DAPI

DAPI ehk 4′,6-diamidiino-2-fenüülindool on orgaaniline aine, mis seostub DNA-ga; tekkinud kompleks on fluorestseeruv nähtava valguse madalamate lainepikkuste juures. Seepärast leiab DAPI laialdast kasutust rakutuumade värvinguks fikseeritud rakkudes, näiteks histokeemias, voolutsütomeetrias ja mujal. DAPI võime läbida elujõuliste rakkude plasmamembraani on üsna piiratud, seepärast ei saa seda kasutada DNA värvinguks elusrakkudes. Pulbrilisel kujul müüakse DAPI-t enamasti soolana, kus orgaanilise aine aminorühmad esinevad positiivselt laetud ammooniumioonidena ning vastasioonideks on kas kloriid või laktaat. Aine molekulmass: 277 g/mol, vesinikkloriidhappe soola kujul (350 g/mol, CAS number 28718-90-3) või piimhappe- ehk laktaatsoola kujul (457 g/mol, CAS number 28718-91-4); Aine brutovalem: C16H15N5, vesinikkloriidhappe soola puhul C16H15N5 · 2 HCl ja laktaatsoola puhul C16H15N5 · 2 C3H6O3; Aine lahustuvus: vesinikkloriidhappe soolana vees ligi 20 mg/ml, dimetüülsulfoksiidis ligi 14 mg/ml; Spektraalomadused: kompleksis DNA-ga on ergastuse maksimum ligi 360 nm (lähi-ultraviolettkiirgus) ja emissiooni maksimum ligi 460 nm (sügav sinine nähtav valgus); fluorestsentsi kvantsaagise väärtus on 0,92 kompleksis DNA-ga ja 0,04 ilma DNA-ta; fluorestsentsi eluiga on DAPI kompleksis DNA-ga vahemikus 2,2-2,8 ns. DNA värvinguks kasutatakse suhteliselt madala kontsentratsiooniga DAPI lahuseid (suurusjärgus 0,1 μg/ml ehk ligi 300 nM). DAPI seostub DNA väikese vao (ingl k minor groove) adeniini (A) ja tümiini (T) poolest rikaste lõikudega. Lisaks seostub DAPI ka RNA-ga, kuid sel juhul toimub DAPi molekuli interkaleerumine ehk sisenemine adeniini (A) ja uratsiili (U) sisaldavatesse aladesse. Kuna aga DAPI ja RNA vahelise kompleksi fluorestsentsi kvantsaagis on oluliselt madalam, võrreldes DAPI ja DNA vahelise kompleksiga, siis on mõlemat tüüpi nukleiinhappeid sisaldavates süsteemides (nt fikseeritud rakkudes) DNA ja DAPI vaheline kompleks oluliselt paremini tuvastatav. DAPI-t kasutatakse laialdaselt rakutuumade asukoha ja suuruse visualiseerimiseks fluorestsentsmikroskoopias, kui vaadeldavas bioloogilises objektis on rakumembraanide läbitavus kunstlikult suurendatud (näiteks fikseerimise tulemusena). Samuti saab DAPI-t kasutada, tuvastamaks anomaalselt kõrge plasmamembraani läbilaskvuse/poorsusega rakkude populatsiooni (nt nekrootiliste või hilis-apoptootiliste rakkude puhul). Sellist lähenemine on rakendatav näiteks voolutsütomeetrilistes mõõtmistes. Samadeks või sarnasteks rakendusteks kasutatakse teisigi fluorestsentsvärve, näiteks Sytox Blue, Trypan Blue (trüpaansinine) ja propiidiumjodiid. Võrreldes Sytox Blue ja trüpaansinisega, on DAPI eeliseks signaali kõrge intensiivsus. Propiidiumjodiid omab aga väga laia ergastus- ja emissioonispektrit (maksimumid vastavalt 535 nm ja 617 nm juures), mis sageli ei võimalda paralleelselt tuumavärvinguga kasutada näiteks immuunvärvingut muude huvipakkuvate rakualade või valkude tuvastamiseks. Samuti kasutatakse DNA märgistamiseks ja rakutuumade visualiseerimiseks Hoechst-tüüpi fluorestsentsvärve (ergastus- ja emissioonimaksimumide lainepikkused väga sarnased DAPI omadele) ja nende derivaate, mille ergastus- ja emissioonimaksimum on nihutatud nähtava ala kõrgemate lainepikkuste juurde (nt SiR-DNA). Viimatimainitud fluorestsentsvärvid läbivad aga rakkude plasmamembraani ning on eeskätt kasutuses elusrakkude mikroskoopias. Samas on tähele pandud, et DNA-ga seonduvad fluorestsentsvärvid ei ole sobilikud kauakestvate mikroskoopiakatsete jaoks, kuivõrd need käivitavad DNA vigastuse parandusmehhanisme ja takistavad rakutsükli normaalset kulgu. Kapuscinski, J. (1995). "DAPI: a DNA-specific fluorescent probe". Biotechnic & Histochemistry: Official Publication of the Biological Stain Commission. 70 (5): 220–233. DOI:10.3109/10520299509108199. ISSN 1052-0295. PMID 8580206. Wallberg, Fredrik; Tenev, Tencho; Meier, Pascal (1. aprill 2016). "Analysis of Apoptosis and Necroptosis by Fluorescence-Activated Cell Sorting". Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4): pdb.prot087387. DOI:10.1101/pdb.prot087387. ISSN 1559-6095. PMID 27037070. Estandarte, Ana Katrina; Botchway, Stanley; Lynch, Christophe; Yusuf, Mohammed; Robinson, Ian (16. august 2016). "The use of DAPI fluorescence lifetime imaging for investigating chromatin condensation in human chromosomes". Scientific Reports (inglise). 6 (1): 31417. DOI:10.1038/srep31417. ISSN 2045-2322. Sigma Aldrich. "Product Information: DAPI" (PDF). sigmaaldrich.com. Vaadatud 02.02.2023. StemCell Technologies. "Dyes and Stains: DAPI (Hydrochloride)" (PDF). cdn.stemcell.com. Vaadatud 02.02.2023. Miltenyi Biotec (2020). "DAPI Staining Solution" (PDF). miltenyibiotec.com. Vaadatud 02.02.2023. Tanious, F. A.; Veal, J. M.; Buczak, H.; Ratmeyer, L. S.; Wilson, W. D. (31. märts 1992). "DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) binds differently to DNA and RNA: minor-groove binding at AT sites and intercalation at AU sites". Biochemistry. 31 (12): 3103–3112. DOI:10.1021/bi00127a010. ISSN 0006-2960. PMID 1372825. Katouzian-Safadi, M.; Cremet, J. Y.; Charlier, M. (1. veebruar 1989). "Limitation of DNA-4',6-diamidine-2-phenylindole assay in the presence of an excess of tRNA". Analytical Biochemistry. 176 (2): 416–419. DOI:10.1016/0003-2697(89)90334-5. ISSN 0003-2697. PMID 2662811. Elabscience. "High Affinity and Specificity Annexin V-APC/DAPI Apoptosis Kit E-CK-A258". www.elabscience.com. Vaadatud 2. veebruaril 2023. Strober, Warren (2015). "Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability". Current Protocols in Immunology (inglise). 111 (1). DOI:10.1002/0471142735.ima03bs111. ISSN 1934-3671. PMC 6716531. PMID 26529666.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link) "SYTOX™ Blue Dead Cell Stain, for flow cytometry". www.thermofisher.com (inglise). Vaadatud 2. veebruaril 2023. "Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water". www.thermofisher.com (inglise). Vaadatud 2. veebruaril 2023. Bucevičius, Jonas; Lukinavičius, Gražvydas; Gerasimaitė, Rūta (2018). "The Use of Hoechst Dyes for DNA Staining and Beyond". Chemosensors (inglise). 6 (2): 18. DOI:10.3390/chemosensors6020018. ISSN 2227-9040. Loeffler, D. A.; Keng, P. C.; Wilson, K. M.; Lord, E. M. (1987). "Comparison of fluorescence intensity of Hoechst 33342-stained EMT6 tumour cells and tumour-infiltrating host cells". British Journal of Cancer. 56 (5): 571–576. DOI:10.1038/bjc.1987.243. ISSN 0007-0920. PMC 2001896. PMID 2447928. Sen, Onur; Saurin, Adrian T.; Higgins, Jonathan M. G. (21. mai 2018). "The live cell DNA stain SiR-Hoechst induces DNA damage responses and impairs cell cycle progression". Scientific Reports (inglise). 8 (1): 7898. DOI:10.1038/s41598-018-26307-6. ISSN 2045-2322.