Enhanser-RNA

Enhanser-RNA (eRNA) on väike (paarsada kuni mõni tuhat aluspaari pikk) mittekodeeriv RNA molekul, mis on transkribeeritud ehk sünteesitud sellele vastavast enhanser-järjestusest. Teisisõnu võiks öelda, et see on enhanseri transkript. eRNA-d avastati 2010. aastal tänu ülegenoomsete meetodite kasutusele. Enhaser-RNA-de avastamisele aitasid kaasa uue põlvkonna sekveneerimismeetodid nagu RNA-seq ja ChIP-seq. RNA-seq-iga saab kätte rakus olevad RNA-d ja ChIP-seq-iga rakus olevate kromatiiniseoseliste valkude asukohad DNA-l. eRNA-d on võimalik jagada nende omaduste järgi kaheks: 1D eRNA-d ja 2D eRNA-d. Need kaks eRNA-d erinevad peamiselt suuruse, keemilise modifitseerituse ja sünteesimise suuna ehk transkriptsiooni poolest. Enhanser-RNA-de hulk korreleerub temale vastava enhanseri aktiivsusega: mida aktiivsem on enhanser, seda enam transkribeeritakse tema eRNA-d. Mitmed eRNA-sid uurinud tööd on näidanud, et eRNA-l on oluline roll transkriptsiooni regulatsioonis. Nad võivad funktsioneerida nii in cis kui ka in trans, mis tähendab, et nad võivad reguleerida nii enda lähedal kui ka endast kaugel asuvate geenide ekspressiooni. Enhanserite transkriptsioon on laialt levinud nähtus, mida on leitud eri rakutüüpidest ja organismidest. Esimesed tõendid eRNA-de kohta tulid uuringutest, milles kirjeldati enhanseritelt suunatud transkriptsiooni lookus-kontroll-regioonist (LCR), mis asub beeta-globiini geeniklastris. Tõendid laialt levinud RNA transkriptsioonist aktiivsete enhanseri elementide juures ilmnesid tänu edusammudele sekveneerimistehnoloogias. Enhanserite markeriks on kindlad kromatiinijäljed, mida kasutati ka geenivälise RNA Pol II transkriptsiooni alade uuringus. Leiti, et oluline osa, peaaegu 70% nendest geenivälistest Pol II jälgedest kattusid enhanseri kromatiinijälgedega. Sellest järeldus, et suur osa Pol II transkriptsiooni aladest kattus enhanserite aladega. Hiire genoomi analüüsidest leiti, et peaaegu veerand RNA polümeraas II aladest seostusid enhanseri genoomsetele aladele ja toodavad väikseid transkripte. Nagu eelnevalt mainitud, siis nendel eRNA-del puudusid polüadenülatsiooni modifikatsioonid, nad on üldiselt lühikesed ja mittekodeerivad ning kahesuunaliselt transkribeeritud. See tähendab, et neid sünteesitakse nii 5! kui 3! suunas. Hiljem avastati esmastest erinevad eRNA-d, mis on pikemad, polüadenüleeritud ja ühesuunaliselt sünteesitud. Kuna on leitud, et lähedal olevate geenide informatsiooni-RNAcmRNA tase on seotud eRNA-de tasemega, siis võib järeldada, et eRNA-del on regulatoorne ja funktsionaalne roll. See tähendab, et nad mõjutavad teatud geeniekspressiooni taset. 1D eRNA-d on keemiliselt muudetud ehk polüadenüleeritud, neil on 3’ otsas polü(A)-saba, mis võib olla kuni mitusada aluspaari pikk. 2D eRNA-del polü(A)-saba puudub ning erinevalt 1D RNA-st on nad sünteesitud kahesuunaliselt. Enhanseri transkriptsiooni mehhanismiks ja funktsiooniks on pakutud mitmeid mudeleid. Üks võimalus on, et enhanseri transkriptsioon on ‘müra’, mis tuleneb RNA Pol II kompleksi seondumisest avatud kromatiini piirkonnaga. Teine võimalus on, et enhanseri funktsiooni aktivatsiooniks on oluline transkriptsiooni protsess, mitte eRNA transkriptid ise. Kolmandaks võimaluseks on, et RNA transkript ise panustab funktsionaalselt enhanseri aktiivsusse. Kõikidele hulkraksetele on oluline rakkude ja kudede talitluslik jaotumine. Selle jaoks peavad rakud vastama arengulistele ja keskkonnast tulevatele signaalidele. Lähtudes identsest geneetilisest materjalist, peavad nad looma rakutüübile omase geeniekspressiooni mustri. Genoomis on enhanserid väga olulised regulatoorsed struktuurielemendid, mis võimaldavad sellise rakutüübist ja olekust oleneva geeniekspressiooni avaldumist. eRNA transkriptsiooni regioonid tunneb ära kindlate markerite ja omaduste järgi. Näiteks saab H3K4me1 ja H3K4me2 kõrge taseme järgi kindlaks määrata enhanseri regioonid, kust transkribeeritakse ka eRNA-sid. Enhanseri regioonidele seonduvad transkriptsioonifaktorid ja teised valgud, mis on olulised geenide avaldumise regulatsioonis. Samuti on leitud, et eRNA-d on seoses omavahel histooni H3K27ac rikastatusega aktiveeritud enhanseri juures, samas on selles piirkonnas vähenenud H3K27me3 aktiivsus. Lisaks võib välja tuua, et eRNA-d ekspresseerivad enhanserid on rikastatud transkriptsiooni algatuse kompleksiga (näiteks TATA-seonduv valk) ja RNA Pol II-ga, mille seriin 5 on fosforüleeritud. See on omane kodeerivate geenide promootori regioonidele. Samas võrreldes valku kodeeriva geeni ‘kehaga’ on enhanserid vähem rikastatud fosforüleeritud seriin 2 RNA Pol II suhtes. Kuigi eRNA-del on lühem eluiga võrreldes teiste pikemate mittekodeerivate RNA-dega, on neil suurem transkriptsiooni alustamise sagedus. eRNAd on dünaamiliselt reguleeritud signaalülekande korral, mida juhitakse signaalsõltuvatest transkriptsioonifaktoritest. eRNA ekspressioonis toimuvad muutused, mille on signaal esile kutsunud. See on omavahel seotud ka lähedal oleva geeni transkriptsiooniliste muutusega. Muutused leiavad aset promootoris ning selle on samuti kindel signaal esile kutsunud. Enhanseri transkriptid on eelistatult rikastatud enhanserites, mis on seotud enhanseri ja promootori vaheliste lingude moodustamisega. Kokkuvõtvalt võiks öelda, et eRNA transkriptsioon on tihedalt seotud aktiivse enhanseri elementidega ja teda mõjutavate teguritega. Tõestamaks, et eRNA funktsioon aitab kaasa enhanseri aktiivsusele, viidi läbi katse, milles klooniti eri suurusega genoomseid fragmente endogeensest enhanseri lookusest. Nende katsetega näidati, et ‘tuuma’ enhanseri fragmendid, mis sisaldavad LDTF-i (lineage determing transcription factor) sidumissaite, olid täiesti piisavad enhanseri aktiivsuseks. Samas leiti, et eRNA transkriptsioonilise järjestusega enhanseritel on suurem transkriptsiooniline aktiivsus. Tulemustest saab järeldada, et eRNA aitab kaasa transkriptsioonilisele aktiivsusele, suurendades ka vastava geeni ekspressiivsust. Samas kui eRNA-d kodeeriva järjestuse suunda muudeti, kadus enhanseri eRNA-st tingitud mõju. See vihjab, et eRNA järjestus on enhanseri funktsiooniks oluline. Mõned uuringud on näidanud, et eRNA-del on potentsiaalne roll selles, et moodustuksid õiged lingud enhanseri ja transkriptsiooni alguskoha vahel. See omakorda mõjutab sihtmärk-geeni ekspressiooni. Lingusid moodustatavatel enhanseritel on suurem eRNA ekspressioon. eRNA transkriptid hõlbustavad RNA Pol II suunamist märklaud-geeni promootorisse. Enhanseri transkriptsiooni inhibeerimine kahjustab signaalist esile kutsutud de novo enhanseri aktivatsiooni. Seda näitavad H3K9 vähenenud atsetülatsioon või nõrgenenud H3K4 mono- ja dimetülatsioon. Need leiud vihjavad, et nii enhanseri transkriptsioon kui ka saadud eRNA panustavad enhanseri funktsiooni. Katsetega on näidatud, et kui eemaldada enhanseri märklaud-promootor, siis hiljem väheneb ka eRNA transkriptsioon. Analüüsidest selgub, et eRNA ekspressiooni tase on positiivselt seotud lähedal asetsevate geenide, märklaud-geenidega ja vastava enhanseriga. Taset võivad kaudselt indutseerida transkriptsioonifaktorid. Mitmed teised uuringud on näidanud, et eRNA-d panustavad enhanseri reguleeritud transkriptsiooni. Mitte kõik enhanserid ei transkribeeri eRNA-sid, ligi pooled suudavad transkribeerida endalt vastavat eRNA-d. Aktiivse enhanseri markeriks on H3K27ac (histoon H3 atsetüleeritus lüsiini 27 juures), millega on seotud ka eRNA-d. On leitud, et enhanserid, mis transkribeerivad eRNA-sid, on seotud kõrgema ekspressiooniga ja rohkem koespetsiifilise funktsiooniga märklaud-geenidega, võrreldes enhanseritega, mis ei transkribeeri eRNA-sid. Viidates sellele, et eRNA-sid võib eristada kahes olekus. See tähendab, et samad enhanserid eri kudedes võivad ühes koes transkribeerida eRNA-sid, kuid teises koes mitte. See omakorda viitab enhanserite eri olekutele ja kudede spetsiifikale. On leitud, et eRNA-de järjestus sisaldab miRNA-ga sarnaseid regioone ja sekundaarstruktuuri. Lisaks leiti mõned komplementaarsed regioonid vastava enhanseri märklaud-promootoris. Kim, T. K.; Hemberg, M.; Gray, J. M.; Costa, A. M.; Bear, D. M.; Wu, J.; Harmin, D. A.; Laptewicz, M.; Barbara-Haley, K.; Kuersten, S.; Markenscoff-Papadimitriou, E.; Kuhl, D.; Bito, H.; Worley, P. F.; Kreiman, G.; Greenberg, M. E. (2010) "Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers". Nature. 465 (7295): 182–187 Natoli, G.; Andrau, J. C. (2012) "Noncoding Transcription at Enhancers: General Principles and Functional Models" Annual Review of Genetics. 46: 1–19 Heinz, S. et al. (2010) "Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities" Mol. Cell 38, 576–589 Collis, P. et al. (1990)" Definition of the minimal requirements within the human beta-globin gene and the dominant control region for high level expression." Embo J. 9, 233–240 De Santa, F.; Barozzi, I.; Mietton, F.; Ghisletti, S.; Polletti, S.; Tusi, B. K.; Muller, H.; Ragoussis, J.; Wei, C. L.; Natoli, G. (2010) Mattick, John S, ed. "A Large Fraction of Extragenic RNA Pol II Transcription Sites Overlap Enhancers" PLoS Biology. 8 (5): e1000384 Heintzman, N. D.; Stuart, R. K.; Hon, G.; Fu, Y.; Ching, C. W.; Hawkins, R. D.; Barrera, L. O.; Van Calcar, S.; Qu, C.; Ching, K. A.; Wang, W.; Weng, Z.; Green, R. D.; Crawford, G. E.; Ren, B. (2007) "Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome" Nature Genetics. 39 (3): 311–318 Heintzman, N.D. et al. (2009) "Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression" Nature 459, 108–112 Djebali, S. et al. (2012) "Landscape of transcription in human cells" Nature 489, 101–108 Koch, F. et al. (2011) Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 956–963 Lam, M.T.Y. et al. (2013) "Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription" Nature 498, 511–515 Wang, D. et al. (2011)" Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA" Nature 474, 390–394 Kaikkonen, M.U. et al. (2013) "Remodeling of the enhancer landscape during macrophage activation is coupled to enhancer transcription" Mol. Cell 51, 310–325 Vucicevic, D., Corradin, O., Ntini, E., Scacheri, P. C. & Orom, U. A.(2015)" Long ncRNA expression associates with tissue-speci c enhancers. Cell cycle" 14, 253–260