マヌエル1世
1526年3月10日にセビリアの王宮で、ポルトガルの先王マヌエル1世の王女で、互いに母方の従兄妹であるイサベル（イザベル、イザベラ）と結婚した。前年の1525年にイサベルの兄ジョアン3世とカール5世の妹カタリナが結婚するという二重結婚であった。また、カール5世の姉レオノールは1518年にマヌエル1世の3番目の王妃となったが、マヌエル1世とは1521年に死別していた。