Kloonimine

Kloonimine (tuletatud vanakreeka sõnast κλών (klõn) – 'oksake') on geneetiliselt identsete organismide saamine sugulise või mittesugulise (sealhulgas ka vegetatiivse) paljunemise tulemusena. Biotehnoloogias tähendab kloonimine ka DNA fragmendi koopiate (molekulaarne kloonimine), rakkude (rakukloonimine) või teiste väiksemate elundiosade kloonimist. Kloonimisest hakati rohkem rääkima pärast seda, kui 1996. aastal õnnestus edukalt liita udara- ja munarakk. Sellest kasvas kloonlammas Dolly. Kloonimistehnoloogiate arenguga loodetakse tulevikus ennetada ja ravida seni ravimatuid haigusi. Lisaks sellele avanevad perspektiivid põllumajanduses tõuaretusega ja pereplaneerimises viljatusraviga. Kloonimine tähendas juba Vana-Kreeka ajal protsessi, milles uus taim saab alguse väikesest oksakesest vegetatiivse paljunemise tulemusena. Nendel taimedel oli oluline väärtus aianduses, kuna nad olid identsed oma eellastega ning olid uue sordi aretamise aluseks. Hiljem hakati kogu sellist tahtlikult vegetatiivset paljundamisprotsessi nimetama kloonimiseks. Ajaga on mõiste laienenud ning seda on hakatud kasutama bakterikultuuride kasvatamisel. Hiljem kasutati terminit "kloonimine" kõikide identsete organismide saamise tehnoloogiate puhul, alates tuumade asendamisest kullestel, lõpetades erinevate organismide, ka lamba Dolly saamisega. Juba 1990. aastate lõpus hakati rääkima võimalusest kasutada seda sama tehnoloogiat, et saada geneetiliselt identseid inimesi. Mõiste "kloonimine" väljus ka teadusringkondade sõnavarast üldisele rahvamassile kasutamiseks. Seda hakati kasutama nii meedias, kinomaastikul, kirjanduses kui ka arvutimängude tootmisel. Molekulaarne kloonimine on protsess, mille läbi saadakse labori tingimustes ühest molekulist mitu samasugust molekuli. Molekulaarset kloonimist kasutatakse laialdaselt nii bioloogilistes eksperimentides kui ka praktilistes rakendustes, alates DNA analüüsidest ja lõpetades valkude tootmisega. Tavaliselt kasutatakse kloonimist pikendamaks DNA fragmente, mis sisaldavad terveid geene. Samuti kasutatakse seda, et pikendada igasuguseid DNA järjestusi, näiteks promootorit, mittekodeerivaid järjestusi ja juhuslikke DNA lõike. DNA fragmendi kloonimine hõlmab nelja etappi: fragmentatsioon – valitud lõigu eraldamine DNA-st; ligeerimine – oma DNA kleepimine valitud lõiku; transformatsioon – moodustatud uue lõigu sisestamine rakku; analüüsimine/selekteerimine – edukalt kloonitud rakkude väljavalimine. Kuigi need on kloonimise põhiprotsessid, leidub ka alternatiivseid meetodeid. Et pikendada elava organismi DNA lõiku, peab see olema ühenduses replikatsiooni alguspunktiga, mis suunab nii enda kui ka ühendatavate lõikude paljunemist. Lisaks sellele on vajalikud mitmesugused protsessid ja spetsialiseerinud kloonimisvektorid (tükike DNA-d, millesse saab lisada võõra DNA fragmente), et algaks valgu ekspressioon, sildistamine, üheahelalise RNA ja DNA moodustamine jne. Alguses tuleb eraldada DNAst sobiva suurusega lõik. Seejärel ligeerimise abil sisestatakse amplifitseeritud DNA vektorisse (DNA lõik). Vektor (mis on tavaliselt ümmargune) lineariseeritakse, kasutades selleks restriktsiooniensüüme. Järgmisena inkubeeritakse vektor meid huvitava fragmendiga kindlates tingimustes koos ensüümi DNA ligaasiga. Pärast ligeerimist siseneb vektor meid huvitava DNA lõiguga peremeesrakku. Esineb ka teisi võimalikke tehnikaid, näiteks elektroporatsioon, optiline süstimine ja DNA-püssi abil. Lõpuks saadud transformeeritud rakud pannakse kasvama. Olenemata sellest, millist sisestamismeetodit kasutati, on võõr-DNA rakku sisenemine väikese efektiivsusega. Ainult teatud väike osa rakkudest võtab võõr-DNA oma koosseisu. Selleks, et kindlaks teha, millised rakud on edukalt kloonitud, kasutatakse vektorisse ehitatud markergeene. Tänapäevased kloonimisvektorid sisaldavad valikulisi antibiootikumiresistentsusmarkereid, mis võimaldavad söötmel kasvada ainult nendel rakkudel, millel on see vektor olemas. Ainuraksete organismide kloonimine Raku kloonimine tähendab rakupopulatsiooni saamist ühest rakust. Bakterite ja pärmi (ainuraksed organismid) puhul on see protsess erakordselt lihtne, kuna võõrkeha tuleb kõigest siirata sobivasse kasvukeskkonda. See-eest keerukamate rakuliinide kloonimisel on protsess raskendatud, kasutatakse kloonimisrõngaid (silindreid). Selle tehnika jaoks vajavad rakud eelnevat eeltöötlemist. Rakususpensioon, mis on kokku puutunud mutageense aine või selektsiooni teostava ravimiga, külvatakse tugevale lahusele. Sellel alusel kasvavad isoleeritud kolooniaid. Varajases kasvufaasis, kui kolooniad koosnevad vaid üksikutest rakkudest, asetatakse nende ümber steriilsed polüstüreenirõngad (kloonimisrõngad). Rõngad on eelnevalt kastetud rasva sisse ja nendesse lisatakse väike kogus trüpsiini. Seejärel siiratakse võõrkeha kolooniatesse. Kloonitud rakud korjatakse rõngaste seest kokku ja viiakse uuele söötmele edasiseks kasvuks. Somaatilise rakutuuma siirdamist (SCNT, somatic-cell nuclear transfer) kasutatakse embrüote loomiseks uuringute või ravi eesmärgil. Levinuim rakendusvaldkond on tüvirakkude uuringud. Seda protsessi nimetatakse ka "ravikloonimiseks" ja "terapeutiliseks kloonimiseks". Eesmärgiks pole luua kloonitud inimkeha (reproduktiivne kloonimine), vaid eraldada tüvirakke. Somaatilist rakutuuma siirdamist kloonimisel kasutatakse aktiivselt selle tõttu, et keharakke saab kergelt kasvatada ja hoida laboritingimustes. Protsess algab tuuma (sisaldab DNA-d) väljavõtmisega somaatilisest rakust (keharakk), mis hiljem pannakse tuumata munarakku. Somaatiline tuum ja munaraku tsütoplasma ühendatakse omavahel elektrišoki abil. Elektrišoki energia võimaldab kloonitud embrüol hakata arenema. Väljaarenev embrüo on geneetiliselt identne patsiendiga. Uus embrüo loob blastotsüste, mis võib moodustuda ükskõik mis rakuks inimese kehas. Oluline on teada, et kloonimine toimub ainult siis, kui munarakk säilitab oma normaalsed funktsioonid. Selle asemel, et replitseeruda kasutades sperma ja munaraku genoomi, sisestatakse somaatiline rakutuum munarakku. Munarakk reageerib keharaku tuumale samamoodi, nagu ta reageeriks spermarakule. Somaatilise rakutuuma siirdamisprotsessi peetakse ka heaks meetodiks, et toota põllumajandusloomi toidu otstarbeks. See tehnoloogia on edukalt klooninud lambaid, veiseid, kitsi ja sigu. Teisalt väga suur kasu somaatiliste tuumade siirdamisel on väljasuremisohus olevate liikide kloonimine. Kahjuks suure surve tõttu nii munarakule kui ka siiratavale tuumale läheb palju rakke kaduma protsessi käigus. Siiamaani pole võimalik seda protseduuri automatiseerida, kõike tuleb käsitsi mikroskoobi all teostada, mille tõttu on see protseduur väga ressursimahukas. Biokeemiaga seotud keharakutuumade ümberprogrammeerimine ning munaraku aktiveerimine pole samuti kaugeltki hästi arusaadavad protsessid. Mõistet "kloon" kasutatakse aianduses, kui räägitakse taimest, mis on järeltulija vegetatiivse paljunemise tulemusena. Paljud aiakultuuride sordid on kloonid, mis on alguse saanud ühest taimest ja on mitmekordistatud mingis vegetatiivses protsessis. Näiteks mõned Euroopa taimesordid, nagu näiteks viinamarjad, kartulid ja banaanid on aastatuhandeid vanad kloonid. Paljud puud, põõsad, viinamarjad, sõnajalad ja muud rohttaimed ja püsililled moodustavad loomulikke kolooniaid kloonidest. See toimub siis, kui taimest eraldunud mingi osa hakkab individuaalse taimena eraldi kasvama. Sammal on samuti üks levinud näide vegetatiivsest paljunemisest. Mõned soontaimed, näiteks võilill ja heintaimed moodustavad ka seemneid aseksuaalselt, mille tulemusena moodustuvad geneetiliselt identsetest indiviididest kloonide populatsioonid. Klonaalne päritolu esineb looduses mõningatel loomaliikidel ja seda nimetatakse partenogeneesiks (organismi paljunemine ilma kaaslaseta). See mittesugulise paljunemise vorm esineb ainult mõningatel emastel putukatel, vähkidel ja sisalikel. Kasv ja areng toimub ilma isaslooma poolt viljastamiseta. Taimedel partenogenees tähendab embrüo arengut viljastamata munarakust. Seda kutsutakse ka apomiksiseks. Kunstlikku organismide kloonimist võib nimetada ka reproduktiivseks kloonimiseks. 1935. aastal pälvis saksa embrüoloog Hans Spemann Nobeli auhinna meditsiinis, kui ta avastas praeguseks tuntud embrüonaalse induktsiooni. Ta eksperimenteeris erinevate embrüo osadega, mis vastutavad erinevate kudede ja elundite arengu eest. 1928. aastal teostasid Spemann ja tema õpilane Hilde Mangold somaatiliste rakkude tuuma siirdamist, kasutades selleks kahepaiksete embrüoid. See oli üks esimesi samme kloonimise suunas. Dolly oli esimene imetaja, kelle kloonimine täiskasvanud rakust saavutas edu. Teda klooniti rakust, mis oli võetud ta bioloogilise ema udarast. Võetud emarakk viidi lamba munarakku ja sellest arenes välja embrüo. Dolly kloonimine oli väga väikese edukusega ühe viljastatud munaraku kohta. Tema kloonimisel kasutati 277 munarakku, millest 29 arenesid embrüoteks. Nendest sündis 3 lammast ja ainult üks jäi ellu. Kloonimine viidi läbi Šotimaal Roslini ülikoolis, kus lammas terve oma elu elas (1996–2003). Paljud teadlased arvavad, et Dolly suri kiirenenud vananemise tõttu. Spekuleeriti, et surm oli seotud lühenenud telomeeridega. Need on kompleksid, mis kaitsevad kromosoome kahjustuste eest. Ian Wilmut, kes viis Dolly kloonimist läbi, vaidleb sellele vastu. Tema arvates oli Dolly varajane surm seotud hingamisteede infektsiooniga. Arvatavasti tulenes see kloonimisprotsessi puudujääkidest. Dollyst on järel topis, mis seisab Edinburghi Kuninglikus muuseumis. Esimese imetaja kloonimine oli avalikkuses väga olulise tähtsusega. Dolly kloonimine näitas, et geneetiline materjal kindlast täiskasvanud rakust on võimeline ümber programmeeruma täiesti uueks organismiks. Inimese kloonimine tähendab olemasolevast või varem eksisteerinud inimesest geneetiliselt identse koopia loomist. Seda mõistet kasutatakse tavaliselt selleks, et määratleda inimese kunstlikku kloonimist. Loomuliku paljunemise ajal võib toimuda samuti kloonimine, selle tulemusena sünnivad identsed kaksikud. Eristatakse kahte inimkloonimist: üks on terapeutiline kloonimine ja teine reproduktiivne kloonimine. Teoreetiliselt on võimalik ka kolmas kloonimise variant, kus ühendatakse nii terapeutiline kui ka reproduktiivne kloonimine. Seda kutsutakse asenduskloonimiseks. See tähendaks ulatuslikult kahjustunud kehaosa asendamist, millele järgneks osaline või täielik ajusiirdamine. Erinevad inimkloonimise tüübid on tekitanud palju vaidlusi. Enamik teadus-, valitsus- ja usuorganisatsioone on rangelt reproduktiivse kloonimise vastu. Ameerika Ühendriikide teaduse edendamise liit (AAAS) ja paljud teised teadusühingud on teinud avaldusi, et inimese kloonimine tuleks keelustada seni, kuni on lahendatud kõik ohutuse probleemid. Samuti on räägitud probleemist, mis saab siis, kui tulevikus hakatakse kloonidelt eemaldama üksikuid elundeid. Alternatiivina on kaalutud mõtet hakata eraldi kasvatama elundeid, mille tulemusena ei tekiks eetilisi probleeme ega peaks kloonitud inimest kahjustama. Uuritakse ka võimalust, mille kohaselt inimesele bioloogiliselt vastuvõetavad elundid kasvatatakse mingi teise organismi, näiteks sea või lehma sees. Seejärel siiratakse valmis elund inimkehale. Esimene inimhübriidkloon loodi novembris 1998. Täiustatud rakutehnoloogia abiga (Advanced Cell Technology, ACT) eemaldati lehma munarakust DNA ja sinna siirati inimese jalast rakk. See hävitati 12 päeva pärast. Kuna normaalne embrüo siirdub oma kohale alles 14 päeva pärast, siis kokkuleppe järgi ei saa hävitatud embrüot vaadelda kui inimorganismi. 2008. aasta jaanuaris teatasid USA California osariigi teadlased Wood ja Andrew French, et on loonud viis esimest küpset embrüot, kasutades selleks täiskasvanud naharaku DNA-d. Nende eesmärk oli tagada elujõulised embrüonaalsed tüvirakud. Dr Samuel Wood ja tema kolleeg annetasid oma naharakud ning DNA nendelt rakkudelt oli siiratud inimese munarakku. Ei ole teada, kas nendel embrüotel oleks võimalik olnud edasi areneda tulevikus. Dr Wood selgitas, et võimaluse korral oleks see ebaeetiline ja illegaalne. Kõik 5 loodud embrüot hävitati. 22. juunil 2013 sündis Eesti Maaülikoolis transgeenne emane vasikas Juuni, kelle genoom sisaldas inimese kasvuhormooni geeni. Loodeti, et tulevikus hakkab lehm tootma oma piimas inimese kasvuhormooni. Maailmas on vaid mõni üksik lehmad, kelle piim sisaldab inimese valke, millest saab toota ravimeid. Transgeense tehnoloogia areng on farmaatsiatööstuses suureks läbimurdeks, kuna see võimaldab kvaliteetset ravimit toota odavamalt. Transgeenne lehmvasikas loodi Eesti Maaülikooli, Tartu Ülikooli ja Reproduktiivmeditsiini Tehnoloogiate Arenduskeskuse teadlaste koostöös. Sama aasta oktoobris suri vasikas ootamatult. Loomaarstid ei oska öelda, mis võis looma surma põhjuseks olla. Talle hakkas külge nakkushaigus. Eesti Maaülikooli teadusprorektor Ülle Jaakma sõnul võis surma põhjustada mittekloonitud loomadest nõrgem immuunsüsteem, mida on täheldatud kloonitud loomade esimestel elukuudel. Lisaks Juunile on Eestis ilmale tulnud kloonitud vasikas Augustiina, kes elas kolm aastat. Ta suri pullvasika sünnitamisel. Eesti kloonlehm on Tervisetehnoloogiate Arenduskeskuse alamprojekt, mida Ettevõtluse Arendamise Sihtasutus on rahastanud kuue miljoni euroga. Projekti alustati 2010. aastal. Inimese kloonimine on Eestis nagu ka mujal maailmas keelatud. Kloonimine esines aastal 2002. George Lucase filmis ''Tähtede sõda: osa II – Kloonide rünnak'', kus Jedimeister Obi-Wan Kenobi reisis Kaminle ja avastas sealt tohutu klooniarmee, mille oli tellinud jedi Sifo-Dyas Galaktika Vabariigile. Torreya (1942). Torrey Botanical Club: Volumes 42–45. United States of America: Torrey Botanical Club. Lk 133. R. Mikelsaar (juuli 2001). "Kloonimine avab uksed tulevikumeditsiini" (eesti keeles). Eesti Päevaleht. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) King M., Science //American Association for the Advancement of Science. 1903. Vol. 18. P. 502. Krens E.A., Molendijk L., Wullems G.I., Schilperoort R.A. In vitro Transformation of Plant Protoplasts with Ti-Plasmid DNA // Nature. 1982. Vol. 296. P. 72-74. Cheryl L. Patten; Glick, Bernard R.; Pasternak, Jack (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Washington, D.C: ASM Press. ISBN 1-55581-498-0.{{cite book}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Peter J. Russel (2005). iGenetics: A Molecular Approach. San Francisco, California, United States of America: Pearson Education. ISBN 0-8053-4665-1. Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S (märts 1989). "Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation". Mol. Gen. Genet. 216 (1): 175–7. DOI:10.1007/BF00332248. PMID 2659971.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Brown, Terry (2006). Gene cloning and DNA analysis: an introduction. Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 1-4051 -1121-6. McFarland, Douglas (2000). "Preparation of pure cell cultures by cloning". Methods in Cell Science. 22 (1): 63–66. DOI:10.1023/A:1009838416621. PMID 10650336. Saroj P. Mathupala and Andrew E. Sloan (aprill 2009). "An agarose-based cloning-ring anchoring method for isolation of viable cell clones" (inglise keeles). Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) Gideon, Gil (jaanuar 2008). "California biotech says it cloned a human embryo, but no stem cells produced". Boston Globe (inglise keeles). Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) N.Halim (september 2002). "Extensive new study shows abnormalities in cloned animals accessdate" (inglise keeles). MIT Tech Talk. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) K.E. Latham (2005). "Early and delayed aspects of nuclear reprogramming during cloning" (PDF) (inglise keeles). Biology of the Cell. Originaali (PDF) arhiivikoopia seisuga 2.08.2014. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) L J.Vorvick (2011). "Fetal development" (inglise keeles). MEDEX. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I (märts 1996). "Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line". Nature. 380 (6569): 64–6. DOI:10.1038/380064a0. PMID 8598906.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) K. E. Holsinger (2000). "Reproductive systems and evolution in vascular plants" (PDF) (inglise keeles). Originaali (PDF) arhiivikoopia seisuga 27.10.2011. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) T. Tammaru (juuni 2003). "Suguline sigimine on mõistatus evolutsiooniuurijaile" (eesti keeles). Eesti Loodus. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) Edward M. De Robertis (aprill 2006). "Explanation of the Spemann-Mangold experiment" (inglise keeles). Nature Reviews. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) Lassen, J., Gjerris, M., & Sandøe, P. (2005). After Dolly–Ethical limits to the use of biotechnology on farm animals. Elsevier, 65, 992–1004. Shiels PG, Kind AJ, Campbell KH. "Analysis of telomere length in Dolly, a sheep derived by nuclear transfer". 1 (inglise keeles). Cloning. Originaali arhiivikoopia seisuga 6.06.2020. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) CS1 hooldus: tundmatu keel (link) Shiels PG, Kind AJ, Campbell KH; et al. (1999). "Analysis of telomere lengths in cloned sheep". Nature. 399 (6734): 316–7. Bibcode:1999Natur.399..316H. DOI:10.1038/20580. PMID 10360570. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) National Museums Scotland. "Dolly the sheep" (inglise keeles). National Museums Scotland. Originaali arhiivikoopia seisuga 26.03.2013. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) NV. Thuan,S. Kishigami ,T. Wakayama (2010). "How to improve the success rate of mouse cloning technology" (inglise keeles). PubMed. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) CS1 hooldus: tundmatu keel (link) Pence, Gregory E. (1998). Who’s Afraid of Human Cloning?. Rowman & Littlefield. paperback ISBN 0-8476-8782-1 and hardcover ISBN 0-8476-8781-3. Advancing science serving society. "HUMAN CLONING DEBATE REIGNITES" (inglise keeles). AAAS home. Originaali arhiivikoopia seisuga 13.11.2013. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) G.McGee (oktoober 2011). "Primer on Ethics and Human Cloning" (inglise keeles). American Institute of Biological Sciences. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) BBC News (aprill 2010). "Details of hybrid clone revealed" (inglise keeles). Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) R.Weiss (jaanuar 2008). "Mature Human Embryos Created From Adult Skin Cells" (inglise keeles). Washington Post. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) M.Sander-Sõrmus (september 2013). "Juuni on esimene transgeenne kloonvasikas" (eesti keeles). Äripäev. Originaali arhiivikoopia seisuga 13.11.2013. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) K.Koppel (oktoober 2013). "Maaülikoolis kloonitud vasikas suri ootamatult" (eesti keeles). ERR uudised. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link) Villu Päärt (08.03.2017). "Kuhu jäi miljardikasumit lüpsev imelehm?". Eesti Ekspress. Vaadatud 14.03.2017. MEGA (august 2000). "Päevateema : Algab inimese kloonimine" (eesti keeles). Eesti Päevaleht. Originaali arhiivikoopia seisuga 13.11.2013. Vaadatud 8.10.2013.{{netiviide}}: CS1 hooldus: tundmatu keel (link)