Splaissimine

Splaissimine ehk splaissing (ka splaising; inglise keeles splicing) on protsess, mille käigus lõigatakse rakutuumas asuvast pre-mRNA molekulist välja intronjärjestused ning allesjäänud eksonitele vastavad osad ühendatakse. Splaissingu tulemusena tekib küps mRNA, mis suundub edasi translatsiooni ehk valgusünteesi. Eukarüootsete intronite puhul katalüüsib splaissimisreaktsioone splaissosoom, kuid olemas on ka isesplaissuvaid introneid. Splaissosoom on väikeste tuuma ribonukleoproteiinide (inglise small nuclear ribonucleoprotein, snRNP) kompleks. Looduses esineb erinevaid RNA splaissimismeetodeid. Splaissimistüüp sõltub splaissitava introni struktuurist ja katalüsaatorist, mida on splaissimise läbiviimiseks vaja. Eukarüootide geenid sisaldavad introneid, mille otsad on sarnased kõikides organismides. Mida lihtsama ehitusega organism, seda harvemad on intronid. Intronid on eksonite vahepealsed osad. Eksonid on kodeerivad järjestused. Splaissimiseks on vaja introni doonorsaiti (introni 5’ otsas), hargnemiskohta (introni 3’ otsa lähedal) ning aktseptorsaiti (introni 3’ otsas). Doonorsaidis on peaaegu alati GU nukleotiidijärjestus koos suurema, vähem konserveerunud regiooniga. Aktseptorsaidis, introni 3’ otsas, on nukleotiidijärjestuseks AG. AG-st ülespoole liikudes (5’ otsa suunas) leiab pürimidiiniderikka (C ja U) regiooni ehk polüpürimidiintrakti. Sellest 5’ otsa pool on hargnemiskoht, mis sisaldab A nukleotiidi. Punktmutatsioonid selles DNA regioonis või tranksriptsioonivead aktiveerivad peidetud splaiss-saidi (inglise cryptic splice site, CSS) transkripti osas, mida tavaliselt ei splaissita. Selle tulemiks on küps mRNA, millel on eksonist osa puudu. Punktmutatsiooni puhul, mis tavaliselt mõjutab ainult ühte aminohapet, saab vale aminohappe valgust lõpuks kustutada. Splaissimist viib läbi splaissosoom, mis on suur RNA valgukompleks, koosnedes viiest väiksemast tuuma ribonukleoproteiinist ja umbes 150 valgust. snRNPde RNA komponendid interakteeruvad introniga ja osalevad niimoodi katalüüsis. Eristatakse kahte erinevat splaissosoomi varianti (üldine ja minoorne), mis sisaldavad erinevaid snRNPsid. Üldine Üldine splaissosoom lõikab välja intronid, millel on 5’ otsas GU ja 3’ otsas AG järjestused. Splaissosoom koosneb U1, U2, U4, U5 ja U6 snRNPdest ning on aktiivne rakutuumas. Lisaks on vajalikud teatud hulk valke, kaasa arvatud U2AF ja SF1, et splaissosoom seonduks. E kompleks – U1 seondub GU järjestusele introni 5’ otsas koos valkudega/ensüümidega ASF/SF2, U2AF (seondub Py-AG saidis) ja SF1/BBP (BBP=Branch Binding Protein); A kompleks – U2 seondub hargnemiskohale. Selle jaoks hüdrolüüsitakse ATPd; B1 kompleks – U5/U4/U6 trimeer seondub: U5 seob ennast eksoniga 5’ saidis ning U6 seondub U2ga. B2 kompleks – U1 vabastatakse, U5 liigub eksonilt intronile ning U6 seondub 5’ otsa splaiss-saidis. C1 kompleks – U4 vabastatakse, U6/U2 katalüüsib transesterifikatsioonireaktsiooni, mille käigus introni 5’ ots ligeerub A saiti intronil ja moodustab lasso-taolise struktuuri. U5 seondub eksoniga 3’ splaiss-saidis ning introni 5’ ots lahkneb, formeerudes lasso. C2 kompleks – U2/U5/U6 jääb tekkinud lasso külge seotuks, eksoni 3’ ots on vaba ning eksonid ligeeritakse ATP hüdrolüüsi arvelt. Splaissitud RNA vabastatakse ning lasso hargneb lahti. Sellist splaissimise tüüpi nimetatakse kanooniliseks splaissinguks või lasso rajaks, mis toimub 99% kordadest. Samas kui intronid ei järgi GU-AG reeglit, toimub mittekanooniline splaissimine (vaata alt "minoorne splaissosoom"). Minoorne Minoorne splaissosoom sarnaneb väga üldise splaissosoomiga, ainult et see splaissib haruldasi introneid, millel on splaiss-saitides teistsugused nukleotiidijärjestused. Kui U5 on nii üldisel kui minoorsel splaissosoomil sama, siis minoorsel on U1, U2, U4 ja U6 asemel erinevad, kuid funktsionaalselt analoogsed snRNPd, vastavalt U11, U12, U4atac ja U6atac. Nagu üldinegi, on minoorne splaissosoom leitav ainult rakutuumas. Trans-splaissimine Trans-splaissimine on splaissimise vorm, kus liidetakse kaks eksonit, mis ei ole samas RNA transkriptis. Isesplaissumine leiab aset vähestes intronites, mis moodustavad ribosüümi. Ribosüüm on võimeline katalüüsima splaissosoomile omaseid reaktsioone. On olemas kolm gruppi isesplaissuvaid introneid: grupp I, grupp II ja grupp III. Grupp I ja II intronid teostavad splaissimise sarnaselt splaissosoomiga, ilma et vajaks teisi valke. Selline sarnasus viitab sellele, et grupi I ja II intronid võivad olla evolutsiooniliselt suguluses splaissosoomiga. Isesplaissumine võib olla ka väga vana ning võis eksisteerida RNA maailmas enne vajalikke valke. Kuigi nimetatud kaks mehhanismi ei vaja toimumiseks teisi proteiine, on vaja siiski viit RNA molekuli ja üle 50 valgu, et kasutada ja hüdrolüüsida palju ATP molekule. Splaissimismehhanismid kasutavad ATP energiat, et mRNA splaissimine oleks täpne. Kui ATPd ei kasutataks, oleks protsess väga ebatäpne ja vigaderohke. Grupi I intronite splaissumist iseloomustavad kaks transesterifikatsioonireaktsiooni: Vaba guaniini nukleosiidi 3’OH rühm või nukleotiidi kofaktor (GMP, GDP, GTP) ründab 5’ splaiss-saidis fosfaatrühma. 3’OH rühm 5’ eksonis muutub nukleofiiliks ning teise transesterifikatsiooni lõpuks liidetakse kaks eksonit. Mehhanism, kus grupp II intronid splaissuvad (kaks transesterifikatsioonireaktsiooni, nagu grupp I) on sellised: Spetsiifilise adenosiini 2’OH rühm intronis ründab 5’ splaiss-saiti, moodustades lasso. 5’ eksoni 3’OH päästab valla teise transesterifikatsiooni 3’ splaiss-saidis ning eksonid liidetakse omavahel. tRNA splaissimine on järjekordne haruldane splaissimisvorm, mis tavaliselt toimub tRNAs. Splaissimisreaktsioonides on splaissosoomist ja isesplaissuvast rajast erinev biokeemia. Ribonukleaasid vabastavad RNA ning ligaasid ühendavad eksonid. Splaissimine toimub kõigis elu domeenides ja riikides, kuid splaissimise ulatus ja tüübid on väga erinevad. Eukarüoodid splaissivad palju valku kodeerivaid mRNAsid ning mõnesid mittekodeerivaid RNAsid. Prokarüoodid splaissivad harva ning enamjaolt mittekodeerivaid järjestusi. Teine tähtis erinevus kahe rühma vahel on see, et prokarüootidel puudub splaissosoomne rada. Kuna splaissosoomsed intronid pole kõigis liikides konserveerunud, on tekkinud debatt teemal, millal splaissosoomne splaissing evolutsioneerus. Pakutakse nii varajast (inglise intron-early model) kui ka hilist introni mudelit (inglise intron-late model). Splaissosoomne ja isesplaissumine koosneb kahe-astmelisest biokeemilisest protsessist. Mõlemaks astmeks on transesterifikatsioonireaktsioon, mis toimub RNA nukleotiidide vahel. tRNA splaissimine on erand ega vaja transesterifikatsiooni. Esiteks teostab introni hargnemispunkti nukleotiidi 2’OH rühm nukleofiilse rünnaku introni 5’ splaiss-saidis asuvale esimesele nukleotiidile, moodustades lassokujulise vaheühendi. Teiseks ründab vabaks jäänud 5’ eksoni 3’OH omakorda introni 3’ splaiss-saidi viimast nukleotiidi, ühendades eksonid ja vabastades introni. Splaissimisprotsess võib mitmetes olukordades luua unikaalseid valke, varieerides eksonite kompositsiooni samas mRNAs. Sellist fenomeni kutsutakse alternatiivseks splaissimiseks. Alternatiivne splaissimine võib toimuda mitmel viisil. Eksoneid võib nii pikendada kui ka vahele jätta või introneid alles jätta. Splaissimissündmusi saab eksperimentaalselt mõjutada, kui seondada snRNPde seondumissaitidesse, hargnemispunkti nukleotiidi külge või regulatoorsetesse saitidesse steerilisi-blokeerivaid antisense oligonukleotiide (inglise steric-blocking antisense oligos), nagu morfoliine või peptidonukleiinhappeid (PNA). Tüüpilised vead: Mutatsioon splaiss-saidis, mille tulemusena kaob saidi funktsioon. Võib tekkida enneaegne stoppkoodon, kaduda ekson või sisse jääda intron. Mutatsioon splaiss-saidi redutseerimise spetsiifilisuses. Tulemusena võib varieeruda splaissimise koht, põhjustades aminohapete sisestusi või deletsioone, kõige tõenäolisemalt aga lugemisraami nihet. Splaiss-saidi vale asetus, mis viib suurema osa RNA sisse või välja jätmisele, kui algselt oodatud. Põhjustab pikemaid või lühemaid eksoneid. Paljud splaissimisvead kontrollib üle rakusisene kvaliteedikontrolli mehhanism, mida nimetatakse nonsense mediated mRNA decay (NMD). Lisaks RNAle läbivad ka valgud splaissimise. Kuigi biomolekulaarsed mehhanismid on erinevad, on printsiip siiski sama: inteiinid, intronite asemel, eemaldatakse. Alles jäänud osad, mida nimetatakse eksteiinideks, liidetakse omavahel. Valgu splaissimist on vaadeldud paljudel organismidel, kaasa arvatud bakteritel, arhedel, taimedel, pärmidel ja inimestel. Clancy, Suzanne (2008). "RNA Splicing: Introns, Exons and Spliceosome". Nature Education. 1 (1). Vaadatud 31. märtsil 2011. Black, Douglas L. (2003). "Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing". Annual Reviews of Biochemistry. 72 (1): 291–336. DOI:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161720. ISSN 0066-4154. PMID 12626338. Matlin, AJ; Clark F, Smith, CWJ (mai 2005). "Understanding alternative splicing: towards a cellular code". Nature Reviews. 6 (5): 386–398. DOI:10.1038/nrm1645. PMID 15956978.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Ng B, Yang F, Huston DP; et al. (detsember 2004). "Increased noncanonical splicing of autoantigen transcripts provides the structural basis for expression of untolerized epitopes". Journal of Allergy and Clinical Immunology. 114 (6): 1463–70. DOI:10.1016/j.jaci.2004.09.006. PMID 15577853. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Patel AA, Steitz JA (2003). "Splicing double: insights from the second spliceosome". Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (12): 960–70. DOI:10.1038/nrm1259. PMID 14685174. Friend K, Kolev NG, Shu MD, Steitz JA (2008). "Minor-class splicing occurs in the nucleus of the Xenopus oocyte". RNA. 14 (8): 1459–62. DOI:10.1261/rna.1119708. PMC 2491479. PMID 18567814.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Di Segni G, Gastaldi S, Tocchini-Valentini GP (mai 2008). "Cis- and trans-splicing of mRNAs mediated by tRNA sequences in eukaryotic cells". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19): 6864–9. DOI:10.1073/pnas.0800420105. PMC 2383978. PMID 18458335.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Draper BW, Morcos PA, Kimmel CB (2001). "Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown". Genesis. 30 (3): 154–6. DOI:10.1002/gene.1053. PMID 11477696.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Sazani P, Kang SH, Maier MA; et al. (1. oktoober 2001). "Nuclear antisense effects of neutral, anionic and cationic oligonucleotide analogs". Nucleic Acids Res. 29 (19): 3965–74. DOI:10.1093/nar/29.19.3965. PMC 60237. PMID 11574678. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Morcos, PA (2007). "Achieving targeted and quantifiable alteration of mRNA splicing with Morpholino oligos". Biochem. Biophys. Res. Commun. 358 (2): 521–7. DOI:10.1016/j.bbrc.2007.04.172. PMID 17493584. Bruno IG, Jin W, Cote GJ (15. oktoober 2004). "Correction of aberrant FGFR1 alternative RNA splicing through targeting of intronic regulatory elements". Hum. Mol. Genet. 13 (20): 2409–20. DOI:10.1093/hmg/ddh272. PMID 15333583.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)(Epub August 27, 2004) Danckwardt S, Neu-Yilik G, Thermann R, Frede U, Hentze MW, Kulozik AE (2002). "Abnormally spliced beta-globin mRNAs: a single point mutation generates transcripts sensitive and insensitive to nonsense-mediated mRNA decay". Blood. 99 (5): 1811–6. DOI:10.1182/blood.V99.5.1811. PMID 11861299.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Ken-ichi Hanada, James C. Yang (2005). "Increased Novel biochemistry: post-translational protein splicing and other lessons from the school of antigen processing" (PDF). J Mol Med. 83 (6): 420–428. DOI:10.1007/s00109-005-0652-6. PMID 15759099.[alaline kõdulink]