Ligeerimine

Ligeerimine on protsess, mille käigus kaks nukleiinhappejääki liituvad ensüümi kaasabiga. See on üheks põhialuseks molekulaarsele DNA kloonimisele, milles DNA fragmente liidetakse kokku, et luua rekombinantseid DNA molekule. Näiteks võõra DNA fragmendi sisestamine plasmiidi. DNA fragmendid liituvad fosfordiestersidemete abil, mis moodustuvad ühe DNA fragmendi 3'hüdroksüülotsa ja teise 5'fosfaatotsa vahel. RNA-d ligeeritakse samal põhimõttel. Reaktsiooni toimumiseks on tavaliselt vaja lisada kofaktorit, näiteks ATP või NAD+. Laboris kasutatakse ligeerimiseks enamasti T4 DNA ligaasi, kuigi ligeerimine ilma ligaasita on ka võimalik. DNA kontsentratsioon lahuses mõjutab ligeerimiskiirust ja seda, kas ligeerimine toimub molekuli sees või molekulide vahel. Ligeerimise käigus ühendatakse DNA otsad teiste DNA otsadega. Igal DNA fragmendil on kaks otsa ja kui nende otsad sobivad ühildumiseks, siis võib DNA fragment otsadega ühenduda, moodustades ringi. Suuremal DNA kontsentratsioonil on molekulidevaheline ligeerimine suurema tõenäosusega, väiksema DNA kontsentratsiooni juures on molekulidesisene ligeerimine tõenäolisem. Lineaarse DNA transformatsiooni kasutegur on palju madalam kui rõngja DNA puhul ning selleks, et saaks tekkida rõngjas DNA, ei tohiks DNA kontsentratsioon olla väga suur. Üldjuhul kasutatakse ligeerimise puhul DNA kontsentratsiooni, mis on võrdne või väiksem kui 10 μg/ml. DNA kontsentratsiooni saab kunstlikult tõsta, lisades kondenseeruvaid aineid, näiteks koobaltheksamiini, ja biogeenseid polüamiine, näiteks spermidiini, või aineid nagu polüetüleenglükool (PEG, PEO,POE), mis suurendavad ensüümide tõhusat kontsentreerumist. Lisaained, nagu koobaltheksamiin, suudavad esile kutsuda ainult molekulidevahelise ligeerimise, mille tagajärjel tekib lineaarne DNA jada. Siiski on rõngjas DNA tranformatsiooniks sobivam ja seetõttu püütakse vältida ligeerimisel lineaarse DNA loomist. Kui siiski on tarvis kasutada lisandeid plasmiidide ligeerimisel, siis on soovitatav kasutada PEG-i, sest see edendab nii molekulisisest kui ka molekulidevahelist ligeerimist. Mida suurem on ligaasi kontsentratsioon, seda kiiremini kulgeb ligeerimine. DNA tömpide otste ligeerimine ei ole nii tõhus kui DNA kleepuvate otste ligeerimine, seega kasutatakse DNA tömpide otste ligeerimisel suuremat ligaasi kontsentratsiooni. Kiire ligeerimise komplektides võib kasutada PEG-i kõrval suuremat DNA ligaasi kontsentratsiooni. Ligeerimise temperatuuri valikul tuleks tähelepanu pöörata järgmistele punktidel: optimaalne temperatuur DNA ligeerimiseks on 37 °C ning on oluline leida DNA otste sobiv sulamistemperatuur. Mida rohkem on guaniini (G) ja tsütosiini (C), seda kõrgem on sulamistemperatuur, sest G-C sideme vahel moodustub kolm vesiniksidet, adenosiini (A) ja tümiini (T) vahel aga kaks vesiniksidet. Ligeerimisreaktsiooni tõhusaks kulgemiseks on tarvis otsad stabiilselt lõõmutada. Ligeerimisel on enamasti otste sulamistemperatuur madalam kui 37 °C. Seega on optimaalne temperatuur kohesiooniliste otste ligeerimiseks kompromiss parima DNA ligeerimisaktiivsusega temperatuuri ja temperatuuri vahel, mille juures DNA otsad saavad liituda. DNA lõikamisel tekkivad otsad sõltuvad ensüümi valikust, see aga omakorda määrab ära, millise temperatuuri juures reaktsiooni läbi viia tuleb. Kuna iga ensüüm lõikab kindlat aluspaaride järjestust, tuleb eelnevalt uurida, milline ensüüm sobib ja milliseid tingimusi selleks kasutada tuleb. Seetõttu võib optimaalne ligeerimistemperatuur suuresti varieeruda. Ligeerides tuleb tihti ette, et samas reaktsioonis on vaja ligeerida palju otsi. Sellest tulenevalt ei valita igale reaktsioonile eraldi optimaalset temperatuuri, vaid pannakse sageli paika kindel temperatuur, mille juures kõik vajalikud ligeerimised (ehkki mõnevõrra erineva kiirusega) võiksid toimuda. Ligeerimisel kasutatud puhvri ioontugevusega saab mõjutada ligeerimist. Erinevad katioonid mõjutavad ligeerimist erinevalt, näiteks liiga suur hulk naatriumi ioone võib muuta DNA molekuli liiga jäigaks, mille tagajärjel suureneb tõenäosus, et ligeerimine toimub molekulide vahel, mitte molekuli enda sees. Kui monovalentsete katioonide kontsentratsioon on liiga suur (>200 mM), siis võib see ligeerimise täielikult blokeerida. Standardsed puhvrid, mida kasutatakse ligeerimisel, on kujundatud iooniliste mõjude minimeerimiseks. Piiravad ensüümid genereerivad erinevaid variante DNA otstest, mida nad läbi töötavad. Enamik ensüüme, mida kasutatakse kloonimisel, tekitab 4 aluspaari pikkuse üksikahelalise ülerippe, mida kutsutakse kleepuvaks. Erandiks on NdeI, mis genereerib 2 aluspaari pikkuse ülerippe. Need kleepuvad otsad saab kinnitada teistele sobivatele otsadele ning need otsad ligeeruvad kleepuv-otste meetodil. EcoRI genereerib AATT otsa. A-T vahel on kaks vesiniksidet ja nende sulamistemperatuur on madalam kui G-C vahel, jäädes umbes 6 °C juurde. Enamiku piiravate ensüümide genereeritavate ülerippuvate otste sulamistemperatuur on 15 °C lähiümbruses. Sellest tulenevalt praktiseeritakse kleepuvate otstega ligeerimist 14–16 °C, toatemperatuuril või 4 °C juures pikemal perioodil. DNA fragmendi paigutamisel vektorisse on soovitatav kasutada kahte piiravat ensüümi DNA läbitöötamiseks, et genereeritaks erinevad otsad. Need erinevad otsad võivad takistada ligeerimise tagasipöördumist otste vahel vektori lisapaaride lisamiseta. See aitab ka fragmente sisestada rohkem suunatud viisil. Kui ei ole võimalik kasutada kahte piirkonda, siis võib olla tarvilik DNA vektori defosforüleerimine, et vältida olukorda, kus vektor DNA on rõngastunud ilma lisaaluspaarideta. Selleks kasutatakse tavaliselt CIAP-i (calf-intestinal alkaline phosphatase), mis eemaldab töödeldavalt DNA-lt fosfaatrühma 5'otsalt. Siinkohal tuleks mainida, et CIAP ei ole reaktsioonis kergesti väljalülitatav ja võib segada ligeerimist, kui ei võeta täiendavaid samme CIAP eemaldamiseks. CIAP-i ei tohiks kasutada liiga suurtes kogustes ning seda peaks kasutama ainult siis, kui see on tarvilik. SAP (shrimp alkaline phosphatase) või AP (Antarctic phosphatase) on sobivad alternatiivid, sest need on hõlpsalt deaktiveeritavad. Tömp-ots ligeerimisel ei ole DNA-l väljaulatuvaid otsi, seega saab igat tömpi otsa teise tömbi otsaga ligeerida. Tömpe otsi saab genereerida selliste piiravate ensüümidega, nagu Smal ja EcoRV. Tömpide otstega ligeerimine pole nii efektiivne kui kleepuvate otstega ligeerimine, toimudes tüüpiliselt sada korda aeglasemalt. Tömpidel otsadel puuduvad väljaulatuvad otsad, mis tähendab, et ligeerimine sõltub suvalistest kokkupõrgetest tömpide otste vahel – järelikult on see väiksema tõhususega. Madalama tootlikkuse kompenseerimiseks on tömpide otsadega ligeerimisel ligaasi kontsentratsioon suurem kui kleepuvate otste ligeerimisel (vähemalt kümme korda). Ka DNA kontsentratsioon on tömbi otsa ligeerimisel suurem, et suurendada tõenäosust otstevahelisteks kokkupõrgeteks. Tömp-ots ligeerimisel võib kasutada ka pikemat inkubatsiooniaega. Kui DNA fragmenti vastuvõtval vektoril on mõlemad otsad tömbid, siis on vaja vektor defosforüleerida, et tagada võimalikult väike enesega ligeerimine. Seda on võimalik saavutada, kasutades CIAP-i, kuid CIAP-i kasutamisel on tarvilik eespool mainitud ettevaatlikkus. Kuna vektor on defosforüleeritud ja ligeerimiseks on tarvis 5'fosfaadi olemasolu, siis peavad lisatava fragmendi otsad olema fosforüleeritud. Tömp-ots polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) saadusest tavaliselt puudub 5'fosfaat. Seetõttu on tarvis see T4 polünukleotiid kinaasi käigus fosforüleerida. Tömp-ots ligeerimine on pöördeliselt aeglustatav suure kontsentratsiooni ATP-ga. Polümeraasi ahelreaktsiooni käigus loodud DNA fragment on tömbi otsaga ja seda on võimalik ligeerida tömbi otsaga vektorile. Taq-polümeraasi käigus on võimalik lisada ekstra adeniin (A) PCR saaduse 3'otsale. Seda on võimalik ära kasutada TA kloonimisel, kus PCR käigus loodud adeniini (A) otsad on võimalik kinnitada tümiini (T) otsale vektoris. TA ligeerimine on seetõttu üks kleepuva otsa ligeerimise alatüübist. Tömpide otstega vektorid on võimalik muuta TA ligeerimise vektoriks, kasutades dideoksütümidiin trifosfaati (ddTTP) lõpetavat transferaasi. Joseph Sambrook, David Russell. "Chapter 1: Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning". Molecular Cloning – A Laboratory Manual. Kd 1 (3rd ed.). Lk 1.20–1.21. ISBN 978-0-87969-577-4. J R Rusche and P Howard-Flanders (25.03.1985). "Hexamine cobalt chloride promotes intermolecular ligation of blunt end DNA fragments by T4 DNA ligase". Nucleic Acids Research. 13 (6): 1997–2008. PMC 341130. PMID 4000951. Zimmerman SB, Pheiffer BH (1983). "Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli". Proceedings of National Academy of Sciences, U S A. 80 (19): 5852–6. PMC 390173. PMID 6351067. James R. Rusche and Paul Howard-Flanders (25.03.1985). "Hexamine cobalt chloride promotes intermolecular ligation of blunt end DNA fragments by T4 DNA ligase". Nucleic Acids Research. 13 (6): 1997–2008. PMC 341130. PMID 4000951. K Hayashi, M Nakazawa, Y Ishizaki, N Hiraoka, and A Obayashi (10.10.1986). "Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol". Nucleic Acids Research. 14 (19): 7617–7631. PMC 311784. PMID 3022231.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) "FAQ". NEB. "Quick Ligation Kit" (PDF). NEB. Originaali (PDF) arhiivikoopia seisuga 21. oktoober 2013. Vaadatud 21. oktoobril 2013. Robert W. Old, Sandy B. Primrose. Principle of Gene Manipulation – An Introduction to Genetic Engineering (5th ed.). Blackwell Scientific. Lk 36. ISBN 9780632037124. L Ferretti and V Sgaramella (10.01.1981). "Temperature dependence of the joining by T4 DNA ligase of termini produced by type II restriction endonucleases". Nucleic Acids Research. 9 (1): 85–93. PMC 326670. PMID 6259621. Dugaiczyk A, Boyer HW, Goodman HM (25.07.1975). "Ligation of EcoRI endonuclease-generated DNA fragments into linear and circular structures". Journal of Molecular Biology. 96 (1): 171–84. PMID 169355.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) Raae AJ, Kleppe RK, Kleppe K. (15.12.1975). "Kinetics and effect of salts and polyamines on T4 polynucleotide ligase". European Journal of Biochemistry. 60 (2): 437–43. PMID 173544.{{cite journal}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link) G. Lucotte, F. Baneyx (1993). Introduction to Molecular Cloning Techniques. Wiley-Blackwell. Lk 156. ISBN 978-0471188490. Janet E. Mertz and Ronald W. Davis (1972). "Cleavage of DNA by R1 Restriction Endonuclease Generates Cohesive Ends". Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 69 (11): 3370–3374. PMC 389773. PMID 4343968. "Cloning Guide". New England Biolabs Inc. L Ferretti and V Sgaramella (11.08.1981). "Specific and reversible inhibition of the blunt end joining activity of the T4 DNA ligase". Nucleic Acids Research. 9 (15): 3695–3705. PMC 327385. PMID 6269089.