CRISPR-Cas9 süsteem

CRISPR-Cas9 süsteem on prokarüootide immuunsüsteemi osa, mis annab resistentsuse mitteomaste geneetiliste elementide, näiteks plasmiidide või faagide suhtes. Selle süsteemi kasutamine biotehnoloogias võimaldab väga kiirelt, täpselt ja odavalt DNA-d muuta ning seepärast peetakse selle avastamist ja kasutuselevõttu üheks suuremaks revolutsiooniks selles valdkonnas. See omandatud immuunsüsteem koosneb CRISPR-kordusjärjestustest ja endonukleaasidest nagu näiteks Cas9. CRISPR on lühikesi nukleotiidseid kordusi sisaldav lookus või piirkond paljude prokarüootide DNAs, kus asuvad eri viiruste lühikesed nukleotiidsete segmentide järjestused ehk protospacer '​id. Cas9 katalüüsib CRISPRi protospacer '​iga seostunud võõra DNA ahela katkemist. Sellega neutraliseeritakse viiruse kahjulik mõju bakterile. Taolisi süsteeme on leitud umbes 40%-l prokarüootidest ja umbes 90%-l arhedest, kelle genoom on sekveneeritud. Cas9 avastati CRISPRi süsteemi nukleaasidest esimesena. Pärast seda on avastatud veel teisigi sarnase funktsiooniga nukleaase: Cpf, Csn, Cas3, Cas10 jne. Kuna CRISPR-Casi süsteem töötab väga spetsiifiliselt ja ei ole väga kallis, on see väga hea biotehnoloogiline vahend genoomi töötlemiseks. Võimalik, et süsteemiga võib tulevikus hakata ravima peaaegu kõiki geneetilisi haigusi. Näiteks on Hiina teadlased seda süsteemi juba rakendanud eluvõimetu inimembrüo genoomil. Esimesed avastused ja vihjed selle süsteemi kohta tulid 1980. aastate lõpus, kui üks Jaapani uurimisrühm kloonis kogemata ühe osa CRISPRi segmendist koos oma uuritava geeniga. Selliste korduvate järjestuste klastrid avastati veel sõltumatult kahes kohas: 1993. aastal Hollandis ja samal ajal ka Hispaanias. 2005. aastal jõudsid kolm uurimisrühma üksteisest sõltumatult järeldusele, et osa CRISPRi lookuses asuvaid spacer'eid on pärit bakteriofaagide DNAst ja/või võõrast plasmiidist. Nende tulemuste järgi on CRISPRi roll bakteris sarnane omandatud immuunsüsteemiga. Esimesed katselised tõendid selle kohta saadi 2007. aastal, kui näidati, et bakteri Staphylococcus thermophilus '​e omandatud spacer '​id on tõesti pärit teda nakatanud bakteriofaagist. Kui tundmatu viirus ründab mikroobi, siis esmane immuunvastus sellele on mingi segment (protospacer) viiruse DNAst salvestada CRISPRi lookusesse. See segment on homoloogiline ehk sarnane viiruse selle piirkonna DNAga. Ensüümid, mis aitavad bakteri genoomi viiruse DNAd integreerida, on Cas1 ja Cas2. Valgumutatsiooni katsed on näidanud, et pärast seda ei lülitu enam uued protospacer '​id CRISPRi süsteemi, kuid samas on väga hästi säilinud mikroobi immuunvastus viirustele, mis on juba varem CRISPRi lookusesse lülitatud. Praeguseks on juba avastatud mitut eri tüüpi CRISPRi süsteemid (tüüp I, tüüp II, tüüp III), mis kõik töötavad teatud erinevustega. Kuna tüüp II on neist kõige enam uuritud ja nii-öelda näidis-CRISPRi süsteem, siis edaspidi tuleb juttu eelkõige just seda tüüpi süsteemist. Võõras geneetiline materjal salvestatakse mikroobi CRISPRi klastrisse nn protospacer '​itena. Nende pikkused varieeruvad tavaliselt umbes 20 nukleotiidi ümber. Eri spacer '​id DNAs on üksteisest eraldatud lühikeste palindroomsete järjestustega. Sellelt transkribeeritud RNA-d nimetatakse CRISPRi RNA-ks ehk crRNAks (vahel mainitud ka kui guide-RNA ehk gRNA). Kuid lisaks crRNA-le on süsteemi toimimiseks vajalik veel üks teine RNA. Selleks on nn transaktiveeriv crRNA ehk tracrRNA. Selle geen on bakteri genoomis nagu Cas9 geengi CRISPRi lookuse lähedal. Sellist asukohta on vaja, et tuttava viiruse rünnaku korral välja valida just see õige, viiruse DNAga homoloogiline crRNA, ja siduda see Cas9 nukleaasiga. Kui sama viirus uuesti bakterit ründab, siis esmase immuunvastusena transkribeeritakse bakteri CRISPRi lookusest transkript pre-crRNA. See sisaldab veel paljusid eri protospacer '​eid ja nendega koos tulnud palindroomseid järjestusi, sellest ka eesliide pre. Samal ajal toimub ka tracrRNA süntees. See RNA sisaldab samuti palindroomset järjestust, mis on komplementaarne CRISPRis olevate korduvate järjestustega. Seejärel toimub tracrRNA hübridisatsioon just selle crRNA kõrval oleva palindroomse järjestusega, mis on homoloogiline sissetunginud viiruse DNAga. Korduste kohast tekib seega kaheahelaline ehk dsRNA (double-stranded), mis initsieerib ensüümi RNase III lõikama tracrRNAga seostunud crRNAd. Pre-crRNA ja tracrRNA kompleks initsieerib veel ka Cas9 ensüümi, mis seostub sellega ja alles siis muutub aktiivseks endonukleaasiks. Moodustub crRNA-tracrRNA-Cas9 kompleks, mis on nüüd valmis seostuma märklaud-DNAga. Kompleks hübridiseerub viiruse DNA selle osaga, mis sisaldab crRNAga homoloogilist järjestust, aga lisaks sellele on väga oluline veel üks järjestus, mis jääb homoloogilise järjestuse 3 otsa. Selleks on nn PAMi (protospacer adjacent motif) ala ehk protospacer '​iga külgnev järjestus, mis on ainult mõni nukleotiid pikk (3–5 aluspaar). See on väga oluline osa süsteemist, sest just see ala takistab CRISPRi süsteemil lagundada enda geneetilist infot, sest taolisi ~20 aluspaaripikkuseid spacer '​iga identseid järjestusi võib juhuslikult esineda ka bakteri enda genoomis. PAMi ala annab bakterile mõista, et tegemist on võõra geneetilise materjaliga, mis võib minna lagundamisele. Tundnud ära selle ala, hübridiseerub crRNA viiruse DNA-le, kusjuures palindroomse kordusega ala hübridiseerub just PAMi alale. Endonukleaas Cas9 katalüüsib nüüd dsDNA fosfodiestersideme katkemist. See toimub samuti PAM ala kõrval. Pärast kaheahelalist katket eemaldub kompleks märklaualt. CRISPR-Cas9 süsteem on oma olemuselt küllaltki lihtne, sest süsteemi toimumiseks on vaja ainult kolme komponenti: crRNA, tracrRNA ja Cas9. Teine väga oluline aspekt on, et erinevalt varasematest genoomi töötlemise tehnoloogiatest võimaldab see süsteem bioloogilisi süsteeme töödelda palju täpsemalt, kiiremalt ja odavamalt. 2011.–2012. aastal näitasid Virginijus Šikšnysi ja Emmanuelle Charpentieri juhitud uurimisrühmad, et manipuleerides RNAd Cas9 ensüümis, võivad nad ise valida märklaud-DNA ahela, mida töödelda. Näiteks valida huvipakkuv ala genoomis, tekitada seal kaheahelaline katke ja integreerida katkenud ahelate vahele uus geen. Charpentieri meeskond ühendas Cas9 ensüümis oleva RNA üheksainsaks pikemaks RNAks – guide-RNA ehk gRNAks. Praeguseks on CRISPR-Cas9 süsteemi rakendatud sellistele organismidele nagu pagaripärm (Saccharomyces cerevisiae), sebrakala (D. rerio), äädikakärbes (Drosophila melanogaster), akselot (A. mexicanum) ja varbuss (C. elegans). Ka hiirtel, taimedel ning ahvide ja inimeste embrüotel. Lisaks gRNA-le ja Cas9-le läheb vaja ka nn parandusmatriitsahelat, mille järgi DNA poolikud ahelad ära parandatakse. DNA poolikud ahelad tekivad, kui katkenud ahelate vahele on integreeritud huvipakkuv geen. Pärast huvipakkuva geeni integreerumist parandatakse need poolikud ahelad, aga tihtipeale võib nendes nukleotiidne järjestus muutuda. Selle vältimiseks ongi vaja nn parandusmatriitsahelat, et huvipakkuva geeni ümber säiliks sama nukleotiidne järjestus. CRISPRit on kasutatud korraga kuni 62 geeni lõikamiseks. Et seda teha, oleks vaja just nii palju erinevaid gRNAsid, mis seostuks Cas9 nukleaasiga ja juhiks ensüümi gRNA järgi määratud kohta DNA-l. Kui Cas9 ensüümilt kõrvaldada selle nukleaasne aktiivsus, siis – kuigi kogu kompleks seostub määratud kohale DNA-l – ei lõigata seda ahelat, vaid kompleks jääb lihtsalt seotuks selle kohaga. Sellist tehnikat kasutades on huvipakkuvaid geene n-ö välja lülitatud, et uurida eri geenide funktsiooni ja mõju organismidele. 2005. aastal avaldati artikkel, milles USA evolutsioonibioloogid tegid katse, kus nad kasutasid CRISPRit, et tekitada nn mutageenne ahelreaktsioon. See kandis teatud pigmentatsioonitunnuse 97% efektiivsusega järgmisesse põlvkonda. Teine uurimisrühm kasutas samuti CRISPRit ja tekitas malaariat kandnud sääskedes geenilülituse, mis aitas takistada malaariaviirust kandvate geenide levitamist. Sellest veidi hiljem andis üks uurimisgrupp teada, et oli laboritingimustes teinud teise geenilülituse, mis muutis emased sääsed viljatuks. Selle tulemusel suri terve populatsioon kiiresti välja. Rodolphe Barrangou: "Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution" Science, 16. mai 2014 "Editing life: A guide to the genetic revolution on our doorstep" New Scientist, 2. detsember 2015 Sawyer, E. Editing genomes with the bacterial immun system. 2013 Scitable. Marraffini, LA. Sontheimer, EJ (2010). CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature Reviews Genetics. 11: 181–190. Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C (2007). The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics. 8: 172. Hsu PD, Lander ES, Zhang F Juuni 2014. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6): 1262–78. Zhang, S. 2015. Everything You Need to Know About CRISPR, the New Tool that Edits DNA[alaline kõdulink] Hsu PD, Lander ES, Zhang F Juuni 2014. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering Cell. 157 (6): 1262–78. Yosef I, Goren MG, Qimron U Juuli 2012. Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 40 (12): 5569–76. Reis, A. 2014. CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing: A New Era in Molecular biology. What is CRISPR-Cas9?. 2016. History. https://www.addgene.org/crispr/reference/history/ CRISPR/Cas9 History. CRISPR/Cas9 Guide. Science News Staff. Detsember 2015. And Science's Breakthrough of the Year is .... news.sciencemag.org.