Geneetiliselt muundatud hiir

Geneetiliselt muundatud hiir ehk transgeenne hiir on koduhiir, kelle genoomi on muudetud, kasutades geenitehnoloogiat. Geneetiliselt muundatud hiired on laialdaselt kasutuses teadustöö jaoks ning tihti ka loommudelina inimhaiguste jaoks. Hiire tugevaim eelis võrreldes teiste mudelorganismidega, nagu varbussid (Caenorhabditis elegans) ja äädikakärbsed (Drosophila melanogaster), on see, et selline imetajamudel on suuresti võrreldav inimese elundkondade, kudede, füsioloogilise süsteemi ja isegi käitumuslike tunnustega. Peale selle kannab hiir peaaegu kõiki geene, mis on olemas ka inimesel. Ta annab võimaluse mõista genotüübi-fenotüübi suhet, mis on oluline, et eristada inimestel esinevate geenide bioloogilisi rolle. Võrreldes teiste imetajatega, nagu rott, jänes ja siga, on hiire eeliseks sadade geneetiliselt homogeensete tüvede saadavus ning paremad võimalused modifitseerida sugurakkude liini geene. Need eelised tulenevad sellest, et hiiri on kerge aretada ja neid on võimalik kasvatada suurtes hulkades, mis teeb nende ülalpidamise taskukohaseks. 1974. aastal lõi Rudolf Jaenisch esimese geneetiliselt muundatud looma, sisestades DNA viiruse varajases arengujärgus hiire embrüosse, näitamaks, et sisestatud geenid olid kõikides rakkudes olemas. Sellegipoolest ei andnud hiired transgeeni edasi oma järglastele ning selle eksperimendi mõju ja rakendatavus olid järelikult piiratud. 1981. aastal süstiti puhastatud DNA hiire embrüosse, kasutades ära 1960ndatel ja 1970ndatel Brinsteri arendatud tehnikaid, näitamaks geneetilise materjali edastamist edasistele generatsioonidele. Seda tehnikat rakendasid Frank Ruddle Yale’ist, Frank Constantini ja Elizabeth Lazy Oxfordist, Ralph Brinster ja Richard Palmiter koostöös Pennsylvania Ülikooli ja Washingtoni Ülikooliga. Palmiter ja Brinster arendasid ja juhtisid 1980ndate alguses transgeneesi valdkonda, mis täiustas algelise modifikatsiooni meetodeid ja kasutas tehnikaid selgitamaks geenide aktiivsust ja funktsiooni viisil, mis polnud võimalik enne nende unikaalset lähenemist. Geneetiliselt muundatud hiirte saamiseks on olemas kaks peamist tehnilist lähenemist. Esimeseks viisiks on DNA süstimine pronukleusse. See meetod põhineb lineaarse DNA sisseviimisel viljastatud munarakkude kromosoomidesse. Võõr-DNA peab integreeruma genoomi enne geneetilise materjali kahekordistumist, mis eelneb esimesele lõigustumisele. See on vajalik selleks, et sündinud loomal oleks igas rakus koopiat uuest geneetilisest informatsioonist. Emas- ja isasloomade pronukleused on individuaalselt vaadeldavad tavalise valgusmikroskoobi all mitu tundi pärast seemneraku sisenemist munarakku. Nad ei ole sel hetkel veel kokku sulandunud sügoodiks. Võõr-DNA võib olla sisestatud mõlemasse pronukleusse, kuigi tavaliselt süstitakse nukleiinhape isaslooma pronukleusse, kuna see on natuke suurem ja ootsüüdi pinnale lähemal. Neid embrüoid kantakse järjestikuselt üle retsepientlooma emakasse. See meetod loob transgeense hiire ja seda kasutatakse uue geneetilise informatsiooni sisestamiseks hiire genoomi või endogeensete geenide üleekspresseerimiseks. Teiseks viisiks, mille rajasid Oliver Smithies ja Mario Capecchi, on embrüonaalsete tüvirakkude modifitseerimine DNA konstruktiga, mis sisaldab märklaudgeeniga homoloogset DNA järjestust. Embrüonaalsed tüvirakud on pärit blastotsüstide (varajane embrüo) sisemiste rakkude massist. Need rakud on pluripotentsed, mis tähendab, et nad saavad areneda peaaegu igasugusteks koetüüpideks. Embrüonaalseid tüvirakke kasutatakse täpsemaks hiire genoomi modifitseerimiseks. See tehnika võimaldab sisestada, eemaldada või muuta DNA järjestust. Selle meetodiga saab toota knock-out, knock-in ning muid mutantseid hiiri. Esmalt on vaja eemaldada embrüonaalsed tüvirakud blastotsüstist ning sisestada tüvirakkudesse DNA. Seejärel, kui nukleiinhape on sisestatud, kloonitakse ja valitakse välja sellised embrüonaalsed tüvirakkude kloonid, milles on toimunud sait-spetsiifiline rekombinatsioon. Pärast geneetiliselt muundatud embrüonaalsete tüvirakkude süstimist blastotsüsti faasis olevasse embrüosse toimub rakkude jagunemine ning nad saavad osaks embrüost. Saadud kimäärsed hiired kannavad rekombinantset genotüüpi edasi oma järglastele, kui see muutus on toimunud sugurakkudes. Seda meetodit saab kasutada ühe geeni manipuleerimiseks, mis enamikul juhtudel tõrjuvad välja märklaudgeeni, kuigi toimuda võivad ka kergemad geneetilised manipulatsioonid (näiteks muutub ainult üks nukleotiid). Geneetiliselt muundatud hiiri kasutatakse laialdaselt uuringutes inimhaiguste mudelitena. Kõige tavalisem transgeense hiire tüüp on knock-out-hiir, kellel on välja lülitatud üks või mõnel juhul mitu geeni. Neid on kasutatud selleks, et uurida ja modelleerida ülekaalulisust, südamehaigusi, diabeeti, artriiti, mõnuainete liigtarvitamist, ärevust, vananemist, Parkinsoni tõbe ja Alzheimeri tõbe. Transgeensed hiired, keda on loodud kandma kloonitud onkogeene, ning knock-out hiired, kellel puuduvad kasvajaid allasuruvad geenid, on olnud headeks inimestel esinevate vähktõveliikide mudeliteks. Onkohiired on loomad, keda on geneetiliselt muundatud spetsiifilise onkogeeni sisseviimisel hiire organismi. Aktiveeritud onkogeen suurendab hiire tundlikkust vähile. Selliseid onkohiiri, kes katavad suure hulga vähitüüpe, mis mõjutavad enamikku elundeid, on aretatud sadu. Neid onkogeene on edasi täiustatud, muutes need sarnasemaks inimestel esinevate vähitüüpidega. Haiguse sümptomeid ja võimalikke ravimeid või ravimooduseid saab testida nende hiiremudelite peal. Inimese, veise või roti kasvuhormooni viimisel hiire organismi on võimalik saada hiired, kes on normaalsetega võrreldes ligi kaks korda suuremad. Näiteks ühe transgeense hiire organismi viidi kasvuhormoon, mis suurendas tema lihasmassi ja tugevust, üleekspresseerides peptiidi, nimega insuliinisarnane kasvufaktor-I (IGF-I), mis asub lihaskiudes. Mõnedel laborihiirtel muudeti geeni, mis on seotud glükoosi metabolismiga ja selle tagajärjel hakkasid hiired kiiremini jooksma, nende eluiga pikenes, tõusis seksuaalne aktiivsus ning nad said süüa rohkem kui tavalised hiired, ilma kaalu juurde võtmata. Sellistel hiirtel on PEPCK-C ensüümi kontsentratsioon lihastes 100 korda suurem kui tavalistel hiirtel. Peale selle on täheldatud, et need hiired on agressiivsemad. Geneetiliselt muundatud hiirte abil on võimalik toota inimesele vajalikke monokloonseid antikehi, mis võivad olla rakenduslikult tähtsad geeniteraapias. Üks kõige paljutõotavamaid lähenemisi terapeutiliste monokloonsete antikehade valmistamisele on selliste hiiretüvede loomine, mis on projekteeritud tootma suurel hulgal inimestele mõeldud antikehi hiire enda antikehade puudumisel. Selliseid transgeenseid hiiri on aretatud inimese immunoglobuliini (antikehade) lookuste lõikude sisseviimisel sellistesse hiireliinidesse, kellel puuduvad hiirele omased antikehi tootvad geenid. Need geneetiliselt muundatud hiired toodavad suurtes kogustes terviklikke inimese antikehi, mis antigeenidega immuniseerides tekitavad antigeen-spetsiifilisi inimese monokloonseid antikehi. Hiirt immuniseeritakse antigeeniga, milleks võib olla valk, hormoon, ensüüm, kasvajarakud. Immuniseeritud hiire põrnarakud liidetakse ehk hübridiseeritakse kasvajarakkudega (müeloomi rakkudega). Hübridoomirakke selekteeritakse selektiivsöötmel. Kasvajarakud, mis ei hübridiseerinud põrnarakkudega, surevad. Antikehade sünteesi testimine. Otsitakse üles rakukloon, mis sünteesib antikehi. Soovitud antikehade rekloneerimine ja osa materjali külmutamine. Hübridoomide kasvatamine masskultuuris või hiire kõhuõõnes. Antikehade puhastamine ja nende kasutamine vastavalt otstarbele. Suurt tähelepanu tuleb pöörata sellele, kuidas kasutada geneetiliselt muundatud hiiri uurimistöödes. Isegi elementaarsed teemad, nagu õige metsiktüüpi hiire valimine, jäetakse mõnikord tähelepanuta. Marten H. Hofker (20. august 2002). "Transgenic Mouse : Methods and Protocols" (PDF). 209 (inglise). Rudolf Jaenisch, Beatrice Mintz (aprill 1974). "Simian Virus 40 DNA Sequences in DNA of Healthy Adult Mice Derived from Preimplantation Blastocysts Injected with Viral DNA" (PDF). 71(4) (inglise). Proc Natl Acad Sci U S A. JW Gordon, FH Ruddle (11. detsember 1981). "Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei" (PDF). 214 (4526) (inglise). Franklin Constantini, Elizabeth Lacy (november 1981). "Introduction of a rabbit β-globin gene into the mouse germ line" (html). 294 (5836) (inglise). Nature. Ralph L. Brinster, Howard Y. Chen, Myrna Trumbauer, Allen W. Senear, Raphael Warren, Richard D. Palmiter (1. november 1981). "Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs" (PDF). 27 (1) (inglise).{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Douglas Hanahan, Erwin F. Wagner, Richard D. Palmiter (2007). "The origins of oncomice: a history of the first transgenic mice genetically engineered to develop cancer" (PDF) (inglise). Cold Spring Harbor Laboratory Press.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) "What's a "Transgenic Mouse" ?". Originaali arhiivikoopia seisuga 15. november 2013. Vaadatud 7. novembril 2013. Kirk R. Thomas, Mario R. Capecchi (6. november 1987). "Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells" (PDF). 51 (inglise). Cell Press. "Background: Cloned and Genetically Modified Animals" (html) (inglise). Center of Genetics and Society. 14. aprill 2005. "Knockout Mice" (html) (inglise). Nation Human Genome Research Institute. Alexandra C. McPherron, Ann M. Lawler, Se-Jin Lee (1. mai 1997). "Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-p superfamily member" (PDF). 287 (inglise). Nature.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Elisabeth R. Barton-Davis, Daria I. Shoturma, Antonio Musaro, Nadia Rosenthal, H. Lee Sweeney (27. oktoober 1998). "Viral mediated expression of insulin-like growth factor I blocks the aging-related loss of skeletal muscle function". 95 (26) (inglise). PNAS. Originaali (html) arhiivikoopia seisuga 3. august 2012. Vaadatud 7. novembril 2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) "Genetically engineered super mouse stuns scientists" (inglise). 3. november 2007. Originaali (html) arhiivikoopia seisuga 8. märts 2013. Vaadatud 7. novembril 2013. Parvin Hakimi, Jianqi Yang, Gemma Casadesus, Duna Massillon, Fatima Tolentino-Silva∥, Colleen K. Nye, Marco E. Cabrera, David R. Hagen, Christopher B. Utter, Yacoub Baghdy, David H. Johnson, David L. Wilson, John P. Kirwan, Satish C. Kalhan, Richard W. Hanson (25. juuli 2007). "Overexpression of the Cytosolic Form of Phosphoenolpyruvate Carboxykinase (GTP) in Skeletal Muscle Repatterns". 282 (inglise). The Journal of Biological Chemistry. Originaali (PDF) arhiivikoopia seisuga 18. august 2016. Vaadatud 7. novembril 2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) A. Jakobovits (oktoober 1995). "Production of fully human antibodies by transgenic mice" (html). 6 (5) (inglise). Cell Genesys Inc. "Rakubioloogia meetodid" (hmtl). W. E. Crusio, D. Goldowitz, A. Holmes, D. Wolfer (6. september 2008). "Standards for the publication of mouse mutant studies" (PDF). 8 (1) (inglise). The International Behavioural and Neural Genetics Society.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Mohammed Bourdi, John S. Davies, Lance R. Pohl (24. mai 2011). "Mispairing C57BL/6 Substrains of Genetically Engineered Mice and Wild-Type Controls Can Lead to Confounding Results as it did in Studies of JNK2 in Acetaminophen and Concanavalin A Liver Injury" (PDF). 24 (6) (inglise). Chem Res Toxicol.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)