Kahedimensionaalne geelelektroforees

Kahedimensionaalne geelelektroforees (2DE- või 2D-elektroforees) on elektroforeesi rakendus, mida klassikaliselt kasutatakse valkude analüüsimiseks. See tehnika eraldab valgud erinevate omaduste kaudu. Esimene dimensioon on isoelektriline fokuseerimine, mis eraldab valgud vastavalt nende isoelektrilisele punktile (pI). Teine dimensioon on SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforees (SDS-PAGE), mis eraldab valgud vastavalt molekulmassidele. Selle meetodi võtsid esimestena kasutusele 1975. aastal Patrick H. O'Farrell ja Joachim Klose. Proovid, mida teaduses kasutatakse, on sageli väga komplekssed ning neid on väga raske analüüsida. Seega on minevikus otsitud ja otsitakse kindlasti ka tulevikus meetodeid, kuidas paremini, lihtsamalt ja odavamalt tulemusi ning andmeid saada ja analüüsida. 1970. aastate alguses oli kasutusel kaks suure jõudlusega elektroforeesi valkude eraldamiseks: tsooniline elektroforees SDSiga; denatureeriv isoelektriline fokuseerimine. Neid kaht meetodit kasutati teineteisest sõltumatult ja edukalt, seega ei olnud üllatav, et varsti üritati neid meetodeid ühendada. Esimene edukas katsetus 1974. aastal jäi peaaegu tähelepanuta, sest geeli värviti mittetundliku Coomassie sinisega ning näha oli vaid mõni üksik täpp geelil. See ei olnud mitte midagi erakordset ning pigem oli tegu ebaõnnestumisega. Siiski jätkati katsetamist ning 1975. aastal muutus olukord täielikult. Avaldati väga detailne uurimus ning sealsel elektroforeesi joonisel oli näha sadu täppe. Seega oli tulemus palju parem kui teiste kahedimensionaalsete tehnikatega. Uurimuse eest vastutas P. H. O’Farrell ning tema väljatöötatud tehnika oli niivõrd muljetavaldav, et mitmed biokeemikud võtsid selle kohe kasutusele. Kuigi meetodi nime järgi võiks arvata, et tegu on kaheetapilise protsessiga, on sel tegelikult hoopis viis etappi: proovi ettevalmistamine enne esimest eraldamist; esimene dimensioon, valkude eraldamine; liitmine teise dimensiooniga; teine dimensioon, valkude eraldamine; valkude tuvastamine. Valkude eraldamise üleüldine järjekord on isoelektriline fokuseerimine ning seejärel SDS elektroforees. Siiski ei ole selline järjekord kohustuslik ning on kirjeldatud ka vastupidine järg. N-ö klassikalist rida kasutatakse eelkõige majanduslikel põhjustel, sest see on odavam. Samas lisanduvad ka tehnilised põhjused: SDS elektroforeesi geele on palju lihtsam värvida kui isoelektrilisi geele. 2D-elektroforees algab elektroforeesiga esimeses dimensioonis. Esimeses dimensioonis eraldatakse molekulid lineaarselt nende isoelektrilise punkti (pI) suhtes. Selleks kasutatakse isoelektrilist fokuseerimist (IEF). IEF töötab, kui valgule rakendatakse pH gradiendis elektriväli. Valgud eralduvad, kui nad migreeruvad läbi pH gradiendi. See on vastus rakendatavale voolule. Kui valk jõuab pH-ni, mis vastab tema isoelektrilisele punktile, siis valgu laeng muutub neutraalseks ja lõpetab migreerumise. Isoelektrilist fokuseerimist saab läbi viia kasutades kaht tehnikat: immobiliseeritud pH gradiendid (IPG), kus amfolüüdid on kovalentselt geelile seotud, või nad on kandjad, mis migreeruvad läbi geeli, et luua pH gradient. Isoelektrilise punkti järgi valkude eraldamist nimetatakse isoelektriliseks fokuseerimiseks (IEF). Kui valk on puhvris, millel on pH gradient ja rakendatakse elektrivälja, siis lõpuks hakkab valk liikuma elektroodi suunas, millel on vastaslaeng. Üleüldiselt on igal valgul laeng. Kui valgud on positiivselt laetud, siis neid tõmmatakse negatiivsema geeli otsa poole ja kui valgud on negatiivselt laetud, siis positiivsema otsa poole. Valgud liiguvad geelis ja akumuleeruvad nende isoelektrilises punktis: see on punkt, kus valgu üleüldine laeng on 0 (neutraalne). pH gradienti läbiva migratsiooni ajal valk kas korjab prootoneid üles või kaotab neid. Kui valk migreerub, siis netolaeng ja liikuvus kasvavad, aga valgu liikumine aeglustub. Lõpuks jõuab valk punkti, kus tema pH gradient on võrdne isoelektrilise punktiga. Seal on valk laenguta ja lõpetab "rändamise". Kui peaks juhtuma, et valk difundeerub madalama pH-ga regiooni, siis toimub protoneerumine ja valk sunnitakse elektriväljaga tagasi katoodi suunas. Teistpidi, kui valk difundeerub regiooni, kus pH on kõrgem isoelektrilisest punktist, siis valk muutub negatiivselt laetuks ja suunatakse anoodi suunas. Tänu sellele omadusele valgud kondenseeruvad pH gradiendis selgeteks ribadeks oma individuaalse isoelektrilise punkti järgi. IEF süsteemis migreeruvad valgud oma püsiasendisse kogu süsteemist. Võrdluseks võib tuua, et tavalises elektroforeesis liiguvad valgud senikaua, kuni elektriväli eemaldatakse. Pärast esimese dimensiooni lõppu hävitatakse valgukompleksid, denatureerides neid naatriumdodetsüülsulfaadiga (SDS) teises dimensioonis. SDS denatureerib valgud ja SDS molekulid seotakse vastavalt valgu pikkusele. Valgu pikkus on ligikaudu proportsionaalne tema massiga. Teine dimensioon on standardne polüakrüülamiidgeel. Valgud, mis eraldati esimeses dimensioonis isoelektrilise fokuseerimisega, pannakse SDS polüakrüülamiidgeeli ja eraldatakse suuruse järgi. Esimesest elektroferogrammist eraldatakse molekulid 90-kraadise nurga all (ristloodis). See toimub molekulmassi alusel. Selleks, et analüüsida rakkudes olevaid valke, on väga oluline teada nende koostööd. Kõige sagedamini töötavad valgud koos mitmetes kompleksides, et nad saaksid olla täielikult funktsionaalsed. Säilitada tuleb valgukomplekside natiivne vorm. Selleks kasutatakse polüakrüülamiidgeelelektroforeesi, kus valgukompleksid säilitavad natiivse vormi ja lahutatakse elektriväljas nende massile vastavalt. Et oleks võimalik säilitada eraldust suuruse, mitte laengu järgi, nagu IEF puhul, viiakse valkudele lisalaeng Coomassie sinise või liitiumdodetsüülsulfaadi abil. Nagu eespool mainitud, rakendatakse teises dimensioonis taas elektrilist potentsiaali, kuid 90-kraadise nurga all võrreldes esimese väljaga. Valgud tõmmatakse geeli positiivsemale poolele proportsionaalselt nende massi-laengu suhtega. Kuna SDS molekulid on negatiivselt laetud, siis kõikidel valkudel on ligikaudu sama mass-laengu suhe üksteise suhtes. Valgu edasijõudmist takistab hõõre. Seega geel käitub nagu molekulaarne sõel. Valgud eralduvad pinge rakendamisel nende molekulmassi põhjal: suuremad valgud jäävad pidama geeli ülaossa ning väiksemad suudavad selle molekulaarse sõela läbida ning jõuavad geeli madalamasse ossa. Kahedimensionaalse elektroforeesi tulemuseks on geel, kus valgud on laotunud selle pinnale. Neid valke saab tuvastada mitmesuguste vahenditega, kuid kõige sagedamini kasutatavad värvained on hõbe ja Coomassie sinine. Esimese meetodi puhul rakendatakse geelile hõbeda kolloidi, mis seondub valkudes olevate tsüsteiingruppidega. Seejärel hõbe tumendatakse, eksponeerides seda UV valguses. Hõbeda koguse saab vastavusse viia tumedusega ning sealt edasi järeldada mingi teatud valgukoguse geelis ja seeläbi tuvastada kindel valk. Mõõtmine annab kahjuks ainult ligikaudsed tulemused, kuid see on enamiku otstarvete korral piisav. Kasutatakse ka Coomassie sinisega värvimist, kuid hõbedaga värvimine on 100x tundlikum ja seega ka tulemused täpsemad. Tööriistad kvantitatiivses proteoomikas analüüsivad peamiselt biomarkereid, kvantifitseerides individuaalseid valke ja näidates lahutavust ühe või mitme valgu "täpi" vahel skannitud 2DE-pildil. Lisaks aitavad need tööriistad eri geelide vahel viia kokku samu täppe. Näiteks proteoomilised erinevused haiguse alg- ja edasijõudnud faasis. Tarkvara pakkides sisaldub näiteks BioNumerics 2D, Delta2D, ImageMaster, Melanie, PDQuest, Progenesis ja REDFIN. Kuigi need tehnoloogiad on laialdaselt kasutusel, siis informatsioon ja materjal ei ole täiuslikud. Näiteks kui PDQuest ja Progenesis kipuvad nõustuma hästi defineeritud ja eraldatud valgu täppide kvantifitseerimises ja analüüsis, siis väljastavad nad erinevad tulemused ja analüüsid vähem defineeritud ja eraldatud täppide kohta. Miinused/väljakutsed automaatsetel analüüsitarkvaradel: ei suuda eristada mittetäielikult eraldunud (ka kattuvaid) täppe; nõrgad täpid, müra; liikumise erinevus erinevatel geelidel (valk migreerub erinevatel geelidel erinevatele positsioonidele); kooskõlastamata/tuvastamata täpid, mis viib kadunud väärtusteni; valesti määratud täpid; vead kvantifitseerimises (lähedased täpid võib kogemata kokku lugeda üheks täpiks); erinevused tarkvara algoritmides ja seepärast ka analüüsi suunitluses. 2D-elektroforeesiga saab eraldada ka teisi molekule peale valkude, näiteks DNAd. DNA superspiralisatsiooni analüüsides eraldatakse esimeses dimensioonis spiraliseeritud DNA. Teises dimensioonis denatureeritakse DNA interkalaatoriga, milleks tavaliselt on etiidiumbromiid või vähem kantserogeenne klorokviin. Analüüs ja tuvastamine toimub veidi teistmoodi kui valkude puhul. Geelelektroforees Classic protocol. Two-dimensional gel electrophoresis of proteins. http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n1/full/nmeth0105-83.html 03.11.2016 O'Farrell, PH (1975). "High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins". J. Biol. Chem. 250 (10): 4007–21. PMID 236308. 03.11.2016 Klose, J (1975). "Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals". Humangenetik. 26 (3): 231–43. PMID 1093965. 03.11.2016 Rabilloud, T. Lelong, C (2011). "Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial". Journal of Proteomics. 74 (10): 1829–1841. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391911002545 03.11.2016 Isoelectric Focusing in 2D Electrophoresis. http://www.bio-rad.com/en-ee/applications-technologies/isoelectric-focusing-2d-electrophoresis 03.11.2016 Second-Dimension Separation. http://www.bio-rad.com/en-ee/applications-technologies/second-dimension-separation 03.11.2016 Switzer, RC 3rd, Merril, CR, Shifrin, S (1979). "A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels". Analytical Biochemistry. 98 (1): 231–37. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269779907322 03.11.2016 Arora, PS, Yamagiwa, H, Srivastava, A, Bolander ME, Sarkar G (2005). "Comparative evaluation of two two-dimensional gel electrophoresis image analysis software applications using synovial fluids from patients with joint disease". J Orthop Sci. 10 (2): 160–66. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15815863 03.11.2016 Dandjinou, AT, Larrivée, M, Wellinger, RE, Wellinger, RJ (2006). "Two-dimensional agarose gel analysis of DNA replication intermediates". Methods Mol Biol. 313:193–208. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16118435 03.11.2016 JVirGel Virtuaalsed 2D-geelid järjestustest