Lap-süsteem

Lap-süsteem on oluline süsteem biokile tekkeks bakteritel Pseudomonas fluorescens ja Pseudomonas putida. Mõlemad bakterid on risosfäärsed bakterid, mis moodustavad taimejuurtel biokile ning soodustavad taimede kasvu. Lap-süsteemi olulisim valk LapA on hädavajalik biokile tekkeks nii P. fluorescens'is kui ka P. putida's. Biokile ehk pinnale kinnitunud bakterite struktureeritud kogumi moodustamiseks peavad keskkonnas vabalt liikuvad bakterid stabiilselt taime juurele kinnituma. Biokile moodustamine on mikroobidele kasulik, sest biokiles saavad bakterid paremini hakkama erinevates keskkonnatingimustes. Lap-süsteemi tähtsaimaks valguks võib pidada LapA-d, mis on bakteri pinnal asuv adhesiin ehk kleepvalk. LapA transporditakse bakteri pinnale ABC-transporteriga, mis koosneb kolmest valgust, LapE, LapB ja LapC. LapEBC transporter vajab tööks ATP energiat. LapG ja LapD reguleerivad LapA hulka bakteri pinnal posttranslatsioonilise regulatsiooni abil. P. putida biokile moodustamisel osaleb ka teine suur adhesiin, LapF, mida P. fluorescens'is ei ole. LapF on oluline rakk-rakk interaktsioonide tekkeks küpses biokiles. LapA on vajalik biokile moodustamise esimeses etapis ehk pinnale kinnitumiseks. Lisaks on LapA oluline biokile järgmises etapis, kui bakter läheb esmaselt pöörduvalt kinnitumiselt üle pöördumatule kinnitumisele pinnaga. LapA on suur kleepvalk, mille molekulmass P. fluorescens'is on umbes 520 kDa. LapA põhijärjestuse moodustavad valgu keskel paiknevad 37 kordusjärjestust (RTX), millest igaüks on 100 aminohapet pikk. Kordusjärjestuste ala on vajalik pinnaga ehk substraadiga seondumiseks, et võimaldada biokile moodustumist. C-terminaalset valgu otsa kasutab LapA samuti pinnaga seondumiseks, kuid selles alas paikneb ka 1. tüübi sekretsioonisüsteemi signaaljärjestus, mille abil on valk võimeline seda sekretsioonisüsteemi läbima. N-terminaalse otsaga kinnitub valk aga bakteriraku pinnale. N-terminaalses otsas asub ka LapG lõikesait, mis on vajalik LapA hulga reguleerimiseks pärast valgusünteesi ehk posttranslatsiooniliseks regulatsiooniks. LapA hulka rakus ja kinnitumist raku pinnale reguleerivad P. fluorescens'is LapD ja LapG, P. putida's kahekomponendiline regulatsioonisüsteem GacS/GacA ja transkriptsioonifaktor FleQ ning mõlemas bakteris c-di-GMP tase. C-di-GMP ja LapD-LapG osalusel toimuv posttranslatsiooniline regulatsioon on enim uuritud LapA regulatsiooni mehhanism. Kui LapA on lapA geenilt kodeeritud, siis see transporditakse raku pinnale. Valk transporditakse raku pinnale läbi 1. tüübi sekretsioonisüsteemi, milleks on vajalik valgu C-terminaalses otsas paiknev signaaljärjestus. Seejärel seondub valk mikroobiraku pinnaga N-terminaalse osa kaudu. Seondumist raku pinnaga abistab ka RTX kordusjärjestus, kuid selle olemasolu pole raku pinnaga seondumiseks hädavajalik. LapA kaudu võib bakter seonduda nii hüdrofoobsete kui ka hüdrofiilsete pindadega. Kui LapA-d on raku pinnal palju, siis toimub seondumine mõlemale pinnale sarnase tõhususega. Juhul kui LapA-d on raku pinnal vähe, on eelistatud kinnitumine hüdrofoobsele pinnale. Kuigi LapA seondub erinevate pindadega, sõltub kinnitumise mehhanism siiski pinna omadustest. Hüdrofoobsele pinnale seondub LapA peamiselt RTX kordusjärjestustega, mis sisaldavad suures hulgas hüdrofoobseid aminohappeid. Hüdrofiilsete pindadega seondub LapA aga põhiliselt C-terminaalse otsa kaudu. Kinnitudes substraadi pinnale, voltuvad LapA kordusjärjestused kokku. See vähendab kaugust mikroobi ja substraadi vahel, mis muudab tekkinud substraat-LapA-mikroob kompleksi struktuuri jäigemaks. Mikroob seondub LapA valgu hüdrofoobset pinda kasutades tugevamalt, sest raku pinna ja substraadi pinna vaheline kaugus on väiksem kui hüdrofiilse pinnaga seondudes. Lisaks alustatakse hüdrofoobse pinnaga seondudes biokile moodustamist kiiremini ja efektiivsemalt. LapA N-terminaalne ots on hädavajalik valgu kinnitumiseks raku pinnale. Seega toimub LapA hulga posttranslatsiooniline regulatsioon N-terminaalse otsa äralõikamise kaudu. Selle eest vastutab periplasmas asuv proteaas LapG. Kui keskkonnas on liiga madal anorgaanilise fosfori kontsentratsioon, on tingimused biokile tekkeks ebasobivad. Sellises olukorras lagundab Pho regulonist kodeeritud fosfodiesteraas RapA c-di-GMP-d, langetades selle hulka rakus. Madala c-di-GMP kontsentratsiooni korral ei ole tsütoplasmamembraanis paiknev c-di-GMP retseptor LapD enam oma ligandiga c-di-GMP-ga seotud ja muudab konformatsiooni nii, et ei suuda enam LapG-d siduda. Nii saab LapG vabalt periplasmas ringi liikuda ning lõigata LapA N-terminaalset otsa, vabastades LapA raku pinnalt keskkonda. Kui keskkonnas on palju fosforit, siis on rakus ka palju c-di-GMP-d, mis seondub oma retseptori LapD-ga. LapD-s toimuvad konformatsioonilised muutused, mille tulemusena on see võimeline siduma LapG-d. LapD-ga seotud LapG ei saa periplasmas vabalt liikuda ega LapA N-terminaalset otsa lõigata. Selle tulemusel jääb LapA seotuks raku välismembraaniga, soodustades biokile teket. LapG on kaltsiumsõltuv (Ca2+) valk. Ca2+ kontsentratsiooni tõus põhjustab LapG-s konformatsioonilised muutused, mis ei lase enam LapG-l LapD-ga seonduda. Seega suurendab Ca2+ kõrge kontsentratsioon biokile teket. Looduslikes tingimustes võib Ca2+ taset rakus kontrollida tsitraat, mis suudab Ca2+ siduda. Tsitraadiga seotud Ca2+ ei ole enam LapG-le kättesaadav, mis põhjustab LapG seondumise LapD-ga ning biokilet ei saa enam tekkida. LapA transkriptsioonilisest regulatsioonist on oluliselt vähem teada kui translatsioonilisest regulatsioonist. P. putida lapA (LapA valku kodeeriv geen) promootorit transkribeeritakse juba varajases eksponentsiaalses kasvufaasis, kuid statsionaarsesse faasi sisenedes transkriptsiooni tase tõuseb veelgi. P. putida lapA transkriptsiooni reguleerib c-di-GMP ja arvatavasti ka GacS/GacA kahekomponendiline regulatsioonisüsteem. Nii c-di-GMP kui ka GacS mõjutavad lapA transkriptsiooni positiivselt. Kui varajases biokile moodustamises on oluline LapA olemasolu, siis P. putida biokile küpses staadiumis on vajalik ka LapF. LapF soodustab bakter-bakter interaktsioonide teket, mis on oluline mikrokolooniate tekkeks ja hilisemaks küpse biokile moodustumiseks. LapF-i olulisus biokile moodustumisel ilmneb ainult toitainetevaeses keskkonnas, täissöötmes pole LapF-i olemasolu biokile tekkeks vajalik. LapF kodeeritakse lapFHIJ operonilt, mille ülejäänud geenid kodeerivad arvatavasti ABC transporterit LapHIJ. See transporter võib osaleda LapF-i transpordil raku pinnale. P. putida lapF-i ekspressiooni regulatsiooni on uuritud transkriptsiooni tasemel. LapF ekspressiooni mõjutavad transkriptsiooni tasemel alternatiivne statsionaarse faasi sigma-faktor RpoS (σS) ja globaalne regulaator Fis. RpoS-i hulk sõltub kasvufaasist, suurenedes oluliselt statsionaarse faasi alguses. Seega aktiveerib RpoS lapF-i transkriptsiooni statsionaarses faasis. Fis-i kontsentratsioon on aga kõrgem logaritmilises faasis. Fis mõjutab lapF-i transkriptsiooni negatiivselt, seondudes promootoralale ja arvatavasti takistades RNA-polümeraasi seondumist. RpoS-i ja Fis-i kaudu toimuva regulatsiooniga saab seletada, miks ekspresseeritakse LapF-i peamiselt küpses biokiles. P. aeruginosa biokiles on mõõdetud fis-i ja rpoS-i mRNA hulga muutusi ja näidatud, et neid reguleeritakse vastassuunaliselt, fis-i mRNA hulk biokile moodustumisel väheneb ja rpoS-i hulk suureneb . Biokile moodustamise algusetappidel kasvavad rakud kiiresti ja neis kodeeritakse Fis-i, mis mõjub lapF-i transkriptsioonile negatiivselt. Fis seondub lapF-i promootoralale nii, et RNA-polümeraas ei saa sinna enam seonduda. Küpses biokiles rakkude kasvu kiirus langeb, mille tagajärjel RpoS-i hulk suureneb ja Fis-i hulk väheneb. Fis ei seondu enam promootoralale, mille tulemusel saab RNA-polümeraas RpoS-i abil promootorile seonduda ja lapF-i transkribeerida. Lisaks reguleerib lapF-i transkriptsiooni taset rakus ka c-di-GMP, kuid vastupidi lapA-le põhjustab c-di-GMP taseme tõus lapF-i transkriptsiooni vähenemist. Täpset mehhanismi, kuidas c-di-GMP lapF-i transkriptsiooni mõjutab, pole teada. Hinsa SM, Espinosa-Urgel M, Ramos JL, O’Toole GA (2003).Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49:905–918 Hinsa, S.M. ja O'Toole, G.A. (2006).Biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365: a role for LapD. Microbiology 152: 1375–1383. Espinosa-Urgel M, Salido A, Ramos JL (2000). Genetic analysis of functions involved in adhesion of Pseudomonas putida to seeds. Journal of Bacteriology 182(9):2363-9. Rodney M.Donlan (2002). Biofilms: Microbial Life Surfaces. Emerging Infectious Diseases journal 881–890. Winsor, G. L., Lam, D. K. W., Fleming, L., Lo, R., Whiteside, M. D., Yu, N. Y., Hancock, R. E. W. ja Brinkman, F. S. L. (2011). Pseudomonas Genome Database: improved comparative analysis and population genomics capability for Pseudomonas genomes. Nucleic acids research 39, D596-D600. Martínez-Gil M, Yousef-Coronado F, Espinosa-Urgel M (2010). LapF, the second largest Pseudomonas putida protein, contributes to plant root colonization and determines biofilm architecture. Mol Microbiol 77: 549–561 Chelsea D. Boyd, T. Jarrod Smith, Sofiane El-Kirat-Chatel, Peter D. Newell, Yves F. Dufrêne, George, A. O’Toolea (2014) Structural Features of the Pseudomonas fluorescens Biofilm Adhesin LapA Required for LapG-Dependent Cleavage, Biofilm Formation, and Cell Surface Localization. Journal of Bacteriology volume 196: number 15: 2775–2788 Yousef, F. and Espinosa-Urgel, M. (2007)In silico analysis of large microbial surface proteins. Res. Microbiol. 158, 545–550. Satchell KJ (2011). Structure and function of MARTX toxins and other large repetitive RTX proteins. Annu. Rev. Microbiol. 65:71–90. Marta Martínez-Gil, María Isabel Ramos-González, Manuel Espinosa-Urgel (2014). Roles of Cyclic Di-GMP and the Gac System in Transcriptional Control of the Genes Coding for the Pseudomonas putida Adhesins LapA and LapF. Journal of Bacteriology 196: 1484–1495 Sofiane El-Kirat-Chatel, Audrey Beaussart, Chelsea D. Boyd, George A. O’Toole and Yves F. Dufrêne (2014). Single-Cell and Single-Molecule Analysis Deciphers the Localization, Adhesion, and Mechanics of the Biofilm Adhesin LapA. ACS Chem. Biol. 9, 485–494 Monds RD, Newell PD, Gross RH, O'Toole GA (2007). Phosphate-dependent modulation of c-di-GMP levels regulates Pseudomonas fluorescens Pf0-1 biofilm formation by controlling secretion of the adhesin LapA. Mol Microbiol 63: 656–679 Newell PD, Boyd CD, Sondermann H, O’Toole GA (2011). A c-di-GMP effector system controls cell adhesion by inside-out signaling and surface protein cleavage. PLoS Biol. 9:e1000587 Navarro MV, Newell PD, Krasteva PV, Chatterjee D, Madden DR, O’Toole GA, Sondermann H. (2011).Structural basis for c-di-GMPmediated inside-out signaling controlling periplasmic proteolysis. Plos Biology 9:e1000588. Chelsea D. Boyd, Debashree Chatterjee, Holger Sondermann, George A. O'Toole (2012). LapG, Required for Modulating Biofilm Formation by Pseudomonas fluorescensPf0-1, Is a Calcium-Dependent Protease. Journal of Bacteriology 194:4406–4414 Moor, H., Teppo, A., Lahesaare, A., Kivisaar, M., Teras, R. (2014). Fis overexpression enhances Pseudomonas putida biofilm formation by regulating the ratio of LapA and LapF. Microbiology. 160(Pt 12):2681-93. Fuqua C (2010). Passing the baton between laps: adhesion and cohesion in Pseudomonas putida biofilms. Mol Microbiol 77:533–536. Andrio Lahesaare, Hanna Moor, Maia Kivisaar, Riho Teras (2014). Pseudomonas putida Fis Binds to the lapF Promoter In Vitro and Represses the Expression of LapF. PLoS One 9(12): e115901. Iris Bertani, Milica Ševo, Milan Kojic, Vittorio Venturi (2003). Role of GacA, LasI, RhlI, Ppk, PsrA, Vfr and ClpXP in the regulation of the stationary-phase sigma factor rpoS/RpoS in Pseudomonas. Arch Microbiol. 180:264–71. Yuste, L., Hervas, A. B., Canosa, I. jt (2006). Growth phase-dependent expression of the Pseudomonas putida KT2440 transcriptional machinery analysed with a genome-wide DNA microarray. Environmental microbiology 8, 165–177. Waite RD, Paccanaro A, Papakonstantinopoulou A, Hurst JM, Saqi M, jt (2006) Clustering of Pseudomonas aeruginosa transcriptomes from planktonic cultures, developing and mature biofilms reveals distinct expression profiles. BMC Genomics 7:162.