Resasuriin

Resasuriin (7-hüdroksü-10-oksidofenoksasiin-10-ium-3-oon; ka diasoresortsinool, Alamari sinine) on veeslahustuv värviline orgaaniline aine, mis on kasutatav nii pH-indikaatorina (ehk selle neeldumisspekter valguse nähtavas alas muutub, olenevalt sellest, kas molekul on protoneeritud) kui redoks-indikaatorina (ehk selle redutseerimisel tekib aine resorufiin, mille neeldumismaksimum valguse nähtavas alas erineb oluliselt resasuriini omast). Resasuriini levinumaks rakenduseks on aga kasutamine rakkude elulevuse sensorina, kuivõrd metaboolselt aktiivsetes (hingavates) rakkudes redutseerub resasuriin resorufiiniks. Kuigi resasuriin võib madalate pH väärtuste juures esineda happe vormis, on see kommertsiaalselt kättesaadav enamasti naatriumsoola kujul. Seepärast on allpool tabelis mainitud nii resasuriini, selle naatriumsoola kui ka resorufiini erinevad omadused. Resorufiini edasisel redutseerumisel tekib värvitu dihüdroresorufiin. Vaatamata sellele, et laetud molekulid läbivad rakumembraani üldiselt halvasti, on resasuriin siiski piisavalt hüdrofoobne, et elusraku plasmamembraani läbida. Elusrakkude mitokondrites ja tsütoplasmas redutseeritakse resasuriin ensüümide reduktaaside toimel, kasutades redutseeriva kofaktorina kas NADH, NADPH või ka FADH (võrdluseks: pH 7 ja 25 °C juures on resasuriini standardne redokspotentsiaal 380 mV, NADH ja NADPH oma 320 mV ning FADH oma 210 mV). Reaktsiooni käigus moodustub fluorestseeruv resorufiin, mis on samuti veeslahustuv ning läbib rakkude plasmamembraani. Mida rohkem on proovis elusrakke, seda kiiremini toimub resorufiini teke. Kui mõõta konkreetsel ajahetkel lahuse neelduvust (resasuriinile ja/või resorufiinile omase neeldumismaksimumi juures) ja/või fluorestsentsi intensiivsust (ergastades proovi resorufiinile omase neeldumismaksimumi juures), on võimalik kindlaks teha rakkude suhtelist elulevust proovis. See on kasulik näiteks juhul, kui soovitakse võrrelda eri ühendite või sama ühendi eri kontsentratsioonide toimet rakkudele: sel juhul tuleb kasutada sobivat negatiivset kontrolli (nt töötlemata rakud) ja positiivset kontrolli (nt rakkudeta proov, kus resorufiini teket ei toimu). Kuna resasuriini üleminek resorufiiniks on võimalik väga paljudes rakkudes (sh bakteri-, seene- ja loomarakkudes), on resasuriini kasutatud mitmeteks rakendusteks – näiteks piima bakteriaalse saastatuse määramiseks või seenevastaste ainete toime hindamiseks. 1991. aastal kasutati resasuriini esmakordselt imetajarakkude (spermide) hulga hindamiseks ning viimase 30 aasta jooksul on resasuriini rutiinselt kasutatud elulevuse sensorina nii 2D- kui 3D-rakukultuuri puhul. Resasuriinile sarnaseid sensoreid on teisigi (nt tetrasooliumvärvid nagu MTT), kuid resasuriini kasutavad meetodid omavad mitmeid eeliseid tänu resasuriini ja resorufiini heale lahustuvusele vees, suutlikkusele läbida rakumembraani, suhteliselt madalale toksilisusele ja kasutatavusele nii fluorimeetria kui kolorimeetria mõõtmistes. Resasuriini kasutava meetodi piirangutena on aga toodud välja järgmiseid aspekte: Rakkude elulevuse mõõtmine resasuriini abil on kaudne (st tegelikult mõõdetakse rakkude metaboolset aktiivsust); Pikaaegne töötlus resasuriiniga võib siiski omada toksilist toimet mõningatele rakkudele; Tsüklodekstriinid (tärklisest toodetavad oligosahhariidid, mida kasutatakse laialdaselt nt toiduainete- ja farmaatsiatööstuses) võivad moodustada komplekse resasuriini ja resorufiiniga, mõjutades elulevuse mõõtmise tulemusi; Resasuriini üleminek resorufiiniks võib toimuda ka väljaspool elusrakke, kui on loodud soodsad tingimused redoksreaktsiooni jaoks (nt fotokatalüütilise protsessi tulemusena kulla nanoosakestel). Ali-Vehmas, T.; Louhi, M.; Sandholm, M. (1991). "Automation of the resazurin reduction test using fluorometry of microtitration trays". Zentralblatt Fur Veterinarmedizin. Reihe B. Journal of Veterinary Medicine. Series B. 38 (5): 358–372. DOI:10.1111/j.1439-0450.1991.tb00883.x. ISSN 0514-7166. PMID 1927150. Kamiloglu, Senem; Sari, Gulce; Ozdal, Tugba; Capanoglu, Esra (2020). "Guidelines for cell viability assays". Food Frontiers (inglise). 1 (3): 332–349. DOI:10.1002/fft2.44. ISSN 2643-8429. Rampersad, Sephra N. (2012). "Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays". Sensors (Basel, Switzerland). 12 (9): 12347–12360. DOI:10.3390/s120912347. ISSN 1424-8220. PMC 3478843. PMID 23112716. Wagner, Andreas O.; Markt, Rudolf; Mutschlechner, Mira; Lackner, Nina; Prem, Eva M.; Praeg, Nadine; Illmer, Paul (15. august 2019). "Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions". Journal of Visualized Experiments: JoVE (150). DOI:10.3791/60155. ISSN 1940-087X. PMC 6796894. PMID 31475968. "Product Information: Resazurin (sodium salt)" (PDF). Cayman Chemicals. 27. oktoober 2022. Vaadatud 15. jaanuaril 2023. "R7017, Sigma-Aldrich: Resazurin sodium salt". Merck. Vaadatud 15. jaanuaril 2023. PubChem. "Resazurin". pubchem.ncbi.nlm.nih.gov (inglise). Vaadatud 15. jaanuaril 2023. PubChem. "3H-Phenoxazin-3-one, 7-hydroxy-, 10-oxide, sodium salt". pubchem.ncbi.nlm.nih.gov (inglise). Vaadatud 15. jaanuaril 2023. PubChem. "Resorufin". pubchem.ncbi.nlm.nih.gov (inglise). Vaadatud 15. jaanuaril 2023. Çakir, Semiha; Arslan, Emine (1. juuni 2010). "Voltammetry of resazurin at a mercury electrode". Chemical Papers (inglise). 64 (3): 386–394. DOI:10.2478/s11696-010-0007-9. ISSN 1336-9075. Cooper, Geoffrey M. (2000). "Cell Membranes". The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition (inglise). Knapp, Julia L. A.; González-Pinzón, Ricardo; Haggerty, Roy (2018). "The Resazurin-Resorufin System: Insights From a Decade of "Smart" Tracer Development for Hydrologic Applications". Water Resources Research (inglise). 54 (9): 6877–6889. DOI:10.1029/2018WR023103. Lavogina, Darja; Lust, Helen; Tahk, Maris-Johanna; Laasfeld, Tõnis; Vellama, Hans; Nasirova, Naila; Vardja, Markus; Eskla, Kattri-Liis; Salumets, Andres; Rinken, Ago; Jaal, Jana (2022). "Revisiting the Resazurin-Based Sensing of Cellular Viability: Widening the Application Horizon". Biosensors. 12 (4): 196. DOI:10.3390/bios12040196. ISSN 2079-6374. PMC 9032648. PMID 35448256. John, C. K. (1939). "Place of the Methylene Blue and Resazurin Reduction Tests in a Milk Control Program". American Journal of Public Health and the Nation's Health. 29 (3): 239–247. DOI:10.2105/ajph.29.3.239. ISSN 0002-9572. PMC 1529338. PMID 18014999. Pfaller, M. A.; Grant, C.; Morthland, V.; Rhine-Chalberg, J. (1994). "Comparative evaluation of alternative methods for broth dilution susceptibility testing of fluconazole against Candida albicans". Journal of Clinical Microbiology. 32 (2): 506–509. DOI:10.1128/jcm.32.2.506-509.1994. ISSN 0095-1137. PMID 8150963. Glass, R. H.; Ericsson, S. A.; Ericsson, R. J.; Drouin, M. T.; Marcoux, L. J.; Sullivan, H. (1991). "The resazurin reduction test provides an assessment of sperm activity". Fertility and Sterility. 56 (4): 743–746. DOI:10.1016/s0015-0282(16)54609-3. ISSN 0015-0282. PMID 1915952. Walzl, Angelika; Unger, Christine; Kramer, Nina; Unterleuthner, Daniela; Scherzer, Martin; Hengstschläger, Markus; Schwanzer-Pfeiffer, Dagmar; Dolznig, Helmut (2014). "The Resazurin Reduction Assay Can Distinguish Cytotoxic from Cytostatic Compounds in Spheroid Screening Assays". Journal of Biomolecular Screening. 19 (7): 1047–1059. DOI:10.1177/1087057114532352. ISSN 1552-454X. PMID 24758920. Markossian, Sarine; Grossman, Abigail; Brimacombe, Kyle; Arkin, Michelle; Auld, Douglas; Austin, Chris; Baell, Jonathan; Chung, Thomas D. Y.; Coussens, Nathan P., toim-d (2004). Assay Guidance Manual. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. PMID 22553861. Lambou, M. G. (19. juuni 1953). "2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloride as a rapid indicator of viability in cottonseed". Science (New York, N.Y.). 117 (3051): 690–693. DOI:10.1126/science.117.3051.690. ISSN 0036-8075. PMID 13076142. Pace, Richard Thomas; Burg, Karen Jane Leadbetter (2015). "Toxic effects of resazurin on cell cultures". Cytotechnology. 67 (1): 13–17. DOI:10.1007/s10616-013-9664-1. ISSN 0920-9069. PMC 4294845. PMID 24242827. Csepregi, Rita; Lemli, Beáta; Kunsági-Máté, Sándor; Szente, Lajos; Kőszegi, Tamás; Németi, Balázs; Poór, Miklós (10. veebruar 2018). "Complex Formation of Resorufin and Resazurin with Β-Cyclodextrins: Can Cyclodextrins Interfere with a Resazurin Cell Viability Assay?". Molecules (Basel, Switzerland). 23 (2): 382. DOI:10.3390/molecules23020382. ISSN 1420-3049. PMC 6017802. PMID 29439432. Alejo, Carlos J. Bueno; Fasciani, Chiara; Grenier, Michel; Netto-Ferreira, José Carlos; Scaiano, Juan C. (18. oktoober 2011). "Reduction of resazurin to resorufin catalyzed by gold nanoparticles: dramatic reaction acceleration by laser or LED plasmon excitation". Catalysis Science & Technology (inglise). 1 (8): 1506–1511. DOI:10.1039/C1CY00236H. ISSN 2044-4761.