# 【資料論文】
## 薬剤耐性菌を含む微生物 27 種 104 株に対する 市販エタノール消毒剤の消毒効果*

\author{
Effect of Commercially Available Ethanol-based Hand Sanitizers on Disinfection \\ against 104 Strains of 27 Microorganisms including Antimicrobial Resistant Bacteria
}

\author{
伊藤淑貴**, 秋冨名子***, 浅岡健太郎***, 山本哲司***, 矢野剛久** \\ Yoshitaka ITO, Meiko AKITOMI, Kentarou ASAOKA, \\ Tetsuji YAMAMOTO and Takehisa YANO
}

\begin{abstract}
Disinfection of hands and environmental surfaces is considered to be one of the most effective means to reduce the risk of contact infection of drug-resistant microorganisms. Commercial ethanol-based hand disinfectants often contain not only ethanol but also various additives, and the effects of these additives on the disinfection efficacy against drug-resistant microorganisms are not fully understood. In this report, we demonstrate that five commercially available ethanol-based hand sanitizers are effective against various strains for standard test methods, antimicrobial-resistant ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, $\underline{K l}$ lebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, $\underline{P}$ seudomonas aeruginosa, and Enterobacter species) strains, and their sensitive strains. These results suggest the use of the hand sanitizers would reduce the risk of infection of drug-resistant microorganisms.
\end{abstract}

Key Words: antimicrobial resistance (AMR), hand sanitizer, hand disinfectants

## 1. はじめに

薬剤耐性菌は，人類が直面する世界的な公衆衛生上の脅威の一つである。2019年の薬剂耐性菌に起因する死亡者数は世界で約127万人 (Murray et al., 2022) で, この数はAIDS 関連の約69万人 (UNAIDS, 2020)，マラリアの約41万人（WHO，2020）を上回っている。国内においてもメチシリン耐性黄色ブドウ球菌及びフルオロキノロン耐性大腸菌による死者数は 2017 年で年間約 8,000 人とされている等 (Tsuzuki et al., 2020), 大きな社会的課題となっている。薬剤耐性菌には様々な感染経路が考えられるが，特に保菌者からの直接的な接触感染や，保菌者から環境中に伝播し, 環境中で生残した微生物による間接的な接触感染は重要である。このような経路を介した感染リスクを低下させる手段の一つとして，手指や環境表面の消毒が有効だと考えられる。

$60 \mathrm{vol} \%$ 以上の濃度のエタノール $(\mathrm{EtOH})$ はこうした微生物の消毒に有効であると言われている (CDC, 2008)。一方で生活者が手に取る市販の $\mathrm{EtOH}$ 消毒剤には EtOHに加えて他の殺菌剤や保湿剂, $\mathrm{pH}$ 調整剂などの様々な化合物が含有されている。例えば4級アンモニウムである塩化ベンザルコニウムや塩化ベンゼトニウムは $60 \mathrm{vol} \%$


EtOHに配合すると，EtOHを単独で作用させたときに比べてより生残菌数を減少させるとの報告がある (Shintre et al., 2006)。一方で保湿剤として使用されるグリセリンはEtOHの最小発育阻止濃度を上昇させる，即ち抗菌作用を低下させるとの報告がある (Mazzola et al., 2009)。また, 微生物は様々な機序で薬剤耐性を発現するのに対し，市販の $\mathrm{EtOH}$ 消毒剂の多くは一部の微生物でしかその消毒効果が確認されていない。加えて, 微生物の消毒剤への耐性化や，その耐性菌の抗菌薬耐性との交叉耐性に関する文献が散見されており（Kim et al., 2018), 微生物との接触時間が極端に短い手指消毒剤のような EtOH 消毒剤が様々な菌に有効かどうか不明である。以上を踏まえると， EtOH 消毒剤を薬剤耐性菌に適用するにあたり，幅広い薬剤耐性菌並びにその感受性菌を対象に, EtOH 以外に様々な成分を含有する各製品を個別評価し，その消毒効果を把握することが肝要である。 そこで本研究では, これまで主にウイルスを対象に同様の試験を行った（山本ら，2023）5 種類の市販 EtOH 消毒剤について, 特にその制御の重要性が指摘されている薬剤耐性菌並びにその感受性菌，そしてFDA-TFM（FDA，1994）にて医療用消毒剤の試験菌として挙げられている菌株を対象に消毒効果を評価した。即ち, 参考試験基準の範囲内において，それぞれの菌株に最適な実験条件を逐一検討し, 妥当性を確認した上で殺菌性試験を実施した。

## 2. 方法

市販 EtOH 消毒剤には，製剤 $\mathrm{A}$ (ハンドスキッシュ $\mathrm{EX})$ ，製剤 $\mathrm{B}$ (ハンドスキッシュ)，製剤 $\mathrm{C}(ソ$ フティハンドクリーン手指消毒液)，製剤 $\mathrm{D}$ (ソフティハンドクリーン手指消毒ジェル), 製剤 $\mathrm{E}$ （EX-CARE手指消毒ジェル）を用いた（いずれも花王プロフェッショナル・サービス)。詳細な成分を Table 1 に示す。

殺菌試験は医療分野での消毒剂製品の殺菌活性を評価する為の試験である BS EN 13727:2012 + A2:2015 （BSI, 2015）を参考に実施した。試験菌株は薬剤耐性菌株並びにその感受性菌株，BS EN 13727 に記載の試験菌株, FDA-TFMにて医療用消毒剤の試験菌として挙げられている菌株 (FDA, 1994) について, Table 2 に示す細菌 25 種 102 株, 真菌 2 種 2株を用いた。このうち薬剂耐性菌株はATCC (American Type Culture Collection) が定める Multidrug Resistant Panel より, Vancomycin Resistant Enterococci Microbial Panel (ATCC MP-1 ${ }^{\mathrm{TM}}$ ) 19 株, SCCmec Type MRSA Panel (ATCC MP-2 ${ }^{\mathrm{TM}}$ ) 7 株, Pulsed-Field Type MRSA Panel (ATCC MP- $3^{\text {TM }}$ ) 10 株, NDM-1 Panel (ATCC MP-18 ${ }^{\mathrm{TM}}$ ) 6株, KPC Strains Panel (ATCC MP-24 ${ }^{\mathrm{TM}}$ ) 4 株, Drug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Panel (ATCC MP-23 ${ }^{\mathrm{TM}}$ ) 中 ATCC-BAA-2112を除く6株, ATCCの薬剤耐性菌カタログ（ATCC，2022）に記載の Acinetobacter baumannii 13 株, 岐阜大学微生物遺伝資源保存センターより分譲された多剂耐性緑膿菌 4 株の計 69 株を用いた。

Table 1 Ingredients of five commercial hand sanitizers

 \\

各菌株の懸濁液は寒天培地（Streptococcus pneumoniae, Str. pyrogenes, Bacteroides fragilis は羊血液寒天培地（日水製薬）, Escherichia coli NBRC 11229, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis は Nutrient寒天培地 (Solabia Biokar Diagnostics), Haemophilus influenzaeは3.6\% GC 基礎培地，1\% Bovine Hemoglobin, 1\% IsoVitaleX (以上, Becton, Dickinson and Company) 含有寒天培地, Candida albicans, C. glabrata $\mathrm{YM}$ 寒天培地 (Becton, Dickinson and Company), Enterococcus faecalis NBRC 100482 は MRS 寒天培地（Solabia Biokar Diagnostics), En. faecium NBRC 113009 は 4\% Tryptic soy agar (Merck Millipore), 0.3\% Yeast extract (MP Biomedicals) 含有寒天培地, 他は全て $\mathrm{SCD}$ 寒天培地（日水製薬））にて 18～24 時間培養して得られたコロニーから調製した。即ち，コロニーを $\varphi=4 \mathrm{~mm}$ ガラスビーズと $0.1 \%$ トリプトン含有生理食塩水（以下，希鄱液と記載）で懸濁して得られた懸濁液を，遠沈管にてキュートミキサー（EYELA，CM-1000）を用いて $1,800 \mathrm{rpm}$ 3〜5分攪汼した。得られた菌懸濁液は $1.5 \times 10^{8}$ $\mathrm{cfu} / \mathrm{mL}$ 以上になるよう，希釈液を用いて ODを調整した。

殺菌作用については，菌の懸濁液に消毒製剂を暴露後，培養液で希釈して消毒製剤の作用を弱め (不活化), 生残した菌を所定の培養時間経過後に各培地上に斑点状に形成されるコロニー数を数えて評価した。具体的には，ODを調整した菌懸濁液と $0.3 \%$ BSA fraction V (富士フイルム和光純薬)水溶液，各試験製剤（全て混合直前まで $20^{\circ} \mathrm{C}$ に静置）を $1: 1: 8$ の割合で混合し室温で 10 秒ボルテックスした。この際, Enterococcus属細菌を対象とした場合は菌体同士の凝集を示唆する報告 （池，2017; Hällgren et al., 2009）を考慮し, 試験製剂と菌体との均一な混和を目的に菌懸濁液と BSA を混合した後, 再度 5 秒ボルテックスして菌体を十分に分散させた直後，各試験製剤を添加して 10 秒ボルテックスした。次に，手指消毒操作にて試験製剂と手指とが接触する時間を考慮し，試験製剂と接触後 15 秒経過時に合わせて, この混合液を9倍量のSCDLP培地（塩谷エムエス）に添加して反応停止後，各菌株の培養時に用いたものと同様の寒天培地に $100 \mu \mathrm{L}$ 塗抹し, C. albicansは $24^{\circ} \mathrm{C}$, C. glabrata, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus NBRC 13276, Sta. epidermidis, Sta. saprophyticus, Acinetobacter haemolyticus, Serratia marcescens,
Pseudomonas aeruginosa NBRC 13736 は $30^{\circ} \mathrm{C}$, その他は $37^{\circ} \mathrm{C}$ の温度条件で， $20 \sim 48$ 時間培養後にコロニー数を測定した。M. luteusをハンドスキッシュ EXと接触させた場合のみ，反応停止剤としてSCDLP培地の代わりにSCD 培地, $2 \%$ 大豆由来レシチン， $14 \%$ ポリソルベート $80,1 \%$ スラミンナトリウム（以上，富士フイルム和光純薬）の混合液を用いた。

本試験の対照群は菌の懸濁液を消毒製剂へ暴露させず培養液で希釈し，所定の培養時間経過後にコロニーが多数形成されることを観察して，消毒製剤の効力と培養自体が成功していることを確認することを目的に行った。具体的には，調製した菌懸濁液を希釈液で $10^{6}$ 倍希釈し $100 \mu \mathrm{L}$ を各寒天培地へ 2 枚ずつ塗抹し， $20 \sim 48$ 時間培養して得られたコロニー数の平均値から対照生菌数を算出した。殺菌活性値は対照生菌数と各試験製剂処理時に得られたコロニー数の $\log$ 値の差とした。各試験製剤処理時に生残菌数が少なくコロニーが得られなかった際は, 本試験系の検出下限値である $3 \log (\mathrm{cfu} / \mathrm{mL})$ として殺菌活性値を算出した。試験は全て $\mathrm{N}=3$ で実施し，その平均值を示した。消毒製剤を培養液で希釈後に菌の懸濁液へ暴露させ, 所定の培養時間経過後にコロニーが相当数形成されることを観察して，消毒製剤の作用は希釈により減弱または喪失（不活化）することを確認する試験, 即ち不活化試験は全試験菌株を対象に実施した。混合直前まで $20^{\circ} \mathrm{C}$ に静置した希釈液， $0.3 \%$ BSA水溶液, 各試験製剤を $1: 1: 8$ の割合で混合し, 8 倍量のSCDLP培地を添加して $20^{\circ} \mathrm{C} て ゙ 5$ 分静置した。この混合液に, 各菌懸濁液を希釈液で $10^{5}$ 倍希釈したものを $1 / 9$ 倍量添加し, $20^{\circ} \mathrm{C}$ で $30 \sim 60$ 分静置後, 各菌株の培養時に用いたものと同様の寒天培地に塗抹し, $37^{\circ} \mathrm{C}, 24 \sim 48$ 時間培養後にコロニー数を測定した。BS EN 13727 の判定基準に基づき，コロニー数が対照と比較して $1 / 2$ 以上であれば各試験製剤が不活化できたとした。尚，M. luteusをハンドスキッシュ EXと接触させた場合のみ, 各試験製剂処理時と同様の反応停止剤を用いて実施した。

## 3. 結果

5 種類の市販 EtOH 消毒剤の各菌株に対する消毒効果を Table 2 に示す。いずれの菌株に関しても消毒剤との混合前に $8 \log (\mathrm{cfu} / \mathrm{mL})$ 以上の菌数があった一方， 15 秒間の暴露において生残菌数
伊藤ら：薬剤耐性菌を含吉微生物 27 種 104 株に対する市販エタノール消毒剤の消毒効果

Table 2 Antibacterial and antifungal activity of five commercial hand sanitizers

} & \multicolumn{5}{|c|}{ b殺菌活性値 } \\

Table 2 Continued

} & \multicolumn{5}{|c|}{$\mathrm{b}$ 殺菌活性値 } \\

a) TS: Type Strain(基準株)，薬剤感受性菌株として使用。ARB: Antimicrobial Resistance Bacteria(薬剤耐性菌), EN: EN13727に記載の試験菌株，FDA: FDA-TFMにて医療用消毒剤の試験菌として挙げられている菌株

b) 単位 : $\log (\mathrm{cfu} / \mathrm{mL})$

が検出下限以下となった。また, 各試験製剤の不活化試験の結果，不活化後の製剤と接触した後のコロニー数は，調製した菌液のコロニー数と比較して，全ての菌株において $1 / 2$ 以上たっった（data not shown)。

## 4. 考察

微生物を消毒する手法の一つとして日常的に使用される EtOH 消毒剤は，薬剤耐性菌並びにその感受性菌に対して幅広く適用できることが望ましい。そこで本研究では, EtOH 消毒剤の適用範囲について, EtOH 以外に様々な成分を含有した消毒剤を用いて検証した。その結果，評価した 5 種類の市販 EtOH 消毒剤全てにおいて, 試験した薬剂耐性菌株とその感受性菌株, BS EN 13727 の試験菌株, FDA-TFM $の$ 医療用消毒剤の試験菌株全てに対し, BS EN 13727 が抗菌効果の有無を判断する基準として定める $5 \log (\mathrm{cfu} / \mathrm{mL})$ 以上の菌数減少が見られたことから, 試験に供した EtOH 製剂は薬剂耐性菌, 感受性菌に関わらず試験に供した全ての菌株で消毒効果があると考えられ，本消毒剤を利用すれば懸念すべきリスクレベル未満に管理できる可能性が考えられた。我々が知る限りこれほど多菌種に対して消毒効果を検証した例はなく, EtOH消毒剤を用いた消毒の適用範囲が様々な菌種で示唆された本報告の意義は大きい。加えて, 本研究では EtOHそのものではなく, 実際の病院や介護施設で使用される製剤を対象に評価した。こうした製剂は，EtOH 消毒剤の頻回使用により懸念される肌荒れを保護する保湿成分等が含まれていることから，消毒動作の徹底に繋がり，ひいては感染リスクの低減に繋がると考えられる。

院内感染を引き起こす主要な薬剂耐性菌として提起された”ESKAPE”と呼称される菌種 (Rice, 2008) について, 本研究では EtOH 消毒剤の有効性を確認できた。ESKAPEはWHOが定めた priority pathogens list (WHO, 2017) において, 最も優先して取り組むべき “Critical”のリストを網羅し，一部はその次に取り組むべき“High”のリストに該当することからも制御対象として非常に重要であると言える。一方，例えばクラリスロマイシン耐性 Helicobacter pylori, フルオロキノロン耐性 Campylobacter属細菌などはこのリストにおいて “High”に該当し, 他にも人類の健康上の脅威とされる菌種がある。更に薬剤耐性菌は細菌だけでな
く真菌も注視する必要がある。即ち, 本報告では Candida 属真菌 (C. albicans, C. glabrata) を対象とした消毒効果を確認しており, 真菌への EtOH 消毒剤の有効性が示唆されたものの, この2菌種の薬剤耐性菌株への消毒効果は試験できていない。 こうした多様な薬剤耐性菌に対して, 引き続き緻密にデータを蓄積しEtOH 消毒剤の消毒効果を検証する取り組みは, 薬剤耐性菌の感染リスク低減効果を精緻に理解する上で重要だと考えられる。

COVID-19のパンデミック以降, EtOH 消毒剤は病院や介護施設のみならず, 飲食店, 一般小売店, 各種レジャー施設など様々な場面において広く使用されるようになった。本報告では一般消費者が日常で使用する場面を想定して反応時間を 15 秒に設定したが，実際にはより短い時間で処理されている可能性も考えられる。また, 手指の細かい凹凸構造に関する物理的要因や, 汗や皮脂などの分泌物，加えて様々な物と接触することによる付着物などに関する化学的要因が消毒効果に与える影響は不明な点が多い。今後このような実使用場面を想定しながら EtOH 消毒剤の適用範囲を確認していくこともまた, EtOH 消毒剤の適切な運用を通した感染リスク低減に向けた重要な取り組みだと考えられる。

## 謝辞

本論文の作成にあたり, 査読者の先生から大変丁寧にご高覧頂き，有意義なご指摘を頂戴いたしました。お陰様で本論文を完成するに至りました事を心より御礼申し上げます。

## 参考文献

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