Identification and differentiation of Heterotardigrada and Eutardigrada species by riboprinting
2007-05-14

In the last decades, the number of known tardigrade species has considerably increased to more than 960 species with new ones being discovered every year. However, the study of tardigrade species presents a general problem which is frequently encountered during the work with invertebrates: small size and remarkable degrees of phenotypic plasticity may sometimes not permit a definite identification of the species. In this investigation we have used riboprinting, a tool to study rDNA sequence variation, in order to distinguish tardigrade species from each other. The method combines a restriction site variation approach of ribotyping with amplified DNAs. In eight investigated species of heterotardigrades and eutardigrades we have amplified the genes for the small subunit ribosomal RNA (SSU; 18S) and subsequently sequenced the genes. Virtual riboprints were used for identification of restriction sites from ten already published 18S rDNA sequences and seven new 18S rDNA sequences. On the basis of the obtained sequences, diagnostic restriction fragment patterns can be predicted with only 11 restriction enzymes. The virtual digestion confirmed the obtained restriction fragment patterns and restriction sites of all amplified and digested tardigrade DNAs. We show that the variation in positions and number of restriction sites obtained by standard restriction fragment analysis on agarose gels can be used successfully for taxonomic identification at different taxonomic levels. The simple restriction fragment analysis provides a fast and convenient method of molecular barcoding for species identification in tardigrades. Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurden viele neue Tardigradenarten beschrieben. Zur Zeit sind mehr als 960 Arten bekannt und jedes Jahr kommen neue Arten hinzu. Die Arbeit mit Tardigraden stellt jedoch oftmals ein Problem dar, das generell auch bei anderen Organismen von großer Bedeutung ist: die geringe Größe und die außergewöhnliche phenotypische Plastizität machen in vielen Fällen eine genaue Artidentifikation schwierig. In der vorliegenden Untersuchung verwenden wir das Riboprinting, eine Technik, rDNA Sequenzunterschiede zu erfassen, um damit verschiedene Tardigradenarten voneinander zu differenzieren. Diese Methode vereint den Ansatz der Restriktionsschnittstellenanalyse des Riboprinting mit amplifizierten DNAs. Von acht untersuchten Heterotardigraden und Eutardigraden wurden die Gene für die kleine ribosomale RNA Untereinheit (SSU; 18S) amplifiziert und sequenziert. Virtuelle Riboprints wurden zur Identifikation von zehn bereits publizierten 18S rDNA Sequenzen und sieben neuen 18S DNA Sequenzen erstellt. Auf der Basis der vorliegenden Sequenzen können die diagnostischen Restriktionsfragmentmuster mit insgesamt elf Restriktionsenzyme vorhergesagt werden. Der virtuelle Verdau bestätigt die Restriktionsfragmentmuster und Restriktionsschnittstellen aller amplifizierten und verdauten Tardigraden DNAs. Wir zeigen, dass die unterschiedlichen Variationen in den Positionen und Anzahl der Restriktionsschnittstellen erfolgreich zur taxonomischen Identifikation auf verschiedenen taxonomischen Ebenen verwendet werden können. Die einfache Restriktionsfragmentanalyse stellt eine schnelle und geeignete Methode für das molekulare Barcoding zur Artidentifikation bei Tardigraden dar.