Transformatsioon (geneetika)

Transformatsioon on muutus raku genoomis, mis juhtub vaba, valkude poolt sidumata eksogeense DNA sattumisest väliskeskkonnast läbi rakumembraani rakku, kus see raku enda geneetilise materjaliga liidetakse ja võõrgeeni ekspresseeritakse. Transformatsiooni esineb osal bakteriliikidest looduslikult, kuid seda kasutatakse ka laboratoorselt erinevate molekulaarsete tehnikate käigus. Transformatsioon on üks kolmest protsessist, mille abil bakterirakud geneetilist materjali vahetavad. Teisteks võimalusteks on konjugatsioon, mis esineb kahe bakteri otsesel kokkupuutel, ja transduktsioon, kus eksogeenne materjal viiakse bakterirakku bakteriofaagi abil. Baktereid, kes on võimelised transformeeruma, nimetatakse kompetentideks. Ka teisi rakke peale bakterite on võimalik transformeerida, näiteks taime- ja loomarakke, kuid eelistatum mõiste kirjeldamaks võõra DNA viimist eukarüootsesse rakku on transfektsioon. Loomarakkude puhul välditakse selle protsessi puhul transformatsiooni mõiste kasutamist, sest maliigse transformatsiooni all mõistetakse ka normaalsete rakkude muutumist pahaloomulisteks kasvajarakkudeks, millel pole seost rakuvälise geneetilise materjali sattumisega rakku. Esimesena demonstreeris transformatsiooni 1928. aastal briti bakterioloog Frederick Griffith, kes uuris kaht Streptococcus pneumoniae tüve. Kui Griffith süstis hiiri ohutu tüve (II-R) bakterite või kuumusega tapetud haigust tekitava tüve (III-S) bakteritega, jäid hiired ellu, kuid nende kahe kombinatsioon osutus hiirtele surmavaks. Surnud hiirte verest õnnestus tal isoleerida mõlema tüve elusaid rakke ning järeldas sellest, et mingi seaduspära järgi on võimalik ühe bakteritüve muundumine teiseks. Tema mõtet arendasid edasi Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty, kes tõestasid aastal 1944, et tegu on geneetilise materjali ülekandega. Kasutades samu tüvesid, isoleerisid nad virulentse tüve DNA ja näitasid, et selle viimisest II-R tüvesse piisab, et kahjutu tüvi samuti virulentseks muutuks, kummutades sellega tol ajal laialt levinud arusaama, et valgud on pärilikkust kandvaks materjaliks. DNA haaramist väliskeskkonnast rakku ja selle arvamist raku enese DNA hulka hakkasid nad nimetama transformatsiooniks. Algul suhtuti nende avastusse küll umbusuga, kuid geneetiliste markerite kasutuselevõtt Joshua Lederbergi avastused teiste geneetilise materjali ülekandeviiside osas (konjugatsioon 1947. ja transduktsioon 1953. aastal) veensid teaduskogukonda Avery tulemusi tunnustama. Siiski oldi üsna veendunud, et Escherichia coli ei ole transformatsioonialdis. Alles aastal 1970 näitasid Morton Mandel ja Akiko Higa, et kaltsiumkloriidi lahusega töötlemise tagajärjel on E. coli võimeline väliskeskkonnast ilma faagi abita bakteriofaagi DNA-d inkorporeerima. Paar aastat hiljem tõestasid Stanley Cohen, Annie Chang ja Leslie Hsu, et selline meetod on efektiivne ka plasmiidse DNA puhul. Mandeli ja Higa meetodit arendas hiljem edasi Douglas Hanahan. Kunstlikult tekitatud kompetentsus E. coli kui laialdaselt kasutatava mudelorganismi puhul pani aluse mugava ja efektiivse metoodika arendamisele bakterite transformeerimiseks, mis võimaldab biotehnoloogias ja teadustöös kasutada varasemast oluliselt lihtsamaid molekulaarse kloonimise võtteid. Praeguseks on transformatsiooni näol tegu igapäevase laboriprotseduuriga. Transformatsioon elektroporatsiooni teel arendati välja 1980. aastate lõpul, parandades in vitro transformatsiooni efektiivsust ja tekitades võimalusi enamate bakteritüvede transformatsiooniks. Uuriti ka taime- ja loomarakkude transformeerimise võimalusi, mis päädis esimese transgeense hiire loomisega aastal 1982, süstides hiire embrüosse geeni roti kasvuhormooni jaoks. 1970. aastate alguses avastati, et Ti-plasmiid Agrobacterium tumefaciens′i rakkudes on põhjuseks, miks bakter taimedele kasvajaid tekitab. Ti-plasmiid integreerub taime genoomi, kutsudes esile tuumorite teket. Asendades Ti-plasmiidis kasvajat tekitava geeni mõne muu geeniga, on võimalik A. tumefaciens’iga taimi nakatades viia kaheiduleheliste taimede genoomi valitud DNA. Üheiduleheliste ja mõningate teiste A. tumefaciens’i suhtes resistentsete taimede transformatsiooniks kasutatakse elektroporeerimist ning mikroinjektsiooni. Biolistilise meetodi ehk raku pommitamise geneetilise materjaliga kaetud metalliioonidega võttis 1990. aastal kasutusele John Stanford. Bakterite puhul mõistetakse transformatsiooni all püsivat muutust raku genoomis, mida on toonud kaasa vaba DNA haaramine väliskeskkonnast rakku ja kompetentsuse all peetakse silmas võimet vaba DNA-d rakuvälisest keskkonnast rakku võtta. Kompetentsus võib esineda nii looduslikult kui tekkida kunstlikult. Umbes 1% bakteriliikidest on loomulikult kompetentsed, olles võimelised laborikeskkonnas ilma lisatöötluseta vaba DNA-d oma rakku võtma. On alust arvata, et looduslikus keskkonnas on see protsent suurem. DNA kandumist ühelt bakterilt teisele nimetatakse horisontaalseks geeniülekandeks ehk geneetilise materjali saamiseks teiselt organismilt, olemata selle järglane. Lähedaste liikide vahel toimib transformatsioon paremini kui evolutsiooniliselt kaugemate liikide puhul. Looduslikult kompetentsetes bakterites on olemas geenikomplektid, mis kodeerivad DNA transmembraanseks transpordiks vajalikke valke, näiteks DNA translokaasi komplekse tsütoplasmamembraanis ja tüüp IV piilide kokkupanekuks tarvilikke valke. Tulenevalt grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite rakumembraani erinevustest esineb mõningaid erinevusi viisis, kuidas bakterid rakuvälist geneetilist materjali enda sisse toovad, kuid üldjoontes on protsess sarnane. Esmalt seondub DNA kompetentse raku pinnal paiknevale DNA-retseptorile ja liigub DNA translokaasi abil läbi rakumembraani. Selle käigus lagundatakse selle üks ahel nukleaaside poolt, kuna rakku pääseb vaid üheahelaline DNA. Sellist üheahelalist DNA-d on RecA ehk rekombinaas A abil võimalik genoomi integreerida. Gramnegatiivsed bakterid vajavad oma rakuseina mitmekihilise ehituse tõttu valgulist kanalit ka välismembraanis, mille moodustavad sekretiinid. Arvatakse ka, et oma roll on piliinil, kuid selle funktsiooni kohta pole veel kuigi palju teada. DNA transport rakku ei sõltu enamasti selle järjestusest, ent mõne liigi puhul võivad kindlad järjestused rakuvälises DNA-s seda soodustada. Kunstliku kompetentsuse tekitamiseks on kaks enamlevinud meetodit: elektroporatsioon ja rakkude manipuleerimine temperatuuri ning soolalahuse abil. Mõlemad neist muudavad rakumembraani DNA-le passiivselt läbitavaks looduses harilikult mitteilmnevate keskkonnategurite mõjul. Elektroporatsiooni käigus antakse bakterirakke sisaldavale lahusele, kuhu on lisatud soovitav plasmiid, elektrilöök, mis perforeerib rakumembraani, et plasmiidne DNA siseneda saaks. Pärast elektriväljale eksponeerumist parandavad bakteri kaitsemehhanismid rakumembraani defektid taas ära. Tegu on rakusõbralikuma meetodiga kui soolalahuse kasutamine, kuna rakud viibivad kahjustavates tingimustes palju lühemat aega. Kasutatava elektrivälja tugevus jääb tavaliselt vahemikku 10–20 kV/cm. Keemilisi kompetente hoitakse mõnda aega jää peal kahevalentsete katioonidega soolalahuses, enamasti kaltsiumkloriidi lahuses, misjärel vapustatakse neid kiire lühiajalise kuumutamisega. Arvatakse, et soolalahuse positiivsed ioonid aitavad bakteriraku negatiivse laenguga pinnamolekule neutraliseerida, muutes membraani negatiivselt laetud DNA jaoks paremini läbitavaks. Kuumašokk on vajalik selleks, et tekitada temperatuurierinevus raku sise- ja väliskeskkonnas, mis sunnib DNA läbi kahjustatud membraani rakku sisenema. DNA viimiseks taimedesse on mitmeid mehhanisme. Lihtsaim neist on transformatsioon Agrobacterium tumefaciens’i abil. Selleks lõigatakse taimekude, milleks tavaliselt on leht, väikesteks tükkideks ja leotatakse umbes kümme minutit Agrobacterium’i sisaldavas suspensioonis. Lõikepindade servmised rakud transformeeruvad bakteri mõjul Kui selliselt töödeldud koetükid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel üles kasvatada, saadakse geenmuundatud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele külvata. Paljusid taimeliike selle meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Suur osa taimedest on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembrüosse. Efektiivsus on sel meetodil küll madalam kui Agrobacterium’i kasutades, kuid sobivate taimeliikide valik on oluliselt laiem. Samuti on eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsioon, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule. Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete taimeviiruste abil, kuid siis pole tegemist transformatsiooni, vaid transduktsiooniga – rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal replitseerub tsütoplasmas, siis saab sel moel enamasti modifitseerida vaid üht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestatud geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised kromosoomidega rekombineeruma, tekitades taime genoomis püsivaid muutusi, mis kanduvad üle ka järglastele. DNA viimist loomsetesse rakkudesse nimetatakse harilikult transfektsiooniks. Ka sel puhul muudetakse rakusein erinevate võtete abil poorseks, et soovitud materjal rakku liikuda saaks. Transfektsioon ei tähenda ainult DNA viimist rakku, vaid ka siRNA konstruktsiooni või valgu (näiteks antikeha) rakku sisestamist. Transfekteerimiseks kasutatakse kaltsiumfosfaati, elektroporatsiooni või segatakse rakku viidav aine katioonsete lipiididega, moodustamaks liposoome, mis membraaniga ühinedes sisaldise rakku viivad. Kunstliku kompetentsuse tekitamine bakterites võimaldab DNA-ga ja valkude ekspressiooniga manipuleerida. Levinuimaks mudelorganismiks on Escherichia coli, mida enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku püsimajäämiseks olema oma replikatsiooni alguspunkt, et seda genoomist sõltumatult paljundada saaks. Transformatsiooni efektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d omastavad, mõõtühikuks on CFU/μg DNA kohta. CFU ehk colony forming unit väljendab eluvõimeliste rakkude hulka mingis koguses lahuses. Väikese plasmiidi, nagu pUC19 puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1×108 CFU/μg seda, et umbes üks plasmiid 2000 hulgast siseneb rakku. Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal külmas CaCl2 lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42 °C juures sõltuvalt metoodikast 30–120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks keskmiselt 106–107 transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib plasmiidse DNA puhul väga hästi, kuid ei sobi lineaarsete DNA-fragmentide puhul, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega. Transformatsiooni efektiivsus väheneb plasmiidi suuruse kasvades, mistõttu kasutatakse suuremate DNA-molekulide puhul elektroporatsiooni. Elektroporeeritavaid rakke on enne töötlust soovitatav pesta külma mitmekordselt destilleeritud veega, eemaldamaks laetud osakesi, mis protsessi käigus sädet anda võiksid. Transduktsioon Transfektsioon [Alberts, Bruce; et al. (2002). Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science. p. G:35. ISBN 9780815340720.]. [Lederberg, Joshua (1994). The Transformation of Genetics by DNA: An Anniversary Celebration of AVERY, MACLEOD and MCCARTY(1944) in Anecdotal, Historical and Critical Commentaries on Genetics. The Rockfeller University, New York, New York 10021-6399. PMID 8150273]. [Mandel, Morton; Higa, Akiko (1970). "Calcium-dependent bacteriophage DNA infection". Journal of Molecular Biology 53 (1): 159–162. doi:10.1016/0022-2836(70)90051-3. PMID 4922220]. [Cohen, Stanley; Chang, Annie and Hsu, Leslie (1972). "Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences 69 (8): 2110–4. doi:10.1073/pnas.69.8.2110. PMC 426879. PMID 4559594]. [Hanahan, D. (1983). "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids". Journal of molecular biology 166 (4): 557–580. doi:10.1016/S0022-2836(83)80284-8. PMID 6345791]. [Wirth, Reinhard; Friesenegger, Anita and Fiedlerand, Stefan (1989). "Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation"]. [Palmiter, Richard; Ralph L. Brinster, Robert E. Hammer, Myrna E. Trumbauer, Michael G. Rosenfeld, Neal C. Birnberg & Ronald M. Evans (1982). "Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein−growth hormone fusion genes". Nature 300 (5893): 611–5. doi:10.1038/300611a0. PMID 6958982]. [Nester, Eugene. "Agrobacterium: The Natural Genetic Engineer (100 Years Later)". Retrieved 14 January 2011]. [Zambryski, P.; Joos, H.; Genetello, C.; Leemans, J.; Montagu, M. V.; Schell, J. (1983). "Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity". The EMBO journal 2 (12): 2143–2150. PMC 555426. PMID 16453482]. [Peters, Pamela. "Transforming Plants – Basic Genetic Engineering Techniques". Retrieved 28 January 2010]. [Voiland, Michael; McCandless, Linda. "DEVELOPMENT OF THE "GENE GUN" AT CORNELL". Retrieved 28th january 2010.]. Horisontaalne geeniülekanne. [Chen I, Dubnau D (2004). "DNA uptake during bacterial transformation". Nat. Rev. Microbiol. 2 (3): 241–9. doi:10.1038/nrmicro844. PMID 15083159]. [Lacks, S.; Greenberg, B.; Neuberger, M. (1974). "Role of a Deoxyribonuclease in the Genetic Transformation of Diplococcus pneumoniae". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 71 (6): 2305–2309. PMC 388441. PMID 4152205]. [Long, C. D.; Tobiason, D. M.; Lazio, M. P.; Kline, K. A.; Seifert, H. S. (2003). "Low-Level Pilin Expression Allows for Substantial DNA Transformation Competence in Neisseria gonorrhoeae". Infection and immunity 71 (11): 6279–6291. PMC 219589. PMID 14573647]. [Sisco, K. L.; Smith, H. O. (1979). "Sequence-specific DNA uptake in Haemophilus transformation". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76 (2): 972–976. PMC 383110. PMID 311478. editFull text at PMC: / 383110]. [Large-volume transformation with high-throughput efficiency chemically competent cells. Focus 20:2]. [Transformation efficiency of "'E. coli'" electroporated with large plasmid DNA. Focus 20:3 (1998)].