GDNFi perekonna ligandid

Gliia rakkuliinides saadud neurotroofilise faktori (GDNF – glial cell line neurotrophic factor) perekonna liikmeteks on GDNF, neurutrin (NRTN), persephin (PSPN) ja artemin (ARTN). Tegemist on väikeste valkudega, mis esmakordselt eraldati gliia rakkudest. Selle valguperekonna ligandide signaaliülekanne toimub kaasretseptor GFRα-ga (GDNF-family receptor-α) seondunult läbi RET retseptori. Gliia rakkuliinides saadud neurotroofilise faktori perekonna liikmed (GFLid) on potentsiaalsed ravimikandidaadid. Nende abil on suudetud nii in vivo kui ka in vitro katsetes ravida erinevaid närvirakke, mis saavad kahjustada Parkinsoni tõve ja teiste närvihaiguste korral. Senine ravi on nende haiguste puhul keskendunud haigestumise pidurdamisele, aga GFLide abil loodetakse leida ravim, mis oleks võimeline ka taastama haigusega kannatada saanud rakke. GFLide toimemehhanismide, kaasretseptorite, raviomaduste ja väikse molekuliga mimeetikute väljatöötamisega tegeleb Mart Saarma labor Helsingi Ülikooli biotehnoloogia instituudis. Gliia rakkuliinidest saadud neurotroofiline faktori perekonna ligandid on osa muutuvate kasvufaktorite-β (TGF-β) superperekonnast, kus rohked tsüsteiini jäägid paiknevad teineteise suhtes sarnasel moel. Vaatamata aminohapete järjestuse väiksele sarnasusele on kirjeldatud TGF-β superperekonna liikmed struktuurselt sarnaste konformatsioonidega. Sarnaselt teiste TGF-β perekonna liikmetega nagu TGF-β2 ja OP-1, on GDNFi dimeeril tasapinnalised "sõrmed", mis koosnevad suurel hulgal β-lehtedest. GDNFi dimeer on painduv. See omadus tuleb alfaheeliksi paiknemisest painduva rihma otsas, mis võimaldab dimeeri eriosadel liikuda, aga siiski säilitada tugevat kontakti teiste osadega. Alfaheelikseid kinnihoidev punkt asub valgu keskosas paiknevas tsüsteiini sõlmes. GDNF toimib homodimeerina ning kuulub tsüsteiini sõlmega valkude perekonda. Tsüsteiini sõlm on struktuuri osa, mis koosneb kuuest tsüsteiini jäägist, mis on kokku seotud kolme disulfiidse sidemega. Sarnaselt teiste eritatud valkudega toodetakse GFL-i (GDNF family ligand) organismis eellasvalguna. Olgugi et GFL-ide sünteesi organismis on põhjalikult uuritud, on jätkuvalt ebaselge, millised geenid ja mehhanismid reguleerivad GFL-i. GFL-id osalevad praktiliselt igas neuroni eluetapis, aga nende täpsed toimemehhanismid ja regulatsioon on jätkuvalt ebaselged. Teatud närvirakud lähevad üle ühelt GFL-ilt teisele, olgugi et need mõlemad GFL-id suudavad aktiveerida samu signaaliradu. Samas võib üks GFL erinevates elu staadiumites põhjustada kategooriliselt erinevaid bioloogilisi vastuseid. Kõik GDNFi perekonna liikmed kannavad oma signaali läbi türosiinkinaasi retseptori (RTK – receptor tyrosine kinase), mis on ümber paiknenud transfektsiooni käigus (RET – reaarranged during transfection). RET on rakumembraani läbiv proteiin, mis erinevalt teistest RTKdest koosneb rakuvälises osas neljast kadheriinilikust üksusest ja rakusiseses osas tüüpilisest türosiinkinaasi domeenist. RET on võimeline aktiveerima erinevaid signaaliradu, mille hulgas on äärmiselt oluline neuritogeneesi signaalirada MAPK ja neuroülekande tugevdamises olulised signaalirajad PLC-γ ja PI3-kinaas. Signaali ülekandumine ei toimu RETi ja GFLi otsesel interaktsioonil, vaid erinevalt teistest teadaolevatest RTKdest on ülekandumise toimumiseks vajalik kaasretseptor. Need kaasretseptorid on tuntud kui GDNFi perekonna retseptor-α-d (GFRα – GDNF family receptor-α). Tundmatu fosfolipaasi või proteaasi lõhestamisel saab GFRαsid teha lahustuvateks, kuid enamasti on nad seotud rakumembraani GPI ankruga. Ligandis spetsiifilisuse otsustab moodustuv GFRα-RET kompleks. Esmalt interakteerub GFL vastava GFRα kaasretseptoriga ning seejärel moodustab kompleksi RETiga. Algse mudeli kohaselt on monomeerne või dimeerne GFRα1 sihtmärgiks GDNF dimeerile. Nad moodustavad GDNF-GFRα1 kompleksi, mis seostub kahe RET retseptoriga raku välispinnal. Seostumine rakuvälisele domeenile põhjustab homodimerisatsiooni, RETi aktivatsiooni ja raku siseses osas türosiinide autofosforülatsiooni. Pärast seda seostub RETi rakusisene osa erinevate rakusiseste signaalproteiinidega. Eelduste kohaselt käituvad ka teised GFLi pere liikmed sarnaselt GDNFiga. Kõigile neljale GNDFi perekonna ligandile (GFLile) vastab oma kaasretseptor GFRα: GDNF seostub GFRα1ga, neurturin (NRTN) GFRα2ga, artemin (ARTN) GFRα3ga ja persephin (PSPN) GFRα4ga. Mõningast ristseostumist on suudetud tõestada, näiteks on persephin võimeline toimima ka läbi GFRα1. GPI ankurdatud GFRα on koondunud lipiidparvedesse ja kompleksi moodustumisel RETiga liigub ka RET samasse lipiidparve. Lipiidne parv paneb interakteeruvad molekulid üksteise lähedale mõlemal pool plasmamembraani ning välistab interaktsioonid molekulidega, mis ei asu lipiidses parves. Eksperimentaalsed andmed näitavad, et see parvedesse koondumine on oluline allavoolu signaaliülekandes. RETi ülekandumine lipiidi parvedesse on oluline seal asuvate signaalproteiinide tõttu, sest RET peab efektiivseks signaaliülekandeks seostuma signaalproteiinidega. Alternatiivne GFRα-RET aktivatsiooni mudel väidab, et aktiveeritud retseptori monomeerid ja aktiveerimata dimeerid eksisteerivad tasakaalus, mis omakorda on tasakaalus aktiveeritud dimeeridega. GFRα-RET kompleksi puhul eksisteerib veel teisigi tasakaale, sest GFRα saab interakteeruda RETiga ka ligandi puuduses. Vastavalt on väidetud, et eelvalminud GFRα-RET ja heterotetrameerne (GFRα)2-(RET)2 kompleksid eksisteerivad. GDNFi peetakse atraktiivseks terapeutiliseks vahendiks Parkinsoni tõve ja amüotroofiline lateraalskleroosi (ALS) raviks. GDNF ja teatud teised väikse molekuliga mimeetilised ühendid on suutelised tugevdama dopamiini neuroneid, mida mõjutab Parkinson. Loomsed ja kliinilised katsed on kinnitanud GDNFi positiivset mõju närvirakkude jätkete kasvule. GDNFi on kasutatud näo motoneuronite päästmiseks ja atroopia vältimiseks ning aksotoomia põhjustatud massilise mootorneuronite rakusurma ja atroopia vältimiseks. Lisaks sellele on Parkinsoni tõve loomsed katsed näidanud, et GDNF suudab vältida neurotoksiinide indutseeritud dopamiinsete närvirakkude surma. Ka neurturin, persephin ja artemin on positiivse mõjuga erinevate närvihaiguste korral. Neurturin suudab elavdada basaal eesaju kolinergilisi närvirakke ja seljaaju motoorseid neuroneid, mistõttu nähakse neurturinis potentsiaalset Alzheimeri ja ALS ravimit. GFLide polüpeptiidid ei ole sobivad farmakoloogilised agendid, ennekõike kuna nad pole võimelised läbima vere-aju barjääri. Seetõttu on ilmnenud vajadus arendada väikse molekuliga agonist, mis on suuteline seonduma GFRαga ja esile kutsuma RETi aktivatsiooni. GFLide mimeetikud ehk ained, mis käituvad sarnaselt GFLidega, annaksid võimaluse ravimit manustada süstemaatiliselt, parema stabiilsuse ja farmakokineetika ning vähendaksid ravimi maksumust. Sünteetiliselt loodud väike molekul võib osutuda spetsiifilisemaks kui GFL, mida ta immiteerib. GDNF on võimeline signaali üle kandma ka läbi GFRα2 ja GFRα3, aga väikese molekuliga ühend võiks olla võimeline aktiveerima ainult GFRα1-RET kompleksi ja teha seda spetsiifilisemalt kui GDNF, aktiveerides kvantitatiivselt erinevaid RETi reguleeritud signaaliradasid. Heterodimeerseid GFRα-RET ja heterotetrameerseid (GFRα)2 -(RET)2 komplekse on organismis piisaval hulgal, et GFLi mimeetikul oleks otstarbekas sihtida neid komplekse. Selline sihtmärgi valik aitab vähendada RETi aktiveerimisest võimalikke kõrvalnähtusid. Arvatakse, et türosiinkinaasi retseptorite aktivatsioon toimub väikse molekuli seondumisel teatud kindlatele punktidele juba eelnevalt seondunud retseptori dimeerile. Väikesed molekulid ei ole võimelised ristseostama kahte retseptori molekuli nagu seda teevad bivalentsed ligandid. Seostumine kindlatesse punktidesse muudab retseptormolekuli kuju sarnaselt endogeense ligandi seostumisest tulenevale konformatsiooni muutusega. Juba on avastatud potentsiaalsed aminohapetest mittekoosnevad väikse molekuliga mimeetikud. Sarnaselt GDNFi toimega kiireneb neuronite jätkete kasv nende mimeetikute kontsentratsioonist sõltuvalt. Edasine uurimine on vajalik, kuna leitud mimeetikud on nõrga afiinsusega, kuid need leitud molekulid on suureks abiks suukaudu manustatava GDNFi retseptori agonisti leidmisel. Airaksinen, M. S., & Saarma, M. (2002). the Gdnf Family: Signalling, Biological Functions and Therapeutic Value. Nature Reviews Neuroscience, 3(5), 383–394. http://doi.org/10.1038/nrn812 Mart Saarma lab, Institute of Biotechnology, University of Helsinki Ibáñez, C. F. Emerging themes in structural biology of neurotrophic factors. Trends Neurosci. 21, 438–444 (1998). Eigenbrot, C; Gerber, N. (1997). X-ray structure of glial cell-derived neurotrophic factor at 1.9 angstrom resolution and implications for receptor binding. NATURE STRUCTURAL BIOLOGY, 4(6), 435–438. http://doi.org/10.1038/nsb0697-435 Golden, J. P., DeMaro, J. A., Osborne, P. A., Milbrandt, J. & Johnson, E. M. Jr. Expression of neurturin, GDNF, and GDNF family-receptor mRNA in the developing and mature mouse. Exp. Neurol. 158, 504–528 (1999) Knowles, P.P. et al. (2006) Structure and chemical inhibition of the RET tyrosine kinase domain. J. Biol. Chem. 281, 33577–33587 Yang, F. et al. PI-3 kinase and IP3 are both necessary and sufficient to mediate NT3-induced synaptic potentiation. Nature Neurosci. 4, 19–28 (2001). Santoro, M. et al. (2004) RET: normal and abnormal functions. Endocrinology 45, 5448–5451 Airaksinen, M. S., Titievsky, A. & Saarma, M. GDNF family neurotrophic factor signaling: four masters, one servant? Mol. Cell. Neurosci. 13, 313–325 (1999) Schlessinger, J. (2000) Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell 103, 211–225 Tansey, G., Baloh, R. H., Milbrandt, J., Johnson, E. M., & Louis, S. (2000). GFR ␣ -Mediated Localization of RET to Lipid Rafts Is Required for Effective Downstream Signaling , Differentiation , and Neuronal Survival, 25, 611–623. Bespalov, M. M., & Saarma, M. (2007). GDNF family receptor complexes are emerging drug targets. Trends in Pharmacological Sciences, 28(2), 68–74. http://doi.org/10.1016/j.tips.2006.12.005 Henderson, C.E. et al. (1994) GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266, 1062–1064 Tokugawa, K., Yamamoto, K., Nishiguchi, M., Sekine, T., Sakai, M., Ueki, T., … Okuyama, S. (2003). XIB4035, a novel nonpeptidyl small molecule agonist for GFRα-1. Neurochemistry International, 42(1), 81–86. http://doi.org/10.1016/S0197-0186(02)00053-0 Grondin, R. & Gash, D. M. Glial cell line-derived neurotrophic factor (Gdnf) – a drug candidate for the treatment of Parkinson’s disease. J. Neurol. 245, 35–42 (1998). Golden J, Milbrandt J, Johnson E (2003). "Neurturin and persephin promote the survival of embryonic basal forebrain cholinergic neurons in vitro". Exp Neurol. 184 (1): 447–55. doi:10.1016/j.expneurol.2003.07.999. PMID 14637114 Garcès A, Livet J, Grillet N, Henderson C, Delapeyrière O (2001). "Responsiveness to neurturin of subpopulations of embryonic rat spinal motoneuron does not correlate with expression of GFR alpha 1 or GFR alpha 2". Dev Dyn. 220 (3): 189–97. doi:10.1002/1097-0177(20010301)220:3<189::AID-DVDY1106>3.0.CO;2-I. PMID 11241828.