氨基酸
另外，由於所有反應都在封閉或體外的環境之下，勢必會達到平衡，因此若在第一個試管裡加入PITC，它會和試管內的第一個氨基酸的N-端氨基結合，可是由於平衡原理：PITC + 一段氨基酸序列 = PITC-氨基酸 + 少了第一個氨基酸的氨基酸序列，因此在第一個試管裡會同時存在沒有結合PITC和有結合PITC的氨基酸序列，這會導致我們將第一管有PITC-氨基酸的物質分離後，繼續在第二個試管裡加入PITC，則此時第二個試管裡會含有少量的PITC-氨基酸(1)和多量的PITC-氨基酸(2)。這時候我們可以利用联用质谱法(Tandem mass spectrometry )等技術來分析，若分析後發現量多者為PITC-氨基酸(2)，量少者則為PITC-氨基酸(1)，因此我們就解決了反應不完全的問題。而另外一個問題也隨之衍生，一旦我們不停地重複此步驟，得到氨基酸的序列時，一直到約第50個試管開始，就會發現所以氨基酸的量經分析後都會變得幾乎一樣，這樣我們就沒有辦法可以知道氨基酸的序列。這也就是為什麼我們需要先將一段大於50個氨基酸的序列用水解酶給進行切割，讓所有片段的氨基酸序列小於50，這樣我們才可以得到比較準確的氨基酸序列。