Multitolerantsus

Multitolerantsus, persistentsus või fenotüübiline tolerantsus on mikroorganismi omadus elada üle antibiootikumide või muude bakteritsiidsete ainete mõju. Multitolerantsuse põhimõtteline erinevus multiresistentsusest (multidrug resistance) seisneb selles, et multitolerantsed bakterid ehk persisterid ei ole mutantsed mikroorganismid, vaid fenotüübi poolest erinev subpopulatsioon bakterikultuuris, kes on soikeseisundis ehk aeglase kasvu ja mahasurutud metabolismiga. Persistentsuse fenomeni kirjeldas esimesena J. W. Bigger, kes penitsilliini kasutamisel meditsiinis avastas, et antibiootikumide juuresolekul mitte kõik Staphylococcus pyogenes aureus’e rakud ei sure, vaid antibiootikumi eemaldamisel keskkonnast alustavad taas kasvu. Nähtuse uurimisel katseid läbi viies avastas ta, et tegemist ei ole mutatsioonist tuleneva resistentsusega, sest ellu jäänud rakkude järglased olid antibiootikumi suhtes taas sama tundlikud kui algne populatsioon. Hiljem on persisterite uurimise käigus selgeks saanud, et selline heterogeensus ei teki bakterikultuuris mitte kokkupuutel bakteritsiidse faktoriga, vaid vastav subpopulatsioon on kujunenud juba varem iseenesliku fenotüübilise ümberlülituse kaudu. Selle käigus võivad aeglasemalt poolduvad persisterrakud hakata loomulikult jagunema ja samas hariliku fenotüübiga rakud võivad laskuda soikeseisundisse. Persisteritel on oluline roll meditsiinis, sest on paljudel juhtudel põhjuseks, miks infektsiooni ravimine antibiootikumidega ebaõnnestub. Tihti on säärastel juhtudel vajalik pikaajaline ravikuur või võib juhtuda, et haigus avaldub tükk aega pärast ravi lõppu uuesti. Headeks näideteks sellistest haigustest on näiteks tuberkuloos ja süüfilis. Persisterrakud moodustavad tihti enda ümber ka biokile ning usutakse, et just selle pärast on biokilet moodustavate bakterite põhjustatud infektsioone eriti raske ravida. Nimelt on biokiles paiknevad rakud immuunsüsteemi eest paremini peidetud, persisteritel on antibiootikumide kontsentratsiooni alanedes võimalik biokile repopuleerida ja infektsioon avaldub uuesti. Sealjuures on biokile moodustavate bakterite põhjustatud infektsioonid umbes 65% kõikidest inimesel esinevatest infektsioonidest läänemaailmas. Sellised rakud ei ole üldiselt probleemsed, kuna inimese immuunsüsteem suudab tulla toime bakteritega, kes jäävad ellu bakteriostaatiliste antibiootikumide toimel, sest need ei paljune. Probleemid tekivad juhul, kui immuunsüsteem on nõrgestatud või need mikroorganismid on kohanenud immuunsüsteemiga ning see on võimetu neid tõrjuma. Sama kehtib juhul, kui ellujäänud bakterid asuvad immuunsüsteemile raskesti ligipääsetavates kohtades. Multiresistentsuse eristamine multitolerantsusest on nimede sarnasuse tõttu väga oluline. Kui multiresistentsus on mikroorganismi geneetiline omadus, mis pärandub põlvest põlve ja võimaldab seda kandval organismil bakteritsiidse toimeaine olemasolul keskkonnas ka kasvada, siis multitolerantsetel bakteritel puuduvad mõlemad nimetatud omadused, mida tõestas oma katsetes juba J. W. Bigger. Resistentsus kujuneb bakteritel elu jooksul kas juhuslike mutatsioonide tulemusel või horisontaalse geeniülekande läbi ja on seetõttu päranduv järglastele. Multitolerantsus on mööduv ja mittepäranduv fenotüüp geneetiliselt sarnaste isendite seas ning ilmneb iseenesliku geneetilise ümberlülituse tagajärjel. Vaatamata sellele, et persisterite olemasolu on teada juba üle poole sajandi, on selle fenomeni taga olevad molekulaarsed mehhanismid valdavalt teadmata. Persisterite uurimine on väga raske, sest nende populatsioon on väga väike (E. colis 10−6–10−5) ja neid on keeruline eristada hariliku fenotüübiga bakteritest. On selge, et persisterite geeniekspressioon erineb suuresti statsionaarse ja eksponentsiaalse kasvufaasi rakkude omast. Paljude geenide, sealhulgas ka nende, mis reguleerivad metabolismi, ekspressioon on maha surutud, mis toetab veel persistentsuse seost soikeseisundiga. Samas on kõrgendatud paljude stressivastusega seotud geenide ekspressioon, mis selgitab persisterite ellujäämist bakteritsiidsete ainete mõjul, kuid ei selgita soikeseisundit. 1983. aastal avastati E. coli K-12 tüves mutant, mille kultuuris persisterite populatsioon oli märkimisväärselt suurem (10−2). Selekteerides kõrgema persistentsussagedusega mutante avastati, et mutatsioon on toimunud hipBA lookuses, mis kodeerib üht toksiin-antitoksiin moodulit. Mutatsioonid on toimunud hipA geenis ning usutakse, et need mutatsioonid põhjustavad halvemat sidusust toksiini ja antitoksiini vahel Kuna suureneb rakkude hulk, kelles on kõrge tase toksiini, mis kasvu pärsib, kasvab ühtlasi ka persisterite arv. Seda väidet kinnitavad ka katsed, kus kogu hipBA mooduli deletsiooniga mutandi populatsioonis persisterite osakaal järsult langeb ja samas teiste toksiinide, näiteks RelE, üleekspressioonil persisterite arv mitmekordistub. Seoses soikeseisundi põhjustamisega toksiin-antitoksiin mehhanismide poolt on leitud, et ppGpp tase kõigub ühe kultuuri rakkudes stohhastiliselt ning selle kõrge tase aktiveerib rakus läbi polüfosfaat- ja Lon proteaas-sõltuva kaskaadi toksiin-antitoksiin lookusi, mis omakorda põhjustavad bakterites aeglast kasvu ja persistentsust. Seni üks edukamaid meetodeid uurida E. coli persistereid on läbi nende metabolismi ja on avastatud, et nende põhilised süsinikuallikad on glütserool ja glükoos. Usutakse, et selline fenotüüp tekib spontaanselt bakterikultuuris iseenesliku geneetilise ümberlülituse tagajärjel. Et persisterid on olulised paljude bakteriaalsete infektsioonide kordumisel, on väga oluline uurida meetodeid, mil neid kõrvaldada või teha lihtsamaks nende kahjutustamine olemasolevate meetoditega. Enamik uuritavaid meetodeid keskenduvad just mitte persisterite otsesele tapmisele, vaid nende tapmise võimaldamisele kõrvalainete kaasmõjul. Selleks on välja pakutud näiteks meetod, millega luuakse bakteri membraanil prootongradient, mis vahendab aminoglükosiidide sisenemist rakku. Samuti on proovitud ka tuua baktereid soikeseisundist välja, et neid saaks mõjutada antibiootikumidega, mis on suunatud kasvavate rakkude vastu. Sellisel lähenemisel on olnud teatav edu vastava mõjuga kemikaalide leidmisel ja on tehtud edukaid katseid koostoimes ampitsilliini ja norfloksatsiiniga, aga mehhanismid selle mõju taga on esialgu teadmata. Usutakse, et persistentsus on kohandumus ellujäämiseks muutuvas keskkonnas. Fenotüüpide paljusust, mis on populatsioonile kindlustuseks muutuvate keskkonnatingimuste vastu, nimetatakse populatsioonigeneetikas riskide maandamise strateegiaks (bet-hedging). Persistentsus võib tekkida populatsioonis kas läbi iseenesliku geneetilise ümberlülituse või vastusena signaalidele keskkonnast. Viimane oleks organismile energeetiliselt kulukam, sest selleks oleks tarvilik ka süsteem, mis tunneks ära vastava stiimuli, annaks signaali edasi ja reageeriks muutunud oludele. Seega oleks selline süsteem eelistatud ainult juhul, kui muutused keskkonnas oleksid nii sagedased, et tasuksid ära süsteemi pidamise energeetilise kulu. Iseeneslik lülitumine oleks soositud just siis, kui keskkonnas muutuste toimumine on pigem haruldane või juhul, mil muutused keskkonnas on katastroofilised ning ei jäta organismile aega oludega kohanemiseks ka vastava aparatuuri olemasolul. Samuti on ka välja pakutud, et peristentsus võib olla vananemise tulemus. Rakkudes võivad nende elu jooksul kuhjuda vigastused ning on näidatud, et rakud, millel on rohkem vigastatud valke, moodustavad väiksema tõenäosusega kolooniaid. Sellest tulenevalt on pakutud välja hüpotees, et persistentsus võib olla kas või osaliselt põhjustatud rakkude juhuslikest vigastustest ja need isendid, mis hakkavad statsionaarsest faasist aeglasemini kasvama, on lihtsalt suuremate kahjustustega. Lewis K (jaanuar, 2007): "Persister cells, dormancy and infectious disease". Nature Reviews Microbiology 5 (1): 48–56. doi:10.1038/nrmicro1557. Bigger JW (14. oktoober, 1944): "Treatment of Staphylococcal Infections with Penicillin by Intermittent Sterilizations". The Lancet 244 (6320): 497–500. doi:10.1016/S0140-6736(00)74210–3. Balaban NQ, Merrin J, Chait R, Kowalik L, Leibler S (10. september, 2004): "Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch". Science 305 (5690): 1622–1625. DOI:10.1126/science.1099390. Brooun A, Liu S, Lewis K (Märts, 2000): "A Dose-Response Study of Antibiotic Resistance in Pseudomonas aeruginosa Biofilms". Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44 (3): 640–646. doi: 10.1128/AAC.44.3.640-646.2000 Costerton W, et. al. (15. november, 2003): "The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections". Journal of Clinical Investigation 112 (10): 1466–1477. doi:10.1172/JCI20365. , Nataro JP, Blaser MJ, Cunningham-Rundles S (2000): "Persistent Bacterial Infections". ASM Press, Washington, DC, p. 453. Shah D, Zhang Z, Khodurski A, et. al. (2006): "Persisters: a distinct physiological state of E. coli". BMC Microbiology 6 (53). doi:10.1186/1471-2180-6-53. Keren I, Shah D, Spoering A, et. al. (2004): "Specialized Persister Cells and the Mechanism of Multidrug Tolerance in Escherichia coli". Journal of Bacteriology 186 (24): 8172–8180. doi: 10.1128/JB.186.24.8172-8180.2004. Moyed H, Bertrand K (august, 1983): "hipA, a newly recognized gene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis"´. Journal of Bacteriology 155 (2): 768–775. doi Maisonneuve E, Shakespeare L, Jorgensen M, Gerdes K (2011): "Bcterial persistence by RNA endonucleases". PNAS 108 (32): 13206-13211. doi: 10.1073/pnas.1100186108. Korch S, Henderson T, Hill T (2003): "Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis". Molecular Microbiology 50 (4): 1199–1213. doi:10.1046/j.1365-2958.2003.03779.x. Gerdes K, Christensen SK, Lobner-Olener A (2005): "Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci"[alaline kõdulink]. Nature Reviews Microbiology '’’3’’’: 371–382. doi:10.1038/nrmicro1147. Orman M, Brynildsen M (juuli, 2013): "Establishment of a method to rapidly assay bacterial persister metabolism". Antimicrobial Agents and Chemotherapy 57 (9): 4398–4409 . doi: 10.1128/AAC.00372-13. Allisson K, Brynildsen M,Collins J (11. mai, 2011): "Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides". Nature 473 (7346): 216–220. doi:10.1038/nature10069. Kim J, Heo P, Yang T (2011): "Selective Killing of Bacterial Persisters by a Single Chemical Compound without Affecting Normal Antibiotic-Sensitive Cells". Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55 (11): 5380–5383. doi:10.1128/AAC.00708-11. Kussel E, Liebler S (2005): "Phenotypic Diversity, Population Growth, and Information in Fluctuating Environments". Science 309 (5743): 2075–2078. doi: 10.1126/science.1114383. Beaumont H, Gallie J, Kost C, et. al. (5. november 2009): "Experimental evolution of bet hedging". Nature 462: 90–93. doi:10.1038/nature08504. Desnues B, Cuny C, Grégori G, Dukan S, Aguilaniu H, Nyström T (2003): "Differential oxidative damage and expression of stress defence regulons in culturable and non-culturable Escherichia coli cells". EMBO reports 4 (4): 400–404. doi: 10.1038/sj.embor.embor799.