Polümeraasi ahelreaktsioon

Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR (lühend ingliskeelsest vastest polymerase chain reaction) on meetod DNA või RNA järjestuse amplifikatsiooniks ehk kordistamiseks. PCR-meetod võimaldab väga väikesest DNA lõigust luua miljoneid koopiaid. PCR metoodika töötas 1983. aastal välja Kary Mullis, kes 1993. aastal sai koos Michael Smithiga selle eest Nobeli keemiaauhinna. PCR metoodika võimaldab in vitro paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset DNA polümeraasi. Esimene termostabiilne DNA polümeraas (Taq polümeraas), mida kasutati PCR-i läbiviimiseks, isoleeriti termofiilsest bakterist Thermus aquaticus. Taq polümeraas on monosubühikuline ensüüm, millel puudub replikatsioonivigu parandav 3’-5’eksonukleaasne aktiivsus. Seetõttu on Taq polümeraasi poolt läbiviidav DNA süntees küllaltki vigaderohke. Selleks, et amplifitseerida kindlat DNA järjestust, peab vähemalt osaliselt teadma uuritava DNA nukleotiidset järjestust. Uuritava DNA regiooniga külgnevatele järjestustele sünteesitakse komplementaarselt kaks lühikest, üksikahelalist DNA fragmenti ehk praimerit, millest üks on komplementaarne kodeeriva ahelaga, teine matriitsahelaga. PCR-reaktsioon toimub kolmes etapis: 1. DNA ahelate denatureerimine. Kui DNA on rakust eraldatud ja puhastatud, võib alustada PCR-analüüsi. PCR-i puhul on võimalik kasutada ka puhastamata DNA-d, kuid see on ebaefektiivne. DNA denatureerimiseks kuumutatakse DNA-d 90–95 °C juures, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks. See on vajalik huvipakkuvate fragmentide paljundamiseks. Süntees saab toimuda vaid üksikahelalt. DNA denatureerumine toimub järskude etappidena väga kindlatel temperatuuridel. DNA denatureerimistemperatuuri nimetatakse DNA sulamistemperatuuriks. Mida suurem on G-C paaride sisaldus võrreldes A-T paaridega, seda kõrgem on sulamistemperatuur. PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel pool sünteesitavat piirkonda. Külgnevate järjestuste järgi on sünteesitud komplementaarsed praimerid, tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda. 2. Praimerite seondumine DNA ahelatega. Praimerite seondumine ehk annealing toimub 50–70 °C juures. Selleks, et kinnitustemperatuur mõistlik oleks, tulebki praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused. Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. Praimerite G-C sisaldus on ka oluline – see peaks jääma 50–55% ulatusse, väiksema sisalduse korral tuleb praimereid pikendada. 3. DNA süntees. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3’ otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72 °C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq polümeraasi. Neid tsükleid korratakse 20–30 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. Juhul kui amplifitseeritakse otse rakkudest pärit DNA-d või kui kasutatava DNA polümeraasi aktivatsiooniks on vajalik eelnev temperatuuri tõstmine, eelkuumutatakse PCR segu ligikaudu 10 minutit 96 °C juures. Samuti on soovitatav kasutada pärast PCR tsüklite lõpetamist DNA sünteesi lisaetappi 10 minutit 72 °C juures. Lisasüntees on vajalik selleks, et Taq DNA polümeraas saaks lõpuni sünteesida kõik seni DNA sünteesil üksikahelaliseks jäänud DNA otsad. DNA sünteesi kiiruseks arvestatakse PCR programmis keskmiselt 1000 aluspaari minutis. Teise PCR tsükliga tekib kaks DNA molekuli, mille ühes otsas on märklaudjärjestuse pikkused ja teises otsas 3 üleulatuvat üksikahelalist ala. PCR kolmandas tsüklis tekib DNA fragmente, mis sisaldavad ainult märklaudjärjestusi. Selliste DNA fragmentide osakaal hakkab järgnevate tsüklite jooksul eksponentsiaalselt kasvama, jõudes 30 tsükli järel 1 073 741 766 molekulini. Pikemate PCR fragmentide hulk on 30 tsükli lõppedes vaid 60 molekuli. See arvutuskäik on teoreetiline ja kehtib vaid juhul, kui PCR reaktsioon on alustatud ühe DNA molekuliga ja kui DNA polümeraasi reaktsioon iga PCR tsükli jooksul on täielikult toimunud. Termotsükler ehk PCR-masin on polümeraasi ahelreaktsiooniks vajalik aparatuur, mis sisaldab reaktsioonituubide hoidjat ja programmi, mis automatiseerib tuubide aluse kuumutamise kindlal temperatuuril kindlate ajavahemike kaupa. Tänapäevaks on loodud PCR-masinad, mis detekteerivad amplikonide tekkimist reaalajas ning suudavad analüüsida mRNA pealt sünteesitud DNA kogust ja geenide ekspressiooni taset. See kõik on võimalik fluorestseeruvate märgiste abil, mille olemasolu detekteeritakse fotodetektoritega, mis on ühenduses PCR masinaga. PCR reaktsioone võib olla erinevaid ning selle tagab temperatuuri, praimerite kasutuse, tsüklite ja reaktsiooni arvu muutmise võimalus. Amplifitseeritud piirkondade pikkust määratakse, nagu klassikalise DNA analüüsi puhulgi, geelelektroforeesil. PCR produktid kantakse geeli kaevudesse ning eraldi foreesirajale pikkusmarker (juba teadaolevate pikkustega DNA lõikude segu). Forees viiakse läbi 150 V juures 30 minuti vältel. PCR-saadused visualiseeritakse arvutijuhitavate laseritega ja tulemused esitatakse graafikuna. Üheks PCR-meetodi eeliseks on selle kiirus ja kasutamise lihtsus. Ühe fragmendi amplifitseerimiseks piisavas koguses kulub vaid 2–3 tundi ning lihtsuse tagab protseduuri automatiseeritus. Kiirust lisab ka see, et ühe PCR protseduuri käigus on erinevates tuubides võimalik korraga töödelda 4–6 erinevat piirkonda. Tähtsaks eeliseks on PCR analüüsi suur tundlikkus – kui klassikalise DNA analüüsi jaoks läheb vaja vähemalt 20 ng puhastatud DNA-d, piisab PCR-i puhul ühest nanogrammist ning protseduur võib isegi õnnestuda vaid ühe raku olemasolul. Samuti ei ole PCR-i puhul DNA puhtus nii oluline kui klassikalise analüüsi korral. Restriktaase, mille tööd DNA saastatus mõjutada võib, ei kasutata ning elektroforeesifragmendid on PCR-i käigus juba sünteesitud ja seega lisaaineteta. Puuduseks on esiteks vajadus teada DNA täpseid järjestusi, mille alusel sünteesida praimerid. Lisaks ka asjaolu, et piirkonnad on lühikesed, mistõttu näiteks isikute tuvastamisel või isadustestis on juhuslik kokkulangevus tõenäolisem. DNA sünteesimise käigus võib tekkida ka vigu, sest ei ole vajalikke kontrollmehhanisme, mis eksisteerivad loodusliku replikatsiooni puhul. Haiguste diagnostikas mängib olulist rolli PCR-i võime analüüsida väga väikest kogust DNA-d. Üheks tähtsaks PCR-i kasutusalaks on võimaliku AIDS-i nakatumise diagnoosimine väga varajases staadiumis juba enne antikehade teket. See on eriti oluline viiruste pikaajalise peiteaja tõttu. Tänu PCR-ile saab leukotsüütidest isoleeritud HIV nakkust tõestavat DNA fragmenti paljundada, kuni on saadud analüüsiks piisav kogus materjali. PCR-i saab kasutada ka preimplantatsioon-diagnostiliselt näiteks tsüstilise fibroosi tuvastamiseks. Testimiseks isoleeritakse in vitro tekkinud kaheksarakulisest embrüost üks rakk. Sellest ekstraheeritakse DNA ning amplifitseeritakse praimeritega piiritletud fragmenti (tsüstilist fibroosi põhjustav järjestus DNA-s on teada). Saadud fragmente analüüsitakse elektrofereesil. Implatsiooniks kasutatakse vaid haigusevaba embrüot. PCR aitab identifitseerida kultiveerimatuid või aeglaselt kasvavaid mikroorganisme, nagu näiteks mükobaktereid või anaeroobseid baktereid, keda on laboritingimustes keeruline kasvatada. PCR-i kasutatakse alates analüüsi ja sellega seotud meetodite väljatöötamisest kuni tänapäevani ja edaspidigi: kliinilises meditsiinis a) muteerunud geenide uurimisel, b) genoomide sekveneerimisel, c) haiguslike seisundite (DNA-viirused, RNA-viirused, hea- ning pahaloomulised kasvajad jne) uurimisel ning eristusdiagnoosi komplekteerimisel d) uute ravimite väljatöötamisel ning laboratoorsetel ning kliinilstel katsetel jne. kriminalistikas – "geneetilise sõrmejälje", geenetilist materjali sisaldavate kehamaterjalide uurimisel; evolutsioonibioloogias fülogeneetika uurimisel, elusorganismide fülogeneesi ja ontogenessi komplekteerimisel; zooloogias imetajate ning kahepaiksete jt põlvnemise ning arenguga ja haigustega seonduvat (vahest ka käitumist) uurides; ökoloogias – keskkonna kaudu elusorganismidele ning looduskeskkonnale toimet avaldavate tegurite ja põhjuste uurimisel, ka geneetiliselt muundatud organismide jälgimises ning iidsete ning kaasaegsete elusorganismide DNA-de kaardistamisel, uurimisel ning taimede ja loomade geneetiliste variatsioonide uurimisel. desoksüribonukleiinhape DNA-viirused laboratoorne diagnostika mitokondriaalne DNA rakutuum reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon RNA RNA-viirused tsütoplasma tuumake tuumapoor vähkkasvajad northern blotting southern blotting western blotting Kary Mullis Nobel Lecture, December 8, 1993 < , Inglise keelne Vikipeedia artikkel. [1], Human Molecular Genetics. 2nd edition. Strachan T, Read AP.New York: Wiley-Liss; 1999, Chapter 6.1.1. [2],The power of real-time PCR ,Valasek, A. M. Repa,(2005) [3], European Initiative for Biotechnology Education; 1998,Chapter DNA profiling [4], Human Molecular Genetics. 2nd edition. Strachan T, Read AP.New York: Wiley-Liss; 1999, Chapter 6.2. [5],The polymerase chain reaction,Powledge, M. T. (2004)