Rakku sisenevad peptiidid

Rakku sisenevad peptiidid (RSP-d; inglise keeles cell-penetrating peptides) on peptiidid, mis keskmiselt koosnevad 5–40 aminohappest ja on võimelised tungima rakku. Nad seovad lastmolekuli enda külge kovalentsete või mittekovalentsete keemiliste sidemetega ning transpordivad saadud kompleksi läbi rakukesta raku sisemusse. Esimesed teadustööd, kus sellist peptiidide rakkudesse sisenemist täheldati, tehti 1988. aastal, eksperimentides kasutati funktsionaalsete valkude nagu penetratiin (Drosophila Antennapedia homeodomeen) ja TAT (HIV-1 viiruse transaktiivne transkriptsiooni aktivaatorvalk) sünteetilisi analooge. Rakku sisenevaid peptiide nimetati varem ka valgu transduktsiooni domeenideks ja membraani translokaliseerivateks järjestusteks. RSP-de nimetuse eestikeelse vastena on välja pakutud sõna süstikpeptiidid. Kokkuleppeline klassifikatsioon rakku sisenevate peptiidide jaoks puudub, kuid üldlevinud on klassifitseerimine nende päritolu või füüsikalis-keemiliste omaduste põhjal. Päritolu järgi liigitatakse RSP-d järgmiselt: 1. Loodusliku päritoluga peptiidid. Sellised on peptiidid, mis on eraldatud looduses esinevatest valkudest või on nende põhjal sünteesitud. 2. Kimäärsed peptiidid. Need peptiidid koosnevad nii osadest, mis esinevad looduses, kui ka osadest, mis on tehislikult disainitud. 3. Sünteetilised peptiidid. Peptiidid, mida looduses ei esine ning mis on kunstlikult sünteesitud. RSP-de klassifikatsioon füüsikalis-keemiliste omaduste põhjal: 1. Primaarsed amfipaatsed peptiidid. Selliste peptiidide primaarstruktuuri moodustavad hüdrofoobsed ja hüdrofiilsed järjestused ning need kasutavad rakku sisenemise mehhanismina tavaliselt otsest transduktsiooni, seondudes raku plasmamembraanis asuvate neutraalsete ja anioonsete lipiididega. 2. Sekundaarsed amfipaatsed peptiidid. Need peptiidid koosnevad katioonsetest ning hüdrofoobsetest aminohapetest. Selle klassi peptiididel on omadus raku membraanis asuvate lipiididega seondumisel minna primaarstruktuurist üle sekundaarsesse. 3. Mitteamfipaatsed peptiidid. Selle klassi esindajad sisaldavad rohkem katioonseid aminohappeid ning seonduvad raku plasmamembraanis asuvate anioonsete lipiididega. Peptiidisünteesiks kasutatakse enamasti tahke kandja sünteesi. Peptiidiahel sünteesitakse üksikute aminohapete haaval ning sünteesitav peptiidiahel on samal ajal kinnitatud kandjale (stüreendivenüülbenseeni kopolümeerid). Sünteesitav peptiidiahel ning tema kandja on reaktsioonisegus lahustumatud ning stabiilses olekufaasis. See võimaldab reaktsioonisegu korduvalt pesta, mille käigus eemaldatakse liias lisatud reagendid ning võimalikud kõrvalsaadused. Sünteesireaktsioon algab C-terminaalse otsaga aminohappe sidumisest tahkele kandjale linkeri vahendusel, kasutades selleks ester- või amiidsidemeid. Kandjana kasutatakse laialdaselt 4-metüülbenshüdrüülamiini, mille reaktsioonil saadakse produktina C-terminaalselt amideeritud peptiid. Peptiid sünteesitakse aminohapetest suunal C-terminusest N-terminuse suunas. Reagentide juurdepääsu kandjale kinnitunud peptiidi vahelülideni võimaldab näiteks diklorometaan. Järgmiseks eemaldatakse sünteesitava peptiidiahela viimasena liitunud aminohappelt Nα kaitserühm ja aktiveeritakse järgmise seotava aminohappe Cα karboksüülrühm. Aktivaatoritena on kasutusel fosfooniumi ja urooniumi reagendid. Selleks, et kindlustada N-kaitstud aminohappe karboksülaadi reageerimine aktivaatoriga, lisatakse reaktsioonsegule tertsiaalset amiini. Sünteesitava peptiidahela N-terminus liitub lisatava aminohappe C-terminusega peptiidsideme kaudu, pikendades peptiidiahelat. Seda etappi korratakse, kuni on saavutatud sobiva pikkusega peptiid. Vahereaktsioonide toimumise efektiivsuse määramiseks kasutatakse Kaiseri testi, mis põhineb värvusmuutusel. Ninhüdriini seostmisel vabade aminorühmadega moodustub sinine ühend, mis viitab, et viimasena lisatud aminohappe seostumine ei olnud edukas. Seevastu vabade aminorühmade puudumisel on tekkinud ühend kollane, mis näitab edukat aminohape liitumist sünteesitavale peptiidiahelale. Viimane etapp on sünteesitud peptiidi eemaldamine kandjalt ning aminohapete kõrvalahelate vabastamine ajutistest kaitserühmadest. Laialdasemalt on levinud Fmoc eemaldamise meetod, kus aminohappe Nα kaitserühm on aluslabiilne 9-fluoroenüülmetüüloksükarbonüülrühm. Kaitserühma eemaldamine toimub aluselises keskkonnas, rohkesti kasutatakse piperidiini 20% lahust. Kõrvalahelad on aga kaitstud happelabiilsete rühmadega, mille eemaldamiseks kasutatakse trifluoroatseethapet. Reaktsioonisegule lisatakse veel tioole, et neutraliseerida kaitserühmad ning vältida nende teistkordset kinnitumist sünteesitud peptiidile. RSP-de ja lastmolekuli komplekside moodustumisel on oluline saavutada stabiilsus, mis võimaldaks lastmolekuli transportida probleemideta läbi raku plasmamembraani ning vabastada peptiidi küljest alles sihtmärkrakku jõudnuna. Selleks ei tohi rakku siseneva peptiidi ja lastmolekuli seostumine olla ei liiga nõrk ega liiga tugev. Suurem osa rakku siseneva peptiidi ja lastmolekuli kompleksidest moodustuvad kovalentsete sidemete kaudu, kuid esineb ka mittekovalentset sidumist. Kui kompleks moodustub kovalentsete sidemete kaudu, moodustuvad rakku siseneva peptiidi ja lastmolekuli vahele disulfiid- või tioestersidemed, mis on stabiilsed, kuid samas kergesti lagunevad. Samuti võib kovalentsel sidumisel muutuda transporditava lastmolekuli bioloogiline aktiivsus ning kuna see sünteesiprotsess on aeganõudev, kasutatakse rohkem mittekovalentset sidumist. Mittekovalentsel sidumisel liitub lastmolekul RSP-ga tänu omavahelisele segunemisele solvendis. Selle meetodiga on võimalik rakku sisenevale peptiidile siduda külge mitu erinevat lastmolekuli ning säilib ka lastmolekuli bioloogiline aktiivsus. Rakku sisenevatel peptiididel on võime transportida lastmolekule, näiteks DNA-d, siRNA-d, plasmiidi, läbi raku plasmamembraani, kasutades selleks erinevaid võimalusi. Seetõttu on hakatud rakku sisenevaid peptiide tänapäeval kasutama geenitehnoloogias ja ravimitööstuses. Endotsütoos on rakku sisenevatel peptiididel kõige levinum viis rakumembraani läbimiseks. Endotsütoosiks nimetatakse protsessi, mille käigus rakk võtab endasse väliskeskkonnast substantse. Endotsütoosi alaliik, mille käigus omastatakse rakku väliskeskkonnast substants, on pinotsütoos. Selle käigus moodustab rakk oma plasmamembraanist lastmolekuli ja rakku siseneva peptiidi kompleksi ümber vessiikuli ehk endosoomi, mis neelatakse raku sisemusse. Pinotsütoosi abil rakku sisenemise viisid saab jagada neljaks: 1. Klatriinsõltuv endotsütoos. Plasmamembraanil asub retseptoriterohke koht, mida nimetatakse kaetud lohuks. Lohku seonduvad spetsiifiliste retseptormolekulide abil kargomolekuli ja rakku siseneva peptiidi kompleks. Seejärel osaleb lohu sulgemises valk nimega dünamiin ning saadud endosoom kaetakse klatriiniga. Seda tüüpi endotsütoosiga saab rakku siseneda kuni 200 nm suurune lastmolekuli ja RSP kompleks. 2. Kaveoliinsõltuv endotsütoos. Kalveoolid on laiad rakumembaani sissesopistused, mis on retseptoriteks erinevatele molekulidele ja nende kompleksidele. Ka selles mehhanismis osaleb valk dünamiin, kuid saadud endosoom kaetakse hoopis kaveoliiniga. Selle mehhanismi abil saavad siseneda rakku ainult suhteliselt väiksed molekulkomplekisd, sest kalveoolide enda suurus on vaid 50–80 nm. 3. Klatriin- ja kaveoliinsõltumatu endotsütoos. See sisenemise viis on rakku sisenevate peptiidide puhul senini kõige vähem uuritud ning täpne info puudub. 4. Makropinotsütoos. Selle rakku sisenemise võimaluse korral moodustab rakk oma plasmamembraanist väljasopistised, mis kerivad end lastmolekuli ja rakku siseneva peptiidi kompleksi ümber, moodustades vesiikuli, mis neelatakse rakku. Makropinotsütoosi abil on võimalik rakul omastada suuremaid, kuni 1 µm läbimõõduga lastmolekuli- ja peptiidikomplekse. Otsene transdruktsioon on protsess, mille käigus peptiid ei kuluta rakku sisenemisel energiat. Rakku sisenevatel peptiididel on võime end nii-öelda süstida rakku otse läbi raku plasmamembraani. Peptiid interakteerub rakumembraanis asuvate lipiidide ja glükaanidega, minnes primaarsest struktuurist üle sekundaarseks, mis toob kaasa polaarsete aminohapete lahutamise mittepolaarsetest. See protsess destabiliseerib fosfolipiidse kaksikkihi nii, et peptiid saab selle läbistada. Rakkudesse sisenevaid peptiide kasutatakse kõige sagedamini terapeutiliste biomolekulide rakku transportimiseks ning neis nähakse suurt potentsiaali tulevikumeditsiinis. RSP-d suudavad endaga siduda väga erinevaid molekule, näiteks plasmiide, valke, oligonukleotiide, siRNA-d jne. Nende omaduste tõttu on võimalik rakku sisenevaid peptiide kasutada selliste haiguste raviks nagu vähk, priionhaigused, lihastüstroofia jne. NickFectid PepFectid Nahka sisenevad peptiidid Langel, Ü. Cell-Penetrating Peptides: Methods and Protocols, Second Edition. Human Press, 2015 Wagstaff, K. M., Jans D. A. Protein Transduction: Cell Penetrating Peptides and Their Therapeutic Applications. Current Medicinal Chemistry, Volume 13, Number 12, May 2006 Zahid, M. ja Robbins, P.D. (2012) Protein transduction domains: applications for molecular medicine. Curr Gene Ther. 12(5):374–80. Futaki, S., Goto, S., Suzuki, T., Nakase, I., Sugiura, Y. (2003) Structural variety of membrane permeable peptides. Curr Protein Pept Sci; 4(2):87-96. Mare Vahtre, Kaisa Põhako: "Tulekul on uue põlvkonna ravimid" ERR Novaator, 2. oktoober 2019 Ziegler, A. Thermodynamic studies and binding mechanisms of cell-penetrating peptides with lipids and glycosaminoglycans. Adv Drug Deliv Rev, 2008 Merrifield, R. Solid-phase peptide synthesis. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 1969 Kaiser, E., Colescott, R., Bossinger, Cook, P. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Analytical biochemistry, 1970 Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group. The Journal of Organic Chemistry, 1972 Heitz, F., Morris, M. C., Divita, G. Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. British Journal of Pharmacology, 2009 Koren, E., Torchilin, V. P. Cell-penetrating peptides: breaking through to the other side. Trends Mol Med, 2012 Copolovici, D. M., Langel, K., Langel, Ü., Eriste, E. Cell-penetrating peptides: design, synthesis and applications. American Chemical Society, 2014 Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 2000 Pae, J., Pooga, M. Peptide-mediated delivery: an overview of pathways for efficient internalization. Future Science, Therapeutic Delivery, 2014 Alberts, B. et al. Essential Cell Biology, Fourth Edition, 2014. Geoffrey M. C., Robert E. H. The Cell: A Molecular Approach, Fifth Edition, 2009