Tsükliinisõltuvad kinaasid

Tsükliinisõltuvad kinaasid (Cdk – cyclin-dependent kinase) on proteiinkinaasid, mis fosforüleerides valke täidavad keskset rolli rakutsükli regulatsioonis ja mis on aktiivsed vaid kompleksis tsükliiniga. Cdk-d on põhilised rakutsükli regulaatorid kõigis uuritud eukarüootides. Cdk-d on suhteliselt väikesed valgud (34–40 kDa) ja sisaldavad aktiivtsentrile lisaks väheseid struktuure. Eri rakutsükli faasides on aktiivsed erinevad tsükliin-Cdk kompleksid, mis fosforüleerivad eri valke ja tagavad sellega kindla valkude aktiivsuse mustri, mida vastavas rakutsükli staadiumis vaja on. Cdk-de tase püsib rakutsükli jooksul võrdlemisi stabiilsena ning tsükliin-Cdk komplekside aktiivsus eri faasides on reguleeritud tsükliinide taseme kõikumisega. Enamik teadaolevatest tsükliin-Cdk kompleksidest on seotud rakutsükli kontrollimisega. Loomarakkudes leidub vähemalt üheksa Cdk-d, millest neli (Cdk1, 2, 3 ja 4) on otseselt seotud rakutsükliga. Imetajate rakkudes suudab Cdk1 koos tsükliin A2 ja B1-ga ka üksi rakutsüklit kontrollida. Normaalsetes tingimustes osaleb regulatsioonis aga rohkem erinevaid Cdk-tsükliin komplekse. Cdk kinaasne aktiivsus muutub rakutsükli jooksul oluliselt, kuigi valgu tase püsib suhteliselt stabiilsena – aktiivsuse regulatsioon toimub post-translatsiooniliselt. Cdk aktiivsuse regulatsioonis on neli põhilist mehhanismi: tsükliini seondumine, aktiveeriv või inhibeeriv fosforüleerimine ja seondumine Cdk inhibiitoritega. Eelnevate staadiumite Cdk-d aktiveerivad järgnevate transkriptsiooni. Kuna mõned rakutsükli faaside üleminekud peavad olema järsud, peab regulatsioon võimaldama S- ja M-Cdk-de kiiret ja ühest aktivatsiooni, et alustada replikatsiooni või mitoosi. Ensümaatilise aktiivsuse saavutamiseks peab Cdk olema seondunud tsükliiniga. Inimese Cdk2-l blokeerib aktivatsiooniling (T-ling) tsükliini puudumisel valkude seondumise aktiivtsentrisse ning seondunud ATP on substraadi fosforüleerimise jaoks valesti orienteeritud. Tsükliini ja Cdk seondumises on olulised mitu struktuuri, tähtsaim on interaktsioon Cdk2 PSTAIRE heeliksi ja tsükliin A heeliksite 3 ja 5 vahel. Seondumine tsükliiniga mõjutab oluliselt Cdk konformatsiooni: osa T-lingust muutub beeta-leheks, mille tulemusena orienteerub ATP aktiivtsentris katalüütiliseks reaktsiooniks sobivalt ja T-ling muutub lamedaks, võimaldades valkudel seonduda aktiivtsentrisse. Lisaks paraneb ligipääs aktiveerivale treoniinile Thr160, mida fosforüleerivad Cdk-sid aktiveerivad kinaasid, suurendades oluliselt Cdk-de aktiivsust . Tsükliin A struktuuri Cdk2-ga seondumine ei mõjuta – tsükliin A on nagu karkass, millega seondub vormitava struktuuriga Cdk2. Tsükliinide taseme kontroll toimub transkriptsiooni ja valgu degradatsiooni tasemel. Kuigi juba tsükliini seondumine aktiveerib Cdk-d oluliselt, on paljude Cdk-de täielikuks aktivatsiooniks vaja kindla aminohappe fosforüleerimist (Thr160 inimese Cdk2-l). Aktiveeriv fosforüleerimine ei mõjuta aktiivtsentri struktuuri oluliselt, kuid soodustab substraatide seondumist Cdk-ga. Selgroogsete rakkudes on Cdk-d aktiveerivaks kinaasiks Cdk7, millel on piisav aktiivsus kogu rakutsükli vältel, et mitte olla piiravaks teguriks Cdk aktiivsusele. Inhibitoorsel fosforüleerimisel – kui fosforüleeritakse konserveerunud türosiin (Tyr15) ja loomadel lisaks lähedalasuv treoniin (Thr14) – on oluliselt suurem roll Cdk aktiivsuse regulatsioonis. Inhibitoorse fosforüleerimise tulemusena muutub tõenäoliselt ATP fosfaatide orientatsioon. Selline regulatsioon on oluline mitoosi alguse ajastamises: enne mitoosi hoiab kinaas Wee1 mitootilisi tsükliin-Cdk komplekse fosforüleerituna ning kompleksid on inaktiivsed. Vastureaktsioonina defosforüleerivad inhibitoorseid fosforüleerimissaite pidevalt Cdc25 perekonna fosfataasid. Wee1 ja Cdc25 võimaldavad mitootiliste tsükliinide kiiret aktivatsiooni: M-Cdk-d fosforüleerivad nii Wee1 kui ka Cdc25-t, põhjustades sellega Wee1 inaktivatsiooni ja Cdc25 aktiivsuse tõusu. Kui M-Cdk-de hulk rakus jõuab piisava tasemeni, et Wee1 ei suuda neid hetkeks fosforüleeritult inaktiivsena hoida, põhjustab väike M-Cdk aktiivsus positiivse tagasisidega (aktiveerivad oma aktivaatori ja inhibeerivad inhibiitori) kõikide inaktiivsete komplekside defosforüleerimise ja selle kaudu järsu ülemineku mitoosi. Tsükliinisõltuvate kinaaside inhibiitorid (CKI-d) on valgud, mis seonduvad Cdk-ga (või tsükliini või tsükliin-Cdk kompleksiga), blokeerides ensüümi kinaasset aktiivsust. Cdk aktiivsus on jagunevates rakkudes enamasti blokeeritud G1-faasis, kui on vaja rakkude stabiilset kasvu uue rakutsükli ettevalmistamiseks. CKI-d on vajalikud ka rakutsükli peatamiseks G1-s, kui keskkonnatingimused ei ole sobilikud. Ka regulatsioon inhibiitori kaudu võimaldab rakutsüklis järske üleminekuid: järgneva faasi tsükliinide hulk tõuseb suhteliselt aeglaselt tänu aktiveerunud transkriptsioonile, kuid inhibiitor seob sünteesitud tsükliinid inaktiivsesse kompleksi. Kui Cdk aktiivsus tõuseb mingi tasemeni, siis lagundatakse või modifitseeritakse inhibiitor, mille tagajärjel tsükliin-Cdk kompleks vabaneb . Kinaasikompleksi vabanemist kiirendab positiivne tagasiside – vabanenud kompleksid fosforüleerivad inhibiitorit, suunates selle lagundamisele. Tsükliin-Cdk kompleksis on Cdk karboksüterminaalse osaga seondunud veel kolmas valk – Cks1. Cks1 on väike valk (9–17 kDa), mis võimaldab kompleksil efektiivselt fosforüleerida mitme fosforüleerimissaidiga substraate. Cks1 sisaldab katioonset taskut, mis seob negatiivselt laetud fosfaatrühma . Seondudes juba fosforüleeritud aminohappega, suurendab Cks1 ühe valgu multifosforüleerimise tõenäosust. Multifosforüleerimine suurendab signaali edasilevimise tõenäosust ja kiirust. Näiteks kui valk on suunatud fosforüleerimise kaudu degradatsiooni, siis signaali edasiliikumiseks peab fosforüleeritud aminohappega enamasti seonduma fosfaatrühma siduv valk, mis ubikvitinüleerimise kaudu suunab valgu proteosoomi. Kui valgus on vaid üks mitteoptimaalne seondumiskoht, siis on seondumine aeglasem ja vähem efektiivne, kui aga näiteks kuus, siis toimub seondumine kiiremini ja valk degradeeritakse samuti kiiremini. Cdk-d on seriin-treoniinkinaasid – nad fosforüleerivad valkudes seriine ja treoniine. Cdk fosforüleerimissaidi üldine konsensusjärjestus on [S/T*]PX[K/R], kus S/T on seriin või treoniin, P on proliin, X suvaline aminohape ja K/R tähistavad positiivselt laetud aminohappeid lüsiini ja arginiini. Substraatidega võivad seonduda ka tsükliinid, võimaldades sellega tsükliin-spetsiifilist fosforüleerimist. S-faasi tsükliini A-ga seondudes fosforüleerib Cdk2 valku p107, aga kompleksis mitootilise tsükliini B-ga ei seondu p107-ga. Niisugune S-faasi tsükliinide spetsiifilisus tuleneb tsükliinil asuvast hüdrofoobsest alast, mis interakteerub substraatidel oleva RXL motiiviga (järjestus arginiin, suvaline aminohape ja leutsiin). Mõnel juhul on tsükliin-spetsiifiline fosforüleerimine seotud ka tsükliini võimega lokaliseerida seondunud Cdk-d mingisse kindlasse raku ossa, kus vastavat substraati leidub. Pagaripärmi rakutsüklit kontrollib vaid üks Cdk, mis tsükli jooksul seondub üheksa erineva tsükliiniga. Tsükliinid Cln1-3 on aktiivsed G1- ja G1/S-faasis, Clb5 ja 6 S-faasis, Clb3 ja 4 G2/M üleminekul ning Clb1 ja 2 mitootilistes rakkudes . Igas faasis on vaja fosforüleerida vaid kindlaid valke ja midagi valel ajal fosforüleerides võib see põhjustada rakule suuri kahjustusi. Näiteks DNA sünteesi alustamiseks peavad S-faasi tsükliin-Cdk kompleksid fosforüleerima replikatsiooni alguspunktiga seondunud valke. Kui seda teevad G1-faasi tsükliin-Cdk kompleksid, võib toimuda liiga varajane DNA süntees ja selle tõttu ka osaliselt mitmekordselt replikatsioon. Selliste vigade vältimiseks mõjutavad tsükliinid Cdk-le seondumisega kinaasi aktiivtsentri konformatsiooni ja selle kaudu sobilike substraatide valikut. Pärm, millel pole G1- ja S-faasi tsükliine, on võimeline jagunema, kuid teeb seda aeglasemalt, aga mõlema mitootilise tsükliini deletsioon on pärmile letaalne. Mitootilised tsükliin-Cdk kompleksid on üldjuhul võimelised fosforüleerima ka eelnevate komplekside substraate. Järjestikused tsükliinid mõjutavad Cdk aktiivtsentrit, tõstes kinaasi afiinsust Cdk konsensusjärjestuse suhtes. Lee, Melanie; Nurse, Paul. "Complementation used to clone a human homologue of of the fission yeast cell cycle control gene cdc2." "Nature" 1987 May 7–13;327(6117):31-5. Morgan, DO. "The Cell Cycle: Principles of Control." London: New Science Press Ltd. 2007. Satyanarayana, A; Kaldis. "Mammalian cell-cycle regulation: several Cdks, numerous cyclins, and diverse compensatory mechanisms" "Oncogene" 2009 Aug 20;28(33):2925-3 Morgan DO. "Principles of CDK regulation." "Nature" 1995 Mar 9;374(6518):131-4. Morgan, DO. "Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors." "Annu Rev Cell Dev Biol." 1997;13:261-91. Jeffrey PD, Russo AA, Polyak K, Gibbs E, Hurwitz J, Massagué J, Pavletich NP. "Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclinA-CDK2 complex." "Nature" 1995 Jul 27;376(6538):313-20. Brown NR, Noble ME, Endicott JA, Garman EF, Wakatsuki S, Mitchell E, Rasmussen B, Hunt T, Johnson LN. "The crystal structure of cyclin A." "Structure" 1995 Nov 15;3(11):1235–47. Orlicky S, Tang X, Willems A, Tyers M, Sicheri F. "Structural basis for phosphodependent substrate selection and orientation by the SCFCdc4 ubiquitin ligase." "Cell" 2003 Jan 24;112(2):243-56. Schwob E, Böhm T, Mendenhall MD, Nasmyth K. "The B-type cyclin kinase inhibitor p40SIC1 controls the G1 to S transition in S. cerevisiae." "Cell" 1994 Oct 21;79(2):233-44. Kõivomägi M, Valk E, Venta R, Iofik A, Lepiku M, Balog ER, Rubin SM, Morgan DO, Loog M. "Cascades of multisite phosphorylation control Sic1 destruction at the onset of S phase." "Nature" 2011 Oct 12;480(7375):128-31. Bourne Y, Watson MH, Hickey MJ, Holmes W, Rocque W, Reed SI, Tainer JA. "Crystal structure and mutational analysis of the human CDK2 kinase complex with cell cycle-regulatory protein CksHs1." "Cell" 1996 Mar 22;84(6):863-74. Kõivomägi, M. and Loog, M. "Cdk1: a kinase with changing substrate specificity." "Cell Cycle", 2011 Nov 1;10(21):3625-6. Epub 2011 Nov 1. Kõivomägi, M., Valk, E., Venta, R., Iofik, A., Lepiku, M., Morgan, D., and Loog, M. "Dynamics of Cdk1 substrate specificity during the cell cycle." "Molecular Cell", 2011 Jun 10;42(5):610-23. Adams PD, Sellers WR, Sharma SK, Wu AD, Nalin CM, Kaelin WG Jr. "Identification of a cyclin-cdk2 recognition motif present in substrates and p21-like cyclin-dependent kinase inhibitors." "Mol Cell Biol." 1996 Dec;16(12):6623-33. Morgan DO. "Principles of CDK regulation." "Nature" 1995 Mar 9;374(6518):131-4 Nasmyth K. "At the heart of the budding yeast cell cycle." "Trends Genet." 1996 Oct;12(10):405-12. Schwob E, Nasmyth K. "CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae." "Genes Dev." 1993 Jul;7(7A):1160–75. Mendenhall MD, Hodge AE. "Regulation of Cdc28 cyclin-dependent protein kinase activity during the cell cycle of the yeast Saccharomyces cerevisiae." "Microbiol Mol Biol Rev." 1998 Dec;62(4):1191-243. "Ameerika mainekas teadusajakiri valis Tartu molekulaarbioloogide tööd aasta läbimurrete hulka" Novaator, 17. jaanuar 2014