חוליה מקשרת

חוליה מקשרת (MCS, Multiple Cloning Site), המכונה גם פולינלינקר ואתר בעל אתרי שיבוט מרובים, היא שמו של מקטע קצר של DNA מסונתז בפלסמידים מהונדסים המכיל אתרי קיטוע רבים של אנזימי הגבלה שונים (עד 20 אתרים). החוליה המקשרת מסייעת בהחדרת מקטעי DNA לפלסמידים בהם היא נמצאת, לשימושים שונים. בטבע, אנזימי ההגבלה לרוב נמצאים בחיידקים בחלק ממנגנון ההגנה שלהם כנגד נגיפים, כך שהם מזהים רצפי DNA ספציפיים של נגיפים שעברו איתם קו-אבולוציה. לכל אנזים אתר קיטוע ייחודי המורכב מ-4 עד 12 נוקלאוטידים. בפלסמידים מהונדסים מוסיפים את החוליה המקשרת המכילה מספר רב של אתרי קיטוע, המאפשרים לאנזימי הגבלה שונים לזהות את הרצף הספציפי שלהם ולקטוע בו את הפלסמיד. קיטוע זה פותח את הפלסמיד הטבעתי, ומאפשר להחדיר את קטע ה-DNA הרצוי לאותו האזור. החוליה המקשרת משמשת בתהליכים רבים הקשורים בחקר גנטי, ייצור חלבונים והנדסה גנטית, ונמצאת במגוון נשאים. סטטיסטית, כל מולקולת DNA בטבע מכילה אתרי מטרה לאנזימי הגבלה, אך לעיתים הנשא (וקטור) הרצוי אינו כולל אתרי קיטוע מתאימים. במקרים כאלו ניתן ליצור ולהחדיר לנשא חוליה מקשרת. השלב הראשון כולל תכנון של רצפי DNA משלימים קצרים (אוליגונוקלאוטידים) המכילים את אתרי הקיטוע של אנזימי ההגבלה הרצויים, כשבקצותיהם בסיסים משלימים נוספים המתאימים לנשא המעוכל. לאחר מכן ניתן לאחות את רצפי האוגלינוקלאוטידים אל תוך הנשא בעזרת האנזים DNA-ליגאז. החוליה המקשרת מאפשרת הכנסת DNA זר לפלסמיד מבלי לפגוע בו, תכונה שהופכת אותה לשימושית במיוחד בתחומי הביוטכנולוגיה, הנדסת הביוטכנולוגיה והביולוגיה המולקולרית. היא יכולה לסייע בין היתר בייצור תרופות, מחקר גנטי ובהכנת אורגניזמים טרנסגניים, המוכרים כאורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO). הוספת אנזים הגבלה מתאים לפלסמיד המכיל חוליה מקשרת מביאה לחיתוך הפלסמיד באתר הקיטוע ולהפיכת הפלסמיד למולקולה קווית. הקיטוע לרוב יתבצע כך שייווצר חתך משונן, בו קטע חד גדילי קצר נמצא בכל צד של המולקולה הקווית (שני הקטעים החד גדיליים משלימים זה לזה). כעת ניתן להוסיף לתמיסה המכילה פלסמידים קטועים רבים את הגנים אותם רוצים להחדיר אליהם. חיתוך הגנים הרצויים עם אותו אנזים הגבלה יביא ליצירת חתך משונן זהה לחתך שנוצר בפלסמיד, כך שהקצוות ה"דביקים" של הגנים משלימים לאלו של הפלסמיד. הוספת האנזים DNA-ליגאז לתמיסה המכילה את הגנים והפלסמידים החתוכים יביא לאיחוי של חלק מהגנים אל תוך חלק מהפלסמידים. ניתן לאתר את הפלסמידים אליהם אוחה הגן בהצלחה בשיטות שונות. החדרת הפסלמיד המאוחה עם הגן הרצוי לחיידק מארח תביא להכפלת מספר עותקי הגן פעמים רבות. גנים שהוחדרו למיקום מתועתק בפלסמיד (לאחר פרומוטור) ושהרצף שלהם עבר התאמות נחוצות לאורגניזם המארח כגון הוצאת אינטרונים, יביאו ליצירת התוצר החלבוני אותו הם מקודדים, אותו ניתן לאחר מכן לסנן ולהפריד מהמארח לקבלת החלבון הנקי. כך ניתן ליצר חלבונים שונים ובכללם חיסונים ותרופות, כגון אינסולין ואנטיביוטיקות שונות, בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה. תהליך זה משמש גם בטיפולים שונים של ריפוי גני. במחקר גנטי ניתן להכפיל את הפלסמידים המכילים את הגן המוחדר בשיטות שונות, כגון PCR, ולייצר מספר עותקים רב מאותו גן. pUC18 הוא פלסמיד חיידקי נפוץ המשמש בהנדסה גנטית כנשא שיבוט. החוליה המקשרת שלו סונתזה מאתרי קיטוע של מספר אנזימי הגבלה נפוצים, כגון EcoRI ,BamHI ו-Pstl, שהונדסו יחד למקטע אחד. נשא נפוץ נוסף הוא pUC19, הדומה ל-pUC18 אך בעל חוליה מקשרת הפוכה. אורגניזם מארח (מאכסן) נפוץ הוא E. coli, בעיקר בשל זמינותו, קצב הכפלתו המהיר והתאמתו למגוון רחב מטרות. Clark DP (2005). Molecular Biology. Academic Press. p. 611. ISBN 0-12-175551-7. "Addgene: What is a Plasmid?". www.addgene.org (באנגלית). נבדק ב-2018-04-29. Matt Carter, Jennifer Shieh, Guide to Research Techniques in Neuroscience, Elsevier, 2015, עמ' 219–237 "How to create a pefect MCS" (PDF). Addgene. 2018-04-28. "BBC - Standard Grade Bitesize Biology - Reprogramming microbes : Revision, Page 2" (באנגלית בריטית). נבדק ב-2018-04-29. "Tools of Genetic Engineering | Boundless Microbiology". courses.lumenlearning.com. נבדק ב-2018-04-29.