Cosimo I de' Medici, Grand Duke of Tuscany
前教皇を支援していたフィレンツェ公コジモ1世との関与も外国との関係が悪化する原因になった。公爵より格上の称号を狙っていたコジモ1世は前教皇に引き続いてピウス5世にも接近して金策に協力、異端者にされていた所を匿っていたを1566年に教皇へ引き渡し（カルネセッキは翌1567年にローマで処刑）、フランスのユグノー戦争でカトリック陣営を支援するなど教皇の歓心を得ることに腐心した。ピウス5世もそれに応じて1569年8月24日、1562年の創設、カルネセッキの身柄引き渡し、ユグノー戦争のカトリック支援などの功績により、コジモ1世へカトリック信仰の擁護者としてトスカーナ大公の称号を授与、1570年3月5日にローマを訪れたコジモ1世に対して大公冠を授ける戴冠式を挙行した。これら一連の出来事に対して神聖ローマ皇帝マクシミリアン2世と従兄のスペイン王フェリペ2世、イタリア諸侯の多くは大公位授与に反対、トスカーナ大公位が皇帝とスペイン王に追認されるのはピウス5世とコジモ1世の死後の1576年までかかった。