Fluorofoor

Fluorofoor on keemiline ühend, mis ergastamisel kiirgab valgust emissiooni teel tagasi. Fluorofoorid sisaldavad enamasti mitut aromaatset rühma või pi-sidemetega tasapinnalisi või tsüklilisi molekule. Fluorofoori kasutatakse nii üksi, vedelikes märkijana, kindlate struktuuride värvijana, ensüümides substraadina, sondina või indikaatorina (kui fluorestsentsi mõjutavad keskkonnaaspektid nagu polaarsus või ioonid). Üldiselt on fluorofoor seotud kovalentsete sidemetega makromolekuli külge, töötades afiinsetes või bioaktiivsetes reagentides (antikehad, valgud, nukleiinhapped) markerina. Eelkõige kasutatakse fluorofoore kudede, rakkude või materjalide värvimiseks mitmesuguste analüüsimeetodite tarbeks, nagu fluorestsentne pildistamine ja spektroskoopia. Fluorofoor neelab valgust kindlal lainepikkusel ja kiirgab valgust sellest pikemal lainepikkusel. Neeldumiseks vajalik lainepikkus, energia ülekande efektiivsus ja emissiooniks kuluv aeg sõltuvad nii fluorofoori struktuurist kui ka selle keemilisest keskkonnast. Põhjus seisneb ergastatud molekuli interaktsioonist ümbritsevate molekulidega. Fluorofoori kirjeldamisel kasutatakse enamasti tema maksimaalse neeldumise ja emissiooni suhet. Maksimaalne neeldumine on ligikaudselt võrdne fluorofoori ergastumisega. Sellele vaatamata võib fluorofoori kogu spekter selle omaduste kujunemisel olulist rolli mängida ning seda on oluline jälgida teadustöös. Ergastamise lainepikkuse spekter võib olla nii väga kitsas kui ka laiem vahemik, samuti võib see jääda väljapoole lõikesageduse tasandit. Emissiooni spekter on tavaliselt teravam kui ergastamise spekter ning see leiab aset kõrgemal lainepikkusel ja vastavalt madalama energia juures. Ergastumisenergia ulatub ultravioletkiirgusest kuni nähtava valguseni ning emissiooni energia võib ulatuda nähtavast valgusest kuni infrapunapiirkonnani. Fluorofoori peamised omadused: maksimaalne ergastamiseks ja emissiooniks vajalik lainepikkus (neid väljendatakse nanomeetrites (nm)): vastab ergastamisel tekkinud piigile ja emissioonil spektrile (tavaliselt kummalgi üks piik), ekstinktsioonikoefitsient (või molaarne imendumine, ühik mol−1*cm−1): seob neeldunud valguse hulga antud lainepikkusel fluorofoori kontsentratsiooniga lahuses, kvantsaagis: vahetunud energia efektiivsus langeva valguse fluorestsentsi emiteerumiseni (võrdne eralduvate footonite ja imendunud footonite suhtega), eluiga (ühik pikosekund): fluorofoori ergastunud oleku kestus kuni selle tavaoleku taastumiseni. See tähendab aega, mis kulub ergastunud fluorofoonide arvu alanemisele 1/e (ligikaudu 0,368) algsummast, stokes nihe: maksimaalse ergastumise ja maksimaalse emissiooni lainepikkuste vahe. Nendest näitajatest sõltuvad ka fluorofoori teised omadused, sealhulgas fotoresistentsus (pideva valgusega ergastamise tõttu kaotatud fluorestsentsi hulk). Arvesse tuleb võtta ka teisi parameetreid nagu fluorofoori molekuli polaarsus, selle suurus ja kuju (st fluorofoori polariseerimise muster). Samuti võivad fluorofoori käitumist mõjutada paljud muud tegurid. Fluorofoore saab kasutada ka fluorestsentsi summutamiseks muudest fluorestsentsvärvidest või vahendada fluorestsentsi isegi suurematel lainepikkustel. Enamik fluorofoore on väiksed orgaanilised molekulid, mis koosnevad 20–100 aatomist (200–1000 daltonit, molekulmass võib olla ka suurem sõltuvalt poogitud modifikatsioonidest ja konjugeeritud molekulidest), kuid on ka palju suuremaid looduslikke fluorofoore, mis kuuluvad valkude klassi. Fluorestsentsi osakesi ei loeta fluorofooride alla (quantum dot: 2–10 nm läbimõõduga, 100...100 000 aatomit). Fluorofoori suurus võib steeriliselt takistada seotud molekuli ning mõjutada selle polaarsust. Fluorofoori molekule võib kasutada nii iseseisvalt kui ka fluorestseeruva osana juba funktsioneerivas süsteemis. Tuginedes molekulide keerukusele ja sünteetilistele meetoditele võib fluorofoori molekulid üldiselt jaotada nelja kategooriasse: valgud ja peptiidid, väiksed orgaanilised ühendid, sünteetilised oligomeerid ja polümeerid ning mitmekomponendilised süsteemid. Kindlatele valkudele saab kinnitada teisi fluorestseeruvaid valke nagu GFP (roheline), YFP (kollane) ja RFP (punane), et moodustada liitvalk. Süntees viiakse läbi rakus pärast sobiva plasmiidi kandja transfektsiooni. Mittevalguliste orgaaniliste fluorofooride hulka kuuluvad järgmised suuremad grupid: xanteeni derivaadid: fluorestsiinisotsüaniid, Oregoni roheline, eosiin ja Texase punane; tsüaniini derivaadid: tsüaniin, indokarboniin, oksakarbotsüaniin, tiakarbotsüaniin ja merotsüaniin; naftaleeni derivaadid: dansüül- ja prodaanderivaadid; kumariini derivaadid; oksadiasooli derivaadid: püriidüüloksasool, nitrobensoksadiasool ja bensoksadiasool; antratseenõli derivaadid; püreeni derivaadid: kaskaadi sinine jne; oksasiini derivaadid: Niiluse punane, Niiluse sinine, kresüülvioletne, oksasiin 170 jne; akridiini derivaadid: proflaviin, akridiinoranž, akradiinkollane jne; arüülmetüün derivaadid: auramiin, kristallvioletne, malahhiitroheline; tetrapürrooli derivaadid: porfiin, ftalotsüaniinühendid, bilirubiin. Need fluorofoorid fluorestseeruvad tänu delokaliseerutud elektronidele, mis saavad hüpata üle keemilise sideme ja stabiliseerida neeldunud energia. Benseen on üks lihtsamaid aromaatsete süsinikuühendite esindajatest, seda ergastatakse 254 nanomeetri juures ja see emiteerib valgust 300 nanomeetri juures. See eraldab fluorofoorid fluorestsentsi pooljuhtivatest nanoosakestest. Neid osakesi saab liita proteiinide konkreetsetele funktsionaalgruppidele, näiteks aminorühmadele (nagu aktiivsetele estritele, karboksülaatidele, isotiotsüanaat hüdrasiinidele), karboksüülrühmadele (karboamiididele), tioolidele (maleimiidele, atsetüül bormiidele), asiididele. Lisaks võivad paljud erinevad funktsionaalgrupid esineda selleks, et muuta aine omadusi (näiteks lahustuvust) või anda ainele eriomadusi (näiteks boorhape, mis seondab suhkruid või mitut karboksüülrühma, et siduda teatud katioone). Kui värvaine sisaldab elektron-donoorseid ja elektron-aktseptoorseid gruppe aromaatsete süsteemide vastasotstes, siis värvi tundlikkus keskkonna polaarsuse suhtes kasvab. Seetõttu loetakse neid keskkonna suhtes tundlikeks. Värve kasutatakse sageli laetud molekulidele läbimatute rakkude sees, mille tulemusena käesolev karboksüülrühm muundatakse estriks. See omakorda eemaldatakse rakusisese esterdamise käigus. Järgnevad värvide perekonnad on moodustatud kaubamärkide järgi ega ole struktuuriliselt sarnased. CF värv (Biotium), DRAQ ja CyTRAK sondid (BioStatus), BODIPY (Invitrogen), Alexa Fluor (Invitrogen), DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce), Atto ja Tracy (Sigma Aldrich), FluoProbes (Interchim), Abberior värvid (Abberior), DY ja MegaStroke värvid (Dyomics), Sulfo Cy värvid (Cyandye), HiLyte Fluor (AnaSpec), Seta, SeTau ja Square värvid (SETA BioMedicals), Quasar ja Cal Fluor värvid (Biosearch Techologies), SureLight värvid (Columbia Biosciences), APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen). Fluorofoorid mängivad tähtsat rolli biokeemia valdkonnas ja valgu-uuringutes, näiteks immunofluorestsentsis, aga ka rakkude analüüsis. Fluorofoore kasutatakse ka väljaspool loodusteadust. Fluorestseeruvad värvid leiavad lisaks laia kasutust tööstuses neoonvärvidena, näiteks mitmete tonnide viisi kasutatakse fluorestseeruvaid värve tekstiili värvimisel ja optiliste valgendajatena pesupesemisvahendites, kosmeetikas, turvaseadmetes ja riidetööstuses, orgaanilistes valgusdioodides, kujutavas kunstis ja disainis (plakatid ja maalid), eksperimentaalsetes ravimites, päikesepaneelides, et koguda rohkem valgust/lainepikkusi. Rietdorf, J. (2005). Microscopic Techniques. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology. Berlin: Springer. pp. 246–9. ISBN 3-540-23698-8. Tsien, R.Y.; Waggoner, A. (1995). "Fluorophores for confocal microscopy". In Pawley JB.Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press. pp. 267–74.ISBN 0-306-44826-2. Lakowicz, J.R. (2006). Principles of fluorescence spectroscopy (3rd ed.). Springer. p. 954.ISBN 978-0-387-31278-1. Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013). Fluorophores and Their Applications as Molecular Probes in Living Cells, Curr. Org. Chem., 17: 564–579, doi:10.2174/1385272811317060003 Taki, M. (2013). Chapter 5. Imaging and sensing of cadmium in cells. In Astrid Sigel; Helmut Sigel; Roland K. O. Sigel. Cadmium: From Toxicology to Essentiality. Metal Ions in Life Sciences. 11. Springer. p. 99115. 10.1007/978-94-007-5179-8_5.