Kromatografi fasa terbalik
Kromatografi fasa terbalik (English: "") atau kromatografi hidrofobik adalah metode kromatografi yang menggunakan fasa diam hidrofobik. RPC merujuk pada kromatografi cair, bukan kromatografi gas.
Istilah "fasa terbalik" mempunyai latar belakang sejarah. Pada tahun 1970an, sebagian besar kromatografi cair dilakukan menggunakan pendukung fasa diam (disebut juga dengan "kolom") berisi resin silika atau alumina yang tidak dimodifikasi. Metode ini disebut "kromatografi fasa normal". Pada kromatografi fasa normal, fasa diam adalah hidrofilik
sehingga mempunyai afinitas yang kuat terhadap molekul hidrofilik dalam fasa gerak. Oleh karena itu, molekul-molekul hidrofilik dalam fasa gerak cenderung untuk terikat (atau teradsorpsi) pada kolom, sementara molekul-molekul hidrofobik mengalir melalui kolom dan dielusi pertama kali. Dalam kromatografi fasa normal, molekul hidrofilik dapat dielusi dari kolom dengan menaikkan polaritas larutan dalam fasa gerak.
Teknik ini diperkenalkan menggunakan rantai alkil yang berikatan kovalen pada fasa pendukung, menciptakan fasa diam hidrofobik yang mempunyai afinitas yang lebih kuat terhadap senyawa-senyawa hidrofobik. Penggunaan fasa diam hidrofobik diperhitungkan sebagai lawan atau "kebalikan" dari kromatografi fasa normal, sehingga muncullah istilah "kromatografi
fasa terbalik". Kromatografi fasa terbalik melibatkan fasa gerak polar (aqueous). Akibatnya, molekul-molekul hidrofobik cenderung teradsorpsi pada fasa diam hidrofobik, dan molekul-molekul hidrofilik dalam fasa gerak akan melewati kolom dan terelusi lebih dulu. Molekul-molekul hidrofobik dapat dielusi dari kolom dengan menurunkan polaritas fasa gerak
menggunakan pelarut organik (non-polar), yang dapat mengurangi interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik suatu molekul, semakin kuat terikat pada fasa diam, dan semakin tinggi konsentrasi pelarut organik yang diperlukan untuk mengelusi molekul tersebut.
Banyak perhitungan matematis dan eksperimental yang digunakan dalam metode kromatografi lainnya juga diterapkan pada RPC (misal, resolusi pemisahan bergantung pada panjang kolom). Hal ini dapat digunakan untuk pemisahan molekul-molekul dengan variasi luas. Tetapi RPC tidak dapat digunakan untuk pemisahan protein, karena pelarut organik yang digunakan dalam RPC dapat mendenaturasi sebagian besar protein. Berdasarkan alasan inilah, kromatografi fasa normal lebih umum digunakan untuk pemisahan protein.
Saat ini, RPC merupakan teknik analisis yang sering digunakan. Tersedia berbagai macam fasa diam yang digunakan dalam RPC, memungkinkan fleksibilitas dalam pengembangan metode pemisahan.
Segala bahan non-polar inert yang dapat memenuhi syarat pengemasan dapat digunakan dalam kromatografi fasa terbalik. Kolom paling populer adalah rantai karbon oktadesil (C18) yang terikat pada silika (klasifikasi USP: L1). Tersedia 297 jenis kolom ini secara komersial. Urutan berikutnya adalah kolom Si-C8 (L7- 166 kolom), silika murni (L3- 88
kolom), Si-siano (L10- 73 kolom), dan Si-fenil (L11- 72 kolom). Perlu dicatat bahwa C18, C8 dan fenil adalah resin yang didedikasikan khusus untuk fasa terbalik, sementara kolom siano dapat digunakan dalam mode fasa terbalik tergantung pada kondisi fasa gerak dan analitnya. Perlu dicatat bahwa tidak semua kolom C18
mempunyai sifat retensi yang identik. Gugus fungsi pada permukaan silika dapat bekerja dalam reaksi monomerik maupun polimerik dengan organosilan rantai pendek yang digunakan dalam tahapan menutup gugus silanol ("end-capping"). Meskipun secara keseluruhan mekanisme retensinya tetap sama, sedikit perbedaan kimia permukaan untuk fasa diam yang berbeda akan membuat perubahan dalam selektivitasnya.
Kolom-kolom modern mempunyai polaritas yang berbeda-beda. PFP adalah pentafluorfenil. CN adalah siano. NH2 adalah amino. ODS adalah oktadesil atau C18. ODCN adalah kolom campuran yang berisi C18 dan nitril. SCX adalah.
Campuran air atau larutan penyangga dalam air dan pelarut organik digunakan untuk mengelusi analit dair kolom fasa terbalik. Pelarut harus dapat campur dengan air, dan pelarut organik yang umum digunakan adalah asetonitril, metanol, dan tetrahidrofuran (THF). Pelarut lain yang dapat digunakan antara lain etanol atau 2-propanol (isopropil alkohol). Elusi dilaukan secara isokratik
(komposisi air-pelarut tidak beruah selama proses pemisahan) atau menggunakan larutan gradien (komposisi air-pelarut berubah selama proses pemisahan, biasanya dengan menurunkan polaritas). pH fasa gerak memiliki peran penting dalam retensi analit dan selektivitasnya dapat diubah untuk analit-analit tertentu.
Analit bermuatan dapat dipisahkan dalam kolom fasa terbalik dengan menggunakan pasangan ion (disebut juga interaksi ion). Teknik ini dikenal sebagai kromatografi pasangan ion fasa terbalik.