DNA ligase
次に、インサートと目的ベクターをDNAリガーゼと混合する。インサート遺伝子と目的ベクターの典型的なモル比は3:1であり、インサート濃度を高めることにより、セルフライゲーションはさらに減少する。反応混合物を特定の温度で一定時間放置すると（ライゲーションする鎖のサイズに依存する。詳細はDNAリガーゼを参照）、インサートは目的プラスミド（）に正常に組み込まれるはずである。