Megalodon
tertutupnya Jalur Laut Amerika Tengah dan perubahan di Samudra Tethys yang turut bersumbangsih terhadap pendinginan samudra. Akibat terhentinya Arus Teluk, air yang kaya akan nutrien tidak dapat menjangkau ekosistem laut, sehingga sumber makanan megalodon pun terkena imbasnya. Hewan ini tidak tersebar di perairan yang dingin dan mereka mungkin tidak mampu
mempertahankan panas metabolis yang cukup, sehingga wilayah persebaran mereka pun semakin menyusut akibat pendinginan lautan. (walaupun hal ini masih dipertentangkan, lihat di bawah) Bukti fosil menunjukkan bahwa megalodon tidak lagi ditemukan di perairan yang mengalami pendinginan secara signifikan pada kala Pliosen.:77 Sementara itu, fluktuasi permukaan laut terbesar pada masa Senozoikum
berlangsung pada Plio-Pleistosen sekitar 5 juta hingga 12 ribu tahun yang lalu; fluktuasi ini disebabkan oleh meluasnya gletser di kutub, yang sangat berdampak terhadap lingkungan pesisir, dan hal ini mungkin menjadi salah satu faktor yang menyebabkan kepunahan megalodon dan megafauna laut lainnya. Perubahan ini (terutama penurunan permukaan laut)
mungkin juga mengurangi perairan air hangat yang dangkal. Perairan semacam ini sangat dibutuhkan oleh anak megalodon, alhasil reproduksi pun terhambat.
Namun, hasil analisis terhadap persebaran megalodon menunjukkan bahwa perubahan suhu tidak berdampak langsung terhadap kepunahannya. Persebaran megalodon pada kala Miosen dan Pliosen tidak berkorelasi dengan tren pemanasan dan pendinginan; walaupun keberlimpahan dan persebaran megalodon mengalami kemunduran pada kala Pliosen, megalodon terbukti mampu menghuni perairan di lintang
yang lebih dingin. Mereka dapat ditemukan di perairan dengan rata-rata suhu yang berkisar dari 12 hingga 27 °C, dengan rentang suhu secara keseluruhan sebesar 1 hingga 33 °C, sehingga menyiratkan bahwa cakupan habitat yang sesuai untuk megalodon seharusnya tak terlalu terdampak oleh perubahan suhu. Hal ini sesuai dengan kemungkinan bahwa hewan ini bersifat mesotermik.
Keanekaragaman mamalia laut mencapai puncaknya pada kala Miosen,:71 misalnya paus balin yang memiliki lebih dari dua puluh genus, sementara pada zaman modern hanya ada enam. Keanekaragaman seperti ini memungkinkan keberadaan predator besar seperti megalodon.:75 Pada akhir kala Miosen, banyak spesies paus balin yang mengalami kepunahan; spesies yang mampu bertahan mungkin adalah
perenang cepat, sehingga mereka lebih sulit untuk dimangsa.:46 Selain itu, setelah tertutupnya Jalur Laut Amerika Tengah, keanekaragaman dan keberlimpahan paus tropis pun berkurang. Kepunahan megalodon berkorelasi dengan kepunahan paus-paus balin kecil, dan terdapat kemungkinan bahwa megalodon bergantung kepada paus-paus ini. Selain itu, peristiwa kepunahan megafauna laut pada
kala Pliosen telah mengakibatkan kemusnahan 36% semua spesies laut besar, termasuk 55% mamalia laut, 35% burung laut, 9% hiu, dan 43% penyu. Kepunahan ini berdampak terhadap hewan-hewan endotermik dan mesotermik alih-alih poikilotermik, sehingga mungkin terdapat sebab-akibat antara berkurangnya persediaan makanan dengan kepunahan megalodon, dan hal ini pun sesuai dengan kemungkinan
bahwa megalodon adalah hewan mesotermik. Pendinginan samudra pada kala Pliosen mungkin juga membuat megalodon tidak dapat memasuki perairan kutub, sehingga mereka tidak dapat memangsa paus-paus besar yang telah bermigrasi ke sana.
Persaingan dengan superpredator baru (seperti paus sperma makropredatori yang muncul pada kala Miosen, serta paus pembunuh dan hiu putih pada kala Pliosen) mungkin juga telah bersumbangsih terhadap penurunan populasi dan kepunahan megalodon.:46-47 Rekaman fosil menunjukkan bahwa cetacea pemakan paus biasanya muncul di perairan di lintang tinggi pada kala Pliosen, sehingga
terdapat kemungkinan bahwa mereka dapat bertahan di perairan yang semakin mendingin; namun, mereka juga dapat ditemui di perairan tropis, seperti Orcinus sp. di Afrika Selatan.
Kepunahan megalodon sendiri juga mengubah komunitas laut. Rata-rata besar tubuh paus balin membesar setelah kemusnahan megalodon, walaupun hal ini mungkin juga dipicu oleh sebab-sebab lain yang terkait dengan iklim. Di sisi lain, perbesaran tubuh paus balin mungkin juga telah bersumbangsih terhadap kepunahan megalodon, karena megalodon lebih memilih paus yang lebih
kecil; bekas-bekas gigitan yang telah ditemukan pada paus-paus besar mungkin berasal dari hiu pemakan bangkai. Kepunahan megalodon mungkin memang terkait dengan kepunahan spesies-spesies paus yang lebih kecil, seperti Piscobalaena nana. Kepunahan megalodon juga berdampak positif terhadap predator puncak lainnya, seperti hiu putih yang kadang-kadang menyebar ke perairan yang pernah menjadi wilayah megalodon.
Megalodon telah digambarkan dalam berbagai karya fiksi yang berkaitan dengan monster laut, termasuk film dan novel. Tiga individu megalodon (dua dewasa dan satu anak) digambarkan dalam serial TV BBC dari tahun 2003, Sea Monsters. Jurassic Fight Club yang disiarkan di History Channel menggambarkan seekor megalodon yang menyerang seekor paus sperma Brygmophyseter di Jepang. Beberapa film layar lebar juga menggambarkan megalodon, seperti Shark Attack
3: Megalodon dan serial Mega Shark (contohnya Mega Shark Versus Giant Octopus dan Mega Shark Versus Crocosaurus). Hiu ini muncul dalam permainan video Ark: Survival Evolved dari tahun 2017. Beberapa cerita (seperti Tedford and the Megalodon karya Jim Shepard) juga menggambarkan peristiwa penemuan kembali hiu ini. Meg: A Novel of Deep Terror karya Steve Alten menggambarkan megalodon sebagai hiu yang memburu dinosaurus, dengan bagian prolog dan karya seni di
sampulnya yang menggambarkan hiu ini sedang membunuh seekor Tyrannosaurus di laut. Sekuel-sekuel buku ini juga menggambarkan megalodon: The Trench, Meg: Primal Waters, Meg: Hell's Aquarium, dan Meg: Origins, dan terdapat pula adaptasi filmnya yang berjudul The Meg dan dirilis pada tanggal 10 Agustus 2018.
Film dokumenter semu Mermaids: The Body Found yang disiarkan di Animal Planet menggambarkan pertemuan seekor duyung dengan megalodon sekitar 1.6 juta tahun yang lalu. Kemudian, pada Agustus 2013, Discovery Channel membuka serial Shark Week yang digelar setiap tahunnya dengan menayangkan film televisi Megalodon: The Monster Shark Lives, yakni sebuah film dokufiksi yang seolah-olah menunjukkan bukti bahwa megalodon masih ada.
Program ini menuai kritikan karena isinya sepenuhnya bersifat fiksi; sebagai contoh, semua "ilmuwan" di dalam film tersebut adalah aktor. Pada tahun 2014, Discovery menyiarkan kembali The Monster Shark Lives, ditambah dengan program baru berdurasi satu jam Megalodon: The New Evidence serta program fiksi tambahan yang berjudul Shark of Darkness: Wrath of Submarine, sehingga mereka semakin menuai cercaan dari media dan komunitas ilmiah.
Laporan mengenai penemuan gigi megalodon yang terbilang baru (seperti gigi yang ditemukan oleh HMS Challenger pada tahun 1873, yang konon berusia 11000 hingga 24000 tahun) perlu dipertanyakan, karena kemungkinan gigi tersebut terjaga dengan baik akibat endapan mangan dioksida yang tebal pada kerak mineral, sehingga laju dekomposisinya lebih lambat, dan warna putihnya tetap
terjaga selama proses fosilisasi. Fosil gigi megalodon memiliki warna yang bermacam-macam, dari putih hingga cokelat tua dan abu-abu, dan kadang-kadang fosil gigi mungkin terendap kembali di stratum yang lebih muda. Klaim bahwa megalodon mungkin masih tersembunyi di laut dalam (seperti hiu bermulut-besar yang ditemukan pada tahun 1976) merupakan klaim
yang keliru, karena megalodon hidup di perairan pesisir yang hangat, dan kemungkinan tidak dapat bertahan di laut dalam yang dingin dan kurang nutrien.