DNA replikatsiooni initsiatsioon

DNA replikatsiooni initsiatsioon on DNA sünteesi esimene samm ehk sünteesi alustamine, millele järgnevad DNA-ahela elongatsioon ehk sünteesitava ahela pikendamine ja terminatsioon ehk sünteesi lõpetamine. Organismidele on väga oluline geneetilise materjali paljundamine ja tütarrakkudesse edasi kandumine. Et kopeerida kogu genoomi ühe korra iga rakutsükli jooksul, peavad olemas olema mehhanismid, mis tagaksid, et DNA replikatsioon kulgeks lõpuni ja ei algaks uuesti enne uut rakutsüklit. Kuigi DNA replikatsioon on evolutsiooniliselt vana protsess, on elu domeenides erinevad mehhanismid, mis reguleerivad genoomi duplitseerimist. Prokarüootides, näiteks Escherichia coli's, replitseeritakse väike tsirkulaarne genoom vaid ühest alguspunktist (ingl origin – oriC) ja DNA replikatsiooni initsiatsiooni kontrollib peamiselt initsiaatorvalgu DnaA seondumine oriC-le. DnaA on AAA+ (ingl ATPases Associated with diverse cellular Activities) tüüpi valk, mis sisaldab seondumisdomeene ATP/ADP-ga ja DNA-ga. Kui rakku on kogunenud piisavalt ATP-DnaA-d, siis moodustub replikatsiooni alguspunktile aktiivne initsiaatorkompleks ja DNA-ahelad avanevad ning seondub replikatiivne helikaas DnaB. DnaA inaktiveerimine või oriC arestimine tagavad, et replikatsiooni initsiatsioon ei toimuks rakutsüklite vahel. OriC aktiivsust reguleeritakse DNA metüleerimise ja spetsiifiliste oriC-ga seonduvate valkude kaudu. DnaA aktiivsust reguleeritakse läbi valkude, mis põhjustavad ATP-DnaA hüdrolüüsi, ja läbi DnaA-ga seonduvate DNA elementide, mis kontrollivad DnaA asukohta raku sees. Initsiatsiooniks on oluline ka dnaA geeni ekspressiooni regulatsioon. E. coli genoomis on ainult üks replikatsiooni alguspunkt, mida nimetatakse oriC. Selle pikkuseks on 245 aluspaari ja selles on kaks konserveerunud piirkonda: 13 aluspaari pikkune A:T-rikas järjestus GATCTNTTNTTTT kolmes tandeemses korduses, mis vastutab DNA kaksikahela lahtihargnemise eest; 9 nukleotiidi pikkune järjestus TTATNCANA nelja kordusena, mis on initsiaatorvalgu seondumiskohaks. G:C-paaride vahel on kolm vesiniksidet, aga kuna A:T-paaride vahel on kaks vesiniksidet, siis hargnevad A:T-rikkad DNA-ahelad kergemini lahti ja denaturatsiooniks kulub vähem energiat. Eukarüootides erineb genoomi organisatsioon ja regulatsioon prokarüootide omast. Eukarüootne genoom on jagatud mitmetesse lineaarsetesse kromosoomidesse, mis igaüks sisaldab mitmeid potentsiaalseid replikatsiooni alguspunkte. Selline genoomi organiseerimine on aja jooksul võimaldanud genoomil suureneda, kuid samal ajal paneb teatud piirangud DNA replikatsiooni regulatsioonile. Et tagada iga kromosoomi terviklik ja õigeaegne kopeerimine, peab replikatsiooni initsieerimine mitmetest replikatsiooni alguspunktidest olema kooskõlastatud. See saavutatakse DNA replikatsiooni range kontrolliga rakutsükli jooksul. Eukarüootide replikatsiooni alguspunktides toimub DNA replikatsioon kahes järjestikuses etapis, mis on ajaliselt (toimub erinevates rakutsükli faasides) reguleeritud. Esimene etapp hõlmab replikatiivse helikaasi MCM2–7 (ingl minichromosome maintenance) kompleksi laadimist replikatsiooni alguspunktidele. Selleks on vajalik replikatsiooni alguspunkti äratundva kompleksi (ingl origin recognition complex (ORC)), Cdc6 (ingl cell division cycle 6) ja Cdt1 (ingl chromatin licensing and DNA replication factor 1) osalemine. ORC seondub replikastiooni alguspunktidele, mis toob kaasa valkude Cdc6 ja Cdt1 seondumise. Need kolm litsentseeerimise faktorit suunavad helikaasi MCM2–7 laadimist ümber kaheahelalise DNA (ingl double-stranded DNA – dsDNA). Sellist inaktiivset helikaasi nimetatakse pre-replikatiivseks kompleksiks (ingl pre-replicative complex – pre-RC). Pre-RC moodustumine toimub hilises mitoosis ja G1-faasis. Seda esmast etappi eukarüootide DNA replikatsiooni initsiatsioonis nimetatakse litsentseerimiseks, kuna see on kromosoomidele eeltingimuseks, et neil oleks potentsiaal või litsents, et replitseeruda järgnevas S-faasis. Teine etapp toimub S-faasis, kus pre-RC muudetakse aktiivseks helikaasiks, mis kerib lahti kaheahelaist DNA-d, tekitades replikatsioonikahvli ja lubades DNA polümeraasidel kopeerida teine DNA-ahel. Helikaasi aktiveerimine kujutab endast CMG kompleksi (Cdc45, MCM2–7 kompleks, GINS kompleks) moodustumist. Litsentseeritud replikastiooni alguspunktidelt DNA sünteesi initsiatsiooniks on vajalikud kaks proteiinkinaasi: tsükliin-sõltuv kinaas (ingl cyclin-dependent kinase – CDK) ja Dbf4-st sõltuv kinaas (ingl Dbf4-dependent kinase – DDK). Mõlemad kinaasid fosforüleerivad MCM kompleksi, mis toob kaasa Cdc45 ja GINS kompleksi seondumise ning täieliku replisoomi moodustumise. Replisoom on täielik replikatsiooniaparaat, mis duplitseerib DNA-d mõlemasuuneliselt poolkonservatiivsel viisil. Replisoomi moodustumisega lõppeb initsiatsioon ja algab DNA replikatsiooni elongatsioon. MCM (ingl minichromosome maintenance) valguperekond on saanud oma nime 1980. aastate alguses Bik-Kwoon Tye laboris tehtud Saccharomyces cerevisiae mutantide uuringust, kust need minikromosoomi säilitamise defektiga seotud valgud esmakordselt eraldati. MCM valguperekonna olulisemad kuus valku on MCM2 kuni MCM7, mis on vajalikud DNA replikatsioonil. MCM valgud kuuluvad AAA+ (ingl ATPases Associated with diverse cellular Activities) valkude perekonda ja sisaldavad tugevalt konserveerunud järjestuselemente ATP seondumiseks ja hüdrolüüsiks, mis varustavad helikaasi energiaga. MCM valgud moodustavad heksameerse ring-kompleksi: -3-7-4-6-2-5-. CMG kujutab endast Cdc45 (ingl cell division cycle 45), MCM2–7 (ingl minichromosome maintenance) ja GINS valgukompleksi, mis kerib replikatsiooni alguspunktis lahti kaheahelalist DNA-d . GINS akronüüm on moodustatud jaapani keele numbritest 5, 1, 2, 3 (go-ichi-ni-san), tähistamaks subühikuid Sld5-Psf1-Psf2-Psf3 . MCM2–7 kompleks omab ainult siis helikaasset aktiivsust, kui see on seotud Cdc45 ja GINS kompleksiga. MCM2–7 on ainsana ATPaas, kusjuures Cdc45 ja GINS seondumine suurendab ATP hüdrolüüsi taset, muutes MCM subühikute asetust selleks optimaalsemaks. Cdc45 ja GINS seondumine MCM2–7 kompleksile suurendab ka selle DNA-ga seondumise efektiivsust. Heinaru, A. 2012. Geneetika, lk 227. Tartu: Tartu Ülikooli Kirjastus. Zagerman, P. (2014). Evolutionary conservation of the CDK targets in eukaryotic DNA replication initiation. Chromosoma. 124(3):309–21. Skarstad, K., Katayama, T. (2013). Regulating DNA replication in bacteria. Cold Spring Harb Perspect Biology 5(4):a012922. Heinaru, A. 2012. Geneetika, lk 234. Tartu: Tartu Ülikooli Kirjastus. Siddiqui, K., On, K. F., Diffley, J. F. X. (2013). Regulating DNA Replication in Eukarya. Cold Spring Harb Perspect Biology 5(9):a012930. Sclafani, R. A., Holzen, T. M. (2007). Cell cycle regulation of DNA replication. Annu. Rev. Genet. 41, 237–280. Forsburg, S.L. (2004). Eukaryotic MCM proteins: Beyond replication initation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 109–131. Ilves, I., Petrojevic, T., Pesavento, J. J., Botchman, M. R. (2010). Activation of the MCM2–7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins. Mol. Cell 37:247–258. Ain Heinaru. Geneetika. Tartu: Tartu Ülikooli Kirjastus. 2012.