RRNA transkriptsiooni regulatsioon soolekepikeses

Ribosomaalse RNA (rRNA) transkriptsiooni regulatsioon on protsess, mille teel mõjutatakse rRNA hulka rakkudes. Antud artikkel kirjeldab seda protsessi soolekepikeses (Escherichia coli ehk E. coli). Kuna E. coli on üks geneetika, molekulaarbioloogia ja biokeemia uuritumatest mudelorganismidest, siis olemasolevate teadmiste najal E. colist on võimalik otsida analoogilisi mehhanisme ka teistest organismidest. rRNA on rakkude elutegevusele oluline, sest vastavad molekulid (bakterites 16S, 23S ja 5S rRNA molekulid) moodustavad vahekorras 1:1:1 koos ribosomaalsete valkudega ribosoomid. Ribosoome on rakkudes vaja valkude tootmise jaoks. Ribosoomide hulka rakus kontrollitakse põhiliselt rRNA transkriptsiooni tasemel. E. colis on seitse peaaegu identset rrn operoni, kuhu on koondunud 16S, 23S ja 5S rRNA molekule kodeerivad geenid. Nendelt viib rRNA transkriptsiooni läbi ensüüm RNA polümeraas (RNAP). Selle protsessi käigus toimub transkriptsiooni alustamine ehk initsiatsioon, RNA ahela pikenemine ehk elongatsioon ning RNA ahela lõpetamine ehk terminatsioon. rRNA transkriptsiooni regulatsioon toimub põhiliselt initsiatsiooni etapis. Erinevad tegurid võivad soodustada RNAP seostumist promootorile (positiivne regulatsioon) või seda takistada (negatiivne regulatsioon). rRNA transkriptsiooni regulatsioon sõltub keskkonnatingimustest ja rakkude kasvukiirusest. Kui keskkonnas on piisavalt toitaineid, toodetakse palju rRNAd ja rakud saavad kiiresti jaguneda. Rakud saavad paljuneda ainult siis, kui neis on piisavalt ribosoome, et toota piisavas koguses rakkude jagunemiseks vajalikke valke. rRNA transkriptsioon moodustab raku kogutranskriptsioonist 75%. Kui keskkonnas on mõnda toitainet vähe või puudu (näiteks suhkruid või aminohappeid), siis satuvad rakud stressi ja rRNA transkriptsioon aeglustub. E. coli kromosoomis on seitse peaaegu identset operoni, millelt rRNAd toodetakse: rrnC, rrnA, rrnB, rrnE, rrnD, rrnG ja rrnH. Neli neist, operonid rrnCABE, paiknevad replikatsiooni alguspunkti oriC lähedal. Need seitse operoni hõlmavad kromosoomi suurusest (4,6 megaaluspaari) vaid 38 kiloaluspaari ehk vähem kui 1% genoomist. Seega peavad need operonid võistlema ülejäänud 99% genoomiga RNAPga seondumise pärast, et transkriptsioon toimuda saaks. Kuna RNAP hulk on rakus kindlal ajamomendil piiratud, ei piisa sellest, et transkriptsioon saaks kõikidelt genoomi operonidelt ja geenidelt korraga toimuda. rRNA transkriptsiooni toimumist lihtsustab asjaolu, et rrn operonide transkriptsiooni ja kromosoomi replikatsiooni suunad ühtivad. Seega on tõenäosus, et RNAP ja replikatsiooni läbi viiv DNA polümeraas põrkuksid, väiksem ning transkriptsioon kulgeb suurema tõenäosusega lõpuni. Kui geeni asend genoomis on selline, et transkriptsiooni ja replikatsiooni suunad on vastandlikud, võivad DNA polümeraas ja RNAP replikatsiooni toimumisel põrkuda. Seetõttu võivad RNAP ja DNA polümeraas DNA ahelalt lahti tulla ning transkriptsioon ja replikatsioon enneaegselt seiskuda. DNA polümeraasi ja RNAP põrkumine võib kaasa tuua DNA kahjustusi ja kromosoomide ebastabiilsust. Operonide rrnCABE paiknemine oriC läheduses põhjustab kiirelt kasvavas rakus geenidoosi efekti. Terve kromosoomi replikatsiooniks kulub umbes 40 minutit, aga rakk võib soodsas kasvukeskkonnas jaguneda kiiremini, seega alustatakse kiirelt kasvavates ehk kiirelt jagunevates rakkudes replikatsiooni üha uuesti enne seda, kui eelmine replikatsiooni tsükkel lõpuni jõudnud on. Seetõttu toodetakse rRNAd ühes rakus korraga rohkemalt kui seitsmelt operonilt. Näiteks on hinnatud, et metsiktüüpi E. coli rakus, mille raku poolestusaeg on 23 minutit, on 38 rrn operoni ekvivalenti, samas kui 36-minutilise poolestusajaga rakus on 22 rrn operoni ekvivalenti. rRNA transkriptsiooni kiirust mõjutab ka eukarüootsete rakkude tuumakeste laadsete struktuuride teke bakteri nukleoidis. Kiiresti kasvavates rakkudes moodustavad rrn operone kandvad kromosoomi lingud kolmemõõtmelise struktuuri nii, et need operonid asuksid üksteise läheduses. Nende struktuuride juurde koondub suurem osa rakus olevast RNAPst ning operonide lähedus soodustab RNAP taaskasutamist ülejäänud rrn operonides, mitte teistes genoomi operonides ja geenides. Sellised tuumakeselaadsed struktuurid kaovad siis, kui raku kasv peatub. Seega aitab rrn operonide asetus genoomis kaasa RNAP seondumisele promootorile ja RNAP taaskasutamisele just rrn operonides ning ennetab rRNA transkriptsiooni liiga varajast katkestamist DNA polümeraasiga põrkumise teel. Iga rrn operon koosneb regulaatoralast, promootoritest P1 ja P2, antiterminatsiooni süsteemist, pausi aladest, 16S, 23S ja 5S rRNA ja paarist tRNA geenist ning terminaatorist. Nii P1 kui P2 promootor on raku kiire kasvu tingimustes äärmiselt tugevad ja tõhusad promootorid. Seda järeldatakse RNAP tihedusest, võrreldes teiste E. coli promootoritega samades tingimustes. Samas on kiire kasvu tingimustes ülekaalus P1 aktiivsus ning madala kasvukiiruse juures ja stressi tingimustes kasutatakse põhiliselt P2 promootorit . P1 ja P2 erinev ekspressioon kiire kasvu tingimustes tuleneb arvatavasti transkriptsiooni häirumisest P2 juures, mida põhjustab RNAP liikumine läbi P2, kui transkriptsioon on alanud P1 juurest. P1 promootorist ülesvoolu olevas regulaatoralas asub UP element. UP element suurendab P1 aktiivsust rohkem kui 30 korda. UP element parandab RNAP seondumist, pakkudes täiendavaid alasid interaktsiooniks RNAP ja promootori P1 vahel. UP elemendist ülesvoolu asuvad ka selliste regulaatorite nagu Fis, H-NS ja Lrp seostumiskohad, mis võivad ka UP elemendiga kattuda. P1 promootori −10 regioonist allavoolu, aga enne transkriptsiooni alguskohta +1, on G/C (guaniini ja tsütosiini) rikas diskriminaator-regioon. Arvatakse, et kuna G/C rikas ala on äärmiselt stabiilne, on vaja lisaenergiat, et transkriptsiooni initsiatsiooniks vajalik RNAP avatud kompleks võiks tekkida ja säilida. Seega annab G/C rikka piirkonna olemasolu oma panuse avatud kompleksi ebastabiilsusse, mis kestab enne esimeste fosfodiestersidemete moodustumist, ning P1 tundlikkusse muutuvate keskkonnatingimuste suhtes. rrn operonide antiterminatsiooni süsteemi, mis asub P2 promootorist allavoolu, on vaja selleks, et rRNA elongatsioonil oleks suurem kiirus kui mRNAde elongatsioonil ning et ennetada enneaegset terminatsiooni. rrn operonide P1 promootorilt toimuva transkriptsiooni kiirust piirav etapp on RNAP avatud kompleksi moodustumine ja säilimine transkriptsiooni initsiatsioonil enne esimeste fosfodiestersidemete tekkimist. Seetõttu reguleeritakse rRNA transkriptsiooni kiirust põhiliselt selles etapis. Avatud kompleksi moodustumise tõhusust ja stabiilsust mõjutavad mitmed tegurid, reguleerides seega transkriptsiooni aktiivsust P1 promootorilt. Superspiralisatsioon ehk DNA vinti keerdumine soodustab rRNA transkriptsiooni. Superspiraliseerunud DNAd kasutades on transkriptsioon rrn operonide promootoritelt väga tõhus, kuid lineaarset DNAd kasutades on märgatud nendelt promootoritelt vaid minimaalse aktiivsusega transkriptsiooni. Lineaarse DNAga seondunud RNAP avatud kompleksid on ebastabiilsemad ja soolade suhtes tundlikumad. Fis on nukleoidiga seostatud valk, millel on palju funktsioone. Kui Fis seostub teatud aladega, mis eelnevad P1 promootorile, aktiveerib ta sealt transkriptsiooni, interakteerudes RNAP-ga. Samuti on katsed näidanud, et Fis stabiliseerib RNAP avatud kompleksi, ent selle nähtuse mehhanism pole veel teada. ppGpp ehk võlutäpike on signaalmolekul, mis kuhjub rakku nii osmootse kui näljastressi tingimustes. Kui kiirelt kasvavatel rakkudel tekib aminohapete puudus, toob see kaasa poomisvastuse (stringent response) ning rakku kuhjub 100 korda enam ppGpp-d, kui seda seal tavatingimustes on. Sellega kaasneb kohene rRNA sünteesi ja kasvu peatumine. ppGpp rRNA transkriptsiooni inhibeeriv mõju avaldub tingimustes, kus on vähenenud avatud kompleksi tekke tõhusus (näiteks lineaarsele DNAle seostunud RNAP või mõõdukate soola kontsentratsioonide (50 mM KCl) puhul), ent siis vähendab ta oluliselt RNAP avatud kompleksi eluiga. ppGpp seostub RNAPga selle kahe subühiku ω ja β' vahele. Samuti mõjutab ppGpp negatiivselt transkriptsiooni elongatsiooni etappi, suurendades transkriptsiooni ajal RNAP seiskumist mitmes piirkonnas nii lineaarse kui ka superspiraliseerunud DNA puhul. Ent ppGpp mõju rRNA ahela elongatsioonile in vivo kontekstis on veel vastuoluline. DksA on valk, mis seostub RNAPga ja vähendab selle avatud kompleksi eluiga rrn operonide P1 promootoritel. DksA võimendab ka ppGpp toimet, vähendades nii avatud kompleksi eluiga veelgi. H-NS on nukleoidiga seostatud valk, mille seostumiskoht asub P1 promootorist ülesvoolu. Fis-i puudumisel püüab H-NS DNAga seotud RNAP lõksu, moodustades P1-st üles-ja allavoolu jäävatest DNA järjestustest linge ja moodustades nende vahele sildu, nii et RNAP ei saa mööda DNAd edasi liikuda. Fis-i seondumine töötab H-NSi negatiivsele efektile vastu, sest Fis-i ja H-NSi seondumiskohad kattuvad regulaatoralas üksteise ja UP elemendiga üle. Lrp (leutsiini-tundlik regulatoorne valk) soodustab H-NSi seondumist rrn operonide P1 promootoritele. Sarnaselt H-NS-iga inhibeerib Lrp ka üksi transkriptsiooni initsiatsiooni, seondudes promootorala lähedale, kuid leutsiini juuresolul kaotab Lrp selle võime. Lrp-i ekspressiooni stimuleerib ppGpp. Transkriptsioon DNA replikatsioon Ribosomaalne RNA Ribosoom Poomisvastus Soolekepike Bremer H ja Dennis PP (2008). "Modulation of chemical composition and other parameters of the cell at different exponential growth rates. In EcoSal–Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology", (Neidhardt FC et al. (eds), Ptk. 5.2.3. Washington, DC: ASM. Jin et al. (2012). "Growth rate regulation in Escherichia coli". FEMS Microbiol Rev 36 (2) 269–287. Ellwood M ja Nomura M (1982). "Chromosomal locations of the genes for rRNA in Escherichia coli K-12". J Bacteriol 149: 458–468. Brewer BJ (1988). "When polymerases collide: replication and the transcriptional organization of the E. coli chromosome". Cell 53: 679–686. Vilette D et al. (1996). "Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability". Mol Gen Genet 252: 398–403. Bremer H ja Dennis PP (1996). Modulation of chemical composition and other parameters of the cell by growth rate. Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2 (Neidhardt FC, ed), pp. 1553–1569. ASM Press, Washington, DC. Cook PR (1999). "The organization of replication and transcription". Science 284: 1790–1795. Cabrera JE ja Jin DJ (2003). "The distribution of RNA polymerase in Escherichia coli is dynamic and sensitive to environmental cues". Mol Microbiol 50: 1493–1505. Lund E ja Dahlberg JE (1979). "Initiation of Escherichia coli ribosomal RNA synthesis in vivo". P Natl Acad Sci USA 76: 5480–5484. Sarubbi E et al.(1988). "Basal ppGpp level adjustment shown by new spoT mutants affect steady state growth rates and rrnA ribosomal promoter regulation in Escherichia coli. Mol Gen Genet 213: 214–222. Adhya S ja Gottesman M (1982). "Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity". Cell 29: 939–944. Gourse RL et al.(1986). "DNA determinants of rRNA synthesis in E. coli: growth rate dependent regulation, feedback inhibition, upstream activation, antitermination. Cell 44: 197–205. Nilsson L et al. (1990). "The role of FIS in trans activation of stable RNA operons of E. coli". EMBO J 9: 727–734. Opel ML et al.(2004). "Activation of transcription initiation from a stable RNA promoter by a Fis protein-mediated DNA structural transmission mechanism". Mol Microbiol 53: 665–674. Gourse RL (1988). "Visualization and quantitative analysis of complex formation between E. coli RNA polymerase and an rRNA promoter in vitro". Nucleic Acids Res 16: 9789–9809. Zhou YN ja Jin DJ (1998). "The rpoB mutants destabilizing initiation complexes at stringently controlled promoters behave like ‘stringent’ RNA polymerases in Escherichia coli". P Natl Acad Sci USA 95: 2908–2913. Glaser G et al.(1983)- "Functional interrelationship between two tandem E. coli ribosomal RNA promoters". Nature 302: 74–76. Finkel SE ja Johnson RC (1992). "The Fis protein: it’s not just for DNA inversion anymore". Mol Microbiol 6: 3257–3265. Gosink KK et al.(1993). "DNA binding and bending are necessary but not sufficient for Fis-dependent activation of rrnB P1". J Bacteriol 175: 1580–1589. Zhi H et al. (2003). "Fis stabilizes the interaction between RNA polymerase and the ribosomal promoter rrnB P1, leading to transcriptional activation. J Biol Chem 278: 47340–47349. Cashel M et al. (1996). "The stringent response. Escherichia coli and Salmonella", Vol. 1 (Neidhardt FC, ed), pp. 1458–1496. ASM Press, Washington, DC. Cashel M (1969) The control of ribonucleic acid synthesis in Escherichia coli. IV. Relevance of unusual phosphorylated compounds from amino acid-starved stringent strains. J Biol Chem 244: 3133–3141. Ross et al. (2013). "The magic spot: a ppGpp binding site on E. coli RNA polymerase responsible for regulation of transcription initiation". Mol Cell 50 (3): 420–429 Kingston RE ja Chamberlin MJ (1981). "Pausing and attenuation of in vitro transcription in the rrnB operon of E. coli. Cell 27: 523–531. Paul BJ et al. (2004). "DksA: a critical component of the transcription initiation machinery that potentiates the regulation of rRNA promoters by ppGpp and the initiating NTP". Cell 118: 311–322. Tippner D et al.(1994). "Evidence for a regulatory function of the histone-like Escherichia coli protein H-NS in ribosomal RNA synthesis". Mol Microbiol 11: 589–604. Schroder O ja Wagner R (2000). "The bacterial DNA-binding protein H-NS represses ribosomal RNA transcription by trapping RNA polymerase in the initiation complex". J Mol Biol 298: 737–748. Afflerbach H et al.(1998). "Effects of the Escherichia coli DNA-binding protein H-NS on rRNA synthesis in vivo. Mol Microbiol 28: 641–653. Pul U et al. (2005). "LRP and H-NS – cooperative partners for transcription regulation at Escherichia coli rRNA promoters". Mol Microbiol 58: 864– 876. Landgraf JR et al. (1996). "Effects of nutrition and growth rate on Lrp levels in Escherichia coli". J Bacteriol 178: 6930–6936.