1,0 g/l се приготвя чрез претегляне с точност до 0,1 mg на 100 mg амониев глицеризинат в 100-милилитрова колба. Прибавя се малко 50 об. % етанол (4.5) и се разтваря амониевият глицеризинат. След като се е разтворил, се допълва до отбелязаното с 50 об. % етанол (4.5).Най-малко четири други разтвора, съответстващи на 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 g/l амониев глицеризинат се приготвят като се капнат съответно 5 ml, 10 ml, 25 ml и 50 ml от запасния разтвор 1,0 g/l в отделни 100-милилитрови колби. След това се допълва до отбелязаното с 50 об. % етанол (4.5) и се разбърква добре.Всички разтвори се филтрират през филтър за органични разтворители.5. Апаратура и оборудване5.1. Система за отделяне5.1.1. Високоефективен течен хроматограф.5.1.2. Изпомпваща система, позволяваща да се достигне и поддържа постоянна или програмирана скорост на потока с голяма точност.5.1.3. Система за UV спектрофотометрична детекция: да бъде поставена на 254 nm.5.1.4. Система за обезгазяване на разтворителя.5.2. Изчислителен интегратор или записващо устройство, работата на което е съвместима с останалата част на системата.5.3. Колона (пример):Материал: неръждаема стомана или стъклоВътрешен диаметър: от 4 до 5 mmДължина: от 100 до 250 mmСтационарна фаза: силицев двуокис с напречни връзки с (за предпочитане сферична) октадецил функционална група (C18), максимален размер на частиците: 5 μm.5.4. Лабораторно оборудване5.4.1. Аналитична везна с точност 0,1 mg5.4.2. Стъклария с обем А-клас5.4.3. Микромембранна филтрация за малки обеми.6. Хроматографски условия6.1. Характеристики на разтвора за отстраняване на абсорбираните вещества: (пример)- скорост на потока: 1 ml/min,- разтворител А = 30 %,- разтворител Б = 70 %.6.2. Детекция:- UV = 254 nm7. Процедура7.1. Приготвяне на спиртната пробаДа се филтрира при необходимост чрез филтър за органични разтворители (диаметър на порите: 0.45 μm).7.2. ОпределянеСлед като се установят хроматографичните условия,- се инжектират 20 μl референтен разтвор В (4.7.1.),- се инжектират 20 μl от пробния разтвор,- сравняват се двете хроматограми. Определят се максимумите на глицеризиновата киселина от тяхното време на задържане. Измерват се техните повърхности (или височини) и се изчислява концентрацията в g/l до втория десетичен знак, като се използва следното равенство:c = c ×h × P × 823H × 100 × 840Където:с е концентрацията в грамове за литър на глицеризиновата киселина в спирта, който се анализираС е концентрацията в грамове за литър на амониевия глицеризинат в референтния разтворh е повърхността (или височината) на максимума на глицеризиновата киселина на спирта, който се анализираH е повърхността (или височината) на максимума на глицеризиновата киселина на референтния разтворP е чистотата на референтния амониев глицеризинат (в %)823 е масата на един мол глицеризинова киселина840 е масата на един мол амониев глицеризинат8. Характеристики на работа на метода (точност)Статистически резултати от вътрешнолабораторния тест:стойностите за глицеризиновата киселина са дадени в следната таблица.Следните данни са получени от международно изследване на действието на метода, извършено в съответствие с международно съгласувани процедури.Година на вътрешнолабораторния тест | 1998 |Брой на лабораториите | 16 |Брой на пробите | 5 |Аналит | глициризинова киселина |Проби | А | Б | В | Г | Д |Брой на лабораториите, ангажирани след отстраняването на отделените слоеве | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 |Брой на отделените слоеве (лаборатории)