Degron

Degron on spetsiifiline aminohapete järjestus valgus, mis on valgu lagundamise alguspunktiks. Degronjärjestus võib olla nii N- kui ka C-terminaalses otsas, seega on olemas vastavalt eraldi nii N-degronid kui C-degronid. Lisaks indutseeritakse valkude lagundamist erinevalt, kas temperatuurimuutusega kasvukeskkonnas või degradeerimist indutseeriva aine lisamisega kasvukeskkonda. Degron on nimetuse saanud degradeerimise ehk lagundamise järgi. Degron on heaks viisiks valkude uurimisel, kuna antud juhul ei ole valgu geen rakust täielikult eemaldatud. Selle asemel saab valgu kogust vastavalt soovile rakus kiiresti vähendada ning seejärel keskkonnatingimuste optimeerimisel valgu kogus rakus uuesti normaalsele tasemele viia. Nii saab hoiduda kõrvalmõjudest, mis võivad tekkida terve geeni eemaldamisel genoomist: kui sihtmärkgeen kodeerib elutähtsat valku, siis ei ole eemaldatud geeniga rakud eluvõimelised. Erinevalt RNA interferentsist, kus on võimalik väline mõjutamine, mida põhjustab aeglane mRNA eemaldamine, ning mittetäielik valgu vaigistamine, on degron hea võimalus valkusid uurida, kuna valku saab kiiresti ning vastavalt soovile rakus kas toota või lagundada. Kui vaadelda RNA interferentsi järel moodustunud rakkude kolooniaid ning pärast degronit moodustunud kolooniaid, siis rakkude võimel kolooniaid moodustada erinevusi ei ole. Siiski ilmnevad fenotüübi uurimisel vedelkultuuris olulised erinevused. Geeni transkriptsiooni allasurumine põhjustab kiire sihtmärkgeenilt transkribeeritud mRNA koguse vähenemise rakus, kuid valgu eemaldamine rakust on palju astmelisem. See põhjustab defekte rakutsükli faasis G2 või mitoosis. Alternatiivseks variandiks degronile ja RNA interferentsile on valgu seostumine rapamütsiini või steroidhormoonidega, kuid selle meetodiga saab uurida vaid kindlaid valke, näiteks tuumas asuvaid ja makromolekulaarsetes interaktsioonides osalevaid valke. Degron sisestatakse sihtmärkgeeni kromosomaalsesse lookusesse, integreerides sinna varem polümeraasi ahelreaktsiooniga (PCR) amplifitseeritud DNA-kasseti. Seda DNA-kassetti kasutatakse rakkude transformeerimiseks. Õigesse kohta integreerumiseks valitakse polümeraasi ahelreaktsiooni jaoks oligonukleotiidid nii, et DNA-kasseti otste järjestused oleksid identsed sihtmärkgeeni kromosomaalse lookuse järjestustele. DNA-kassetis on 3 komponenti: kanMX geen, millele järgneb CUP1 promootor ning degron ise. Geen kanMX on selektiivseks markeriks, kuna see tagab resistentsuse antibiootikum G418-le. CUP1 promootorit kasutatakse degroni ekspresseerimiseks, kuna DNA-kasseti integreerimine sihtmärkgeeni häirib geenisisese promootori töötamist. CUP1 promootor vajab töötamiseks CuSO4 olemasolu kasvukeskkonnas, seega tuleb valgu lagundamise indutseerimiseks lisada rakkude kasvukeskkonda ka CuSO4. Degroni kasseti võib integreerida nii haploidsesse kui diploidsesse rakuliini. Kiireim viis saada soovitud tulemust on degroni sisestamine haploidsesse rakuliini. Sellises rakuliinis on GAL1, 10 promootori kontrolli all ainult 1 koopia UBR1 geeni. Teiseks viisiks on sisestada degroni kassett diploidsesse rakuliini. Nii on rakus ühte sihtmärkgeeni koopiasse integreerunud degron ning teine koopia geenist on metsiktüüpi. Nii on rakus pärast degroniga valgu degradeerimist olemas ka funktsioneeriv valk. Selle meetodi läbiviimiseks kasutatakse rakuliine, milles GAL1, 10 promootor kontrollib vaid 1 koopia UBR1 geeni ekspresseerumist. Teise koopia promootoriks on endogeenne promootor. Pärast transformeerimist eraldatakse kolooniad, milles on toimunud transformatsioon. Diploidsetest rakkudest saadakse sporuleerumise teel tetraadid, mida analüüsitakse. Tetraadide analüüsimise teel saadakse haploidne rakuliin, mis ekspresseerib GAL-UBR1 ning millel on sihtmärkvalgule lisatud degronjärjestus. Temperatuuriga indutseeritava valkude degradeerimise süsteemi korral on degroni kassetiga märgistatud valk tundlik temperatuurimuutusele. Antud kassett asub avatud lugemisraami alguses. Valk degradeerub, kui rakkude kasvukeskkonnas viia temperatuur 24 °C pealt 37 °C-ni. Degron algab ubikvitiini molekuliga, mis kiiresti pärast translatsiooni eemaldatakse. Temperatuuritundlik degron on N-reegli põhine: N-terminaalne aminohappejääk destabiliseeritakse ning see vähendab in vivo oluliselt valgu poolestusaega. Temperatuuritundliku degroni korral on degron ubikvitiinist, arginiinist ja DHFR-ist (dihüdrofolaatreduktaasist) integreerunud valk. Dihüdrofolaatreduktaas on hiirest eraldatud ensüüm, mis on vajalik aminohappe tümiini sünteesiks. Seda ensüümi on leitud ka teistest imetajatest ning bakteritest. See ensüüm on ebastabiilne: kõrgemal temperatuuril kui 37 °C valgu kokku pakitud struktuur avaneb veidi ning paljastuvad sisemised lüsiinijäägid. Neil lüsiinijääkidel toimub polüubikvitiniseerumine. Proteolüüs on kiire ning tõhus, valk lagundatakse proteosoomis. Degronit on võimalik sisestada nii uuritava valgu geeni kui ka üle kanda plasmiidile. N-degroni näitel paljastub arginiini jääk, mis asub N-terminuses. Sellele seondub Ubr1, mis on seotud ubikvitiini konjugeeriva ensüümiga. Ubr1-l on potentsiaal indutseerida valgu pinnale jäävate lüsiinijääkide ubikvitiiniga seondumist ning seeläbi valgu lagunemist. Tegelikult on selleks vaja aga temperatuurimuutust või indutseeriva aine olemasolu, näiteks dihüdrofolaatreduktaasi. Auksiinist sõltuv degron aitab in vivo uurida valkude funktsiooni ning reguleerida geeniekspressiooni. Auksiinid on taimehormoonide perekond, mis kontrollib geeniekspressiooni taime kasvu ning arengu ajal. Auksiini perekonna hormoonid, nagu näiteks indool-3-atsetaat hape, soodustavad ubikvitiini ligaasi interaktsiooni, ning seeläbi lagundatakse valk auksiinist sõltuva degradatsioonisüsteemi kaudu. Auksiin seondub F-box transpordi inhibiitorile reageeriva valguga ning aitab kaasa E3 ubikvitiini ligaasi SCF-TIR1 ja auksiini transkriptsiooni repressori interaktsioonile. SCR-TIR1 paneb tööle E2 ubikvitiini konjugeeriva ensüümi, mis seejärel polüubikvitineerib auksiini. See protsess viib valgu kiirele degradatsioonile proteosoomis. Kõikidel eukarüootidel on palju SCF eri vorme, kuid TIR1 ja auksiini on leitud ainult taimerakkudes. Auksiinist sõltuv degroni rada on üle võetud taimerakkudest. Selle süsteemi abil saab vastavalt vajadusele valku inaktiveerida või seda rakust kustutada. Auksiinitundliku degroni meetod annab võimaluse kiirelt, 30 minuti jooksul, valgu kogust rakus vähendada, kui keskkonda lisada auksiini. See reaktsioon on pöörduv ning seda saab reguleerida. Sellist valkude funktsiooni uurimist saab kasutada enamikus eukarüootides, välja arvatud taimedes. Nii auksiini indutseeritava kui ka temperatuuritundliku degroni puuduseks on see, et endogeenseid valke pole võimalik uurida antud geeni manipuleerimata. Temperatuuritundliku degroni puuduseks on ka see, et selle meetodiga pole võimalik uurida protsesse, mis ei toimu 37 °C juures või sellest kõrgemal temperatuuril. Auksiinitundliku degroni puuduseks on asjaolu, et valkude lagundamise algatamiseks on vaja keskkonda lisada auksiini, pole võimalik degradatsiooni indutseerimine lihtsalt rakukultuuri ühest keskkonnast teise viimisega. Auksiini indutseeritava degroni suureks eeliseks on rakukultuuride säilitamine konstantsel temperatuuril. Kasutades auksiini indutseeritavat degronit, on võimalik uurida protsesse, mis ei toimu 37 °C juures, näiteks meioosi. Lisaks sellele on võimalik vältida rakkude stressi, mis tekib temperatuurimuutusel. Temperatuuritundliku degroni eeliseks on lihtne süsteem valkude degradeerimise indutseerimiseks: rakukultuur tuleb lihtsalt viia teise kasvukeskkonda, lisamata kasvukeskkonda ühtki ainet. Eestis tegeldakse degrontüvede konstrueerimise ning sel meetodil valkude uurimisega Tartu Ülikooli molekulaar- ja rakubioloogia instituudis molekulaarbioloogia õppetoolis. Kanemaki M., Sanchez-Diaz A., Gambus A. and Labib K. Functional proteomic identification of DNA replication proteins by induced proteolysis in vivo. Nature (2003) 423: p.720-724. A. Sanchez-Diaz, M. Kanemaki, V. Marchesi, K. Labib, Rapid depletion of budding yeast proteins by fusion to a heat-inducible degron. Sci. STKE (2004) pl8: p.1-20. "CUP1 geeni tutvustus". Originaali arhiivikoopia seisuga 26. august 2021. Vaadatud 10. oktoobril 2014. Dohmen, R.J., P. Wu, and A. Varshavsky, Heat-inducible degron: a method for constructing temperature-sensitive mutants. Science, 1994. 263(5151): p. 1273-1276. Nishimura K., Fukagawa T., Takisawa H., Kakimoto T. Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods, 2009. 6(12): p. 917-923.