八爪博士
除了蜘蛛俠和瑪莉·珍·華生之外，麥爾斯·莫拉雷斯、梅嬸、諾曼·奧斯朋、渡邊悠里（）和黑貓等都會出現在遊戲內。《蜘蛛俠》亦包含眾多其他漫威宇宙中的客串角色，例如夜魔俠和復仇者。許多起源自蜘蛛俠系列和其他漫威漫畫的反派也會出現，例如八爪博士、負極先生、金霸王、震動人、電光人、犀牛人、 蠍子人、禿鷹、銀貂、、和-{模仿大師}-。DLC出現角色有黑猫和。