Molecular beacon
Molecular beacon adalah oligonukleotida berbentuk tangkai melingkar yang dilabel dengan fluorophore dan quencher. Saat tidak ada gen target, tangkai akan menyatukan fluorophore dan quencher sehingga menghambat produksi sinyal fluoresensi. Saat probe molecular beacon berhibridisasi dengan sekuens gen target spesifik, tangkainya akan terpisah sehingga sinyal fluoresensi dapat dihasilkan oleh
fluorophore. Ikatan antara molecular beacon dan sekuens gen target bersifat sangat spesifik, dan hanya sekuens yang berpasangan sempurna dapat berhibridisasi dengan molecular beacon.
Pengembangan pendekatan baru untuk mendeteksi sel kanker adalah hal penting dalam memberikan penanganan dini bagi penderita kanker. Ekspresi gen yang abnormal merupakan ciri dari sel kanker. Maka diperlukan senyawa yang dapat mengenali gen abnormal tersebut sehingga dapat diketahui keberadaan sel kanker. Molecular beacon dapat digunakan untuk mengukur kuantitas mRNA. Sangat penting untuk mengetahui kuantitas ekspresi gen
karena banyak penanda atau marker dari sel kanker tidak bersifat unik dan juga ditemukan pada sel normal. Sehingga cara untuk membedakan suatu sel normal atau tidak adalah dengan mengukur jumlah ekspresi gen. Pada penelitian ini digunakan dua tipe molecular beacon untuk mendeteksi penanda ekspresi gen sel tumor, yaitu gen survivin dan cyclin D1 pada sel kanker payudara manusia. Molecular beacon kontrol
digunakan untuk mendeteksi gen gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase manusia. Setelah molecular beacon dicampur dengan beragam DNA target, maka akan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60 menit. Lalu intensitas fluoresensi diukur dengan fluorescence microplate reader.
Total RNA yang telah diisolasi akan diamplifikasi dengan metode RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) menggunakan enzim reverse transcriptase, sehingga didapatkan cDNA. Primer yang digunakan adalah primer forward dan reverse untuk setiap gen yang ingin didapatkan. Deteksi dari mRNA penanda tumor yang berbeda dapat diketahui secara bersamaan dengan pelabelan fluorophore yang berbeda jenis, pada molecular beacon survivin dilabel
dengan fluorophore hijau, dan pada cyclin D1 dilabel dengan fluorophore merah. Pewarna untuk fluorophore hijau adalah FITC, sedangkan pewarna fluorophore merah adalah Texas Red. Quencher yang digunakan adalah dabcyl. Untuk kontrol digunakan molecular beacon untuk mendeteksi ekspresi gen GAPDH. Pada sel kelenjar susu yang normal, sinyal fluoresensi untuk kedua gen tersebut sangat rendah,
sehingga probe untuk kedua gen ini dapat menjadi indikator dari keberadaan sel kanker payudara. Hasil dari ekspresi sinyal fluoresensi berkorelasi dengan ekspresi gen survivin dan cyclin D1.
Molecular beacon juga dapat mendeteksi ekspresi gen di jaringan kanker payudara yang dibekukan secara in situ. Artinya molecular beacon dapat digunakan untuk deteksi dini secara simpel dan cepat. Molecular beacon survivin ini juga dapat digunakan sebagai pemantauan real time untuk jumlah ekspresi gen survivin. Saat sel diinduksi oleh senyawa EGF atau docetaxel, maka ekspresi gen survivin akan meningkat. Ekspresi gen survivin akan
menurun saat ditekan oleh suppressor yaitu p53. Molecular beacon dapat mendeteksi perubahan ini dan intensitas fluoresensinya akan berubah sesuai peningkatan atau penurunan ekspresi gen. Metode deteksi ini dikonfirmasi dengan western blot untuk ekspresi protein survivin dan menunjukkan hasil yang sesuai dengan metode kuantifikasi molecular beacon.
Namun yang perlu menjadi perhatian khusus adalah pada transportasi molecular beacon yang tidak termodifikasi, dapat terjadi digesti oleh nuklease dari sel, atau interaksi nonspesifik antara molecular beacon, dan tangkai (stem) dari probe ini juga dapat terbuka oleh protein seluler, sehingga marker fluoresensinya bersifat nonspesifik. Akan tetapi, pada penelitian ini ditemukan hasil
yang menunjukkan bahwa intensitas fluoresensi tetap mampu menunjukkan perbedaan antara ekspresi gen sel kanker dan sel normal. Aplikasi lainnya adalah deteksi polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dan identifikasi serta diskriminasi alel.