Elizabeth I dari Inggris
Kejadian-kejadian ini membuat Mary dikalahkan dan dipenjara di Istana Loch Leven. Bangsawan-bangsawan Skotlandia memaksanya untuk mengundurkan diri dan membiarkan putranya James (yang lahir pada Juni 1566) naik takhta. James dibawa ke Istana Stirling untuk dibesarkan sebagai seorang Protestan. Mary melarikan diri dari Loch Leven pada tahun 1568, namun ia dikalahkan lagi sehingga melarikan diri ke Inggris
karena Elizabeth pernah menjanjikan dukungannya. Insting Elizabeth mengarahkannya untuk mengembalikan Mary ke takhta; namun, ia dan penasihatnya malah memilih bermain aman. Daripada berisiko mengembalikan Mary ke Skotlandia dengan tentara Inggris atau mengirimnya ke Perancis dan musuh-musuh Inggris yang beragama Katolik, mereka menahannya di Inggris dan memenjarakannya selama sembilan belas tahun berikutnya.
Mary segera menjadi sasaran pemberontakan. Pada tahun 1569, meletus pemberontakan Katolik di Utara; tujuannya adalah untuk membebaskan Mary, menikahkannya dengan Thomas Howard, Adipati Norfolk Keempat, dan menjadikannya Ratu Inggris. Setelah para pemberontak dikalahkan, lebih dari 750 di antaranya dihukum mati atas perintah Elizabeth. Karena percaya pemberontakan tersebut berhasil, Paus Pius V mengeluarkan
bulla kepausan pada tahun 1570 yang berjudul "Regnans in Excelsis", yang menyatakan bahwa "Elizabeth, Ratu Inggris palsu dan budak kejahatan" diekskomunikasi dan merupakan seorang pengikut ajaran sesat, sehingga semua bawahannya tidak harus patuh kepadanya. Orang Katolik yang mematuhi perintahnya diancam akan diekskomunikasi. Bulla kepausan tersebut
memprovokasi Parlemen untuk melancarkan inisiatif-inisiatif legislatif terhadap orang Katolik, yang kemudian dikurangi berkat campur tangan Elizabeth. Pada tahun 1581, upaya untuk membuat orang-orang Inggris menjadi Katolik dengan "maksud" untuk membuat mereka tidak patuh kepada Elizabeth dijadikan kejahatan yang dapat diganjar hukuman mati. Dari tahun 1570-an, misionaris-misionaris dari seminari
kontinental datang ke Inggris untuk "mengembalikan" Inggris ke iman Katolik secara rahasia. Banyak yang dihukum mati, sehingga memicu kultus kemartiran.
"Regnans in Excelsis" memberi insentif yang kuat bagi orang Katolik di Inggris untuk menganggap Mary Stuart sebagai penguasa Inggris yang sesungguhnya. Mungkin tidak semua persekongkolan Katolik diberitahukan kepada Mary, namun dari Persekongkolan Ridolfi pada tahun 1571 (yang membuat Adipati Norfolk kehilangan kepalanya) hingga Persekongkolan Babington pada tahun 1586, kepala mata-mata Elizabeth Sir Francis
Walsingham dan dewan kerajaan mengumpulkan bukti keterlibatannya. Awalnya, Elizabeth enggan menghukum mati Mary. Pada akhir tahun 1586, Elizabeth telah diyakinkan untuk menyetujui pengadilan dan penghukuman mati Mary berdasarkan bukti surat-surat yang ditulis selama Persekongkolan Babington. Berikut adalah proklamasi dakwaan Elizabeth: "Mary, yang mengklaim gelar takhta yang sama,
telah merencanakan dan membayangkan (...) hal-hal yang condong pada luka, kematian, dan kehancuran tokoh kerajaan kita." Maka, pada 8 Februari 1587, Mary dipancung di Istana Fotheringhay, Northamptonshire. Setelah Mary dihukum mati, Elizabeth mengklaim bahwa ia tidak memerintahkan hal tersebut dan sebagian besar catatan menunjukkan bahwa ia memberitahu Sekretaris Davidson, yang memberinya surat perintah
untuk ditandatangani, agar tidak mengirim surat perintah tersebut meskipun ia telah menandatanganinya. Kesungguhan penyesalan Elizabeth dan alasannya memberitahu Davidson untuk tidak melaksanakan surat perintah tersebut telah dipertanyakan oleh orang-orang semasanya dan sejarawan-sejarawan.
Kebijakan luar negeri Elizabeth sebagian besar bersifat defensif. Pengecualiannya adalah pendudukan Inggris di Le Havre dari Oktober 1562 hingga Juni 1563, yang berakhir dengan kegagalan karena sekutu Huguenot Elizabeth bergabung dengan orang Katolik untuk merebut kembali kota pelabuhan tersebut. Elizabeth sebelumnya bermaksud menukar Le Havre dengan Calais, yang direbut Perancis pada Januari 1558. Elizabeth hanya melancarkan kebijakan
agresif melalui armadanya, yang digunakan dalam perang melawan Spanyol, dengan 80% pertempuran berlangsung di laut. Ia memberikan gelar kesatria kepada Francis Drake setelah ia berhasil mengelilingi dunia dari tahun 1577 hingga 1580, dan Drake menjadi terkenal karena menyerang pelabuhan dan armada Spanyol. Pembajakan dan pemerkayaan diri pun menjadi pendorong bagi para pelaut pada masa Elizabeth, dan sang ratu hanya memiliki sedikit kendali atas mereka.
Setelah pendudukan dan lepasnya Le Havre pada 1562-1563, Elizabeth tidak melakukan ekspedisi militer di Benua Eropa hingga tahun 1585, ketika ia mengirim tentara Inggris untuk membantu pemberontak Belanda yang beragama Protestan dalam peperangan melawan Felipe II. Hal ini dilakukan setelah kematian Willem van Oranje dan François, Adipati Anjou, pada tahun 1584, dan diserahkannya beberapa kota Belanda
kepada Alessandro Farnese, Adipati Parma, yang merupakan gubernur Felipe di Belanda Spanyol. Pada Desember 1584, persekutuan antara Felipe II dengan Liga Katolik Perancis di Joinville menjatuhkan kemampuan saudara Anjou, Henri III dari Perancis, dalam mengimbangi dominasi Spanyol di Belanda. Persekutuan tersebut juga menyebarkan pengaruh Spanyol di pesisir utara Perancis, yang merupakan tempat
kekuatan Liga Katolik, sehingga Inggris rentan terhadap invasi. Pengepungan Antwerpen pada musim panas tahun 1585 oleh Adipati Parma juga mengharuskan adanya tanggapan dari Inggris dan Belanda. Maka ditandatanganilah Traktat Nonsuch pada Agustus 1585, dan dalam traktat tersebut Elizabeth menjanjikan dukungan militer kepada Belanda. Traktat tersebut menandai dimulainya Perang Inggris-Spanyol, yang berlangsung hingga ditandatanganinya Traktat London pada tahun 1604.
Ekspedisi Inggris di Belanda dipimpin oleh Robert Dudley, Earl Leicester. Elizabeth dari awal tidak terlalu mendukung kebijakan ini. Strateginya yang tampak mendukung Belanda dengan mengirim tentara Inggris sementara secara rahasia memulai negosiasi perdamaian dengan Spanyol beberapa hari setelah Leicester tiba di Belanda bertentangan dengan Leicester yang menginginkan dan mengharapkan agar orang Belanda bertempur secara aktif.
Di sisi lain, Elizabeth ingin agar Leicester "sebisa mungkin menghindari tindakan mutlak terhadap musuh". Ia membuat Elizabeth marah dengan menerima jabatan Gubernur-Jenderal dari Dewan Negara Belanda. Elizabeth melihat hal tersebut sebagai rencana Belanda untuk memaksanya menerima kedaulatannya atas Belanda, yang sejauh ini selalu ia tolak. Ia menulis kepada Leicester:
Kami tidak pernah membayangkan (bila kita tidak melihatnya berlangsung) bahwa seseorang yang dibesarkan oleh kami sendiri dan sangat diistimewakan oleh kami, di atas bawahan-bawahan lain di negeri ini, akan dengan amat hina melanggar perintah kami dalam kepentingan yang sangat menyentuh kehormatan kami... Dan maka kesenangan dan perintah singkat kami adalah, dengan mengesampingkan
semua penundaan dan dalih, agar anda segera berdasarkan kewajiban kepatuhan anda mematuhi dan memenuhi apapun yang diarahkan oleh pemegang jabatan atas nama kami. Agar anda tidak gagal, karena anda akan menjawab yang bertentangan atas risiko anda sendiri.
"Perintah" Elizabeth adalah agar utusannya membacakan surat-surat ketidaksetujuannya secara terbuka di hadapan Staten-Generaal der Nederlanden, dan Leicester harus berdiri di dekatnya. Permaluan "Letnan Jenderal" Elizabeth di muka umum diperburuk dengan dilanjutkannya negosiasi perdamaian dengan Spanyol, yang sangat menjatuhkan posisinya di mata orang Belanda. Kampanye militer di Belanda sendiri amat terhambat