין בסוגים שונים של אטומים הנמצאים על המשטח, או לצפות בשינויים אנרגטיים באטומים מאותו סוג. בנוסף לתפקידו ככלי תצפית, יכול הממ"ס לשמש להזזת אטומים בודדים. יכולת זו התפרסמה כאשר בשנת 1989 סידרו החוקרים במרכז מחקר של יבמ 35 אטומים של קסנון בצורת האותיות IBM על פני משטח של ניקל, ובכך ייצרו את שלט הפרסום הקטן בעולם (נכון ל-2016), שגובהו 5 ננומטר בלבד. אולטרמיקרוסקופ טלסקופ נאשה אתר האגודה הישראלית למיקרוסקופיה ארז גרטי, מיקרוסקופ אור, במדור "מאגר המדע" באתר של מכון דוידסון לחינוך מדעי, 19 במאי 2010 מיקרוסקופיה (באנגלית) החברה המלכותית למיקרוסקופים מיקרוסקופ, באתר אנציקלופדיה בריטניקה (באנגלית) מיקרוסקופים, דף שער בספרייה הלאומית מיקרוסקופ : שנת 1590, באתר lib.cet.ac.il דר. משה נחמני, ‏פרס נובל לכימיה לשנת 2014 למגלי המיקרוסקופ הפלורסנטי: דוחקים את מגבלות מיקרוסקופ האור, באתר "הידען", 8 באוקטובר 2014 איתי נבו, ‏זוכי פרס נובל לכימיה מנצחים את חוקי הפיזיקה, באתר "הידען", 8 באוקטובר 2014 דר. משה נחמני, ‏נובל לכימיה 2014: כיצד הפך המיקרוסקופ האופטי לננו-סקופ, באתר "הידען", 9 באוקטובר 2014 Ernst Ruska, פרס נובל