YPD

YPD (ka YEPD; Yeast Extract Peptone Dextrose) ehk pärmiekstrakt-peptoonsööde on mikrobioloogias laialdaselt kasutusel olev mitteselektiivne sööde, mida enamasti kasutatakse pagaripärmi (Saccharomyces cerevisiae) kasvatamiseks nii vedelsöötmes kui ka tahkel söötmel Petri tassil. Olles rikas sööde, sisaldab YPD kõiki efektiivseks kasvuks vaja olevaid toitaineid. YE (Yeast Extract) ehk pärmiekstrakt on pärmirakkudest rakukestade eraldamisel (pärmirakkude lüüsimisel) saadud toode, mida kasutatakse väga laialdaselt toiduainetööstuses nii maitselisandina kui ka toidulisandina pärmiekstrakti suure toiteväärtuse tõttu. Kuna pärmiekstrakt on ka ainuke optimaalne mitteloomne B12-vitamiini allikas, on see eriti populaarne veganite seas. Mikrobioloogias kasutatakse pärmiekstrakti bakteri- ja pärmikasvatusel, kuna pärmiekstrakt on odav ja efektiivne aminohapete, vitamiinide ning mineraalide allikas. Pärmiekstrakt moodustab tavaliselt 1% söötme kogumahust. Peptoon (Peptone) on segu erinevatest polüpeptiididest, mida saadakse loomsete valkude töötlemisel erinevate ensüümidega – proteaasidega. Ensüümideks on tavaliselt pankreatiin (pankrease ehk kõhunäärme eritatav ekskreet, mis omakorda on segu ensüümidest amülaas, lipaas ja proteaas, mis vastavalt lagundavad tärklist, rasvu ja valke) ning papaiin, mis esineb looduslikult harilikus papaias (Carica papaya) ning on samuti laia funktsionaalsusega, st on võimeline valke lõikama mitmest erinevast kohast – saidist. Nende ensüümide erinevad omadused tagavad selle, et peptoon koosneks erinevatest polüpeptiididest, mis on kasvavale organismile vajalik maksimaalse efektiivsusega kasvamiseks. Peptoon on mikroobidele peamiseks lämmastikuallikaks YPD söötmel. Peptoon moodustab tavaliselt 2% söötme kogumahust. Dekstroos (Dextrose) ehk D-glükoos on monosahhariid, glükoosi D-isomeer. Nagu ka enamuse teiste monosahhariidide puhul, on ka glükoosi D-isomeer looduses tunduvalt enam levinud kui L-isomeer. Dekstroosi on pärmirakud võimelised fermenteerima. Selle käigus tekib etanool ja süsihappegaas ning ka glütserooli. Seega dekstroosi sisaldaval söötmel pärmirakud aeroobselt ei hinga (st ei kasuta tsitraaditsüklit, mida võimaldab organell mitokonder), vaid kasutavad energia saamiseks anaeroobset metaboolset rada – kääritamist. See osutub aga probleemiks, kui pärmirakkude seas on ka mutante, kellel mitokondriaalne DNA puudub (rho0-mutandid) või on defektne/fragmenteerunud (rho–-mutandid). Mõlemal juhul on mitokonder ebafunktsionaalne ning aeroobset ainevahetusrada kasutada ei ole võimalik. Selleks, et veenduda, et uuritavate pärmirakkude seas ei ole mutante, tuleb neid selekteerida, kasvatades pärmirakke söötmel, mida ei ole võimalik kääritada, st pärmirakkudel tuleb kasutada hingamisahelat. Sel juhul mutandid, kelle mitokonder on ebafunktsionaalne (rho-mutandid), ei suuda söötmel kasvada ning söötmel jäävad elama ainult metsiktüüpi (wild-type) rakud. Üheks pärmirakkudele mittefermenteeritavaks süsinikuallikaks on glütserool, mis on ühe teise, YPD-ga sarnase söötme koostisosaks: YPG (Yeast Extract Peptone Glycerol). Selle söötme koostisosad on samad, kuid dekstroosi asemel sisaldab sööde glütserooli. YPG-söötmel suudavad kasvada ainult hingavad rakud. Dekstroos on YPD-söötmes süsinikuallikaks, see moodustab tavaliselt 2% söötme kogumahust ja glütserool (YPG puhul) 3%. ddH2O (double-distilled water) ehk kahekordselt destilleeritud vesi on mikrobioloogias asendamatu vahend. Destilleeritud vett kasutatakse nii söötmete valmistamisel, kus veega pannakse paika ruumala, mille järgi arvestatakse teiste komponentide kogused (nagu ka YPD puhul), kui ka puhverlahuste valmistamisel, lahjendamisel ning töövahendite puhastamisel. Destilleeritud vee tähtsus seisneb selles, et kuna teaduses peab olema võimalik kõiki katseid korrata, saades sealjuures samasugused (või vähemalt kriitiliselt sarnased) tulemused, ei ole kraanivee kasutamine otstarbekas, kuna kraanivee mineraalne koostis varieerub paiguti ning võib juhtuda, et sama katse teostamisel teises maailma osas (või teises riigi osas) saadakse seepärast katsel teistsugused tulemused. Veel üks võimalus sellisel juhul teaduslike kriteeriumite piiridesse jääda oleks määrata igal kasutuskorral kogu kasutatava kraanivee ioonne koostis. See aga tähendaks meeletult lisatööd (rääkimata katse kordamisel tekkivatest raskustest) ning seetõttu ongi palju lihtsam, mugavam ning kindlam kasutada (kahekordselt) destilleeritud vett ning lisada ise vastavasse lahusesse vastavalt mineraale. ddH2O on YPD-söötmes lahustiks. Agar on galaktoosi polümeer, mida saadakse agaroosist. Agaroos omakorda koosneb agarist ja agaropektiinist. Agar saadakse agaroosist agaropektiini kõrvaldamisel. Agaroosi leidub looduslikult kõige enam punavetikates (Rhodophyta). Agarit kasutatakse toiduainetööstuses nii tardainena kui paksendajana, kuid mikrobioloogias leiab agar kasutust Petri tasside söötme valmistamisel. Petri tassi valmistamisel on agar tardaineks, mis söötme ühtseks kokku seob. Agarile annab eelise teiste tardainete, näiteks želatiini ees see, et erinevalt želatiinist ei sula agar inimese kehatemperatuuril (37 °C), mis on aga paljude mikroobide, eriti bakterite (näiteks Escherichia coli) kõige optimaalsem kasvutemperatuur. Agariga on ka lihtne umber käia, kuna agari kasutamiseks tuleb vaid kommertsiaalset agaripulbrit vees lahustada ning viia temperatuurile, mis on vähemalt 85 °C, mis on agari sulamistemperatuuriks. Agarile on omane ka hüstereesile mitte allumine, st agari sulamis- ja külmumistemperatuur ei ühildu, mistõttu kui agar on kord sulamistemperatuurile (85 °C) viidud, on agar vedelas olekus kuni selle temperatuur langeb tahenemistemperatuurini, milleks on 32–40 °C. Agari kuumutamisel 85 °C-ni murduvad galaktoosi molekulide vahelised sidemed, mis lubab agaril muutuda vedelaks. 32–40 °C juures aga toimub galaktoosi molekulide repolümeriseerumine, mille tulemusena agar taheneb. Agar moodustab tavaliselt 2% tahkest söötmest. Kaaluda keskmise täpsusega laborikaaluga (±0,5%) vastavalt söötme mahule välja vajaminevad kogused koostisosasid ning lisada kolbi või laboratoorsesse pudelisse. Näiteks 1 liitri söötme valmistamiseks läheb vaja 10g pärmiekstrakti, 20g peptooni, 20g dekstroosi/glükoosi ning Petri tasside valmistamisel lisaks 20g agarit. Lisada vastavalt söötme mahuni (destilleeritud) vett, segada. Keeta söödet umbes üks minut (näiteks mikrolaineahjus), vahepeal segades, et sööde üle ei keeks, kuid samas nii, et kõik koostisosad oleksid täielikult lahustunud. Steriliseerida(!) sööde autoklaavis 115–121 °C juures 15 minutit. Edasipidi avada söödet sisaldav kolb/pudel vaid steriilsetes tingimustes, näiteks laminaaris. Lasta söötmel jahtuda ~55–65 °C, Petri tasside valmistamise puhul valada söödet tassile nii, et sööde kataks kogu tassi põhja. 300 ml söötme kohta saab keskmiselt 15 tassi. Agarit sisaldava söötme säilitamisel toatemperatuuril ning hilisemal kasutamisel tuleb sööde uuesti üles sulatada nagu eelnevalt mainitud. Petri tasside valmistamisel lasta tassidel taheneda toatemperatuuril vähemalt üleöö, soovitatavalt 24 tundi. Vedelsöötme kasutamise puhul kasvatada mikroobe kolbis või katseklaasis. (valikuline) Kontrollida söötme steriilsust ja funktsionaalsust kontrolltüve kasvatamisega. Sööde on valmis kasutamiseks, Petri tassidel kasvatatavaid mikroobe inkubeerida vastava temperatuuriga kapis (näiteks pagaripärmi puhul 30 °C), vedelsöötmes kasvatatavaid mikroobe inkubeerida loksutajal (näiteks pagaripärmi puhul 25–30 °C, 100–300 pööret minutis; pöörete arv võib sõltuvalt loksutaja tüübist ja labori standarditest varieeruda). Tüve ülesvõtmiseks (inaktiivse mikroobitüve aktiivseks muutmisel) kasutatakse tüüpiliselt n-ö stock-lahust, mis kujutab endast pikaajaliseks säilitamiseks mõeldud lahust, mis võib olla nii nukleiinhappe-stock, kui ka mikroobi stock jne. Stock-i säilitatakse tavaliselt −80 °C juures. Pärmitüve stock koosneb näiteks vastavatest pärmirakkudest ja glütseroolist. Glütserool oma madala külmumistemperatuuri (−37,8 °C) ning hüdroksüülrühmade (mis omakorda võimaldavad vesiniksidemete teket) tõttu on hea ning ohutu viis pärmirakkude pikaajaliseks säilitamiseks madalal (−80 °C) temperatuuril, kuna glütserool ei võimalda vee kristallstruktuuril (jääl) tekkida ning kaitseb seeläbi mikroobe külmumise, sh jääkristallide tekitatud mehaanilise kahju eest. Stock-ist võetakse pagaripärmi puhul tüved üles tavaliselt YPD tahkel söötmel (Petri tassil), kuna see võimaldab eraldada üksikuid kolooniaid ehk üksiku raku järeltulijaid, mis tagab selle, et uuritavate rakkude seas oleksid geneetiliselt identsed rakud. Kuna pagaripärmi kahekordistusaeg optimaalsetes tingimustes (ehk YPD söötmes, 30 °C juures) on ~90 minutit (rho mutantide puhul ~2h), võib silmaga nähtavaid kolooniad näha juba 12–16 tundi pärast tassile külvamist (metsiktüüpi rakkude puhul). Tavaliselt läheb n-ö elujõuliste kolooniate tekkeks 2–3 päeva. Seejärel toimitakse tavaliselt järgnevalt: Petri tassilt valitakse välja meelepärased kolooniad, mida eraldi kolbidesse YPD vedelsöötmesse külvatakse. Vedelsöötmes on rakkude kokkupuude söötmega suurem ning õhutus efektiivsem (loksutaja tõttu), mistõttu on ka nende kasv kiirem. Kiirem kasv võimaldab toota väikse ajaga suurema rakumassi, mida rakendatakse muuhulgas nt valkude ja hormoonide tootmisel (transgeenne mikroob toodab vastavat molekuli, mis inimesele huvi pakub; kuna rakud kasvavad vedelsöötmes kiiresti, saadakse nii ka kiiremini rohkem produkti), kuid ka tagab, et vastava protseduuri läbimiseks oleks piisavalt rakke, kuna paljud katsed (nt transformatsioon) on rakkudele väga koormavad ning suur osa rakkudest selle käigus hukkub. Samuti peab olema suur rakkude hulk näiteks selleks, et piisavalt DNA-d oleks võimalik eraldada. DNA kogus omakorda on oluline, et näiteks Southern blottingu teostamisel oleks DNA signaal piisavalt tugev. YPD vedelsöötme kasutamisel tuleb mainida ka OD-d (Optical Density) ehk optilist tihedust, mis iseloomustab rakkude kogust söötmes. Eksponentsiaalses kasvufaasis olevate pärmirakkude OD on 0,3–1. Pärmirakkude OD-d mõõdetakse spektrofotomeetri abil, lainepikkuse 600 nm juures. OD on siinkohal võrdeline absorptsiooniga. OD on tähtis ka seetõttu, et eksponentsiaalses kasvufaasis olevad rakud (n-ö noored rakud) on vastuvõtlikumad muutustele, sh näiteks võõra DNA integreerumine genoomi. YPD söötmest on lugematu hulk variatsioone vastavalt vajadusele, näiteks mingit konkreetset antibiootikumi sisaldav YPD (et välja juurida söötmest võõrad rakud ning võimaldada kasvu ainult uuritavatel, resistentseteks muudetud rakkudel), mingit lisatoitainet sisaldav YPD jne. University of Tartu DSpace Repository, Rikas sööde Vaadatud 26.10.2016 The laboratory of Thomas E. Wilson, TEWLAB Yeast Media – General Description (Microsoft Word dokument) Horisont 3/2012, Pärmi paljud paled. Vaadatud 19.10.2016 The Vegan Society, Vitamin B12 : your key facts Vaadatud 05.11.2016 Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD) (PDF-fail). Vaadatud 19.10.2016 Rensselaer Polytechnic Institute, Carbohydrates – Sugars and Polysaccharides Vaadatud 19.10.2016 The National Center for Biotechnology Information, Mitochondria-mediated nuclear mutator phenotype in Saccharomyces cerevisiae 15.07.2003. Vaadatud 19.10.2016 The National Center for Biotechnology Information, Section 16.3 : Glucose Can Be Synthesized from Noncarbohydrate Precursors Vaadatud 19.10.2016 Sigma-Aldrich, Yeast Growth Protocols Vaadatud 21.10.2016 Dr. Bernard Cole's Home Page, GELATIN Vaadatud 05.11.2016 Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut, Pärmi Saccharomyces cerevisiae mitokondriaalse valgu Din7 deletsiooni mõju mitokondriaalsele DNA-le Vaadatud 26.10.2016 The National Center for Biotechnology Information, Development of a Saccharomyces cerevisiae Strain with Enhanced Resistance to Phenolic Fermentation Inhibitors in Lignocellulose Hydrolysates by Heterologous Expression of Laccase märts 2001. Vaadatud 26.10.2016 ResearchGate, Optimization of Optimization of a culture conditions for Baker’s yeast cell mass production – A preliminary study Vaadatud 26.10.2016 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 91 no. 26, Phytochrome assembly in living cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae[alaline kõdulink] (PDF-fail). Vaadatud 05.11.2016 PubChem Open Chemistry Database, Glycerol Vaadatud 29.10.2016 The BioNumbers database, BioNumber Details Page Vaadatud 19.10.2016 Nature Protocols, Southern blotting Vaadatud 26.10.2016 The National Center for Biotechnology Information, Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi 2010. Vaadatud 05.11.2016 European Association for Specialty Yeast Products, http://yeastextract.info/faq. Vaadatud 26.10.2016 J.F. Sambrook & D.W. Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (väljaanne 2 ja 3) Cold Spring Harbor Laboratory Press. OpenWetWare, McClean: Glycerol stocks (yeast) Vaadatud 26.10.2016