Kenneth Clark
制作年を1498年から1499年とするのは、セバスティアーノ・レスタ神父が、16世紀のイタリア人画家でヴァザーリと同様に芸術家列伝の執筆者としても知られるジョヴァンニ・ピエトロ・ボロッリ () に宛てた、レオナルドがフランス王ルイ12世の依頼で絵画の下絵をミランで描いたという書簡に依っている。制作年については多くの研究者に支持されてきたが、ルイ12世と『聖アンナと聖母子と幼児聖ヨハネ』との関連性についてはほぼ否定されている。また、現代の美術史家のなかには1490年代半ばとする説や、カルロ・ペドレッティやケネス・クラークのように1508年から1510年とする説もある。オクスフォード大学教授で美術史家のマーティン・ケンプ () は、大英博物館が所蔵するレオナルドの下絵や『アトランティコ手稿』のドローイングと『聖アンナと聖母子と幼児聖ヨハネ』との類似性から、1507年から1508年に描かれたのではないかとしている。