Hiina hamstri munasarjarakud

Hiina hamstri munasarjarakke (edaspidi CHO) kasutatakse mudelorganismidena bioloogilistes ja meditsiinilistes uuringutes. CHO rakud on enim kasutatavad imetajarakud, milles toodetakse terapeutilisi valke suures mahus. Nende rakkude abil on välja töötatud ja toodetud palju ravimeid, sealhulgas näiteks vähi ja viljatuse raviks. Neid rakke eelistatakse teistele rakuliinidele seetõttu, et neil on võime toota õige konfiguratsiooniga rekombinantseid valke ning valke post-translatsioonil modifitseerida (näiteks glükosüleerides), mis on vajalik valgu töövõime ja stabiilsuse tagamiseks. Samuti on produkti saagis suur, kuni 10 g liitri kultuuri kohta. Hiina hamstreid (Cricetulus griseus) kasutati teadaolevalt esimest korda katseloomadena 1919. aastal, et uurida pneumokokke. 20. sajandi keskpaigaks olid Hiina hamstrid laboritingimustes n-ö kodustatud ning dr George Yerganian jt märkasid, et sugulusaretuse tulemusel tekkis palju pärilikke haigusi. See nähtus tekitas huvi hamstrite geneetika vastu. Leiti, et Hiina hamstritel on vähe kromosoome (2n = 22), mis muutis nad kasulikeks mudelorganismideks tsütogeneetika ja koekultuuride uurimiseks. Dr Theodore T. Puck tegeles somaatiliste rakkude geneetikaga. 1957. aastal isoleeris ta emasest Hiina hamstrist 0,1 g munasarjarakke ja külvas need söötmeplaadile. Peagi selgus, et rakud suutsid kasvada kunstlikes tingimustes suhteliselt kiire generatsiooniajaga. Sellest ajast peale on CHO rakud kogunud populaarsust ning nende rakkudega on tehtud uurimistöid näiteks metabolismi ja rakutsükli kohta ning biomeditsiinis, toksikoloogias. Alles hiljuti on hakatud neid rakke kasutama kui tööstuslikke reaktoreid. Pärast esimeste CHO rakkude isoleerimist on rakud võetud kasutusele üle maailma. Neist on aretatud rohkesti liine, neist omakorda uusi alamliine. Tänapäevaks on nii palju eri CHO rakuliine, et natiivse Hiina hamstri DNAga võrreldes on uutes rakuliinides üle 3,7 miljoni punktmutatsiooni, 551 240 indelit (sisestust või deletsiooni) ja 7063 koopiaarvu variatsiooni. Eri CHO rakkude alamliinide genoomid ja fenotüübid varieeruvad, kuid peamised iseloomulikud jooned on siiski säilinud. Järgmisena on iseloomustatud enim kasutatavaid CHO rakuliine. Dr T. T. Pucki isoleeritud CHO originaalrakkudest aretati 1960ndate lõpul nende alamkloon CHO-K1. Uus rakuliin leidis laialdast kasutust kogu maailmas. Tänapäeval on CKO-K1 rakud eelistatud unikaalse glutamiin süntetaasi (GS) geeniülekande süsteemi pärast. GS sünteesib glutamiini, mis on imetajarakkudele eluks vajalik. Kui lisada rakkudele GSi inhibiitorit metioniin sulfoksimiini, siis surevad kõik rakud peale nende, millesse on sisse viidud plasmiidid, kus on sees GSi geen ning sihtmärk võõrgeen. Nii jäävad ellu vaid soovitud mutatsiooniga rakud. CHO-DXB11 rakuliin oli esimene rakuliin, mida kasutati sadade kilogrammide koe plasminogeeni aktivaatori (tissue plasminogen activator, TPA) tootmiseks. CHO-DXB11 (või DUK-XB11) rakuliini lõi 1980. aastatel dr Chasin. Rakuliini eesmärk oli dihüdrofolaat reduktaasi (DHFR) deletsioon. Selleks kustutati rakkudes ära üks DHFRi lookus ja teises DHFRi lookuses missenssmutatsioon (T137R). DHFR reguleerib tetrahüdrofolaate, mis on vajalikud puriinide ja tümidülaatide sünteesiks. Nendeta on raku elutegevus väga häiritud. Selleks, et rakk jääks DHFRi puudumisel ellu, on tal vaja saada keskkonnast glütsiini, aminohappeid ja tümidiini. Rakuliini edasiarenduseks pandi töökorras DHFRi geen ühte plasmiidi ja huvipakkuv geen teise plasmiidi. Kaks plasmiidi sisestati rakku korraga ehk transfekteeriti CHO-DXB11 rakkudesse ning rakk hakkas tootma mõlemaid rekombinantsed valke (nii DHFRi kui ka huvipakkuva geeni produkt). Tavaline, ilma kahe plasmiidita rakk vajab elamiseks glütsiini, aminohappeid ja tümidiini, aga kui transfektsioon on tehtud, siis rakud, kuhu kaks plasmiidi sisenesid, ei vaja enam neid kolme ühendit. Rakud pannakse kasvama glütsiini-, aminohapete- ja tümidiinivaesesse keskkonda, kus jäävad ellu ainult DHFRi plasmiidi sisaldavad valgud, mutandid, sest siis suudab valk ise tümidiine sünteesida. Sellise süsteemiga saab vaadata, missugustesse rakkudesse on soovitud DNA sisenenud ja millistesse mitte. DG44 rakud loodi 1976. aastal. See rakuliin võimaldas kustutada mõlema DHFRi geeni lookust. Kahe lookuse deleteerimine hoidis ära DHFRi n-ö lekkimise võimaluse, mis parandas transfekteerunud rakkude selekteerimist. Kahe DHFR-negatiivse rakuliini kasutamisega võeti peagi kasutusele DHFRi antagonist ehk vastandtoimeaine metotrekstaat. Metotrekstaati kontsentratsiooni järkjärguline suurendamine surus alla DHFRi valgu toime ühes plasmiidis ning võimaldas teisel plasmiidil oleva huvipakkuva geeni aktiivsemat ekspressiooni. See rakuliin aretati CHO-Toronto (teatakse ka kui CHO pro-5) rakkudest, mis oli CHO-K1 sõsarrakuliin. Erinevalt CHO-K1 rakkudest on CHO-Si rakud võimelised elama suspensioonis ehk vedelas söötmes ning taluvad rotatsiooni, mida kasutatakse söötme hapnikuga rikastamiseks. Dr R. A. Tobey laboratoorium andis rakuliini edasi suurfirmale ning seda hakati nime CHO-S all müüma alates 2002. aastast. Vedelkultuuris kasvatamine pani aluse CHO rakkude kasvatamisele suurtes segamistankides (10 000 l), tänu millele on võimalik kiiresti toota erinevaid terapeutilisi peptiide. Terapeutilisi valke toodetakse bioloogilise aktiivsuse tagamiseks imetajate rakkudes. Tavalised laborites kasutatavad bakterid, nagu näiteks Escherichia coli, ei suuda sünteesida valgule vajalikke glükovorme ega tagada korrektset voltumist. Imetajarakkude valik terapeutiliste valkude tootmiseks on mitmekesine. Näriliste või inimrakkudest on valgu ekspressiooniks levinuimad rakuliinid 3T3, CHO, BHK, HeLa ja HepG2. 2012. aasta seisuga oli ligi 70% terapeutilistest valkudest toodetud CHO rakkudes, mille saaduste läbimüük oli ligi 30 miljardit USA dollarit aastas. CHO rakkudes on toodetud bioloogilisi ravimeid viljatuse, hemofiilia A ja B, vähi, Pompe'i tõve mukopolüsahharidoosi I ja VI, astma, aneemia, ägeda müokardiinfarkti ja muude haiguste vastu. Peamised seda tüüpi ravimite tootjad on Amgen, Genzyme, Sereno ja Genentech. Jayapal KP, Wlaschin KF, Hu WS, Yap MG (2007) Recombinant protein therapeutics from CHO cells—20 years and counting. Chem Eng Prog 103:40–47 Kim L. Y., Kim Y.G. Lee G. M. (2012). CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl. Microbiol Biotechnol, 93:917–930. Lewis NE, Liu X, Li Y et al (2013) Genomic landscape of chinese hamster ovary cell lines as revealed by the Cricetulus griseus draft genome. Nature biotechnology: online publication. Wurm M. 2013. Quasispiecises-implications for manufacturing processes. Processes, 1, 296–311. Lonza Biologics plc. (2007) GS gene expression system. [PDF] https://web.archive.org/web/20130622020746/http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_Brochures_The_GS_Gene_Expression_System.pdf (09.05.2014). Urlaub, G.; Chasin, L.A. (1980) Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Lacking Dihydrofolate Reductase Activity. Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216–4220. Scahill, S.J.; Devos, R.; Van der Heyden, J.; Fires, W. (1983) Expression and characterization of the product of a human immune interferon cDNA gene in Chinese Hamster Ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci, 80, 4654–4658. Walsh G. 2010. Biopharmaceutical benchmarks 2010. Nature America 28 (9): 917–924. American Type Culture Collection Chinese Hamster Genome databse CHO cells Transfection and Selection Data