RNA polümeraas

RNA polümeraas (RNApol, RNAP) ehk DNA-sõltuv RNA polümeraas on ensüüm, mis transkriptsiooni käigus sünteesib uue RNA molekuli, kasutades matriitsina DNA-d. Ensüüm on klassifikatsioonilt nukleotidüül-transferaas. Prokarüootidel on vaid üks RNA polümeraas, samas kui eukarüootides leidub kuni viis erinevat tüüpi (RNA pol I-III, taimedes lisaks RNA pol IV-V). Eukarüootsed RNA polümeraasid erinevad struktuurilt ja sünteesitava RNA poolest. Transkriptsiooni põhimehhanismid ja regulatsioon on kõrgelt konserveerunud, seega esineb homoloogia ka erinevate RNA polümeraaside vahel. RNA polümeraas meenutab struktuurilt krabi sõrga (crab claw), mille keskel paikneb lõhe (cleft), mille kaudu siseneb DNA aktiivtsentrisse. Ensüümi aktiivtsentris on konserveerunud järjestusmotiiv, mille 3 aspartaadijääki on koordinatiivselt seondunud Mg2+-ioonidega. Mg2+-ioonide ülesandeks on neutraliseerida RNA-ahelasse lisatavate nukleotiidtrifosfaatide (NTP) fosfaatgruppide negatiivset laengut. Ensüümi katalüütilise tsentri arhitektuur on kõrgelt konserveerunud kõigis organismides. Transkriptsioon toimub fundamentaalsete mehhanismide osas kõigis organismides sarnaselt. Siiski on see eukarüootides mitme aspekti poolest keerulisem. Esiteks leidub eukarüootides 3 RNA polümeraasi (Pol I-III), mis transkribeerivad erinevaid geene, samas kui prokarüootidel vastutab kõigi geenide transkribeerimise eest üks RNA polümeraas. Teiseks on eukarüootse transkriptsiooni läbiviimiseks vajalik mitmete abistavate valkude (transkriptsioonifaktorite) osalus. Eukarüootne RNA polümeraas pole võimeline initsieerima transkriptsiooni vaid DNA promootorjärjestuse olemasolul, vaid vajab mitmete transkriptsioonifaktorite kohalolu. Tranksriptsiooni mõistmiseks on peamiselt uuritud RNA Pol II ja sellele seonduvaid valke. Esmalt on vajalik transkriptsioonifaktorite seondumine promootorjärjestusega, kusjuures nii promootorid kui ka faktorid on eri geenide puhul väga erinevad. Basaalseteks transkriptsioonifaktoriteks on need, mis seonduvad kõigi Pol II poolt transkribeeritavate geenide promootoritega, ja mis seega moodustavad basaalse transkriptsiooniaparaadi. Lisaks võib seonduda veel geenipetsiifilisi faktoreid, mis individuaalselt reguleerivad geeniekspressiooni. Transkriptsiooni toimumiseks on vajalik DNA ahelate lokaalne teineteisest eraldumine, et moodustuks vaba matriitsahel. Promootorjärjestus sisaldab konsensuselemente, mis paiknevad transkriptsiooni alguspunktist ülesvoolu. TATA-järjestus (TATA box) on üks paremini kirjeldatud ja uuritud konsensusjärjestusi, mis paikneb transkriptsiooni algussaidist 30 nukleotiidi ülesvoolu. Siiski esineb see vaid osade geenide promootorites, mistõttu leidub veel teisigi konsensuslikke DNA-motiive, näiteks CAAT-järjestus positsioonis −80, GC-järjestus ning oktameerne järjestus (octamer box). RNA polümeraas I on spetsialiseerunud ribosomaalse RNA (rRNA) geenide transkriptsiooniks. Primaarseks transkriptiks on 45S pre-rRNA, mis protsessitakse 28S, 18S ja 5,8S rRNA-deks. Kromosoomipiirkondadest, kus sisalduvad rRNA geenid (inimeses kromosoomid 13, 14, 15, 21 ja 22), moodustub tuumas selgelt eristuv struktuur – tuumake. rRNA geenide transkribeerimine on esimene samm ribosoomide biogeneesis. RNA pol I koosneb pagaripärmis (Saccharomyces cerevisiae) 14 subühikust, selle molekulmass on 590 kDa. Mitmed Pol I alaühikud sisaldavad rohkemal või vähemal määral homoloogseid polüpeptiide teiste eukarüootsete polümeraaside subühikutega. Lisaks on polümeraasil 5 identset subühikut (Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10, Rpb12) Pol II ja Pol III-ga. Pol I subühikud A49 ja A34.5 omavad homoloogiat RNA pol II transkriptsioonifaktori TFIIF kahe suurima subühikuga. A49 ja A34.5 kompleks on polümeraasi küljes, ent funktsioneerib elongatsioonifaktorina.  Pikemalt artiklis RNA polümeraas II RNA polümeraas II osaleb kõigi valke kodeerivate geenide transkriptsioonis. Transkriptideks on eel-mRNA, eel-miRNA ja muud struktuursed ja regulatoorsed RNA-d. RNA polümeraas II on 12-subühikuline. Ensüümkompleks on jagatav neljaks mobiilseks elemendiks – südamik (core), klamber (clamp), lõug (jaw lobe) ja riiul (shelf). Südamiku moodustavad subühikud on ühised kõigil rakulistel polümeraasidel. Ensüümi keskel paikneb lõhe, mille kaudu siseneb aktiivtsentrisse DNA. Klambri ülesanne on avada ja sulgeda lõhe. Riiuli ka lõua elemendid ei liigu suurel määral, aga saavad pöörelda paralleelselt aktiivtsentriga. Pol II suurima subühiku Rpb1 C-terminus (C-terminaalne domeen ehk CTD) koosneb YSPTSPS kordusest. Sõltuvalt organismist võib neid seitsme aminohappe kordusi olla 25–52 (inimeses 52, pagaripärmis 26). CTD on platvormiks, kuhu seonduvad faktorid, mis vahendavad transkriptsiooni initsiatsiooni, elongatsiooni ja terminatsiooni. Lisaks interakteeruvad CTD-ga ka need valgud, mis teostavad posttranskriptsioonilist mRNA protsessimist. CTD korduvates motiivides saab fosforüleerida Ser2, Ser5, Ser7 või Thr4. Tekkinud modifikatsioonimuster on indikaatoriks seonduvatele faktoritele. Defosforüleeritud CTD on vajalik preinitsiatsioonikompleksi (PIC) moodustumiseks. Tranksriptsiooni initsieerimiseks tuleb fosforüleerida Ser5. Mediaator on suur valkkompleks, mis on transkriptsiooni toimumiseks sama oluline kui transkriptsioonifaktorid ja Pol II. Mediaatori kohaloluta transkriptsiooni ei initsieerita. Mediaator seondub Pol II ja tranksriptsioonifaktoritega. Seondumine stabiliseerib preinitsiatsioonikompleksi moodustumist ja kompleksi säilimist läbi mitme transkriptsioonitsükli. Mediaator mõju võib olla nii transkriptsiooni aktiveeriv kui inhibeeriv. RNA polümeraas III transkribeerib tRNA-sid, 5S rRNA ning snRNA molekule. Pol III vajab transkriptsiooni initsiatsiooniks 3 transkriptsioonifaktorit. TFIIIB toob polümeraasi promootorile. TFIIIB koostisse kuulub TATA-seoseline valk TBP (TATA binding protein). TFIIIC vahendab TFIIIB seondumist promootoritele, milles puudub TATA-element. TFIIIA seondub ainult 5S rRNA geenide promootoritele ning on platvormiks, kuhu seondub TFIIIC. Polümeraasid IV ja V on hiljuti avastatud ensüümid, mis esinevad vaid taimerakkudes. Nende struktuur on sarnaneb RNAP II-ga, kusjuures osad subühikud on kodeeritud samade geenide poolt. RNAP IV ja V osalevad siRNA-de (small-interfering RNAs) transkribeerimises. Pol IV ja mitmete teiste ensüümide abil sünteesitakse (p4-)siRNA-d, mis indutseerivad endaga homoloogsete järjestuste metülatsiooni (RdDM). RNA interferents vaigistab geene ning on seeläbi kaitsemehhanismiks viiruste ja transposoonide vastu. Geenide vaigistamise mehhanismiks on RNA-suunatud DNA metüleerimine (RdDM). Pol IV sünteesib siRNA-sid tuhandetest korduvatest genoomsetest lookustest, kaasa arvatud transposoonidest. Pol IV interakteerub RNA-sõltuva RNA polümeraasiga (RdRp), mis sünteesib siRNA-le komplementaarse ahela. Seejärel toimub tekkinud kaheahelalise RNA lõikamine Dicer-tüüpi endonukleaasi poolt. Saadakse 24 nukleotiidi pikkused siRNA-d, mis seondununa AGO-valkudega (Argonaut) leiavad üles spetsiifilise regiooni genoomis. AGO/p4-siRNA/PolV kompleks ja DNA metüleerimiseks vajaminevad lisavalgud vaigistavad transkriptsiooni. Arhed moodustavad eubakterite ja eukarüootide kõrval kolmanda eluslooduse domeeni. Arhed on tsütoloogiliselt ja morfoloogiliselt sarnased bakteritega, kuid molekulaarsete kriteeriumite (DNA järjestuste võrdlus, rRNA geenid jne) alusel on nähtud arhede ja eukarüootide põlvnemist ühisest eellasest. Arhede transkriptsiooni uurimisel on leitud sarnasusi nii eukarüootide kui ka bakteritega. Basaalne transkriptsiooniaparaat, mis koosneb RNA polümeraasist ja basaalsetest transkriptsioonifaktoritest (GTF, general transcirption factors) sarnaneb eukarüootidega, kuid regulaatorvalgud, aktivaatorid ja repressorid, on pigem lähedased bakteriaalsetele faktoritele. Arhede RNA polümeraas koosneb sõltuvalt liigist 11–13 alaühikust (A’, A’’, B, D, K, L, F, H, E, G, N, P, Rpo13). Preinitsiatsioonikompleksi moodustavad RNA polümeraas ning transkriptsioonifaktorid – TBP, TFB ja TFE, mis on eukarüootsete TBP, TFIIB ja TFIIEα ortoloogid. TFIIB-l on DNA lahtikeeramise aktiivsus, mida on näidatud ka arhede TFB-l. TBP on väga konserveerunud valk, mis esineb kõigis kirjeldatud arhedes ja eukarüootides, kuid mitte bakterites. Escherichia coli RNA polümeraas koosneb viiest subühikust – α1, α2, β, β’ ja ω. Molekulmass ca 480 kDa. Lisaks on oluline sigmafaktor ehk σ-faktor, mida võib lugeda ainsaks bakteriaalseks transkriptsioonifaktoriks. σ-faktor vahendab promootori ja RNA polümeraasi vahelist spetsiifilist seondumist ning on vajalik transkriptsiooni initsiatsiooniks. σ-faktor ei ole tugevalt polümeraasiga seotud ning ei ole vajalik ensüümi katalüütilise aktiivsuse jaoks. σ-faktori peamiseks ülesandeks on identifitseerida transkriptsiooni initsiatsiooni alguspunkt, pärast initsiatsiooni σ-faktor dissotsieerub. Prokarüootidel on geenid koondunud operonideks, mistõttu transkribeeritakse ühe üksusena mitu geeni. Sellist operonilt sünteesitud RNA-molekuli nimetatakse polütsistroonseks RNA-ks. Mitmete geenide promootorjärjestuses on defineeritud kuuenukleotiidilised konsensuselemendid, mis paiknevad transkriptsiooni startsaidist positsioonides −10 ja −35. RNA polümeraas võtab promootoriga seondudes enda alla ligi 60 nukleotiidi pikkuse ala, kusjuures σ-faktor seondub spetsiifiliselt −35 ja −10 regioonidega. σ-faktori puudumisel seondub RNA polümeraas promootoriga ebaspetsiifiliselt ja madala afiinsusega. Leidub erinevaid σ-faktoreid, mis tunnevad ära teatud tüüpi promootoreid. Näiteks σ70 on E. colis ekspresseeritud pidevalt ning selle ülesandeks on koduhoidjate geenide (housekeeping genes) promootorite äratundmine; σ32 vastutab kuumašokigeenide (heat shock promootorite äratundmise eest. Polümeraasi seondumist promootoriga nimetatakse suletud kompleksiks, kuna DNA lahtikeerdumist toimunud ei ole. Polümeraas avab DNA kaksikheeliksi 15 lämmastikaluse ulatuses ning moodustub avatud kompleks. Pärast esimeste nukleotiidide ühinemist ja RNA-ahela pikenemist umbes 10 nukleotiidi võrra, vabaneb σ-faktor polümeraasi küljest. Viirused vajavad erinevaid polümeraase, et replitseerida genoomi ja ekspresseerida geene. Viirustel, kes oma elutsükli veedavad tsütoplasmas, peavad need ensüümid olema kodeeritud endi genoomi poolt. Need, kelle genoomiks on DNA-molekul, vajavad DNA-sõltuvat RNA polümeraasi (DdRp). RNA-viirused vajavad nii genoomi replikatsiooniks kui ka transkriptsiooniks RNA-sõltuvaid RNA polümeraase (RdRp). Konserveerunud järjestuselemente leidub kõigi viiruslike polümeraaside puhul (RdRp, DdRp, RdDp, DdDp). Funktsioonilt on viiruslikud polümeraasid sarnased mitmesubühikulistele prokarüootsetele ja eukarüootsetele variantidele. Viiruslikud polümeraasid sisaldavad neile iseloomulikke konsensusjärjestusi, mis on olulised matriitsile seondumiseks, nukleotidüül-transferaasseks aktiivsuseks, esimese nukleotiidi positsioneerimiseks ja valgu struktuuri säilitamiseks. On kirjeldatud 4 konserveerunud järjestusmotiivi – A, B, C ja D –, mis on reeglina esindatud viiruslikes polümeraasides. Motiivid A ja C sisaldavad katalüütilise tähtsusega Asp-jääke, mis seovad koordinatiivsidemetega 2 kahevalentset metalliiooni (Mg2+ või Mn2+). Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9839/ Sainsbury, S., Bernecky, C., & Cramer, P. (2015). Structural basis of transcription initiation by RNA polymerase II. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 16(3), 129–143. http://doi.org/10.1038/nrm3952 A. Heinaru. Geneetika õpik kõrgkoolile. Tartu: Tartu Ülikooli kirjastus, 2012. lk 269–274 Kuhn, C.-D., Geiger, S. R., Baumli, S., Gartmann, M., Gerber, J., Jennebach, S., … Cramer, P. (2007). Functional Architecture of RNA Polymerase I. Cell, 131(7), 1260–1272. http://doi.org/10.1016/j.cell.2007.10.051 Meyer PA, Ye P, Suh M-H, Zhang M, Fu J. Structure of the 12-Subunit RNA Polymerase II Refined with the Aid of Anomalous Diffraction Data. The Journal of Biological Chemistry. 2009;284(19):12933-12939. doi:10.1074/jbc.M809199200. Hahn, S. (2004). Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nature Structural & Molecular Biology, 11(5), 394–403. http://doi.org/10.1038/nsmb763 Hsin, J., & Manley, J. L. (2012). The RNA polymerase II CTD coordinates transcription and RNA processing. Genes and Development, 2119–2137. http://doi.org/10.1101/gad.200303.112.Transcription Kornberg, R. D. (2005). Mediator and the mechanism of transcriptional activation. Trends in Biochemical Sciences, 30(5), 235–239. http://doi.org/10.1016/j.tibs.2005.03.011 Huang, Y., Kendall, T., Forsythe, E. S., Dorantes-Acosta, A., Li, S., Caballero-Pérez, J., … Mosher, R. A. (2015). Ancient Origin and Recent Innovations of RNA Polymerase IV and V. Molecular Biology and Evolution, 32(7), 1788–1799. http://doi.org/10.1093/molbev/msv060 Langer, D., Hain, J., Thuriaux, P., & Zillig, W. (1995). Transcription in archaea: similarity to that in eucarya. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92(13), 5768–72. http://doi.org/10.1073/pnas.92.13.5768 Sung-Hoon Jun, Matthew J. Reichlen, Momoko Tajiri & Katsuhiko S. Murakami (2011) Archaeal RNA polymerase and transcription regulation, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 46:1, 27–40, http://dx.doi.org/10.3109/10409238.2010.538662 Werner, F. (2007). Structure and function of archaeal RNA polymerases. Molecular Microbiology, 65(6), 1395–1404. http://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.05876.x Bae, B., Feklistov, A., Lass-napiorkowska, A., Landick, R., & Darst, S. A. (2015). Structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme open promoter complex, 1–23. http://doi.org/10.7554/eLife.08504 Rossmann, Michael G.; Rao, Venigalla B.; Choi, Kyung H. 2011. Viral Molecular Machines. Springer US. Viral Polymerases, p 267-304. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4614-0980-9_12