Valgustundlikud kaitserühmad

Valgustundlik kaitserühm on molekuli osa, millega saab funktsionaalrühma keemilist või bioloogilist aktiivsust blokeerida ning mis eemaldub valgusega kiiritades (üldiselt UV-kiirgus). Valgustundlikud kaitserühmad võimaldavad valguse toimel juhtida valkude talitlust – valke pöörduvalt sisse ja välja lülitada või pöördumatult aktiveerida/desaktiveerida. Valgustundlike ühendite uurimise üks laiemaid eesmärke on näiteks bioloogiliste protsesside uurimine. Valgustundlikud kaitserühmad koosnevad üldiselt aromaatsetest struktuuridest ning on seotud kovalentselt väikeste molekulide või aminohapete külge, nii et viimaste bioloogiline aktiivsus on alla surutud. Valgusega kiiritamisel (enamjaolt UV) lõhustub valgustundliku rühma ja väikese molekuli/aminohappe vaheline kovalentne side ning ühendi loomulik konformatsioon taastub (valk muutub samasuguseks nagu enne kaitserühmaga sidumist). Selle tulemusena valk aktiveerub või desaktiveerub (joonis 2 a,b). Eelmainitud rakendusteks kõige tihemini kasutatavad valgustundlikud kaitserühmad põhinevad orto-nitrobenseeni ühenditel, kuid on valmistatud ka teisi fotokeemiliste omadustega rühmi. On väljatöötatud ka süsteeme, kus loomulikult esinevad fotoreaktiivsed valgud on konjugeeritud uuritava valgu külge. Need fotoreaktiivsed valgud sisaldavad valgus-, hapniku- ja pingetundlikke piirkondi (LOV-valgud) ja hõlbustavad valgusega kiiritades aktiivsete valkude modulatsiooni, tihtipeale pöörduvalt (joonis 3 c, d). On neli erinevat lähenemist valgu aktiivsuse kontrollimiseks valgusega: UV-valgusega kiiritatud väikesed molekulid suudavad inhibeerida valgu talitlust (joonis 2, a). Valgustundlikke kaitserühmi saab UV kiirgusega eemaldada, mille tulemusena valk aktiveerub (joonis 2, b). Valgusretseptoriga valgu aktiivsust on võimalik valguskiirgusega pöörduvalt reguleerida (joonis 3, c). Kahte valku on võimalik valguse toimel kokku dimeriseerida seotuna taime fütokroomile (joonis 3, d). Looduses juhivad valkude tegevust mitmesugused keerukad mehhanismid. Võrdlemisi suur hulk efektormolekule kontrollivad valkude aktiivsust nii ruumiliselt kui ka ajaliselt. Teaduses on juba pikka aega kasutatud keemilis- ja biokeemilisi vahendeid manipuleerimaks rakkudevahelisi radasid, seega ka mõjutanud rakkude ja organismi käitumist. Ometi, kui toimeaine (inhibiitor, aktivaator jne) siseneb rakku, kaotab teadlane selle üle igasuguse kontrolli. Juhtida toimeaine rakusisest jaotust, täpset ajastust ja aktiivsuse kestvust on väga keerukas ülesanne. Valgu aktiivsuse aeg-ruumiliseks kontrollimiseks või mõne bioloogilise aine toime selektiivsuse parandamiseks on võimalik panna ühend sõltuma tegurist, millega saab seda väliselt aktiveerida. Sellise ülesande lahendamiseks on valgus täiesti ainulaadne vahend, kuna tema intensiivsust, asukohta ja ajastust on võimalik täpselt kontrollida. Valgustundlikud versioonid sellistest ühenditest võimaldavad kontrollida bioloogilist aktiivsust isegi pärast toimeaine rakku sisenemist. Esimene valgustundliku kaitserühmaga blokeeritud bioaktiivne ühend oli adenosiintrifosfaadi (ATP) derivaat 1 (joonis 4). Esimesed valgustundlikud kaitserühmad olid tänapäeva mõistes seotud nö väikestele molekulidele. Tänapäevaks on lisatud valgustundlikke kaitserühmi väga erinevatele molekulidele erinevatest aineklassidest. Lisaks aminohapetele on valgustundlike kaitserühmadega ja bioloogilises analüüsis kasutatud ka steroide, sekundaarseid virgatsained, suhkruid, rasvu. Valgustundliku kaitserühmaga ATP 1 (joonis 4) ja cAMP-i analoogid 3 ja 5 (joonis 4). Need derivaadid on klassikalised näited kovalentse sidemega kaitserühmast, mis blokeerib bioloogilist aktiivsust. Fotolüüs muudab valgustundliku kaitserühmaga kaitstud ATP 1 ühendi aktiivseks vormiks 2 ning cAMP-i 3 ühendiks 4. Siiski saab ühendeid nagu cAMP kiirelt desaktiveerida ensüüm-katalüüsitud hüdrolüüsi teel. Siinkohal eristub broomiga töödeldud cAMP analoog 5 (joonis 5), mis on bioortogonaalne endogeense raku biokeemia suhtes. Valgustundlikust kaitserühmast vabastatud bromo-cAMP-i analoog näitab pikaajalist cAMP-i aktiivsust, kuna on resistantne fosfodiesteraas-katalüüsitud hüdrolüüsi suhtes. Kasutatuim valgustundlik kaitserühm on orto-nitrobensüül ja tema derivaadid (joonis 6). Neid on laialdaselt kasutatud sünteesil kaitsva rühmana ning ka fotolabiilse linkerina tahkefaasi rakendustes. Orto-nitrobensüüli valgustundlikes kaitserühmades on nitrorühm seotud ülejäänud kaitserühmaga. Mõningaid orto-nitrobensüül tüüpi valgustundlikud rühmad (vt joonis 6): 2-nitrobensüül (NB) 1, selle 4,5-dimetoksü analoog (DMNB) 2, 1-(2-nitrofenüül)etüül (NPE) 3 ja selle 4,5-dimetoksü analoog (DMNPE) 4 ning α-karboksü-2-nitrobensüül (CNB) rühmad 5. Neid ühendeid on kasutatud keemilises sünteesis kui fotolabiilseid prekursoreid. Fotolüütilise protsessi käigus kandub prooton bensüülrühmalt nitrorühma hapnikule, mille tulemusena tekib järgnev ühend: Kumariin-4-metüül rühmad on valgustundlikud kaitserühmad, mida saab kasutada fosfaatide, karboksülaatide, amiinide, alkoholide, fenoolide ja karbonüülide korral (joonis 7). Fotolüüsil lõheneb side C-4 metüleeni ja lahkuva rühma X (tavaliselt hapniku) vahel, mille tulemusel tekib lahkuva rühma anioon ja kumariin. Valgustundlikud lainepikkuste maksimumid jäävad 310 ja 410 nm vahele olenevalt sellest, mis ühendi külge kumariini derivaat on seotud. Väikese efektormolekuli seostumine valguga viib valgu bioloogilise aktiveerimise või inaktiveerimiseni. Sidudes valgustundlikke kaitserühmi väikestele efektormolekulidele (MW < 1000 Da) saab juhtida valgu bioloogilist aktiivsust, ilma et peaks kaitserühma uuritava valgu enda külge siduma. Näide: valgustundliku kaitserühmaga seotud isopropüül-b-D-tiogalaktsioodi (IPTG) (joonis 8) kasutatakse lac-operaatoriga juhitud geeniekspressiooni kontrollimiseks bakteri rakkudes. Valgustundliku kaitserühmaga seotud IPTG ei ole võimeline lac-repressorvalguga seonduma. Alles pärast UV-valgusega kiiritamist tekib aktiivne IPTG, mis omakorda eemaldab lac-repressorvalgu DNA promootorjärjestusest ja tekitab geeni avaldumise. Valgustundliku kaitserühmaga seotud IPTG-d kiiritati 5 minutit UV kiirgusega (365 nm) ning seejärel jälgiti geeniekspressiooni aktivatsiooni. Valgustundliku kaitserühmaga seotud IPTG kiiritamine viis sarnase tasemega geeniekspressiooni avaldumiseni kui lihtsalt kaitserühmata IPTG lisamine. Selliseid väikseid valgustundlike kaitserühmadega seotud molekule saab kasutada erinevates in vivo prokarüootsetes ja eukarüootsetes süsteemides. Selleks lisatakse lihtsalt väike valgustundliku kaitserühmaga seotud molekul kasvu keskkonda. Mõned väikesed kaitserühmadega efektormolekulid, mis mõjutavad geeni ekspressiooni: valgustundliku kaitserühmaga doksütsükliin, ektüsoon, östradiool ja tamoksifeen. Valgustundlike kaitserühmadega valkude bioloogilise aktiivsuse juhtimiseks saab kasutada fotolülitatavat afiinsusmärgistust (PAL), mis seovad neuronitele fotoaktiveeritavaid ioonkanaleid. Valgustundlikke kaitserühmi on kasutatud laialdaselt neuroni talitluse uurimisel. Erinevates lähenemistes on kasutatud foto-aktiveeritavat valgustundliku kaitserühmaga glutamaati, kaltsiumit, geneetiliselt modifitseeritud nikotiin-atsetüülkoliini retseptoreid, kaalium-ioonkanaleid (K+), glutamaadi retseptoreid. Võimalik on siduda valgustundlik kaitserühm valgu külge. Selline lähenemine võib osutuda problemaatiliseks, kuna töödeldav valk on vaja eelnevalt ära puhastada, lisada valgustundlikud kaitserühmad ning valk tagasi rakusüsteemi viia. Esmalt määratakse ühendis kindlaks toimeaine struktuuriosa, mis omab bioloogilist aktiivsust. Teiseks seotakse sinna kovalentselt funktsionaalne valgustundlik rühm, mille tulemusel muutub ühend aktiivseks või inaktiivseks. Kolmandaks viiakse valmistatud toimeaine rakku või organismi. Neljandaks aktiveeritakse/desaktiveeritakse toimeaine valgusega, täpselt õiges kohas, ajaliselt õigel momendil (piisavaks ajaks). Ideaalsed valgustundlike kaitserühmadega seotud ühendid ei hüdrolüüsu, kaitserühma eemaldamine toimub suurel määral ja mitte liialt madalatel lainepikkustel (>300 nm), kõrvalsaadused ei ole mürgised. Goeldner, M.; Givens, R. Dynamic Studies in Biology. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim: Federal Republic of Germany, 2005. Riggsbee, C.W.; Deiters, A. Recent advances in the photochemical control of protein function. Trends Biotechnol. 2010. 28, 9, 468–75. Lee, H.-M.; Larson, D. R.; Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS. Chem. Biol. 2009. 4, 6, 409–427. Mayer, G.; Heckel, A. Biologically active molecules with a "light switch". Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006, 45, 30, 4900–21.