# 第 84 回東京女子医科大学学会総会 シンポジウム「ここまで来た! 心臟血管外科治療の最前線」重症心不全の Futurability 〜骨格筋・筋芽細胞シートでリモデリングを治せるか？～

大阪大学大学院・医学系研究科・心臟血管外科

澤芳樹

(受理 2018 年 12 月 1 日)

The 84th Annual Meeting of the Society of Tokyo Women's Medical University
Symposium "Up-to-Date Cardiovascular Surgery"
"Futurability" for Severe Heart Failure
}

Yoshiki Sawa

Department of Cardiovascular Surgery, Osaka University Graduate School of Medicine, Osaka, Japan

Heart failure is a life-threatening disorder worldwide, and the current end-stage therapies for severe heart failure are replacement therapies such as ventricular-assist devices and heart transplantation. Although these therapies have been reported to be useful, there are many issues in terms of the durability, complications, limited donors, adverse effect of continuous administration of immunosuppressive agents, and high costs involved. Recently, regenerative therapy based on genetic, cellular, or tissue engineering techniques has gained attention as a new therapy to overcome the challenges encountered in transplantation medicine. We focused on skeletal myoblasts as the source of progenitor cells for autologous cell transplantation and the cell-sheet technique for site-specific implantation. In vitro studies have reported that myoblast sheets secrete cytoprotective and angiogenic cytokines such as hepatocyte growth factor (HGF). Additionally, in vivo studies using large and small animal models of heart failure, we have shown that myoblast sheets could improve diastolic and systolic performance and enhance angiogenesis and antifibrosis as well as the expression of several cytokines including HGF and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the tissues at the transplanted site. Based on the results of these studies, we performed clinical trials using autologous myoblast sheets in ischemic cardiomyopathy (ICM) and dilated cardiomyopathy patients. Some patients showed left ventricular reverse remodeling and improved symptoms and exercise tolerance. Recently, multiple medical institutions including our institution successfully conducted an exploratory, uncontrolled, open-label phase II study in subjects with ICM to validate the efficacy and safety of autologous myoblast sheets. Thus, we could get the evidence that autologous skeletal muscle sheet might occur reverse remodeling in the responder of severe heart failure patients.

Key Words: severe heart failure, myoblast cell-sheet, cytokine, multi-center study, translational research

## はじめに

わが国の心不全による年間死亡数は約 4 万 3 千人， 特に end-stage 心不全にあっては 1 年死亡率が 75\%とされる。高齢化，虚血性心疾患の増加にともない，今後心不全患者数の増大およびそれに伴う治療費の増加が予想される。重症心不全に対する現在の最終的な治療法は, 補助人工心藏や, 心藏移植などの置換型治療であるが，現段階では前者はその耐久性や合併症, 後者はドナーの確保や免疫抑制剤等に問題があり，普遍的治療とは言い難いのが現状である。

我々は, 100 例に及ぶ心臓移植と 400 例を超える補助人工心臓治療を経験する重症心不全治療の拠点であるが，多数の重症心不全患者を目の前に置換型治療の限界と再生型治療の必要性を痛感し, 自己骨格筋由来の筋芽細胞シートによる心筋再生治療法を開発し, 補助人工心臓離脱成功例を世界で初めて報告した. さらに 20 例以上の臨床例の経験から細胞シート移植技術を確立し，企業治験が開始され橋渡し研究を成功させるに至った (Figure 1)．また，本細胞シートによる心不全治療は，シートから分泌される様々なサイトカインによる血管新生, 抗線維化作用による作用であることを突き止めた.
1. 心不全に対する細胞治療の発展一細胞シート技術の開発

重症心不全の治癒という目標を達成するためには，細胞治療の基礎技術をさらに発展する必要がある. 細胞治療に重要な不全心への細胞供給システムの問題を解決すべく, 我々は温度応答性培養皿 ${ }^{1}$ を用いて, 細胞シートを作成し, この組織体を心藏へ移植することにより，細胞を供給するという新しい供給システムを開発した。

これまで, 細胞を組織化して移植する方法は主に,人工的な scaffold に細胞を組み込む方法が考案されていたが，温度応答性培養皿による本法は，人工的 scaffold を用いない唯一の方法であり，組織を構築している細胞・細胞外基質はすべて自己生体組織由来であり，細胞と細胞間，移植組織とレシピエント間の接着蛋白の発現は維持されており, 生体適合性の高い組織体であることが種々の基礎研究から証明されている。

我々はまず，ラット新生仔より単離した心筋細胞を，温度応答性培養皿を用いて培養し，細胞シートを作成した.シート状になった心筋細胞を $20^{\circ} \mathrm{C}$ にて剝し，これを二枚重ねて重層化し，障害心の心外膜側に移植した。重層化した心筋細胞シートは homogeneous な 3 次元構造を持ち, connexin 43 の発現および心筋細胞シート間の電気的結合を有し，自己拍

Figure 1 Progress of our translational research. これまでの本研究の成果.
動能を示した. この心筋細胞シートをラット梗塞心の心臟表面に貼付したところ, 心筋細胞シートは心臟表面に接着し, 梗塞心の機能改善を認めた22。

我々はさらにヒト臨床に応用可能な細胞源として, 新生仔由来ではなく, 自己骨格筋由来の筋芽細胞を用いた筋芽細胞シートの作成と評価を行った.

ラットを用いて, 骨格筋由来筋芽細胞を単離し, 筋芽細胞シートを作成し, ラット梗塞心，拡張型心筋症ハムスター4)に移植した. その結果, 従来の注射針を用いた細胞移植法と比較して, 組織・機能において，有意な改善が起こることを報告した. さらに，大動物心不全モデルとして, イヌ拡張型心筋症モデ $ル^{5)}$, およびブ夕慢性心筋梗塞モデル゙年作成し, 筋芽細胞シートを移植し, 長期にわたる心機能改善効果を確認するとともに, 本治療法の安全性を確認した。本研究にあたっては, 死亡率が少なく重症の慢性期ブタ心筋梗塞モデルを開発・作成した ${ }^{7)}$.また, 細胞シート移植治療は左心不全のみならず, 右心不全にも有効性があることが示唆されだと同時に, 心不全治療における既存の外科術式である左室形成術と組み合わせることにより, 左室の再拡大が抑制されることを小動物モデルによって証明しだ．また筋芽細胞シートで治療した不全心には, 弾性の高い elastin が豊富に産生されており, これらの弾性緎維が心機能を改善させることが予測されたため, 筋芽細胞に elastinを遺伝子導入し, シート化・移植したところ, 同遺伝子導入細胞シートはより有効な心機能改善効果があることも示された ${ }^{10}$.

## 2. 筋芽細胞シートの心不全に対する機能改善の

## メカニズム

上記の動物実験と並行して, 我々は筋芽細胞シー トの心不全に対する心機能向上効果に関するメカニズムを解明すべく，基礎的研究を行った．元来筋芽細胞は, 骨格筋が損傷した際に, 基底膜に存在する筋芽細胞が活性化され, 細胞が增殖・分化し, 最終的には, 久損した骨格筋を補うことが知られている。筋芽細胞を心臟に移植した際，筋芽細胞は心筋新生仔由来の心筋細胞とは異なり, 心筋特有の収縮蛋白を発現することはなく, また connexin 43 も発現しないため, 電気的にレシピエント心と隔絶されて心臟内に存在し, レシピエント心と同期して拍動することはない. 我々は, 筋芽細胞シートの効果のメカニズムは，移植した細胞より遊離される様々なサイトカインによる作用であると考え, ラット慢性期心筋梗塞モデルに筋芽細胞シートを移植し, 移植され
た心臟組織の growth factor の発現を網羅的に解析したところ, 肝細胞増殖因子 (hepatocyte growth factor：HGF)，血管内皮増殖因子 (vascular endothelial growth factor: VEGF), ストロマ細胞由来因子 1 (stromal cell-derived factor-1 :SDF-1)，インスリン様成長因子 I (insulin-like growth factor I：IGF1)の発現が特に向上していることを見出しだ .この蛋白の発現は, 移植される筋芽細胞シートの枚数に比例して, 向上することを確認している ${ }^{11}$. さらに,本蛋白がどこから産生されているか検討したとこ万, 外来より移植された筋芽細胞よりこれらの蛋白が分泌されていることが判明した. また, 組織学的検討の結果, シート移植された心臟では, $\alpha$-smooth muscle actin 陽性の細胞が多量に移植部位に存在し, 同細胞は myosin heavy chain 陰性の細胞で, 筋芽細胞の特徴を有していないことが判明している. また, HGF, VEGF 等の作用だけではなく, シートを移植した部位に, residual stem cell と呼ばれる心筋幹細胞が多数集積していることが観察されだ3. 同細胞は, 心筋がダメージを受けた際に，損傷部位に集積し, 分化して心筋細胞特有骨格蛋白を発現し,損失した心筋細胞補填にあたっていることが知られている。細胞シートは, このように内因性の心筋再生メカニズムを惹起し(Figure 2), 拡張型心筋症の犬モデルを用いた前臨床試験において，リバースリモデリングをおこすことが観察され゙(Figure 3)，心機能向上効果の一因と考えている.

## 3. 細胞シート治療法の臨床研究および医師主導型治験への発展

1）人工心臟を装着した拡張型心筋症患者に対する筋芽細胞シート移植治療

これらの基礎実験をもとに, 左室人工心臟を装着している拡張型心筋症患者に対する自己筋芽細胞シート移植の臨床研究について, 本学倫理委員会未来医療センターに承認を受け（UMIN 試験 ID： UMIN000000660), 2007 年に臨床研究を開始した (Figure 4). 第 1 例目において, 人工心臟や筋芽細胞シートによる集学的治療により, 心機能の改善を認め, 最終的には左室補助人工心臟からの離脱に成功し, 元気に退院した ${ }^{12)}$. 本症例においては, 人工心臟の持つ “Bridge to Recovery” 効果と筋芽細胞シートの持つ心筋賦活効果の両者の作用であると考えている。また, 人工心臟を装着した 3 例の患者に筋芽細胞シートを移植したところ, うち 2 名において, 左室収縮能の改善, 左室のリバースリモデリングを認

血管新生

## C-kit陽性細胞

幹細胞集積

壁厚の肥厚

Figure 2 Mechanism of myocardial recovery. 予測される心筋組織修復のメカニズム. VEGF, vascular endothelial growth factor; bFGF, basic fibroblast growth factor; HGF, hepatocyte growth factor; FGF, fibroblast growth factor; SDF-1, stromal derived factor-1; BMMNC, bone marrow mononuclear cell.

Figure 3 Reverse remodeling in dilated cardiomyopathy: Pre clinical trial. 拡張型心筋症の前臨床試験で観察されたリバースリモデリング.

め, 最終的に内 1 名が人工心藏から離脱した. 本治療法にて人工心藏から離脱した患者は 2 名であるが, 離脱後 6 年を経過した時点で, 心不全兆候を認めず，自宅にて療養しており，仕事に復帰している。離脱できなかった 2 症例は, 最終的に心藏移植を行ったが，本治療を行った 4 症例の心筋組織を用いて, 血管密度を解析したところ, いずれの症例の血管密度も向上しており, 非臨床研究で得た結果との相同性が認められた。

Figure 4 Myocardial regeneration therapy with myoblast sheet for patients with left ventricular assist system. 左室補助人工心臟装着患者に対する筋芽細胞シートによる心筋再生治療.

LVAS, left ventricular assist system.

Figure 5 Clinical results in each treatment for severe heart failure. 重症心不全に対する各種治療成績.

ISHLT, International Society for Heart \& Lung Transplantation; LV, left ventricular; LVAD, left ventricular assist device.

2) 人工心臟を装着していない拡張型心筋症患者,虚血性心筋症患者に対する筋芽細胞シート移植治療我々は，人工心臟を装着していない拡張型心筋症および虚血性心筋症患者 50 名以上に対して, 自己筋芽細胞シートを移植し，本治療法の安全性・認容性を確認した. 現在のところ，筋芽細胞シートに関連
した重篤な有害事象を認めず，安全性を確認できている. また, 一部の患者において, 左室収縮能の改善, 臨床症状の改善が得られており, シートを移植した患者の予測生命予後は, 左室形成を受けた患者と比較して良好であった (Figure 5). また, 本治療法は, 多施設にて企業治験を 7 例に行い (Figure 6),

Figure 6 Change in cardiac contraction by echocardiography. 心エコー検查による心機能 (LVEF) の変化の推移. LVEF, left ventricular ejection fraction.

Figure 7 Relationship between LVEF and LVESVI (Reverse-remodeling). LVEF と LVESVIとの関係（リバースリモデリング).

LVEF, left ventricular ejection fraction; LVESVI, left ventricular end systolic volume index.

安全性が検証された ${ }^{13}$. 特に, Figure 7 のごとく左室駆出率 (left ventricular ejection fraction：LVEF) と左室収縮終（末）期容積指数（left ventricular end systolic volume index：LVESVI）の術前後の関係から, 7 例中 5 例にリバースリモデリングが観察され, レスポンダーにおいては有効であることが治験例からも示唆された. これらのデータを元に, 薬事申請が行われ, 2016 年に保険償還された.この背景には, 2014 年に薬事法の改正, すなわち医薬品, 医療機器等の品質, 有効性及び安全性の確保等に関する法律 (薬機法)が制定され，その中に再生医療の審査承認についての章立てが書かれており，その新しい規制である, 条件期限付き承認のもとに保険診療が開始されている。ただし, 重要なのは, この条件期限付き承認の後の市販後調査における有効性の検証であり, 現在 5 年間に 60 例の検証が行われている.この結果を基に本格的承認が行われる。この規制は，世界に類無き日本が最先端の法律として，世界から高い評価を受けているが，この法律が本格的に運用されて多くの再生医療製品が承認され，日本から世界に発信されることが期待される。

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\text { まとめ }
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自己筋芽細胞シートによる心筋再生治療は, 医薬品と異なり, また医療機器の臨床研究や治験に近く, 1 例ごとの有効性の確認が大変重要である. しかし, これまでの詳細な検討において，リバースリモデリングが観察される症例を経験し, さらなる検証が必要であるものの, 従来の医薬品や医療機器に加えて,新たな心不全治療法としてその展開が期待される.

したがって「細胞シートでリモデリングを治せるか？」という命題に対しては, Yes と答えうる可能性が示唆された。

利益相反 (COI) :

テルモ株式会社との共同研究講座，奖学寄附金の受入れ.

## 文 献

1) Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A et al: Twodimensional manipulation of cardiac myocyte sheets utilizing temperature-responsive culture dishes augments the pulsatile amplitude. Tissue Eng 7 (2): 141-151, 2001

2) Miyagawa S, Sawa Y, Sakakida S et al: Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: their integration with recipient myocardium. Transplantation 80 (11): 1586-1595, 2005

3) Memon IA, Sawa Y, Fukushima $\mathbf{N}$ et al: Repair of impaired myocardium by means of implantation of engineered autologous myoblast sheets. J Thorac Cardiovasc Surg 130 (5): 1333-1341, 2005

4) Kondoh H, Sawa Y, Miyagawa S et al: Longer preservation of cardiac performance by sheetshaped myoblast implantation in dilated cardiomyopathic hamsters. Cardiovasc Res 69 (2): 466475, 2006

5) Hata H, Matsumiya G, Miyagawa S et al: Grafted skeletal myoblast sheets attenuate myocardial remodeling in pacing-induced canine heart failure model. J Thorac Cardiovasc Surg 132 (4): 918-924, 2006

6) Miyagawa S, Saito A, Sakaguchi $T$ et al: Impaired myocardium regeneration with skeletal cell sheets-a preclinical trial for tissue-engineered regeneration therapy. Transplantation 90 (4): 364-372, 2010

7) Shudo Y, Miyagawa S, Fukushima S et al: Establishing new porcine ischemic cardiomyopathy model by transcatheter ischemia-reperfusion of the entire left coronary artery system for preclinical experimental studies. Transplantation 92 (7): e34-e

## 35, 2011

8) Hoashi T, Matsumiya G, Miyagawa S et al: Skeletal myoblast sheet transplantation improves the diastolic function of a pressure-overloaded right heart. J Thorac Cardiovasc Surg 138 (2): 460-467, 2009

9) Saito S, Miyagawa S, Sakaguchi T et al: Myoblast sheet can prevent the impairment of cardiac diastolic function and late remodeling after left ventricular restoration in ischemic cardiomyopathy. Transplantation 93 (11): 1108-1115, 2012

10) Uchinaka A, Kawaguchi N, Hamada $Y$ et al: Transplantation of elastin-secreting myoblast sheets improves cardiac function in infarcted rat heart. Mol Cell Biochem 368 (1-2): 203-214, 2012
11) Sekiya N, Matsumiya G, Miyagawa S et al: Layered implantation of myoblast sheets attenuates adverse cardiac remodeling of the infarcted heart. J Thorac Cardiovasc Surg 138 (4): 985-993, 2009

12) Sawa Y, Miyagawa S, Sakaguchi T et al: Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg Today 42 (2): 181184, 2012

13) Sawa Y, Yoshikawa Y, Toda K et al: Safety and efficacy of autologous skeletal myoblast sheets (TCD-51073) for the treatment of severe chronic heart failure due to ischemic heart disease. Circ J 79 (5): 991-999, 2015