Elumusanalüüs

Elumusanalüüs ehk elujõulisuse analüüs on laialt levinud laboratoorne analüüsimeetod in vitro, mis kajastab tulemustes erinevust elus ja surnud rakkude vahel . Elumuse analüüsid põhinevad elus rakkudele omasele rakumembraani selektiivsele läbilaskvusele. Rakkude hukkudes kaotab membraan terviklikkuse ning seeläbi ka selektiivsuse. Selliselt läbi membraani funktsioneerimise tuvastavad analüüsid surnud rakke. Peale membraani läbilaskvuse on võimalik hinnata raku funktsioneerimiseks ensüümide aktiivsust, raku adhesiooni, ATP produktsiooni ja koensüümide tootmist. Elumusanalüüse kasutatakse näiteks erinevate ainete toksilisuse hindamiseks või vastupidi, ainete tõhususe hindamiseks eelnevalt mürgise ainega töödeldud rakkudel (et näha leevendatud mõju). Hinnang on oluline eelkõige meditsiinis (näiteks ravimite mõju rakkudele), aga ka näiteks mitmesuguste signaal-ülekannete uurimiseks, sealhulgas geneetiliste retseptorite ja organellide funktsioonide jälgimiseks. Raku elujõulisuse analüüsimeetodid jaotuvad nelja erinevasse rühma: värvaine sissevõtmise meetodid (põhinevad rakumembraani terviklikkusel) – kasutatavad värvained on näiteks trüpaansinine, eosiin, Kongo punane ja erütrosiin B; kolorimeetrilised meetodid (põhinevad raku mitokondrite aktiivsusel, et metaboliseerida reaktiivi), näiteks tetrasoolium (MTT), Alamar-sinine, laktaadi dehüdrogenaas (LDH); fluorestsentsmeetodid, näiteks propiidium jodiid, lilla kaltsedon, sulforhodamine B; luminestsentsmeetodid – ATP-d hõlmavad analüüsid. 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT, ingl. k. (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) on kõige laialdasemalt kasutatav kolorimeetriline analüüs toksiliste mõjude uurimiseks. Sellega määratakse elus rakkude arv nende metabolismi tasemete kaudu. Ühend tetrasoolium sool redutseerub formasaaniks raku ensüümide, sealhulgas mitokondriaalse NAD(P) H sõltuvate oksüdoreduktaaside ja dehüdrogenaaside, toimel. Kollane tetrasoolium sool muutub lillaks formasaaniks ja see toimub vaid elusates rakkudes. Värvimuutus markeerib elusad rakud ning näitab protsentuaalselt nende arvu proovis. MTT formasaani akumuleerumine peegeldab mitokondrite aktiivsust, mis kaudselt näitab rakkude elujõulisust. Ühend määratakse spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 570 nm. MTT analüüsi on lihtne, kiire ja ohutu teostada ning see võimaldab katse korratavust. Oluline puudus meetodi puhul on see, et toksilisusest kahjustatud mitokondrid suudavad siiski MTT redutseerida formasaani kristallideks, nagu teevad seda terved mitokondrid. MTT formasaan on vees mittelahustuv, seetõttu tuleb enne neelduvuse mõõtmist formasaan orgaanilises lahustis lahustada . Selleks sobib näiteks dimetüülsulfoksiid (DMSO) või isopropanool. Lisaks, võib MTT analüüs anda ebatäpseid tulemusi, sest formasaan interakteerub kergesti teiste ühendite toimel ja uuritav ühend, mida rakukultuurile lisatakse, võib häirida mitokondriaalse dehüdrogenaasi aktiivsust, mis omakorda mõjutab MTT analüüsi tulemusi. Teine laialdaselt kasutatav kolorimeetriline analüüs on Alamar-sinine (AB, ingl. k. Alamar Blue), nimetatakse ka resasuriiniks. See on indikaatorvärv raku elujõulisuse ja proliferatsiooni kvantitatiivseks analüüsiks. AB on laialdaselt kasutatav reagent eukarüootsete ja prokarüootsete rakkude puhul. Ühend resasuriin tuvastab metaboolselt aktiivsed rakud redutseerivas keskkonnas (AB on redoksindikaator), muutudes punaseks kõrgelt fluorestseeruvaks ühendiks resorufiiniks. AB analüüs on kolorimeetriline ja fluorestsents-meetod. Värvimuutust ja suurenenud fluorestsentsi detekteeritakse neeldumise (570 ja 600 nm juures) või fluorestsentsi (ergastus 530–560 ja emissioon 590 nm juures) abil. AB on üks enim viidatud analüüs publikatsioonides, kus meetodit kasutatakse vähiuuringutes ja ravimite avastamises ja arendamises. Valdavalt kasutatakse AB analüüsi näiteks raku apoptoosi või toksiliste ühendite hindamisel keskkonnas. AB-l on mitmeid eeliseid teiste analüüside ees: puudub toksiline omadus rakkudele, veeslahustuv, ökoloogiline, sobilik enamjaolt kõikidele rakuliinidele, analüüs loeb nii põhjale kinnitunud rakke kui ka proovis hõljuvaid rakke, kiire analüüsi teostamine . Propiidium jodiidi (PI, ingl. k. Propidium iodide) analüüsimeetod on fluorestsentsmeetod, mida on kasutatud alates voolutsütomeetrial põhinevate meetodite kasutuselevõtust. Analüüsiga saab teha kindlaks kvantitatiivset rakkude apoptoosi, hinnates plasmamembraani terviklikkuse ja läbilaskvuse erinevust. PI värvaine jõuab surnud rakkudesse, mille membraan on kahjustatud. Elus rakkudesse värvaine ei pääse. PI-d kasutatakse selle ökonoomsuse ja stabiilsuse tõttu sagedamini, kui teisi värvaineid. Analüüsi põhimõte seisneb selles, et apoptootilisi rakke iseloomustab DNA degradatsioon fragmentideks, millega seostub rakumembraani läbinud PI, nihutades eksitatsiooni/emissiooni lainepikkuseid 493/636 nm pealt 535/617 nm peale . Lisaks voolutsütomeetrile on PI analüüsi võimalik läbi viia ka kasutades mikroplaadilugejat, mis võimaldab mõõta apoptoosi reaalajas kuni 24 h vältel . See on pikk aeg, mille mõõtmisel arvestatakse ka hilisemat rakusurma. Teiste meetodite puhul, kus raku elujõulisust hinnatakse ühel konkreetsel ajahetkel, hilist rakusurma mõõta ei saa. PI analüüs on väga kasulik meetod rakkude elujõulisuse jälgimiseks. See võimaldab analüüsida konkreetse aine reaktsiooni dünaamikat. Analüüsiga saab hinnata mitmeid parameetreid, sealhulgas viivitusaegu ja suremuse määra. Mukherjee, Pulok K. (2019), "Bioassay-Guided Isolation and Evaluation of Herbal Drugs", Quality Control and Evaluation of Herbal Drugs (inglise), Elsevier, lk 515–537, DOI:10.1016/b978-0-12-813374-3.00013-2, ISBN 978-0-12-813374-3, vaadatud 9. jaanuaril 2024 Riss, T.; Niles, Andrew.; Moravec, Rich.; Vidugiriene, Jolanta. (2004). Assay Guidance Manual (inglise). Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Aslantürk, ÖS. (2018), Larramendy, Marcelo L.; Soloneski, Sonia (toim-d), "In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays: Principles, Advantages, and Disadvantages", Genotoxicity - A Predictable Risk to Our Actual World (inglise), InTech, DOI:10.5772/intechopen.71923, ISBN 978-1-78923-418-3, vaadatud 9. jaanuaril 2024 Kamiloglu, S; Sari, G; Ozdal, T; Capanoglu, E (2020). "Guidelines for cell viability assays". Food Frontiers (inglise). 1 (3): 332–349. DOI:10.1002/fft2.44. ISSN 2643-8429. Mosmann, T. (1983). "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays". Journal of Immunological Methods (inglise). 65 (1–2): 55–63. DOI:10.1016/0022-1759(83)90303-4. Rojo, J.; Sousa-Herves, A.; Mascaraque, A. (2017), "Perspectives of Carbohydrates in Drug Discovery", Comprehensive Medicinal Chemistry III (inglise), Elsevier, lk 577–610, DOI:10.1016/b978-0-12-409547-2.12311-x, ISBN 978-0-12-803201-5, vaadatud 9. jaanuaril 2024 Noh, MY.; Koh, SH.; Kim, Y.; Kim, HY.; Cho, GW; Kim, SH. (2009). "Neuroprotective effects of donepezil through inhibition of GSK‐3 activity in amyloid‐β‐induced neuronal cell death". Journal of Neurochemistry (inglise). 108 (5): 1116–1125. DOI:10.1111/j.1471-4159.2008.05837.x. ISSN 0022-3042. Jaszczyszyn, A.; Gasiorowski, K. (2008). "Limitations of the MTT Assay in Cell Viability Testing". Advances in Clinical and Experimental Medicine (17): 525–529. "alamarBlue Assays for Cell Viability". Thermo Fisher Scientific. Vaadatud 9. jaanuaril 2024. "alamarBlue™ Cell Viability Reagent". Thermo Fisher Scientific. Vaadatud 9. jaanuaril 2024. Rampersad, SN. (2012). "Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays". Sensors (inglise). 12 (9): 12347–12360. DOI:10.3390/s120912347. ISSN 1424-8220. PMC 3478843. PMID 23112716.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link) "alamarBlue advantages". Bio-Rad. Vaadatud 9. jaanuaril 2024. Vermes, I.; Haanen, C.; Reutelingsperger, C. (2000). "Flow cytometry of apoptotic cell death". Journal of Immunological Methods (inglise). 243 (1–2): 167–190. DOI:10.1016/S0022-1759(00)00233-7. Riccardi, C.; Nicoletti, I. (2006). "Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry". Nature Protocols (inglise). 1 (3): 1458–1461. DOI:10.1038/nprot.2006.238. ISSN 1754-2189. "Propidium Iodide". Thermo Fisher Scientific. Vaadatud 9. jaanuaril 2024. "Propidium Iodide Cell Viability Flow Cytometry Protocol". R&D Systems. Vaadatud 9. jaanuaril 2024. "Propidium iodide Viability on a Plate Reader". BMG LABTECH. Vaadatud 9. jaanuaril 2024.