Kokswarenbesluit (Warenwet) Let op: Deze regeling is ingetrokken. Dit is geen geldige regeling meer. [Regeling vervallen per 23-02-2005.] Gebruikte datum 'geldig op' 25-09-1996. Geldend van 25-09-1996 t/m 22-02-2005. Origineel opschrift en aanhef Besluit van 1 oktober 1979, tot vaststelling van het Kokswarenbesluit (Warenwet) Wij Juliana, bij de gratie Gods, Koningin der Nederlanden, Prinses van Oranje-Nassau, enz., enz., enz. Op voordracht van Onze Minister van Volksgezondheid en Milieuhygiëne van 22 juni 1979, DG Vgz/VA, no. 146386, van Onze Minister van Landbouw en Visserij en van de Staatssecretaris van Economische Zaken, Th. M. Hazekamp; Gelet op artikel 16 van de Warenwet ( Stb. 1935, 793); Overwegende, dat het in het belang van de volksgezondheid wenselijk is gebleken regelen te stellen ten aanzien van kokswaren; Gezien de adviezen van de Adviescommissie Warenwet van 31 maart 1978, nr. 12750/(115) en van 12 april 1978, nr. 12750 a /(115); De Raad van State gehoord (advies van 8 augustus 1979, nr. 17); Gezien het nader rapport van Onze Minister van Volksgezondheid en Milieuhygiëne van 5 september 1979, DG Vgz/VA, no. 147009, van Onze Minister van Landbouw en Visserij en van voornoemde Staatssecretaris van Economische Zaken; Hebben goedgevonden en verstaan: Artikel 1 [Regeling vervallen per 23-02-2005] In dit besluit en de daarop berustende bepalingen wordt verstaan onder: a. kokswaren: de waren als bedoeld in de artikelen 3 tot en met 8 van dit besluit; b. gekoeld bewaard: zodanig bewaard dat de temperatuur van de waar maximaal 7°C bedraagt; c. gekoeld vervoerd: zodanig vervoerd dat de temperatuur van de waar maximaal 7°C bedraagt; d. diepvriesprocédé: procédé waarbij een waar zodanig snel wordt bevroren dat het temperatuurtraject van maximale kristallisatie snel wordt doorlopen en, na thermische stabilisatie, in het hart van de waar een temperatuur van -18°C of lager wordt bereikt, waarna zij bij -18°C of lager wordt opgeslagen; e. in diepvries bewaard: zodanig bewaard dat de temperatuur van de waar maximaal -18°C bedraagt; f. in diepvries vervoerd: zodanig vervoerd dat de temperatuur van de waar maximaal -18°C bedraagt. Artikel 2 [Regeling vervallen per 23-02-2005] De in dit besluit bedoelde waren moeten voldoen aan de volgende algemene eisen: 1. a. Zij moeten normaal van kleur, geur, smaak en consistentie zijn; b. Zij moeten, indien zij kennelijk - teneinde ze voor consumptie gereed te maken - nog verhit moeten worden, ononderbroken gekoeld dan wel in diepvries bewaard of vervoerd worden, met dien verstande dat de temperatuur: - tijdens het gekoeld vervoer naar de detailhandel in de minst koude eenheid gedurende een korte periode maximaal 10°C mag bedragen; - tijdens het vervoer in diepvries gedurende een korte periode maximaal -15°C mag bedragen; - tijdens het vervoer in diepvries naar de detailhandel in de minst koude eenheid gedurende een korte periode maximaal -12°C mag bedragen; - tijdens het bewaren in diepvries in de verkoopmeubels bij de detailhandel in de minst koude eenheid gedurende een korte periode maximaal -12°C mag bedragen; c. Zij mogen, indien zij kennelijk - teneinde ze voor consumptie gereed te maken - niet of niet meer verhit behoeven te worden, niet zodanig worden bewaard dat zij een temperatuur tussen 7°C en 55°C hebben. 2. [Red: Vervallen.] 3. [Red: Vervallen.] 4. Het bepaalde in het eerste lid, onder b en c , is niet van toepassing op eetwaren in dit besluit bedoeld die zich bevinden in: - een voor micro-organismen ondoordringbare verpakking en die een conserverende (niet zijnde hitte) behandeling hebben ondergaan, waardoor de waar na bewaring gedurende 7 dagen bij 23° C ± 1°C nog voldoet aan de eisen in dit besluit aan die waar gesteld, onderscheidenlijk; - een hermetisch gesloten verpakking en die een conserverende hittebehandeling hebben ondergaan, waardoor de waar na bewaring van ten minste 5 en ten hoogste 7 dagen bij 30° C ± 2°C geen tekenen van bederf vertoont en niet meer dan in totaal 500 aëroob of anaëroob kweekbare micro-organismen per gram of per milliliter bevat. Artikel 3 [Regeling vervallen per 23-02-2005] Eetwaren, voorhanden als: - kroketten, bitterballen, nierbroodjes, bamiballen, nasiballen, loempia's en de met een en ander overeenkomende meelprodukten, eventueel gemengd of gevuld met vlees, pluimveevlees, wild, vis of groenten, of produkten daarvan, die in hun geheel gefrituurd zijn of bestemd zijn om in hun geheel gefrituurd te worden, - saucijzenbroodjes, palingbroodjes, kaasbroodjes, hambroodjes, tosti's, pizza's en de met een en ander overeenkomende meelprodukten, eventueel gemengd of gevuld met vlees, pluimveevlees, wild, vis of groenten, of produkten daarvan, die in hun geheel gebakken zijn of bestemd zijn om in hun geheel gebakken te worden, - pasteitjes en de met deze overeenkomende produkten, moeten: a. indien zij kennelijk nog door verhitten voor consumptie moeten worden gereed gemaakt, voldoen aan de volgende eisen: 1°. pathogene micro-organismen en hun toxinen moeten afwezig zijn, met dien verstande, dat coagulase-positieve Staphylococci geacht worden afwezig te zijn, indien het aantal kweekbare micro-organismen van dit type ten hoogste 500 per g bedraagt; 2°. het aantal kweekbare micro-organismen mag, uitgezonderd in waren waarin garnalen, onverhitte groenten of onverhitte taugeh als kenmerkende bestanddelen aanwezig zijn, en in de waren, die micro-organismen bevatten die voor aard of samenstelling noodzakelijk zijn of geweest zijn (zoals kaasbevattende waren), ten hoogste 1 000 000 per g bedragen; b. indien zij kennelijk gereed zijn voor consumptie of, teneinde ze voor consumptie gereed te maken, niet meer verhit behoeven te worden, voldoen aan de volgende eisen: 1°. pathogene micro-organismen en hun toxinen moeten afwezig zijn, met dien verstande, dat coagulase-positieve Staphylococci geacht worden afwezig te zijn, indien kweekbare micro-organismen van dit type in 0,1 g van de waar niet aantoonbaar zijn; 2°. het aantal kweekbare micro-organismen mag ten hoogste 10 000 per g bedragen; 3°. kweekbare Enterobacteriaceae mogen in 0,1 g van de waar niet aantoonbaar zijn. Artikel 4 [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1 Eetwaren, voorhanden als patates frites en andere voor- en afgebakken aardappelprodukten, met uitzondering van de in artikel 5 bedoelde eetwaren, moeten: a. indien zij kennelijk nog door verhitten voor consumptie moeten worden gereed gemaakt voldoen aan de eisen, gesteld in artikel 3, onder a ; b. indien zij kennelijk gereed zijn voor consumptie of, teneinde ze voor consumptie gereed te maken, niet meer verhit behoeven te worden, voldoen aan de eisen, gesteld in artikel 3, onder b . 2 Op de in het eerste lid bedoelde eetwaren, voorzover voorhanden als werkvoorraad voorgebakken frites en soortgelijke aardappelprodukten is het bepaalde in artikel 2, eerste lid, onder b en c niet van toepassing. Artikel 5 [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1 Eetwaren, voorhanden als chips en soortgelijke aardappelprodukten, alsmede kroepoek en soortgelijke produkten, moeten voldoen aan de eisen, gesteld in artikel 3, onder a , 1° . 2 Op de in het eerste lid bedoelde eetwaren is het bepaalde in artikel 2, eerste lid, onder b en c , niet van toepassing. Artikel 6 [Regeling vervallen per 23-02-2005] Eetwaren, voorhanden als - gekookte, gestoomde, voorgebakken of op andere wijze toebereide mie, bami goreng, ravioli, toebereide spaghetti en op overeenkomstige wijze toebereide andere deegwaren - gekookte, gestoomde of voorgebakken rijst, nasi goreng of op andere wijze toebereide rijst, moeten: a. indien zij kennelijk nog vóór aflevering aan de verbruiker door verhitten voor consumptie moeten worden gereed gemaakt, voldoen aan de eisen, gesteld in artikel 3, onder a ; b. indien zij kennelijk bestemd zijn om na aflevering aan de verbruiker door verhitten voor consumptie te worden gereed gemaakt, voldoen aan de volgende eisen: 1°. de eis, gesteld in artikel 3, onder a , 1° , 2°. het aantal kweekbare micro-organismen mag, uitgezonderd in waren waarin onverhitte taugeh als kenmerkend bestanddeel aanwezig is, ten hoogste 100 000 per g bedragen; c. indien zij, teneinde ze voor consumptie gereed te maken, niet meer verhit behoeven te worden, voldoen aan de eisen, gesteld in artikel 3, onder b . Artikel 7 [Regeling vervallen per 23-02-2005] Eetwaren, voorhanden als salades, russisch ei, gevulde tomaat, gevulde paprika en soortgelijke koud te nuttigen waren moeten voldoen aan de volgende eisen: a. pathogene micro-organismen en hun toxinen moeten afwezig zijn, met dien verstande dat coagulase-positieve Staphylococci geacht worden afwezig te zijn indien het aantal kweekbare micro-organismen van dit type ten hoogste 500 per g bedraagt; b. het aantal kweekbare schimmels en gisten mag in totaal niet hoger zijn dan 10 000 per g, tenzij deze micro-organismen voor de aard van de gebruikte bestanddelen noodzakelijk zijn of zijn geweest; c. het aantal kweekbare Enterobacteriaceae mag ten hoogste 1000 per g bedragen. Artikel 8 [Regeling vervallen per 23-02-2005] Eetwaren, voorhanden als zoete of zoetzure waren, welke als dessert plegen te worden genuttigd, zoals pudding mousse en dergelijke opgeklopte waren, weens dessert, bavaroise en soorgelijke koud te nuttigen waren, moeten voldoen aan de volgende eisen: a. pathogene micro-organismen en hun toxinen moeten afwezig zijn, met dien verstande dat coagulase-positieve Staphylococci geacht worden afwezig te zijn indien het aantal kweekbare micro-organismen van dit type ten hoogste 500 per g bedraagt; b. het aantal kweekbare micro-organismen mag ten hoogste 1 000 000 per g bedragen; c. het aantal kweekbare schimmels en gisten mag in totaal ten hoogste 1000 per g bedragen; d. het aantal kweekbare Enterobacteriaceae mag ten hoogste 1000 per g bedragen. Artikel 9 [Regeling vervallen per 23-02-2005] Voor de beoordeling of de in dit besluit bedoelde waren voldoen aan de daaraan gestelde eisen, moet worden gebruik gemaakt van de daartoe vastgestelde methoden van onderzoek, aangegeven in de bij dit besluit gevoegde bijlage. Artikel 10 [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1 Dit besluit kan worden aangehaald als "Kokswarenbesluit (Warenwet)". 2 Het treedt in werking met ingang van een jaar na de datum van uitgifte van het Staatsblad waarin het wordt geplaatst. Origineel slotformulier en ondertekening Lasten en bevelen dat dit besluit met de daarbij behorende nota van toelichting in het Staatsblad zal worden geplaatst en dat daarvan afschrift zal worden gezonden aan de Raad van State. Soestdijk, 1 oktober 1979 Juliana De Minister van Volksgezondheid en Milieuhygiëne, L. Ginjaar De Minister van Landbouw en Visserij, Van der Stee De Staatssecretaris van Economische Zaken, Th. M. Hazekamp Uitgegeven de dertigste oktober 1979 De Minister van Justitie, J. de Ruiter Bijlage Methoden van onderzoek, behorende bij het Kokswarenbesluit (Warenwet) [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1. Bepaling van het aantal aeroob kweekbare micro-organismen [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1.1. Definitie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Onder het aantal aeroob kweekbare micro-organismen wordt verstaan het aantal kolonies, dat zich bij 30 ± 1°C per g van de onderzochte waar ontwikkelt in het onder 1.3.1 beschreven medium, voorzover deze kolonies tevens de onder 1.4 beschreven reactie vertonen. 1.2. Verdunning [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1.2.1. verdunningsvloeistof [Regeling vervallen per 23-02-2005] natriumchloride p.a. 8,5 g pepton 1 g water (zie 7.1) 1000 ml Maak een oplossing van de bovenaangegeven samenstelling en steriliseer deze gedurende 20 min. bij 120°C. 1.2.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Weeg in een adequaat te reinigen en steriele mixer bij voorkeur 20 g doch niet minder dan 10 g van het te onderzoeken materiaal af. Voeg per 5 g toe 45 ml van de onder 1.2.1 genoemde verdunningsvloeistof. Meng gedurende 1,5 min. bij een toerental van ca. 12 000 toeren per minuut (onder belasting). Bereid zonodig, uitgaande van de aldus verkregen verdunning 1:10, verdere decimale verdunningen door steeds 1 ml in 9 ml verdunningsvloeistof te pipetteren en te mengen. Een zogenaamde stomacher of soortgelijk apparaat met overeenkomstige werking mag ook worden gebruikt (zelfde mengtijd). 1.3. Telling [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1.3.1. medium (zie 7.2) [Regeling vervallen per 23-02-2005] trypsine-hydrolysaat van caseïne 5 g gistextractpoeder 2,5 g glucose 1 g agar 15 g water 1000 ml Los onder verwarming de overige ingrediënten in het water op, breng de pH op 7,0 ± 0,1 en steriliseer gedurende 20 min. bij 120°C. 1.3.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Verricht de bepaling als aangegeven in de meest recente versie van NEN 1507 met 1 ml van enkele passende verdunningen, evenwel onder gebruikmaking van het onder 1.3.1 beschreven medium. Het aantal getelde kolonies, verkregen uit de daartoe meest geschikte verdunning, wordt aangegeven met K. Verricht, wanneer invloed op het kiemgetal is te verwachten van een zich in verwerkte bestanddelen bevindende functionele Lacto-bacilluaceae-flora, een bevestiging volgens 1.4. 1.4. Bevestiging [Regeling vervallen per 23-02-2005] 1.4.1. reagens [Regeling vervallen per 23-02-2005] Bereid, onmiddellijk voor het gebruik, een oplossing van de volgende samenstelling: waterstofperoxyde 30% 10 ml water 90 ml 1.4.2. uitvoering [Regeling vervallen per 23-02-2005] Onderzoek, indien van een plaat met 30 of meer kolonies kan worden uitgegaan, ten minste k van deze kolonies die geheel willekeurig worden gekozen. Blijft in alle volgens 1.3.2 verkregen platen K < 30, ga dan uit van de plaat met de meest geconcentreerde verdunning en onderzoek zo mogelijk tenminste 5 kolonies. Breng van elk voor dit doel geselecteerde kolonie een gedeelte op een afzonderlijk voorwerpglas en bedek dit met enkele druppels van de onder 1.4.1 genoemde oplossing. De reactie is positief wanneer gasontwikkeling optreedt. Van zeer kleine kolonies kan men zonodig tevoren enig bacteriemateriaal aankweken door afstrijken op een plaat of schuingestolde buis met het onder 1.3.1 beschreven medium en bebroeden bij 30°C. 1.5. Berekening en opgave [Regeling vervallen per 23-02-2005] Indien een bevestiging volgens 1.4 is verricht, volgt het aantal gezochte kolonies per elke onder 1.3.2 genoemde plaat (K') uit de formule: , waarin K = het totaal aantal getelde kolonies p = het aantal volgens 1.4.2 onderzochte kolonies q = het aantal daarvan, dat positief is bevonden. Indien genoemde bevestiging niet is verricht, is uiteraard K' = K. Neem het gemiddelde van de beide duplo-waarden en rond dit getal als volgt af: a. indien het kleiner is dan 100 en geen geheel getal is: op het dichtstbijzijnde veelvoud van 2; b. indien het groter is dan 100 en niet op 5 eindigt: op het dichtstbijzijnde veelvoud van 10; c. indien het groter is dan 100 en op een 5 eindigt: op het dichtstbijzijnde veelvoud van 20. Vindt men van meer dan één verdunning uitgaande een resultaat tussen 30 en 300, dan dient men voor de berekening van de meest geconcentreerde van die verdunningen uit te gaan. Vermenigvuldig het aldus verkregen getal zonodig met de gebruikte verdunningsfactor. Geef kiemgetallen beneden 100 als zodanig op. Geef kiemgetallen van 100 of meer als volgt op: N = a.10b, waarin: a = een getal met één decimaal, dat kan variëren van 1,0 tot 9,9; b = een geheel getal, niet kleiner dan 2. Was het aantal in de plaat, waarop de berekening werd gebaseerd, kleiner dan 5, geef dan op: N < 50. 2. Grensreactie op en telling van enterobacteriaceae [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.1. Grensreactie (voor het aantonen in een voorgeschreven hoeveelheid) [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.1.1. Definitie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Enterobacteriaceae worden geacht aanwezig te zijn, indien na bebroeding van een mengsel van het desbetreffende medium en 3 porties van 1 ml van de voorgeschreven volgens 2.1.2 bereide verdunning van de te onderzoeken waar, een en ander als beschreven onder 2.1.3, bij 30 ± 1°C micro-organismen tot ontwikkeling komen, die bij afstrijken op het onder 2.1.4 genoemde medium kolonies geven die bij bevestiging volgens 2.1.5 het onder 2.1.6 vermelde reactiepatroon vertonen. 2.1.2. Verdunning [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 1.2. 2.1.3. Ophoping (met voorbebroeding) [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.1.3.1. medium voor de voorbebroeding [Regeling vervallen per 23-02-2005] pepton 10 g natriumchloride p.a. 5 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH 2 PO 4 ) p.a. 1,5 g dinatriumwaterstoffosfaat (NA 2 HPO 4 .2H 2 O) p.a. 9,0 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten in het water op en breng de pH op 7,0 ± 0,1. Vul af in buizen in porties van 15 ml en steriliseer gedurende 20 min. bij 120°C. 2.1.3.2. medium voor de ophoping (zie 7.3) [Regeling vervallen per 23-02-2005] pepton 10 g glucose 5 g dinatriumwaterstoffosfaat (Na 2 HPO 4 .2H 2 O) p.a. 8 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH 2 PO 4 ) p.a. 2 g gedroogde rundergal 20 g briljantgroen 15 mg water 1000 ml Los de overige ingrediënten in het water op en breng de pH op 7,2 ± 0,1. Vul af in buizen in porties van 15 ml. Verhit de buizen gedurende 30 min. op 100°C. Verhitting gedurende langere tijd of bij hogere temperatuur is niet nodig en bovendien ongewenst. 2.1.3.3. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Breng 1 ml van de vereiste volgens 2.1.2 bereide verdunning in een buis met het volgens 2.1.3.1 bereide medium. Verricht dit in drievoud. Bebroed 16-18 uur bij 30 ± 1°C. Breng daarna uit elke buis 0,1 ml over in een buis met 15 ml van het onder 2.1.3.2. genoemde medium. Bebroed deze 3 nieuwe buizen 24 uur bij 30 ± 1°C. Strijk daarna uit elk ervan af op het onder 2.1.4 genoemde medium. 2.1.4. Isolatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.1.4.1. medium (zie 7.4) [Regeling vervallen per 23-02-2005] pepton 7 g gistextractpoeder 3 g glucose 10 g natriumchloride p.a. 5 g galzouten 1,5 g neutraalrood 30 mg kristalviolet 2 mg agar 15 mg water 1000 ml Los de overige ingrediënten onder verwarming tot 100°C in het water op. Koel zodra alles volledig is opgelost af tot ca. 50°C en giet uit in petrischalen van 12 of 15 cm diameter. Een verdere verhitting is niet nodig en bovendien ongewenst. Droog de platen 20 min. bij 55°C of 45 min. bij 37°C, in ieder geval tot zij goed droog zijn. 2.1.4.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Strijk uit elke onder 2.1.3.3 genoemde buis met ophopingsmedium af op een plaat van het onder 2.1.4.1 genoemde medium, en wel op dusdanige wijze dat aan het eind van de bebroedingsperiode losliggende kolonies zijn te verwachten. Bebroed 18-24 uur bij 30 ± 1°C. Onderzoek, indien groei optreedt, enkele losliggende kolonies op de onder 2.1.5 genoemde eigenschappen, waarbij de oxydasereactie (2.1.5.2) dient te worden uitgevoerd met materiaal, gegroeid in buizen volgens 2.1.5.1. 2.1.5. Bevestiging [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.1.5.1. omzetting van glucose [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.1.5.1.1. medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] A. trypsine-hydrolysaat van caseïne 2 g glucose 10 g natriumchloride 5 g dikaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4) p.a. 0,3 g broomthymolblauw 80 mg agar 15 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten onder verwarming in het water op. Breng de pH op 7,1 ± 0,1. Vul af in cultuurbuizen in porties van 4 à 5 ml. Steriliseer 20 min. bij 120°C. Plaats de buizen rechtop en laat het medium stollen (zie 7.5.). B. vleesextractpoeder 1 g gistextractpoeder 2 g pepton 5 g natriumchloride 5 g agar 15 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten onder verwarming in het water op. Breng de pH op 7,4 ± 0,1. Vul af in kolven en steriliseer gedurende 20 min. bij 120°C (zie 7.6). Pipetteer onder aseptische voorzorgen in elke volgens A bereide buis 4 à 5 ml medium B bovenop het gestolde medium A. Laat stollen als onder A vermeld. De buizen dienen bij 4°C te worden bewaard en zijn dan maximaal 4 dagen houdbaar zonder hun diagnostische effect te verliezen. 2.1.5.1.2. uitvoering. [Regeling vervallen per 23-02-2005] Beënt volgens 2.1.5.1.1 verkregen buizen met het volgens 2.1.4.2 verkregen materiaal door middel van een diepe rechte streek. Bebroed bij 30 ± 1°C. Controleer na 1 en 2 dagen bebroeden. De reactie is positief (fermentatieve omzetting van glucose), indien door de gehele buis heen geelkleuring door zuurvorming optreedt. 2.1.5.2. reactie op oxydase [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.1.5.2.1. reagens [Regeling vervallen per 23-02-2005] Bereid onmiddellijk voor het gebruik een oplossing van de volgende samenstelling: N,N,N',N'-tetramethylparafenyleendiamine 2 HCI 1 g water 100 ml De in de handel verkrijgbare kant-en-klare papiertjes zijn eveneens bruikbaar. Deze zijn geïmpregneerd met 2 andere reagentia dan het bovengenoemde. 2.1.5.2.2. uitvoering [Regeling vervallen per 23-02-2005] Breng in een petrischaal een velletje filtreerpapier van 5 cm diameter of van 5 ∗ 5 cm. Breng in het midden daarvan 3 druppels van het onder 2.1.5.2.1 genoemde reagens. Maak vervolgens met een weinig van het bacteriemateriaal, afkomstig van het oppervlak van een volgens 2.1.5.1.2 beënte en bebroede buis, op het bevochtigde papier een streep van ten hoogste 5 mm lengte. De reactie wordt als positief beschouwd, indien binnen 5 sec. op de plaats van deze streep een sterke diepblauwe tot purperen kleur ontstaat. Bij te hard wrijven met de naald over het papier kunnen vals positieve reacties ontstaan. Bij gebruik van de kant-en-klare papiertjes dient het voorschrift bij de verpakking te worden opgevolgd. Het risico van vals positieve reacties is bij gebruik van deze papiertjes minder groot. Voer als controle de proef ook uit met een Aeromonas- of Pseudomonasstam. Deze geven een positieve reactie. 2.1.6.. Interpretatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Enterobacteriaceae vertonen het volgende reactiepatroon: glucose-omzetting + (fermentatief) oxydase | Beschouw, indien - uitgaande van elke volgens 2.1.3.3 ingezette buis - één of meer van de onderzochte kolonies dit reactiepatroon vertonen, het resultaat van het onderzoek als positief. 2.2. Telling van Enterobacteriaceae [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.2.1. Definitie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Onder het aantal Enteroacteriaceae wordt verstaan het aantal kolonies dat zich bij 30 ± 1°C per g van de onderzochte waar ontwikkelt in het onder 2.2.3.1 beschreven medium, voorzover deze kolonies tevens het onder 2.1.6 aangegeven reactiepatroon vertonen. 2.2.2. Verdunning [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 1.2. 2.2.3. Telling [Regeling vervallen per 23-02-2005] 2.2.3.1. medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 2.1.4.1. Giet echter niet uit in petrischalen, doch bewaar het op 100°C verhitte medium op circa 47°C tot aan het gebruik. 2.2.3.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Gebruik in ieder geval een volgens 2.2.2 bereide verdunning 1 : 10 en daarnaast zonodig verdere decimale verdunningen, indien verwacht wordt dat alleen in dat geval platen zullen worden verkregen met een aantal specifieke kolonies, gelegen tussen 30 en 300. Gebruik voor elke te onderzoeken verdunning 2 petrischalen van circa 9 cm doorsnede. Pipetteer in elk van deze schalen 1 ml van de betrokken verdunning. Voeg per petrischaal toe circa 15 ml van het onder 2.2.3.1 genoemde medium, meng en laat stollen. Bedek daarna de agar-laag met een ongeveer even grote hoeveelheid van hetzelfde medium en laat ook dit laagje stollen. Bebroed de platen gedurende 18-24 uur bij 30 ± 1°C. Tel na afloop van deze periode het aantal kolonies dat niet omgeven is door een bleekgele achtergrond, indien deze aanwezig zijn in die platen waarin hun aantal is gelegen tussen 30 en 300. Stel dit aantal gelijk aan K. 2.2.4. Bevestiging [Regeling vervallen per 23-02-2005] Ga voor de selectie van de te onderzoeken specifieke kolonies te werk als aangegeven onder 1.4.2, eerste alinea. Verricht van de geselecteerde kolonies dezelfde reacties als aangegeven onder 2.1.5. Voor de interpretatie zij verwezen naar 2.1.6. 2.2.5. Berekening en opgave [Regeling vervallen per 23-02-2005] Het aantal Enterobacteriaceae per elke onder 2.2.3.2 genoemde plaat (K') volgt uit de formule: , waarin K = het totaal aantal getelde kolonies p = het aantal volgens 2.2.4 onderzochte kolonies q = het aantal daarvan, dat het onder 2.1.6 beschreven reactiepatroon vertoont. Neem het gemiddelde van de beide duplo-waarden en ga ook overigens te werk als aangegeven onder 1.5. 3. Grensreactie op salmonella [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.1. Definitie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Als Salmonella worden beschouwd bacteriën die zich vermeerderd hebben in één der hierna te beschrijven vloeibare media en zich na overenting op het briljantgroen fenolrood agar medium ontwikkelen tot specifieke kolonies die het onder 3.5.7 vermelde reactiepatroon vertonen. 3.2. Media voor de ophoping [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.2.1. niet-selectief medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 2.1.3.1. 3.2.2. selectief medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] Tetrathionaat-bouillon volgens Muller Kauffmann (zie 7.7) 3.2.2.1. basismedium [Regeling vervallen per 23-02-2005] pepton 4,5 g gistextractpoeder 1,8 g vleesextractpoeder 0,9 g natriumchloride p.a. 4,5 g calciumcarbonaat (CaCO3) 25 g natriumthiosulfaat (Na2S2O3.5H2O) p.a. 40,7 g water 1000 ml Vermeng de ingrediënten onder verwarming met het water, waarbij uiteraard door de aanwezigheid van het calciumcarbonaat geen heldere oplossing ontstaat. Breng de pH op 7,0 ± 0,1 en verhit tot koken. Koel daarna af tot 45°C en vul, na het calciumcarbonaat regelmatig door de vloeistof te hebben verdeeld, af in kolven in porties van 100 ml. 3.2.2.2. jodiumoplossing [Regeling vervallen per 23-02-2005] jodium p.a. 20 g kaliumjodide (KI) p.a. 25 g water 100 ml Los het kaliumjodide op ca. 50 ml water. Voeg daarna het jodium toe en los op. Vul aan met water tot 100 ml. 3.2.2.3. gal [Regeling vervallen per 23-02-2005] Bereid een oplossing van de navolgende samenstelling: gedroogde rundergal 10 g water 100 ml Steriliseer gedurende 20 min. bij 115°C. 3.2.2.4. briljantgroenoplossing [Regeling vervallen per 23-02-2005] Bereid een oplossing van de volgende samenstelling: briljantgroen (BDH) 100 mg water 100 ml Verhit de oplossing gedurende een half uur in een bad met kokend water en gebruik hem dezelfde dag als waarop hij is bereid. 3.2.2.5. bereiding [Regeling vervallen per 23-02-2005] Bereid kort voor het gebruik op aseptische wijze een mengsel van de bovengenoemde componenten in de hieronder aangegeven verhouding: basismedium (3.2.2.1) 100 ml jodiumoplossing (3.2.2.2.) 2 ml gal (3.2.2.3) 5 ml briljantgroenoplossing (3.2.2.4) 1 ml 3.3. Isolatiemedium (zie 7.8) [Regeling vervallen per 23-02-2005] vleesextractpoeder 5 g gistextractpoeder 3 g pepton 10 g lactose 10 g saccharose 10 g dinatriumwaterstoffosfaat (N2HPO4) p.a. 1 g natriumwaterstoffosfaat (NaH2PO4) p.a. 0,6 g fenolrood 0,09 g briljantgroen (BDH) 4,7 mg agar (gezuiverd en snel oplosbaar) 12 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten onder verwarming in het water op. Breng de oplossing aan de kook en laat ten hoogste 1 min. doorkoken. Koel direct af tot 50°C en giet uit in petrischalen van 15 cm doorsnede bij een zodanige temperatuur dat de agar snel in de schalen stolt. Droog de voedingsbodems vóór het gebruik goed (45 min. 37°C). De pH dient 6,9 ± 0,1 te bedragen. 3.4. Werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Breng 25 g van het monster over in ca. 225 ml van het niet-selectieve vloeibare medium (3.2.1). Bebroed deze vloeistof 16-20 uur bij 37°C en breng daarna 10 ml over in ca. 100 ml tetrathionaatbouillon (3.2.2). Bebroed de vloeistof gedurende 48 uur bij 42,5 ± 0,5°C. Strijk na 18-20 uur en na 48 uur de tetrathionaatbouillon met behulp van een entoog (2,3-3 mm) uit op briljantgroen fenolrood agar-platen ( 3.3). Bebroed de platen gedurende 18-24 uur bij 37°C en beoordeel ze op het voorkomen van specifiek rode kolonies. Onderzoek enkele van deze kolonies op de onder 3.5 genoemde identificatiereacties. (Indien gewenst, kan naast de briljantgroen fenolrood agar ook een ander isolatiemedium worden gebruikt). 3.5. Identificatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.1. te verrichten reacties [Regeling vervallen per 23-02-2005] Strijk zo nodig de te onderzoeken kolonies van de onder 3.4 genoemde selectieve platen nog een keer uit op niet-selectieve selectieve vaste media en bebroed weer 18-24 uur bij 37°C. Voer daarna per oorspronkelijke kolonie, uitgaande van één losliggende nieuwe kolonie, de volgende reacties uit. T.S.I.-agar reacties (zie 3.5.2) lysinedecarboxylatie (zie 3.5.3) ureumsplitsing (zie 3.5.4) reactie op β-galactosidase (zie 3.5.5) agglutinatie (zie 3.5.6) 3.5.2. T.s.i.-agar [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.2.1. samenstelling en bereiding (zie 7.9) [Regeling vervallen per 23-02-2005] pepton 20 g gistextractpoeder 3 g vleesextractpoeder 3 g glucose 1 g lactose 10 g saccharose 10 g natriumchloride p.a. 5 g natriumthiosulfaat (Na2S2O3.5H2O) p.a. 0,3 g ijzer(III)citraat (FeC6H5O7.3H2 O) p.a. 0,3 g fenolrood 50 mg agar 12 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten onder verwarming in het water op. Breng de pH op 7,4 ± 0,1. Vul af in cultuurbuizen van 160 ∗ 16 mm in porties van 7 ml. Steriliseer 20 min. bij 120°C. Laat de buizen in schuine stand stollen, doch op dusdanige wijze dat deze, gerekend vanaf de onderkant, over een lengte van ca. 2,5 cm nog geheel met agar zijn gevuld. Tussen bereiding en gebruik mogen deze buizen niet langer dan 1 week worden bewaard. Wil men ze op een later tijdstip gebruiken, dan dienen ze opnieuw te worden opgesmolten en tenminste 20 min. in een bad met kokend water te worden verhit. Laat ze daarna stollen op de eerder aangegeven wijze. 3.5.2.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Beënt de volgens 3.5.2.1 verkregen buizen met het te onderzoeken bacteriemateriaal door afstrijken op het oppervlak en steken in het onderste gedeelte ("voet") van de buis. Bebroed 1-2 dagen bij 37 ± 1°C. De waargenomen verschijnselen zijn als volgt te interpreteren: "voet": geel glucose omgezet rood of onveranderd glucose niet omgezet zwart vorming van zwavelwaterstof bellen of scheuren gasvorming uit glucose oppervlak: geel lactose en/of saccharose omgezet rood of onveranderd noch lactose noch saccharose omgezet 3.5.3. lysinedecarboxylatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.3.1. medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] I-lysine, HCl 5 g gistextract in poedervorm 3 g glucose 1 g broomkresolpurper 15 mg water 1000 ml Los de overige ingrediënten in het water op en breng de pH op 7,2 ± 0,1. Vul af in de buizen in porties van ca. 5 ml en steriliseer gedurende 20 min. bij 120°C. 3.5.3.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Beënt het onder 3.5.3.1 genoemde medium met het te onderzoeken bacteriemateriaal en bebroed gedurende 24 uur bij 37 ± 1°C. Een positieve reactie blijkt uit een paarse kleur van het medium, een negatieve uit een gele kleur. 3.5.4. ureumsplitsing [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.4.1. medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.4.1.1. oplossing van ureum, voedingsstoffen en indicator [Regeling vervallen per 23-02-2005] Bereid een oplossing van de volgende samenstelling: pepton 1 g glucose 1 g natriumchloride 5 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) p.a. 2 g ureum p.a. 20 g fenolrood 12 mg water 1000 ml Los hiertoe eerst onder verwarming het fenolrood in het water op. Koel daarna af en los de overige ingrediënten op. Breng de pH op 6,8 ± 0,1 en steriliseer door middel van filtratie. 3.5.4.1.2. agar [Regeling vervallen per 23-02-2005] agar 15 g water 900 ml Los de agar onder verwarming in het water op en steriliseer 20 min. bij 120°C. 3.5.4.1.3. bereiding [Regeling vervallen per 23-02-2005] Meng onder aseptische omstandigheden de onder 3.5.4.1.1 genoemde gefiltreerde oplossing met de onder 3.5.4.1.2 genoemde tot ca. 50°C afgekoelde agar. Vul eveneens onder aseptische omstandigheden af in buizen in porties van ca. 7 ml per buis. Leg de buizen in schuine stand en laat de inhoud stollen. 3.5.4.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Beënt het oppervlak van het volgens 3.5.4.1.3 bereide medium met het te onderzoeken bacteriemateriaal door middel van een rechte streep. Bebroed gedurende 1 of 2 dagen bij 37 ± 1°C. Splitsing van het ureum geeft ammoniakontwikkeling, waardoor de kleur van de indicator fenolrood naar rose en, bij verdergaande reactie, naar rood omslaat. 3.5.5. reactie op β-galactosidase [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.5.1. reagens [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.5.1.1. O.N.P.G.-oplossing [Regeling vervallen per 23-02-2005] orthonitrofenyl-ß-d-galactopyranoside (ONPG) 6 g dinatriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4.2H2O) p.a. 2 g water 1000 ml Los in het water de overige ingrediënten op, breng de pH op 7,5 ± 0,1 en steriliseer de oplossing door middel van filtratie. Bewaar de oplossing bij 4°C en onder afsluiting van licht. 3.5.5.1.2. peptonwater [Regeling vervallen per 23-02-2005] pepton 10 g natriumchloride (NaCl) p.a. 5 g water 1000 ml Los in het water de overige ingrediënten op, breng de pH op 7,5 ± 0,1 en steriliseer gedurende 15 min. bij 120°C. 3.5.5.1.3. bereiding [Regeling vervallen per 23-02-2005] Voeg onder aseptische omstandigheden bij elkaar: O.N.P.G.-oplossing (3.5.5.1.1) 25 ml peptonwater (3.5.5.1.2) 75 ml Meng en vul op aseptische wijze af in buizen in porties van 2,5 ml per buis. Het mengsel is 1 maand houdbaar bij 4°C. 3.5.5.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Beënt een volgens 3.5.5.1.3 verkregen buis met het te onderzoeken bacteriemateriaal en bebroed 24 uur bij 37 ± 1°C. De reactie is positief, indien een gele kleur ontstaat doordat β-galactosidase uit het O.N.P.G. het geel gekleurde orthonitrofenol vrijmaakt. Bij een controleproef met een O.N.P.G.-negatieve bacteriesoort (bijvoorbeeld Salmonella of Proteus hauseri) moet het reactiemengsel kleurloos blijven. 3.5.6. serologische reacties (zie 7.10) [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.6.1. agglutinatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Culturen welke voldoen aan de biochemische specificaties voor Salmonella (3.5.7) moeten verder onderzocht worden op de aanwezigheid van Salmonella O- en/of H-antigenen. Hiertoe wordt een voorwerpglas-agglutinatie uitgevoerd met behulp van Salmonella O- en/of H-agglutinerende antisera. 3.5.6.2. Salmonella O-antigenen [Regeling vervallen per 23-02-2005] 3.5.6.2.1. uitvoering van de reactie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Breng op een zorgvuldig gereinigd voorwerpglas een druppel van een agglutinerende Salmonella O-antiserum en een druppel fysiologische zoutoplossing, wrijf in deze druppel een weinig van de te onderzoeken bacterie-cultuur, afkomstig van de T.S.I.-agar tot een homogene, matig troebele suspensie ontstaat. Doe hetzelfde in de druppel fysiologische zoutoplossing. Maak met het voorwerpglas schommelende bewegingen gedurende 30-60 sec. en lees dan de reacties af tegen een donkere achtergrond, bij voorkeur onder gebruikmaking van een loep. Hebben de bacteriën zich aaneengesloten tot grotere eenheden, dan wordt gezegd dat agglutinatie heeft plaatsgevonden. Ingeval van een positieve agglutinatie dient de druppel antiserum positief en de druppel fysiologische zoutoplossing negatief te zijn. Vindt agglutinatie ook in de druppel fysiologische zoutoplossing plaats, dan heeft men met een auto-agglutinabele stam te maken. In dit geval kan de stam niet serologish gedetermineerd worden. 3.5.6.2.2. omschrijving van de te gebruiken O-sera [Regeling vervallen per 23-02-2005] In de handel zijn verschillende Salmonella O-sera te verkrijgen en wel het zogenaamde korte polyvalente serum (omvattende bijvoorbeeld de O-groepen A t/m E) en het zogenaamde lange omnivalente O-serum (omvattende alle tot nu toe bekende O-groepen). Daarnaast zijn groeps- of factorensera B, C, D, E, G, L en het anti-Vi-serum in de handel. 3.5.6.2.3. interpretatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Indien een negatief resultaat met het omnivalente serum wordt verkregen, is het vrijwel zeker dat men niet met een Salmonellastam heeft te maken. De enige uitzondering bestaat hierin, dat men eventueel met een nieuwe nog niet ontdekte O-groep of met een der T-antigenen heeft te maken. Indien de cultuur negatief reageert met het korte polyvalente serum, kan geagglutineerd worden met een lang omnivalent serum. Indien deze laatste reactie ook negatief is, heeft men vermoedelijk geen Salmonella geïsoleerd (zie boven). Indien deze laatste reactie positief is, heeft men vermoedelijk een Salmonella geïsoleerd die een O-antigeen heeft dat niet in het korte polyvalente is vertegenwoordigd. Is de agglutinatie met een der polyvalente sera positief, dan is dit slechts een aanwijzing dat de te onderzoeken cultuur tot het genus Salmonella zou kunnen behoren, een en ander in verband met de talrijke O-antigeen-verwantschappen tussen de genera der familie Enterobacteriaceae. Een nader onderzoek met factorensera en eventueel met een polyvalent H-serum zal dienen te geschieden. Indien de cultuur reageert met een van de factorensera B, C, D, E, G, L of het Anti-Vi-serum luidt de uitslag: Salmonella, behorende tot de B-groep, de C-groep, enz. geïsoleerd. In alle gevallen, ook bij twijfel, dient de stam ter determinatie en eventuele serologische typering naar het Rijksinstituut voor de Volksgezondheid te Bilthoven te worden gezonden. 3.5.6.3. Salmonell [Regeling vervallen per 23-02-2005] a H-antigenen 3.5.6.3.1. uitvoering van de reactie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Zie 3.5.6.2.1, met dit verschil dat de agglutinerende H-sera (zie 3.5.6.3.2) gebruikt worden en dat de bacteriecultuur uit het vocht onder in de T.S.I.-buis wordt genomen. 3.5.6.3.2. omschrijving van de te gebruiken Salmonella H-sera [Regeling vervallen per 23-02-2005] In de handel zijn verschillende Salmonella H-agglutinerende antisera verkrijgbaar en wel polyvalente sera, omvattende de meest voorkomende specifieke H-antisera en de specifieke H-antisera afzonderlijk. 3.5.6.3.3. interpretatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Indien een negatief resultaat met een polyvalent serum wordt verkregen, is de kans groot dat men niet met een Salmonellastam te maken heeft. De enige uitzondering bestaat hierin, dat men met een eventueel nieuw H-antigeen te maken heeft, waarvan het antiserum niet in het polyvalente serum voorkomt of dat men met een te weinig beweeglijke cultuur te maken heeft. Indien een positief resultaat wordt verkregen met polyvalent serum of met een specifiek serum, kan de cultuur Salmonella-positief genoemd worden en dient deze ter nadere typering naar het Rijksinstituut voor de Volksgezondheid te Bilthoven te worden gezonden. 3.5.7. interpretatie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Salmonellae vertonen het volgende reactiepatroon: T.S.I. -glucose (zuurvorming) + 100% glucose (gasvorming) + 92% lactose + 99% saccharose + 99% zwavelwaterstof + 92% lysine-decarboxylatie + 95% ureumsplitsing + 100% ß-galactosidase reactie + 98% agglutinatie (zie 3.5.6.2.3 en 3.5.6.3.3) + = positief | = negatief. De cijfers in de rechter kolom geven het percentage aan dat bij een bepaald onderzoek van een groot aantal stammen (W. H. Ewing and M. M. Ball, The biochemical reactions of numbers of the genus Salmonella (1966)) het resultaat gaf als in de middelste kolom (+ of thèta]) aangegeven (bijvoorbeeld lysinedecar- boxylatie: 95% van de stammen +, derhalve 5% [thèta]). 4. Grensreactie op en telling van Staphylococcus aureus [Regeling vervallen per 23-02-2005] 4.1. Grensreactie (voor het aantonen in een voorgeschreven hoeveelheid) [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor is nog een methode in bewerking. 4.2. Telling van Staphylococcus aureus [Regeling vervallen per 23-02-2005] 4.2.1. Definitie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Onder het aantal bacteriën van de soort Staphylococcus aureus wordt verstaan het aantal specifieke kolonies dat zich bij 37 ± 1°C per g van de onderzochte waar ontwikkelt op het onder 4.2.3.1 genoemde medium, voorzover deze kolonies tevens de onder 4.2.4 aangegeven reactie vertonen. 4.2.2. Verdunning [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 1.2. 4.2.3. Telling [Regeling vervallen per 23-02-2005] 4.2.3.1. medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] 4.2.3.1.1. basismedium (zie 7.11) [Regeling vervallen per 23-02-2005] trypsine-hydrolysaat van caseïne 10 g vleesextractpoeder 5 g gistextractpoeder 1 g natriumpyruvaat 10 g glycine 12 g lithiumchloride (liCl) p.a. 5 g agar 20 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten onder verwarming in het water op. Breng de pH op 6,8 ± 0,1. Steriliseer gedurende 15 min. bij 120°C en koel af tot ca. 50°C. 4.2.3.1.2. tellurietoplossing [Regeling vervallen per 23-02-2005] kaliumtelluriet (K2TeO3) p.a. 1 g water 100 ml Bereid een oplossing van de bovenaangegeven samenstelling en steriliseer deze door middel van filtratie. Gebruik de oplossing onmiddellijk of ten hoogste 1 week na de bereiding en bewaar hem in het laatste geval bij 4°C. 4.2.3.1.3. eidooieremulsie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Gebruik hiervoor bij voorkeur een in de handel in steriele vorm verkrijgbaar gestandaardiseerd preparaat met ca. 20% dooier. 4.2.3.1.4. bereiding [Regeling vervallen per 23-02-2005] Voeg per 100 ml van het onder 4.2.3.1.1 genoemde tot ca. 50°C afgekoelde basismedium toe: ml van de onder 4.2.3.1.2 genoemde tellurietoplossing; ml van de onder 4.2.3.1.3 genoemde eidooieremulsie. Meng door zwenken de toevoegingen door het basismedium heen en giet onmiddellijk daarna uit in petrischalen van 12 of 15 cm diameter, in porties van resp. 25 en 40 ml. Laat stollen. Droog de platen vóór het gebruik tenminste 20 min. bij 55°C of 45 min. bij 37°C, in elk geval tot ze goed droog zijn. Gebruik de gegoten platen onmiddellijk of ten hoogste 24 uur na de bereiding. 4.2.3.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Gebruik in ieder geval een volgens 1.2 bereide verdunning 1 : 10 en daarnaast zonodig verdere decimale verdunningen, indien verwacht wordt dat alleen in dat geval platen zullen worden verkregen met een aantal specifieke kolonies gelegen tussen 30 en 300. Gebruik voor elke te onderzoeken verdunning 2 van de volgens 4.2.3.1.4 bereide platen. Pipetteer op elk van deze platen 0,1 ml van de betrokken verdunning en verdeel de suspensie met een steriele Drigalskispatel gelijkmatig over de agar. Bebroed de platen gedurende 30-40 uur bij 37 ± 1°C en tel na afloop van deze periode het aantal specifieke kolonies, indien deze aanwezig zijn op die platen waarop hun aantal gelegen is tussen 30 en 300. Stel dit aantal gelijk aan K. Specifieke kolonies kunnen het volgende uiterlijk hebben: a. gitzwart, glanzend en bol, met veelal rondom zich een heldere hof waarbinnen zich een doffe hof kan bevinden; b. grijszwart, glanzend en bol. In dat geval is de onder a genoemde heldere hof steeds aanwezig. 4.2.4. Bevestiging [Regeling vervallen per 23-02-2005] 4.2.4.1. kweken van het materiaal [Regeling vervallen per 23-02-2005] 4.2.4.1.1. medium (zie 7.12) [Regeling vervallen per 23-02-2005] aftreksel van kalfshersenen in droge vorm 12,5 g aftreksel van runderhart in droge vorm 5 g enzymatisch verteerd vers vlees 10 g glucose 2 g natriumchloride p.a. 5 g dinatrium waterstoffosfaat (Na 2 HPO 4 .2H 2 O) p.a. 2,5 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten in het water op en breng de pH op 7,4 ± 0,1. Vul af in cultuurbuizen in porties van 5 ml en steriliseer gedurende 20 min. bij 120°C. 4.2.4.1.2. uitvoering [Regeling vervallen per 23-02-2005] Ga voor de selectie van de te onderzoeken specifieke kolonies te werk als aangegeven onder 1.4.2, eerste alinea. Ent elke geselecteerde kolonie over in een buis met het onder 4.2.4.1.1 aangegeven medium. Bebroed gedurende 18-24 uur bij 37 ± 1°C en verricht daarna de onder 4.2.4.2 aangegeven reactie. 4.2.4.2. coagulasereactie [Regeling vervallen per 23-02-2005] 4.2.4.2.1. oplossen van het plasma [Regeling vervallen per 23-02-2005] Pipetteer 3 ml steriel gedestilleerd water in een flesje lyofiel gedroogd coagulaseplasma (niet met citraat gestabiliseerd). Los op door schudden. Dit gereconstitueerde plasma is niet houdbaar en dient dezelfde dag te worden gebruikt. 4.2.4.2.2. uitvoering [Regeling vervallen per 23-02-2005] Pipetteer porties van 0,5 ml van de volgens 4.2.4.2.1 verkregen oplossing in steriele agglutinatiebuisjes. Breng van elke volgens 4.2.4.1.2 verkregen goed gegroeide cultuur 0,1 ml in een buisje als in de vorige zinsnede genoemd. Plaats de buisjes bij 37 ± 1°C. Controleer na 1 uur, na 3 uur en maximaal na 6 uur. Bij een positieve reactie is het plasma geheel gestold; bij een negatieve reactie vindt geen of slechts gedeeltelijke stolling plaats. 4.2.5. Berekening en opgave [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 1.5. Evenwel dient de verkregen waarde van K' met een extra factor van 10 te worden vermenigvuldigd, daar per plaat slechts 0,1 ml verdunning werd gebruikt. 5. Bepaling van het aantal kweekbare schimmels en gisten [Regeling vervallen per 23-02-2005] 5.1. Definitie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Onder het aantal kweekbare schimmels en gisten wordt verstaan het aantal specifieke kolonies dat zich bij 24 ± 1°C per g van de onderzochte waar ontwikkelt in het onder 5.3.1 beschreven medium. 5.2. Verdunning [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 1.2. 5.3. Telling [Regeling vervallen per 23-02-2005] 5.3.1. medium [Regeling vervallen per 23-02-2005] 5.3.1.1. basismedium [Regeling vervallen per 23-02-2005] gistextractpoeder 5 g glucose 20 g agar 20 g water 1000 ml Los de overige ingrediënten onder verwarming in het water op, breng de pH op 6,5 ± 0,1 en steriliseer gedurende 20 min. bij 120°C. 5.3.1.2. oxytetracycline-oplossing [Regeling vervallen per 23-02-2005] oxytetracycline HCL 50 mg water 50 ml Los de oxytetracycline HCl op door het water geleidelijk in kleine porties en onder voortdurend schudden en roeren aan het poeder toe te voegen. Druk grote delen, die zich niet snel genoeg in het water verdelen, fijn met een glazen staaf. Laat niet-opgeloste deeltjes gedurende korte tijd bezinken en steriliseer vervolgens de bovenstaande vloeistof door middel van filtratie. Het antibioticum is tevens in steriele toestand in oplossing in ampullen verkrijgbaar. Open, bij gebruik daarvan, deze ampullen op aseptische wijze en verdun met steriel water tot de bovenaangegeven concentratie. De aldus verkregen oplossing dient in de koelkast bewaard te worden en is dan enige weken houdbaar. Een lichte verkleuring duidt niet op wijziging van de activiteit. 5.3.1.3. bereiding [Regeling vervallen per 23-02-2005] Voeg onder aseptische voorzorgen onmiddellijk vóór het gebruik per 100 ml van het opgesmolten en tot ca. 50°C afgekoelde basismedium (5.3.1.1) toe 10 ml van de onder 5.3.1.2 genoemde oxytetracycline-oplossing en meng. 5.3.2. werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] Gebruik in ieder geval een volgens 5.2 bereide verdunning 1 : 10 en daarnaast zo nodig verdere decimale verdunningen, indien verwacht wordt dat alleen in dat geval platen zullen worden verkregen met een aantal specifieke kolonies gelegen tussen 10 en 100. Pipetteer 1 ml van elke te onderzoeken verdunning in elk van 2 petrischalen (diameter tenminste 12 cm), voeg toe 15-25 ml van het tot ca. 45°C afgekoelde volgens 5.3.1.3 bereide medium (hoeveelheid afhankelijk van de gebruikte petrischaal), meng en laat stollen. Bebroed de platen bij 24 ± 1°C. Tel na 2, 3, en 5 dagen en noteer voor elke plaat het hoogste van de aldus verkregen resultaten. Houd er rekening mee, dat sporen, afkomstig van eerder gegroeide schimmelkolonies, die zich over de platen hebben verspreid, na 5 dagen tot groei van secundaire kolonies kunnen leiden. De laatste dienen uiteraard niet te worden meegeteld. Ga bij twijfel hieromtrent microscopisch na of op gistkolonies gelijkende kolonies ook inderdaad uit gisten bestaan. 5.4. Berekening en opgave [Regeling vervallen per 23-02-2005] Neem het gemiddelde van de beide volgens 5.3.2 gevonden duplo-waarden en rond dit getal af als onder 1.5 aangegeven. Ga ook voor de verdere berekening en opgave te werk als aldaar vermeld. 6. Microbiologische oriëntatie omtrent conserveermiddelen [Regeling vervallen per 23-02-2005] 6.1. Definitie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Conserveermiddel wordt voorlopig geacht aanwezig te zijn, indien rondom een met extract van de te onderzoeken waar geïmpregneerd schijfje papier bij bebroeding op een met Bacillus subtilis beënte agarplaat gedurende 18-20 uur bij 30°C, als beschreven in 6.4.3, een heldere zone ontstaat terwijl de rest van de plaat troebel wordt. 6.2. Media en verdere benodigdheden [Regeling vervallen per 23-02-2005] 6.2.1. kweekmedium voor Bacillus subtilis ATCC 6633 [Regeling vervallen per 23-02-2005] vleesextract 3 g pepton 5 g agar 15 g water 1000 ml Maak een oplossing van de bovenaangegeven samenstelling, breng de pH op 6,8 ± 0,1 en steriliseer gedurende 20 min. bij 120°C. 6.2.2. suspensievloeistof voor Bacillus subtilis [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 1.2. 6.2.3. extractievloeistof voor de conserveermiddelen [Regeling vervallen per 23-02-2005] 6.2.3.1. citroenzuuroplossing [Regeling vervallen per 23-02-2005] citroenzuur (C6H8O7.H2O) 21 g water 1000 ml 6.2.3.2. fosfaatoplossing [Regeling vervallen per 23-02-2005] dinatriumwaterstoffosfaat Na2HPO4.2H2O) 17,8 g water 1000 ml 6.2.3.3. bereiding [Regeling vervallen per 23-02-2005] Voeg de beide bovengenoemde oplossingen in dusdanige hoeveelheid bij elkaar, dat een pH-waarde van 5,0 ± 0,1 wordt verkregen. 6.2.4. medium voor het aantonen [Regeling vervallen per 23-02-2005] Hiervoor zij verwezen naar 1.3.1 Vul af in buizen à 5 ml per buis. 6.2.5. schijfjes filtreerpapier [Regeling vervallen per 23-02-2005] Pons uit vellen dik filtreerpapier schijfjes met een diameter van 12,7 mm. De schijfjes zijn ook als zodanig in de handel verkrijgbaar. 6.3. Voorbereiding [Regeling vervallen per 23-02-2005] 6.3.1. het aanhouden van de bacteriecultuur [Regeling vervallen per 23-02-2005] Ent de stam van Bacillus subtilis ATCC 6633 regelmatig over op het onder 6.2.1 genoemde schuingestolde medium. Kweek aanvankelijk bij 37 ± 1°C en bewaar de cultuur daarna bij 4°C. 6.3.2. het bereiden van de sporesuspensie [Regeling vervallen per 23-02-2005] Maak een zichtbaar troebele suspensie van het volgens 6.3.1 verkregen materiaal in de onder 6.2.2 genoemde vloeistof en beënt hiermede door overgieten een aantal platen met het onder 6.2.1 genoemde medium. Bebroed deze platen 7 dagen bij 37 ± 1°C. Breng vervolgens op elke plaat 5 ml van de onder 6.2.2 genoemde vloeistof en suspendeer daarin met behulp van een steriele entnaald het gegroeide bacteriemateriaal. Verzamel dit materiaal tot één hoeveelheid in een met steriele glaskralen voorziene steriele fles met schroefdop, schud gedurende 5 min. op een schudapparaat en verhit gedurende 10 min. bij 80 ± 1°C. Tel het aantal sporen op de wijze als aangegeven onder 1, daarbij echter gebruikmakend van het onder 6.2.1 genoemde medium. Breng de suspensie over in een steriel stopflesje. Wil men de sporen langdurig bewaren zonder dat noemenswaardig verlies optreedt, dan dient men in plaats van de onder 6.2.2 genoemde vloeistof voor het suspenderen 1 / 4 Ringer-vloeistof te gebruiken. Bewaar steeds bij ca. 5°C. 6.4. Werkwijze [Regeling vervallen per 23-02-2005] 6.4.1. het vervaardigen van de platen [Regeling vervallen per 23-02-2005] Verdun de volgens 6.3.2 bereide sporesuspensie tot een concentratie van ca. 105 sporen per ml. Breng voor elke te gieten plaat 0,5 ml van deze suspensie in 5 ml van het onder 6.2.4 genoemde opgesmolten en tot ca. 50°C afgekoelde medium, meng, giet uit in verwarmde petrischalen met een diameter van 9 cm en laat stollen. Desgewenst kunnen ook petrischalen met een andere diameter worden gebruikt, mits hiermee bij de hoeveelheid rekening wordt gehouden, zodat dezelfde laagdikte wordt verkregen. 6.4.2. het extraheren van de conserveermiddelen [Regeling vervallen per 23-02-2005] Meng in een mixer het te onderzoeken monster met zo weinig mogelijk van de onder 6.2.3 genoemde extractievloeistof. Hiertoe is maximaal nodig een hoeveelheid gelijk aan 2 maal de afgewogen hoeveelheid monster, doch meestal veel minder. Breng de pH van het mengsel op pH = 5,0 ± 0,1 en centrifugeer bij 100 g. Indien reeds bij de extractie voldoende vrij vocht wordt verkregen, kan het centrifugeren achterwege worden gelaten. 6.4.3. uitvoering van de proef [Regeling vervallen per 23-02-2005] Houd een schijfje van het onder 6.2.5 genoemde papier met behulp van een met 70% zuivere ethanol gereinigd pincet met de rand juist in de te onderzoeken vloeistof, zodat het schijfje zich snel daarmee volzuigt. Breng het schijfje over op een volgens 6.4.1 vervaardigde plaat en druk het zachtjes aan. Verricht ter controle hetzelfde met een schijfje dat met de volgens 6.2.3 bereide extractievloeistof wordt geïmpregneerd. Op één plaat kunnen op deze wijze ten hoogste 4 schijfjes worden aangebracht, waarvan één geïmpregneerd met alleen de extractievloeistof. Bebroed de platen gedurende 18-20 uur bij 30 ± 1°C. Conserveermiddelen worden voorlopig geacht aanwezig te zijn, indien zich na afloop rondom het betreffende schijfje een vrijwel concentrische heldere zone van tenminste 1 mm heeft gevormd, terwijl de rest van de plaat troebel is. Rond de controleschijfjes mag geen zone te zien zijn. Dit laatste is een gevolg van eventueel remmende stoffen in het papier, die ook aanleiding kunnen geven tot heldere lobben die niet het gehele papier omgeven. 7. Opmerkingen [Regeling vervallen per 23-02-2005] 7.1. Waar in deze Methoden van Onderzoek sprake is van water kan gebruikt worden hetzij gedemineraliseerd water, hetzij uit glas gedestilleerd water. 7.2. Het eerste ingrediënt is in de handel verkrijgbaar, bijvoorbeeld onder de namen "trypton" of "trypticase". Het gehele medium is in gedroogde vorm, met mogelijk een iets andere hoeveelheid agar, in de handel verkrijgbaar onder de naam "plate count agar". 7.3. Dit medium is in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder de naam "E.E.-broth". 7.4. Het in gedroogde vorm met mogelijk een iets andere hoeveelheid agar in de handel verkrijgbare "violet red bile dextrose agar", dat naast de genoemde ingrediënten 10 g lactose per l bevat, kan hiervoor worden gebruikt. In de handel is tevens onder de naam "violet red bile agar" een medium verkrijgbaar, dat een analoge samenstelling vertoont. Het bevat echter alleen lactose. Dit medium kan ook worden gebruikt, mits per liter 10 g glucose wordt toegevoegd. 7.5. Soortgelijke media, maar zonder glucose en met minder agar zijn in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder namen als "OF basal medium". Deze zijn te gebruiken, mits de ontbrekende ingrediënten worden toegevoegd resp. aangevuld. 7.6. Dit medium is in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder de naam "nutrient agar". 7.7. Dit medium is in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder de naam "tetrathionate broth base". 7.8. Dit medium is in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder de naam "brillant green agar (modified)". 7.9. Media van deze en analoge evenzeer bruikbare samenstelling zijn in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder de naam "triple sugar iron agar". Desgewenst kan ook de in de handel verkrijgbare "Kligler agar" worden gebruikt. Deze verschilt in samenstelling met triple sugar iron agar in dit opzicht, dat ze geen saccharose bevat. Dit dient dus afzonderlijk te worden toegevoegd. 7.10. De betreffende sera zijn verkrijgbaar bij het RIV in Bilthoven. 7.11. Dit medium is in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder de naam "Baird-Parker-medium". 7.12. Dit medium is in gedroogde vorm in de handel verkrijgbaar onder de naam "brain heart infusion". Enzymatisch verteerd vers vlees is verkrijgbaar onder de naam "proteose peptone".