# 遺伝医学アップデート：基礎医学から臨床現場まで

（1）線虫のゲノム解析について

東京女子医科大学医学部生理学講座 (分子細胞生理学分野)

产哀 昌昌平

（受理 2022 年 10 月 28 日）

Genetic Medicine Update: From Basic Research to Clinical Care
(1) Caenorhabditis elegans Genome Analysis
Shohei Mitani
Department of Physiology, Division of Molecular and Cellular Physiology,
Tokyo Women's Medical University School of Medicine, Tokyo, Japan
}

Approximately $40 \%$ of protein-coding genes in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) are orthologous to human protein-coding genes, making this animal a useful model organism. The characteristics of this model organism include its simple structure, detailed basic biological description, and ease of culturing and freezing. In older years, researchers have used forward genetics to isolate mutants, examine their phenotypes, and clone the causal gene, revealing gene functions. By the end of the 20th century, researchers began to use various experimental techniques developed in the C. elegans community, including transgenic analyses by green fluorescent protein (GFP) expression and RNA interference, and this facilitated gene function analyses. These techniques are now used regularly in mammalian experiments. The C. elegans genome was sequenced for the first time as a multicellular organism, and the technologies used were then transferred to human genome sequencing.

We used C. elegans genome sequences and developed efficient techniques to isolate deletion mutants in a genomewide manner using reverse genetics. We introduced deletions in the C. elegans genome by treating the animals with trimethylpsoralen (TMP) and ultraviolet light, and then screened for mutants using PCR. Next-generation sequencing was used to isolate the deletion mutants more efficiently. Current research has revealed that our laboratory has achieved a higher number and quality of deletion mutants than that of other laboratories worldwide. Furthermore, only our laboratory has effectively isolated deletion mutants for approximately half of the total genes. Through the National Bioresource Project funded by MEXT (Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology), Japan, we have been distributing these deletion mutants to laboratories worldwide. Thus, in the past 20 years, gene function analyses of $C$. elegans have progressed notably. This information is useful for understanding the functions of human disease-causing genes. We hope that the knowledge gained from these activities will benefit research on the treatment of human diseases.

Keywords: Caenorhabditis elegans, model organisms, genome, functional genomics, deletion mutants

Corresponding Author: 三谷昌平 〒 162-8666 東京都新宿区河田町 8-1 東京女子医科大学医学部生理学講座（分子細胞生理学分野） mitani.shohei@twmu.ac.jp

doi: $10.24488 /$ jtwmu.93.1_1

Copyright (C) 2023 Society of Tokyo Women's Medical University. This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution License (CC BY), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original source is properly credited.
## はじめに

ゲノム解析といえば，主としてゲノム配列の解読と思われる方も多いことでしょう，我々が行ってきた研究は，一時期「ポストゲノム解析」に分類されてきたゲノム機能解析である。元々，ヒトゲノムの解読でさえも，あまりにも膨大なために，お金の無駄で得られた遺伝子情報を医療や産業に活用できるのはいつのことになるか分からないと考える人が多かった。私が線虫のゲノム機能解析に挑戦を始めた 1990 年代の終わり頃 (1998 年) に線虫ゲノム解読が完了した。線虫ゲノム解読はヒトゲノム解読に数年間先行していて興味を持つ研究者も少なかった。それもそのはず，線虫ゲノム解読に成功した研究チー ムがヒトゲノム解読にも参加して大きな貢献をしたためである、下等生物であるためにヒトとの関連も分かり難い線虫ゲノムの機能解析は, 非常識的で無謀な計画と見做されていたと思われる。本稿では， そのような逆風の中で何とか達成できたこと, 将来期待されることを紹介したい。人類はアポロ計画も含めて途方もないことに情熱を燃やして挑戦する生き物である．今となっては，ゲノム解読は本学のような医学医療を担う大学としては自然なことであるが，研究現場では時流に乗るまでは理解され難い。挑戦者はしばしば難題に解答を得られるかどうかが問われている.

## モデル生物としての線虫のゲノム解読

線虫(Caenorhabditis elegans) は成虫で体長が 1 $\mathrm{mm}$ 強で, 体細胞数が 1,000 個弱しかない多細胞生物としては最も単純なモデル生物である．研究の初期に受精から成虫に至るまでの全細胞系譜の記載が行われ ${ }^{1)}$,また電子顕微鏡の連続切片を用いて神経回路のシナプスレベルの形態学的記載もできている²).大腸菌を䬺として $20^{\circ} \mathrm{C}$ で飼育すると 3 日程度で 1 世代が進み，雌雄同体の自家受精で 300 弱の子供を産み，大腸菌を餌として飼育が容易である。稀に出現する雄を使って交配実験が可能であるため，遺伝学に使い易い。増えたところで冷凍して保管すると半永久的に維持可能であるため，得られた変異体や遺伝子組換え体は大量に保管が可能である. Brenner 博士はこれを利用して発生や行動の仕組みを解明できると提唱した。初期の線虫研究では順遺伝学が標準的手法であり, Brenner 博士は化学物質を用いて突然変異体を大量に分離することに成功しだ）.変異体遺伝子の遺伝子クローニングが徐々に進むと, 個々の遺伝子のイントロンが小さく, 遺伝子間
も短いことなどがわかり"), ゲノムサイズがハプロイドで 100 メガ塩基対ほどしかないため（3 ギガ塩基対あるヒトゲノムの 30 分の 1)，まず線虫のゲノム解読を行って手法の確立が試みられた。小原博士が大腸菌を材料に考案した「ゲノム断片を仮想的に繋ぎ合わせて物理地図を作成する」という手法を導入し, 酵母人工染色体でクローン化したゲノム断片の集合として線虫全ゲノムの物理地図を作成しだ ${ }^{5 / 6)}$. Brenner 博士が作っていた遺伝地図で同定済みの遺伝子構造と位置関係などを加えてゲノム配列を解読して行った. 1992 年に 3 番染色体の中心部の配列を決定 (7)，ヒトなどの高等生物と類似のホメオボックス遺伝子の存在が明らかにされたことからさらに研究は進み, 1998 年には全ゲノムの解読に至った ${ }^{81}$. 線虫の全ゲノム配列解読ができると同時に既知の遺伝子配列情報などを参考に mRNA の構造予想なども進んだ。これは現在のように次世代シーケンサーを用いて全ゲノム配列を一気に解読できる時代の前のことである．ゲノム断片をそれぞれ配列決定してコンピュータ上で繋ぎ合わせる手法はヒトゲノム解析でも有用であったし, 蛍光シーケンサーの発達もあり，かつては無謀としか思えなかった全ゲノム解析が現実的になった所以である ${ }^{9}$. 全ゲノム配列情報が得られたことから，線虫研究者はそれまで主流だった順遺伝学的手法から逆遺伝学的手法を多用することになった。具体的なゲノム情報の利用法をこの後で説明する。

## 線虫のトランスジェニック解析

線虫の雌雄同体は体全体の中で生殖腺が比較的大きい。線虫の体が透明で微分干渉顕微鏡で内部が良く見えることから，Mello 博士らは生殖腺にDNA 液を注入することで容易にトランスジェニック個体を作成することができることを示した ${ }^{10}$. 研究者たちはすぐにこの技術を利用して線虫に遺伝子導入を行うようになった. ゲノム構造情報があればプロモーター配列に $\beta$ ガラクトシダーゼ遺伝子を繋いでトランスジェニック個体を作成することで遺伝子発現パターンが解析できるようになった。この方法を用いることで，線虫変異体のレスキュー実験（変異遺伝子を導入することで野生型様に戻す）や，線虫自身の遺伝子だけでなくヒト遺伝子などの過剰発現なども可能になった。筆者はこれとほぼ同年代に米国に留学する機会を得たが，効率的なトランスジェニック法の発表の直前であったことから，指導教授の Chalfie 博士は私にトランスジェニックでは

wild-type

mutant

Figure 1. An example demonstrating the method for determining the function of a gene. In the presence of a green fluorescent protein (GFP) reporter (fused to some nuclear protein) that is localized to the nucleus in cells of wild-type animals, the effects of a gene that helps in GFP localization can be observed by examining the GFP localization in the mutant background. GFP may translocate from the nucleus (left: wild-type) to the cytoplasm (right: mutant).

なくin situハイブリダイゼーションを勧めた. 線虫のクチクラが硬く, 容易な実験ではなかったため,使われていなかった技術であったが，何とか遺伝子発現を検出できるまでになった ${ }^{11}$. その際に研究室内では遺伝子発現解析の手法について大いに議論された。私が帰国した後に Chalfie 博士は GFP (green fluorescent protein)をトランスジェニック発現させることに成功した ${ }^{12} . \beta$ ガラクトシダーゼトランスジェニックと異なり，生きたまま遺伝子発現を観察することができる点で画期的な方法であり，私が in situ ハイブリダイゼーションで使用していたマー カー遺伝子を用いて当時研究室で議論された課題が解決したことを知って感動した (Chalife 博士は 2008 年にノーベル化学賞を受賞)．GFPによる局在解析はその有用性の高さにより, 線虫に限らずマウスやヒト細胞の実験にも迅速に拡散し， $\mathrm{Ca}^{2+}$ イオン濃度測定などを含む追加技術が多数創出された ${ }^{13)}$ とはご存じの読者も多いと思われる.

## RNA 干渉と線虫の遺伝子破壊解析

遺伝子機能阻害実験は大変有用であることは上述のマーカー発現を利用した実験からも明白だった。興味のある生命現象の指標となる抗体染色, in situ ハイブリダイゼーション, トランスジェニック遺伝子レポーターなど（結果に相当）と興味のある遺伝子の機能低下した状態（原因に相当）を組み合わせると，個々の表現型を古典的な方法で観察するだけでなく, 生命現象の因果関係がより迅速に, より詳細に明らかになるのである（Figure 1)，ゲノム情報が整備された時点で, 多種多様な生命現象について, このような解析を行えば分子メカニズムが次々と解明されることが期待される。線虫の全ゲノム解読とほぼ同時期に RNA 干涉 (RNAi) という現象が発見されだ ${ }^{14}$. 既にマウスでは相同組換えを用いた遺伝子ノックアウトが普及しつつあったが，線虫の RNAi は二本鎖 RNA (dsRNA) を導入することで相同遺伝子の mRNA を分解することが可能であった. 導入方法はマイクロインジェクションが効率的であるが，後には餌の大腸菌に発現させておけば起こすこともできることが発見されて, 多くの研究者が利用するようになった ${ }^{15}$. 線虫での RNAi は大変便利な方法であったが, dsRNA の状態などにより効果が見られないことがあるなど, やや結果が不安定であることや, 神経系でほとんど効果がないなどの問題点もあった. 線虫で初めて普及した RNAiであったが, 人工合成した siRNAを培養細胞などに投与することでヒトにも有効であることが証明されたことから, GFP と同様に線虫に限定されずあらゆる分野で使用されるようになった.

上述のように全ゲノム配列情報が利用可能になったため, 線虫でも遺伝子破壊株の取得も多くの研究室で試みられた。線虫ゲノム解読の前は遺伝子クローニングの際に頻繁に使用されていたトランスポゾンを用いて，その挿入と切り出しの際に遺伝子の一部が壊れるという現象を利用する方法が使われ始めた2. ${ }^{16}$. 変異体取得の労力が大きいことから，間もなく化学物質によってランダムに欠失変異を起こし, その後で PCR 法を用いてスクリーニングする方法が主流となった ${ }^{17)}$. 我々の研究室も TMP (trimethylpsoralen）と紫外線によって欠失変異を起こし， PCR 法でスクリーニングする方法を試みた。開始した当時は, 博士研究員が 1 遺伝子の変異体を分離するのに半年 1 年程度の労力を要すると言われてお

5' -ATGGGCTTCAACGTGCCCGTCATCAACCGAGACTCGGAGATCCTCAAAGCGGACGCCAAAAAGTGG-3' TGTTGCACGGGCAGTAGTTGGCTCTGAGCCTCTAGGAGTTTCGCCTGCGGTTTTTCACC-5'

synthesis

Figure 2. Upper row: DNA polymerase incorporates nucleotides correctly at the arrow to give rise to complete double-stranded DNA. Lower row: DNA polymerase incorporates an incorrect nucleotide (A to $\mathrm{T}$ change) at the arrow resulting in the unannealed 3 -end terminus. When an incorrect nucleotide is incorporated, the next nucleotide incorporation often fails, unless the wrong nucleotide is removed by the proofreading function of the DNA polymerase. Proofreading activity depends on the enzyme used for polymerase chain reaction (PCR).

り，他の研究室よりスタートが遅かったけれど，はるかに効率の良い方法を編み出すことが目的であった. 我々の研究室では数々の工夫を行ってそれを実現したが，紙面の都合もあり，工夫の 1 例を記載することに留めたい.

PCR 法ではあまり大きな DNA 断片を増幅できないことは PCR を用いた実験を行ったことのある研究者なら誰でもご存知と思われる。しかし, 普段はその理由をあまり意識せずに使うことが多い．標準的な PCR 法では増幅したいゲノムDNA の端の 2 か所にプライマーを設計し，そこから DNA ポリメラーゼでコピーを作る. 反対側のプライマーの部位より遠いところは 2 回目の増幅からは存在する配列が少ないために目的の長さの DNA 断片が増幅する. 使用する酵素によっては長い配列は増幅に失敗することもあり，より高性能の酵素を選択する必要が生じる場合があることも知られている. PCR 法では理論的には 1 サイクルで 2 倍に増幅されるはずであるが，実際には徐々に増幅効率が低下するのである. 反応チューブ中の酵素が失活するとか，プライマーやモノマーのヌクレオチドが枯渴してくることが良く知られている。長い配列が増幅できないのはなぜかというと, 反応が途中で停止してしまうことが多いからである. Sanger 博士が開発してキャピラリーシーケンサーなどで使用されているサンガー法では DNA 増幅の際に少量の dideoxy nucleotide を使用することにより，例えば塩基 A のところにアデニンでなくジデオキシアデニンが取り达まれるとそれ以上鎖の伸長が起こらないことを利用している ${ }^{18}$.このことにより，その位置にアデニンが存在す
ることが分かるのである。サンガー法の別名をチェーン・ターミネーション法と呼ぶ所以である. ところが, 通常の PCR 反応ではジデオキシヌクレオチドを使わなくてもチェーン・ターミネーション (伸長停止)が起こってしまうのである (Figure 2). その理由は, DNA ポリメラーゼは一定の割合で間違った塩基を取り达んでしまい，増幅を繰り返すと塩基置換の変異が入ってしまうためである。その際に, $\mathrm{A}$ と $\mathrm{T}$ 間, $\mathrm{C}$ と $\mathrm{G}$ 間のアニーリングの水素結合は弱くなり, 次の塩基の取り达みに失敗するためである。間違いが入る確率が一定の場合, 長いDNA 断片ほど増幅の途中でチェーン・ターミネーションが起こる確率が高くなる. 我々は野生型に比べて短い変異体を感度良く検出できる方法を使うことで短い配列のみ選択的に増幅できることを見出した ${ }^{19}$. $\mathrm{PCR}$ 反応の際の条件として「 $\mathrm{Mg}^{2+}$ イオン濃度を下げる」,「アニーリング温度を上げる」,「デオキシヌクレオチドの濃度を下げる」などを行うと, 長いDNA 断片は増幅が悪くなる, すなわち短い DNA 断片(プライマーが結合する部分は同一配列だが，途中の一部が欠失して短くなったもの）を選択的に増幅することが可能になるのである. 我々が行った工夫は他にも多くあるが，個々のプロセスで効率が数倍になるとしても，それらが積算されることで全体の効率は飛躍的に向上するのである. 我々は, PCR 法以外にも変異導入法などの多くのプロセスを工夫して，従来法の 100 倍程度の効率を達成することができた. それまでは個々の研究室で興味のある遺伝子を選び, 若手の研究者が時間をかけて遺伝子破壊するという作業を行っていたが，さらに分注ロボットの
導入その他による実験の自動化などを加えて，我々の研究室だけで年間 500 遺伝子程度の変異体分離が可能となったことから遺伝子破壊実験に時間をかける研究者は減少した，しばらくの間は日本，米国， カナダの 3 研究室が変異体分離を行い，インター ネット公開を行い，使いたい研究者はそれを分与してもらって遺伝子の機能解析を行うという状態が続いた. 我々の研究室では 2002 年に文部科学省の予算を獲得して第 1 期のプロジェクトに着手し， 5 年毎の更新で現在は第 5 期に至っている. 我々の研究室では， 途中で上記の PCR スクリーニング法に加えて，全ゲノムシーケンス法を用いた。欠失変異が入りやすい条件で上記の TMP と紫外線処理を行い，雌雄同体を単一個体で増殖させた後に全ゲノムシー ケンスを行って欠失変異を見つける方法を導入した。変異体分離の主要なプロセスを自動化することで年間 1,000 株の変異体を分離できるようになった20).これらの蓄積で, 現在はタンパク質をコードする線虫の全遺伝子約 20,000 個のうちの半数程度の変異体を取得済みである ${ }^{21}$ 。このプロジェクトの途中で, 我々は変異体分離の数や品質で米国やカナダの研究室に差をつけ, 外国チームは欠失変異の分離から撤退したために本学プロジェクトのみとなった。

線虫の変異体に限らないが, 2013 年にゲノム編集に CRISPR/Cas9を利用する方法が使われ始めてからは，少数の変異体であればどの研究室でも分離が可能な状態になった222. 我々の研究室でもゲノム編集技術による変異体分離を行うことはあるが，既に重要な遺伝子（例えばヒト遺伝子の相同遺伝子は 8,000 個弱と言われている)の大半の変異体を分離済みであること，ゲノム編集で多くの変異体を分離することはとても労力を要する．そのためか，本学プロジェクトへの分譲依頼は減ることなく続いている.

不思議なことに，発見当初はRNAi があれば遺伝子破壊株は不要と対立的に考える研究者もいたが，現実では両者が必須だったのである．著者自身は， Mello 博士の依頼で RNAi の分子メカニズム解明に挑戦することになった． RNAiの分子メカニズムを調べる時にRNAiに関わる分子をRNAiで抑制しても論理が循環して結論が出せないことが理由であった. その成果の詳細は本稿では割愛する (Mello 博士は 2006 年にノーベル生理学医学賞を受賞).

## ヒト疾患モデルとしての線虫

上述したように, 線虫にはヒト遺伝子のオーソログが多数存在するが，その大半は既に変異体を分離済みか容易に追加取得できる状態になっている。 ヒ卜疾患のうち古典的なメンデル遺伝学で説明されるような遺伝子であれ, 最近の GWAS (genome wide association study）や次世代シーケンサを用いた全エクソーム解析や全ゲノム解析で発見された遺伝子であれ, 多数のホモログの遺伝子機能解析を線虫実験系で解析できる状況となった．既にマウスなどで疾患発症メカニズムが解明されているものも多数あることは事実であるが，ヒ卜遺伝子の数を考えるとそのすべてが完全に解明されることは一朝一夕で達成できるものではない．著者が線虫を用いてゲノム機能解析を行うことを始めた頃は線虫を使ってヒト疾患の解析を行おうという研究者は少なかったが，最近は世界的に見てもあまりに多くなり実数が把握できないほどになった. 実験動物を専門とする研究者には 3R (replacement, reduction, refinement)が頻繁に求められるようになった．新規に線虫を用いた実験を始める研究者からの問い合わせが頻繁に来ることから線虫を用いて疾患遺伝子の機能解析を行うとか，化合物の効果を検証して産業応用するなどのアプローチが増えている実感がある.

## おわりに

筆者の研究室では, 膨大な数の変異体を用いることにより, 逆遺伝学のスケールを大きくすることが容易である。特定の遺伝子ファミリーについて網羅的に表現型解析を行うことで, どの分子がどの生命現象に関わっているかを検証可能になった. 古典的な遺伝学では 1 つの変異体の機能をより詳細に解析するためにその表現型を増強する変異体（エンハンサー) や減弱する変異体 (サプレッサー) をスクリー ニングして分離する方法が多用されてきた。今や， ヒト疾患遺伝子の線虫モデルでこのような実験を行うと, 疾患の仕組みに関わる未知の遺伝子が変異体として同定できる。線虫ゲノムはサイズが小さいため, 新規変異体の全ゲノムシーケンスにより, 容易に原因遺伝子を同定することが可能であることも分かった. さらに, 同定した遺伝子が本当にヒ卜疾患原因遺伝子と相互作用するかどうかは, 膨大な数の欠失変異体を用いて確認を行うことができる。このように, 線虫ゲノムを起点にいわゆる順遺伝学と逆遺伝学の両方を併用して疾患発症メカニズムの主要な部分を解き明かすことが可能になったのである.
著者はこのようなアプローチを統合遺伝学と呼びたいと考えている ${ }^{23}$. 実際, 我々は独自に遺伝子機能解析を行った結果，いくつかの日本人の死因の多くを占める疾患に関する疾患発症の根幹に関わる候補の機能を解明しつつある。これらは，線虫遺伝子とヒ卜相同遺伝子の機能が酷似しており，PubMed などで調べる限りでは先行論文による機能解析は十分ではなさそうである．我々は，解明された分子機能を元に治療薬を開発することに挑戦の主軸を移行しつつある. さらなる発展を期待しつつ研究を進めている.

## 文 献

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