Biotransistor

Biotransistor (ka bioloogiline väljatransistor, BioFET, Bio-FET) on seade, mis sisaldab väljatransistori (field-effect transistor, FET) ja sellega seotud bioloogilist signaali ära tundvat sensorit (biosensor). See on kombinatsioon bio- ja elektrokeemiast, tahkiste füüsikast ning pinnakeemiast. Enamasti interakteerub biotransistorides bioloogiline materjal ISFET-tüüpi transistoriga (ioonselektiivne väljatransistor, reageerib ioonide kontsentratsioonile). ISFET töötab kui isoleeritud paisuga väljatransistor (IGFET), kus metallpaisu asemel on ioonidele tundlik membraan koos elektrolüüdi lahuse ja referentselektroodiga. Keskendume ISFET-tüüpi biotransistoridele, kuigi tänapäeval on juba välja arendatud ka uusi tehnoloogiaid, näiteks nanomõõtmetes grafeemil põhinev FET-süsteem (GFET), mida on kasutatud elusas rakupopulatsioonis pH mõõtmiseks. ISFET-tüüpi transistor on kasutusel enamikus biotransistorides, isegi kui selle tundlikkus ioonidele pole peamiseks eesmärgiks (näiteks afiinsusel põhinevates või rakupotentsiaali mõõtvates biotransistorides. ISFET-i saab muuta BioFET-iks, muutes paisumaterjali või sidudes paisuga bioloogilist materjali detekteerivaid elemente. Laengu või potentsiaali muutuse kaudu tuvastatakse paisuga seonduv element (Joonis 1). N-kanaliga ISFET koosneb p-juhtivusega (aukjuhtivusega) baaskristallist (ränisubstraadist), millesse on tekitatud doonorlisandite manustamisega kaks n-tüüpi (elektronjuhtivusega) piirkonda, mis on omakorda kaetud isoleerkihtidega (Joonis 2). Kui tüüpiliselt on olnud paisuisolaatoriks SiO2 kiht, siis pH-tundlike ISFET-ide korral kasutatakse tihti kaksikkihti järgmistest materjalidest: SiO2–Si3N4, SiO2–Al2O3 või SiO2–Ta2O5. ISFET-i töörežiimis rakendatakse paisule referentselektroodi (näiteks Ag/AgCl) pealt pinge UG (joonistel Vg), sama elektroodi kaudu fikseeritakse potentsiaal uuritavas lahuses. Kui paisule rakendatakse piisav positiivne eelpinge (lävipinge), siis vähemuslaengukandjate (elektronide) kontsentratsioon kanali dielektrikupoolses kihis kasvab ja indutseeritakse n-tüüpi inversioonkiht, kus vähemuslaengukandjate tihedus on suurem enamuslaengukandjate kontsentratsioonist, võimendades neeluvoolu. Neeluvoolu tugevus ID määratakse inversioonkihi efektiivse elektrilise takistuse ja lätte ja neelu vahelise pingega UDS (joonistel Vds). ISFET-i neeluvoolu (ID) saab tuletada IGFET-i järgi, lisades potentsiaali langused lisandunud eralduspindadel: I D = μ C i W L U D S [ U G − ( E r e f − φ + χ s o l − ϕ s o l q − Q i + Q s s C i − Q B C i + 2 ϕ f ) − 0 , 5 U D S ] , {\displaystyle I_{D}=\mu C_{i}{\frac {W}{L}}U_{DS}[U_{G}-(E_{ref}-\varphi +\chi _{sol}-{\frac {\phi _{sol}}{q}}-{\frac {Q_{i}+Q_{ss}}{C_{i}}}-{\frac {Q_{B}}{C_{i}}}+2\phi _{f})-0,5U_{DS}],} kus µ on elektroni mobiilsus kanalis; W ja L on kanali laius (width) ja pikkus (length); Eref on referentselektroodi potentsiaal; ϕSi on funktsioon räni elektronide tehtavast tööst; q on elementaarlaeng; Ci on paisuisolaatori mahtuvus; Qi, Qss ja QB on vastavalt laengud isolaatoril, pinnal/eralduspinnal ning vaeguspiirkonnas; χsol on lahuse pinna dipooli potentsiaal; ϕf on Fermi energianivoode potentsiaalide vahe dopeeritud räni ja loomuliku räni vahel; φ on elektrolüüt-membraani kontaktpinna potentsiaal, mis sõltub lahuses olevate ioonide aktiivsusest. Potentsiaali φ saab arvutada Nernst-Nikolsky võrrandist. pH-tundliku ISFET-i puhul tunnetab paisuisolaator (tüüpiliselt Si3N4, Al2O3 või Ta2O5) vesinikioonide kontsentratsiooni, genereerides paisu eralduspinnal potentsiaali. Selline mudel eeldab, et vesilahuses paisuisolaatori pinnal tekivad ioniseeruvad piirkonnad (nt OH grupid). Sellised piirkonnad saavad kas siduda või vabastada vesinikioone ja nende protoneerumisaste muutub sõltuvalt lahuse pH-st. Ülalkirjeldatud mudeli põhjal saab arvutada potentsiaali φ järgmise valemiga: φ = 2 , 3 k T q β β + 1 ( pH p z c − pH ) , {\displaystyle \varphi =2,3{\frac {kT}{q}}{\frac {\beta }{\beta +1}}({\text{pH}}_{pzc}-{\text{pH}}),} kus pHpzc (nulllaengu punkt, point of zero charge) on pH väärtus, mille korral φ = 0; k on Boltzmanni konstant; T on absoluutne temperatuur; β on parameeter, mis iseloomustab paisuisolaatori keemilist tundlikkust ja sõltub pinnal leiduvate hüdroksüülrühmade tihendusest ja pinna reaktiivsusest. pH-st sõltuv paisuisolaatori pinnalaeng viib ISFET-i kanali juhtivuse muutuseni ja seeläbi neelupinge muutuseni. Seega mõõtes neelupinge muutusi saab määrata uuritava lahuse pH väärtust. Praktikas kasutatakse ISFET-tüüpi biotransistore sageli konstantse neeluvoolu juures, kus vool fikseeritakse tagasisideahelaga. Sealjuures registreeritakse biokeemilisest reaktsioonist lähtuv pingemuutus. Kuna ISFET, millel põhineb enamik biotransistore, on väga tundlik igasugustele elektrilistele interaktsioonidele, mis toimuvad paisuisolaatoril või selle läheduses, saab mõõta erinevaid biokeemilisi reaktsioone, ühendades ISFET-i mõnd bioloogilist signaali ära tundva retseptoriga. Seetõttu kasutatakse selliseid biotransistore näiteks: potentsiaali muutuste mõõtmiseks, mida põhjustavad produktid katalüütilistes protsessides, näiteks ensüümi ja substraadi vahel; potentsiaali muutuste mõõtmiseks, mida põhjustavad pinna polarisatsiooniefektid või dipoolmomentide muutus biomolekulide seondumisel, näiteks antigeen-antikeha afiinsusreaktsioonid või DNA hübridisatsioon; potentsiaalide registreerimiseks, mis pärinevad elussüsteemidest, näiteks rakkude pinnalt või närvirakkude vahelisest signaalidest. Vastavate rakenduste alusel erineb ka biotransistoride ehitus, mille järgi saab neid klassifitseerida. ISFET-i paisuisolaatoriga ühenduses olevate bioretseptoritena on enim levinud ensüümide kasutamine, eelkõige tänu nende võimele siduda molekule spetsiifiliselt. Sellise transistori valmistamise puhul on oluliseks ensüümi(de) kinnitamine anorgaanilise alusmaterjali külge. Tuntakse füüsikalist ja keemilist adsorptsiooni, polümeerse maatriksiga ühendamist, kovalentset sidumist, ristseostamist glutaarraldehüüdiga ja eelkirjeldatud meetodite kombinatsioone. Kõige lihtsam ensüümide paigaldamine toimub kas ensüümi tilgutamisega transistorile või siis transistori ensüümilahusessse sissekastmisega, kusjuures ensüümi kogus transistoril võib olla väga väike. Et parandada paisuisolaatori pinna adhesiooni, teostatakse sellele enne ensüümiga katmist tihti silaanimine. EnFET-i üldpõhimõte Ensümaatilise reaktsiooni tulemusena tekivad lahusesse kas produktid või tarbitakse regente lahusest ära ja nende kontsentratsiooni muutust ISFET-i abil registreeritaksegi. EnFET-e kasutatakse näiteks glükoosi, uurea, penitsilliini, etanooli, laktoosi, sukroosi, maltoosi, askorbiinhappe, laktaasi, atsetüülkoliini, orgaaniliste pestitsiidide, formaldehüüdi jms tuvastamiseks. Enamik EnFET-e põhinevad pH-tundlikel ISFET-idel. Näiteks ureaasi kasutav EnFET: NH2-CO-NH2 (uurea) + H2O → ureaas → 2NH4+ CO2 + 2OH– On võimalik teha ka mitmel erineval ensüümil põhinevaid multi-sensoreid, et näiteks jälgida samaaegselt suhkrute, etanooli ja uurea taset tööstuslikus mikrobioloogias rakukultuuride kultiveerimisel, kuid nende puhul peab arvestama, et erinevad reaktsioonid võivad üksteist segada, lisaks võivad eri ensüümidel olla erinevad pH optimumid, seetõttu on väga oluline sensorite paigutus ja reaktsioonide järjekord. Oluline kliiniline rakendus, kus EnFET-i saab kasutada, on glükoosi määramine verest. FET-iga seotud ensüümina töötab siinkohal glükoosi oksüdaas: β-D-glükoos + H2O + O2 → glükoosi oksüdaas → glükonolaktoon + vesinikperoksiid (H2O2) Glükolaktoon hüdrolüüsub glükoonhappeks. Glükoonhape dissotsieerub lahuses glükonaatiooniks ja H+ iooniks. Kui klassikalistes glükomeetrites kasutatakse seda reaktsiooni määramaks glükoosi hulka lahustunud hapniku kontsentratsiooni vähenemise kaudu, siis EnFET puhul toimub glükoosi kontsentratsiooni määramine lahuse pH muutuse mõõtmise kaudu. Praktikas kasutatakse selliseks mõõtmiseks kahte pH-tundlikku ISFET-i, kus ühe FET-i membraanile on kinnitatud ensüüm, kuid teisele mitte. Nii üles ehitatud süsteem võimaldab automaatset kompensatsiooni muutuva lahuse pH, temperatuuri ja sensori tundlikkuse ajas vähenemise suhtes. Samuti puudub vajadus stabiilse referentselektroodi järele ning saab kasutada kullast või plaatinast "pseudoreferentselektroodi", mida saab integreerida FET sisemusega. Et suurendada sellisel viisil glükoosi hulga määramise tundlikkust, arendati välja EnFET, kus glükoosi oksüdaasi kandva paisuisolaatori lähedale on integreeritud plaatinaelektrood, mille abil elektrolüüsitakse tekkivat vesinikperoksiidi, saades lisaks veel kaks vesinikiooni. Järgmises edasiarenduses lisati ISFET-i paisuisolaatorile MnO2 pulbrit, mis toimib katalüsaatorina, et saada lisaks hapnikku, mida taaskasutada glükoosi oksüdatsioonil. Nii suurendati tundlikkust kuni 20 mM kontsentratsiooni määramiseks, mis on sobilik glükoositaseme määramiseks lahjendamata vereproovist, sest kui normaalne vere glükoositase on 5 mM mõõtepiirkonnas, siis diabeetikutel tõuseb see 20 mM-ni ja enam. Antikeha-antigeeninteraktsioon on väga spetsiifline ja seepärast huvipakkuv ka biotransistoride tootmisel. ImmunoFET-i puhul on transistori paisuga seostatud huvipakkuvad antikehad või antigeenid. ImmunoFET-i teoreetiline mudel põhineb elektriliselt laetud molekulide seondumisega tekkiva laengumuutuse mõõtmisel, kui ISFET-i pinnal tekib antikeha-antigeenkompleks. Paraku nõuab selliste interaktsioonide jälgimine ideaaltingimusi ja on seega osutunud praktikas teostamatuks, sest suurte molekulide elektrilaengud jäävad paisust liiga kaugele ja registreerimist vajavaid laenguid varjestavad lahuseioonid. Edasiarendus oleks mitte kasutada immunoFET-i puhul pinge ega voolutugevuse muutust, vaid hoopis impedantsspektroskoopiat, sest valkude seondumine mõjutab vahelduvvoolu karakteristikuid. Antikeha-antigeeninteraktsioonil põhinevaid ImmunoFET-e alles arendatakse. Tänapäeval on DNA molekulide detekteerimiseks olemas palju võimekaid süsteeme, mis põhinevad kas hübridisatsioonil (DNA-mikrokiiptehnoloogia) või erinevatel sekveneerimismeetoditel (meetodeid eristatakse tööprintsiibi järgi: DNA ahela terminatsioonil põhinevad, üht molekuli matriitsina kasutavad või otse DNA molekulilt infot lugevad meetodid). Lisaks kirjeldatutele on võimalik FET-i baasil ehitada nn genosensoreid, mida saab kasutada DNA või RNA järjestuste ülikiireks tuvastamiseks. DNA hübridisatsioon põhineb protsessil, kus uuritav järjestus (nt lahuses olev üheahelaline DNA (ssDNA, single-strand DNA) seostub kandjale fikseeritud komplementaarse üheahelalise järjestusega, moodustades kaheahelalise DNA (dsDNA, double-strand DNA) ainult seal, kus leiduvad sobivad paarilised. DNA-l põhinevad ISFET-id registreerivad paisupinge muutuse, mis tuleneb pinnalaengu muutumisest hübridisatsioonil, sest DNA on laetud makromolekul. Kuigi DNA-FET-i juures võivad esineda samad probleemid mis immunoFET-i puhul, kus laengud varjestatakse lahuses olevate ioonide tõttu, sobib DNA sellisteks mõõtmisteks paremini, sest DNA on korrapärane molekul, mis on negatiivselt laetud, ja DNA-FET, mis on positiivse pinnalaenguga, soodustab molekulide omavahelist seondumist. Raku ja transistori hübriid saadakse, kui rakk katab FET-i paisuisolaatori. CPFET-e saab kasutada nii raku enda metabolismi signaalide mõõtmiseks kui ka rakuvälise potentsiaali tuvastamiseks. Rakkudel põhinevate biotransistoride arendamine on suure potentsiaaliga, sest nii saab uurida rakkude elutegevust in situ, mis on vajalik, kuna elusorganismi mikrostruktuurides toimuvad kemikaalide kontsentratsiooni muutused kontrollitud protsessidena, on üksteisega tihedalt seotud ning informatsioon otse sündmuspaigalt annab väärtuslikku kvalitatiivset ja kvantitatiivset infot näiteks kliinilises diagnostikas, toksikoloogias, farmakoloogias ja elukeskkonnauuringutes. CPFET-e ehk raku potentsiaali mõõtvaid FET-e on kasutatud registreerimaks lihaste ja närvisüsteemi toimimisel tekkivat elektrilist informatsiooni. Rakkudega seondumisel põhinevat FET-i meetodit on kasutatud ka hiireembrüote hindamisel, mis võib tulevikus tagada efektiivsema preimplantatsioonilise embrüoselektsiooni ka inimeste viljatusravis. Kui transistoriga seostatakse terve organism või mõni tema organ, näiteks putuka tundel, saadakse väga võimekas ja suure rakendusliku potentsiaaliga biotransistor. Näiteks on loodud BioFET, kasutades putukate ülisuurt lõhnatundlikkust ja ühendades putuka tundel FET-iga. Kui tundel reageerib kindlale lõhnale, genereeritakse pinge, mille FET registreerib. Putuka tundlates reageerivad lõhnadele retseptoorsed neuronid ja lõhna ära tundmine initsieeritakse närvirakkude membraanides, misjärel lõhna kontsentratsioonist sõltuv pingeimpulss kantakse üle terve tundla, mis põhjustab dipooli tekke ja vastavalt registreeritakse FET neeluvoolu karakteristikuna. Et sellist biotransistori ehitada, tuleb luua kontaktpind putuka tundla ja FET-i vahel. Esimeses lahenduses võetakse terve putukas ja kinnitatakse see nii, et tema tundel on elektrolüüdi lahuses, mis on otsekontaktis FET-i paisuisolaatoriga. Referentselektrood, näiteks plaatinajuhe, paigutatakse putuka pea ja kaela vahele. Teine võimalus on lõigata tundel putuka küljest ja paigutada mõlema otsaga elektrolüüdi lahusesse. Kui õhuvooluga kandub uuritav marker (lõhn, aine) antennile, indutseeritakse depolarisatsioonikoste, mis mõjutab FET-i kanali juhtivust lätte ja neelu vahel ja mis registreeritakse neeluvoolu muutusena. Siinkirjeldatud lahenduste edasiarenduste abil saab ehitada näiteks varajasi põlengutuvastamise andureid või siis kunstlikke ninasid narkootikumide, lõhkeainete, keskkonnasaaste või riknenud toiduainete tuvastamiseks (nn bioelektrooniline nina). ISFET-ide tuntumad tootjad on Orion, Beckman, Sentron, Honeywell, Chem-FET Corporation. Biotransistoride katseeksemplaride ja esimeste funktsionaalsete BioFET-ide tootmine oli varem käsitöö, kuid nüüdseks on arendatud välja tootmistehnoloogiad kiipidele näiteks ensüümide pealekandmiseks, kus kasutatakse valgusega mõjutatavaid polümeere, nagu polüakrüülamiid või polüuretaanakrülaat, Langmuiri-Blodgetti polümeerkilede valmistamise tehnikat ja erinevaid tindiprits- ja mikrokontakt-printimise tehnikaid. Nii saab biotransistore toota automatiseeritult koos ISFET-i tootmisega. Tootmisprotsessi teeb keerulisemaks see, et kui üldiselt tuleb transistore katta, et nad ei puutuks väliskeskkonnaga kokku, siis biotransistoride tootmisel on oluline jätta analüütidega kokkupuutuvad kontaktpinnad vabaks. Näiteks on võimalik toota EnFET-e, kus katmist vajavate külg- ja tagapindade katmiseks on kasutatud SiO2, Si3N4 ja Ta2O5 kilesid. Biotransistoride edasiarendamine toimub pidevalt koos uute tootmistehnoloogiate väljatöötamisega. 1970 – Piet Bergveld leiutas ISFET-i. Esimene kontseptsioon, kus ISFET-i abil prooviti mõõta neurofüsioloogilisi parameetreid 1976 – esimene BioFET-i kontseptsioon (EnFET) 1980 – esimene kasutatav EnFET penitsilliini kontsentratsiooni määramiseks 1980 – esimene ImmunoFET-i kontseptsioon 1981 – esimene elusrakkudega ühendatud MOSFET 1991 – esimene CPFET (neuron-transistor) 1997 – esimene organipõhine BioFET (Beetle/chip) 1997 – esimene DNA-hübridiseerumist detekteeriv BioFET 1999 – esimene EnFET glükoosi kontsentratsiooni määramiseks vereseerumist 2001 – oluliselt täiustatud tundlikkusega EnFET glükoosi kontsentratsiooni määramiseks verest 2013 – esimene embrüo jälgimiseks valmistatud BioFET Orgaaniline väljatransistor Bergveld P. (1986). The development and application of FET-based biosensors. Biosensors. ;2(1):15-33. Brown M.A., Barker L., Semprini L., Minot E.D. (2015). Graphene Biotransistor Interfaced with a Nitrifying Biofilm. Environ. Sci. Technol. Lett., 2 (4), pp 118–122 DOI: 10.1021/acs.estlett.5b00025 Schöning M.J. & Poghossian A. (2002). Recent advances in biologically sensitive field-effect transistors (BioFETs). Analyst.; 127(9):1137-51. Blackburn G. F. (1987). Biosensors: Fundamentals and Applications. Oxford: Oxford University Press. Lk 481–530. Thevenot D.R. et al (2001). Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification. Biosens. Bioelectron., 16, 121–131. Tonyushkina, K., & Nichols, J. H. (2009). Glucose Meters: A Review of Technical Challenges to Obtaining Accurate Results. Journal of Diabetes Science and Technology (Online), 3(4), 971–980. Poghossian A., et al (2001) Functional testing and characterisation of (bio-)chemical sensors on wafer level. Electrochim. Acta,47, 243–249. Seo, H.I. et al (1997) ISFET glucose sensor based on a new principle using the electrolysis of hürdogen poroxide. Sensors and Actuators B: Chemical 40, 1-5 Yin L-T. et al, (2001) Glucose ENFET doped with MnO2 powder. Sens Actuators B Chem 76(1–3):187–192 Luo XL, et al, (2004). A novel glucose ENFET based on the special reactivity of MnO2 nanoparticles. Biosens Bioelectron. 19(10):1295-300. Schenck J. F. (1978). Theory, Design and Biomedical Applications of Solid State Chemical Sensors. Boca Raton: CRC Press. Lk 165–173. Bergveld P., (1996) The future of biosensors. Sens. Actuators, A, 56, 65–73 Kharitonov A.B. et al, (2001) The Use of Impedance Spectroscopy for the Characterization of Protein-Modified ISFET Devices: Application of the Method for the Analysis of Biorecognition Processes. J. Phys. Chem. B, 105, 4205–4213. Heather J.M. & Chain B. (2016). The sequence of sequencers: The history of DNA sequencing. Genomic 107, 1-8 Lee, H. et al. (2016). Third-generation sequencing and the future of genomics. BioRxiv, 048603 Wang J., (2000) From DNA biosensors to gene chips. Nucleic Acids Res., 28, 3011–3016. Bousse L. (1996), Whole cell biosensors. Sens. Actuators, B, 34, 270–275. Sakata T. et al (2013) Single embryo-coupled gate field effect transistor for elective single embryo transfer. Anal Chem. 85(14):6633-8. doi: 10.1021/ac4001018 Schütz S. et al (2000), Biosensors on the Basis of Insect Olfaction. Sens. Actuators, B, 2000, 65, 291–295 Wasilewski, Tomasz & Gebicki, Jacek & Kamysz, Wojciech. (2016). Bioelectronic nose: Current status and perspectives. Biosensors & Bioelectronics. 87. . 10.1016/j.bios.2016.08.080. Fitzgerald J.E. et al (2017) Artificial Nose Technology: Status and Prospects in Diagnostics. Trends Biotechnol. 35(1):33-42. doi: 10.1016/j.tibtech.2016.08.005 Bergveld P. (1970) Development of an Ion-Sensitive Solid-State Device for Neurophysiological Measurements, IEEE Trans. Biomed. Eng., 17, 70–71 Janata J. & Moss S. (1976) Chemically sensitive field effect transistors. Biomed. Eng.; 6:241–245 Caras S. & Janata J., (1980) Field effect transistor sensitive to penicillinAnal. Chem., 52, 1935–1937 Jobling D. T. et al (1981) Active microelectrode array to record from the mammalian central nervous systemin vitro. Med. Biol. Eng. Comput., 19, 553–560. Fromherz P. et al (1991) A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science, 252, 1290–1293 Schütz, S. et al (1997) A field effect transistor—insect antenna junction. Naturwissenschaften , 84,86 -88. Souteyrand E. et al (1997) Direct Detection of the Hybridization of Synthetic Homo-Oligomer DNA Sequences by Field EffectJ. Phys. Chem. B, 101, 2980–2985. Dzyadevich S.V. et al (1999) Application of enzyme field-effect transistors for determination of glucose concentrations in blood serum. Biosens Bioelectron.;14(3):283-7.