مانويل الأول ملك البرتغال
ولدت خوانا في البلاط الملكي في مدريد، بحيث أنها ابنة شارلكان (الذي كان أول ملك لإسبانيا الموحدة، رسميا كان ملك أراغون وملك قشتالة) وزوجته إيزابيلا من البرتغال، لذلك كان أجدادها فيليب الأول ملك قشتالة وخوانا الأولى، في حين أجدادها من ناحية أمها مانويل الأول ملك البرتغال وماريا من أراغون، وكانت شقيقة فيليب الثاني ملك إسبانيا والإمبراطورة ماريا من النمسا، ومن بين الآخرين حملت خوانا ألقاب أرشيدوقة النمسا، وإنفانتا قشتالة وأراغون ، وأميرة بورغوندي، سميت بذلك نسبة إلى ميلادها يوم 24 يونيو يعتبر ميلاد القديس يوحنا المعمدان، وتكريمًا لجدتها خوانا من قشتالة، فقدت خوانا والدتها في سن الرابعة من عمرها وعُهد بها إلى الدونا ليونور دي ماسكاريناس، وفي سن الثامنة أصبحت تفهم اللغة اللاتينية ويمكنها العزف على العديد من الآلات الموسيقية.