Éléonore de Habsbourg
Le , lors de la cérémonie d'abdication de Charles Quint, Marie annonce sa décision de laisser sa charge de gouverneur et son souhait de suivre Charles et Éléonore de Habsbourg en Espagne, et ce malgré les demandes répétées de Charles qui désire qu'elle aide son fils, le futur Philippe II. Son départ est dû en partie à son état de santé et à son souhait de se consacrer à Dieu, mais surtout à ses nombreux désaccords avec Philippe II qui succède à Charles à la tête de l'Espagne et des Provinces-Unies.