理查德·伯顿
李文斯頓原先沒有重返非洲的意願，後來他仍然接受英國駐非洲領事的職務與皇家地理學會的委託。原先约翰·汉宁·斯皮克、Samuel Baker、理查德·伯顿等人認為尼羅河源頭問題已經獲得解決，他們認為艾伯特湖與維多利亞湖就是尼羅河的源頭，不過李文斯頓認為尼羅河的源頭應該在更南方。然而英國駐東非領事沒有任何薪水，而政府只補助£500英鎊給這次探險；政府後來補助£1000英鎊、地理學會也補助£500英鎊，不過對於他龐大的花費而言只是杯水車薪，主要只能從私人募款。1865年8月14日李文斯頓最後一次離開母國，這次從桑給巴爾出發，然後從魯伏馬河河口進入。於8月8日抵達尼亞薩湖。這一次大多數隊員棄他而去、補給大多被偷。叛逃的隊員回到桑給巴爾，散發李文斯頓已經死去的謠言。李文斯頓繼續往北，在1867年4月1日抵達坦噶尼喀湖。接著往西，在1867年11月8日發現姆韦鲁湖。之後往南又在1868年7月18日發現班韋烏盧湖。李文斯頓受到肺炎、霍亂、熱帶潰瘍等重病纏身，1869年3月回到烏吉吉又發現行李被偷。李文斯頓終於來到摩法特當年所提過的從來沒有白人到過的數千座繁榮村莊，然而這時的他卻無比孤獨寂寞。至1870年6月，李文斯頓的探險隊只剩下三名成員：蘇西（Susi）、朱瑪（Chuma）與 Gardner。李文斯頓不像當時其他的探險家如史丹利用嚴刑峻罰來保持隊伍的完整，李文斯頓本身是一位糟糕的領導者，他的探險最後變成他個人的獨力探險，除了他的僕人與腳夫，身邊完全沒有任何後勤補給與專業支援。李文斯頓的著作中常提到奴隸制度的殘酷，這對英國民間輿論對廢奴的態度有很大影響，但令他感到難堪的是，在他最困難的時候唯一能伸出援手的反而只有他避之唯恐不及的奴隸商人。1871年3月29日，李文斯頓抵達盧阿拉巴河岸邊的Nyangwe。