# 遺伝医学アップデート：基礎医学から臨床現場まで

（2）脳動脈瘤の感受性遺伝子の解析

東京女子医科大学総合医科学研究所
東京女子医科大学足立医療センター脳神経外科
$\begin{array}{ll}\text { アカガワ } & \text { ヒロュキ }
\text { 赤川 浩之 }\end{array}$
}

（受理 2023 年 1 月 19 日）
## Genetic Medicine Update: From Basic Research to Clinical Care (2) Genetic Susceptibility to Intracranial Aneurysms

\author{
Hiroyuki Akagawa \\ Institute for Comprehensive Medical Sciences, Tokyo Women's Medical University, Tokyo, Japan \\ Department of Neurosurgery, Tokyo Women's Medical University Adachi Medical Center, Tokyo, Japan
}

Intracranial aneurysms (IA) cause subarachnoid hemorrhage (SAH), which has high mortality and morbidity rates when rupture occurs. The success of genome-wide association studies (GWASs) followed by phenotypic confirmation in transgenic mice has supported the implication of genetic factors in the formation of IA. For example, a Sox17-deficient mouse model was established based on previous GWAS findings, confirming the development of IA resulting in SAH following Sox17 deficiency. The most recent international GWAS identified over half of the disease heritability of IA, including 17 risk loci using more than ten thousand patients. The remaining proportion of heritability, the so-called missing heritability, can be explained by the effects of rare variants detected by next-generation sequencing (NGS). In this review, we discuss the current knowledge regarding genetic factors associated with IAs provided by GWAS and rare variant analysis using NGS.

Keywords: intracranial aneurysm, susceptibility gene, genome-wide association study, next-generation sequencing, rare variant

## はじめに

脳血管疾患は，1951 年より 1980 年まで本邦の死因の第 1 位であった。近年は肺炎や老衰の割合が増加して第 4 位とはなったものの, 依然として悪性新生物や心疾患と並び，我々の生命を脅かす主要な疾患の座にとどまり続けている¹).いわゆる“三大疾病” のうちの一つである.このうち特に死亡率が高いこ
とで知られているのがクモ膜下出血であり, そのおよそ $85 \%$ が脳動脈瘤の破裂に起因する ${ }^{2}$. 脳動脈瘤は, 他の多くの脳血管疾患と同様, 複数の遺伝的要因と環境要因が相互に作用して発症に関わる多因子疾患である。本邦では脳の画像検査を受けた人の 6〜7\% で診断される“ありふれた疾患 (common disease)”である ${ }^{3)}$. 危険因子（環境要因）として喫煙習

Corresponding Author: 赤川浩之 〒 162-8666 東京都新宿区河田町 8-1 東京女子医科大学総合医科学研究所 akagawa. hiroyuki@twmu.ac.jp

doi: $10.24488 /$ jtwmu.93.2_49

Copyright (C) 2023 Society of Tokyo Women's Medical University. This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution License (CC BY), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original source is properly credited.
慣と高血圧症が最も主要なものとして挙げられ，脳動脈瘤が診断された場合は禁煙と降圧療法が推奨される。一方，遺伝的要因は，しばしば聴取される家族歴によっても実感され， 1 親等以内の脳動脈瘤保有者の家族歴がクモ膜下出血をきたす危険因子ともなっている2).これを支持する定量的指標として，破裂脳動脈瘤によるクモ膜下出血患者の第 1 度近親者の相対危険率は 4 倍, 同胞の場合は相対危険率 6 倍と報告されている). さらに, 脳動脈瘤の遺伝的要因の証左として, 脳動脈瘤を合併する遺伝性疾患の存在も挙げられる。常染色体顕性多発性囊胞腎 (autosomal dominant polycystic kidney disease: ADPKD)，マルファン症候群，エーラス・ダンロス症候群など様々な遺伝性疾患との合併の報告があるが,このうち ADPKD が最も脳動脈瘤と関連がある遺伝性疾患であり，ADPKD 患者は一般人口に比し有意に脳動脈瘤保有率が高い (12.4\%) ことが示されている ${ }^{45)}$.このような遺伝的要因を背景にこれまで様々な遺伝子解析が行われてきたが，本稿では近年のハイスループット解析技術によりもたらされたゲノムワイド関連解析 (genome-wide association study：GWAS）の成果，そこから浮かび上がってきた課題と次世代シーケンシング解析による成果，そして今後の展望について概説する。

## ゲノムワイド関連解析（GWAS）

もはや多因子疾患の遺伝子解析ではゴールドス夕ンダードとして広く認知されている手法である。これまで様々な形質で実施されてきた 5,000 を超える研究が，米国立ヒトゲノム研究所と欧州バイオインフォマティクス研究所の共同運営によりGWAS Catalogueとしてデータベース化されている  ${ }^{6}$. 脳動脈瘤においては，2008 年に米国 Yale 大学を中心とした研究グループによって初めての GWAS が行われたて). 同グループはさらにサンプルサイズを増やした検討も継続し, 最終的にはヨーロッパ人や本学の日本人サンプルを含む患者 5,891 例と対照 14,181 例に及ぶ解析となっだ ${ }^{8}$. 再現性の高い主要な遺伝子として， CDKN2A-CDKN2B 遺伝子領域 $(9 \mathrm{p} 21.3 ; \mathrm{p}=1.5 \times$ $10^{22}$, オッズ比 1.31) やSOX17 遺伝子 (8q11.23$\mathrm{q} 12.1 ; \mathrm{p}=1.3 \times 10^{-12}$,オッズ比 1.28 ）などが特定されている。さらに同グループは，日本人患者に注目したサブ解析により，染色体 $4 \mathrm{q} 31.22-\mathrm{q} 31.23$ の EDNRA 遺伝子も特定した $\left(\mathrm{p}=2.2 \times 10^{-8}\right.$, オッズ比 $1.22)^{9}$.この ENDRA 遺伝子は後にバイオバンク・
ジャパンにより報告されたGWAS（日本人患者 1,048 例, 対象 7,212 例）によっても再現性をもって検出されている $\left(\mathrm{p}=9.6 \times 10^{-9}\right.$, オッズ比 1.25$)($ Table 1 ${ }^{10}$. GWAS の隆盛とともにデー夕解析に係る遺伝統計学的手法も洗練されていった. 世界の様々な人種における一塩基多型 (single nucleotide polymorphisms : SNPs) や連鎖不平衡地図のデータベー スも整備され，SNPアレイのデータから実際にはジェノタイピングされていない SNPS 遺伝子型を高精度に決定することも定型的に行われている（imputation 法).これによりプラットフォームの異なる SNPアレイで取得したデータを無駄なく統合することが可能となり, GWAS は多数の研究機関が参画する大規模メ夕解析へと発展していった. 脳動脈瘤では 2020 年に国際脑卒中遺伝学コンソーシアムや本邦のバイオバンク・ジャパンなど多数の研究機関が参画した大規模解析の結果が報告された。患者 10,754 例と対照 306,882 例に及ぶ解析がなされ, 前述の CDKN2A-CDKN2B 遺伝子領域, SOX17 遺伝子や EDNRA 遺伝子の関連が再現されたほかに 14 種の遺伝子が検出され,これら合計 17 種の遺伝子で脳動脈瘤の遺伝力 (heritability) の搞よそ半分を説明できる成果となった ${ }^{11}$. 本稿では再現性, 日本人患者の解析, そして機能解析の有無という観点で前述から例示している代表的な 3 種の遺伝子領域を染色体番号順に取り上げて解説する。

## 1. EDNRA (4q31.22-q31.23)

日本人患者に注目した 2 つの別個な研究で再現性をもって検出された座位である ${ }^{910)}$. 関連 SNP は EDNRA 遺伝子上流の発現調節領域に位置している. 塩基置換によりDNA 結合蛋白との親和性が変化し, 遺伝子発現を減弱させることも示されている $^{10}$. EDNRA は血管平滑筋に発現する $\mathrm{A}$ 型エンドセリン受容体をコードしている。リガンドであるエンドセリンは強力な血管収縮因子として生理的機能を担う一方で, 高血圧症やアテローム性動脈硬化などの発症にも深く関与している ${ }^{122}$. エンドセリン経路の抑制は血管壁修復作用を抑制するといわれており，A 型エンドセリン受容体の拮抗薬を投与した動物モデルでは，冠動脈に動脈瘤様の変化が起きることも報告されているる ${ }^{1314)}$

## 2. $\operatorname{SOX17(8 \mathrm{q} 11.23)$}

SOX17 は SOX [sex-determining region Y (SRY)related high mobility group (HMG) box] 遺伝子ファミリーに属する転写因子である。 マウス Sox17 は胎

Table 1. A summary of previous genome-wide association studies of intracranial aneurysms.

 & Locus &  & Gene &  & $\mathrm{p}$-value \\

CI, confidence interval; NA, not available.

子および成体の動脈血管内皮細胞に強く発現しており，血管構築やその維持に重要な役割を果たしていることが知られている ${ }^{15}$. GWAS の結果を受けて血管内皮細胞特異的なSox17 久失マウスが樹立され，高血圧ストレス下において脳動脈瘤が形成されることが確認されている ${ }^{16}$.

## 3. CDKN2A-CDKN2B 遺伝子領域 (9p21.3)

癌抑制遺伝子としてよく知られる $C D K N 2 B$ および CDKN2A 遺伝子のテロメア側近傍に存在する領域である. GWAS 黎明期より 2 型糖尿病, 心筋梗塞や腹部大動脈瘤など複数の多因子疾患との関連が相次いで報告された興味深い座位である。 その後の研究で, $C D K N 2 B, C D K N 2 A$ 遺伝子の発現調節に関与している non-coding RNA である CDKN2BAS 遺伝子(別名 antisense non-coding RNA in the INK4 locus：ANRIL)に相当することが明らかにされだを.17188.相同領域を欠失させたマウスでは, 大動脈平滑筋細胞の Cdkn2a, Cdkn2bの発現が減少し細胞増殖が元進することが確認されている ${ }^{19}$.

## 次世代シーケンシング（NGS）による レアバリアント解析

遺伝力 heritability のかなりの部分を特定できたのはGWASによる大きな成果である。かねてより想定されていた病態（血管平滑筋細胞や内皮細胞の障害）と矛盾しない遺伝子が捉えられ，さらには SOX17のようにGWAS で同定された感受性遺伝子の改変によって脳動脈瘤モデル動物も確立されるに至った ${ }^{16}$. しかしその一方で, 大規模 GWASによっても検出しえない遺伝力, いわゆる“missing heritability”の存在が強く認識されるようになった20).

GWASでは一般人口での対立遺伝子頻度が高い SNPs が解析対象となるため, 統計学的に強固な感受性 SNPs が特定されてもその効果サイズは小さい

(Figure 1). Table 1 でも示した通り脳動脈瘤ではオッズ比にして1.2 1.36 程度である. 多型よりも低頻度のバリアント（対立遺伝子頻度 $0.5 \%$ に満たないレアバリアント）に効果サイズの高い未知の遺伝要因が存在すると考えられてきたが，次世代シーケンシング (next-generation sequencing：NGS) の登場

Modified from Manolio TA, et al. Nature. 2009;641:747-53, and Tsuji S, et al. Hum Mol Genet. 2010;19:R65-70.

Figure 1. Risk allele frequency and strength of genetic effect.

GWAS, genome-wide association study; SNPs, single nucleotide polymorphisms.

Figure 2. Japanese multiplex families with intracranial aneurysms.

によりこのような疾患感受性レアバリアントの探索が可能な時代が到来した ${ }^{21)}$ レアバリアントが関連する感受性遺伝子では，種類が異なる複数の病因性レアバリアントが総和として患者群に多く観察されるというパターンが最も想定されるが, 疾患発症に対して中立のレアバリアントやプロテクティブに働くレアバリアントも存在するため, GWAS とは異なる特別な遺伝統計学的アプローチも必要となる22).以下に我々が報告したレアバリアント関連解析を実例として紹介する。

我々は脳動脈瘤患者のゲノム DNA サンプリングに際し, 特に第 1 度近親者に家族歴を有する家族性脳動脈瘤患者に注目して血縁罹患者の収集に努めてきた。 そのなかで 3 世代にわたって 7 人の患者を生じた大家系 F2054 に注目し (Figure 2), 世代 III の 6 姉妹および世代 IV で生じた患者の計 7 例で全エクソーム・シーケンシングを実施した．有害なレアバリアントが罹患者 4 人で共有される候補遺伝子が 7 個検出されたが，そのうち特にバリアントの有害度の指標が最も高かったNPNT (Nephronectin) と CBY2 (Chibby family member 2) 遺伝子に着目した (Table 2).NPNT は細胞外マトリクスのネフロネクチンをコードし，インテグリン $\alpha 8 /$ $\beta 1$ の機能的なリガンドとして腎臟の発達に欠かせ

Table 2. Overview of seven representative candidate genes identified from the F2054 family.

} & \multirow{2}{*}{} & \multicolumn{7}{|c|}{ Genotype } & \multirow{2}{*}{} & \multirow{2}{*}{} \\

IBD segment, identity by descent segments were calculated from the SNP array data using Beagle version 3.3; CADD, C-scores of the combined annotation dependent depletion version 1.2. None of the listed variants was observed in our 105 Japanese populationbased controls.

Figure 3. Minigene splicing assay of the c.1515+1G>A variant in NPNT.

ないほか, いくつかのインテグリンを結びつけて細胞接着にも関与する. NPNT の異常は血管内皮機能に影響し, 正常な血管新生が阻害されることも報告
されている ${ }^{23}$. 今回 NPNT で検出されたスプライスドナー部位 c. $1515+1 \mathrm{G}>\mathrm{A}$ を minigene assay で解析したところ，異常なスプライシングを引き起こし

Peripheral cerebral artery

## Ruptured cerebral aneurysmal wall

Figure 4. Immunohistochemical analysis of cerebral arterial specimens. HE, hematoxylin eosin.

て第 10 エクソン全体の skipping をきたすことが確認された(Figure 3)。一方, CBY2 は遺伝子発現デー タベースによれば，主に精巣で発現し，次いで脳でも発現が見られることが示されていた。しかし，これまでにヒトの疾患との関わりが全く報告されておらず疾患遺伝子としては新規分子であったため, ょり詳細に検討を行った. 免疫組織学的検討では脳血管平滑筋に発現しており (Figure 4), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) によっても isoform 2 特異的に脳血管平滑筋細胞に発現していることを確認した. CBY2 に赤色蛍光タグを付加して COS7 細胞に強制発現させたところ，患者から検出されたミスセンス変異 p.Pro83Thrでは細胞質内での異常凝集が観察された (Figure 5). 立体構造解析ではアミノ酸置換により周辺の $\beta$ シー 卜構造が伸長して凝集モチーフを獲得するとの計算結果が得られ，培養細胞実験結果を支持した。この p.Pro83Thr バリアントは他の脳動脈瘤家系 F2012 からも検出されていたため (Figure 2), 追加脳動脈瘤患者 499 例, 対照 323 例を用いて CBY2 全域のリ
シーケンシングを行った. その結果, 3 種類の有害なレアバリアント (p.Arg46His, p.Pro83Thr, p.Leu $183 \mathrm{Arg}$ ）が患者特有に検出され有意な関連を示した (患者合計 $8 / 501$, 対照合計 $0 / 323, p=0.026$ ) (Table 3)，以上より，脳動脈瘤家系 F2054 では新規感受性遺伝子 NPNT と CBY2 のレアバリアントが，それぞれ脳血管内皮および平滑筋細胞の機能障害を惹起して脳動脈瘤の発生に寄与したと考えられた，家族性脳動脈瘤は同一家系であっても複数の遺伝要因で発症し, その遺伝背景は多様で家系によって大いに異なることも示唆された24.

このような NGSを用いたレアバリアント解析は欧米からの研究報告も散見されており，もやもや病の感受性遺伝子として知られる RNF213 遺伝子や循環血管新生誘導因子をコードする ANGPTL6 遺伝子のレアバリアントとの関連などが報告されてい $る^{2526)}$. 互いに検証し合いながら知見を蓄積していくことが重要である.

## おわりに

多因子疾患では大規模 GWAS が進み，特定され

A

Figure 5. Immunofluorescence imaging of CBY2-expressing COS7 cells.

Table 3. Association analysis with rare sequence variants in $C B Y 2$.

} & \multirow[b]{2}{*}{} & \multirow[b]{2}{*}{} & \multicolumn{3}{|c|}{ No. of detected subjects } & \multirow[b]{2}{*}{ SIFT } & \multirow[b]{2}{*}{} \\

Burden association tests were performed using a two-tailed Fisher's exact test.

た多数の遺伝要因を使って個人の疾患リスクをスコア化 (polygenic risk score : PRS) する研究が精力的に進められている。個人のゲノム情報は生涯不変のため, 算出された PRS も不変であり, 様々な生活習慣病に対する易罹患性予測や薬剤効果，副作用予測に大きな効果が期待できる。予測により早期に行動変容すれば疾患発症を阻止，遅延させうることもできるだろう。より高精度な PRS を構築するために， さらに大規模な GWAS（100万人规模）を目指す考えや，レアバリアント情報を組み达む取り組みも行われている ${ }^{2728)}$. 今後の動向を注視したい.開示すべき利益相反はない。

$
\text { 文献 }
$

1）厚生労働省政策統括官（統計 - 情報政策担当）編.我が国の人口動態平成 28 年までの動向 [インター ネット]. 東京; 厚生労働統計協会 : 2018[Accessed January 23, 2023]. Available from: https://www. mhlw.go.jp/toukei/list/d1/81-la2.pdf.

2）脳卒中治療ガイドライン策定委員会編. 脳卒中治療ガイドライン 2015. 東京；協和企画：2015.366p.

3) Akagawa H, Tajima A, Sakamoto Y, et al. A haplotype spanning two genes, ELN and LIMK1, decreases their transcripts and confers susceptibility to intracranial aneurysms. Hum Mol Genet. 2006; 15

(10): 1722-34.

4）恩田英明，米山琢，赤川浩之ほか. 脳動脈瘤の遺伝子解析. BRAIN and NERVE. 2008; 60 (11): 124560.

5）広田健吾, 赤川浩之，糟谷英俊 ; 井川房夫，森田明夫編. 脳動脈瘤の遺伝解析。未破裂脳動脈瘤 Japan standard. 東京; 中外医学社：2015. p.40-6.

6) Buniello A, MacArthur JAL, Cerezo M, et al. The NHGRI-EBI GWAS Catalog of published genomewide association studies, targeted arrays and summary statistics 2019. Nucleic Acids Res. 2019; 47 (D1): D1005-12.

7) Bilguvar K, Yasuno K, Niemelä M, et al. Susceptibility loci for intracranial aneurysm in European and Japanese populations. Nat Genet. 2008; 40: 1472-7.

8) Yasuno K, Bilguvar K, Bijlenga P, et al. Genomewide association study of intracranial aneurysm identifies three new risk loci. Nat Genet. 2010; 42 (5): 420-5.

9) Yasuno K, Bakırcıoğlu M, Low SK, et al. Common variant near the endothelin receptor type A (EDNRA) gene is associated with intracranial aneurysm risk. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108 (49): 19707-12.

10) Low SK, Takahashi A, Cha PC, et al. Genomewide association study for intracranial aneurysm in the Japanese population identifies three candidate susceptible loci and a functional genetic variant at EDNRA. Hum Mol Genet. 2012; 21 (9): 2102-10.

11) Bakker MK, van der Spek RAA, van Rheenen W, et al. Genome-wide association study of intracranial aneurysms identifies 17 risk loci and genetic overlap with clinical risk factors. Nat Genet. 2020; 52 (12): 1303-13.

12) Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature. 1988; 332 (6163): 411-5.

13) Stephan-Gueldner M, Inomata A. Coronary arterial lesions induced by endothelin antagonists. Toxicol Lett. 2000; 112-113: 531-5.

14) Wang $X$, Douglas SA, Louden C, et al. Expression of endothelin-1, endothelin-3, endothelin-converting enzyme-1, and endothelin-A and endothelin-B receptor mRNA after angioplasty-induced neointimal formation in the rat. Circ Res. 1996; 78 (2): 322-8.

15) Corada M, Orsenigo F, Morini MF, et al. Sox 17 is indispensable for acquisition and maintenance of ar- terial identity. Nat Commun. 2013; 4: 2609.

16) Lee S, Kim IK, Ahn JS, et al. Deficiency of endothelium-specific transcription factor Sox17 induces intracranial aneurysm. Circulation. 2015; 131 (11): 995-1005.

17) Foroud T, Koller DL, Lai D, et al. Genome-wide association study of intracranial aneurysms confirms role of Anril and SOX 17 in disease risk. Stroke. 2012; 43 (11): 2846-52.

18) Hashikata H, Liu W, Inoue K, et al. Confirmation of an association of single-nucleotide polymorphism rs1333040 on 9p21 with familial and sporadic intracranial aneurysms in Japanese patients. Stroke. 2010; 41 (6): 1138-44.

19) Visel A, Zhu Y, May D, et al. Targeted deletion of the 9 p 21 non-coding coronary artery disease risk interval in mice. Nature. 2010; 464 (7287): 409-12.

20) Manolio TA, Collins FS, Cox NJ, et al. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 2009; 461 (7265): 747-53.

21) Tsuji S. Genetics of neurodegenerative diseases: insights from high-throughput resequencing. Hum Mol Genet. 2010; 19 (R1): R65-70.

22) Lee S, Abecasis GR, Boehnke M, et al. Rarevariant association analysis: study designs and statistical tests. Am J Hum Genet. 2014; 95 (1): 5-23.

23) Kuek V, Yang Z, Chim SM, et al. NPNT is expressed by osteoblasts and mediates angiogenesis via the activation of extracellular signal-regulated kinase. Sci Rep. 2016; 6: 36210.

24) Maegawa T, Akagawa H, Onda H, et al. Wholeexome sequencing in a Japanese multiplex family identifies new susceptibility genes for intracranial aneurysms. PLoS One. 2022; 17 (3): e0265359.

25) Zhou S, Ambalavanan A, Rochefort D, et al. RNF 213 is associated with intracranial aneurysms in the French-Canadian population. Am J Hum Genet. 2016; 99 (5): 1072-85.

26) Bourcier R, Le Scouarnec S, Bonnaud S, et al. Rare coding variants in ANGPTL 6 are associated with familial forms of intracranial aneurysm. Am J Hum Genet. 2018; 102 (1): 133-41.

27）尾崎浩一. 生活習慣病の遺伝因子群とポリジェニックリスクスコア. 現代医学. 2021; 68 (1): 22-7.

28) Dornbos P, Koesterer R, Ruttenburg A, et al. A combined polygenic score of 21,293 rare and 22 common variants improves diabetes diagnosis based on hemoglobin A1C levels. Nat Genet. 2022; 54 (11): 1609-14.