Kromatografi kolom
Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari campurannya. Metode ini sering digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Keuntungan utama kromatografi kolom adalah biaya yang rendah dan kemudahan membuang fasa diam yang telah digunakan. Kemudahan pembuangan fasa diam ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fasa diam akibat pemakaian ulang atau daur ulang.
Kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan diameter antara 5 mm hingga 50 mm dengan panjang 5 cm hingga 1 m dengan keran dan pengisi (dengan sumbat kaca atau serat kaca- untuk mencegah hilangnya fasa diam) pada bagian bawah. Dua metode yang umum digunakan untuk preparasi kolom adalah: metode kering dan metode basah. Komponen-komponen tunggal tertahan oleh fasa diam secara berbeda
satu sama lain pada saat mereka bergerak bersama eluen dengan laju yang berbeda melalui kolom. Di akhir kolom, mereka terelusi satu per satu. Selama keseluruhan proses kromatografi, eluen dikumpulkan sesuai fraksi-fraksinya. Fraksi-fraksi dapat dikumpulkan secara otomatis oleh pengumpul fraksi. Produktivitas kromatografi dapat ditingkatkan dengan menjalankan
beberapa kolom sekaligus. Di sini, diperlukan pengumpul multi aliran. Komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan masing-masing fraksi dianalisa senyawa terlarutnya, misalnya dengan kromatografi, absorpsi sinar UV atau fluoresensi. Senyawa berwarna (atau senyawa berfluoresensi di bawah lampu UV) dapat terlihat di dalam kolom sebagai pita-pita bergerak.
"Fasa diam" atau "adsorben" (penjerap) dalam kromatografi kolom adalah zat padat. Fasa diam yang paling umum untuk kromatografi kolom adalah silika gel, diikuti dengan alumina. Serbuk selulosa pernah banyak digunakan. Kromatografi kolom memungkinkan melakukan teknik kromatografi pertukaran ion, kromatografi fasa terbalik, kromatografi afinitas, atau
penjerapan bed ekspansi (). Fasa diam biasanya serbuk halus atau gel dan/atau mikropori untuk peningkatan permukaan, meskipun dalam EBA digunakan bed berfulida. Ada rasio penting antara berat fasa diam dan berat kering campuran analit yang dapat diaplikasikan ke dalam kolom. Untuk kolom silika, rasio berada antara 20:1 hingga 100:1, bergantung pada kedekatan jarak elusi antar komponen analit.
"Fasa gerak" atau "eluen" dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilai faktor retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0.2- 0.3 untuk meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga senyawa yang
berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya menggunakan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa gerak yang sama.
Ada laju aliran optimum untuk masing-masing pemisahan. Semakin cepat laju aliran eluen akan meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk melalui kolom sehingga meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi karena analit memerlukan waktu tertentu untuk berada pada kesetimbangan antara fasa diam-fasa gerak,
lihat persamaan Van Deemter. Kolom laboratorium sederhana bekerja dengan prinsip aliran gravitasi. Laju aliran kolom semacam ini dapat dinaikkan dengan menambah eluen baru di bagian atas fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah. Laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan (misalnya: udara, nitrogen, atau argon) untuk menekan pelarut melalui kolom (kromatografi kolom kilat).
Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom kilat biasanya lebih halus daripada kromatografi kolom gravitasi. Misalnya, silika gel untuk kromatografi kilat berukuran antara 230- 400 mesh (40- 63 m), sementara untuk kromatografi gravitasi antara 70- 230 mesh (63- 200 m).
Telah dikembangkan lembar lajur ("spreadsheet") yang mendukung suksesnya pengembangan kolom kilat. Lembar lajur memperkirakan volume retensi dan pita volume analit, jumlah fraksi yang diperkirakan untuk masing-masing kandungan analit, dan resolusi antara dua puncak yang berdekatan. Informasi ini memungkinkan pengguna memilih parameter optimal untuk pemisahan berskala preparatif sebelum dicobakan pada kolom kilat.
Kromatografi kolom adalah tahapan yang sangat memakan waktu dalam laboratorium apapun, dan dapat berubah menjadi suatu proses leher botol dalam sekejap. Oleh karenanya, beberapa pabrikan seperti Buchi, Interchim dan Teledyne Isco telah mengembangkan sistem otomasi kromatografi kilat (biasanya dirujuk sebagai KCTR, kromatografi cair tekanan rendah () dengan tekanan antara 350-525
kPa atau 50.8-76.1 psi, yang meminimalisir keterlibatan manusia dalam proses pemurnian. Sistem otomasi meliputi komponen-komponen yang secara normal ditemukan dalam sistem yang lebih mahal kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) seperti pompa gradien, port injeksi sampel, detektor UV, dan pengumpul fraksi untuk mengoleksi eluen. Biasanya, sistem otomatis ini dapat
memisahkan sampel mulai beberapa miligram hingga skala industri kilogram, dan menawarkan solusi yang lebih murah dan cepat untuk melakukan injeksi multipel pada sistem KCKT-preparasi.
Resolusi (kemampuan memisahkan campuran) pada sistem LPLC pasti lebih rendah daripada KCKT, karena bahan kemasan dalam kolom KCKT dapat lebih kecil, biasnya hanya 5 mikrometer sehingga meningkatkan luas permukaan fasa diam, meningkatkan luas permukaan interaksi dan pemisahan menjadi lebih baik. Namun, penggunaan media berkemasan kecil ini menyebabkan tekanan balik yang
tinggi dan itulah mengapa disebut kromatografi cair tekanan tinggi. Kolom LPLC biasanya dikemas dengan silika sekitar 50 mikrometer, sehingga mengurangi tekanan balik dan resolusi, tetapi juga menghilangkan kebutuhan pompa bertekanan tinggi yang mahal. Pabrikan juga sekrang mulai berpindah kepada sistem kromatografi kilat bertekanan tinggi dan memberinya nama sistem kromatografi cair tekanan menengah () yang beroperasi pada tekanan di atas 1 Mpa (150 psi).
Ada juga kromatografi kolom yang dilengkapi dengan pompa peristaltik, mengalirkan dapar dan larutan sampel melalui bagian atas kolom. Larutan dan dapar mengalir melalui kolom hingga mencapai pengumpul fraksi di bagian akhir kolom untuk mengumpulkan sampel yang terelusi. Sebelum mencapai pengumpul sampel, sampel yang dielusi dari kolom melewati suatu detektor seperti
spektrofotometer atau spektrometer massa sehingga konsentrasi sampel yang sudah dipisahkan dalam campuran dapat ditentukan.
Sebagai contoh, jika kita ingin memisahkan dua protein yang berbeda dengan kapasitas ikatan terhadap kolom yang berbeda dari suatu larutan, jenis detektor yang baik adalah spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm. Semakin tinggi konsentrasi protein yang melalui kolom, semakin besar absorbansinya pada panjang gelombang tersebut.
Oleh karena kromatografi kolom mempunyai aliran tetap untuk semua eluat yang melalui detektor dengan berbagai macam konsentrasi, harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi sampel terelusi melawan waktu. Plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut dengan kromatogram.
Tujuan utama kromatografi adalah untuk memisahkan komponen yang berbeda dari suatu campuran larutan. Resolusi menyatakan daya pemisahan antar komponen dalam campuran. Semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin baik pemisahan sampel yang dihasilkan oleh kolom. Data ini adalah cara terbaik menentukan sifat pemisahan kolom untuk sampel tertentu. Resolusi dapat dihitung dari kromatogram.
Kurva terpisah dalam diagram mewakili profil konsentrasi elusi sampel yang berbeda selama proses, berdasarkan afinitasnya terhadap resin kolom. Untuk menghitung resolusi, diperlukan waktu retensi dan lebar kurva.
Waktu retensi: waktu dari awal sinyal terdeteksi oleh detektor hingga titik puncak profil konsentrasi elusi masing-masing sampel yang berbeda.