Nukleaas

Nukleaas on ensüüm, mis lagundab DNA-s ja RNA-s nukleotiididevahelisi fosfodiestersidemeid. Ensüümid on võimelised hüdrolüüsi abil lagundama nukleiinhappes (DNA või RNA) nukleotiidide (A, T, G, C, U) vahelisi fosfodiestersidemeid, mistõttu nimetatakse neid ka fosfodiesteraasideks. Nukleaasid kuuluvad hüdrolaaside ensüümiklassi. Nukleaase leidub kõikides elusorganismides ning ka viirustes. Nukleaase on väga erinevaid ja nad varieeruvad substraadispetsiifilisuse poolest. DNA fosfodiestersidemeid lõikav nukleaas on desoksüribonukleaas ehk lühendatult DNaas. RNA fosfodiestersidemeid lõikav nukleaas on ribonukleaas ehk lühendatult RNaas. Endonukleaasid lõikavad fosfodiestersidemeid DNA- või RNA-ahela keskelt kas mittespetsiifiliselt või kindla lämmastikaluste (nukleotiidide) järjestuse juurest (näiteks restriktsiooni endonukleaasid ehk restriktaasid). Spetsiifilist lõikekohta võivad aidata leida ka abivalgud. Eksonukleaasid lõikavad lämmastikaluseid DNA- või RNA-ahela otstest. Mõned nukleaasid võivad olla korraga nii endonukleaasid kui eksonukleaasid. Samuti võivad nukleaasid olla kas 5’->3’ või 3’->5’ suunalised, mõned võivad olla mõlemasuunalised. Nukleaasidel on tihti konserveerunud minimaalsed motiivid, mis sisaldavad aktiivsaidis happelisi ja aluselisi (aminohappe) jääke. Nukleaaside katalüüsis on sageli tähtsad ka erinevad katioonid, näiteks magneesium, kaltsium, mangaan, tsink või mõni kofaktor. Metalliioonide roll on enamasti fosfodiestersideme hüdrolüüsil tekkivate vaheühendite stabiliseerimine. Kuna restriktaasid on nukleaasid, siis on nukleaaside ajalugu seotud restriktaaside avastamisega ja iseloomustamisega 1960. aastatel. Sellega said hakkama molekulaarbioloogid Werner Arber, Hamilton Othanel Smith ja Daniel Nathans ning 1978. aastal said nad restriktaaside avastamise eest Nobeli auhinna füsioloogia või meditsiini valdkonnas. 1971. aasta detsembris ilmunud uurimuses näitasid Kathleen Danna ja Daniel Nathans esimest korda, et varem Hamilton Smithi ja Kent Wilcoxi isoleeritud ning iseloomustatud restriktsiooni ensüümi "endonukleaas R" saab kasutada SV40 viiruse DNA lõikamiseks kindlateks juppideks. Praeguseks on see "endonukleaas R" tuntud kui HindII. Deoksüribonukleaas I ehk lühendatult DNaas I on endonukleaas ning ta lõikab kaheahelalist ja üheahelalist DNAd. Lõikesait on pürimidiinide vastas kõrvalahelas. Ensüüm tekitab 5’ otsa fosforüleeritud di-, tri- või tetranukleotiididest üleulatuva osa. DNaas I kasutatakse DNA (näiteks plasmiidide) degradeerimiseks RNA preparaatides, sest DNaas I ei lõika RNAd. Ribonukleaas A ehk lühendatult RNaas A on endonukleaas ning tema substraat on üheahelaline RNA, see teeb temast endoribonukleaasi. Lõikus toimub 3’ otsast pürimidiini (C,T,U) lämmastikaluse juurest ning tekivad 3’ otsast fosforüleeritud mononukleotiidid ja oligonukleotiidid. RNaas A on võimeline töötama ilma kofaktorite ja divalentsete katioonideta, kuid teda inhibeerib platsentaalset päritolu RNaasi inhibiitor. RNaas A kasutatakse RNA degradeerimiseks DNA (näiteks plasmiidi) preparaatides. Samuti saab antud ensüümi abil kaardistada ühenukleotiidseid mutatsioone DNA- või RNA-ahelates. Ribonukleaas H ehk lühendatult RNaas H leidub kõigis elusorganismides ning ta kõrvaldab Okazaki fragmente, mis tekivad DNA replikatsiooni käigus. Eukarüootides ja arhedes aitavad Okazaki fragmente kõrvaldada 5’->3’ aktiivsusega endonukleaasid, inimestel kodeerib sellist endonukleaasi 11. kromosoomis asuv geen FEN1. Ribonukleaas T1 on endoribonukleaas, mis lõikab DNAd 3’ otsa guaniini (G nukleotiid) jääkide juurest, tekitades sedasi oligonukleotiide. Saadakse hallitusseenest Aspergillus oryzae. Kasutatakse selleks, et eemaldada mittepaardunud RNA järjestused DNA-RNA hübriididest. Nukleaas S1 saadakse hallitusseente Aspergillus perekonnalt. Üheahelalist DNAd ja RNAd saab nukleaas S1 lõigata madalate kontsentratsioonide juures, kaheahelaliste substraatide (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA) jaoks on vaja kõrgemaid ensüümi kontsentratsioone. Keskmise kontsentratsiooni juures saab lõigata kaheahelalist DNAd lõigete (lämmastikalus ei ole selles kohas oma naabriga fosfodiestersideme kaudu ühendatud, aga komplementaarse lämmastikalusega vastasahelast võivad tal olla vesiniksidemed) ja väikeste tühimike (selles kohas ei oma DNA komplementaarset ahelat) juures. Kasutatakse peamiselt DNA-RNA hübriidide struktuuri analüüsimiseks ning DNAle tömpide otsade tekitamiseks. Nukleaas S1 tekitab 5' otsast fosforüleeritud mono- või oligonukleotiide. Antud ensüüm töötab paremini madala pH (4,5) juures, seega on tema kasutusviisid mingil määral piiratud. Mungoa nukleaase saadakse mungoa võrsetest. See ensüüm lõikab üheahelalise DNA 5’ otsast fosforüleeritud mono- või oligonukleotiidideks. Suuremates kontsentratsioonides on ensüüm võimeline lõikama ka kaheahelalisi nukleiinhappeid. Hea on seda ensüümi kasutada tömpide otsadega DNA saamiseks. Nukleaas BAL31 saadakse proteobakterite Alteromonas'e perekonnalt. Tal on nii eksonukleaasne kui endonukleaasne aktiivsus. Eksonukleaasina lõikab ta ära kaheahelalise DNA 5’ ja 3’ otsa, seega saab ensüümi saab kasutada DNA fragmentide lühendamiseks mõlemast otsast. Endonukleaasina lõikab ta DNA tühimike juurest ning DNA katkestuste juurest, neis kohtades on üheahelaline DNA lõikamiseks kättesaadav. DNA lõikuse protsess on sõltuv kaltsiumi olemasolust lahuses ning reaktsiooni saab eri faasides peatada kelaadi EGTA (inglise k ethylene glycol tetraacetic acid) lisamisega, see seob lahuses oleva kaltsiumi. BAL 31 saab kasutada lühikestes DNA-ahelates restriktsioonisaitide kaardistamiseks. Restriktaas EcoRI on E. coli RY13 tüvedelt eraldatud endonukleaas, mis on osa restriktsiooni-modifikatsiooni süsteemist. Laboris on ta asendamatu, sest lõikab spetsiifilise järjestuse juurest (GAATTC) ning tekitab DNA kaksikahelale 4 nukleotiidi pikkuse üheahelalise otsa. Seda üksikahelalist otsa nimetatakse "kleepuvaks otsaks", sest vesiniksidemete tõttu, mis nukleotiide vastakuti seovad, on selline järjestus aldis komplementaarse RNA või komplementaarse üksikahelalise DNAga seostuma. EcoRI tekitab AATT järjestusega kleepuva otsa. Molekulaarses bioloogias on EcoRI eriti tähtis, kuna ta tekitab kindla järjestusega (AATT) üksikahelalise DNA otsa, mida on siis kerge DNA ligaasiga mingi teise komplementaarse otsa (TTAA) külge liita. Vahetevahel toimuvad lämmastikalustega muutused, mis nad kasutuskõlbmatuteks muudavad. Nendest muteeritud lämmastikalustest aitavad vabaneda AP endonukleaasid, mis lõikavad läbi fosfodiestersidemed vigase lämmastikaluse ja tema naabri vahel. Bakteril Escherichia coli on kaks AP endonukleaasi, endonukleaas IV (lühendatult Endo IV) ja eksonukleaas III (lühendatult Exo III). Exo III eemaldab kaheahelaliselt DNAlt 3’ otsast mononukleotiide ning eelistab substraadina tömbi otsaga DNAd (st ei ole üleulatuvaid nukleotiide) või 5’ üleulatuva otsaga kaheahelalist DNAd. 3’ üleulatuva otsaga substraadil töötab antud ensüüm ebaefektiivselt ning üheahelalise DNA substraadil on ensüüm inaktiivne. Mida pikem on üleulatuv osa, seda resistentsem on substraat lõikamisele, näiteks 4 nukleotiidi pikkuse üleulatuva osaga substraat on Exo III suhtes resistentne. Eukarüootides aitab vigastest lämmastikalustest vabaneda üks teadaolev AP endonukleaas. Pärmide APN1 on homoloog E. coli AP endonukleaasile Endo IV. Imetajatel on olemas Ape1 valk, mis järjestuselt sarnaneb E. coli Exo III nukleaasiga, aga ei oma 3’->5’ eksonukleaasset aktiivsust. Ape1 valgu deletsiooniga hiired hukkuvad embrüonaalses eas. Bakteritel ja arhedel on nukleaasid viiruste vastases kaitses tähtsad, neil on restriktaasid ehk restriktsiooni endonukleaasid, mis lõikavad tükkideks rakku sissetungiva viiruse DNA. Samuti tuleb peale viirusinfektsiooni raku enda DNA degradeerida. Rakus mängivad nukleaasid tähtsat rolli DNA replikatsioonis, parandamises ja rekombinatsioonis. Näiteks tuleb eukarüootidel pärast DNA transkriptsiooni (DNA-ahela põhjal sünteesitakse komplementaarne mRNA) tuleb mRNA-st välja lõigata intronid, mis ei sisalda kodeerivaid järjestusi (kuid võivad rakus täita ka mõnda muud funktsiooni). Seda nimetatakse RNA splaissimiseks. Asendamatud on nad molekulaarses bioloogias, kui on vaja DNA lõigata kindla järjestuse juurest katki (endonukleaas) või lihtsalt tükkideks lõigata (eksonukleaas). Prokarüootides on sünteesitud mRNA eluiga umbes 1–3 minutit. mRNA pealt toimub samaaegselt translatsioon ning tema lagundamine nukleaaside poolt. On viirusi, mis kodeerivad enda nukleaase. Neil on nukleaase vaja näiteks viirusekapslisse pakitava DNA või RNA kärpimiseks, sest kapsli maht on limiteeritud. Näiteks bakteriofaagidel T4 on väga tähtsad enda genoomi kodeeritud DNaasid. Üks neist on endonukleaas VII (EndoVII), mida algul kirjeldati kui ensüümi, mida on hilises infektsioonitsüklis vaja sünteesitud DNA pakkimiseks viirusekapslitesse. Nukleaasid mängivad tähtsat rolli rekombinantse DNA tehnoloogias ja geneetilises modifikatsioonis (transgeensed organismid). "Arhiivikoopia". Originaali arhiivikoopia seisuga 19. september 2015. Vaadatud 19. oktoobril 2014.{{netiviide}}: CS1 hooldus: arhiivikoopia kasutusel pealkirjana (link) http://www.britannica.com/EBchecked/topic/421887/nuclease Structure and function of nucleases in DNA repair: shape, grip and blade of the DNA scissors; Tatsuya Nishino and Kosuke Morikawa; Department of Structural Biology, Biomolecular Engineering Research Institute (BERI), 6-2-3 Furuedai, Suita, Osaka 565-0874, Japan http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/ How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology, Richard J. Roberts, 19.04.2005, https://web.archive.org/web/20141017030316/http://www.pnas.org/content/102/17/5905.full#ref-1 http://www.nature.com/milestones/miledna/full/miledna04.html "Arhiivikoopia". Originaali arhiivikoopia seisuga 5. august 2004. Vaadatud 19. oktoobril 2014.{{netiviide}}: CS1 hooldus: arhiivikoopia kasutusel pealkirjana (link) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. köide, Joseph Sambrook, E. F. Fritsch, Tom Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, ISBN 0879693096, 9780879693091 http://www.accessexcellence.org/AE/AEC/CC/action.php https://www.neb.com/products/r0101-ecori Voet, D. and Voet, J. G., Biochemistry (3rd ed.), John Wiley & Sons (2004)