Tsellulaas

Tsellulaasid (EC 3.2.1.4) on grupp ensüüme, mis katalüüsivad tselluloosi hüdrolüüsi. Peamised tsellulaaside produtseerijad looduses on mikroseened. Lisaks toodavad tsellulaase ka mõned bakterid ja algloomad (nt Epidinium ecauda). Mikroobid toodavad tsellulaase, et lagundada tselluloosi neile omastatavateks suhkruteks, peamiselt glükoosiks. Kuna tselluloosi (mis tavaolekus vees ei lagune) hüdrolüüs looduses on võimalik ainult rea erineva toimemehhanismi ja substraadispetsiifikaga ensüümide koosmõjul, siis mõistetakse nimetuse "tsellulaas" all kogu tsellulolüütilist süsteemi. Tsellulolüütiline süsteem hõlmab lisaks "tõelistele" tsellulaasidele ka hemitsellulaase ja pektinaase, aga ka madalmolekulaarsetel substraatidel aktiivseid ensüüme (nt β-glükosidaas). (See on tingitud asjaolust, et tselluloosi molekulid on tihedalt seotud hemitselluloosi ja ligniini molekulidega ja ensüümid-tsellulaasid ei pääseks ilma hemitsellulaasideta ja teiste abistavate molekulideta tselluloosi molekulide ligi.) Üks kõige enam uuritud tsellulaaside produtseerija on filamentne pehmemädanikseen Trichoderma reesei, kes tänu kõrgele tsellulaaside produktsioonile on peamine tsellulaaside tööstuslikul tootmisel kasutav mikroorganism. Tsellulaasid kuuluvad glükosüülhüdrolaaside hulka ja katalüüsivad β-1,4-glükosiidse sideme hüdrolüüsi tselluloosiahelas. Tselluloosiahel lagundatakse hüdrolüüsi käigus lahustuvateks tsellooligosahhariidideks, peamiselt tsellobioosiks. (Tsellobioos on disahhariid ja koosneb kahest glükoosimolekulist, mis on ühenduses keemilise sidemega hapniku aatomi kaudu.) Tsellulaasid jagatakse kahe mehhanismi järgi konfiguratsiooni retentsiooniga või inversiooniga töötavateks ensüümideks. Glükosiidse sideme hüdrolüüsi katalüüsivad kaks glükosüülhüdrolaaside aktiivtsentris paiknevat aminohappe jääki, millest esimene käitub vastavalt retentsioonile kui happekatalüsaator ja protoneerib ehk annab prootoni glükosiidsele hapnikule, teine käitub aga kas nukleofiilina ja ründab C1 poolatsetaalset süsinikku või üldise aluskatalüsaatorina ja deprotoneerib nukleofiilse vee molekuli. Retentsiooni korral, kui nukleofiiliks on teine katalüütiliselt aktiivne aminohape, toimub glükosiidse sideme hüdrolüüs ensüüm-glükosüül-vaheühendi kaudu, mis teises etapis hüdrolüüsitakse vee molekuli poolt. Sel juhul säilitab C1 süsinikuga seotud β-OH rühm oma algse β-asendi. Inversiooni puhul on nukleofiiliks vee molekul ja toimub sideme hüdrolüüs ühes etapis ja C1-süsinikuga seotud OH-rühm läheb β-asendist α-asendisse. Tsellulaasid jagatakse sarnaselt teiste polümeersel substraadil töötavate ensüümidega neile iseloomuliku toimemehhanismi järgi peamiselt ekso- ja endoensüümideks: eksotsellulaasid (EC 3.2.1.91) (tsellobiohüdrolaasid) alustavad tselluloosi hüdrolüüsi tselluloosiahela otsast. Tsellobiohüdrolaaside peamine hüdrolüüsiprodukt on tsellobioos. Tsellobiohüdrolaasidele on omane protsessiivsus, mis võimaldab ensüümil teha mitu katalüüsiakti järjest. Protsessiivsuse kaudu väljendatakse katalüüsiaktide arvu, mida ensüüm sooritab enne tselluloosilt lahkumist. Tsellobiohüdrolaasidele toimemehhanismi peegeldab ka nende ensüümide pikk tunnelikujuline aktiivtsenter; endotsellulaasid (EC 3.2.1.4) katalüüsivad tselluloosiahela hüdrolüüsi juhuslikust positsioonist ahelas, vähendades substraadi polümerisatsiooni astet ning tekitades juurde redutseerivaid otsi. Endotsellulaaside aktiivtsenter on tsellobiohüdrolaasidega võrreldes lühem ja avatud. See avatud aktiivtsenter võimaldab ensüümil erinevalt eksotsellulaasidest tselluloosi molekulile läheneda suvaliselt positsioonilt ja seal siis hüdrolüüsi katalüüsida. Reaktsioonis tekivad erineva pikkusega oligosahhariidid; β-glükosidaasid (tsellobiaas) (EC 3.2.1.21) katalüüsivad tsellobiohüdrolaaside ja endotsellulaaside poolt vabastatud lahustuvate tsellooligosahhariidide ja tsellobioosi hüdrolüüsi glükoosiks. oksüdatiivsed tsellulaasid klassifitseeritakse erinevalt ülejäänud tsellulaasidest abi-aktiivsusega (Auxiliary activities) ensüümide hulka. Avastati algselt seoses kitiini lagundamisega, kuid hilisemal uurimisel selgus, et lagundavad ka tselluloosi. Need ensüümid teevad katkeid kristallilise tselluloosi ahelatesse oksüdatiivset mehhanismi kasutades ning vajavad divalentsete metalliioonide kui ka välise elektroni doonori osalust. Tsellulolüütilised ensüümid võivad olla komplekseerunud, moodustades multiensüümkompleksi – tsellulosoomi, või mittekomplekseerunud. Mittekomplekseerunud tsellulaasid vabastatakse mikroorganismide poolt iseseisvalt rakuvälisesse keskkonda, tsellulosoomid eksisteerivad aga vaid raku välispinnaga seotult. Tsellulosoomid võivad sisaldada lisaks tsellulaasidele ka erinevaid hemitsellulaase. Erinevalt mittekomplekseerunud ensüümidest, mis on iseloomulikud mikroseentele ja aeroobsetele bakteritele, on tsellulosoomid omased anaeroobsetele bakteritele (nt Clostridium thermocellum). Mittekomplekseerunud tsellulaasid koosnevad valdavalt kahest domeenist: suuremast katalüütilisest domeenist ja väiksemast tselluloosile seondumise domeenist. Katalüütilises domeenis paiknevas ensüümi aktiivtsentris toimub glükosiidse sideme hüdrolüüs. Tselluloosile seondumise domeeni peamine teadaolev ülesanne on ensüümi kinnitamine tselluloosi pinnale. Nimetatud kaks domeeni on omavahel ühendatud peptiidse linkeriga, mis on tugevalt 0-glükosüleeritud. Lisaks sellele, et linker ühendab kahte domeeni omavahel, on näidatud ka linkeri seondumist tselluloosiga, mistõttu oletatakse, et linker võib osaleda otseselt ka tselluloosi lagundamise protsessis. Mikroobide toodetavad tsellulaasid leiavad laialdast rakendust tööstuses, peamiselt tselluloosi lagundamise eesmärgil. Tänu üleekspressioonile on märgatavalt suurendatud mikroorganismide poolset tsellulaaside tootlikkust, mistõttu on odavnenud ka tsellulaaside kasutamine. Järgnevalt on toodud peamised valdkonnad, kus tsellulaase kasutatakse. Tsellulaasidega töötlemist kasutatakse paberitööstuses kombineerituna mehaanilise töötlusega. Viimasega võrreldes võimaldab biomehaaniline töötlus saada parema kvaliteediga paberit ning säästa energiat kuni 40%. Tselluloosi "peenestamine" tsellulaaside abil võimaldab saada peenekoelisemat ja elastsemat paberit ning tagab ka paberi parema võime pleegituda. Lisaks kasutatakse tsellulaase koos hemitsellulaasidega ka vanapaberi ümbertöötamisel trükivärvi eemaldamise etapis. Sel viisil trükivärvi eemaldamine võimaldab kemikaalidega töötlusega võrreldes nii vältida paberi kolletumist kui ka vähendada ka kemikaalide kasutamisega kaasnevaid keskkonnariske. Tsellulaase kasutatakse tekstiili märgtöötlusel, eeskätt tselluloosi sisaldavate materjalide viimistlemisel. Tavapärane teksade kivipesu hõlmab esmalt tärklise katte eemaldamist amülaasidega töödeldes, misjärel kulutatakse riiet masinpesul koos pimsskiviga. Traditsioonilisel viisil töötlemise käigus jäävad riide külge hõõrdumise käigus tekkinud väikesed kiud, mis muudavad riide pärast pesu topiliseks. Alternatiivina traditsioonilisele kivipesule kasutatakse aga tsellulaaside vahendatud "kivipesu", mis kahjustab teksariiet vähem. Tsellulaasid lagundavad puuvillase teksariide ja ka muu tselluloosi sisaldava tekstiili pinnakihilt riidekiu otsi, mistõttu värvaine eemaldub osaliselt. Tsellulaasidega töödeldud riie on pehmem, siledam, värv säilib kirkam ning tänu väiksemale energia- ja veekulule on töötlus ka keskkonnasõbralikum. Tsellulaaside üheks perspektiivsemaks kasutusvaldkonnaks tulevikus on nende rakendamine teise generatsiooni bioetanooli tootmisel. See on ka hetkel enim uuritud tsellulaaside kasutusvaldkond. Teise generatsiooni bioetanooli tootmise toorainena kasutatakse peamiselt põllumajanduse-, puidu- ja metsatööstuse jääke. Tsellulaase koos hemitsellulaasidega on võimalik kasutada taimse biomassi suhkrustamise etapis alternatiivina happelisele hüdrolüüsile. Erinevalt happelisest hüdrolüüsist kasutatakse ensümaatilise hüdrolüüsi korral "pehmemaid" reaktsioonitingimusi, mistõttu ei teki järgnevaid etappe pärssivaid kõrvalühendeid ning samuti on ensümaatiline hüdrolüüs võrreldes happehüdrolüüsiga kordades keskkonnasõbralikum. Biomassi efektiivsema hüdrolüüsi nimel toimub tänapäeval intensiivne tsellulaasisegude parendamine. Eesmärgiks on muuta teise generatsiooni bioetanool fossiilsete mootorikütustega konkurentsivõimeliseks. Tsellulaase kasutatakse puu- ja juurviljamahlade, aga ka veini ja õlle tootmisel. Tsellulaaside kasutamisel koos hemitsellulaaside ja pektinaasidega on võimalik nii suurendada toorainest kättesaadava mahla kogust kui ka tõsta jookide kvaliteeti. Ensüümide kasutamine mahlatootmisel võimaldab parandada mahla värvi, aroomi, maitset ja läbipaistvust ning pikendab säilivust. Lisaks kasutatakse samade klasside ensüüme mis mahla tootmisel ka kõrge kvaliteediga oliiviõli tootmisel. Tööstuslikult toodetud ensüümisegude kasutamine võimaldab suurendada oliividest saadava õli hulka ning antioksüdantide ja E-vitamiini sisaldust, lisaks parandada oliiviõli aroomi ja maitset ning pidurdada rääsumist. Tsellulaase kasutatakse ka toiduvärvide – karotenoidide – tootmisel. Karotenoidid on looduses laialt levinud värvipigmendid, mis annavad taimedele punase, oranži ja kollase värvi. Tänu looduslikule päritolule, mittetoksilisusele, laiale värvispektrile ja nii vesi- kui ka rasvlahustuvatele pigmentidele on karotenoidid toiduainetööstuses hinnatud värvained. Tsellulaase ja pektinaase kasutatakse karotenoide sisaldavate viljade (näiteks apelsinikoor, bataat, porgand) rakukestade lagundamiseks, misjärel vabanevad karotenoidid neile omaselt kompleksis valkudega. Selline seotud kompleks kaitseb pigmente oksüdeerumast, mistõttu looduslik värv säilib paremini. Samuti ei sadestu mittevesilahustuvad pigmendid välja, kuna on vees lahustuvate valkudega kompleksis. Silo ja kuivsööda töötlemine tsellulaaside, hemitsellulaaside ja pektinaasidega suurendab loomasööda toiteväärtust ja seeditavust. Tsellulaasidega on võimalik lagundada söödas sisalduvaid mitteseeditavaid ühendeid lihtmaoga loomadele kergesti seeditavateks. Näiteks on näidatud, et söödas leidub loomadele mitteseeditavaid tärkliserikkad ühendeid, mis on toiduks jämesoole patogeenidele. Selliste ühendite lagundamine võimaldab ennetada jämesoole patogeenide kasvu ja nende põhjustatud seedetrakti haigusi, samuti suurendada loomasööda toiteväärtust. Tsellulaaside, hemitsellulaase ja pektinaase kasutatakse põllumajanduses viljasaagi suurendamiseks. Mõnede mikroseente tsellulaasidel (β-glükanaas) on omadus lagundada taimepatogeenide rakumembraane. Tsellulaasidel on omadus parandada mulla kvaliteeti ja vähendada taimede sõltuvust mineraalväetistest. Eksogeense tselluloosi lisamine võib kiirendada mullas oleva tselluloosi lagunemist, seega võib eksogeensete tsellulooside kasutamine tõhustada põhu lagunemist ja suurendada sellega mulla viljakust. Tsellulaaside lisamisega pesupulbritele saab suurendada tselluloosikiude sisaldavate kangaste värvi erksust, koevust ja mustuse eemaldumist. Aluselised tsellulaasid, lisatuna pesupulbrile, seostuvad selektiivselt tsellulloosikiududega ning aitavad koostöös traditsiooniliste ensüümidega (proteaasid, lipaasid) tselluloosikiudude vahelt mustust eemaldada. Lisaks, lagundades tselluloosikiududest kulumise/kulutamise tagajärjel välja ulatuvaid tselluloosiahelaid, väheneb tsellulaaside toimel riide topilisus ja suureneb värvierksus. Martinez, D., Berka, R. M., Henrissat, B., Saloheimo, M., Arvas, M., Baker, S. E., Chapman, J., Chertkov, O., Coutinho, P. M., Cullen, D., Danchin, E. G. J., Grigoriev, I. V., Harris, P., Jackson, M.,. Kubicek, C. P, et al. (2008). Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecorina) (vol 26, pg 553, 2008). Nat. Biotechnol. 26(10): 1193–1193. Davies G., Henrissat B. (1995) "Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases" Structure. 3, 853–859 Lynd L. R., Weimer P. J., van Zyl W. H., Pretorius I. S. (2002) "Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology" Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol. 66 Kurašin M., Väljamäe P.(2010) ,,Processivity of Cellobiohydrolases Is Limited by the Substrate" Journal of Biological Chemistry vol. 286, 169–177 Horn S.J., Vaaje-Kolstad G., Westenberg B., Eijsink V. GH. (2012) ,,Novel Enzymes for The Degradation of Cellulose" Horn et al. Biotechnology for biofules, 5:45 Samejima M., Sugiyama J., Igarashi K., Eriksson K.-E. L. (1997) "Enzymatic hydrolysis of bacterial cellulose" Carbohydr. Res. 305 AFMB CNRS Université d'Aix-Marseille"Auxiliary Activities family classification" 31.10.13 http://www.cazy.org/Auxiliary-Activities.html Horn S.J., Vaaje-Kolstad G.,Westereng B., Eijsink V. GH. (2012) ,,Novel enzymes for the degradation of cellulose" Horn et al. Biotechnology for Biofuels 2012 5:45 Bayer E. A., Belaich J.-P., Shoham Y., Lamed R. (2004) "The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides" Annu. Rev. Microbiol. 58, 521–554 Himmel M. E. Ding S.-Y., Johnson D. K., Adney W. S., Nimlos M. R., Brady J. W., Foust T. D. (2007) "Biomass Recalcitrance: Engineering Plants and Enzymes for Biofuels Production" Science 315, 804–807 Zverlov V. V. (2005) ,,A major new component in the cellulosome of Clostridium thermocellum is a processive endo-β-1,4-glucanase producing cellotetraose" FEMS Microbiology Letters 2, 353–358 Carrard, G., Koivula, A., Soderlund, H. and Beguin, P. (2000). Cellulose-binding domains promote hydrolysis of different sites on crystalline cellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(19): 10342-10347. Kuhad R.C., Gupta R., Singh A. (2011) "Microbial Cellulases and Their Industrial Applications" Enzyme research, vol. 2011: 280696 "Eesti Vabariigi preemiad", Eesti Teaduste Akadeemia Kirjastus 2022, (lk 110-129 Priit Väljamäe uurimistöö "Tõrksate polüsahhariidide ensümaatilisest lagundamisest" kohta; ISSN 1406-2321 (trükiväljaanne), ISSN 2674-3019 (võrguväljaanne). [1]