Dr. Mario
使用できるキャラクターはプレイ初期段階で21人、最終的には総勢35人に及ぶ。本作に関する情報公開から早い段階で、前作に登場したいくつかのプレイヤーキャラクターは引き続いて参戦しないことが発表されており、本作ではミュウツー、こどもリンク、ドクターマリオ、ピチュー、ロイの5人は登場しなかった（同じ少年リンクという点でトゥーンリンクはこどもリンクのリファインともいえる）。