Replisoom

Replisoom on valgukomplekside kooslus, mis viib läbi DNA replikatsiooni. Replisoom harutab kaheahelalise DNA (dsDNA) lahti üheahelaliseks DNA-ks (ssDNA). Seejärel sünteesitakse kummalegi DNA üksikahelale komplementaarne kõrvalahel – algse DNA molekuli asemele tekib kaks uut ja identset DNA koopiat. Replisoom moodustub igal replikatsioonitsüklil uuesti, st iseseisva üksusena see ei eksisteeri. Replisoom saab moodustuda vaid replikatsioonikahvlis – nii nimetatakse piirkonda eraldatud ahelate ja mittereplitseerunud DNA vahel. Replikatsioonikahvel omakorda liigub alati replitseerimata DNA suunas. Replisoomi põhikomponendid on eri domeenides (viirused, arhed, eukarüoodid, prokarüoodid) konserveerunud ehk evolutsioonis muutumatuna püsinud. Peamised komponendid on: helikaas kaheahelalise DNA lahti harutamiseks; polümeraas(id) uue komplementaarse ahela sünteesiks; libisev klamber, et suurendada polümeraaside protsessiivsust; üksikahelale seonduvad valgud (SSB/RPA) eraldunud ahelate stabiliseerimiseks; RNaas H ja ligaas protsessi lõpetamiseks. Replisoom peab oma ülesannete täitmiseks olema ühtaegu stabiilne, ent samas piisavalt dünaamiline. Kompleks vastutab kõigi replikatsiooni efektiivsust ja täpsust tagavate ensümaatiliste protsesside eest. Replisoom peab kõigepealt replitseeruvale DNA-le korrektselt moodustuma, seejärel tagama elongatsiooni ehk sünteesitava ahela pikendamise ning peale replikatsiooni terminatsiooni ka DNA-lt eralduma. Prokarüootides replitseeritakse väike tsirkulaarne genoom vaid ühest spetsiifilisest alguspunktist (ingl origin – oriC) lähtudes. Replikatsiooni algussaiti tekib kaks eraldiseisvat replikatsioonikahvlit, mis lahknevad vastassuunas. Koos kahvlitega liiguvad kaasa ka replisoomid, mis tagavad DNA kahesuunalise replikatsiooni – üht ahelat pikendatakse ühes, teist teises suunas. Genoomi tsirkulaarsuse tõttu kohtuvad replisoomid uuesti terminaatorpiirkonnas ter, moodustunud ahelad jäävad ketina seotuks, neid eraldab topoisomeraas II. Eukarüootidel on see-eest suur hulk replikatsiooni algussaite, mis tähendab, et üle kogu kromosoomi tekib üheaegselt mitmeid replikatsioonimulle. Sarnaselt prokarüootsele replikatsioonile algab igast alguspunktist kahesuunaline replikatsioon. Helikaas on DNA lahtiharutamises võtmerolli mängiv ensüüm, mis lõhub ATP hüdrolüüsi jõul DNA dupleksis olevate aluspaaride vahelisi vesiniksidemeid. Selle rõngakujuline heksameerne struktuur seondub ümber dsDNA ning harutab lahti edasisse sünteesi minevad ahelad, tekitades replikatsioonikahvli. Helikaasid mängivad olulist rolli nii replikatsiooni initsiatsioonis kui ka elongatsioonis. Prokarüootides esineb helikaas DnaB, mis aga suudab lahti harutada vaid juba avatud dsDNA-d – siin tuleb mängu initsiaatorvalk DnaA, mis seondub DNA algussaidile (oriC) ja harutab kõrvaloleva DNA lahti. Valk-valk-interaktsioonide abil antakse signaal helikaasi laadija DnaC-le, mis omakorda signaliseerib helikaasi DnaB-d. Eukarüootides esineb helikaas MCM2–7 (ingl minichromosome maintenance) kompleks, mille reguleerimine toimub vastavalt rakutsüklile. Esmalt laetakse MCM2–7 kompleks ORC-dega (ingl origin recognition complex) märgistatud algussaitidele, kusjuures laadimiseks on vaja lisavalke Cdc6 (ingl cell division cycle 6) ja Cdt1 (ingl chromatin licensing and DNA replication factor 1). Helikaasid aktiveeritakse sünteesifaasis – tekib CMG kompleks, mis on võimeline dsDNA ahelaid lahti harutama ning replikatsiooni alustama. Helikaaside pöörlev liikumine DNA ahelate lahti harutamisel muudab DNA topoloogiat, tekitades superspiralisatsiooni ehk DNA vinti keerdumist. Replikatsioonikahvli ees paiknev piirkond superspiraliseerub positiivselt, kahvli taha jääv osa aga negatiivselt. Superspiraalid akumuleeruvad eemaldatud DNA-aluspaaride tõttu. Topoloogilisi pingeid vähendavad topoisomeraasid, mis tekitavad DNA-sse lühiajalisi ühe- või kaheahelalisi katkeid. Selle tulemusena tekivad sälgud, mille kaudu saab DNA-l superspiraalist välja keerduda. Üheahelaline DNA on termodünaamiliselt väga ebastabiilne, mistõttu võib see spontaanselt iseendaga sekundaarstruktuure moodustada. Lisaks on ssDNA oluliselt tundlikum keemiliste ja nukleolüütilste (nukleaasid lõhuvad nukleiinhappe fosfodiestersidemeid) reaktsioonide suhtes. Vältimaks genoomse info kahjustusi, seostub ssDNA kaitsvate valkudega, millel on ssDNA suhtes kõrge afiinsus ehk vastuvõtlikkus, kusjuures valgud seostuvad kooperatiivselt (üks ees, teine järel) ja mitte järjestusspetsiifiliselt. Lisaks on kaitsvate valkudega seotud ssDNA polümeraasile paremaks substraadiks. Sünteesi käigus üksikahelaga seotud valgud eemaldatakse. ssDNA-ga seonduvad kaitsvad valgud on leitavad kõigis eludomeenides, kuid valkudel on eri organismides võrdlemisi vähe sarnasusi. Eukarüootide vastavad valgud on heterotrimeersed ehk kolmest identsest subühikust koosnevad RPA-d (ingl replication protein A). Prokarüootide (näiteks Escherichia coli'l) valgud on aga homotetrameersed SSB-d (ingl single-stranded binding protein) . Üheahelalisele DNA-le seonduvaid valke reguleeritakse aminohappejääkide fosforüülimise teel – eukarüootsel RPA-l fosforüülitakse vastavalt seriini ja treoniini jäägid ning bakteriaalsel SSB-l türosiini jäägid . RPA ja SSB on olulised ka homoloogilisel rekombinatsioonil ja nukleotiidide väljalõikereparatsiooni (NER) rajas . Uute DNA ahelate sünteesiks ei piisa üheahelalisest DNA-st (koos SSB-ga), sest DNA polümeraas uut ahelat de novo sünteesida ei suuda. Replikatiivne polümeraas vajab nukleotiidse ahela elongatsiooniks lühikest juba valmis RNA juppi, mida nimetatakse praimeriks. Praimeril on vaba 3´ OH ots, mille külge saab polümeraas uusi nukleotiide sünteesida. Lühikesi RNA praimereid loovad praimeerivad ensüümid (DNA sõltuvad RNA polümeraasid), mis on komplementaarsed üheahelalise matriits-DNA-ga. RNA-polümeraas on erinevalt DNA-polümeraasist võimeline alustama uut RNA ahelat de novo. Spetsiaalne RNA polümeraas – praimaas – sünteesib lühikesi oligonukleotiidseid RNA praimereid nii juhtiva kui ka mahajääva ssDNA matriitsile. Praimaas ei vaja seega uue RNA praimeri sünteesi initsiatsiooniks spetsiifilist DNA järjestust. Replikatsiooni lõpus eemaldab praimerid 5´→ 3´ suunaline eksonukleaas. Juhtivale ahelale sünteesitakse praimer vaid ühe korra, kuid mahajäävat ahelat praimeeritakse umbes iga tuhande nukleotiidi järel (igale Okazaki fragmendile toodetakse üks praimer). Prokarüoodis on praimeriks DnaG, mis aktiveerub DnaB helikaasiga ühendudes. Eukarüoodis on heterodimeerne praimaas, mis moodustab nelja subühikulise kompleksi DNA polümeraas α-ga. Kui praimaas sünteesib RNA praimeri, muutub RNA praimer-matriitsühendus substraadiks DNA polümeraas α-le DNA sünteesi initsiatsiooniks (sünteesib umbes 20–30 nukleotiidi pikkuse jupi). DNA polümeraas α on aga madala protsessiivsusega, mistõttu toimub polümeraasi vahetus kõrgelt protsessiivsete polümeraaside DNA Pol δ ja DNA Pol ε vastu. Korrektne DNA replikatsioon on protsessiivsusega, seega kiire, täpne ja katkematu. Protsessiivsuse tagab rõngakujuline mitmest identsest subühikust koosnev libisev klamber, mis hoiab DNA polümeraasi kopeeritava ahelaga tugevalt seotuna ning ei lase sel dissotsieeruda ehk eralduda. Klambri keskel asetsev avaus on piisavalt suur, et mahutada DNA kaksikheeliksit ning 1-2 molekuli paksust veekihti DNA ja klambri vahel. Klambrid libisevad mööda DNA-d dissotsieerumata ning seonduvad replikatsioonikahvlites tugevalt DNA-polümeraasidele. Klambri asetab DNA-le libiseva klambri laadija – valgukompleks, mis katalüüsib klambri avamist ja asetamist DNA-le, kasutades ATP hüdrolüüsi energiat. Klamber lisatakse vaid juhul, kui rakus on olemas praimer-matriits DNA-hübriidkompleks (nn DNA A-vorm). Kompleksile seondumisel eralduv energia on piisav klambri avamiseks ning selle keeramiseks DNA ahelate ümber. Laadiv kompleks vastutab ka klambri eemaldamise eest replikatsiooni lõpus (või Okazaki fragmendi lõpus). Klambri puudumisel dissotsieeruks DNA-polümeraas juba peale 20–100 aluspaari sünteesi. Klambriga seotuna võib polümeraasi aktiivsait küll 3´ OH otsast lahti haakuda, kuid klamber ei lase sel minema difundeeruda. Kui ssDNA matriits on kopeeritud, muutub DNA-polümeraasi ja klambri vaheline afiinsus. DNA-polümeraas, mis on seotud praimer-matriitsühendusele, on klambri suhtes kõrge afiinsusega. Fragmendi lõppu jõudes (näiteks Okazaki fragmendi puhul) toimub konformatsiooniline muutus, mille tagajärjel DNA-polümeraasi vastuvõtlikkus klambri ja DNA suhtes väheneb. Seega kui polümeraas lõpetab DNA jupi replikatsiooni, vabastab klamber ensüümi nii, et see saab seonduda uue praimer-matriitsiga. Libiseva lambri laadija on üldnimetus, mis viitab prokarüoodis replikatsioonifaktorile γ ning eukarüoodis replikatsioonifaktorile C (RFC). Prokarüoodis on libisev klamber homodimeerne β-klamber (koosneb polümeraas III β-subühikutest) ning eukarüoodis homotrimeerne PCNA (ingl proliferating cell nuclear antigen). Libisev klamber ja tema laadija on hädavajalikud replikatsiooni läbiviimiseks, mistõttu on nad ka eri domeenides oma struktuurilt kõrgelt konserveerunud (struktuurilt identsed, aga nukleotiidselt järjestuselt erinevad). DNA-polümeraasid DNA ahelate polümerisatsiooni ehk pikenemist katalüüsivate ensüümide perekonna. Replikatiivne polümeraas moodustab asümmeetrilise dimeeri, mille struktuur tagab juhtiva ja mahajääva ahela üheaegse polümerisatsiooni. DNA-polümeraas saab lisada vabu nukleotiide vaid sünteesitava ahela 3’ otsa, mistõttu pikendatakse uut ahelat alati 5´→ 3’ suunal. Juhtiv ja mahajääv ahel on aga omavahel anti-paralleelsed (vastassuunalised), seega neid sünteesitakse erinevalt. Juhtiva ahela kopeerimine toimub katkematult, kuid mahajäävat ahelat sünteesitakse lühikeste lõikudena, nn Okazaki fragmentidena. Okazaki fragmendid võivad oma pikkuselt varieeruda, olles 1000–2000 nukleotiidi pikad prokarüootides ja 100–400 nukleotiidi pikad eukarüootides. Mahajäävale ahelale saab komplementaarse ahela süntees toimuda alles siis, kui helikaas on lahti harutanud piisava pikkusega jupi DNA-d, tekitades ssDNA lingu ehk silmuse. Polümeraas töötab seni, kuni kohtab eelmise fragmendi RNA-praimerit. Seejärel libisev klamber ja polümeraas dissotsieeruvad ning kogu tsükkel algab uuesti. Prokarüoodis teostab replikatiooni polümeraas III, mis on kõrge protsessiivsusega ning esineb enamasti osana suuremast kompleksist – DNA polümeraas III holoensüüm – mis tagab veelgi suurema täpsuse . Eukarüoodis on replikatsiooni initsiatsiooniks vaja polümeraas α olemasolu, mis aga oma madala protsessiivsuse tõttu vahetatakse kiiresti välja DNA Pol δ ja DNA Pol ε vastu . Pärast juhtiva ja mahajääva ahela sünteesi säilivad dupleksis RNA-praimerid; mahajäävale ahelale, Okazaki lõikude vahele jäävad alles ka väikesed sälgud. Praimerite eemaldamine ja sälkude ligeerimine tagavad keemiliselt stabiilse ja ilma vigadeta DNA topeltheeliksi. Prokarüoodis viivad eeltoodud protsesse läbi RNaas H, DNA-polümeraas I ja DNA-ligaas. RNaas H tunneb ära ja eemaldab enamiku RNA praimeritest, välja arvatud viimase nukleotiidi praimeri 3´ otsas – ensüüm on nimelt võimeline sidemeid ainult ribonukleotiidide (mitte desoksüribonukleotiidide) vahel lõhkuma. Viimase nukleotiidi eemaldab seetõttu eksonukleaasse aktiivsusega polümeraas I. Erinevalt DNA-polümeraas III-st on polümeraas I-l ka 5′→ 3′ suunaline eksonukleaasne aktiivsus, millega eemaldataksegi RNA praimeri viimane nukleotiid. Tekkinud augud täidab sama polümeraas. Kõige lõpus ligeerib ehk ühendab fragmendid üheks ahelaks kokku DNA ligaas. Eukarüootidel on RNaas H ja DNA ligaas samuti olemas, ent eksonukleaasse aktiivsusega polümeraas puudub. Selle asemel on eukarüoodil olemas ensüüm nimega FEN1 (ingl flap endonuclease 1). Okazaki fragmente ühendatakse teistsuguse mehhanismi kui prokarüoodis – iga kord, kui polümeraas δ uue fragmendi sünteesib, siis sõidab osa sellest sisse eelneva fragmendi 5´ otsa, tekitades nihke ja lahtise otsa, mis sisaldab nii RNA praimerit kui ka väikest DNA segmenti. N-ö kõrvaletõrjutud ahela eemaldabki just endonukleaas FEN1. Alles jääb väike sälk, mille ühendab DNA-ligaas. Kui aga juhtub, et kõrvaletõrjutud ahelad sisaldavad sekundaarstruktuure või on liiga pikad, siis pole FEN1 suuteline neid eemaldama. Sellised ssDNA jupid kaetakse RPA-dega ning need on substraadiks helikaasse ja nukleaasse aktiivsusega ensüümile Dna2, mis eemaldab liiga pikad ahelad, jättes alles lühikese otsa, mis on FEN1-le sobiv substraat. Yao, N. Y., O’Donnell, M. (2010). SnapShot: The Replisome. Cell. 141 (6): 1088–1088. Leman, A. R., Noguchi, E. (2013). The Replication Fork: Understanding the Eukaryotic Replication Machinery and the Challenges to Genome Duplication. Genes.4 (1): 1–32. Beattie, T. R., Reyes-Lamothe, R. (2015). A Replisome’s journey through the bacterial chromosome. Frontiers in Microbiology. 6:562. Postox, L. , Crisona, N. J., Peter, B. J., Hardy, C. D., Cozzarelli, N. R. (2001). Topological challenges to DNA replication: Conformations at the fork. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98(15):8219–8226. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. (2000). Molecular Cell Biology. 4th edition. Section 12.3. The Role of Topoisomerases in DNA Replication. W. H. Freeman. New York Richard, D. J., Bolderson, E., Khanna, K. K. (2009)Multiple human single-stranded DNA binding proteins function in genome maintenance: structural, biochemical and functional analysis. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 44 (2–3): 98–116. Mijakovic, I., Petranovi D. C. et al. (2006). Bacterial single-stranded DNA-binding proteins are phosphorylated on tyrosine. Nucl. Acids Res. 34 (5): 1588–1596 Griep, M. A. (1995). Primase structure and function. Indian. J. Biochem. Biophys. 32 (4): 171–8. Muzi-Falconi, M., Giannattasio, M., Foiani, M., Plevani, P. The DNA Polymerase _-Primase Complex: Multiple Functions and Interactions. ScientificWorldJournal. 3: 21–33. Kelch, B. A., Makino, D. L., O’Donnell, M., & Kuriyan, J. (2012). Clamp loader ATPases and the evolution of DNA replication machinery. BMC Biology.10: 34. Bruck I., O’Donnell M. (2001). The ring-type polymerase sliding clamp family. Genome Biology. 2(1):reviews3001.1-reviews3001.3. Stukenberg, P. T., Studwell-Vaughan, P. S., O'Donnell, M. (1991). Mechanism of the sliding beta-clamp of DNA polymerase III holoenzyme. J. Biol. Chem. 266 (17): 11328–34. Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L. 2002 Biochemistry. 5th edition. Section 27.2, DNA Polymerases Require a Template and a Primer. W H Freeman, New York Leman, A. R., Noguchi, E. (2013). The Replication Fork: Understanding the Eukaryotic Replication Machinery and the Challenges to Genome Duplication. Genes, 4 (1): 1–32. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. (2000). Molecular Cell Biology. 4th edition. Section 12.2. The DNA Replication Machinery. W. H. Freeman. New York. Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. (2009). Ribonuclease H: the enzymes in Eukaryotes. The FEBS Journal. 276(6): 1494–1505. Balakrishnan, L., Bambara, R. A . (2013). Okazaki Fragment Metabolism. 1:5 (2).