MAT-lookus

MAT-lookus on DNA lõik pagaripärmi kolmandas kromosoomis, mis sisaldab informatsiooni pärmi paardumistüübi kohta. Pagaripärmi (Saccharomyces cerevisiae) paardumistüübi määravad kaks mittehomoloogset alleeli MATa ja MATα. MAT lookuse uurimisega on avastatud olulisi teadmisi geeniekspressiooni vaigistamise, heterokromatiini moodustamise ja doonorjärjestuste regulatsiooni ning kättesaadavuse kohta. Reaalajas MAT-lookuse vahetuse analüüs on andnud kõige täpsema kirjeldus selle kohta, mis juhtub homoloogilise rekombinatsiooni protsessis kaheahelalise katke ajal. Pärmirakkudel on märkimisväärne võime vahetada oma paardumistüüpi iga generatsiooniga. Selle mehhanismiks on sait-spetsiifiline homoloogiline rekombinatsioon. Antud vahetusprotsessis osalevad kaks vaikivat (mitteekspresseeritud) lookust HMLa ja HMRα, mis kannavad paardumistüübi vahetumiseks vajalikku informatsiooni. Need vaigistatud lookused asuvad sama kromosoomi vastasotstes, kus paikneb ka MAT-lookus ise. MAT-lookus asub kolmanda kromosoomi parema õla keskel, umbes 100 kb nii tsentromeerist kui ka telomeerist. Pagaripärmi MAT-lookuse vahetusel põhineva paardumistüübi vahetamise mehhanism sõltub järgnevatest fenomenidest: 1. Kaks vaigistatud paardumistüübi järjestuse koopiat käituvad MAT vahetuse ajal doonoritena. 2. Toimub programmeeritud sait-spetsiifiline kahe-ahelaline katke MAT-lookuses, mille tagajärjel asendatakse MAT-lookuse järjestus vastaspaardumistüübi järjestusega. 3. Doonorjärjestuse (vaigistatud vastaspaardumistüübi järjestuse) selekteerimine toimub spetsiifiliselt. Pärmirakkudel ilmnevad kaks haploidset paardumistüüpi: MATa ja MATα ning nende konjugeerumisel tekkinud diploidne paardumistüüp MATa/MATα. Nagu paljudel seentel, on ka pärmil võime konverteerida osasid koloonias olevaid rakke ühest paardumistüübist teise. See omadus annab võrreldes haploidsete rakkudega mitmeid evolutsioonilisi eeliseid, millest tähtsaimad on võime läbida meioosi ning omadus toitainevaesel ajal moodustada spoore. MATα kodeerib kahte valku: MATα1 ja MATα2. MATα1 koostöös valguga Mcm1 aktiveerivad hulga α-spetsiifilisi geene, nende hulgas ka paardumisferomooni α-faktorit ning vastaspaardumistüübi feromooni a-faktori transmembraanset retseptorit Ste2 kodeerivaid geene. Mainitud feromoonid käivitavad rakutsükli G1-faasi seisaku. MATα2 kodeerib valku, mis ühineb Mcm1-ga. Tekkiv MATα2-Mcm1 kompleks represseerib a-spetsiifilised geenid, kaasa arvatud need, mis toodavad a-faktorit ning Ste3 retseptorvalku, mis tuvastab α-faktori olemasolu. Kui MATα1 ja MATα2-te kontrolliv promootor on kustutatud, käituvad haploidsed rakud identselt a-paardumistüüpi rakkudega, sest Matα2 puudumisel on a-spetsiifilised geenid pidevalt avaldatud ning α-spetsiifilisi geene Matα1 puudumisel neid ei transkribeerita. MATa/MATα on mittepaarduv, aga MAT∆/MATα on alfa-paardumistüübiga. Fakt, et MATa/MATα on mittepaarduv, tuleneb väga stabiilsest Mata1 ja Mata2 valkude korepressorist, mis lülitab välja mitmed haploidispetsiifilised geenid ning lubab ekspresseeruda vaid diploidispetsiifilistel geenidel. A1-α2 repressor lülitab välja MATα1 ehk α-spetsiifiliste geenide aktivaatori transkriptsiooni, kuid lubab ekspresseeruda MATα2-l, mis on a-spetsiifiliste geenide repressor. Nii ei ekspresseeru ei α ega a geenid ning sellepärast on diploidne rakk mittepaarduv. Paardumistüübist sõltuvaid erinevusi on mitmeid, kusjuures küsimus ei ole vaid haploidsuses või diploidsuses. MATa/MATα diploidid on märkimisväärselt erinevad haploididest: esiteks on need mittepaarduvad, teiseks võivad need läbida meioosi ning moodustada spoore (a- ja α-paardumistüüpidega diploidid seda ei suudaks). Meioosi sisenemist ja sporulatsiooni kontrollib RME1 geeni repressor a1-α2. Kui RME1 on kustutatud, siis saavad ka MATa/MATa või mat∆/MATα diploidid läbida nii meioosi kui ka sporulatsiooni. Lisaks sellele on MATa ja MATα paardumistüübi vahetamisel osalev HO-endonukleaas ekspresseeritud haploidides, kuid vastaspaardumistüübiga diploidi (MATa/MATα) moodustumisel represseerib HO-endonukleaasi ekspressiooni a1-α2 repressor. Veel üks võtmegeen paardumistüübi kontrollis on NEJ1, mis kodeerib olulist mittehomoloogilise DNA-otste ühinemise (nonhomologus end joining) komponenti. Kaheahelalisi katkeid kromosoomis saab parandada kas homoloogilise rekombinatsiooni või mittehomoloogse DNA-otste ühendamise kaudu. Haploidides on mõlemad protsessid tõhusad; näiteks HO endonukleaasi tekitatud kaheahelalist katket MAT-lookuses parandatakse umbes 90% ulatuses HML või HMR doonorjärjestuse abiga ning ülejäänud 10% kasutavad mittehomoloogset lõppude ühendamist, et kaheahelalise katke otsasid uuesti kokku ligeerida. Pagaripärmil on võime valida kahe doonorjärjestuse HML ja HMR vahel kindla mehhanismi abil. HML ning HMR järjestust ei lõigata HO-endonukleaasiga, vaid mõlemat järjestust kasutatakse ainult rekombinatsiooni protsessis doonorina. Pärm peab aga kasutama õiget doonorit. MATa järjestusega rakk peab leidma ja rekombineeruma HMLα, mitte HMRa-ga, et rekombinatsiooniline kaheahelalise katke parandamine viiks ka paardumistüübi vahetumiseni. HML geen sisaldab Ya ning HMR geen Yα järjestust, mis kannavad vajalikku informatsiooni, et peale paardumistüübi vahetusprotsessi oleks homoloogilise rekombinatsiooni tagajärjel uues MAT-lookuses õige vastastüübi järjestus. Katsete tulemused on näidanud aga huvitavat aspekti: kui HML järjestus välja vahetada terve HMR lookusega, ei muuda see doonorjärjestuse valikut. Siit võib järeldada, et doonorjärjestuse valikul mängib suuremat rolli doonori asukoht ja mitte selles sisalduv info ehk mitte HML ja HMR lookuste järjestuste erinevused. MATα eelistus valida just HMR ei sõltu MATα1 geenist, kuid on tugevalt sõltuv MATα2 geenist, mis käitub a-spetsiifiliste geenide repressorina. MATa doonorjärjestuse valik ei sõltu funktsionaalsest MATa1 geenist. Sellest teadmisest võib järeldada, et MATa rakud aktiveerivad HML lookuse mitme a-spetsiifilise geeniprodukti abil, mis MATα rakkudes on välja lülitatud ning α-spetsiifilised valgud võiksid aktiveerida HMR lookust. Kuid samuti on täheldatud, et HMR lookust kasutatakse eelistatud lookusena ja kogu muu aktiivne regulatsioon keerleb HML lookuse kättesaadavamaks tegemise ümber. Seega saab MATa paardumistüübiga rakk, milles HML on kustutatud, kergesti kasutada HMR lookust, kuid 10–20% MATα rakkudest surevad, kui nende ainus doonor on HML lookus. Kogu doonorjärjestuse valikut kontrollib rekombinatsiooni enhanser (võimendaja) ehk RE, mis asub samuti kolmandal kromosoomil, HMLα ja MATa lookuste vahel. Kuigi terve RE mehhanism ei ole selge, on teada, et a-paardumistüübiga rakkudes on see aktiveeritud ning α-rakkudes represseeritud. Antud enhanserilt transkribeeritakse mitmeid a-paardumistüübiga rakule iseloomulikke mittekodeerivaid RNA-sid. RE järjestuse aktiivsust a-rakkudes kontrollivad Mcm1 ja Fkh1, kusjuures Mcm1 seondumine on vajalik nii mittekodeerivate RNA-de transkriptsiooniks kui ka Fkh1 seondumiseks. Täpsemalt avab Mcm1 kromatiini struktuuri konserveerunud domeenide ümbert, et hõlbustada Fkh1 seondumist, mis omakorda määrab doonorjärjestuse valiku taset. Terve RE kustutamine põhjustab a-paardumistüübiga rakkude hulgas doonorjärjestuse valikul suure muutuse: HML-i eelistamine langeb ∼85% pealt ∼15% peale. Fkh1 valgu kustutamine vähendab a-paardumistüübiga rakkude HML järjestuse eelistamist ∼35%-ni. HO-endonukleaas, mida kodeerib HO geen, vastutab pärmi paardumistüübi vahetuse initsiatsiooni eest. Seda ekspresseeritakse ainult haploidsetes rakkudes, diploidides on tema transkriptsioon represseeritud MATa1/MATα2 repressori seondumisega mitmetele seondumissaitidele. HO-endonukleaas tunneb ära 24 aluspaari pikkuse saidi MAT-lookuses ning teeb sinna kaheahelalise katke. Kuigi sellel on äratundmisjärjestused nii HML kui ka HMR saidis, takistab kromatiini struktuur seal lõike tegemist. HO-endonukleaasil on võime teha vaid üks lõige, peale mida viiakse see proteasoomi lagundamisele. Saccharomyces cerevisiae metsiktüüpi tüvedes ekspresseerub HO-endonukleaas pidevalt, kuid laboratoorsetes tüvedes on ta enamasti välja lülitatud. Haber JE, 2012. Mating-Type Genes and MAT Switching in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 191(1): 33–64. Hagen D. C., Bruhn L., Westby C. A., Sprague G. F., Jr, 1993. Transcription of alpha-specific genes in Saccharomyces cerevisiae: DNA sequence requirements for activity of the coregulator alpha 1. Mol. Cell. Biol. 13: 6866–6875. Smith D. L., Johnson A. D., 1992. A molecular mechanism for combinatorial control in yeast: MCM1 protein sets the spacing and orientation of the homeodomains of an alpha 2 dimer. Cell 68: 133–142. Keleher C. A., Passmore S., Johnson A. D., 1989. Yeast repressor alpha 2 binds to its operator cooperatively with yeast protein Mcm1. Mol. Cell. Biol. 9: 5228–5230. Herschbach B. M., Arnaud M. B., Johnson A. D., 1994. Transcriptional repression directed by the yeast alpha 2 protein in vitro. Nature 370: 309–311. Strathern J., Hicks J., Herskowitz I., 1981. Control of cell type in yeast by the mating type locus. The alpha 1-alpha 2 hypothesis. J. Mol. Biol. 147: 357–372. Goutte C., Johnson A. D., 1988. a1 protein alters the DNA binding specificity of alpha 2 repressor. Cell 52: 875–882. Kegel A., Sjostrand J. O., Aström S. U., 2001. Nej1p, a cell type-specific regulator of nonhomologous end joining in yeast. Curr. Biol. 11: 1611–1617. Pâques F., Haber J. E., 1999. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 349–404. Weiler KS, Broach JR. Donor locus selection during Saccharomyces cerevisiae mating type interconversion responds to distant regulatory signals. Genetics. 1992;132:929–942. Wu X., Haber J. E., 1995. MATa donor preference in yeast mating-type switching: activation of a large chromosomal region for recombination. Genes Dev. 9: 1922–1932. Hicks J., Strathern J., Herskowitz I., 1977. The cassette model of mating-type interconversion, pp. 457–462 DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes, edited by Bukhari A., Shapiro J., Adhya S., editors. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Wu X., Haber J. E., 1996. A 700 bp cis-acting region controls mating-type dependent recombination along the entire left arm of yeast chromosome III. Cell 87: 277–285. Wu, X., and J. E. Haber. 1996. A 700-bp cis-acting region controls mating-type dependent recombination along the entire left arm of yeast chromosome III. Cell 87:277–285. Rine, J., and I. Herskowitz. 1987. Four genes responsible for a position effect on expression from HML and HMR in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 116:9–22. Sun, K., E. Coic, Z. Zhou, P. Durrens, and J. E. Haber. 2002. Saccharomyces forkhead protein Fkh1 regulates donor preference during mating-type switching through the recombination enhancer. Genes Dev. 16:2085–2096. Ercan S, Reese JC, Workman JL and Simpson RT (2005) Yeast Recombination Enhancer Is Stimulated by Transcription Activation. Mol Cell Biol. 25(18): 7976–7987. Nasmyth K and Shore D (1987) Transcriptional regulation in the yeast life cycle. Science 237(4819):1162–70. Nickoloff JA, et al. (1986) A 24-base-pair DNA sequence from the MAT locus stimulates intergenic recombination in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 83(20):7831–5. Jin Y, et al. (1997) Ho endonuclease cleaves MAT DNA in vitro by an inefficient stoichiometric reaction mechanism. J Biol Chem 272(11):7352-9.