שכפול DNA

שכפול DNA הוא תהליך יצירת העתק של מולקולות ה-DNA בתאיהם של יצורים חיים. מולקולת ה-DNA החדשה מסונתזת מנוקלאוטידים חופשיים הנמצאים בתא. השכפול מתבצע באמצעות האנזים DNA פולימראז. מולקולת ה-DNA הקיימת משמשת כתבנית ליצירת המולקולה החדשה. תהליך השכפול מתרחש טרם הפליגה, המיטוזה והמיוזה ומהווה אחד משורת התהליכים הקודמים לחלוקת התא. שלב שכפול ה-DNA במחזור התא נקרא גם שלב S. אם שלב זה מוכתר בהצלחה, בסיומו קיימות בתא 2 מולקולות DNA דו-גדילי אשר זהות למולקולה המקורית. השכפול הוא תהליך סמי-קונסרבטיבי—כל אחת ממולקולות ה-DNA החדשות מכילה גדיל אחד שמקורו במולקלת ה-DNA המקורית וגדיל אחד אשר נוצר בזמן תהליך השכפול. מזלג ההכפלה (Replication fork) הוא השם שניתן לצורה המתקבלת בעת שכפול ה-DNA. שני הגדילים המרכיבים אותו מופרדים זה מזה בעזרת האנזים הליקאז (Helicase), אשר שובר את קשרי המימן בין הבסיסים. במצב זה מקבל ה-DNA צורה המזכירה מזלג או Y ומכאן השם. לאחר הפרדת הגדילים נוצרים שני חד גדילים, כדי למנוע מהם לשוב וליצור קשרי מימן זה עם זה נקשרים אליהם חלבונים הנקראים חלבונים קושרי חד-גדיל (SSBP - Single strand binding proteins). הדנ"א פולימראז מזהה את האזור שאליו הוא אמור להקשר בעזרת פריימר, נקשר אליו ומתחיל לסנתז גדיל כפול מחד הגדיל תוך שהוא מסיר את ה SSBP. בפרוקריוטיים, בכל מקור שכפול נוצרים שני מזלגות הכפלה, עם התקדמות הפולימראז מתחברים מזלגות אלו כך שהגדיל כולו מוכפל. על-מנת לשכפל כרומוזומים שלמים בתאים האאוקריוטיים, התא משקיע אנרגיה רבה ביצור אנזימים אשר משכפלים את ה-DNA במקביל, בקצב של 50 זוגות בסיסים בשנייה, כל אחד. התהליך מואץ על ידי התחלה סימולטנית של תהליך השכפול ממספר מקורות שכפול, וכך שכפול כלל ה-DNA בתא אאוקריוטי (כ-3 מיליארד בסיסים בתא אנושי) לוקח כ-8 שעות בלבד. בתאים פרוקריוטיים קצב השכפול מהיר יותר (כ-1000 בסיסים לשנייה), אך מתבצע ממקור הכפלה אחד בלבד, כך שתהליך השכפול של כרומוזום של חיידק דוגמת אי קולי, שאורכו כמה מיליוני בסיסים, אורך כ-40 דקות. דיוק התהליך הוא בעל חשיבות עליונה שכן למוטציות ב-DNA יכולות להיות השפעות הרסניות על תפקוד התא ועל גורל האורגניזם כולו. על-מנת לשמור על מהימנות ה-DNA החדש, קיים בתא מנגנון לתיקון DNA שתפקידו לתקן פגמים בזיווג הבסיסים ולתקנם. עיקרי המנגנון מוכתבים על ידי מספר הגבלות ביוכימיות אשר מסבכות את המלאכה: סינתזת גדיל DNA אפשרית רק בכיוון אחד - מקצה 5' לקצה 3' - כלומר - נוקלאוטידים מוספים רק לקצה 3'. סינתזת DNA חייבת להתחיל מקצה 3' חשוף של נוקלאוטיד כלשהו. משמעות הדבר היא שלא ניתן "לשתול" נוקלאוטיד DNA בודד על גבי תבנית של DNA חד-גדילי. לשם כך בתחילת הסינתזה של כל גדיל יש לשתול פריימר קצר - מספר בסיסים של RNA שאליו מתחברת ההתחלה של הגדיל החדש. לאחר שימוש יש צורך לסלק את הפריימר, להשלים במקומו מספר בסיסי DNA ולסגור קשר פוספודיאסטרי בפתח שנוצר ליד הבסיס שהיה מחובר לפריימר (nick). האורך הכולל של הכרומוזומים בתא אאוקריוטי מגיע למיליארדי בסיסים, בעוד שזמן מחזור התא יכול להימדד בשעות. תהליך השכפול צריך להיות לכן תהליך מהיר במיוחד, תוך שמירה על אמינות מרבית. תהליך השכפול מתחלק לשלושה שלבים: אתחול (Initiation), שכפול (Replication) וסיום (Termination). תהליך האתחול מתרחש באזור מקור השכפול (Origin of Replication), על גבי מולקולת ה-DNA. ביצורים פרוקריוטיים, שלהם לרוב כרומוזום מעגלי בודד, קיים בדרך כלל מקור שכפול אחד, בעוד שבאאוקריוטיים, שמולקולות ה-DNA שלהם גדולות בהרבה, השכפול מתחיל בו זמנית במספר מקורות. מסתבר, כי לולא היה נוצר מנגנון זה ו-DNA היה משתכפל ממקור שכפול אחד - שכפול מולקולה אחת היה אורך כ-800 שעות. בתחילת התהליך מספר חלבוני מפתח נקשרים לאזור מקור השכפול וגורמים לפתיחה חלקית של סליל ה-DNA באזור. כתוצאה מפתיחה זו נוצרת בועת השכפול (Replication bubble), שמכילה שני מזלגות השכפול - אחד לכל כיוון. תהליך השכפול מתקדם מאתר האתחול בשני כיוונים, כאשר המזלגות הולכים ומתרחקים ממקור השכפול ובועת השכפול הולכת וגדלה לכל אורך התהליך. במרכזו של כל מזלג נמצאת קבוצת אנזימים. האנזימים העיקריים בתהליך הם: DNA הליקאז (DNA Helicase): אנזים אשר מבצע התכה (Denaturation) של ה-DNA הדו-גדילי ומפריד אותו לשני גדילים נפרדים. חלבונים קושרי חד-גדיל (Single-Strand Binding Proteins):לאחר פתיחת הדו-גדיל, הנטייה הכימית של הגדילים היא להיסגר בחזרה, דבר אשר לא יאפשר, כמובן, את שכפולם. תפקיד החלבונים קושרי החד-גדיל הוא למנוע קישור זה ולהשאיר את שני הגדילים כתבניות חשופות. DNA פרימאז (DNA Primase):כאמור, לא ניתן להתחיל את סינתזת ה-DNA מדיאוקסי נוקלאוטיד (בסיס DNA) בודד, אולם הדבר אפשרי עם נוקלאוטיד של RNA. תפקידו של הפרימאז הוא ליצור פריימר RNA ראשוני שאליו מתחברים לאחר מכן בסיסי הDNA. דיוק הפריימר נמוך מאחר שהוא מוסר לקראת סוף התהליך. DNA פולימארז III (DNA Polymerase III): אנזים אשר מבצע פלמור של הגדיל החדש על ידי יצירת קשרים פוספודיאסטריים בין הנוקלאוטידים אשר נקשרים לגדיל התבנית. אנזים זה הוא למעשה קומפלקס המורכב ממספר חלבונים הפועלים יחדיו. זה הפולימראז העיקרי הפועל לבניית ה DNA וקצבו מהיר. DNA פולימארז I - פולימראז שמזהה את הניק שנוצר בין ה-DNA שסונתז לפריימר שנוצר על ידי הפרימז. הוא נקשר לניק, ומפרק את הפריימר תוך סינתוז גדיל DNA חדש. פעילותו איטית יחסית לפעילות פולימראז III.‏ DNA ליגאז (DNA Ligase): לאחר סילוק הפריימר יש צורך "לקשר מחדש" בקשר פוספודיאסטרי את הנוקלאוטיד שהיה צמוד לפריימר ה-RNA. הליגאז מבצע תפקיד זה. בשלב זה מזלגות השכפול "מתקדמים" לשני הכיוונים ומתרחקים ממקור השכפול. בפתח של כל מזלג מצוי ה-DNA פולימראז המאריך את הגדילים המתהווים על גבי שתי התבניות המקוריות. בשל האילוץ המתואר לעיל, רק על אחד הגדילים של המזלג ניתן לבצע סינתזה רצופה של גדיל אחד לכל אורך המולקולה - הגדיל המסונתז מתחיל בקצה ה5' ומתארך לכיוון ה3'. בכיוון השני נוצרת בעיה שנפתרת על ידי מקטעי אוקזקי. כל כמה מאות בסיסים מוטבע פריימר על התבנית, מסונתז קטע DNA קצר בכיוון הנכון ואז הפריימר מסולק. קומפלקס האנזימים אוחז בשני הגדילים של מולקולת ה-DNA בצורה המאפשרת פעילות בו-זמנית של הסינתזה בשני הגדילים. בסיום השכפול, כאשר המזלגות משני הצדדים מגיעים לסוף הכרומוזום, נוצרת בעיה חדשה - לאחר שמוסר פריימר ה-RNA של המקטע האוקזקי האחרון, לא ניתן להחליפו במקטע DNA, שכן אין קצה 3' חשוף שאליו ניתן לחברו. הפתרון שמצאה האבולוציה לבעיה זו הוא הטלומר. אנזים מיוחד בתא - הטלומראז, אחראי בשלבי התפתחות עובריים של התאים על יצירת מקטעי DNA חוזרניים וארוכים בשני צידי הכרומוזום. מקטע DNA זה אינו מקודד וכל תפקידו הוא להתקצר במהלך השכפולים שהתא עובר במחזור חייו, כדי שההתקצרות הבלתי נמנעת של הכרומוזום לא תפגע בחלקים המקודדים. כיום מאמינים שמנגנון זה מבקר הזדקנות של התאים ומהווה את אחד ממנגנוני ההגנה של הגוף כנגד גידולים סרטניים. אחת ההשערות היא שחלק מן התאים הסרטניים "רוכשים מחדש" את פעילות הטלומראז ובכך מונעים את מותם הטבעי מ"זקנה". שכפול עצמי מודל הרוכסן לשכפול DNA מדיה וקבצים בנושא שכפול DNA בוויקישיתוף הלכה למעשה - כיצד פועל ה-DNA שיכפול DNA - מכון ויצמן שכפול DNA, דף שער בספרייה הלאומית