Tiopuriinmetüültransferaas

Tiopuriinmetüültransferaas (TPMT) on tsütoplasma ensüüm, mis viib läbi inimese organismis tiopuriinravimite metüleerimist. Metüleerimise protsessis kasutab tiopuriinmetüültransferaas metüülrühma doonorina S-adenosüül-L-metioniini (SAM). Metülatsioon muudab aromaatsed ja heterotsüklilised väävliühendid, nende hulgas ka tiopuriinravimid 6-merkaptopuriini, asatiopriini ja 6-tioguaniini inaktiivseks. TPMT katalüüsitud metülatsioon on tiopuriinravimite metabolismis viimaseks oluliseks etapiks, metüleerimine muudab ravimi jääksaaduseks. Tiopuriinmetüültransferaasi kodeerib TPMT geen. Inimese genoomis paikneb TPMT geen 6. kromosoomi lühikesel õlal (6p22.3). Geeni pikkus on 27 000 aluspaari ning koosneb 10 eksonist ja 9 intronist. TPMT geeni promootori piirkonna (−873 kuni +736 aluspaari) GC sisaldus on 71% ehk piirkond on GC rikas. Geeni promootori piirkonnas asuvad veel 17–18 aluspaari pikkused tandeemsed kordusjärjestused, mis varieeruvalt esinevad kolm kuni üheksa korda, eurooplastel tavaliselt viis või kuus korda. Inimese tiopuriinmetüültransferaasi geenil on neli pseudogeeni, mis asuvad 3. kromosoomil, 18. kromosoomil ning kaks pseudogeeni X-kromosoomil. Inimese TPMT-geenile on leitud üheksa homoloogi: šimpansil, reesusahvil, koeral, lehmal, hiirel, rotil, kanal, sebrakalal, konnal. TPMT geeni ortolooge on 101. Tiopuriinmetüültransferaasi geen kodeerib 28 kDa suurust valku, mis koosneb 245 aminohappest. Valku kodeeritakse 8 eksonilt. Valgul on üks domeen, mis on kokku pakitud omapäraselt klass I metüültransferaasidele. Domeen koosneb üheksaahelalisest beetalehest, mis külgneb mõlemalt poolt kolme alfalehega. Beetaahelad sisaldavad saiti, mis on võimeline moodustama kompleksi S-adenosüül-homotsüsteiini, S-adenosüül-L-metioniini ja 6-merkaptopuriiniga. Geneetilised muutused (mutatsioonid ja üksiku nukleotiidi polümorfismid) TPMT-geenis kutsuvad esile muutusi TPMT aminohappelises koostises ja valgu struktuuris. Struktuuri või koostise muutuse tagajärjel võib valgu funktsioon muutuda ning valk ei suuda oma algupärast ülesannet täita. Tiopuriinmetüültransferaas katalüüsib teiste aromaatsete ja tsükliliste väävliühendite seas tiopuriinravimite 6-merkaptopuriini, asatiopriini ja 6-tioguaniini metüleerimist. Tiopuriinravimid on puriini analoogid, tsütotoksilised ravimid, mis on meditsiinis kasutusel erinevate haiguste raviks. Esialgu on tiopuriinravimid inaktiivsed, organismis moodustuvad rakusisese metabolismi käigus aktiivsed ühendid. Aktiivsed metaboliidid (tiopuriinid) seonduvad puriinide asemel DNA ja RNA ahelasse, mis põhjustavad normaalse rakutsükli peatumist ning rakk suunatakse apoptoosi ehk programmeeritud rakusurma. Tiopuriinmetüültransferaasi aktiivsusest oleneb aktiivsete metaboliitide hulk. TPMT inaktiveerib tiopuriinid metüleerimise teel ning seeläbi vähendab tsütotoksilisuse mõju organismile. TPMT ensüümi normaalse aktiivsuse korral omab ravimi standarddoos terapeutilist ehk toimivat mõju ning ebanormaalse aktiivsuse korral võib ravimite manustamine esile kutsuda kõrvalnähte ning põhjustada toksilisust. Tiopuriinravimeid, mille metabolismi katalüüsib tiopuriinmetüültransferaas, kasutatakse erinevate haiguste ravimisel. 6-merkaptopuriini kasutatakse ägeda lümfoidleukeemia ravis. Tioguaniini kasutatakse ägeda müeloidleukeemia ravis. Asatiopriini kasutatakse mitmete autoimmuunhaiguste, põletikulise soolehaiguse ja sidekoehaiguste raviks ning organite siirdamisjärgse äratõukereaktsiooni ärahoidmiseks. Mutatsioonid ja polümorfismid TPMT geenis reguleerivad ensüümi aktiivsust, mistõttu ravimi talumine ning efektiivsus on individuaalsed. Aktiivsuse vähenedes võib ravimi manustajal esineda eluohtlikke kõrvalnähte ja toksilisust, põhjustades leukopeeniat, müelosupressiooni või hematotoksilisust. Ensüümi aktiivsuse suurenemise korral võib ravimi standarddoosi manustamisel haigusest vabanemine olla pikemaajaline ning haigus võib korduda, sest ensüüm lagundab aktiivsed metaboliidid kiiremini ja ravimi efektiivsus väheneb. Seetõttu on väga suure TPMT-aktiivsusega indiviididel toimiva mõju saavutamiseks üks võimalus ravimi doosi suurendamine, kuid sellega suureneb kõrvaltoimete tekke risk ning võimalusel tuleks eelistata teistsugust raviprogrammi. Praeguseni saaks kasutada individuaalse raviprogrammi määramiseks polümorfismidega seonduvaid farmakogeneetilisi markereid, kuid need ei seleta lõplikult inimeste erinevat ravimitaluvust. Seetõttu töötavad teadlased (ka Eestis) uute markerite leidmise nimel, et patsientide ravi efektiivsemaks muuta.  Praeguseks on tuvastatud TPMT geenil 42 eri alleeli, millest osadel on selge mõju TPMT valgu ekspressioonitasemele ning seeläbi ka ensüümi aktiivsusele. Enamusel tuvastatud mutantsetel alleelidel on ensüümi aktiivsust vähendab efekt. Normaalne alleelivariant ehk metsiktüüpi alleel on TPMT*1. Selle alleelivariandi suhtes homosügootsed indiviidid ehk need, kellel on mõlemas kromosoomis TPMT*1 metsiktüüpi alleel, kodeerivad TPMT valku normaaltasemel ja reeglina on ensüümi aktiivsus samuti normaaltasemel. Mutatsioonid erinevatel alleelidel võivad esineda geeni mittekodeerivas piirkonnas ehk intronis, kodeerivas piirkonnas ehk eksonis või nende piiril. Mittekodeerivas piirkonnas paiknevad mutatsioonid teadaolevalt ensüümi aktiivsust ei mõjuta. Muutused eksonis põhjustavad valgu struktuuri või koostise muutumist ning muteerunud valk lagundatakse kiiresti. Eksoni ja introni piiril esinevad muutused põhjustavad ebakorrektse mRNA splaissingu ehk eksonite ühendamise, mis samuti põhjustab valgu kiiremat lagundamist. Mutantsetest alleelidest on kõige enam levinud kolm varianti: TPMT*2, TPMT*3A ja TPMT*3C. 85–90% inimestest, kellel on tuvastatud madal või keskmise tasemega ensüümi aktiivsus, kannavad ühte nimetatud alleelivariantidest. TPMT*2 alleelil on mutatsioon toimunud geeni viiendas eksonis, mis kutsub esile aminohappe vahetuse koodonis 80, alaniini asemel on proliin. Võrreldes metsiktüüpi alleeliga, põhjustab TPMT*2 ensüümi aktiivsuse vähenemist enam kui sajakordselt. TPMT*3A on kõige levinum mutatsiooni kandev alleel valge rassi seas. Muutused on toimunud seitsmendas ja kümnendas eksonis, põhjustades samuti aminohapete vahetuse (ekson 7 koodon 154, alaniini asemel treoniin; ekson 10 koodon 240, türosiini asemel tsüsteiin). Võrreldes metsiktüüpi alleeliga, põhjustab TPMT*3A ensüümi aktiivsuse vähenemist enam kui kahesajakordselt. TPMT*3C alleel kannab kümnendas eksonis sama mutatsiooni mis TPMT*3A, aminohappe türosiini asemel on tsüsteiin. Ülejäänud 38 alleelivarianti esinevad inimpopulatsioonis väga väikese sagedusega. Tiopuriinmetüültransferaas aktiivsust määratakse enamasti erütrotsüütidest ehk punastest vererakkudest. Erütrotsüütides on TPMT ensüümi aktiivsus tugevas korrelatsioonis teiste kudedega, sealhulgas maksas ja neerudes oleva TPMT tasemega. Seetõttu kasutataksegi TPMT-aktiivsuse määramiseks vereproovi, kuna teiste kudede proovidega võrreldes on punased vererakud lihtsamini kättesaadavad. Pärast proovi eraldamist tuvastatakse TPMT ensüümi aktiivsus kõrgefektiivse vedelikkromatograafiaga. Uuringute põhjal on tuvastatud, et populatsioonis esineb trimodaalne TPMT ensüümi aktiivsuse jaotus: 0,3% indiviididel on väga madal aktiivsus, umbes 10% populatsioonist on osaliselt vähenenud aktiivsus ning ligikaudu 90% on normaalse aktiivsusega. Indiviidid, kellel on tuvastatud normaalsest madalam ensüümi aktiivsus, on enamasti heterosügootsed ühe mutantse alleeli suhtes ning indiviididel, kel esineb ensüümi defitsiit, kannavad kahte mutantset alleeli. TPMT ensüümi aktiivsuse populatsioonisisese varieeruvuse tõttu on oluline enne tiopuriinravimite kasutama hakkamist tuvastada igal patsiendil TPMT-aktiivsus, et vältida eluohtlikke ja tõsiseid kõrvalnähtusid ning ära hoida ravimimürgistuse tekkimine. Tiopuriinmetüültransferaasi ensüümi aktiivsust mõjutavad lisaks genotüübile ka muud tegurid. Üks nendest on S-adenosüül-L-metioniin (SAM), mis osaleb metüülrühma doonorina TPMT töös. SAMi seondumine TPMT aktiivsaiti teeb tekkinud ühendi stabiilsemaks ning TPMT ensüümi aktiivsus ei vähene. SAMi biosünteesiraja võtmeelementideks on aminohape metioniin ja ATP. Kui metioniini ja ATP tase on rakkudes piisavalt kõrge, püsib SAMi süntees normaaltasemel ja ühtlasi hoiab SAM TPMT-aktiivsust üleval. Võimalik, et TPMT aktiivsust tõstab ka testosterooni tase. Väikelapseeas on tuvastatud poistel tunduvalt suurem TPMT-aktiivsus kui tüdrukutel. Puberteedieani on aktiivsus poistel vähenenud ning puberteedi algusega uuesti märgatavalt kasvanud. Pärast puberteediaja möödumist väheneb ensüümi aktiivsus uuesti. Hoolimata sellest pole täiskasvanutel soo mõju TPMT-aktiivsusele suudetud üheselt kinnitada. Woodson, L. C., & Weinshilboum, R. M. (1983). Human kidney thiopurine methyltransferase. Purification and biochemical properties. Biochemical Pharmacology, 32(5), 819–26. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6838629 Blaker, P. A. et al. (2012). The pharmacogenetic basis of individual variation in thiopurine metabolism. Personalized Medicine, 9(7), 707–725. http://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/pme.12.85 Fessing, M. Y. et al. (1998). Molecular cloning and functional characterization of the cDNA encoding the murine thiopurine S-methyltransferase (TPMT). FEBS Letters, 424(3), 143–5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9539138 TPMT thiopurine S-methyltransferase [Homo sapiens (human)] – Gene – NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7172 03.10.2014 Wang, L., & Weinshilboum, R. (2006). Thiopurine S-methyltransferase pharmacogenetics: insights, challenges and future directions. Oncogene, 25(11), 1629–38. http://www.nature.com/onc/journal/v25/n11/abs/1209372a.html Spire-Vayron de la Moureyre et al. (1999). Characterization of a variable number tandem repeat region in the thiopurine S-methyltransferase gene promoter. Pharmacogenetics, 9(2), 189–98. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10376766 Wu, H. et al. (2007). Structural basis of allele variation of human thiopurine-S-methyltransferase. Proteins, 67(1), 198–208. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2750861/ Krynetski, E. et al. (1996). Genetic polymorphism of thiopurine S-methyltransferase: clinical importance and molecular mechanisms. Pharmacogenetics, 6(4), 279–90. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8873214 Swann, P. F. et al. (1996). Role of postreplicative DNA mismatch repair in the cytotoxic action of thioguanine. Science (New York, N.Y.), 273(5278), 1109–11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8688098 Lennard, L. et al. (1987). Thiopurine pharmacogenetics in leukemia: correlation of erythrocyte thiopurine methyltransferase activity and 6-thioguanine nucleotide concentrations. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 41(1), 18–25. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3467886 Krynetski, E. Y., & Evans, W. E. (1999). Pharmacogenetics as a molecular basis for individualized drug therapy: the thiopurine S-methyltransferase paradigm. Pharmaceutical Research, 16(3), 342–9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10213363 Relling, M. V. et al. (1999). Prognostic importance of 6-mercaptopurine dose intensity in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 93(9), 2817–23. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10216075 Stanulla, M. et al. (2005). Thiopurine methyltransferase (TPMT) genotype and early treatment response to mercaptopurine in childhood acute lymphoblastic leukemia. JAMA, 293(12), 1485–9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15784872 Karas-Kuzelicki, N., & Mlinaric-Rascan, I. (2009). Individualization of thiopurine therapy: thiopurine S-methyltransferase and beyond. Pharmacogenomics, 10(8), 1309–22. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19663675 TPMT allele nomenclature table (April 2014) ♙https://web.archive.org/web/20161118230556/http://www.imh.liu.se/tpmtalleles/tabell-over-tpmt-alleler?l=en 04.10.2014 Szumlanski, C. et al. (1996). Thiopurine methyltransferase pharmacogenetics: human gene cloning and characterization of a common polymorphism. DNA and Cell Biology, 15(1), 17–30. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8561894 Tai, H. L. et al. (1997). Enhanced proteolysis of thiopurine S-methyltransferase (TPMT) encoded by mutant alleles in humans (TPMT*3A, TPMT*2): mechanisms for the genetic polymorphism of TPMT activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94(12), 6444–9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC21069/ Otterness, D. et al. (1997). Human thiopurine methyltransferase pharmacogenetics: gene sequence polymorphisms. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 62(1), 60–73. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10764140 McLeod, H. L. et al. (2000). Genetic polymorphism of thiopurine methyltransferase and its clinical relevance for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 14(4), 567–72. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9246020 Szumlanski, C. L. et al. (1992). Human liver thiopurine methyltransferase pharmacogenetics: biochemical properties, liver-erythrocyte correlation and presence of isozymes. Pharmacogenetics, 2(4), 148–59. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1306116 Loit, E. et al. (2011). Pre-analytic and analytic sources of variations in thiopurine methyltransferase activity measurement in patients prescribed thiopurine-based drugs: A systematic review. Clinical Biochemistry, 44(10–11), 751–7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21402061 Serpe, L. et al. (2009). Thiopurine S-methyltransferase pharmacogenetics in a large-scale healthy Italian-Caucasian population: differences in enzyme activity. Pharmacogenomics, 10(11), 1753–65. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19891552 Bolton, N. J. et al. (1989). Circulating sex hormone-binding globulin and testosterone in newborns and infants. Clinical Endocrinology, 31(2), 201–7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2605795