Мария Бургундская
Причиной физических и психических отклонений инфанта вероятно стало кровосмешение между Габсбургами и королевскими домами Португалии (Ависская династия) и Испании. Дон Карлос имел только четверых прабабок (Хуана I Безумная и Мария Арагонская) и прадедов (Филипп I Красивый и Мануэл I) вместо максимально возможных восьми; кроме того, его родители имели одинаковый коэффициент сонаследования (1/8), как если бы они были наполовину братом и сестрой. Также дон Карлос имел только шесть прапрабабок (Мария Бургундская, Изабелла I Кастильская и Беатрис Португальская) и прапрадедов (император Максимилиан I, Фердинанд II Арагонский и Фернанду, герцог Визеу) вместо максимально возможных шестнадцати; его бабка по матери (Екатерина Австрийская) была родной сестрой деда по отцу (император Карл V), дед по матери (Жуан III) был родным братом бабки по отцу (Изабелла Португальская), а прабабки (Хуана и Мария) приходились друг другу родными сёстрами.