エドワード・コーク
この頃、エリザベス1世による王室の寵愛は復活していたものの、それは長続きしなかった。エリザベス1世は1603年に死去し、新たにスコットランド王ジェームズ6世がイングランド王ジェームズ1世に即位すると一転して投獄されたからである。ジェームズ1世に接近したセシルと初代ノーサンプトン伯爵ヘンリー・ハワードがローリーを即位に反対したと讒言したこと、親スペインのジェームズ1世にとって反スペインのローリーが疎ましかったなどローリーを取り巻く環境が悪化、エリザベス1世に授与された国王親衛隊隊長など数々の地位を取り上げられた。更に同年11月17日、ローリーはウィンチェスター城のグレート・ホールにおいて、ジェームズ1世廃位の陰謀が発覚したへの関与の疑いから内乱罪で裁判を受けた。これは陰謀に参加し逮捕されていたコバム男爵が保身からローリーも陰謀に参加したと証言したことが切っ掛けで、裁判を担当した法務長官エドワード・コークによりローリーはロンドン塔に1616年まで監禁された。