# 遺伝医学アップデート：基礎医学から臨床現場まで
## (4) Genome Wide Association Study および Polygenic Risk Score の

## 基礎と臨床への応用

## 東京女子医科大学医学部内科学講座膠原病リウマチ内科学分野

（受理 2023 年 3 月 28 日）

## Genetic Medicine Update: From Basic Research to Clinical Care \\ (4) Basics and Clinical Applications of the Genome Wide Association Study and the Polygenic Risk Score

\author{
Suguru Honda and Masayoshi Harigai \\ Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, \\ Tokyo Women's Medical University School of Medicine, Tokyo, Japan
}

Genome wide association study (GWAS) is a type of genetic analysis that looks for association between a particular disease or trait and single nucleotide polymorphism (SNP). The polygenic risk score is the sum of the number of risk alleles weighted the GWAS-estimated effect sizes of each SNP on a disease. Researchers have been exploring the use of polygenic risk score (PRS) to predict disease risk and personalize treatment plans, an approach known as precision medicine. Our study was the first to demonstrate that a PRS based on GWAS data for rheumatoid arthritis (RA) onset can also predict joint damage progression. In particular, we found that the PRS is more accurate for predicting joint damage progression in young-onset patients with RA. To facilitate large-scale validation of our findings, we developed an artificial intelligence-based joint damage scoring system. This system will enable us to further investigate the relationship between PRS and disease severity in a larger, more diverse population. Further research is needed to refine the PRS construction method, particularly in terms of identifying the most informative SNPs and optimizing the weighting scheme for risk alleles.

Keywords: genome wide association study, polygenic risk score, rheumatoid arthritis, precision medicine, joint destruction

## はじめに

2002 年に理化学研究所が約 2,000 人による心筋梗塞発症に対するゲノムワイド関連解析 (genome wide association study：GWAS）を世界で最初に報

冠動脈疾患 ${ }^{4}$, アルツハイマー病 ${ }^{5}$, うつ病, 心的外傷後ストレス障害 (PTSD) などの精神疾患において,百万人を超える規模の疾患発症に対する GWAS が

報告され，次々と新たなリスクバリアントが同定されている。さらに, GWAS の結果を用いて, 各個人の遺伝因子の積み重なりを量的に評価して患者を層別化し, precision medicineへ展開するということが試みられている. Polygenic risk score (PRS) と呼ばれるこの手法は, 2009 年に Purcell らが統合失調

発症リスクの高い患者や病勢の進行するリスクの高い患者の同定などに応用されてきた。本稿では，まず GWAS と PRS の解析手法について概説し, 当科の行った関節リウマチにおける関節破壊と PRS の研究について述べる。

## GWAS について

ある形質と関連するゲノム上の遺伝子の存在部位を探索する手法には，連鎖解析と関連解析がある。連鎖解析は, 同一染色体上にある 2 つの遺伝子座は,家系内では独立した分離が認められないこと，すなわち連鎖を利用して行われる。連鎖解析は，家系情報が得られるメンデル型遺伝病には非常に有効である。一方, 多遺伝子疾患の場合は, 単一の遺伝子の変異により発症するのではなく, エフェクト（ある変異と疾患との関連の程度, 効果量）の弱い変異の積み重なりが発症と関連する。このため検出力は低く, エフェクトを持つ変異は広範に分布するため,連鎖解析によってそれらの存在部位を同定することが困難である。一方，関連解析は，まず家系情報を必要としない点が連鎖解析と異なる点である. さらに関連解析は候補遺伝子アプローチと網羅的アプローチに分かれ，前者は既報の研究などにより事前に候補となる遺伝子の情報を必要とするが，GWAS を含む網羅的アプローチは事前の情報を必要とせず，ゲノム全体に広範に分布する，弱いエフェクトの変異と疾患との関連を解析することができる。ただし，変異の持つエフェクトが弱い場合，検出力を上昇させるために，より大規模なサンプル数を必要とする.

GWAS は, 疾患発症群と対照群を集め, 2 群間での遺伝子型（genotype）頻度やアレル頻度が異なるかどうかを検定する，ケースコントロール関連解析である，実際には，年齢，性別などでバイアスを補正する目的で, single nucleotide polymorphism （SNP）と疾患感受性の関連を検定する場合はロジスティック回帰分析を, SNP と身長などの量的変数との関連を検定する場合は線形回帰分析を用いる. SNP に関しては事前に quality control (QC) により選別を行う. $\mathrm{QC}$ は膨大な数の遺伝子型タイピング (genotyping)の際に, どうしてもタイピングエラー が発生してしまうので，これを除外する目的で行われる. 具体的な方法においては本稿の範疇を超えるため, 詳細は割愛するが, マイナーアレル頻度 [minor allele frequency：MAF，ある集団の single nucleotide variant (SNV) の中で観察数の少ない塩基 (A, T, G, C)の頻度], Hardy-Weinberg 平衡, 各 SNP における genotyping の成功率などを用いて $\mathrm{QC}$ を行う．またサンプルについても同様に，各サンプルにおける genotyping の成功率から, 回収した DNA の質の低い症例を除外し, 近縁関係の近い症例は偽陽性, 偽陰性の原因となるため除外する（例えば, 症例発症群にある疾患を発症した家系が多く集まっていた場合, 関連解析を行うと, 疾患とは関係のないその家系特有の変異が為陽性として検出される可能性がある)。

GWAS は数十万の SNP について疾患との関連を検定するため, 多重比較の問題が生じる. 1 つの SNP と疾患との関連を検定する場合, 「このSNP と疾患は関連がない」という帰無仮説を立てる。対立仮説は「このSNP と疾患は関連がある」であり，帰無仮説が間違っていると説明できた（棄却した）場合に採択する。次に, 帰無仮説が正しいとしたときに, その観測データが得られる確率 $(\mathrm{p}$ 値) を計算する. そしてこの $\mathrm{p}$ 値が事前に決めておいた水準（有意水準）より小さい場合は，観測データが帰無分布から得られていたと考えるには低いために，帰無仮説が間違っていると考え，これを棄却する。統計で一般的に用いられる有意水準 $\alpha$ は $5 \%(\alpha=0.05)$ である.問題は，帰無仮説を棄却したにも関わらず，実は正しかったという場合もあり，これを第一種の過誤という. そして, 仮説検定の第一種の過誤の確率は有意水準 $\alpha$ の値に一致する。つまり 1 つの SNP と疾患との関連を検定して, 関連があると判断したにも関わらず，実は関連はなかったという確率は $5 \%$ である。もし 100 万個の SNP について有意水準 $\alpha$ を 0.05 として関連解析を行うと, 帰無仮説が正しく 100 万個の SNP すべてにおいて疾患と関連がないという仮定をしているにもかかわらず，このような SNP は $0.05 \times 100$ 万 $=5$ 万個も出現してしまう.この問題を避けるために, GWAS では Bonferroni の補正法を用いる。つまり，一般的に用いられる有意水準である 0.05 を GWAS で検定する SNP の数 $(50$万 100 万）で除算し， $0.05 / 50$ 万 $~ 100$ 万 $\doteqdot 5 \times 10^{-8}$

という有意水準 $\alpha$ を採用する。この水準を一般的にゲノムワイド有意水準という.

PRS について

それではゲノムワイド有意水準を満たさなかった SNP は本当にすべて疾患との関連がないのだろうか? 対立仮説が正しいのに, 誤って帰無仮説を棄却しない場合（すなわち本当はそのSNP と疾患が関連しているにも関わらず,このSNP と疾患は関連がないと判断してしまう場合）を第二種の過誤といい，

この確率を $\beta$ で表す. 第一種の過誤の確率と第二種の過誤の確率はトレードオフであり, Bonferroni の補正法は最も厳しい補正法であるため, $\beta$ は大きくなってしまう．このため, 特にサンプル数が少ないときには検出力（1- $\beta$ ）は小さくなり, 偽陰性が増えてしまう，実際に，ゲノムワイド有意水準を満た LたGWAS 疾患感受性SNP のみを用いて, 疾患発症に対する各個人の遺伝的素因を推定してみる。具体的には以下の式を用いて, genotype risk score （GRS）を計算する.

$
G R S=\sum_{i=1}^{n} \beta_{i} X_{i}
$

この式の $\beta$ はロジスティック回帰の偏回帰係数 $\beta$ である（第二種の過誤の確率 $\beta$ とは異なるので注意されたい)。そしてXi は推定対象の個人における genotype ( $\mathrm{Xi}=0,1,2)$ である. ヒトは一対の遺伝子を有するので, genotype は $0,1,2$ のいずれかをとる. $\mathrm{n}$ は上述のゲノムワイド有意水準 $\left(\mathrm{p}<5 \times 10^{-8}\right)$ を満たしたSNP の個数である。つまり，ゲノムワイド有意水準を満たしたSNPのみを用いて，GWAS で推定されたリスク（エフェクト）と推定対象の個人における genotype をかけ合わせて合計したものがGRSである。この GRS は疾患の遺伝的背景の一部しか説明できないことが知られており，このギャップは missing heritability と呼ばれる.

つぎに， $5 \times 10^{-8}$ よも緩い有意水準を採用し，同様の計算を行う．これがPRSである。計算式は以下の通りで先ほどと全く一緒であり，有意水準を緩めた分, 計算に使用するSNP の数が増えている.

$
P R S=\sum_{i=1}^{n} \beta_{i} X_{i}
$

これにより，多くの感受性 SNP が計算式に含まれ，ギャップが埋まり，発症予測精度が改善するということが知られている。このスコアを PRSという．ただし，常に多くのSNP を入れれば入れるほど改善するわけではなく, 形質によっては有意水準を緩め過ぎると疾患と関連のないSNP まで含まれ, 精度は下がってしまう。

実際の SNP の選択方法はもう少し複雑であり, 正則化という機械学習手法を用いてSNP を選択するというような, $\mathrm{p}$ 値を用いない手法もある. 本稿では, $\mathrm{p}$ 値と連鎖不平衡係数 (linkage disequilibrium coefficient：r2) を用 $いる \mathrm{LD}$ clumping \& Pthreshold 法について解説する. SNPの選択を $\mathrm{p}$ 値のみで行わないのは，アレル間が独立でない場合が多いためである。この状態を連鎖不平衡と呼ぶ. 連鎖不平衡係数は近接する SNP の genotype がどの程度似通っているかを示す指標であり，0１までの値を取り，0なら互いに完全に独立であり，1なら互いに完全に非独立である。LD clumping\&Pthreshold 法は, 最初にこの連鎖不平衡係数を使って，連鎖不平衡関係にあるSNP を一つにまとめて (LD clumping), 次に緩い有意水準を使って,この水準以下の SNP を削除する（P-threshold）方法である. Figure 1 では, まず physical distance threshold 内の最も GWAS の P 值が低い SNP ( 印)に着目する（図の縦軸は- $\log _{10}$ (p-value）であるため数值が高いほどGWAS の p 值が低いことに注意されたい).次にこの着目したSNP（`印）と $\mathrm{r} 2 \geqq 0.4$ の連鎖不平衡にある, physical distance threshold 内の SNP は消去され，1つのSNP（`印）にまとめられる (clumping). 残ったSNP の中で, 次に $\mathrm{p}$ 值の低かった SNP にも clumping が適用され, 同様に繰り返される。最後に，設定した $\mathrm{p}$ 値の閾値（図中の $\mathrm{P}-$ threshold）未満のSNP のみ（図ではとく）が PRS の計算に使用される (P-threshold).

## 関節リウマチにおける関節破壊と PRS について

ここまで, 主に疾患感受性 (発症)に対する GWAS および PRS の方法論について論じてきた. もちろん疾患発症に対してだけではなく, 疾患の活動性や治療反応性に対しても GWAS, PRS を行うことも可能であるが，これまでの報告された研究の規模は疾患感受性に対するGWAS の規模と比べて小さい。なぜなら疾患感受性と疾患活動性および治療反応性に対する解析では必要となるデータが異なるためである. 感受性に対する GWAS の場合は, 上述のように発症の有無, 遺伝子型 (genotype), 年齢と性別というデー夕を用いて解析される場合が多い（ただし家族歴を加えたり，環境因子との相互作用を見たりする場合もある). 疾患活動性や治療反応性などの表現型に対するGWAS の場合は当然治療薬，疾患活動

Figure 1. Selection of single nucleotide polymorphism (SNP) by linkage disequilibrium (LD) clumping and P-threshold.

To construct a polygenic risk score (PRS), first select SNPs necessary for the construction. In this paper, we use LD clumping and P-threshold, which are widely used SNP selection methods. For Figure 1, the shape of the SNP plot indicates the linkage disequilibrium coefficient (r2) for SNPs labeled with $\star$. The vertical axis represents the negative base 10 logarithm, and the horizontal axis indicates the physical position of the base pair. Thus, the SNP labelled with $\star$ is the top variant in the Genome Wide Association Study (GWAS) for this region. First, to perform LD clumping for the SNPs labeled with $\star$ in the figure, the clumping range is specified (physical distance threshold in the figure). Next, SNPs that are in high linkage disequilibrium within the specified clumping range are excluded. For instance, in the situation depicted in Figure 1, SNPs marked with $\square$ and $\boldsymbol{\Delta}$ are removed because their linkage disequilibrium coefficient (r2) is equal to or greater than 0.4 while SNPs labeled with $\star$, and $\square$ are retained (i.e., SNPs that have a low LD with $\star$, with an r2 of less than 0.4 are preserved as they are not closely correlated). This method is referred to as clumping as the SNPs in $\boldsymbol{\Delta}$ are merged into the SNP in $\star$ (as shown in Figure 1, right). The next step is to remove SNPs with a relationship of $\mathrm{r} 2 \geqq 0.4$ to the SNP of $\downarrow$, which has the next lowest p-value after $\star$, in the same way. Finally, the two SNPs marked with $\star$ and above the P-threshold line are retained for constructing the PRS.

性の指標, ベースラインの患者データなどが必要となるため, これらのデータを集めたコホートやデー タベースがなければこのような表現型に対する GWAS は施行できない。

一方で, 疾患活動性や治療反応性などの表現型に対する PRSに関しては，これらの表現型に対する GWAS だけではなく, 疾患感受性に対するGWAS から PRS を構築することもできる.この場合, 疾患感受性と関連する変異は疾患表現型とも関連するという仮定の下で検定を行う。筆者らのグループは，年に 2 回当科のコホートである IORRA から表現型の解析に必要なデータを収集しており，これを用いて疾患感受性 [関節リウマチ（rheumatoid arthritis: RA）発症］と関連するバリアントは疾患表現型（関節破壊の進行）とも関連することを報告したので，最後にこれを紹介する”。

## 1. 方法

この研究では PRS が重度関節破壊進行の予測因子であるかどうかを調べた。関節破壊の評価はRA の臨床試験で最もよく使われるスコアリング方法である van der Heijde modified Sharp score（SHS）を用いた. 重度関節破壊進行の定義は 5 年で $\Delta \mathrm{SHS}$ が 35 以上とし, それ未満を非重度関節破壊進行と定義した. PRS は 22,515 人のアジア人の GWASのエフェクトとRA 患者 1,240 人の遺伝子型 (genotype) をかけ合わせて構築した，具体的には，まず患者をトレーニングセット（n = 500）とテストセット（n $=740$ )にランダムに分割した. そして様々な $\mathrm{p}$ 值, およびr2を用いて SNP を選択して PRS を構築し，最も重度関節破壊進行に対する診断能の高い組み合わせを探索した。次にこの $\mathrm{p}$ 值と $\mathrm{r} 2$ を持つ最良の PRS がテストセットでも同様の診断能を持つかを確認した. なお, 複雑な LD 構造を有する HLA 領域の SNP を線形モデルである PRS にそのまま適用するかは議論の余地があり, 本研究では HLA 領域の SNP を除いて PRS を構築した. HLA 領域に関して

Table 1. Patients' characteristics.

はRA に最も関わりのある HLA-DRB1 領域の代表的なバリアントを同定し, 解析に用いた. IORRA コホート研究 (\#2952-R, \#2922-R16) およびその遺伝子研究 (217C) は, 東京女子医科大学倫理委員会の承認を得ており，各調査前にすべての患者からインフォームドコンセントを得ている。

## 2. 患者背景

Table 1 に患者背景を示す。平均発症年齢は 48.6 歳, 女性比率は $85.6 \%$, SHS 中央値は 16 であった.

## 3. PRS の構築と関節破壊進行の分類精度

トレーニングセットでのべストモデルは GWAS における SNP の $\mathrm{p}$ 值の閾値が $0.13, \mathrm{r} 2$ が 0.1 のモデルであった. PRSの分類精度は, receiver operating characteristic (ROC) 曲線から area under the curve （AUC)を算出して評価した. 重度進行群と非重度進行群を識別する AUC は，トレーニングセットで 0.589, テストセットで 0.556 であった. さらに患者を発症年齢に応じて 3 群 (若年発症; $\leqq 40$ 歳, 中年発症; $>40$ 歳, $\leqq 60$ 歳, 高齢発症; > 60 歳)に分けてさらに解析を行ったところ, 若年発症群では中高年発症群と比較して AUC が最も高くなった（トレー ニングセットの AUC：若年発症 0.659 , 中年発症 0.553 , 高齢発症 0.607 . テストセットの AUC：若年発症 0.662 , 中年発症 0.517 , 高齢発症 0.522 ).

## 4. PRS の分位数に基づく関節破壊進行の評価

次に，関節破壊進行群に分類されるリスクが PRS の値によりどのように異なるかを検討するため，患者を PRS の値に応じて 5 つに分けて解析を行った。全症例を用いて解析した場合は PRS が最も高い群は最も低い群と比べて，関節破壊進行群に分類され
るオッズが約 2 倍（トレーニングセット：1.90, テストセット：1.87)であったが，若年発症に限定して解析を行った場合は, 最も PRS が高い群は最も低い群と比べて, 関節破壊進行群に分類されるオッズが約 5 倍（トレーニングセット：5.06, テストセット： 6.29）となった. 中高年発症の患者にはこの傾向は認められなかった。

## 5. 多変量解析による PRS と関節破壊進行の関

## 連性の確認

最後にロジスティック回帰モデルを用いて，関節破壊進行の有無と PRS および他の因子との関連について多変量解析を実施した．全患者を含めた多変量解析では以下の因子が関節破壊進行に対する独立したリスク因子であった；PRS ( $\mathrm{p}=0.00019)$ ，性別 (女性) $(\mathrm{p}=0.0033)$, ACPAs $(\mathrm{p}=0.0023)$, bDMARDs $(\mathrm{p}=0.0082)$, HLA-DRB1 (Ser11) $(\mathrm{p}=$ 0.027), BMI（ $\mathrm{p}=0.024 ）$ (Table 2).このモデルの AUC は 0.648 であった. さらに発症年齢による層別解析を行ったところ, 若年発症群の AUC は中高年発症群よりも高い傾向にあったが（それぞれ 0.711 , $0.648,0.688)$, その差は統計的に有意ではなかった (若年発症 $v s$ 中高年発症 $: p=0.12$, 若年発症 $v s$ 高齢発症： $p=0.69)$.

## まとめ

GWAS およびPRS の構築手法を概説し，当科が行ったPRS 研究を紹介した。この研究は近年の GWAS の規模には及ばないものの, RA 発症に対する GWASを用いて構築された PRSが疾患表現型の一つであるSHSにも関連することを世界に先駆けて示した。さらに，今後SHSに対するGWASを行

Table 2. Multivariable analysis for radiographic progression with a logistic regression model.

い,これを使って PRS を構築するには膨大な関節レントゲンスコアデータが必要となる。このため昨年筆者らは関節破壊のスコアリングを自動化するため疊み达みニューラルネットワークを用いた AI（artificial intelligence）を開発しだ．．Ａを用いると，数万枚規模の読影でも数分で完了し，さらにそのスコアリングもばらつきはなく, データの質および量を向上させることができる. 現在, さらに関節レントゲンデータを増やし，またPRS 手法自体も改良するベく研究中である.

## 謝 辞 \\ 本研究は AMED 研究費 (JP21ek0410086) の助成を受 けている。

本論文に関して，開示すべき利益相反状態はない.

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\text { 文献 }
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