Fluorestsentsspektroskoopia

Fluorestsents-spektroskoopia on optilise spektroskoopia haru, mis tegeleb ainete fluorestsentsi uurimisega. Fluorestsents on fotoluminestsentsi nähtus, mille puhul ainet ergastatakse UV-kiirguse või nähtava valgusega ja mille tagajärjel hakkab aine kiirgama üldjuhul juba pikema lainepikkusega valgust. Kui tekkinud kiirguse järelhelendus peaks kestma nii kaua, et see on silmaga märgatav, siis on tegemist juba fosforestsentsiga. Seadet, millega fluorestsentsi mõõdetakse, nimetatakse fluorimeetriks. Molekulidel on erinevate energiatega olekud, mida kutsutakse energiatasemeteks. Antud juhul on olulised elektronolekud, millega kaasneb hulk võnkeseisundeid, mille võnkeenergiad on väikesed võrreldes elektronoleku energiaga ja paiknevad seega energiaskaalal tihedalt. Energiatasemeid aitab mõista ja visualiseerida Jablonski diagramm. Normaalolekus paiknevad elektronid põhielektronseisundi madalaimal võnkenivool. Molekuli ergastatakse optiliselt põhiolekust mõnele ergastatud elektronseisundi võnkenivoole. Ergastamisel neeldub aines footon ja täpselt selle footoni energia võrra liigub molekul energiatasemete skeemil kõrgemale. Ergastatud olek ei ole molekuli jaoks stabiilne ja kokkupõrgetel teiste molekulidega kaotab ta energiat (see protsess toimub väga kiiresti umbes pikosekundi jooksul ja seda nimetatakse termalisatsiooniks) ning langeb antud elektronseisundi madalaima energiaga võnkenivoole. Järgmisena langeb molekul tagasi elektroni põhioleku mõnele võnkenivoole, mille käigus kiiratakse footon. Kuna võnkenivood paiknevad tihedalt ja molekuli sattumine ühele neist on juhuslik, siis kiiratavate footonite energiad ja ka lainepikkused on teatud määral erinevad. Sellest tulenevalt on võimalik määrata erinevate võnkenivoode struktuure. Fluorestsentsi käigus kiiratud footon on reeglina väiksema energiaga kui ergastamiseks kasutatud footon. Seetõttu on ainest kiiratud valgus reeglina punasem, st pikema lainepikkusega kui tema ergastamiseks kasutatud valguskiirgus. Seda reeglit nimetatakse Stokesi seaduseks ja nende lainepikkuste erinevust nimetatakse Stokesi nihkeks. On ka võimalik n-ö anti-Stokesi olukord, kus neeldunud valguse lainepikkus on suurem kui kiiratud valguse oma, kuid see kuulub mittelineaarse optika valdkonda, kus tegeletakse suurte kiiritustihedustega. Kasutatakse kahte tüüpi seadmeid: filterfluorimeetrites kasutatakse valgusfiltreid, et eristada ergastamiseks kasutatud valgust ja fluorestseerunud kiirgust; spektrofluorimeetrites kasutatakse difraktsioonivõredega monokromaatoreid, et eristada ergastamiseks kasutatud valgust ja fluorestseerunud kiirgust. Mõlemat tüüpi seadmed kasutavad järgmist skeemi. Valgusallikalt pärinev valgus suunatakse läbi filtri või monokromaatori uuritavale ainele. Osa pealelangenud valgusest neeldub ja mingi hulk molekule kiirgab fluorestsentkiirgust. Sellel kiirgusel ei ole eelissuunda, st see võib olla kiiratud ükskõik millisesse suunda. Osa tekkinud kiirgusest läheb läbi järgmise filtri või monokromaatori, mille taga on fluorestsentsi registreeriv detektor. Viimane on ainele pealelangeva valgusega üldjuhul 90° nurga all, et vedelike uurimisel vältida ergastava valguse sattumist detektorisse, lisaks on nii tehniliselt lihtsam. Kuna ergastatav valgus on üldjuhul intensiivne ja detektor väga tundlik, siis on eelnev vajalik detektori töökorras hoidmiseks. Kasutatud on ka läätsi ja peegleid ning erinevatel fluorimeetritel võib esineda mitmesuguseid modifikatsioone. Kasutust leiavad erinevaid valgusallikaid, sealhulgas laserid, LEDid, ksenoon- ja elavhõbelambid. Ergastava valgusena kasutatakse sellist kiirgust, mis neeldub tugevalt uuritavas aines. Seda on lihtne leida neeldumisspektrist. Laserid kiirgavad väga monokromaatset valgust, mistõttu pole vajadust ergastavat valgust enne ainega interakteerumist läbi filtri või monokromaatori lasta. Laserite kasutamise puuduseks on aga asjaolu, et neilt pärineva valguse lainepikkust ei saa muuta. Seevastu ksenoonlambi spekter on pidev ja temalt pärineva valguse intensiivsus püsib enam-vähem konstantsena lainepikkuste vahemikus 300–800 nm. Valgusfiltreid on erinevat tüüpi, kuid põhimõte on neil sama – teatud lainepikkusega valgus neelatakse (mitte alati täielikult), muu lastakse läbi. Monokromaatorisse sisenenud valgusest jäetakse difraktsioonivõrede abil alles ainult teatud lainepikkusega valgus. Läbiva valguse lainepikkust saab muuta, kuid tuleb arvestada, et tegelikult laseb monokromaator läbi mingit kitsast lainepikkuste vahemikku ja lisaks sellele ka mingil määral parasiitvalgust, mis on soovitust erineva lainepikkusega. Detektorid on kas ühe- või mitmekanalilised. Ühe kanaliga detektoriga saab registreerida kiirguse intensiivsust ainult ühe lainepikkuse kaupa, samas mitmekanaliline salvestab terve spektri korraga ja kiirguva valguse jaoks pole monokromaatorit vajagi. Mõlemal variandil on siiski omad eelised ja puudused. Küvett on anum, mille sees analüüsitavat ainet hoitakse. Tuleb hoolega jälgida, millised on küveti enda optilised omadused, et ei juhtuks olukord, kus küvett ei lase ergastavat valgust läbi või küveti enda fluorestsents on tunduvalt parem kui uuritaval ainel. Eelistatud on kvartsist küvetid, mis lasevad valgust läbi lainepikkuste vahemikus 200–2500 nanomeetrit (siinkohal oleks õigem rääkida mitte enam valgusest, vaid kiirgusest, sest nähtava valguse diapasoon moodustab ainult väikse osa sellest vahemikust). Kallim ja kõrgema klassi kvarts laseb läbi kiirgust kuni 3500 nanomeetrit. Mitmekülgseimad fluorimeetrid kahe monokromaatori ja pideva valgusallikaga suudavad mõõta nii ergastus- kui ka fluorestsentsspektri. Viimase mõõtmisel on ergastava valguse lainepikkus konstantne (eelistatavalt tugeva neeldumise piirkonnas) ja kiiratava valguse monokromaator skannib spektri. Ergastusspektri mõõtmisel töötavad monokromaatorid vastupidi, esimene skannib ja teine püsib konstantsena. Arvestada tuleb paljude teguritega, mis mõõdetavat spektrit võivad moonutavad. Tõelise ehk mõõtmisviisidest sõltumatu spektri saamiseks tuleb sisse viia korrektsioone, mis kõiki arvesse võttes võib osutuda väga tülikaks. Siin välja toodavad moonutused pärinevad kas mõõteriistadelt või uuritavalt ainelt endalt. Esiteks võivad valgusallika intensiivsuse ja lainepikkuse karakteristikud ajas muutuda ning seda juba ühe mõõtmise ajal. Lisaks ei kiirga ükski valgusallikas konstantse intensiivsusega kõigil lainepikkustel. Selle probleemi lahendamiseks võib kasutada kiirtejagajat ja teist võrdlevat detektorit, mis mõõdab ergastava valguse intensiivsust. Teiseks tuleb arvestada monokromaatorite ja filtrite läbilaskvusega, mis sõltuvad lainepikkusest. Selle tõttu tuleks võrdlev detektor panna pärast ergastava kiire monokromaatorit või filtrit, mitte enne neid. Ka detektorite tundlikkus sõltub lainepikkusest. Lisaks mõõteseadme poolt tekitatud moonutustele võivad veel esineda sisemised efektid. Võib juhtuda olukord, kus uuritavast ainest kiiratud footon neeldub selle aine mõnes teises molekulis. Ka ei ole mõistlik fluorofooride liiga suur kontsentratsioon, sest siis paljudeni enam ergastav kiirgus ei jõuagi. Sisemisi efekte tuleb arvestada, sest nende tõttu võivad kiiratud spekter ja intensiivsus muutuda. Rakendusalade hulk on suur ja sinna kuuluvad näiteks biokeemia, meditsiin, materjaliteadus, keemia. Analüütilises keemias kasutatakse fluorestsents-spektroskoopiat kõrgsurve-vedelikkromatograafias. Aatomiabsorptsioonispektroskoopia UV/Vis-spektroskoopia Laserindutseeritud plasma spektroskoopia Fotoluminestsents Kiisk, Valter (1.9.2014). "Spektroskoopia alused" (PDF). Tartu: Tartu Ülikooli Füüsika Instituut. Originaali (pdf) arhiivikoopia seisuga 28.10.2014. Vaadatud 21.10.2014. Mehta, Akul. "Animation for the principle of fluorescence and UV-visible absorbance". Originaali arhiivikoopia seisuga 9.06.2013. Vaadatud 21.10.2014. Kikas, Jaak. "Luminofoorid". Originaali arhiivikoopia seisuga 1. juuni 2016. Vaadatud 21.10.2014. Introduction to Fluorescence Spectroscopy. Sharma, A. ja Schulman, S. G. Wiley interscience, 1999 "Super-Quiet Xenon Lamp. Super-Quiet Mercury-Xenon Lamp" (PDF). Originaali (PDF) arhiivikoopia seisuga 28. oktoober 2014. Vaadatud 21.10.2014. "What is a CCD detector?". Vaadatud 28.10.2014. "Quartz and Glass Cuvettes". Vaadatud 21.10.2014. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Lakowicz, J. R. Plenum Publishers 1999 Principles and Applications of Fluorescence Spectroscopy. Albani, Jihad Rene. Wiley-Blackwell, 2007 Shahzad, Aamir. "Emerging applications of fluorescence spectroscopy in medical microbiology field". Vaadatud 28.10.2014. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Valeur, Bernard. Wiley-VCH, 2012 Fluorescence Spectroscopy: New Methods and Applications. Wolfbeis, Otto S. Springer-Verlag, 1993 Lombardi, Ana T. "Fluorescence spectroscopy of high performance liquid chromatography fractionated marine and terrestrial organic materials." Water Research. 33, 512–520, 1999