דיכוי פלואורסצנטי

ריווי או דיכוי פלואורסצנטי (באנגלית: Quenching) מתייחס לכל תהליך שמוריד את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של חומר נתון. מגוון תהליכים יכולים לגרום לרלקסציה, כמו תגובות למצב מעורר, העברת אנרגיה, יצירת קומפלקסים או התנגשות אלקטרונים. כתוצאה מכך, דיכוי פלואורסצנטי תלוי לעיתים קרובות מאוד בלחץ ובטמפרטורה. חמצן מולקולרי, יוני יוד ואקרילאמיד הם מדכאים כימיים נפוצים. יון הכלוריד הוא מדכא ידוע לפלואורסצנצית כינין. דיכוי פלואורסצנטי מהווה בעיה בשיטות ספקטרוסקופיות שאינן מיידיות, כגון פלואורסצנציה בהשראת לייזר. לדיכוי פלואורסצנטי נעשה שימוש בחיישני אופטוד; למשל אפקט הדיכוי של חמצן על קומפלקסי רותניום מסוימים מאפשרת מדידה של ריווי חמצן בתמיסה. דיכוי פלואורסצנטי הוא הבסיס לתבחינים ביולוגיים של העברת אנרגיית תהודה (FRET). דיכוי ואי-דיכוי פלואורסצנטי לאחר אינטראקציה עם יעד ביולוגי מולקולרי ספציפי הוא הבסיס לחומרי ניגוד אופטיים פעילים בדימות מולקולרי. ערך מורחב – מעבר אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית ישנם כמה מנגנונים מובחנים שבאמצעותם ניתן להעביר אנרגיה ללא קרינה (ללא בליעה או פליטה של פוטונים) בין שני צבענים, תורם ומקבל. העברת אנרגיה בתהודה (FRET) היא מנגנון דיכוי דינמי מכיוון שהעברת אנרגיה מתרחשת בזמן שהתורם במצב מעורר. FRET מבוסס על אינטראקציות דיפול-דיפול קלאסיות בין דיפולי המעבר של התורם ומקבל והוא תלוי באופן קיצוני במרחק המקבל מהתורם, R {\displaystyle R} , נופל בקצב של 1 / R 6 {\displaystyle {1}/{R^{6}}} . FRET תלוי גם בחפיפה הספקטרלית של התורם ומקבל (ראה איור) ובנטייה היחסית של מומנטי הדיפול של התורם והמקבל. FRET יכול בדרך כלל להתרחש על פני מרחקים של עד 100 אנגסטרם. דקסטר (המכונה גם שחלוף דקסטר או מעבר אנרגיה קולקטיבי) הוא מנגנון דיכוי דינמי נוסף. מעבר אלקטרון דקסטר היא תופעה קצרת טווח הנופלת באופן אקספוננציאלי עם המרחק (פרופורציונלי ל- e − k R {\displaystyle e^{-kR}} , כאשר k {\displaystyle k} הוא קבוע התלוי הופכית ברדיוס ואן דר ואלס של האטום) ותלויה בחפיפה מרחבית של אורביטלים מולקולריים של התורם והמדכא (Quencher). ברוב המצבים של תורם פלואורופור ומקבל מדכא, מנגנון FRET חשוב יותר ממנגנון דקסטר שמתרחש במרחקים קצרים יותר של פחות מ-10 אנגסטרם. מעבר אלקטרון דקסטר יכולה להיות משמעותית בין הצבען לממס, במיוחד כאשר נוצרים ביניהם קשרי מימן. דיכוי סטטי יכול להיות מנגנון דומיננטי עבור פרובים מדכאים. שלא כמו דיכוי דינמי, דיכוי סטטי מתרחש כאשר המולקולות מהוות קומפלקס במצב היסוד, כלומר לפני שמתרחש עירור. לקומפלקס תכונות ייחודיות משלו, כמו למשל שאינו פלואורסצנטי וספקטרום בליעה ייחודי. הצטברות צבע נובעת לרוב מאפקט הידרופובי - מולקולות הצבע נערמות זו על גבי זו כדי למזער את המגע עם המים. צבעים ארומטיים מישוריים המתאימים לאסוציאציה באמצעות כוחות הידרופוביים יכולים להעצים את הדיכוי הסטטי. טמפרטורות גבוהות ותוספת של חומרים פעילי שטח נוטות לשבש היווצרות קומפלקס במצב היסוד. ניתן לראות תהליך דיכוי חשוב בפיזיקה האטמוספירית בשונות הגובה של פליטות אורוריות. בגבהים גדולים (מעל ~ 200 ק"מ), יש פליטה אדומה של 630 ננומטר של חמצן אטומי, ואילו בגבהים בשכבת E (היונוספירה) הפליטה הדומיננטית היא פליטה ירוקה של 557.7 ננומטר. שתיהן כמעט נעלמות בגבהים שמתחת למאה ק"מ. וריאציה זו מתרחשת בגלל זמני החיים הארוכים במיוחד של מצבים מעוררים של חמצן אטומי, עם 0.7 שניות לפליטה הירוקה של 557.7 ננומטר וכמעט שתי דקות לפליטה האדומה של 630 ננומטר (שניהם מעברים אסורים). הנתיבים הממוצעים ללא התנגשות פוחתים בגבהים נמוכים יותר בגלל צפיפות החלקיקים הגוברת, מה שמביא לירידה בעירור אטומי החמצן עקב ההסתברות הגבוהה יותר להתנגשות, ומונעת פליטה של קווי החמצן האדומים והירוקים. מדכא אפל (Dark Quencher) - משמש בביולוגיה מולקולרית. FRET - תופעה שכמה טכניקות דיכוי מסתמכות עליה. Phillips SR, Wilson LJ, Borkman RF, Acrylamide and iodide fluorescence quenching as a structural probe of tryptophan microenvironment in bovine lens crystallins, Current Eye Research, 8 5, 1986, עמ' 611-620 doi: 10.3109/02713688609015126 J. E. O'Reilly, Fluorescence experiments with quinine, Journal of Chemical Education, 9 52, 1975, עמ' 610-612 doi: 10.1021/ed052p610 Sacksteder L, Ballew RM, Brown EA, Demas JN, Nesselrodt D, DeGraff BA, Photophysics in a disco: Luminescence quenching of quinine, Journal of Chemical Education, 12 67, 1990, עמ' 1065 doi: 10.1021/ed067p1065. Gutow JH, Halide (Cl-) Quenching of Quinine Sulfate Fluorescence: A Time-Resolved Fluorescence Experiment for Physical Chemistry, Journal of Chemical Education, 2 82, 2005, עמ' 302 doi: 10.1021/ed082p302 Peng X, Draney DR, Volcheck WM, Quenched near-infrared fluorescent peptide substrate for HIV-1 protease assay, Optical Molecular Probes for Biomedical Applications 6097, 2006, עמ' 60970F doi: 10.1117/12.669174 Peng X, Chen H, Draney DR, Volcheck W, Schutz-Geschwender A, Olive DM, A nonfluorescent, broad-range quencher dye for Förster resonance energy transfer assays, Analytical Biochemistry, 2 388, 2009, עמ' 220-228 doi: 10.1016/j.ab.2009.02.024 Osterman H, The Next Step in Near Infrared Fluorescence: IRDye® QC-1 Dark Quencher, Review Article 388, 2009, עמ' 1-8 Blum G, Weimer RM, Edgington LE, Adams W, Bogyo M, Comparative Assessment of Substrates and Activity Based Probes as Tools for Non-Invasive Optical Imaging of Cysteine Protease Activity, PloS One, 7 4, 2009, עמ' e6374 doi: 10.1371/journal.pone.0006374 Weissleder R, Tung CH, Mahmood U, Bogdanov A, "In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes, Nature Biotechnology, 4 17, 1999, עמ' 375-378 doi: 10.1038/7933 "The "Gold Book, Dexter excitation transfer (electron exchange excitation transfer), 2nd ed, International Union of Pure and Applied Chemistry, 1997, ISBN 10.1351/goldbook.D01654 Rees MH, Jones RA, Time dependent studies of the aurora—II. Spectroscopic morphology, Planetary and Space Science, 7 21, 1973, עמ' 1213–1235 doi: 10.1016/0032-0633(73)90207-9 Johnsen MG, Lorentzen DA, Holmes JM, Løvhaug UP, A model based method for obtaining the open/closed field line boundary from the cusp auroral 6300 Å[OI red line], Journal of Geophysical Research: Space Physics, A3 117, 2012 doi: 10.1029/2011JA016980