Prince of Portugal
في 11 يناير 1552 مع بلوغها السن السادسة عشرة عاماً تزوجت من أمير البرتغال البالغ من العمر أربعة عشر عامًا جواو مانويل دي أفيس بالوكالة في تورو، هو في الآصل ابن عمتها كاثرين وخالها جواو الثالث، وصلت أخيراً إلى البلاط البرتغالي في نوفمبر 1552، مع ذلك الزواج استمر لمدة عامين لأن زوجها جواو مانويل توفي بسبب مرض السل في 2 يناير 1554، ومع ذلك كانت جوانا حاملاً في ذلك الوقت، وولد الملك البرتغالي المستقبلي سيباستياو الأول في 20 يناير 1554، إلا أن عادت جوانا إلى إسبانيا في مايو 1554 بناءً على طلب والدها، تاركة خلفها ابنها حديث الولادة مع حماتها وعمتها كاثرين.