Rakuvaba DNA

Rakuvaba DNA (cell free DNA/cfDNA) on DNA, mis ringleb vabalt veres. Päritoluks on surnud rakkude DNA, mis on sattunud vereringesse ja mis seal lagundatakse. Veres ringleva rakuvaba DNA (cfDNA) avastuseni jõudsid Mandel ja Metais juba 1948. aastal. On leitud, et cfDNA-d võib leida nii tervete, rasedate kui ka vähki põdevate inimeste vereringest. Suurem osa veres olevast DNA-st arvatakse pärinevat tuumaga vererakkudest ning on verest kättesaadav. Terve inimese rakuvaba DNA hulk kasvab intensiivse treeningu, maratoni ja jõutõstmise tagajärjel. Päevas surevad tavalisel inimesel miljonid keharakud, mis lagundatakse meie kehas. Erinevalt apoptootilistest rakkudest, ei lagundata nekrootilisi rakke fagotsütoosiga ja sellest tulenevalt võib seda kergemini leida vereringest. Vereringes olevat DNA-d leidub organismis piisavas koguses diagnostilisteks analüüsideks ning seda on võimalik leida lisaks verele ka teistest kehavedelikest, näiteks uriinist. CfDNA-l põhinev mitteinvasiivne diagnostiline meetod on loonud uusi võimalusi nii vähiravis kui ka südame veresoonkonna haiguste ja loote kromosomaalsete anomaaliate tuvastamiseks. Rakuvaba DNA päritolu pole veel täpselt teada, kuid arvatakse, et see pärineb platsenta apoptootilistest rakkudest. Mitteinvasiivse rakuvaba DNA uuringut lootekandja verest on võimalik teostada alates 9.–10. rasedusnädalast. Sellisel viisil on võimalik tuvastada põhilisi trisoomiaid, kõige sagedamini 21., 18. ja 13. kromosoomi triploidiaid, ja sugukromosoomide aneuploidiaid nt xxy, xxx jne. Samuti on võimalik sellisel viisil kindlaks teha loote sugu. 10.–20. rasedusnädalal on ema veres ringlevast rakuvabast DNA-st loote päritolu keskmiselt 11–13,4%. See erineb suuresti patsientidel. Loote rakuvaba DNA on juppidena ja liigub ema verre, jättes maha platsenta mikroosakesi. Kuna loote cfDNA on märgatavalt väiksem ema DNA-st, siis paljud protokollid eraldavad loote ja ema cfDNA-d suuruse järgi. Loote rakuvabal DNA-l põhineva testi valepositiivsete ja -negatiivsete määr on alla 1% ning sellega invasiivsete protseduuride osakaal väheneks. Kuid sellel on ka negatiivseid külgi, nt mõjutavad testi raseda ülekaal või vale verekogumismetoodika. Samuti ei saa testida kõiki kromosomaalseid nihkeid ning test ei tee vahet, kas kromosoomipatoloogia esineb emal või lootel. Uuring ei soovitata kaksik- või kolmikraseduse puhul, kuna sellistel juhtudel on rakuvaba DNA hulk veres suurem ja test võib anda vale tulemuse. Invasiivsete meetoditega on võimalik kindlaks teha rohkemaid kõrvalekaldeid kui cfDNA-ga ning trisoomiad ei võta kokku kogu kõrvalekallete võimalusi populatsioonis. Naised, kes tahaksid täpsemat analüüsi, peaksid kaaluma kogu karüotüübi analüüse. Kuigi cfDNA on väga tundlik meetod ja sellega on võimalik tuvastada eesmärgiks seatud aneuploidiaid, siis ei suuda test tuvastada väiksemaid punktmutatsioone. Ka Eestis on võimalik tellida alates 2014. aastast rasedal endale vastav uuring. Eestis tehakse seda alates 12. rasedusnädalast. Eestis pole see uuring lisatud Eesti Haigekassa tervishoiu teenuste loetellu, seega saab testi tellida vaid ise selle eest tasudes. Veel on võimalik cfDNA-ga tuvastada preeklampsiat, mis on rasedusaegne haigus. See võib põhjustada mitmeid probleeme, nagu enneaegne sünnitus, lihasdüstroofiat ja palju teisi rasedusega seotud haigusi, isegi surma. Preeklampsia on enamesinev rasedusaegne haigus, hõlmates 2–10% rasedustest. Reaal-aja PCR (polümeraas ahelreaktsioon) tehti SRY geeni ja DYS14 markeri praimeritega, kasutades selleks ema vereplasmat. Kui mõlemad testid, nii DRY kui ka DYS14 on positiivsed, on loode meessoost. Negatiivse tulemuse korral kasutatakse loote DNA olemasolu kindlakstegemiseks vanemate veregrupi analüüsi või deletsioonide polümorfismi. Ainult pärast loote cfDNA olemasolu kindlaks tegemist, võib väita, et tegemist on naissoost lootega. On leitud, et vabalt oleva kasvaja cfDNA allikaks on kasvajarakkude hävinemine nekroosi või lüüsimise tulemusel. CfDNA on biomarkeriks vähi diagnoosimisel. Uurides cfDNA-d on võimalik tuvastada vähki juba väga varajases staadiumis, samuti on täheldatud, et cfDNA hulk kasvab vähi staadiumi kasvades. CfDNA abil suudetakse kiiremini selgeks teha vähirakkude geneetilisi muutusi ja valida sobivaim raviviis patsiendile. See on üsna kiire viis detekteerida selliseid anomaaliaid. CfDNA poolestusaeg (aeg mis kulub DNA kontsentratsiooni vähenemisele poole võrra) on umbes 2 tundi ja cfDNA kontsentratsioon võib veres muutuda mõne päeva kuni mõne kuuga. Kuna cfDNA on spetsiifiline patsiendile, saab seda võrrelda patsiendi DNA-ga ja teha kindlaks vähile iseloomulikud mutatsioonid, nagu näiteks punktmutatsioonid ja ümberpaigutused DNA-s. Mutantsete alleelide võrdlemisel normaalsete rakkude geenidega, aitab vähendada invasiivsete protseduuride osakaalu, eriti prognoosimisel ja kasvaja jälgimisel. CfDNA järjestused on umbes 170 bp pikad ja kaovad kiiresti pärast edukat kasvaja ravimist. CfDNA-l põhinevad uuringud võimaldaks vähiga võitlevatel patsientidel keemiaravi osakaalu vähendada. CfDNA analüüsimine nõuab väga tundlikke tehnikaid, kuna vähi/loote cfDNA kontsentratsioon veres on väga väike. Klassikalised meetodid rakuvaba DNA uurimiseks on reaal-ajas PCR (polümeraasi ahelreaktsioon), fluorestseeruvad ja spektrofotomeetrilised võimalused, samuti ka digitaalsed võimalused nagu digitaalne PCR koos erinevate süsteemide ja programmidega. Digitaalne karüotüüp aitab leida eelnevalt mitteteada olevaid kromosomaalseid muutusi ja genoomiväliseid järjestusi eriti vähi puhul. CfDNA isoleerimiseks mõeldud protokollid näevad ette kogutud vere tsentrifugeerimist, sealhulgas ka mikrotsentrifugeerimist, millele järgneb isolatsioon ja cfDNA puhastamine. Plasma filtreeritakse läbi 0,2-mikromeetrise filtri, et eemaldada rakke, mis on pärast esmast töötlemist plasmasse jäänud. Erinevus filtreeritud ja filtreerimata cfDNA vahel on saadud DNA koguses. Filtreerimata plasmas on rohkem DNA-d, seal esineb ka DNA, mis oli rakkudes, mis jäid plasmasse. Uuesti tsentrifugeeritud plasma kogutakse puhastamiseks ning seejärel tehakse PCR analüüs. Praegused protseduurid cfDNA puhastamiseks vereplasmast eeldavad erinevaid DNA-järjestusi kasutades PCR-i. Kahjuks on sellel mitu piirangut: esiteks DNA isolatsiooni meetodid vajavad suurel hulgal vereproove. Teiseks on DNA isolatsioon ajakulukas ja see suurendab saastumise ohtu. Ained, mida kasutatakse proovide puhastamiseks, võivad sisaldada PCR inhibiitoreid, mis minimeerib proovi õigsust ja võib viia vale tulemuseni. Selleks, et neid probleeme vähendada, eemaldatakse plasmast valgud. Reaalaja PCR meetodis kasutatakse fluorestseeruvaid osakesi, et monitoorida PCR-il kogutud materjali. Reaalaja PCR-i protokoll on disainitud detekteerima mingit kindlat mutatsiooni ja need protokollid erinevad vähemal või suuremal määral. Realaja PCR loeb pärast igat paljundamist kokku mitu molekuli suudeti tekitada. Punktmutatsioone analüüsitakse kvantitatiivse realaja PCR-iga, kasutades alleel spetsiifilisi praimereid. Mass-spektromeetrias eraldatakse ioonid vastavalt nende massi ja laengu suhtest. Enim kasutatakse MALDI-TOF-spektromeetriat, kus osakesed eraldatakse nende lennuaja järgi maatriksis, mis võimaldab eraldada võõr-cfDNAd tavalisest molekuli täpsusega. Esiteks viiakse DNA-ga läbi PCR ja seejärel otsitakse kolmanda praimeriga üles muteeruv ala. Digitaalne PCR on mikrojoaga seadeldis, milles on võimalik teostada paralleelselt analüüsi ühes PCR-i tsüklis. Digitaalne PCR suudab teha vahet tavalise vereplasma ja võõr-DNA vahel, mõõtes mitmetasandiliselt. Mandel, P., Metais, P. 1948, "Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme", C. R. Acad. Sci., vol. 142, pp. 241–243. Breitbach, S., Tug, S., Helmig, S., Zahn, D., Kubiak, T., Michal, M., Gori, T., Ehlert, T., Beiter, T. 2014, "Direct Quantification of Cell-Free, Circulating DNA from Unpurified Plasma". Rogers, J.C., Boldt, D., Kornfeld, S., Skinner, A., Valeri, C.R. 1972, "Excretion of deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 69, no. 7, pp. 1685–1689. Gravina, S., Sedivy, J.M., Vijg, J. 2016, "The dark side of circulating nucleic acids" Botezatu, I., Serdyuk, O., Potapova, G., Shelepov, V., Alechina, R., Molyaka, Y., Ananev, V., Bazin, I., Garin, A., Narimanov, M., Knysh, V., Melkonyan, H., Umansky, S., Lichtenstein, A. 2000, "Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism", Clinical chemistry, vol. 46, no. 8 Pt 1, pp. 1078–1084 Rudin, C.M., Thompson, C.B. 1997, "Apoptosis and disease: regulation and clinical relevance of programmed cell death", Annual Review of Medicine, vol. 48, pp. 267–281. Cell-free DNA vs sequential screening for the detection of fetal chromosomal abnormalities[alaline kõdulink],american jurnalof obsterics and genecology, juuni 2016 Prenatal cell-free DNA (cfDNA) Screening, genetic support foundation Cell-free DNA Analysis for Noninvasive Examination of Trisomy, aprill 2015, The new england journal of medicine Smets, E. M.; Visser, A.; Go, A. T.; van Vugt, J. M.; Oudejans, C. B. 2006, "Novel biomarkers in preeclampsia". Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry 364 vol. 1,pp. 22–32. Li, Y., et al. 2004, "Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready de-tection of fetal DNA polymorphisms". Clinical Chemistry vol. 50 no. 6, pp. 1002–1011. Li, Y., et al. 2005, "Detection of paternally inherited fetal point mutations for beta-thalassemia using size-fractionated cell-free DNA in maternal plasma". The Journal of the American Medical Association vol. 293, no. 7, pp. 843–849. Sünnieelse diagnostika uued võimalused: mitteinvasiinve sünnieelne loote DNA uuring ehk NIPT, jaanuar 2014, Tartu ülikooli kliinikumi leht Wright, C. F.; Burton, H. 2009,"The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis". Human Reproduction Update vol. 15, no.1, pp. 139–151. Scheffer, P. G., et al. 2010, "Reliability of fetal sex determination using maternal plasma". Obstetrics and Gynecology vol. 115, no.1, pp. 117–126. Burke, E. 2014, "Circulating tumor DNA: A new generation of cancer biomarkers" Circulating, Cell-Free DNA, Swift biosciences Kelly, J.C. 2014, "ctDNA 'Liquid Biopsy' Could Revolutionize Cancer Care" [1] Qin, Z, Ljubimov, V. A., Zhou, C., Tong, Y., Liang, J. 2016, "Cell-free circulating tumor DNA in cancer". Chinese Journal of Cancer no. 35, pp. 36 Chiu, R. W., et al. 2001, "Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma". Clinical Chemistry vol. 47, no.9, pp. 1607–1613. Breitbach, S., Tug, S., Helmig, S.S., Zahn, D., Kubiak, T., Michal, M., Gori, T., Ehlert, T., Beiter, T., Simon, P. 2014,"Direct Quantification of Cell-Free, Circulating DNA from Unpurified Plasma" Plos One no.9 [2] Guibert, J., et al. 2003, "Kinetics of SRY gene appearance in maternal serum: detection by real time PCR in early pregnancy after assisted reproductive technique". Human Reproduction vol. 18, no. 8, pp. 1733–1736. Ding, C. 2008, "Maldi-TOF mass spectrometry for analyzing cell-free fetal DNA in maternal plasma". Methods in Molecular Biology no. 444, pp. 253–267 Zimmermann, B. G., et al. 2008, "Digital PCR: a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis?". Prenatal Diagnosis vol. 28, no. 12, pp. 1087–1093.