Walt Disney
tidak menerima pengurangan biaya. Universal Studios, bukan Disney, memiliki "trademark" Oswald, dan dapat membuat film tanpa Disney. Disney menolak tawaran Mintz dan kehilangan banyak karyawannya.
Setelah ditinggalkan oleh karyawannya, Disney sekali lagi bekerja sendiri. Perlu waktu 78 tahun bagi perusahaan Disney untuk mendapatkan kembali hak karakter Oswald.
Setelah kehilangan hak milik Oswald, Disney merasakan perlunya mengembangkan karakter baru untuk menggantikannya. Ia mendapat ilham dari seekor tikus yang pernah dipeliharanya ketika bekerja di Kansas City Studio. Ub Iwerks mengerjakan ulang sketsa yang dibuat Disney agar lebih mudah dianimasi. Namun, suara dan karakter Miki dibuat oleh Disney. Menurut seorang karyawan Disney, "Ub melukis wajah Miki,
tetapi Walt memberikan jiwanya." Pada awalnya, tikus itu diberi nama "Mortimer", kemudian diganti menjadi "Miki Tikus" oleh Lillian Disney yang merasa nama Mortimer tidak sesuai.
Film animasi pendek pertama yang menampilkan Miki merupakan film bisu yang berjudul "Plane Crazy". Setelah gagal mendapatkan distributor untuk "Plane Crazy" atau "The Gallopin' Gaucho", Disney akhirnya membuat kartun dengan suara yang berjudul "Steamboat Willie". Disney lalu mulai merilis kartun melalui perusahaan seorang wiraswasta yang bernama Pat Powers. Akhirnya "Steamboat Willie" sukses, dan "Plane Crazy", "The Galloping Gaucho",
dan semua kartun Miki selanjutnya dirilis dengan "soundtrack". Disney sendiri mengisi menyediakan efek vokal untuk kartun-kartun awalnya dan mengisi suara Miki Tikus hingga tahun 1946. Setelah dirilisnya "Steamboat Willie", Walt Disney terus berhasil menggunakan suara pada kartun-kartun selanjutnya. Miki lalu mengalahkan Felix the Cat sebagai tokoh kartun paling populer di dunia. Pada
tahun 1930, Felix, walaupun bersuara juga, pudar dari latar karena film kartun bersuaranya gagal menarik perhatian. Popularitas Miki lalu meningkat tajam pada awal tahun 1930-an.
Mengikut jejak serial Miki Tikus, serial kartun musikal yang berjudul "Silly Symphonies" dirilis tahun 1929. Judul pertama dalam serial ini adalah "The Skeleton Dance", yang dilukis dan dianimasi sepenuhnya oleh Iwerks, yang juga melukis banyak kartun Disney pada tahun 1928 dan 1929. Walaupun kedua seri disambut baik, studio Disney berasa bahwa pembagian keuntungan dengan Pat Powers tidak adil. Pada tahun 1930, Disney menandatangani persetujuan distribusi baru dengan Columbia Pictures.
Iwerks terpikat oleh Powers agar membuka studio sendiri dengan kontrak eksklusif. Iwerks mengeluarkan seri "Flip the Frog" dengan kartun berwarna-nya "Fiddlesticks". Iwerks juga membuat dua seri kartun lain, yaitu "Willie Whopper" dan "Comicolor". Pada tahun 1936, Iwerks menutup studionya untuk bekerja dalam berbagai proyek yang berhubungan dengan teknologi animasi. Iwerks kembali ke Disney pada tahun 1940, lalu merintis beberapa proses film dan teknologi animasi khusus.
Pada tahun 1932, Miki Mouse menjadi watak yang populer, tetapi "Silly Symphonies" tidak sesukses Miki. Pada tahun yang sama, Disney bersaing dengan kartun Max Fleischer, Betty Boop, yang semakin populer di kalangan penonton. Fleischer dianggap sebagai pesaing utama Disney pada 1930-an, Sementara itu, Columbia Pictures berhenti mengedarkan kartun Disney dan digantikan oleh United Artists.
Pada akhir tahun 1932, Herbert Kalmus yang baru saja menyelesaikan kamera "three-strip technicolor", mendekati Walt dan meyakinkannya untuk membuat kembali film "Flowers and Trees" yang awalnya hitam putih menjadi "three-strip Technicolor". "Flowers and Trees" sukses dan memenangkan Academy Award for Best Short Subject: Cartoons tahun 1932. Setelah dirilisnya "Flowers and Trees", semua kartun "Silly Symphonies" selanjutnya
menjadi berwarna. Disney juga berhasil menegosiasikan persetujuan dua tahun dengan Technicolor, memberikannya hak untuk menggunakan "three-strip Technicolor". Melalui "Silly Symphonies", Disney juga membuat kartunnya yang paling sukses, "The Three Little Pigs", pada tahun 1933. Kartun ini ditayangkan di bioskop selama berbulan-bulan, dan juga menampilkan lagu "hit" yang menjadi lagu bagi Depresi Besar, yaitu "Who's Afraid of the Big Bad Wolf".
Setelah pembuatan dua seri kartun, Disney segera mulai merencanakan film fitur pada 1934. Ketika industri film mengetahui rencana Disney untuk mengadaptasi cerita Putih Salju menjadi film fitur animasi, mereka mentertawakan rencana Disney sebagai ""Disney's Folly"" (Kebodohan Disney) dan yakin bahwa proyek ini akan menghancurkan Disney. Lillian dan Roy juga membujuk Disney agar melupakan hasrat itu, namun Disney tetap ingin
melanjutkan usahanya. Ia mempekerjakan profesor Don Graham dari Chouinard Art Institute untuk memulai latihan untuk pekerja studio, berlandaskan "Silly Symphonies" sebagai platform untuk menguji animasi manusia realistik, animasi watak tersendiri, "special effect", dan penggunaan proses-proses dan peralatan khusus seperti kamera "multiplane".
Segala usaha pengembangan dan latihan ini digunakan untuk mengangkat mutu studio agar mampu memberikan mutu yang dikehendaki oleh Disney. Film yang berjudul "Snow White and the Seven Dwarfs" diproduksi dari tahun 1934 hingga pertengahan tahun 1937, ketika studionya kehabisan dana. Untuk mendapatkan pembiayaan untuk menyiapkan film "Snow White", Disney terpaksa meminjam di Bank of America, lalu berhasil mendapatkan
uang yang diperlukannya. Setelah disiapkan, film tersebut ditayangkan di "Carthay Circle Theater" pada 21 Desember 1937; pada akhir film, para penonton berdiri sambil memberikan tepuk tangan kepada "Snow White and the Seven Dwarfs". "Snow White", film animasi buatan Amerika Serikat dan Technicolor yang pertama, dirilis pada Februari 1938 setelah tercapainya persetujuan pengedaran baru dengan RKO Radio Pictures. Film ini menjadi film yang paling berhasil pada tahun 1938 setelah memperoleh lebih $8 juta dalam tayangan pertamanya.
Keberhasilan film "Snow White" memangkinkan Disney untuk membangun kampus baru bagi Walt Disney Studios di Burbank, yang dibuka pada 24 Desember 1939. "Snow White" bukan saja menandakan puncak keberhasilan Disney, tetapi juga memulai zaman yang dikenal sebagai Zaman Keemasan Animasi bagi Disney. Seluruh pekerja animasi film fitur, setelah menyiapkan film "Pinocchio", melanjutkan pekerjaan untuk film "Fantasia" dan "Bambi", serta tahap
awal produksi "Alice in Wonderland" dan "Peter Pan", sementara pekerja film pendek meneruskan pekerjaan mereka untuk kartun Miki, Donal, Gufi dan Pluto, sambil mengakhiri seri "Silly Symphonies". Animator Fred Moore mendesain ulang Miki Tikus pada akhir 1930-an, ketika Donal Bebek semakin populer di kalangan penonton dibanding Miki.
Film "Pinocchio" dan "Fantasia" mengikut jejak "Snow White and the Seven Dwarfs" ke bioskop pada tahun 1940, tetapi keduanya dalam hal keuntungan kurang memuaskan. Film "Dumbo" yang tidak terlalu mahal awalnya dirancang sebagai sumber pendapatan, tetapi ketika film ini diproduksi, banyak animator studio berdemo, lantas menegangkan hubungan antara Disney dan artisnya dalam jangka waktu yang lama.
Segera setelah dirilisnya "Dumbo" pada Oktober 1941, Amerika Serikat mulai terlibat dalam Perang Dunia II. Tentara AS mengkontrak banyak fasilitas studio Disney. Para pekerja studio membuat film pelatihan dan instruksi untuk militer, atau film pendek peningkat moral seperti "Der Fuehrer's Face". Namun, film militer tidak memberikan pendapatan.
Film fitur "Bambi" dirilis pada April 1942, dan Disney berhasil merilis kembali "Snow White" pada 1944. Pada tahun 1945, "The Three Caballeros" adalah film fitur animasi terakhir Disney yang dibuat pada masa perang.