Ogataea polymorpha

Ogataea polymorpha (ka Hansenula polymorpha) on metülotroofne pärmseen. Seda kasutatakse valgu allikana ravimite tootmises. Ogataea polymorpha liik kuulub vähese arvukusega metülotroofsete pärmide rühma. Need on pärmid, mis suudavad kasvada metanoolil. Metülotroofsed pärmiliigid on Candida boidinii, Pichia methanolica, Pichia pastoris ja Ogataea polymorpha. O. polymorpha on taksonoomselt Saccharomycetaceae sugukonda kuuluv liik. On teada vaid kolm Ogataea polymorpha tüve, mis tuvastati 1950ndatel. Nendevahelised suhted on ebaselged ning nad on sõltumatu päritoluga. Neid on leitud pinnase proovidest, putukate soolest või halvaks läinud kontsentreeritud apelsinimahlast. Neil ilmnevad erinevad omadused ja neid kasutatakse alusuuringutes ning rekombinatiivsel valgu tootmisel. Nimetatud kolm tüve on järgmised: tüvi CBS4732 (CCY38-22-2; ATCC34438, NRRL-Y-5445) tüvi DL-1 (NRRL-Y-7560; ATCC26012) tüvi NCYC495 (CBS1976; ATAA14754, NRLL-Y-1798) Tüved CBS4732 ja NCYY495 saavad omavahel paarituda, kuid DL-1 tüvega kumbki neist paarituda ei saa. Tüvesid CBS4732 ja DL-1 kasutatakse rekombinatiivsel valgu tootmisel, tüve NCYC495 kasutatakse põhiliselt nitraadi assimilatsiooni uuringuteks. Tüve CBS4732 terve genoom on ära sekveneeritud. Ogataea polymorpha on termotolerantne mikroorganism, mille osad tüved suudavad kasvada isegi üle 50 °C temperatuuri juures (122 °F). Antud organism suudab omastada nitraati ning kasvada mitmesugustel erinevatel süsinikuallikatel, kaasa arvatud metanoolil. Rakkudes, mis kasvavad kõrgenenud temperatuuri tingimustes, kuhjub suhkrut nimega trehaloos, mida leidub tavaliselt putukates ning mis on termokaitsev ühend. On näidatud, et trehaloosi süntees ei ole vajalik sellistes tingimustes kasvamiseks, vaid on vajalik termotolerantsuse omandamiseks. O. polymorpha trehaloosi sünteesiraja sammud on detailselt ära kirjeldatud ning on suudetud isoleerida ja iseloomustada selle sünteesiraja põhilise ensüümi geeni, milleks on TPS1. Kõikides metülotroofsetes pärmides on kasutusel identne metanooli kasutamise rada (Joonis 1). Nende kasvul, metanooli sisaldaval söötmel, on märgata ka raku organellide, peroksüsoomide, massiivset kvantitatiivset kasvu suurenemist. Nendes organellides leiavad aset esmased ensümaatilised sammud metanooli kasutamise rajast. O. polymorpha on mudelorganismiks peroksüsoomide funktsiooni ja nende funktsioonide aluseks oleva molekulaarse bioloogia paremaks mõistmiseks. Metanoolil kasvades suureneb rakus metanooli metabolismis vajalike põhiliste ensüümide arvukus. Eriti rohkesti võib leida ensüüme nimega MOX (metanooli oksüdaas), FMDH (formiaadi dehüdrogenaas) ja DHAS (dihüdroksüatsetooni süntaas). Nende ensüümide hulka reguleeritakse transkriptsioonitasemel läbi vastavate geenide. O. polymorpha sugulasliikidel C. boidinii, P. methanolica ja P. pastoris oleneb vastav geeniekspressioon rangelt vaid sellest, kas keskkonnas on metanooli või selle derivaate, kuid O. polymorpha enda puhul kutsub nende geenide kõrge ekspressiooni esile hoopis vastav glütseroolitase või glükoosi nälja tingimused. O. polymorpha produtseerib glükoproteiine, millel on kahte tüüpi suhkruahelad, N- ja O-ühendusega glükaanid ühenduses valguga. N-ühendusega ahelate uuringud on ilmsiks toonud kindla keskmise pikkuse (Man8-12GlcNAc2) koos terminaalse alfa-1,2-ühendusega mannoosi jäägiga, mitte aga koos allergeense terminaalse alfa-1,3-ühendusega mannoosi jäägiga, mis on tavaline teistes pärmiliikides, eriti spetsiifiline veel pagaripärmile Saccharomyces cerevisiae. Ogataea polymorpha on enda omadustelt suurepärane alus geenitehnoloogilisteks valgu sünteesimiseks ja tootmiseks. Seda kasutatakse näiteks diabeedi raviks kasutatava insuliini valmistamiseks. Lisaks on see hea alus B-hepatiidi vaktsiini tootmiseks või isegi IFNalfa-2a valmistamiseks, mida kasutatakse C-hepatiidi raviks. CBS4732 ja DL-1 derivaate kasutatakse selliste rekombinantsete ühendite tootmisel. Teised pärmiliigid, mida kasutatakse samal otstarbel, on näiteks Pichia pastoris, Arxula adeninivorans, Saccharomyces cerevisiae ja teised. Nagu teised pärmiliigid, on ka O. polymorpha selline mikroorganism, mida saab kasvatada suurtes fermentaatorites kõrge raku tiheduseni lühikese aja jooksul. Teda on turvaline kasutada, kuna ei sisalda pürogeene, patogeene ega viiruse kandjaid. Ta suudab vabastada aineid söötmesse, kuna tal on olemas kõik vajalikud komponendid sekretsiooniks (sellist omadust pole aga näiteks bakteril Escherichia coli). Ta suudab anda atraktiivseid geneetilisi komponente efektiivseks valgutootmiseks. O. polymorpha atraktiivsust (väga sobilik ja mugav kasutada) kasutavad ära mitmed biotehnoloogia asutused kaubandusliku kasu saamiseks, kuna teda saab kasutada tootmisprotsesside arendamiseks. Teiste hulgas kasutab seda pärmiliiki näiteks asutus nimega PharmedArtis, mis asub Aachenis, Saksamaal ja ka asutus Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK). Joonisel 2 on näha üldist vektori disaini (geneetiline masin, mis muundab pärmi tüve geneetiliselt konstrueeritud valgutootjaks). See peab sisaldama järgmisi geneetilisi elemente: Selektsiooni marker, mida on vaja, et eristada tranformeeritud tüve transformeerimata taustast. Seda saab teha, kui näiteks valitakse selline element, mis laseb defektsel tüvel kasvada söötmel, millel on puudu kindel ühend, näiteks konkreetne aminohape, mida antud defektne rakutüvi ei suuda ise toota, aga mis on talle eluks vajalik. Kindel element, mis võtaks võõrDNA sihtmärgiks ning suudaks paljundada seda pärmi kromosoomi (ARS ja/või rDNA järjestus). Segment, mis vastutab kindla soovitud valgu sünteesi eest. Nimetatakse ekspressioonikassetiks. See koosneb regulatoorsete elementide järjestustest ja promootorist, mis kontrollib, kui palju ja mis tingimustes talle järgnevat geeni transkribeeritakse ning sellest tulenevalt ka, kui palju valku sünteesitakse. See tähendab aga, et promootorile järgnev segment peab varieeruma vastavalt soovitud valgule – see võib olla järjestus, mis määrab ära aminohappelise järjestuse insuliini sünteesimiseks, B-hepatiidi vaktsiini jaoks või lausa interferooni sünteesiks. Ekspressioonikasseti termineerib talle järgnev terminaatorjärjestus, mis peatab transkriptsiooni. O. polymorpha promootorelemendid pärinevad geenidelt, mis on kõrgelt ekspresseeruvad, nagu näiteks MOX geen, FMD geen ja TPS1 geen. Nende geenide promootorid on väga tugevad ning nende efektiivsust on võimalik reguleerida lisaks veel kindlate süsinikallikatega, nagu näiteks suhkrud, metanool või glütserool. Hansenula polymorpha on saanud tunnustatud mudelorganismiks biotehnoloogia valdkonnas. Tänu kasvavale huvile tema vastu algatati 2000. aastal konverents, mis toimub iga kahe aasta tagant ja mis on pühendatud antud metülotroofse pärmi eri aspektidele. Konverentsi nimeks on Hansenula polymorpha ülemaailmse võrgustiku konverents (HPWN – Hansenula polymorpha worldwide network conference). Selle asutasid professor Marten Veenhuis Groningenist ja professor doktor Gerd Gellissen Düsseldorfist. Esimesel konverentsil (Düsseldorfis) läksid osalejate antud toetused selle organismi esimese monograafi koostamisele . [1], "Ogataea polymorpha (Morais & M.H. Maia) Y. Yamada, K. Maeda & Mikata, Biosc., Biotechn., Biochem. 58(7): 1254 (1994)" [2], Gellissen G. Veenhuis M. (2001) The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: its use in fundamental research and as cell factory. The 1st HPWN conference, August 24th to 27th, Düsseldorf. Yeast 13, i–iii. [3], Gellissen G. (2002) Hansenula polymorpha– Biology and Applications. Wiley-VCH, Weinheim, Germany. Massoud Ramezani-Rad, Cornelis P. Hollenberg, Juergen Lauber, Holger Wedler, Eike Griess, Christian Wagner, Kaj Albermann, Jean Hani, Michael Piontek, Ulrike Dahlems & Gerd Gellissen (2003). "The Hansenula polymorpha (strain CBS4732) genome – sequencing and analysis". FEMS Yeast Research 4 (2): 207–215. doi:10.1016/S1567-1356(03)00125-9, 14613885. Gerd Gellissen, Gotthard Kunze, Claude Gaillardin, James M. Cregg, Enrico Berardi, Marten Veenhuis & Ida van der Klei (2005). "New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowia lipolytica – a comparison". FEMS Yeast Research 5 (11): 1079–1096. doi:10.1016/j.femsyr.2005.06.004, 16144775. Gerd Gellissen, ed. (2002). Hansenula polymorpha – biology and applications. Weinheim: Wiley-VCH. Gerd Gellissen, ed. (2005). Production of recombinant proteins – novel microbial and eukaryotic expression systems. Weinheim: Wiley-VCH. K.S. Shin, Y.K.Shin, J.H. Yoon & Y.H. Park. (2001). Candida thermophila. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51(6): 2168. Wick. (1951). Hansenula angusta , Tech. Bull. U.S. Dep. Agric. 1029: 31. Morais & M.H. Maia. (1959). Hansenula polymorpha, An. Esc. Sup. Quim. Univ. Recife 1: 16. G. Peter, Tornai-Leh., K.S. Shin & Dlauchy. (2007). Ogataea thermophila, FEMS Yeast Res. 7(3): 495. Urakami. (1975). Torulopsis methanothermo, Trudy Troitsk. Otd. imp. russk. geogr. obsc.: 1.