Mitokondriaalsed nukleoidid

Mitokondriaalsed nukleoidid on DNA-valk kompleksid, mis esinevad mitokondrites. Mitokondriaalne DNA (mtDNA) sarnaselt tuuma DNA-ga ei esine paljalt, vaid on pakitud valkude abil. Kompleksi nimetus "nukleoid" tuleneb mitokondrite bakteriaalsest päritolust: bakteri kromosoomi nimetatakse samuti nukleoidiks ning endosümbiootilisest hüpoteesist lähtudes on alust arvata, et mtDNA on pigem sellega sarnaselt organiseeritud erinevalt eukarüootide tuuma DNA-st. Pagaripärm Saccharomyces cerevisiae oli esimene organism, kus kirjeldati mitokondriaalseid nukleoide ning selles organismis on need kõige paremini uuritud. Pärmi mitokondriaalsed nukleoidid on globulaarsed, keskmiselt 0,3 μm läbimõõduga. Põhiline valk, mis esineb nukleoidides on Abf2p, mis seondub mtDNA-ga ning osaleb selle pakkimises. Nukleoidide moodustamises osaleb samuti üheahelalise DNA-ga seonduv valk Rim1p ning valgud Ilv5 ja Aco1. Ilv5 on ensüüm, mis osaleb hargnenud ahelaga aminohapete sünteesis ning Aco1 on TCA tsükli ensüüm akonitaas. Seoses nende valkude metaboolsete funktsioonidega oleneb vastavate geenide ekspression raku metaboolsest seisundist ehk sellest, millist substraati saab rakk kasutada energia saamiseks. Sellest lähtuvalt on välja pakutud mudel, mille järgi pärmis on mitokondriaalsed nukleoidid ümber korraldatud vastavalt metaboolsele seisundile. Ka mõned teised metaboolse funktsiooniga valgud on leitud pagaripärmi nukleoididest. Aeroobsete rakkude puhul on ühes nukleoidis keskmiselt 1–2 mtDNA koopiat, anaeroobsete rakkude puhul keskmiselt 20 koopiat. Imetajatest on mitokondriaalsed nukleoidid kõige paremini kirjeldatud inimeses. Samuti on nukleoidid leitud roti, rohepärdiku ja potoroo maksarakkude mitokondritest. Imetajate mtDNA paiknemine diskreetsete üksustena oli esmakordselt näidatud 1991. aastal inimrakkude mtDNA värvimisel DAPI-ga ning see oli hiljem kinnitatud ka immunofluorestsentsi katsetes, kus kasutati anti-DNA antikehi. mtDNA kompleksid valkudega olid imetajates kirjeldatud siis, kui näidati mtDNA seondumist DNA helikaasiga Twinkle inimrakkudes. Seejärel demonstreeriti mitme uuringu käigus ka teiste valkude esinemine mtDNA-ga, peaaegu alati esinesid koos mtDNA-ga mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A (TFAM, ingl. mitochondrial transcription factor A), pagaripärmi Apf2p valgu homoloog, ning mitokondriaalne üheahelalise DNA-ga seonduv valk mtSSB (ingl. mitochondrial single strand binding protein), mis on pagaripärmi Rim1p homoloog. TFAM on seejuures valk, mille põhiline funktsioon seisneb mtDNA pakkimises, sarnaselt histoonidele tuumas, mida tõestab asjaolu, et TFAM esineb rakkudes koos mtDNA üksustega. Sama asjaolu kehtib ka mtSSB puhul, kuid see on mtDNA-ga nõrgemini seotud. Imetajate nukleoidid on üsna väikese diameetriga, keskmiselt vaid 0,068 μm, ning sisaldavad 1–2 mtDNA genoomi koopiat. Nukleoidide arv raku kohta varieerub sõltuvalt koetüübist ning rakuliinist. Kompleksid on valkude abil seotud mitokondrite sisemembraaniga, kusjuures on leitud, et saab eristada vähemalt 2 nukleoidide populatsiooni. Esimene populatsioon on membraaniga tugevamini seotud ning nendes nukleoidides esinevad Twinkle, mtSSB ja mitokondriaalne DNA polümeraas gamma, selle populatsiooni nukleoidid läbivad replikatsiooni. Teine populatsioon on membraaniga nõrgemini seotud, need nukleoidid tõenäoliselt osalevad muudes protsessides ning ei sisalda replikatsiooniks vajalikke valke. On teada, et nukleoidid on seotud membraaniga Twinkle kaudu, kuid ka selle puudumisel jäävad nukleoidid membraaniga seotuks. Seega ilmselt on olemas ka teised valgud, mille kaudu saavad nukleoidid membraaniga seonduda. Nukleoidid on dünaamilised struktuurid, mis tähendab, et need on võimelised liikuma, kui mitokondrid venivad ning saavad liikuda ka ühest mitokondrist teise, kui mitokondrid jagunevad või sulanduvad kokku. Mitmed valgud seonduvad mtDNAga vaid ajutiselt või ainult osade nukleoididega. Kuigi need valgud võivad olla mtDNA metabolismi jaoks vajalikud, pole siiski selge, kas pidada neid nukleoidi valkudeks või mitte. Seetõttu on nukleoidi valgulist koostist raske üheselt määrata ning kasutusele on võetud laiem mõiste mtNAP (ingl mitochondrial nucleoid associated protein). Samas puudub ka mtNAP-ide täielik nimekiri, kuna erinevates katsetes saadud tulemused varieeruvad sõltuvalt katsetingimustest, metoodikast ning rakuliinidest. Mitokondriaalsete nukleoidide uurimiseks kasutatakse erinevaid rakuliine. Väga levinud on inimese ja hiire rakukultuurid, kuid kasutatakse ka primaatide ja lindude rakke. Kasutusel on nii surematud rakuliinid kui ka doonoritelt saadud rakud. Katsete läbiviimiseks kasutatakse erinevaid biokeemilisi ja molekulaarbioloogilisi meetodeid. Mitokondriaalsete nukleoidide uurimine on oluline eelkõige seetõttu, et mtDNA ja ka nukleoidide valkude mutatsioonidega on seotud mitmed inimese haigused. Näiteks mutatsioonid helikaas Twinkle kodeerivas geenis põhjustavad progresseeruvat välist oftalmopleegiat, mille põhiline sümptom on silmi liigutavate lihaste halvatus. Mitmed teised haigused on seotud mitokondrite või mtDNA kahjustustega. Seega on väga oluline aru saada, millised valgud osalevad mtDNA pakkimises ja stabiliseerimises, mis on nende täpsemad funktsioonid ning kas neid on võimalik kasutada märklaudadena haiguste ravil. Mitokondriaalsed nukleoidid on leitud ka teistest organismidest. Lisaks pagaripärmile esinevad need ka teistes pärmseentes, näiteks Yarrowia lipolytica, Candida albicans ja Candida parapsilosis. Samuti esinevad mitokondriaalsed nukleoidid protistides Physarum polycephalum ja Crithidia fasciculate. Nukleoidid on leitud ka kannuskonna Xenopus laevis ootsüütide mitokondritest. Nendes esinevad sarnaselt imetajatele transkriptsioonifaktor A (kannuskonna homoloog mtTFA) ning mtSSB, aga ka muud valgud, nagu näiteks prohibitiin 2, ANT1 (ingl. adenine nucleotide translokator 1) ja PDC-E2 (ingl. pyruvate dehydrogenase E2 subunit). Hensen, F., Cansiz, S., Gerhold, J.M., and Spelbrink, J.N. (2014). To be or not to be a nucleoid protein: A comparison of mass-spectrometry based approaches in the identification of potential mtDNA-nucleoid associated proteins. Biochimie 100: 219–226. Spelbrink, J.N. (2010). Functional organization of mammalian mitochondrial DNA in nucleoids: History, recent developments, and future challenges. IUBMB Life 62(1): 19–32. Chen, X.J., and Butow, R.A. (2005). The organization and inheritance of the mitochondrial genome. Nature Reviews Genetics 6: 815–825. Kaufman, B.A., Newman, S.M., Hallberg, R.L., Slaughter, C.A., Perlman, P.S., and Butow, R.A. (2000). In organello formaldehyde crosslinking of proteins to mtDNA: identification of bifunctional proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences 97: 7772–7777. Petersen, J.G.L., and Holmberg, S. (1986). The ILVS gene of Saccharomyces cerevisiae is highly expressed. Nucleic Acids Research 14: 9631–9651. He, J., Mao, C.-C., Reyes, A., Sembongi, H., Di Re, M., Granycome, C., Clippingdale, A.B., Fearnley, I.M., Harbour, M., Robinson, A.J., et al. (2007). The AAA + protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. The Journal of Cell Biology 176: 141–146. Kukat, C., Wurm, C.A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N.-G., and Jakobs, S. (2011). Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 108: 13534–13539. Satoh M., Kuroiwa T. (1991). Organization of multiple nucleoids and DNA molecules in mitochondria of a human cell. Exp Cell Res. 196(1): 137–40. Iborra, F.J., Kimura, H., and Cook, P.R. (2004). The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biology 2: 9. Legros, F., Malka, F., Frachon, P., Lombes, A., and Rojo, M. (2004). Organization and dynamics of human mitochondrial DNA. Journal of Cell Science 117: 2653–2662. Spelbrink, J. N., Li, F. Y., Tiranti, V., Nikali, K., Yuan, Q. P., Tariq, M., Wanrooij, S., Garrido, N., Comi, G., Morandi, L., Santoro, L., Toscano, A., Fabirzi, G. M., Somer, H., Croxen, R., Beeson, D., Poulton, J., Suomalainen, A., Jacobs, H. T., Zeviani, M., Larsson, C. (2001). Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics 28: 223–231. Garrido, N., Griparic, L., Jokitalo, E., Wartiovaara, J., van der Bliek, A.M., and Spelbrink, J.N. (2003). Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell 14: 1583–1596. Wang, Y., and Bogenhagen, D.F. (2006). Human Mitochondrial DNA Nucleoids Are Linked to Protein Folding Machinery and Metabolic Enzymes at the Mitochondrial Inner Membrane. Journal of Biological Chemistry 281: 25791–25802. Rajala, N., Gerhold, J.M., Martinsson, P., Klymov, A., and Spelbrink, J.N. (2014). Replication factors transiently associate with mtDNA at the mitochondrial inner membrane to facilitate replication. Nucleic Acids Research 42: 952–967. Reyes, A., Yang, M. Y., Bowmaker, M. & Holt, I. J. (2005). Bidirectional Replication Initiates at Sites Throughout the Mitochondrial Genome of Birds. Journal of Biological Chemistry 280: 3242–3250. Vafai, S.B., and Mootha, V.K. (2012). Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature 491: 374–383 Bakkaiova, J., Arata, K., Matsunobu, M., Ono, B., Aoki, T., Lajdova, D., Nebohacova, M., Nosek, J., Miyakawa, I., and Tomaska, L. (2014). The Strictly Aerobic Yeast Yarrowia lipolytica Tolerates Loss of a Mitochondrial DNA-Packaging Protein. Eukaryotic Cell 13: 1143–1157. Ito-Kuwa S, Aoki S, Watanabe T, Ehara T, Osafune T. (1988). Fluorescence microscopic studies on mitochondria and mitochondrial nucleoids in a wild-type strain and respiratory mutants of Candida albicans. J Med Vet Mycol. 26(4): 207–17. Miyakawa, I., Okamuro, A., Kinsky, S., Visacka, K., Tomaska, L., and Nosek, J. (2009). Mitochondrial nucleoids from the yeast Candida parapsilosis: expansion of the repertoire of proteins associated with mitochondrial DNA. Microbiology 155: 1558–1568. Sasaki, N., Kuroiwa, H., Nishitani, C., Takano, H., Higashiyama, T., Kobayashi, T., Shirai, Y., Sakai, A., Kawano, S., and Murakami-Murofushi, K. (2003). Glom is a novel mitochondrial DNA packaging protein in Physarum polycephalum and causes intense chromatin condensation without suppressing DNA functions. Molecular Biology of the Cell 14: 4758–4769. Xu, C., and Ray, D.S. (1993). Isolation of proteins associated with kinetoplast DNA networks in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences 90: 1786–1789. Barat M, Rickwood D, Dufresne C, Mounolou JC. (1985). Characterization of DNA-protein complexes from the mitochondria of Xenopus laevis oocytes. Exp Cell Res. 157(1): 207–217. Bogenhagen, D.F., Wang, Y., Shen, E.L., and Kobayashi, R. (2003). Protein Components of Mitochondrial DNA Nucleoids in Higher Eukaryotes. Molecular & Cellular Proteomics 2: 1205–1216.