Reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon

Reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon ehk reaalaja PCR (RT-PCR) ehk kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (qPCR) on molekulaarbioloogiline analüüsimeetod, mis põhineb polümeraasi ahelraktsioonil (PCR). Kui PCRi puhul saab produkti analüüsida pärast kõikide tsüklite toimumist, siis qPCRi eeliseks on produkti kvantitatiivne mõõtmine iga tsükli järel. Reaalaja PCRi kasutatakse paljudes valdkondades: meditsiinis haiguste diagnoosimisel, toidumikrobioloogias, teadustöös. Teaduses kasutatakse qPCRi eelkõige geeniekspresiooni uurimiseks, aga ka mikroRNA analüüsiks, üksiku nukleotiidi polümorfismide (SNP) genotüüpimisel, koopiaarvu variatsioonide (CNV) määramiseks ja valkude analüüsiks. Rakud reguleerivad geeniekspressiooni RNA transkriptsiooni kaudu. Et teada, kui palju mingit valku rakus toodetakse ehk kui palju geen avaldub, tuleb mõõta, kui palju on rakus selle geeni RNA-transkripte. Selleks on vaja geeni transkripti paljundada ehk amplifitseerida. Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR on levinud meetod DNA amplifitseerimiseks. RNA paljundamiseks viiakse esmalt läbi pöördtranskriptsioon ning saadakse cDNA ehk komplementaarne DNA, mida saab siis PCRiga amplifitseerida. DNA amplifitseerimiseks kasutatakse soovitud DNA lõiku matriitsina, millele disainitakse kaks praimerit (5'–3' ja 3'–5' ahela jaoks). Praimeritele lisatakse desoksüribonukleotiide, mis on DNA-ahela komponendid, puhverlahus, mis loob sobiva keskkonna sünteesimiseks, ja termostabiilne DNA polümeraas (reaktsioon toimub teatud etappides kõrgel temperatuuril). Levinuim polümeraas on Taq-polümeraas. Lahusesse lisatakse ka fluorofoore sisaldavat markerainet, et hiljem oleks võimalik kindlal lainepikkusel mõõta produkti kogust. Kvantitatiivne PCR võimaldab kogust mõõta iga amplifikatsioonitsükli lõpus, kuid tavalise PCR puhul saab produkti kogust mõõta alles kogu protsessi lõpus. Siit tuleb ka nimetus reaalaja PCR. Juhul kui produkti sünteesitakse cDNA pealt, nimetatakse seda ka qRT-PCR-iks (lühend ingliskeelsest väljendist quantitative reverse transcription polymerase chain reaction). Lühend RT-PCR võib tekitada segadust, sest seda kasutatakse kahes tähenduses: pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon ja reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon. qPCRi iga tsükkel koosneb kolmest etapist ja ühe analüüsi vältel läbitakse keskmiselt 40 tsüklit. Kolm põhietappi on järgmised: Denaturatsioon – matriitsi inkubeeritakse kõrgel temperatuuril, et kaheahelaline ahel laguneks üheahelaliseks DNAks. Denatureerumistemperatuur ja inkubatsiooniaeg sõltuvad konkreetsest proovist. Kõrgeim temperatuur on tavaliselt kuni 95 °C. Inkubatsiooniaega tuleks tõsta, kui matriitsi GC-ahelate osakaal on kõrge. Praimerite sulandumine ehk annealing – praimerid seonudvad DNA-ahelale. Selleks vajalik emperatuur sõltub praimerite hübridiseerumistemperatuurist. DNA süntees ehk elongatsioon – DNA-d hakatakse sünteesima praimeritega seondunud matriitsilt. Lahusesse lisatud DNA polümeraas hakkab komplementaarsusprintsiibi alusel sünteesima matriitsile vastavat ahelat. DNA polümeraasi aktiivsus on optimaalne 70–72 °C juures, sünteesi kiirus on keskmiselt 100 aluspaari sekundis. qPCRi produktide tuvastamine reaalajas toimub fluorestsentsi abil. Ühe meetodi puhul kasutatakse mittespetsiifilist fluorestseeruvat värvi (näiteks SYBR Green), mis seondub DNA-ahelate vahele – mida rohkem kaheahelalist DNAd on lahuses, seda rohkem värvi saab sellega seonduda ning seda tugevam on signaal. Teise meetodi puhul toimub ahelale seondumine spetsiifiliselt (näiteks TaqMan-analüüsi puhul). DNA lõigu ühes otsas on reporterfluorofoor, mis fluorestseerub, ja teises otsas nn fluorestsentsi kustutaja, mis ei lase fluorestseerumist tuvastada. Kui see DNA lõik aga ahelasse seondatakse, siis eraldab DNA polümeraas fluorestsentsi kustutava molekuli ja reporterfluorofoor annab signaali. Reaalaja PCRi tulemuste analüüsiks vajalikud põhimõisted: algtase (baseline) – näitab signaali taset esimeste tsüklite ajal (enamasti kuni 15 tsüklit), kui fluorestsents on nõrk. Algtaset määratletakse ka kui taustamüra; läviväärtus (threshold) – signaalitase, mis peegeldab statistiliselt olulist fluorestsentsi tugevnemist võrreldes algtasemega, mis peab jääma PCR-i eksponentsiaalsesse faasi. Määratakse lävitsükkel (CT); lävitsükkel (threshold cycle ehk CT) – CT on tsüklite arv, mille juures reaktsiooni fluorestsents ületab läviväärtuse. CT oleneb ka algsest DNA kogusest; sulamiskurv – peegeldab fluorestsentsi muutust, kui kaheahelaline DNA koos fluorofoorimolekulidega laguneb üheahelaliseks DNA-ks (see toimub temperatuuri tõusu tagajärjel). Kui võrrelda fluorestseeruva signaali muutust temperatuuri muutusega, saab ettekujutuse lagunemise dünaamikast. Samuti annab see infot, kas tegu on puhta produktiga või on proov saastunud. Geeniekspressiooni analüüsi käigus määratakse, kui palju geenidelt transkribeeritakse funktsionaalseid produkte – RNAd või valke. Geeniekspressioonis on kolm olulist etappi: transkriptsioon ehk DNA pealt RNA sünteesimine; splaissimine ehk intronite eemaldamine ning eksonite ühendamine; translatsioon ehk valgusüntees. Geeniekspresiooni või mRNA (messenger RNA ehk informatsiooni-RNA) analüüsiks kasutatakse tihti just qPCRi. Viiakse läbi pöördtranskriptsioon ehk sünteesitakse RNA pealt cDNA. cDNA alusel tuvastatakse ekspresseeritud geeni produkt ja määratakse selle kogus. Lisaks kvantitatiivsele PCRile kasutatakse geeniekspressiooni uurimiseks DNA-mikrokiiptehnoloogiat. Vanemate meetoditega mõõdeti mRNA hulka vahetult, selleks kasutati RNA kapillaarülekannet, ribonukleaasitesti ja differential display meetodit ehk DD-PCRi. MikroRNA analüüsiks tuleb RNA isoleerida, profileerida, paljundada ja valideerida. miRNA-d on väikesed väga konserveerunud RNA molekulid, mis reguleerivad raku arengut, rakutsüklit ja takistavad rakkude kontrollimatut paljunemist. Aktiivne miRNA on üheahelaline molekul, keskmiselt 17–24 nukleotiidi pikk. Arvatakse, et rohkem kui kolmandikku geenidest reguleerivad miRNA-d. Reaalaja PCRi seadmeid ja metoodikat kasutatakse ka geenivariatsioonide analüüsiks. See tehnoloogia ei sobi kvantitatiivseteks mõõtmisteks ja genotüüpimiseks kasutatakse alleelispetsiifilisi analüüsikomplekte. Andmed kogutakse pärast kõikide tsüklite lõppu. Teadlased, kes uurivad geenide funktsioone, peavad arvestama geneetilise variatsiooniga. Geenide variandid võivad olla mitmekesised, alates üksiku nukleotiidi polümorfismist, tandeemsetest järjestustest ja väiksematest insertsioonidest või deletsioonidest koopiaarvu variatsioonideni. Varem oli geneetilisest variatsioonist vähe teada, kuid tänu geenitehnoloogia arengule on seda lihtsam uurida. Reaalaja PCRi läbiviimiseks kasutatakse erinevaid seadmeid. Igal aparaadil peab olema sensor, mis tuvastab fluorestsentsi; termotsükkel, kuna temperatuure tuleb iga etapi jooksul kiiresti muuta. Kõikidel masinatel on kaasas ka tarkvara andmete kogumiseks ja analüüsimiseks. "Real-Time PCR Research Applications & Technologies". ThermoFisher. Vaadatud 11.01.2022. Arya, Manit; Shergill, Iqbal S.; Williamson, Magali; Gommersall, Lyndon; Arya, Neehar; Patel, Hitendra R. H. "Basic principles of real-time quantitative PCR". Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2): 209–219. Neidler, Sarah. "What are the differences between PCR, RT-PCR, qPCR, and RT-qPCR?". Enzo. Vaadatud 11.01.2022. Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 3 Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 10–11 Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 6 Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 8 "MicroRNA Analysis—Start Here". ThermoFisher. Vaadatud 11.01.2022. Barnes, Michael R. "Genetic variation analysis for biomedical researchers: a primer". Methods in Molecular Biology. 2010, 628: 1–20. Thermo Fisher scientific, Real-Time PCR handbook, lk 13