text: aufgelöst 3.8 Natriumhydroxidlösung 40 v.H. (G/V) 3.9 0,1 N Natriumhydroxidlösung 3.10 0,25 N Natriumhydroxidlösung 3.11 Gesättigte Natriumsulfidlösung p.a. 3.12 Natriumthiosulfatlösung 8 v.H. (G/V), Na2S2O3 7 5 H2O p.a. 3.13 Bimsstein gekörnt, mit Salzsäure gewaschen und geglüht 4. Geräte Aufschlussapparat und Destillationsapparat nach Kjeldahl (s. Bemerkung 7.1) 5. Ausführung 5.1 Aufschluß 1 g der Probe wird auf 1 mg genau eingewogen und in den Kolben des Aufschlussapparats gebracht. 10 g Kaliumsulfat (3.1), eine passende Menge des Katalysators (3.2) (0,3 bis 0,4 g Kupferoxid oder 0,9 bis 1,2 g Kupfersulfat oder ein Tropfen Quecksilber oder 0,6 bis 0,7 g Quecksilberoxid), 25 ml Schwefelsäure (3.4) und ein paar Bimssteinkörner (3.13) werden hinzugefügt und der Kolbeninhalt gemischt. Der Kolben wird zunächst mässig, dann - unter Schütteln von Zeit zu Zeit - bis zur Verkohlung der Substanz und zum Verschwinden des Schaums und schließlich intensiv bis zum gleichmässigen Sieden der Flüssigkeit erhitzt. Eine Überhitzung der Kolbenwände und ein Anhängen organischer Teile an ihnen sind zu vermeiden. Sobald die Lösung klar und farblos (bzw. hellgrün, wenn ein kupferhaltiger Katalysator verwendet wurde) ist, wird noch 1 Stunde lang weiter im Sieden gehalten, danach abkühlen gelassen. 5.2 Destillation Unter fortlaufendem Schwenken werden vorsichtig 250 bis 350 ml Wasser zugegeben, wobei sich die Sulfate vollständig lösen sollen. Man lässt abkühlen ; sodann werden einige Zinkkörnchen (3.3) zugesetzt. In den Auffangkolben des Destillierapparats werden je nach dem zu erwartenden Stickstoffgehalt genau 25 ml 0,1 N (3.5) oder 0,5 N (3.6) Schwefelsäure (s. Bemerkung 7.2) gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (3.7) hinzugefügt. Der Kolben wird mit dem Kühler des Destillationsapparats verbunden und dessen äusserstes Ende mindestens 1 cm tief in die Flüssigkeit des Auffangkolbens gesenkt (s. Bemerkung 7.3). Durch den Hahntrichter werden 100 ml Natriumhydroxidlösung 40 v.H. (3.8) langsam in den Destillierkolben eingefuellt. Bei Verwendung eines Quecksilber-Katalysators sind in den Destillierkolben ausserdem 10 ml Natriumsulfidlösung (3.11) oder 25 ml Natriumthiosulfatlösung (3.12) hinzuzufügen. Der Kolben ist so zu erhitzen, daß in 30 Minuten etwa 150 ml der Flüssigkeit abdestilliert werden. Nach Ablauf dieser Zeit ist die neutrale Reaktion des übergehenden Destillats mit Lackmuspapier zu kontrollieren. Ist die Reaktion alkalisch, so ist die Destillation fortzusetzen. Sie ist zu beenden, wenn das Destillat sich auf dem Lackmuspapier als neutral erweist. Während des Destillationsvorgangs ist der Inhalt des Auffangkolbens von Zeit zu Zeit zu schwenken und seine Färbung zu beobachten. Wenn sie ins Gelbliche umschlägt, ist sofort eine genau abgemessene Menge 0,1 N (3.5) oder 0,5 N (3.6) Schwefelsäure zuzusetzen. 5.3 Titration In dem Auffangkolben wird der Überschuß an Schwefelsäure mittels 0,1 N (3.9) oder 0,25 N (3.10) Natriumhydroxidlösung, je nach Normalität der verwendeten Schwefelsäure, bis zum Umschlag der Färbung zu klarem Gelb titriert. 5.4 Kontrolle der Methode Zur Feststellung, ob die Reagenzien stickstofffrei sind, ist ein Blindversuch (Destillation und Titration) ohne die zu analysierende Probe vorzunehmen. Zur Kontrolle der Genauigkeit der Methode ist die Analyse (Aufschluß, Destillation und Titration) mit 1,5 bis 2,0 g Azetanilid p.a. (Schmelzpunkt : 114 oC ; % N : 10,36) bei Anwesenheit von 1 g stickstofffreier Saccharose vorzunehmen. 1


text: g Azetanilid verbraucht 14,80 ml 0,5 N Schwefelsäure. 6. Berechnung der Ergebnisse Die Menge der verbrauchten Schwefelsäure wird ermittelt. 1 ml 0,1 N Schwefelsäure entspricht 1,4 mg Stickstoff. Die Stickstoffmenge wird mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Das Ergebnis wird in Hundertteilen der Probe ausgedrückt. Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von - weniger als 20 v.H. Rohprotein - 0,2 v.H. absolut, - 20 v.H. bis 40 v.H. Rohprotein - 1,0 v.H. relativ, - mehr als 40 v.H. Rohprotein - 0,4 v.H. absolut nicht überschreiten. 7. Bemerkungen 7.1 Geräte, bei denen ein Umfuellen zwischen Aufschluß und Destillation erforderlich ist, können verwendet werden. Auf verlustloses Umfuellen ist zu achten. 7.2 Bei stickstoffarmen Futtermitteln kann die in den Auffangkolben einzufuellende Menge 0,1 N Schwefelsäure gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert und mit Wasser auf 25 ml aufgefuellt werden. 7.3 Befindet sich kein Hahntrichter an dem Destillationsapparat, so erfolgt der Zusatz der Natriumhydroxidlösung unmittelbar bevor der Kolben mit dem Kühler verbunden wird ; die Flüssigkeit ist in diesem Fall langsam an den Kolbenwänden entlanglaufen zu lassen, um zu vermeiden, daß sie sich mit der sauren Lösung vermischt. 3. BESTIMMUNG DES DURCH PEPSIN UND SALZSÄURE LÖSBAREN ROHPROTEINS 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des durch Pepsin und Salzsäure lösbaren Rohproteins unter definierten Bedingungen. Sie gilt für alle Futtermittel. 2. Prinzip Die Probe wird 48 Stunden lang bei 40 oC mit einer Pepsin-Salzsäure-Lösung behandelt. Die Suspension wird filtriert und der Stickstoffgehalt des Filtrats nach der für die Bestimmung von Rohprotein beschriebenen Methode bestimmt. 3. Reagenzien 3.1 Salzsäure, D : 1,125 3.2 0,075 N Salzsäure 3.3 Pepsin 2.0 E/mg. Die Aktivität ist definiert in der Vorschrift des Teils 4 dieser Anlage und hiernach zu kontrollieren. 3.4 Pepsinlösung ca. 0,02 v.H. (G/V) in Salzsäure (3.2), frisch zubereitet. Aktivität 400 E/l 3.5 Antischaumemulsion (z.B. Silikon) 3.6 Sämtliche unter Punkt 3 der Methode zur Bestimmung von Rohproteinen aufgeführte Reagenzien 4. Geräte 4.1 Wasserbad oder Brutschrank, auf 40 oC ± 1 oC eingestellt 4.2 Apparatur zum Aufschluß und zur Destillation nach Kjeldahl 5. Ausführung 5.1 Lösen des Rohproteins (s. Bemerkung 7.2) 2 g der Probe werden auf 1 mg genau eingewogen und in einen 500-ml-Meßkolben gebracht. Dann fügt man 450 ml Pepsinlösung (3.4), die zuvor auf 40 oC erwärmt wurden, hinzu und schüttelt um, um Klümpchenbildung zu verhindern. Es ist darauf zu achten, daß der pH-Wert der Suspension unter 1,7 liegt. Der Kolben wird ins Wasserbad oder in den Brutschrank (4.1) gestellt und dort 48 Stunden belassen. Nach 8,24 und 32 Stunden ist er zu schütteln. Nach 48 Stunden werden 15 ml Salzsäure (3.1) zugesetzt, auf 20 oC abkühlen gelassen, mit Wasser zur Marke aufgefuellt und filtriert. 5.2 Aufschluß 250 ml des Filtrats werden abgenommen und in den Kolben der Aufschlussapparatur (4.2) gefuellt. Dann werden die zum Aufschluß benötigten Reagenzien, wie in der Beschreibung der Methode zur Bestimmung des Rohproteins unter Punkt 5.1, zweiter Satz, angegeben, hinzugefügt. Es wird gemischt und bis zum Sieden erhitzt. Falls sich starker Schaum

type: legislation

jurisdiction: EU


text: bildet, werden einige Tropfen Antischaumemulsion (3.5) zugesetzt. Die Flüssigkeit wird im kräftigen Sieden gehalten, bis das Wasser fast vollständig verdampft ist. Die letzten Wasserspuren werden vorsichtig bei verringerter Hitze beseitigt. Wenn die Lösung klar und farblos (bzw. hellgrün bei Verwendung eines kupferhaltigen Katalysators) ist, wird das Sieden noch eine Stunde lang fortgesetzt ; dann lässt man abkühlen. 5.3 Destillation und Titration Es ist wie in der Methode zur Bestimmung von Rohproteinen unter 5.2 und 5.3 angegeben zu verfahren. 5.4 Blindversuch Ein Blindversuch wird unter Anwendung desselben Verfahrens ohne Analysenprobe ausgeführt. 6. Berechnung der Ergebnisse Das Volumen an Schwefelsäure, das im Blindversuch verbraucht wird, wird von dem Verbrauch der Analysenprobe abgezogen. 1 ml 0,1 N Schwefelsäure entspricht 1,4 mg Stickstoff. Die erhaltene Stickstoffmenge wird mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Das Ergebnis wird in Hundertteilen der Probe ausgedrückt. Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe - bei Gehalten von weniger als 20 v.H. lösbarem Rohprotein 0,4 v.H. absolut, - bei Gehalten von 20 bis 40 v.H. lösbarem Rohprotein 2 v.H. relativ, - bei Gehalten von mehr als 40 v.H. lösbarem Rohprotein 0,8 v.H. absolut nicht überschreiten. 7. Bemerkungen 7.1 Die ermittelten Werte stehen in keinem unmittelbaren Zusammenhang mit der Verdaulichkeit in vivo. 7.2 Futtermittel, deren Rohfettgehalt 10 v.H. übersteigt, sind durch Extraktion mit Petroläther (Kp 40 - 60 oC) zu entfetten. 4. BESTIMMUNG DER PEPSINAKTIVITÄT 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode dient zur Kontrolle der Aktivität des Pepsins, das zur Bestimmung des durch Pepsin und Salzsäure lösbaren Rohproteins verwendet wird. 2. Prinzip Hämoglobin wird unter definierten Bedingungen mit Pepsin und verdünnter Salzsäure behandelt. Der nicht hydrolysierte Anteil der Proteine wird mit Trichloressigsäure gefällt. Das Filtrat wird mit Natriumhydroxidlösung und mit Reagenz nach Folin-Ciocalteu versetzt. Die Extinktion dieser Lösung wird bei 750 nm gemessen und die dieser Extinktion entsprechende Menge Tyrosin einer Eichkurve entnommen. Definition : Die Pepsin-Einheit (E) wird definiert als die Enzymmenge, die unter den Bedingungen der Methode pro Minute soviel Hydroxyaryl-Verbindungen freisetzt, daß deren Färbung mit Folin-Ciocalteu-Reagenz eine Extinktion ergibt, die derjenigen von 1 ¶ Mol Tyrosin unter den gleichen Bedingungen entspricht. 3. Reagenzien 3.1 0,2 N Salzsäure 3.2 0,06 N Salzsäure 3.3 0,025 N Salzsäure 3.4 Trichloressigsäurelösung 5 v.H. (G/V) 3.5 0,5 N Natriumhydroxidlösung 3.6 Reagenz nach Folin-Ciocalteu : 100 g Natriumwolframat (Na2W04 7 2 H2O), 25 g Natriummolybdat (Na2MoO4 7 2 H2O) und 700 ml Wasser werden in einen 2-l-Rund-kolben mit Schliffstopfen gegeben. Man fügt 50 ml Phosphorsäure (D : 1,71) und 100 ml konzentrierte Salzsäure (D : 1,19) hinzu, verbindet den Kolben mit einem Rückflußkühler, erhitzt zum Sieden und hält die Lösung 10 Stunden lang im gelinden Sieden. Nach dem Abkühlen entfernt man den Rückflußkühler, gibt 175 g Lithiumsulfat (Li2SO4 7 2 H2O), 50 ml Wasser und 1 ml Brom hinzu. Anschließend kocht man 15 Minuten lang zur Entfernung des überschüssigen Broms. Nach Abkühlen überführt man die Lösung in einen 1-l-Meßkolben, fuellt mit Wasser auf, schüttelt um und filtriert. Das fertige Reagenz darf keine grünliche Farbe aufweisen. Vor Gebrauch werden 1 Volumenteil


text: Reagenz mit 2 Volumenteilen Wasser verdünnt. 3.7 Hämoglobinlösung : Eine 354 mg Stickstoff (1) entsprechende Hämoglobinmenge (ca. 2 g), Proteasesubstrat nach Anson, wird eingewogen und in einen 200-ml-Kolben mit Schliffstopfen gebracht. Man gibt einige ml 0,06 N Salzsäure (3.2) hinzu, schließt den Kolben an der Vakuumpumpe an und schüttelt, bis das Hämoglobin vollständig gelöst ist. Man entfernt das Vakuum und gibt unter Umschütteln die noch zu 100 ml fehlende Menge Salzsäure (3.2) hinzu. Vor Gebrauch frisch herzustellen. 3.8 Tyrosin-Standardlösung : 181,2 mg Tyrosin werden in Salzsäure (3.1) gelöst und zu 1 l mit derselben Säure aufgefuellt (Stammlösung). 20,0 ml dieser Lösung werden entnommen und mit Salzsäure (3.1) auf 100 ml verdünnt. 1 ml dieser Lösung enthält 0,2 ¶ Mol Tyrosin. 4. Geräte 4.1 Ultrathermostat, auf 25 oC ± 0,1 oC eingestellt 4.2 Spektralphotometer 4.3 Chronometer, Genauigkeit : 1 sec. 4.4 pH-Meßgerät 5. Ausführung 5.1 Herstellung der Lösung (s. Bemerkung 7.1) 150 mg Pepsin werden in 100 ml Salzsäure (3.2) gelöst. Von dieser Lösung werden 2 ml abpipettiert und in einem 50-ml-Meßkolben mit Salzsäure (3.3) zur Marke aufgefuellt. Der mit dem pH-Meßgerät kontrollierte pH-Wert sollte 1,6 ± 0,1 betragen. Der Kolben wird in den Ultrathermostaten (4.1) gebracht. 5.2 Hydrolyse 5,0 ml Hämoglobinlösung (3.7) werden in ein Reagenzglas pipettiert und im Ultrathermostat (4.1) auf 25 oC erwärmt. Dann gibt man 1,0 ml der nach 5.1 erhaltenen Pepsinlösung zu, mischt durch etwa 10maliges Auf- und Abbewegen eines am Ende verdickten Glasstabes und belässt das Reagenzglas, von der Zugabe der Pepsinlösung an gerechnet, genau 10 Minuten lang bei 25 oC im Wasserbad (Zeit und Temperatur sind genau einzuhalten). Nach Ablauf dieser Zeit fügt man 10,0 ml der zuvor auf 25 oC gebrachten Trichloressigsäurelösung (3.4) hinzu, schüttelt um und filtriert durch ein trockenes Filter. 5.3 Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion 5,0 ml des Filtrats werden in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben pipettiert, mit 10,0 ml Natriumhydroxidlösung (3.5) versetzt, dann werden unter stetigem Umschütteln 3,0 ml des verdünnten Reagenz nach Folin-Ciocalteu (3.6) hinzugefügt. Nach 5 bis 10 Minuten wird die Extinktion der Lösung in 1-cm-Kuevetten bei 750 nm gegen Wasser photometrisch bestimmt. (1)Der Gehalt an Stickstoff wird nach der Halb-Mikrokjeldahlmethode bestimmt (theoretischer Gehalt : 17,7 % N). 5.4 Blindversuch Zu jeder Bestimmung ist ein Blindversuch wie folgt durchzuführen: 5,0 ml Hämoglobinlösung (3.7) werden in ein Reagenzglas pipettiert und im Ultrathermostaten (4.1) auf 25 oC erwärmt. Dann gibt man 10,0 ml der zuvor auf 25 oC gebrachten Trichloressigsäurelösung (3.4) hinzu, mischt und fügt anschließend 1,0 ml der nach 5.1 erhaltenen Pepsinlösung hinzu. Man mischt mittels eines Glasstabes und belässt das Reagenzglas genau 10 Minuten lang bei 25 oC im Wasserbad (4.1). Es wird umgeschüttelt und filtriert. Dann wird das Verfahren wie unter 5.3 beschrieben fortgeführt. 5.5 Eichkurve In 50-ml-Erlenmeyerkolben werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 5,0 ml Tyrosinstandardlösung (3.8) (entsprechend den Tyrosinmengen von 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 ¶ Mol) gegeben. Die Reihe wird durch eine tyrosinfreie Vergleichsprobe vervollständigt. Die einzelnen Ansätze werden mit Salzsäure (3.1) auf 5,0 ml ergänzt. Weiter werden 10,0 ml Natriumhydroxidlösung (3.5) und


text: unter ständigem Schütteln 3,0 ml des verdünnten Reagenz nach Folin-Ciocalteu (3.6) zugegeben. Die Extinktion wird gemäß 5.3, letzter Satz, gemessen. Die Eichkurve wird durch Auftragen der zugesetzten Mengen Tyrosin gegen die Extinktion festgelegt. 6. Berechnung der Ergebnisse Man entnimmt der Eichkurve die Menge an Tyrosin in ¶ Mol, die der durch den Blindwert korrigierten Extinktion der gefärbten Lösungen entspricht. Die Aktivität des Pepsins in ¶ Mol Tyrosin pro mg und pro Minute bei 25 oC ist nach folgender Formel zu berechnen: >PIC FILE= "T0004335"> wobei: a = aus der Eichkurve entnommene Tyrosinmenge in ¶ Mol, p = Gewicht in mg der gemäß 5.2 zugesetzten Pepsinmenge. 7. Bemerkung 7.1 Die aufzulösende Menge an Pepsin ist so zu wählen, daß bei der photometrischen Endmessung eine Extinktion von 0,35 ± 0,035 erreicht wird. 7.2 2 E/mg, bestimmt nach dieser Methode, entsprechen 3,64 m-Anson E/mg (¶ Mol Tyrosin/mg 7 Min. bei 35,5 oC) oder 36 400 handelsüblichen E/g (¶ Mol Tyrosin/g 7 10 Min. bei 35,5 oC). 5. BESTIMMUNG VON FREIEM UND GESAMTGOSSYPOL 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung von freiem Gossypol, Gesamtgossypol und chemisch nahe verwandter Substanzen in Samen, Mehl und Kuchen von Baumwollsaat sowie in Mischfuttermitteln, die Erzeugnisse aus Baumwollsaat enthalten. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 20 ppm. 2. Prinzip Gossypol wird in Gegenwart von 3-Amino-1-Propanol entweder mit einer Isopropanol-Hexan-Mischung für die Bestimmung von freiem Gossypol oder mit Dimethylformamid für die Bestimmung von Gesamtgossypol extrahiert und mittels Anilin zu Gossypoldianilin umgesetzt, dessen Extinktion bei 440 nm gemessen wird. 3. Reagenzien 3.1 Isopropanol-Hexan-Mischung : 60 Volumenteile Isopropanol p.a. werden mit 40 Volumenteilen n-Hexan gemischt. 3.2 Lösungsmittel A : In einen 1-l-Meßkolben werden ungefähr 500 ml Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1), 2 ml 3-Amino-1-Propanol, 8 ml Eisessig und 50 ml Wasser gefuellt und mit Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefuellt. Dieses Reagenz ist eine Woche lang haltbar. 3.3 Lösungsmittel B : In einen 100-ml-Meßkolben werden 2 ml 3-Amino-1-Propanol und 10 ml Eisessig abpipettiert, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit N,N-Dimethylformamid zur Marke aufgefuellt. Dieses Reagenz ist eine Woche lang haltbar. 3.4 Anilin p.a. : Wenn die Extinktion im Blindversuch 0,022 überschreitet, ist das Anilin über Zinkstaub unter Verwerfung der ersten und letzten 10 v.H. Teile des Destillats zu destillieren. In einem braunen, geschlossenen Gefäß ist dieses Reagenz einige Monate im Kühlschrank haltbar. 3.5 Gossypol-Standardlösung A : In einem 250-ml-Meßkolben werden 27,9 mg Gossypol-Acetat mit Lösungsmittel A (3.2) gelöst und dann damit zur Marke aufgefuellt. 50 ml dieser Lösung werden in einen 250-ml-Meßkolben pipettiert und mit Lösungsmittel A (3.2) zur Marke aufgefuellt. Die Konzentration dieser Lösung an Gossypol beträgt 0,02 mg/ml. Vor Gebrauch lässt man 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen. 3.6 Gossypol-Standardlösung B : In einem 50-ml-Meßkolben werden 27,9 mg Gossypol-Acetat in Lösungsmittel B (3.3) gelöst und zur Marke aufgefuellt. Die Konzentration dieser Lösung an Gossypol beträgt 0,5 mg/ml. Die Standard-Gossypol-Lösungen sind vor Lichteinwirkung geschützt 24 Stunden lang haltbar. 4. Geräte 4.1 Mechanischer Schüttelapparat : ungefähr 35 U/min. 4.2 Spektralphotometer. 5. Ausführung 5.1 Einwaage Die Grösse der Einwaage richtet sich nach dem vermuteten Gehalt an


text: Gossypol in der Probe. Es ist vorteilhaft, mit einer geringen Einwaage und einem relativ grossen aliquoten Teil des Filtrats zu arbeiten, um genügend Gossypol für eine genaue photometrische Messung zu erhalten. Für die Bestimmung von freiem Gossypol in Samen, Mehl und Kuchen von Baumwollsaat soll die Einwaage 1 g nicht überschreiten, während sie bei Mischfuttermitteln 5 g erreichen kann. Ein aliquoter Teil des Filtrats von 10 ml ist in den meisten Fällen anwendbar, er soll 50 bis 100 ¶g Gossypol enthalten. Für die Bestimmung von Gesamtgossypol soll die Einwaage 0,5 bis 5 g betragen, so daß im aliquoten Teil des Filtrats von 2 ml 40 bis 200 ¶g Gossypol enthalten sind. Die Analyse ist bei einer Raumtemperatur nahe 20 oC auszuführen. 5.2 Bestimmung von freiem Gossypol Die Einwaage wird in einen 250-ml-Kolben mit Schliffstopfen, dessen Boden mit Glassplittern bedeckt ist, übergeführt, 50 ml des Lösungsmittels A (3.2) werden hinzupipettiert, der Kolben wird verschlossen und 1 Stunde lang im Schüttelapparat bewegt. Dann wird durch ein trockenes Filter filtriert und das Filtrat in einem kleinen Kolben mit Schliffstopfen aufgefangen. Währen der Filtration wird der Trichter mit einem Uhrglas bedeckt. Es werden gleich grosse aliquote Teile des Filtrats, die 50 bis 100 ¶g Gossypol enthalten, in zwei 25-ml-Meßkolben (A und B) pipettiert, gegebenenfalls wird auf 10 ml mit Lösungsmittel A (3.2) ergänzt. Dann wird der Inhalt des Kolbens (A) mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefuellt. Diese Lösung wird als Vergleichslösung für die Messung der Probelösung verwendet. Danach werden in zwei andere 25-ml-Meßkolben (C und D) 10 ml Lösungsmittel A (3.2) pipettiert. Der Inhalt des Kolbens (C) wird mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefuellt. Diese Lösung wird als Vergleichslösung für die Messung der Blindprobelösung verwendet. Zu den Meßkolben (D) und (B) werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzugefügt. Es wird 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefuellt, geschüttelt und 1 Stunde lang stehen gelassen. Dann werden im Spektralphotometer bei 440 nm und in Glasküvetten von 1 cm Dicke die Extinktion der Blindprobe (D) im Vergleich mit der Vergleichslösung (C) und die Extinktion der Probelösung (B) im Vergleich mit der Vergleichslösung (A) gemessen. Die Extinktion der Blindprobelösung wird von der Extinktion der Probelösung abgezogen (= korrigierte Extinktion). Aus dem erhaltenen Wert wird der Gehalt an freiem Gossypol wie unter 6 angegeben berechnet. 5.3 Bestimmung von Gesamtgossypol Eine Einwaage, die 1 bis 5 mg Gossypol enthält, wird in einen 50-ml-Meßkolben gegeben ; dann werden 10 ml des Lösungsmittels B (3.3) hinzugefügt. Gleichzeitig wird ein Blindversuch mit 10 ml des Lösungsmittels B (3.3) in einen anderen 50-ml-Meßkolben vorbereitet. Beide Meßkolben werden 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser erhitzt, bei Raumtemperatur abkühlen gelassen und mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefuellt. Es wird geschüttelt, 10 bis 15 Minuten stehen gelassen, dann filtriert und das Filtrat in Kolben mit Schliffstopfen aufgefangen. Es werden je 2 ml des Filtrats der Probe in zwei 25-ml-Meßkolben und je 2 ml


text: des Filtrats des Blindversuchs in zwei andere 25-ml-Meßkolben pipettiert. Je ein Kolben jeder Serie wird auf 25 ml mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) aufgefuellt. Diese Lösungen werden als Vergleichslösungen verwendet. Zu den beiden anderen Meßkolben werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzugefügt. Dann wird 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, auf 25 ml mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) aufgefuellt, geschüttelt und 1 Stunde lang stehen gelassen. Die Extinktionen werden wie unter 5.2 für freies Gossypol angegeben gemessen. Aus dem ermittelten Wert wird der Gehalt an Gesamtgosspyol wie unter 6 angegeben berechnet. 6. Berechnung der Ergebnisse Die Berechnung der Ergebnisse kann aus der spezifischen Extinktion (6.1) oder unter Benutzung einer Eichkurve (6.2) vorgenommen werden. 6.1 Aus der spezifischen Extinktion >PIC FILE= "T0004336"> wobei: E = korrigierte Extinktion, wie unter 5.2 bestimmt, p = Einwaage in g, a = aliquoter Teil des Filtrats in ml. 6.2 Mit Hilfe einer Eichkurve 6.2.1 Freies Gossypol Es werden 2 Reihen von je fünf 25-ml-Meßkolben vorbereitet. In beide Reihen werden 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 und 10,0 ml der Gossypol-Standardlösung A (3.5) pipettiert und das Volumen auf 10 ml mit dem Lösungsmittel A (3.2) ergänzt. Jeder Reihe wird ein 25-ml-Meßkolben beigegeben, der nur 10 ml des Lösungsmittels A (3.2) enthält (Blindversuch). Die Kolben der ersten Reihe einschließlich des Blindversuchs werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) auf 25 ml aufgefuellt (Vergleichsreihe). Zu den Kolben der zweiten Reihe, einschließlich des Blindversuchs, werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzugefügt. Dann wird 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, zur Marke mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) aufgefuellt, geschüttelt und 1 Stunde lang stehen gelassen (Standardreihe). Unter den unter 5.2 angegebenen Bedingungen wird die Extinktion der Standardreihelösungen durch Vergleich mit den entsprechenden Lösungen der Vergleichsreihe gemessen. Die Eichkurve wird graphisch dargestellt, indem die Extinktionswerte und Gossypolmengen (in ¶g) gegeneinander eingetragen werden. 6.2.2 Gesamtgossypol Es werden sechs 50-ml-Meßkolben vorbereitet. In den ersten werden 10 ml des Lösungsmittels B (3.3) und in die übrigen je 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 und 10,0 ml der Gossypolstandardlösung B (3.6) pipettiert. Der Inhalt jedes Kolbens wird auf 10 ml mit dem Lösungsmittel B (3.3) ergänzt, 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefuellt und geschüttelt. In zwei Reihen von sechs 25-ml-Meßkolben werden je 2,0 ml dieser Lösung pipettiert. Die Kolben der ersten Reihe werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) auf 25 ml aufgefuellt (Vergleichsreihe). In die Kolben der zweiten Reihe werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzugefügt. Dann werden sie 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefuellt, geschüttelt und 1 Stunde lang stehen gelassen (Standardreihe). Unter den unter 5.2 angegebenen Bedingungen wird die Extinktion der Standardreihelösungen durch Vergleich mit den entsprechenden Lösungen der Vergleichsreihe gemessen. Die Eichkurve wird graphisch dargestellt, indem die Extinktionswerte und Gossypolmengen (in ¶g) gegeneinander eingetragen werden. 6.3 Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen


text: darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von weniger als 500 ppm Gossypol 15 v.H. relativ, - 500 bis 750 ppm Gossypol 75 ppm absolut, - 750 und mehr ppm Gossypol 10 v.H. relativ nicht überschreiten. ANLAGE II 1. NACHWEIS UND IDENTIFIZIERUNG VON ANTIBIOTIKA DER TETRACYCLINGRUPPE 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode dient zum Nachweis und zur Identifizierung von Antibiotika der Tetracyclingruppe in Futtermitteln, die mindestens 0,1 ppm Antibiotikum enthalten, in Konzentraten und in Vormischungen. 2. Prinzip Die Probe wird mit einem Gemisch von Methanol und Salzsäure extrahiert. Der Extrakt wird vergleichsweise mit Eichlösungen aufsteigend auf Papier chromatographiert. Die Antibiotika werden durch Vergleich ihrer Rf-Werte mit denen der Standardstoffe entweder durch Fluoreszenz im UV-Licht (hoher Gehalt an Antibiotika) oder durch Bioautographie auf einem mit B. cereus beimpften Agarnährboden nachgewiesen und identifiziert. 3. Reagenzien und Nährboden >PIC FILE= "T9000459"> 3.5 Gemisch von Methanol, rein/Salzsäure (D : 1,19) : 98/2 in Vol. 3.6 0,1 N Salzsäure 3.7 Ammoniaklösung, D : 0,91 3.8 Standardsubstanzen : Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Tetracyclin, deren Aktivität als Hydrochlorid angegeben wird. 3.9 Testorganismus : B. cereus ATCC Nr. 11.778 Haltung der Stammkultur, Herstellung der Sporensuspension und Beimpfung des Nährbodens : Es ist nach den Punkten 3.1 und 3.2 der in Teil 2 dieser Anlage vorgesehenen Bestimmungsmethode von Chlortetracyclin, Oxytetracyclin und Tetracyclin durch Diffusion in Agarnährboden zu verfahren. 3.10 Nährboden (1) >PIC FILE= "T9000460"> 3.11 Lösung von 0,1 v.H. (G/V)2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid und 5 v.H. (G/V) Glukose 4. Geräte 4.1 Apparat für aufsteigende Papierchromatographie (25 cm Papierhöhe). Schleicher- und Schüll-Papier 2040 b oder 2043 b, oder Gleichwertiges 4.2 Zentrifuge 4.3 Brutschrank, auf 30 oC geregelt 4.4 UV-Lampe zum Fluoreszenz-Nachweis 4.5 Glasplatten ca. 20 x 30 cm, zur Herstellung einer flachen Schale für die Bioautographie 5. Standardlösungen 5.1 Stammlösungen Mit Salzsäure (3.6) werden Lösungen der Standardsubstanzen (3.8) hergestellt, deren Konzentration 500 ¶g Chlortetracyclin-HCl, Oxytetracyclin-HCl und Tetracyclin-HCl pro ml entspricht. 5.2 Vergleichslösungen für den Nachweis im UV-Licht Die Lösungen (5.1) werden mit dem Phosphatpuffer (3.2) verdünnt, um Lösungen zu erhalten, deren Konzentration 100 ¶g Chlortetracyclin-HCl, Oxytetracyclin-HCl und Tetracyclin-HCl pro ml entspricht. 5.3 Vergleichslösungen für den Nachweis durch Bioautographie Die Lösungen (5.1) werden mit dem Phosphatpuffer (3.2) verdünnt, um Lösungen zu erhalten, deren Konzentration 5 ¶g Chlortetracyclin-HCl, Oxytetracyclin-HCl und Tetracyclin-HCl pro ml entspricht. 6. Extraktion Bei einem zu erwartenden Gehalt an Antibiotikum unter 10 ppm kann man entweder die homogenisierte Probe oder die ausgesiebte Feinfraktion verwenden, da die Antibiotika sich vorzugsweise in den feinsten Fraktionen befinden. Die Probe wird mit dem Gemisch (3.5) aufgeschlämmt und zentrifugiert. Der Überstand wird direkt aufgetragen oder, wenn nötig, mit dem Gemisch (3.5) verdünnt, um Konzentrationen an Antibiotikum von ca. 100 ¶g pro ml (6.1) und ca. 5 ¶g pro ml (6.2) zu erhalten. 7. Nachweis und Identifizierung 7.1 Chromatographie Das Papier wird in den Puffer pH 3,5 (3.1) getaucht und zwischen trockenem Filterpapier ausgepresst, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Danach werden Volumen von (1)Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden. 0,01 ml der Vergleichslösungen (5.2 und 5.3) und Extraktlösungen (6.1 und 6.2) auf


text: das Papier getropft. Für eine gute Auftrennung ist der richtige Feuchtigkeitsgehalt des Papiers entscheidend ; gegebenenfalls muß man noch etwas abtrocknen lassen. Es wird durch aufsteigende Chromatographie mit Laufmittel I (3.3) für den Nachweis durch Bioautographie, mit Laufmittel II (3.4) für den Nachweis im UV-Licht entwickelt. Wenn die Laufmittelfront ca. 15 bis 20 cm hoch gewandert ist (ca. 1,30 Std.), wird die Chromatographie abgebrochen und das Papier getrocknet. 7.2 Nachweis im UV-Licht Bei einem Gehalt an Antibiotikum über 1 ¶g/cm2 können die Flecken nach Behandlung mit Ammoniakdämpfen (3.7) durch ihre goldgelbe Fluoreszenz um UV-Licht (4.4) sichtbar gemacht werden. 7.3 Nachweis durch Bioautographie Der mit B. cereus (3.9) beimpfte Nährboden (3.10) wird auf Glasplatten (4.5) gegossen und das Papier auf den Nährboden gelegt. Nach 5 Minuten Kontakt wird es abgezogen und auf eine andere Stelle des Nährbodens gelegt, wo es während der Inkubationszeit verbleibt. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 30 oC im Brutschrank. Bei Anwesenheit eines Antibiotikums der Tetracyclingruppe erscheinen im sonst trüben Nährboden klare Hemmzonen. Um das Chromatogramm zu fixieren, wird das Papier nach Inkubation mit der Lösung (3.11) besprüht. 7.4 Identifizierung Nachstehend folgen die relativen Rf-Werte der Antibiotika der Tetracyclingruppe. Diese Werte können je nach der Qualität und dem Feuchtigkeitsgehalt des Papiers geringfügig schwanken. >PIC FILE= "T9000461"> Epi- Verbindungen haben eine geringere antibiotische Aktivität als die normalen Verbindungen. 2. BESTIMMUNG VON CHLORTETRACYCLIN, OXYTETRACYCLIN UND TETRACYCLIN A. DURCH DIFFUSION IN AGARNÄHRBODEN 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung von Chlortetracyclin (CTC), Oxytetracyclin (OTC) und Tetracyclin (TC) in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 5 ppm. Die Gehalte unter 5 ppm können durch graphische Interpolation geschätzt werden. 2. Prinzip Bei Gehalten, gleich oder unter 50 ppm, wird die Probe mit Formamid extrahiert. Bei Gehalten über 50 ppm wird die Probe für die Bestimmung von CTC mit einem Gemisch von Aceton, Wasser und Salzsäure, und für die Bestimmung von OTC und TC mit einem Gemisch von Methanol und Salzsäure extrahiert. Dann werden die Extrakte verdünnt und ihre antibiotische Aktivität durch Messung der Diffusion des CTC, OTC oder TC in einen mit B. cereus beimpften Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen ist dem Logarithmus der Konzentration des Antibiotikums direkt proportional. 3. Testorganismus : B. cereus ATCC Nr. 11.778 3.1 Haltung der Stammkultur Ein Agarschrägröhrchen aus dem Nährboden (4.1), ohne Borsäure und Methylenblau, wird mit B. cereus beimpft und über Nacht bei etwa 30 oC bebrütet. Danach wird die Kultur im Kühlschrank aufbewahrt und alle 14 Tage in Agarschrägröhrchen überimpft. 3.2 Herstellung der Sporensuspension Ein Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit 2 bis 3 ml physiologischer Kochsalzlösung (4.5) aufgenommen. Mit dieser Suspension wird eine Rouxflasche, die 300 ml des Nährbodens (4.1) ohne Borsäure und Methylenblau mit einer Agarkonzentration von 3 bis 4 v.H. enthält, beimpft. Nach einer Inkubationszeit von 3 bis 5 Tagen bei 28 bis 30 oC werden die Keime nach erfolgter Versporung, die mikroskopisch kontrolliert wird, mit 15 ml Äthanol (4.6) abgeschwemmt und homogenisiert. Diese Suspension


text: kann mindestens 5 Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden. Durch Versuchsplatten mit dem Testnährboden (4.1) wird diejenige Impfmenge ermittelt, die möglichst grosse aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwendeten Konzentrationen an Antibiotika ergibt. Sie beträgt im allgemeinen 0,2 bis 0,3 ml/1000 ml. Die Beimpfung des Nährbodens muß bei 50 bis 60 oC erfolgen. 4. Nährboden und Reagenzien 4.1 Testnährboden (1) >PIC FILE= "T9000462"> 4.5 Physiologische Kochsalzlösung, steril 4.6 Äthanol 20 v.H. (V/V) 4.7 0,1 N Salzsäure (1)Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden. 4.8 Formamid 70 v.H. (V/V) : frisch vor dem Gebrauch hergestellt und mit etwa 2 N Schwefelsäure auf pH 4,5 eingestellt 4.9 Gemisch von Aceton, rein/Wasser/Salzsäure (D : 1,19) : 65/33/2 in Vol. 4.10 Gemisch von Methanol, rein/Salzsäure (D : 1,19) : 98/2 in Vol. 4.11 Standardsubstanzen : CTC, OTC, TC, deren Aktivität als Hydrochlorid angegeben wird 5. Standardlösungen 5.1 Chlortetracyclin Mit 0,1 N Salzsäure (4.7) wird aus der Standardsubstanz (4.11) eine Stammlösung hergestellt, deren Konzentration 500 ¶g Chlortetracyclin-HCl pro ml entspricht. Diese Lösung ist eine Woche lang im Kühlschrank haltbar. Aus dieser Stammlösung wird eine Arbeitsstandardlösung S8 hergestellt, deren Konzentration 0,2 ¶g Chlortetracyclin-HCl pro ml entspricht. Die Verdünnung erfolgt mit Phosphatpuffer pH 5,5, der auf 1/10 (4.3) verdünnt ist und einen Zusatz von 0,01 v.H. Amidoschwarz enthält (1). Dann werden die nachstehenden Konzentrationen mit dem Phosphatpuffer (4.3) durch aufeinander folgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt: S4 0,1 ¶g/ml S2 0,05 ¶g/ml S1 0,025 ¶g/ml 5.2 Oxytetracyclin In der gleichen Weise wie unter 5.1 angegeben werden aus einer Stammlösung, deren Konzentration 400 ¶g Oxytetracyclin-HCl pro ml entspricht, eine Arbeitsstandardlösung S8 von 1,6 ¶g Tetracyclin-HCl pro ml und danach folgende Konzentrationen hergestellt: S4 0,8 ¶g/ml S2 0,4 ¶g/ml S1 0,2 ¶g/ml 5.3 Tetracyclin In der gleichen Weise wie unter 5.1 angegeben werden aus einer Stammlösung, deren Konzentration 500 ¶g Tetracyclin-HCl pro ml entspricht, eine Arbeitsstandardlösung S8 von 1,0 ¶g Tetracyclin-HCl pro ml und danach folgende Konzentrationen hergestellt: S4 0,5 ¶g/ml S2 0,25 ¶g/ml S1 0,125 ¶g/ml 6. Extraktion 6.1 Gehalte, gleich oder unter 50 ppm Nach den unten beschriebenen Angaben wird eine Einwaage Formamid (4.8) zugesetzt und 30 Minuten lang auf einem Schütteltisch geschüttelt. Danach wird sofort mit dem Phosphatpuffer (4.3) nach den unten beschriebenen Angaben verdünnt, um die U8-Konzentration zu erreichen. Die Formamid-Konzentration dieser Lösung darf nicht mehr als 40 v.H. betragen. Dann wird der Extrakt zentrifugiert oder dekantiert, um eine klare Lösung zu erlangen. Anschließend werden die Konzentrationen U4, U2 und U1 mit dem Phosphatpuffer (4.3) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt. (1)Das Amidoschwarz dient zur Kennzeichnung der Hemmzonen der Standardlösungen (blaue Ringe). >PIC FILE= "T0004338"> 6.2 Gehalte über 50 ppm 6.2.1 Chlortetracyclin Nach dem mutmaßlichen Gehalt an Antibiotika der Probe oder seiner Herstellungsgarantie wird eine Einwaage zwischen 2 und 10 g mit dem 20fachen Volumen des Gemisches (4.9) zugesetzt und 30 Minuten lang auf einem Schütteltisch geschüttelt. Während der Extraktion muß der pH-Wert unter 3 liegen ; wenn nötig, ist er auf 3 zurückzustellen (bei Mineralmischungen wird der pH-Wert


text: mit 10 v.H. Eisessig eingestellt). Danach wird ein aliquoter Teil des Extraktes mit Hilfe des Phosphatpuffers pH 8 (4.4) unter Zusatz von Bromkresol-Grün auf pH 5,5 gebracht (Umschlag von Gelb nach Blau). Dann wird mit dem auf 1/10 verdünnten Phosphatpuffer pH 5,5 (4.3) verdünnt, um die U8-Konzentration zu erhalten (s. 6.1). Anschließend werden die Konzentrationen U4, U2 und U1 mit dem Phosphatpuffer (4.3) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt. 6.2.2 Oxytetracyclin und Tetracyclin In der gleichen Weise wie unter 6.2.1 angegeben wird fortgefahren, indem man das Gemisch (4.9) durch das Gemisch (4.10) ersetzt. 7. Testverfahren 7.1 Beimpfung des Nährbodens Der Testnährboden (4.1) wird mit der Sporensuspension (3.2) bei 50 bis 60 oC beimpft. 7.2 Herstellung der Platten Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je 4 Konzentrationsstufen der Standardlösung (S8, S4, S2, S1) und das Extraktes (U8, U4, U2, U1) angelegt. Jede Platte erhält unbedingt alle 4 Konzentrationen des Standards und der Probe. Daher muß die Plattengrösse so bemessen sein, daß mindestens 8 Löcher in der Nährbodenschicht ausgestanzt werden können ; der Lochdurchmesser beträgt 10 bis 13 mm. Die beimpfte Nährbodenmenge (7.1) soll so berechnet sein, daß man eine gleichmässige Schicht von ca. 2 mm Höhe erhält. Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Aluminium- oder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt werden. In die Löcher werden mit der Pipette genau abgemessene Mengen der Antibiotika-Lösung zwischen 0,10 und 0,15 ml, je nach Durchmesser der Löcher, gefuellt. Für jede Probe muß mindestens jede Konzentration in 4facher Wiederholung eingefuellt werden, so daß pro Ansatz für jede Probe 32 Hemmzonen ausgewertet werden. 7.3 Inkubation Die Inkubation erfolgt während 18 Stunden bei etwa 28 bis 30 oC. 8. Auswertung Der Durchmesser der Hemmzonen wird vorzugsweise durch Projektion gemessen. Die Messungen werden auf Semilogarithmenpapier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen den Durchmesser der Hemmzonen angetragen wird. Für den Standard sowie für den Extrakt werden die Geraden gezogen. In einem störungsfreien Test müssen die beiden Geraden parallel sein. Der Logarithmus der relativen Aktivität wird durch folgende Formel rein rechnerisch ermittelt: >PIC FILE= "T0004339"> Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität x relative Aktivität. 9. Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe 10 v.H. relativ nicht überschreiten. B. DURCH TURBIDIMETRIE 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung von Chlortetracyclin (CTC), Oxytetracyclin (OTC) und Tetracyclin (TC) bei Gehalten über 1 g/kg, sofern keine störenden Begleitsubstanzen zu getrübten Extrakten führen. Diese Methode ist schneller als die Methode durch Diffusion in Agarnährboden. 2. Prinzip Die Probe wird für die Bestimmung von CTC mit einem Gemisch von Aceton, Wasser und Salzsäure und für die Bestimmung von OTC und TC mit einem Gemisch von Methanol und Salzsäure extrahiert. Die Extrakte werden verdünnt, und ihre antibiotische Wirkung wird durch Messung der Lichtdurchlässigkeit eines mit Staphylococcus aureus beimpften Nährbodens, dem Antibiotikum zugesetzt ist, bestimmt. Die Transmission ist eine Funktion der Konzentration an Antibiotikum. 3. Testorganismus : Staphylococcus aureus K 141 (1) 3.1


text: Haltung der Stammkultur Ein Agarschrägröhrchen aus dem Nährboden (4.1) mit Zusatz von 1,5 bis 3 v.H. Agar (je nach Qualität) wird mit S. aureus beimpft und über Nacht bei etwa 37 oC bebrütet. Danach wird die Kultur im Kühlschrank aufbewahrt und alle 4 Wochen in Agarschrägröhrchen überimpft. Gleichzeitig werden Subkulturen für den Gebrauch im Labor angelegt. 3.2 Herstellung der Impfkultur 24 Stunden vor dem Test wird ein Agarschrägröhrchen mit einer Subkultur beimpft und über Nacht bei 37 oC bebrütet. Die gesamte Kultur eines Schrägröhrchens wird in ca. 2 ml des Testnährbodens (4.1) suspendiert und danach in ca. 100 ml des Testnährbodens (4.1) unter sterilen Bedingungen überspült. Diese Suspension wird im Wasserbad bei 37 oC bebrütet, bis das Stammwachstum in seine logarithmische Phase eintritt (1,30 bis 2 Std.). (1)Dieser von der LUFA, Kiel, isolierte Stamm hat ein intensiveres Wachstum als S. aureus ATCC 6538 P. 4. Nährboden und Reagenzien 4.1 Testnährboden (1) >PIC FILE= "T9000463"> 4.3 0,1 N Salzsäure 4.4 Gemisch von Aceton, rein/Wasser/Salzsäure (D : 1,19) : 65/33/2 in Vol. 4.5 Gemisch von Methanol, rein/Salzsäure (D : 1,19) : 98/2 in Vol. 4.6 Formaldehydlösung ca. 10 v.H. (G/V) 4.7 Standardsubstanzen : CTC, OTC, TC, deren Aktivität als Hydrochlorid angegeben wird. 5. Standardlösung Mit Salzsäure (4.3) wird aus der Standardsubstanz (4.7) eine Stammlösung hergestellt, deren Konzentration 400 bis 500 ¶g CTC-HCl, OTC-HCl oder TC-HCl pro ml entspricht. Diese Lösung ist eine Woche lang im Kühlschrank haltbar. 6. Extraktion 6.1 Chlortetracyclin Eine Probe von 1 bis 2 g wird mit ca. 100 ml des Gemischs (4.4) in einen 200- oder 250-ml-Meßkolben gegeben und 30 Minuten lang auf einem Schütteltisch geschüttelt. Dann wird es zur Marke mit Phosphatpuffer pH 4,5 (4.2) aufgefuellt, gemischt und absetzen gelassen. 6.2 Oxytetracyclin und Tetracyclin Eine Probe von 1 bis 2 g wird mit ca. 100 ml des Gemischs (4.5) in einen 200- oder 250-ml-Meßkolben gegeben und 30 Minuten lang auf einem Schütteltisch geschüttelt. Dann wird es zur Marke mit Phosphatpuffer pH 4,5 (4.2) aufgefuellt, gemischt und absetzen gelassen. 7. Testverfahren 7.1 Herstellung von Standard- und Extraktreihen Die Standardlösung (5) und die Extraktlösung (6) werden mit Phosphatpuffer pH 4,5 (4.2) so verdünnt, daß man eine Reihe von Verdünnungen erhält. Für jede Bestimmung wird aus der jeweiligen Verdünnung eine Standardkurve erstellt, die zumindest die Interpolation von 2 Meßwerten der Extraktlösung erlaubt. Die Verdünnungen werden je nach den Wachstumsbedingungen des Stammes gewählt. Diese Bedingungen können in den einzelenen Laboratorien verschieden sein. Im allgemeinen wird wie folgt verfahren: (1)Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden. 7.1.1 Chlortetracyclin Die Standardlösung (5) wird mit dem Phosphatpuffer (4.2) so verdünnt, um eine Arbeitsstandardlösung, deren Konzentration 0,2 ¶g CTC-HCl pro ml entspricht, zu erhalten. Dann werden mit dem Phosphatpuffer (4.2) 6 Verdünnungen mit einer Wiederholung für jede Verdünnung in Teströhrchen wie folgt vorbereitet: >PIC FILE= "T0004340"> Der Extrakt (6.1) wird mit dem Phosphatpuffer (4.2) auf eine vermutete Konzentration an CTC-HCl von 0,12 ¶g/ml verdünnt. Davon werden 2 Röhrchen mit je 1 ml und 2 andere Röhrchen mit je 0,75 ml


text: (= 0,09 ¶g) eingefuellt und das Volumen der 2 letzten Röhrchen bis zu 1 ml mit dem Phosphatpuffer (4.2) gefuellt. 7.1.2 Oxytetracyclin und Tetracyclin Die Standardlösung (5) wird mit dem Phosphatpuffer (4.2) so verdünnt, um eine Arbeitsstandardlösung, deren Konzentration 0,6 ¶g OTC-HCl oder TC-HCl pro ml entspricht, zu erhalten. Dann werden mit dem Phosphatpuffer (4.2) 7 Verdünnungen mit einer Wiederholung für jede Verdünnung im Teströhrchen wie folgt vorbereitet: >PIC FILE= "T0004341"> Der Extrakt (6.2) wird mit dem Phosphatpuffer (4.2) auf eine vermutete Konzentration an OTC-HCl bzw. TC-HCl von 0,48 ¶g/ml verdünnt. Davon werden 2 Röhrchen mit je 1 ml und 2 andere Röhrchen mit je 0,5 ml (= 0,24 ¶g) eingefuellt und das Volumen der 2 letzten Röhrchen bis zu 1 ml mit dem Phosphatpuffer (4.2) gefuellt. 7.2 Beimpfung des Nährbodens Der Testnährboden (4.1) wird mit der Impfkultur (3.2) so beimpft, daß bei 590 nm und mit einer 5-cm-Kuevette eine Lichtdurchlässigkeit von 85 v.H. und mit einer 2-cm-Kuevette eine Lichtdurchlässigkeit von 92 v.H. erzielt wird, wobei das Photometer auf 100 v.H. Transmission mit dem unbeimpften Testnährboden (4.1) eingestellt wird. 7.3 Beimpfung Pro Teströhrchen (7.1.1 bzw. 7.1.2) werden 9 ml beimpften Nährbodens (7.2) gegeben. Dieses Einfuellen muß möglichst sauber, aber nicht notwendig steril erfolgen. 7.4 Bebrüten Die Bebrütung erfolgt obligatorisch in einem Wasserbad, das durch Umwälzung auf einer einheitlichen Temperatur von 37 oC ± 0,1 oC gehalten wird. Die Bebrütungszeit muß so gewählt sein, daß sie die Darstellung von Transmissionskurven mit einer für genaue Messungen geeigneten Steigung erlaubt (im allgemeinen 2,30 bis 3 Std.). Danach werden die Röhrchen, um das Wachstum zu stoppen, schnell mit je 1 ml Formaldehydlösung (4.6) abgespritzt. 7.5 Messung des Wachstums Die Transmission wird bei 590 nm gemessen, wobei das Photometer auf 100 v.H. Transmission mit der klarsten Standardlösung (entsprechend die höchste Konzentration an Antibiotika) eingestellt wird. Wegen der geringen Trübungsunterschiede der einzelnen Röhrchen empfiehlt es sich, zumindest 2-cm-, besser 5-cm-Kuevetten zu benutzen. 8. Berechnung der Ergebnisse Die Standardkurve wird graphisch auf Millimeterpapier dargestellt, wobei photometrische Transmissionen und Konzentrationen an Antibiotikum gegeneinander angetragen werden. Die Transmissionswerte des Extraktes werden auf der Standardkurve interpoliert und der Gehalt an Antibiotikum der Probe berechnet. 9. Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe 10 v.H. relativ nicht überschreiten. 3. BESTIMMUNG VON OLEANDOMYCIN - durch Diffusion in Agarnährboden - 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung von Oleandomycin in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen, auch in Gegenwart von Tetracyclinen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 0,5 ppm. 2. Prinzip Die Probe wird mit einer verdünnten methanolischen Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Lösung extrahiert. Nach Zentrifugieren wird der Extrakt verdünnt und seine antibiotische Aktivität durch Messung der Diffusion des Oleandomycins in einen mit B. cereus beimpften Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen ist dem Logarithmus der Konzentration des Antibiotikums direkt proportional. 3. Testorganismus : B. cereus K 250 TR (1) (resistent gegen Tetracyline) 3.1 Haltung der Stammkultur Ein Agarschrägröhrchen aus dem Nährboden (4.1), der 100 ¶g Oxytetracyclin enthält, wird mit B.


text: cereus beimpft und über Nacht bei etwa 30 oC bebrütet. Danach wird die Kultur im Kühlschrank aufbewahrt und alle 4 Wochen in Agarschrägröhrchen überimpft. 3.2 Herstellung der Sporensuspension Ein Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit ca. 3 ml physiologischer Kochsalzlösung (4.3) aufgenommen. Mit dieser Suspension wird eine Rouxflasche, die 300 ml des Nährbodens (4.1), aber mit einer Agarkonzentration von 3-4 v.H. enthält, beimpft. Nach einer Inkubationszeit von 3 bis 5 Tagen bei 28 bis 30 oC werden die Keime nach erfolgter Versporung, die mikroskopisch kontrolliert wird, mit 15 ml Äthanol (4.4) abgeschwemmt und homogenisiert. Diese Suspension kann mindestens 5 Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden. Durch Versuchsplatten mit dem Testnährboden (4.2) wird diejenige Impfmenge ermittelt, die möglichst grosse aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwendeten Konzentrationen an Oleandomycin ergibt. Sie beträgt im allgemeinen 0,1 bis 0,2 ml/1000 ml. Die Beimpfung des Nährbodens muß bei 60 oC erfolgen. (1)Von der LUFA, Kiel, isolierter Stamm. 4. Nährböden und Reagenzien 4.1 Kulturnährboden (1) >PIC FILE= "T9000464"> 4.3 Physiologische Kochsalzlösung, steril 4.4 Äthanol 20 v.H. (V/V) 4.5 Methanol, rein 4.6 Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Lösung p.a. 0,5 v.H. (G/V) 4.7 Extraktionslösung >PIC FILE= "T9000465"> 4.8 Standardsubstanz : Oleandomycin von bekannter Aktivität. 5. Standardlösungen Eine Menge der Standardsubstanz (4.8) wird in 5 ml Methanol (4.5) gelöst und mit der Lösung (4.6) verdünnt, um eine Konzentration an Oleandomycin von 100 ¶g/ml zu erhalten. Aus dieser Stammlösung wird durch Verdünnung mit der Lösung (4.6) eine Arbeitsstandardlösung S8 hergestellt, die 0,1 ¶g/ml Oleandomycin enthält. Dann werden die nachstehenden Konzentrationen mit der Lösung (4.6) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt: S4 0,05 ¶g/ml S2 0,025 ¶g/ml S1 0,0125 ¶g/ml 6. Extraktion Nach dem mutmaßlichen Gehalt an Oleandomycin der Probe wird eine Einwaage von 2 bis 10 g 100 ml der Lösung (4.7) zugesetzt und 30 Minuten lang auf einem Schütteltisch geschüttelt. Nach Zentrifugieren wird ein aliquoter Teil des Extrakts entnommen und mit der Lösung (4.6) verdünnt, um eine vermutete Konzentration an Oleandomycin von 0,1 ¶g/ml (= U8) zu erhalten. Anschließend werden die Konzentrationen U4, U2 und U1 mit der Lösung (4.6) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt. (1)Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden. 7. Testverfahren 7.1 Beimpfung des Nährbodens Der Testnährboden (4.2) wird mit der Sporensuspension (3.2) bei 60 oC beimpft. 7.2 Herstellung der Platten Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je 4 Konzentrationsstufen der Standardlösung (S8, S4, S2, S1) und des Extrakts (U8, U4, U2, U1) angelegt. Jede Platte erhält unbedingt alle 4 Konzentrationen des Standards und der Probe. Daher muß die Plattengrösse so bemessen sein, daß mindestens 8 Löcher in der Nährbodenschicht ausgestanzt werden können. Der Lochdurchmesser beträgt 10 bis 13 mm. Die beimpfte Nährbodenmenge (7.1) soll so berechnet sein, daß man eine gleichmässige Schicht von ca. 2 mm Höhe erhält. Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Aluminiumoder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt werden. In die Löcher werden mit der Pipette genau abgemessene Mengen der Antibiotikalösung zwischen


text: 0,10 und 0,15 ml je nach Durchmesser der Löcher gefuellt. Für jede Probe muß mindestens jede Konzentration in 4facher Wiederholung eingefuellt werden, so daß pro Ansatz für jede Probe 32 Hemmzonen ausgewertet werden. 7.3 Inkubation Die Inkubation erfolgt während etwa 18 Stunden bei 28 bis 30 oC. 8. Auswertung Der Durchmesser der Hemmzonen wird vorzugsweise durch Projektion gemessen. Die Messungen werden auf Semilogarithmenpapier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen den Durchmesser der Hemmzonen angetragen wird. Für den Standard sowie für den Extrakt werden die Geraden gezogen. In einem störungsfreien Test müssen die beiden Geraden parallel sein. Der Logarithmus der relativen Aktivität wird durch folgende Formel rein rechnerisch ermittelt: >PIC FILE= "T0004342"> Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität. 9. Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe 10 v.H. relativ nicht überschreiten. 4. BESTIMMUNG VON TYLOSIN - durch Diffusion in Agarnährboden - 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung von Tylosin in Futtermitteln, Konzentrationen und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 2 ppm. 2. Prinzip Die Probe wird mit einer auf 80 oC erwärmten Phosphatpufferlösung pH 8 behandelt und danach mit Methanol extrahiert. Nach Zentrifugieren wird der Extrakt verdünnt und seine antibiotische Aktivität durch Messung der Diffusion des Tylosins in einen mit Sarcina lutea beimpften Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen ist dem Logarithmus der Konzentration direkt proportional. 3. Testorganismus : Sarcina lutea ATCC Nr. 9341 3.1 Haltung der Stammkultur Ein Agarschrägröhrchen aus dem Nährboden (4.1), auf pH 7,0 eingestellt, wird mit Sarcina lutea beimpft und über Nacht bei etwa 35 oC bebrütet. Danach wird die Kultur im Kühlschrank aufbewahrt und monatlich in Agarschrägröhrchen überimpft. 3.2 Herstellung der Keimsuspension Ein Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit 2 bis 3 ml steriler, frisch hergestellter Kochsalzlösung (4.4) aufgenommen. Mit dieser Suspension wird eine Rouxflasche, die 250 ml des Nährbodens (4.1) auf pH 7,0 enthält, beimpft. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 35 oC werden die Keime mit 25 ml physiologischer Kochsalzlösung (4.4) aufgenommen und homogenisiert. Diese Suspension wird verdünnt, um eine Lichtdurchlässigkeit bei 650 nm von etwa 75 v.H. zu erhalten. Diese Suspension kann während einer Woche verwendet werden, wenn sie im Kühlschrank aufbewahrt wird. Durch Versuchsplatten mit dem Testnährboden (4.1) wird die Impfmenge ermittelt, die möglichst grosse, aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwendeten Konzentrationen an Tylosin ergibt. Die Beimpfung des Nährbodens muß zwischen 48 und 50 oC erfolgen. 4. Nährboden und Reagenzien 4.1 Testnährboden (1) >PIC FILE= "T9000466"> 4.4 Physiologische Kochsalzlösung, steril 4.5 Methanol, rein 4.6 Methanol 40 v.H. (V/V) 4.7 Gemisch von Phosphatpuffer (4.2) und Methanol, rein : 60/40 in Vol. 4.8 Standardsubstanz : Tylosin von bekannter Aktivität. (1)Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden. 5. Standardlösungen Die Standardsubstanz (4.8) wird 3 Stunden lang bei 60 oC im Vakuumtrockenschrank bei 5 mm Quecksilber getrocknet. Eine Einwaage von 10 bis 50 mg wird mit 5 ml Methanol (4.5) in einem Meßkolben gelöst und dann mit


text: Phosphatpuffer pH 7 (4.3) verdünnt, um eine Konzentration an Tylosinbase von 1000 ¶g/ml zu erhalten. Aus dieser Stammlösung wird durch Verdünnung mit dem Gemisch (4.7) eine Arbeitsstandardlösung S8 hergestellt, die 2 ¶g Tylosinbase/ml enthält. Dann werden die nachstehenden Konzentrationen mit dem Gemisch (4.7) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt: S4 1 ¶g/ml S2 0,5 ¶g/ml S1 0,25 ¶g/ml 6. Extraktion Bei Konzentraten werden 10 g eingewogen, bei Vormischungen und Mischfuttermitteln 20 g. Die Einwaage wird mit 60 ml auf 80 oC erwärmtem Phosphatpuffer pH 8 (4.2) versetzt und während 2 Minuten homogenisiert (Küchenmaschine, Ultra-Turrax etc.). Danach lässt man 10 Minuten stehen, versetzt mit 40 ml Methanol (4.5) und homogenisiert erneut während 5 Minuten. Der Extrakt wird zentrifugiert und ein aliquoter Teil mit dem Gemisch (4.7) verdünnt, um eine vermutete Konzentration an Tylosin von 2 ¶g/ml (= U8) zu erhalten. Anschließend werden die Konzentrationen U4, U2 und U1 mit dem Gemisch (4.7) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt. Bei Gehalten unter 10 ppm wird der Extrakt bei 35 oC zur Trockne auf einem Rotationsverdampfer eingeengt und mit Methanol 40 v.H. (4.6) aufgenommen. 7. Testverfahren 7.1 Beimpfung des Nährbodens Der auf pH 8,0 eingestellte Testnährboden (4.1) wird mit der Keimsuspension (3.2) bei 48 bis 50 oC beimpft. 7.2 Herstellung der Platten Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je 4 Konzentrationsstufen der Standardlösung (S8, S4, S2, S1) und des Extrakts (U8, U4, U2, U1) angelegt. Jede Platte erhält unbedingt alle 4 Konzentrationen des Standards und der Probe. Daher muß die Plattengrösse so bemessen sein, daß mindestens 8 Löcher in der Nährbodenschicht ausgestanzt werden können. Der Lochdurchmesser beträgt 10 bis 13 mm. Die beimpfte Nährbodenmenge (7.1) soll so berechnet sein, daß man eine gleichmässige Schicht von ca. 2 mm Höhe erhält. Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Aluminiumoder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt werden. In die Löcher werden mit der Pipette genau abgemessene Mengen der Antibiotikalösung, zwischen 0,10 und 0,15 ml je nach Durchmesser der Löcher, gefuellt. Für jede Probe muß mindestens jede Konzentration in 4facher Wiederholung eingefuellt werden, so daß pro Ansatz für jede Probe 32 Hemmzonen ausgewertet werden. 7.3 Inkubation Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 35 bis 37 oC. 8. Auswertung Der Durchmesser der Hemmzonen wird vorzugsweise durch Projektion gemessen. Die Messungen werden auf Semilogarithmenpapier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentration gegen den Durchmesser der Hemmzonen angetragen wird. Für den Standard sowie für den Extrakt werden die Geraden gezogen. In einem störungsfreien Test müssen die beiden Geraden parallel sein. Der Logarithmus der relativen Aktivität wird durch folgende Formel rein rechnerisch ermittelt: >PIC FILE= "T0004343"> Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität. 9. Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe 10 v.H. relativ nicht überschreiten. 5. BESTIMMUNG VON VIRGINIAMYCIN - durch Diffusion in Agarnährboden - 1. Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung von Virginiamycin in Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit


text: beträgt 2 ppm. 2. Prinzip Die Probe wird mit einer methanolischen Tween-80-Lösung extrahiert. Nach Zentrifugieren oder Filtration wird der Extrakt verdünnt und seine antibiotische Aktivität durch Messung der Diffusion des Virginiamycins in einen mit Sarcina lutea beimpften Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen ist dem Logarithmus der Konzentration direkt proportional. 3. Testorganismus : Sarcina lutea ATCC Nr. 9341 3.1 Haltung der Stammkultur Ein Agarschrägröhrchen aus dem Testnährboden (4.1) wird mit S. lutea beimpft und über Nacht bei etwa 35 oC bebrütet. Danach wird die Kultur im Kühlschrank aufbewahrt und alle 14 Tage in Agarschrägröhrchen überimpft. 3.2 Herstellung der Keimsuspension Ein Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit 2 bis 3 ml steriler, frisch hergestellter Kochsalzlösung (4.3) aufgenommen. Mit dieser Suspension wird eine Rouxflasche, die 250 ml des Nährbodens (4.1) enthält, beimpft. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 35 oC werden die Keime mit 25 ml physiologischer Kochsalzlösung (4.3) aufgenommen und homogenisiert. Diese Suspension wird verdünnt, um eine Lichtdurchlässigkeit bei 650 nm von etwa 75 v.H. zu erhalten. Diese Suspension kann während einer Woche verwendet werden, wenn sie im Kühlschrank aufbewahrt wird. Durch Versuchsplatten mit dem Testnährboden (4.1) wird die Impfmenge ermittelt, die möglichst grosse, aber noch schärfere Hemmzonen mit den verschiedenen verwendeten Konzentrationen an Virginiamycin ergibt. Die Beimpfung des Nährbodens muß zwischen 48 und 50 oC erfolgen. 4. Nährboden und Reagenzien 4.1 Testnährboden (1) >PIC FILE= "T9000467"> (1)Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden. 4.2 Phosphatpuffer, pH 6 >PIC FILE= "T9000468"> 4.3 Physiologische Kochsalzlösung, steril 4.4 Methanol, rein 4.5 Gemisch von Phosphatpuffer (4.2) und Methanol, rein 80/20 in Vol. 4.6 Methanolische Tween-80-Lösung 0,5 v.H. (G/V). 4.7 Standardsubstanz : Virginiamycin von bekannter Aktivität. 5. Standardlösungen Eine methanolische Lösung der Standardsubstanz (4.7), die 800 ¶g Virginiamycin/ml enthält, wird hergestellt. Aus dieser Stammlösung wird durch Verdünnung mit dem Gemisch (4.5) eine Arbeitsstandardlösung S8 hergestellt, die 1 ¶g Virginiamycin/ml enthält. Dann werden die nachstehenden Konzentrationen mit dem Gemisch (4.5) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt: S4 0,5 ¶g/ml S2 0,25 l ¶g/m S1 0,125 ¶g/ml 6. Extraktion 6.1 Bei Gehalten an Virginiamycin, gleich oder unter 50 ppm 10 bis 20 g der Probe werden eingewogen, 100 ml der Lösung (4.6) zugesetzt und 30 Minuten lang auf einem Schütteltisch geschüttelt. Dann wird zentrifugiert oder filtriert. 20 ml der klaren Lösung werden abgenommen und in einem Rotationsverdampfer zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in 20 ml oder mehr des Gemischs (4.5) aufgenommen, um eine vermutete Konzentration an Virginiamycin von 1 ¶g/ml (= U8) zu erhalten. Anschließend werden die Konzentrationen U4, U2 und U1 mit dem Gemisch (4.5) durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt. 6.2 Bei Gehalten an Virginiamycin über 50 ppm 1 bis 10 g der Probe werden eingewogen, 100 ml der Lösung (4.6) zugesetzt und 30 Minuten lang auf einem Schütteltisch geschüttelt. Dann wird zentrifugiert oder filtriert und mit dem Gemisch (4.5) verdünnt, um eine vermutete Konzentration an Virginiamycin von 1 ¶g/ml (= U8) zu erhalten. Anschließend werden die


text: Konzentrationen U4, U2 und U1 wie unter 6.1 beschrieben hergestellt. 7. Testverfahren 7.1 Beimpfung des Nährbodens Der Testnährboden (4.1) wird mit der Keimsuspension (3.2) bei 48 bis 50 oC beimpft. 7.2 Herstellung der Platten Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je 4 Konzentrationsstufen der Standardlösung (S8, S4, S2, S1) und des Extrakts (U8, U4, U2, U1) angelegt. Jede Platte erhält unbedingt alle 4 Konzentrationen des Standards und der Probe. Daher muß die Plattengrösse so bemessen sein, daß mindestens 8 Löcher in der Nährbodenschicht ausgestanzt werden können ; der Lochdurchmesser beträgt 10 bis 13 mm. Die beimpfte Nährbodenmenge (7.1) soll so berechnet sein, daß man eine gleichmässige Schicht von ca. 2 mm Höhe erhält. Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Aluminiumoder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt werden. In die Löcher werden mit der Pipette genau abgemessene Mengen der Antibiotika-Lösung zwischen 0,10 und 0,15 ml je nach Durchmesser der Löcher gefuellt. Für jede Probe muß mindestens jede Konzentration in 4facher Wiederholung eingefuellt werden, so daß pro Ansatz für jede Probe 32 Hemmzonen ausgewertet werden. 7.3 Inkubation Die Inkubation erfolgt während etwa 18 Stunden bei 28 bis 30 oC. 8. Auswertung Der Durchmesser der Hemmzonen wird vorzugsweise durch Projektion gemessen. Die Messungen werden auf Semilogarithmenpapier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen den Durchmesser der Hemmzonen angetragen wird. Für den Standard sowie für den Extrakt werden die Geraden gezogen. In einem störungsfreien Test müssen die beiden Geraden parallel sein. Der Logarithmus der relativen Aktivität wird durch folgende Formel rein rechnerisch ermittelt: >PIC FILE= "T0004344"> Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität. 9. Wiederholbarkeit Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe 10 v.H. relativ nicht überschreiten.


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 32002D0466(01)
 2002/466/EG: Beschluss des Rates vom 17. Dezember 2001 über den Abschluss eines Zusatzprotokolls zum Europa-Abkommen zur Gründung einer Assoziation zwischen den Europäischen Gemeinschaften und ihren Mitgliedstaaten einerseits und der Republik Lettland andererseits zur Festlegung der Handelsregelung für bestimmte Fische und Fischereierzeugniss
 Amtsblatt Nr. L 162 vom 20/06/2002 S. 0022 - 0022
 Beschluss des Ratesvom 17. Dezember 2001über den Abschluss eines Zusatzprotokolls zum Europa-Abkommen zur Gründung einer Assoziation zwischen den Europäischen Gemeinschaften und ihren Mitgliedstaaten einerseits und der Republik Lettland andererseits zur Festlegung der Handelsregelung für bestimmte Fische und Fischereierzeugnisse(2002/466/EG)DER RAT DER EUROPÄISCHEN UNION -gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft, insbesondere auf Artikel 133 in Verbindung mit Artikel 300 Absatz 2 Unterabsatz 1 Satz 1,auf Vorschlag der Kommission,in Erwägung nachstehender Gründe:(1) Es ist angebracht, das Europa-Abkommen zur Gründung einer Assoziation zwischen den Europäischen Gemeinschaften und ihren Mitgliedstaaten einerseits und der Republik Lettland andererseits(1) durch ein Zusatzprotokoll zu ergänzen, um Präferenzbedingungen für die Einfuhr bestimmter Fische und Fischereierzeugnisse mit Ursprung in der Republik Lettland in die Gemeinschaft und für die Einfuhr bestimmter Fische und Fischereierzeugnisse mit Ursprung in der Gemeinschaft in die Republik Lettland vorzusehen.(2) Zu diesem Zweck sollte dem Europa-Abkommen ein neues Protokoll hinzugefügt werden, das die Handelsregelung für bestimmte Arten von Fisch und Fischereierzeugnissen enthält.(3) Das Protokoll sollte genehmigt werden -BESCHLIESST:Artikel 1Das Zusatzprotokoll zum Europa-Abkommen zur Gründung einer Assoziation zwischen den Europäischen Gemeinschaften und ihren Mitgliedstaaten einerseits und der Republik Lettland andererseits zur Festlegung der Handelsregelung für bestimmte Fische und Fischereierzeugnisse wird im Namen der Gemeinschaft genehmigt.Der Wortlaut des Protokolls ist diesem Beschluss beigefügt.Artikel 2Der Präsident des Rates wird ermächtigt, die Person zu bestellen, die befugt ist, das Protokoll rechtsverbindlich für die Gemeinschaft zu unterzeichnen.Geschehen zu Brüssel am 17. Dezember 2001.Im Namen des RatesDer PräsidentA. Neyts-Uyttebroeck(1) ABl. L 26 vom 2.2.1998, S. 3.


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 31998D0716(06)
 Beschluß des Rates vom 29. Juni 1998 zur Ernennung eines Mitglieds und eines stellvertretenden Mitglieds des Beratenden Ausschusses für die Ausbildung von Hebammen
 Amtsblatt Nr. C 222 vom 16/07/1998 S. 0009 - 0009
 BESCHLUSS DES RATES vom 29. Juni 1998 zur Ernennung eines Mitglieds und eines stellvertretenden Mitglieds des Beratenden Ausschusses für die Ausbildung von Hebammen (98/C 222/06)DER RAT DER EUROPÄISCHEN UNION -gestützt auf den Beschluß 80/156/EWG des Rates vom 21. Januar 1980 zur Einsetzung eines Beratenden Ausschusses für die Ausbildung von Hebammen (1), insbesondere auf die Artikel 3 und 4;in der Erwägung, daß der Rat mit Beschluß vom 23. Oktober 1995 und mit Beschluß vom 16. September 1996 (2) für die Zeit bis zum 22. Oktober 1998 Frau Vassiliki FLOURI zum Mitglied und Frau Maria NOULA zum stellvertretenden Mitglied des obengenannten Ausschusses ernannt hat;in der Erwägung, daß die griechische Regierung Frau Maria NOULA als Nachfolgerin von Frau Vassiliki FLOURI und Frau Antiopi GRIVA als Nachfolgerin von Frau Maria NOULA benannt hat -BESCHLIESST:Artikel 1 Frau Maria NOULA wird als Nachfolgerin von Frau Vassiliki FLOURI für deren verbleibende Amtszeit, d. h. bis zum 22. Oktober 1998, zum Mitglied des Beratenden Ausschusses für die Ausbildung von Hebammen ernannt.Artikel 2 Frau Antiopi GRIVA wird als Nachfolgerin von Frau Maria NOULA für deren verbleibende Amtszeit, d. h. bis zum 22. Oktober 1998, zum stellvertretenden Mitglied des Beratenden Ausschusses für die Ausbildung von Hebammen ernannt.Geschehen zu Luxemburg am 29. Juni 1998.Im Namen des RatesDer PräsidentR. COOK(1) ABl. L 33 vom 11.2.1980, S. 13.(2) ABl. C 292 vom 7.11.1995, S. 2 und ABl. C 290 vom 3.10.1996, S. 1.


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 31980L0666
 Richtlinie 80/666/EWG des Rates vom 24. Juni 1980 zur Änderung der Richtlinie 75/268/EWG über die Landwirtschaft in Berggebieten und in bestimmten benachteiligten Gebieten
 Amtsblatt Nr. L 180 vom 14/07/1980 S. 0034 - 0035 Finnische Sonderausgabe: Kapitel 3 Band 12 S. 0056 Griechische Sonderausgabe: Kapitel 03 Band 29 S. 0140 Schwedische Sonderausgabe: Kapitel 3 Band 12 S. 0056 Spanische Sonderausgabe: Kapitel 03 Band 18 S. 0167 Portugiesische Sonderausgabe: Kapitel 03 Band 18 S. 0167
 RICHTLINIE DES RATES vom 24. Juni 1980 zur Änderung der Richtlinie 75/268/EWG über die Landwirtschaft in Berggebieten und in bestimmten benachteiligten Gebieten (80/666/EWG) DER RAT DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN - gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft, insbesondere auf die Artikel 42 und 43, auf Vorschlag der Kommission (1), nach Stellungnahme des Europäischen Parlaments (2), in Erwägung nachstehender Gründe: In dem Gebiet des Mezzogiorno, einschließlich der Inseln, und in den Gebieten des Departements d'Outre-Mer, ist die landwirtschaftliche Mindestnutzfläche von 3 Hektar für die Betriebe, die die Ausgleichszulage gemäß Titel II der Richtlinie 75/268/EWG des Rates vom 28. April 1975 über die Landwirtschaft in Berggebieten und in bestimmten benachteiligten Gebieten (3), zuletzt geändert durch die Richtlinie 76/400/EWG (4), erhalten, bei der grossen Zahl von Kleinstbetrieben zu groß ; es ist notwendig, diese Mindestgrösse auf 2 Hektar landwirtschaftliche Nutzfläche festzulegen. In Anbetracht der Entwicklung der Kaufkraft seit der Verabschiedung der Richtlinie 75/268/EWG ist es gerechtfertigt, den Hoechstbetrag der Ausgleichszulage heraufzusetzen. Angesichts der Entwicklung der Rinderzucht in den benachteiligten Gebieten Italiens in den letzten Jahren ist es gerechtfertigt, die Gewährung der Ausgleichszulage nicht auf eine bestimmte Zahl von Milchkühen zu beschränken. Der in Artikel 15 der Richtlinie 75/268/EWG vorgesehene Erstattungssatz von 25 % der erstattungsfähigen Ausgaben bezueglich der Förderungsregelung für Betriebsinhaber, die einen Entwicklungsplan aufstellen, erscheint in den benachteiligten landwirtschaftlichen Gebieten des Mezzogiorno, einschließlich der Inseln, und in Westirland ("western region") im Sinne der obigen Richtlinie nicht ausreichend, um die in der Richtlinie 72/159/EWG (5) vorgesehenen Maßnahmen zur Modernisierung der Betriebe wirksam anzuwenden ; dieser Satz ist daher auf 50 % festzulegen. In dem Gebiet des Mezzogiorno, einschließlich der Inseln, sind die in Artikel 11 der Richtlinie 75/268/EWG genannten Maßnahmen von zunehmender Bedeutung ; für eine wirksame Anwendung dieser Maßnahmen erscheint der gegenwärtige Erstattungssatz für die damit verbundenen Ausgaben nicht ausreichend. Der Erstattungssatz muß daher auf 50 % festgelegt und die finanzielle Hoechstbeteiligung der Gemeinschaft auf 48 358 ECU je kollektive Investition und auf 242 ECU je Hektar verbesserte oder ausgerüstete Weide oder Alm erhöht werden. Im Falle Italiens und Irlands erscheint der Erstattungssatz von 35 % der erstattungsfähigen Ausgaben betreffend die Ausgleichszulage gemäß Artikel 15 der Richtlinie 75/268/EWG nicht ausreichend, um diese Maßnahme wirksam anzuwenden ; er muß daher auf 50 % festgelegt werden - HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN: Artikel 1 Die Richtlinie 75/268/EWG erhält folgende Fassung: 1. In Artikel 2 Absatz 3 wird die Zahl 0,5 % durch die Zahl 1,5 % ersetzt. 2. In Artikel 6 Absatz 1 wird nach dem ersten Unterabsatz folgender Unterabsatz hinzugefügt: "In dem Gebiet des


text: Mezzogiorno, einschließlich der Inseln, sowie in den Gebieten des Departements d'Outre-Mer, wird jedoch die landwirtschaftliche Mindestnutzfläche je Betrieb auf 2 Hektar festgelegt." 3. In Artikel 7 Absatz 1 Buchstaben a) und b) wird der Betrag von 50 Rechnungseinheiten durch 97 ECU ersetzt. (1)ABl. Nr. C 124 vom 17.5.1979, S. 3. (2)ABl. Nr. C 85 vom 8.4.1980, S. 57. (3)ABl. Nr. L 128 vom 19.5.1975, S. 1. (4)ABl. Nr. L 108 vom 26.4.1976, S. 21. (5)ABl. Nr. L 96 vom 23.4.1972, S. 1. 4. In Artikel 7 Absatz 1 Buchstabe a) wird folgender Absatz angefügt: "Die beiden vorangehenden Absätze finden in den Hügelgebieten Italiens, die Bestandteil der Gebiete im Sinne des Artikels 3 Absätze 4 und 5 sind, keine Anwendung." 5. Artikel 15 erhält folgende Fassung: "Artikel 15 (1) Die von den Mitgliedstaaten im Rahmen der Maßnahmen nach den Artikeln 5 bis 11 getätigten Ausgaben sind nach Maßgabe des Artikels 19 der Richtlinie 72/159/EWG erstattungsfähig durch den EAGFL, Abteilung Ausrichtung. In dem Gebiet des Mezzogiorno, einschließlich der Inseln, und in den Gebieten Westirlands ("western region") beträgt der Erstattungssatz für die im Rahmen der Maßnahmen nach Artikel 8 Absatz 2 und Artikel 10 der Richtlinie 72/159/EWG, ergänzt durch Artikel 9 der vorliegenden Richtlinie, getätigten Ausgaben 50 %. In dem Gebiet des Mezzogiorno, einschließlich der Inseln, beträgt der Erstattungssatz für die im Rahmen der Maßnahmen nach Artikel 11 getätigten Ausgaben 50 %. (2) Die Beteiligung der Gemeinschaft an den erstattungsfähigen Ausgaben gemäß Artikel 11 darf jedoch 24179 ECU je kollektive Investition und 121 ECU je Hektar verbesserte oder ausgerüstete Weide oder Alm nicht übersteigen. In dem Gebiet des Mezzogiorno, einschließlich der Inseln, darf die Beteiligung der Gemeinschaft jedoch 48 358 ECU je kollektive Investition und 242 ECU je Hektar verbesserte oder ausgerüstete Weide oder Alm nicht übersteigen. (3) Der EAGFL, Abteilung Ausrichtung, vergütet den Mitgliedstaaten 25 % der in Titel II genannten Ausgleichszulage. Im Falle Italiens und Irlands beträgt der Erstattungssatz 50 %. Für die Ausgaben im Zusammenhang mit der Ausgleichszulage wird jedoch keinerlei Erstattung gewährt, wenn der Betriebsinhaber eine allgemeine Altersrente bezieht." Artikel 2 (1) Die Änderung gemäß Artikel 1 Nummer 2 wird am 1. Januar 1980 wirksam. (2) Die Änderungen gemäß Artikel 1 Nummer 4 beziehen sich nur auf die für das Jahr 1979 und die folgenden Jahre gewährten Beihilfen. Artikel 3 Diese Richtlinie ist an die Mitgliedstaaten gerichtet. Geschehen zu Luxemburg am 24. Juni 1980. Im Namen des Rates Der Präsident S. FORMICA


text:
 11.11.2006
 DE
 Amtsblatt der Europäischen Union
 L 312/59
 BESCHLUSS DER KOMMISSION
 vom 9. November 2006
 zur Änderung des Anhangs zur Verordnung (EG) Nr. 1228/2003 über die Netzzugangsbedingungen für den grenzüberschreitenden Stromhandel
 (Text von Bedeutung für den EWR)
 (2006/770/EG)
 DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
 gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,
 gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 1228/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 26. Juni 2003 über die Netzzugangsbedingungen für den grenzüberschreitenden Stromhandel (1), insbesondere auf Artikel 8 Absatz 4,
 in Erwägung nachstehender Gründe:
 (1)
 In der Verordnung (EG) Nr. 1228/2003 wurden Leitlinien für die Verwaltung und Vergabe verfügbarer Übertragungskapazität von Verbindungsleitungen zwischen nationalen Netzen festgelegt.
 (2)
 In diese Leitlinien sollten effiziente Engpassmanagementmethoden für die grenzüberschreitenden Stromverbindungskapazitäten aufgenommen werden, um einen wirksamen Zugang zu den Übertragungsnetzen für die Zwecke grenzüberschreitender Transaktionen zu gewährleisten.
 (3)
 Die Maßnahmen dieses Beschlusses stehen im Einklang mit der Stellungnahme des gemäß Artikel 13 Absatz 2 der Verordnung (EG) Nr. 1228/2003 eingesetzten Ausschusses —
 BESCHLIESST:
 Artikel 1
 Der Anhang zur Verordnung (EG) Nr. 1228/2003 wird durch den Anhang zu diesem Beschluss ersetzt.
 Artikel 2
 Dieser Beschluss tritt am zwanzigsten Tag nach seiner Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.
 Brüssel, den 9. November 2006
 Für die Kommission
 Andris PIEBALGS
 Mitglied der Kommission
 (1) ABl. L 176 vom 15.7.2003, S. 1.
 ANHANG
 Leitlinien für das Management und die Vergabe verfügbarer Übertragungskapazitäten auf Verbindungsleitungen zwischen nationalen Netzen
 1. Allgemeine Bestimmungen
 1.1
 Die Übertragungsnetzbetreiber (ÜNB) setzen alle verfügbaren Mittel ein, um alle kommerziellen Transaktionen, einschließlich Transaktionen zum Zwecke des grenzüberschreitenden Handels, anzunehmen.
 1.2
 Besteht kein Engpass, darf der Netzzugang für den grenzüberschreitenden Handel nicht beschränkt werden. Wo üblicherweise keine Engpässe auftreten, ist kein ständiges, allgemeines Engpassmanagementverfahren erforderlich.
 1.3
 Wo fahrplanmäßige kommerzielle Transaktionen mit dem sicheren Netzbetrieb nicht vereinbar sind, wirken die ÜNB dem Engpass im Einklang mit den Anforderungen an den sicheren Netzbetrieb entgegen und setzen entsprechende Maßnahmen ein, um sicherzustellen, dass alle damit verbundenen Kosten ein ökonomisch effizientes Niveau nicht überschreiten. Falls kostengünstigere Maßnahmen nicht angewandt werden können, sind ein Redispatching oder Countertrading als Abhilfemaßnahme in Betracht zu ziehen.
 1.4
 Falls strukturelle Engpässe auftreten, müssen die ÜNB unverzüglich geeignete, im Voraus festgelegte und vereinbarte Regeln und Vereinbarungen für das Engpassmanagement anwenden. Die Engpassmanagementmethoden gewährleisten, dass die mit der zugewiesenen Übertragungskapazität verbundenen physikalischen Stromflüsse mit den Netzsicherheitsstandards übereinstimmen.
 1.5
 Die für das Engpassmanagement angewandten Methoden senden effiziente ökonomische Signale an die Marktteilnehmer und ÜNB aus, fördern den Wettbewerb und sind für eine regionale und gemeinschaftsweite Anwendung geeignet.
 1.6
 Beim Engpassmanagement dürfen keine Unterschiede aufgrund der unterschiedlichen Transaktion gemacht werden. Ein Antrag auf Netzzugang für den grenzüberschreitenden Handel darf nur dann verweigert werden, wenn die folgenden Voraussetzungen zusammen vorliegen:
 a)
 Die zusätzlichen physikalischen Lastflüsse, die aus der Annahme dieses Antrags resultieren, lassen eine Situation entstehen, in der der sichere Betrieb des elektrischen Energieversorgungsnetzes nicht mehr gewährleistet werden kann, und
 b)
 der monetäre Wert dieses Antrags ist im Engpassmanagementverfahren niedriger als der aller anderen Anträge, die für dieselbe Leistung und zu denselben Bedingungen angenommen werden


text:
sollen.
 1.7
 Bei der Bestimmung der Netzgebiete, in denen und zwischen denen Engpassmanagement betrieben werden soll, lassen sich die ÜNB von den Grundsätzen der Rentabilität und der Minimierung negativer Auswirkungen auf den Elektrizitätsbinnenmarkt leiten. Insbesondere dürfen die ÜNB die Verbindungskapazität, außer aus Gründen der Betriebssicherheit, nicht beschränken, um einen Engpass innerhalb der eigenen Regelzone zu beheben, es sei denn aus den oben genannten Gründen und aus Gründen der Betriebssicherheit (1). Falls eine solche Situation eintritt, wird sie von den ÜNB beschrieben und allen Nutzern in transparenter Weise dargelegt. Eine solche Situation kann nur solange geduldet werden, bis eine langfristige Lösung gefunden wird. Die Methodik und die Projekte, durch die eine langfristige Lösung erreicht werden soll, werden von den ÜNB beschrieben und allen Nutzern in transparenter Weise dargelegt.
 1.8
 Beim Einsatz von netztechnischen Maßnahmen und von Redispatching im Betrieb des Übertragungsnetzes in der eigenen Regelzone berücksichtigt der ÜNB die Auswirkungen dieser Maßnahmen auf benachbarte Regelzonen.
 1.9
 Spätestens bis zum 1. Januar 2008 werden koordinierte Mechanismen für das „intra-day“-Engpassmanagement eingeführt, um die Handelsmöglichkeiten zu maximieren und den grenzüberschreitenden Austausch von Ausgleichsenergie zu ermöglichen.
 1.10
 Die nationalen Regulierungsbehörden bewerten die Methoden des Engpassmanagements in regelmäßigen Abständen unter besonderer Berücksichtigung der Einhaltung der in dieser Verordnung und diesen Leitlinien festgelegten Grundsätze und Regeln sowie der von den Regulierungsbehörden gemäß diesen Grundsätzen und Regeln festgelegten Modalitäten und Bedingungen. Eine solche Bewertung umfasst die Konsultation aller Marktteilnehmer und einschlägige Studien.
 2. Engpassmanagementmethoden
 2.1
 Die Engpassmanagementmethoden sind marktorientiert, um einen effizienten grenzüberschreitenden Handel zu erleichtern. Zu diesem Zweck erfolgt die Kapazitätsvergabe nur durch explizite (Kapazitäts-)Auktionen oder durch implizite (Kapazitäts- und Energie-)Auktionen. Beide Methoden können für ein und dieselbe Verbindungsleitung gleichzeitig bestehen. Für den „intra-day“-Handel kann ein fortlaufendes Handelssystem verwendet werden.
 2.2
 In Abhängigkeit von den Wettbewerbsbedingungen müssen die Mechanismen für das Engpassmanagement unter Umständen sowohl eine kurz- als auch eine langfristige Kapazitätsvergabe ermöglichen.
 2.3
 Bei jedem Kapazitätsvergabeverfahren werden ein festgeschriebener Anteil der verfügbaren Verbindungskapazität, etwaige verbleibende, nicht zuvor zugewiesene Kapazitäten und Kapazitäten, die Kapazitätsinhaber aus früheren Vergaben freigegeben haben, zugewiesen.
 2.4
 Die ÜNB optimieren die Verlässlichkeit der Kapazitätsbereitstellung unter Berücksichtigung der Rechte und Pflichten der beteiligten ÜNB und der Rechte und Pflichten der Marktteilnehmer, um einen wirksamen und effizienten Wettbewerb zu erleichtern. Ein angemessener Anteil der Kapazitäten kann dem Markt mit einem geringeren Verbindlichkeitsgrad angeboten werden, die genauen Bedingungen für die Übertragung über grenzüberschreitende Leitungen müssen den Marktteilnehmern jedoch immer bekannt gegeben werden.
 2.5
 Die mit lang- und mittelfristigen Vergaben verbundenen Kapazitätsrechte müssen verbindliche Übertragungskapazitätsrechte sein. Für sie gilt zum Zeitpunkt der Nominierung der „use-it-or-lose-it“-Grundsatz oder der „use-it-or-sell-it“-Grundsatz.
 2.6
 Die ÜNB legen eine zweckmäßige Struktur für die Kapazitätsvergabe für die einzelnen Zeitraster fest. Hierzu kann die Option gehören, einen Mindestprozentsatz der Verbindungskapazität für die täglich oder mehrmals täglich erfolgende Vergabe zu reservieren. Diese Vergabestruktur wird von den jeweiligen Regulierungsbehörden überprüft. Bei der Erstellung ihrer Vorschläge berücksichtigen die ÜNB
 a)
 die Merkmale der Märkte
 b)
 die Betriebsbedingungen, z. B. die Auswirkungen der Saldierung verbindlich angemeldeter Fahrpläne
 c)
 den Grad der Harmonisierung der Prozentsätze und der Zeitraster, die für


text:
die verschiedenen bestehenden Kapazitätsvergabemechanismen festgelegt wurden.
 2.7
 Bei der Kapazitätsvergabe dürfen Marktteilnehmer, die grenzüberschreitende Lieferungen durch die Nutzung bilateraler Verträge realisieren, und Marktteilnehmer, die ihre grenzüberschreitenden Lieferungen über die Strombörsen realisieren, nicht diskriminiert werden. Die höchsten Gebote, ob implizite oder explizite Gebote für ein bestimmtes Zeitraster, erhalten den Zuschlag.
 2.8
 In Regionen, in denen Terminstrommärkte gut entwickelt sind und sich als effizient erwiesen haben, kann die gesamte Verbindungskapazität durch implizite Auktionen vergeben werden.
 2.9
 Außer bei neuen Verbindungsleitungen, für die eine Ausnahme nach Artikel 7 der Verordnung gilt, dürfen bei den Kapazitätsvergabemethoden keine Mindestpreise festgesetzt werden.
 2.10
 Grundsätzlich dürfen alle potenziellen Marktteilnehmer uneingeschränkt am Vergabeverfahren teilnehmen. Um zu vermeiden, dass Probleme im Zusammenhang mit der potenziellen Nutzung der marktbeherrschenden Stellung eines Marktteilnehmers entstehen oder verschärft werden, können die jeweiligen Regulierungs- und/oder Wettbewerbsbehörden gegebenenfalls allgemeine oder für ein einzelnes Unternehmen geltende Beschränkungen aufgrund der Machtmarkt verhängen.
 2.11
 Die Marktteilnehmer nominieren ihre Kapazitätsnutzung bis zu einem für die einzelnen Zeitraster festgelegten Termin verbindlich bei den ÜNB. Der Termin ist so festzusetzen, dass die ÜNB in der Lage sind, ungenutzte Kapazitäten für eine Neuvergabe im nächsten relevanten Zeitraster, einschließlich „intra-day“, neu einzustellen.
 2.12
 Die Kapazität ist auf sekundärer Basis frei handelbar, sofern der ÜNB ausreichend rechtzeitig unterrichtet wird. Lehnt ein ÜNB den Sekundärhandel (Sekundärtransaktionen) ab, muss der ÜNB dies allen Marktteilnehmern in deutlicher und transparenter Form mitteilen und erklären und der Regulierungsbehörde melden.
 2.13
 Die finanziellen Folgen, die sich aus der Nichteinhaltung der mit der Kapazitätsvergabe verbundenen Verpflichtungen ergeben, werden denjenigen angelastet, die für diese Nichteinhaltung verantwortlich sind. Nutzen Marktteilnehmer die Kapazität, zu deren Nutzung sie sich verpflichtet haben, nicht, oder handeln sie diese im Falle einer durch eine explizite Auktion erworbenen Kapazität nicht auf sekundärer Basis oder geben sie die Kapazität nicht rechtzeitig zurück, verlieren sie ihren Anspruch auf diese Kapazität und zahlen ein kostenorientiertes Entgelt. Die kostenorientierte Entgelte für die Nichtnutzung von Kapazität müssen gerechtfertig und angemessen sein. Ebenso muss ein ÜNB, der seiner Verpflichtung nicht nachkommt, den Marktteilnehmer für den Verlust von Kapazitätsrechten entschädigen. Folgeverluste werden dabei nicht berücksichtigt. Die zentralen Konzepte und Methoden zur Bestimmung der Haftungsansprüche aus der Nichteinhaltung von Verpflichtungen sind, was die finanziellen Konsequenzen betrifft, im Voraus festzulegen und von der jeweiligen nationalen Regulierungsbehörde bzw. den jeweiligen nationalen Regulierungsbehörden zu überprüfen.
 3. Koordinierung
 3.1
 Die Kapazitätsvergabe auf einer Verbindungsleitung wird mit Hilfe gemeinsamer Vergabeverfahren der beteiligten ÜNB koordiniert und vorgenommen. In Fällen, in denen damit zu rechnen ist, dass der kommerzielle Handel zwischen zwei Ländern (ÜNB) erhebliche Auswirkungen auf die physikalischen Lastflüsse in einem Drittland (ÜNB) haben wird, werden die Engpassmanagementmethoden zwischen allen auf diese Weise betroffenen ÜNB durch ein gemeinsames Verfahren für das Engpassmanagement koordiniert. Die nationalen Regulierungsbehörden und die ÜNB gewährleisten, dass es nicht zu einer einseitigen Anwendung eines Engpassmanagementverfahrens kommt, das erhebliche Auswirkungen auf die physikalischen Stromflüsse in anderen Netzen hat.
 3.2
 Spätestens zum 1. Januar 2007 werden zwischen den Ländern in den folgenden Regionen eine gemeinsame, koordinierte Methode für das Engpassmanagement und ein gemeinsames, koordiniertes Verfahren, durch das dem Markt auf mindestens


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jährlicher, monatlicher und vortäglicher Grundlage Kapazitäten zugewiesen werden, angewandt:
 a)
 Nordeuropa (d. h. Dänemark, Schweden, Finnland, Deutschland und Polen)
 b)
 Nordwesteuropa (d. h. Benelux, Deutschland und Frankreich)
 c)
 Nordgrenzen Italiens (d. h. Italien, Frankreich, Deutschland, Österreich, Slowenien und Griechenland)
 d)
 Mittelosteuropa (d. h. Deutschland, Polen, Tschechische Republik, Ungarn, Österreich und Slowenien)
 e)
 Südwesteuropa (d. h. Spanien, Portugal und Frankreich)
 f)
 Vereinigtes Königreich, Irland und Frankreich
 g)
 Baltische Staaten (d. h. Estland, Lettland und Litauen)
 Bei einer Verbindungsleitung, die Länder betrifft, die mehr als einer Region angehören, kann die jeweils angewandte Engpassmanagementmethode verschieden sein, um die Vereinbarkeit mit den in den anderen Regionen, zu denen diese Länder gehören, angewandten Methoden zu gewährleisten. In diesem Fall schlagen die maßgeblichen ÜNB die Methode vor, die von den jeweiligen Regulierungsbehörden überprüft wird.
 3.3
 In Regionen, auf die unter Ziffer 2.8 Bezug genommen wird, kann die gesamte Verbindungskapazität durch eine Vergabe für den Folgetag zugewiesen werden.
 3.4
 In allen genannten sieben Regionen sind miteinander kompatible Engpassmanagementverfahren im Hinblick auf die Bildung eines wirklich integrierten europäischen Elektrizitätsbinnenmarkts festzulegen. Die Marktteilnehmer dürfen sich nicht regionalen Netzen gegenüber sehen, die miteinander nicht kompatibel sind.
 3.5
 Mit Blick auf die Förderung eines fairen und effizienten Wettbewerbs und des grenzüberschreitenden Handels umfasst die Koordinierung zwischen den ÜNB innerhalb der unter Ziffer 3.2 genannten Regionen alle Stufen von der Kapazitätsberechnung und der Vergabeoptimierung bis zum sicheren Netzbetrieb, wobei die Verantwortlichkeiten klar zugeordnet sind. Zu einer solchen Koordinierung gehören insbesondere
 a)
 die Verwendung eines gemeinsamen Übertragungsnetzmodells, das auf effiziente Weise mit voneinander abhängigen physikalischen Ringflüssen umgeht und Abweichungen zwischen den physikalischen und den kommerziellen Lastflüssen berücksichtigt,
 b)
 die Vergabe und die Nominierung von Kapazität für einen effizienten Umgang mit voneinander abhängigen physikalischen Ringflüssen
 c)
 identische Verpflichtungen der Kapazitätsinhaber zur Bereitstellung von Informationen über ihre beabsichtigte Kapazitätsnutzung, z. B. die Nominierung von Kapazität (für explizite Auktionen)
 d)
 einheitliche Zeitraster und Termine für die letzte Mitteilung von Fahrplänen
 e)
 eine hinsichtlich der Zeitraster (z. B. 1 Tag, 3 Stunden, 1 Woche usw.) und der verkauften Kapazitätsblöcke (Leistung in MW, Energie in MWh usw.) einheitliche Struktur für die Kapazitätsvergabe
 f)
 ein einheitlicher Rahmen für die Verträge mit den Marktteilnehmern
 g)
 die Überprüfung von Stromflüssen, um die Anforderungen an die Netzsicherheit für die Betriebsplanung und für den Echtzeitbetrieb einzuhalten
 h)
 Rechnungslegung und Bezahlung von Maßnahmen des Engpassmanagements.
 3.6
 Die Koordinierung umfasst auch den Informationsaustausch zwischen ÜNB. Art, Zeitpunkt und Häufigkeit des Informationsaustauschs müssen mit den unter Ziffer 3.5 genannten Tätigkeiten und mit dem Funktionieren der Elektrizitätsmärkte vereinbar sein. Dieser Informationsaustausch muss es insbesondere den ÜNB ermöglichen, die bestmöglichen Prognosen zur allgemeinen Netzsituation zu erstellen, um die Stromflüsse in ihrem Netz und die verfügbaren Verbindungskapazitäten zu bewerten. Ein ÜNB, der Informationen im Auftrag anderer ÜNB kompiliert, meldet den beteiligten ÜNB die Ergebnisse der Datenerhebung zurück.
 4. Zeitplan für den marktbetrieb
 4.1
 Die Vergabe der verfügbaren Übertragungskapazität erfolgt mit ausreichendem Vorlauf. Vor jeder Vergabe veröffentlichen die beteiligten ÜNB gemeinsam die zuzuweisende Kapazität, wobei sie gegebenenfalls die aus etwaigen verbindlichen Übertragungsrechten frei gewordene Kapazität und, sofern relevant, die damit


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verbundenen saldierten Nominierungen sowie alle Zeiträume, in denen die Kapazität (z. B. aus Wartungsgründen) reduziert wird oder nicht zur Verfügung steht, berücksichtigen.
 4.2
 Unter umfassender Berücksichtigung der Netzsicherheit erfolgt die Nominierung von Übertragungsrechten mit ausreichendem Vorlauf vor den vortäglichen Sitzungen aller relevanten organisierten Märkte und vor der Veröffentlichung der Kapazität, die nach dem Mechanismus der am Folgetag oder „intra-day“ erfolgenden Vergabe zugewiesen werden soll. Nominierungen von Übertragungsrechten in gegenläufiger Richtung werden saldiert, um die Verbindungsleitung effizient zu nutzen.
 4.3
 Sukzessive, mehrmals täglich („intra-day“) stattfindende Vergaben der verfügbaren Übertragungskapazität für den Tag d erfolgen an den Tagen d-1 und d nach der Veröffentlichung der prognostizierten oder der tatsächlichen Erzeugungsfahrpläne für den Folgetag.
 4.4
 Bei der Vorbereitung des Netzbetriebs für den Folgetag tauschen die ÜNB Informationen mit den benachbarten ÜNB aus, darunter Informationen über ihre prognostizierte Netztopologie, die Verfügbarkeit und die prognostizierte Erzeugung von Erzeugungseinheiten und Lastflüsse, um die Nutzung des gesamten Netzes durch betriebliche Maßnahmen im Einklang mit den Regeln für den sicheren Netzbetrieb zu optimieren.
 5. Transparenz
 5.1.
 Die ÜNB veröffentlichen alle relevanten Daten, die die Netzverfügbarkeit, den Netzzugang und die Netznutzung betreffen, einschließlich eines Berichts, in dem die Engpässe und die Gründe dafür, die für das Engpassmanagement angewandten Methoden und die Pläne für das künftige Engpassmanagement dargelegt werden.
 5.2
 Die ÜNB veröffentlichen auf der Grundlage der elektrischen und physikalischen Netzgegebenheiten eine allgemeine Beschreibung der einzelnen, in Abhängigkeit von den jeweiligen Rahmenbedingungen zur Maximierung der dem Markt zur Verfügung stehenden Kapazität angewandten Methoden für das Engpassmanagement und ein allgemeines Modell für die Berechnung der Verbindungskapazität für die verschiedenen Zeitraster. Ein derartiges Modell unterliegt der Überprüfung durch die Regulierungsbehörden der betroffenen Mitgliedstaaten.
 5.3
 Die angewandeten Engpassmanagement- und Kapazitätsvergabeverfahren sowie die Zeiten und Verfahren für die Beantragung von Kapazitäten, eine Beschreibung der angebotenen Produkte und der Rechte und Pflichten sowohl der ÜNB als auch der Partei, die die Kapazität bezieht, einschließlich der Haftungsansprüche aus der Nichteinhaltung von Verpflichtungen, werden von den ÜNB ausführlich dargelegt und allen potenziellen Netznutzern in transparenter Weise zugänglich gemacht.
 5.4
 Die Betriebs- und Planungsstandards sind fester Bestandteil der Informationen, die die Übertragungsnetzbetreiber in öffentlich zugänglichen Unterlagen veröffentlichen. Auch diese Unterlagen werden von den nationalen Regulierungsbehörden überprüft.
 5.5
 Die ÜNB veröffentlichen alle relevanten Daten, die den grenzüberschreitenden Handel betreffen, ausgehend von der bestmöglichen Prognose. Um dieser Verpflichtung nachzukommen, stellen die betroffenen Marktteilnehmer den ÜNB die relevanten Daten zur Verfügung. Die Art und Weise, in der solche Informationen veröffentlicht werden, wird von den Regulierungsbehörden überprüft. Die ÜNB veröffentlichen mindestens folgende Angaben:
 a)
 jährlich: Informationen über die langfristige Entwicklung der Übertragungsinfrastruktur und ihre Auswirkungen auf die grenzüberschreitende Übertragungskapazität
 b)
 monatlich: Prognosen über die dem Markt im Folgemonat und im Folgejahr zur Verfügung stehende Übertragungskapazität unter Berücksichtigung aller dem ÜNB zum Zeitpunkt der Prognoseberechnung vorliegenden relevanten Informationen (z. B. Auswirkungen der Sommer- und der Wintersaison auf die Leitungskapazität, Netzwartungsarbeiten, Verfügbarkeit von Erzeugungseinheiten usw.)
 c)
 wöchentlich: Prognosen über die dem Markt in der Folgewoche zur Verfügung stehende Übertragungskapazität unter Berücksichtigung aller dem ÜNB zum Zeitpunkt der Prognoseberechnung vorliegenden relevanten Informationen wie Wetterprognose, geplante


text:
Netzwartungsarbeiten, Verfügbarkeit von Erzeugungseinheiten usw.
 d)
 täglich: die dem Markt je Marktzeiteinheit am Folgetag und „intra-day“ zur Verfügung stehende Übertragungskapazität unter Berücksichtigung aller saldierten Nominierungen für den Folgetag, aller saldierten Erzeugungsfahrpläne für den Folgetag, aller Nachfrageprognosen und geplanten Netzwartungsarbeiten
 e)
 die bereits zugewiesene Gesamtkapazität je Marktzeiteinheit und alle relevanten Bedingungen, die für die Nutzung dieser Kapazität gelten (z. B. Auktionsgleichgewichtspreis, Auflagen bezüglich der Art der Kapazitätsnutzung usw.), um etwaige verbleibende Kapazitäten zu ermitteln
 f)
 möglichst bald nach jeder Vergabe die zugewiesene Kapazität und Angaben zu den gezahlten Preisen
 g)
 unmittelbar nach der Nominierung die genutzte Gesamtkapazität je Marktzeiteinheit
 h)
 möglichst echtzeitnah: die aggregierten realisierten kommerziellen Lastflüsse und die tatsächlichen physikalischen Lastflüsse je Marktzeiteinheit, einschließlich einer Beschreibung etwaiger Korrekturmaßnahmen, die von den ÜNB zur Behebung von Netz- oder Systemschwierigkeiten vorgenommen wurden (z. B. Einschränkung der Transaktionen)
 i)
 ex-ante-Informationen über geplante Ausfälle und ex-post-Informationen über planmäßige und unplanmäßige Ausfälle von Stromerzeugungseinheiten mit mehr als 100 MW des Vortags.
 5.6
 Alle relevanten Informationen müssen dem Markt rechtzeitig für das Aushandeln aller Transaktionen (z. B. rechtzeitig für das Aushandeln jährlicher Lieferverträge für Industriekunden oder für die Einsendung von Geboten an organisierte Märkte) zur Verfügung stehen.
 5.7
 Die ÜNB veröffentlichen die relevanten Informationen über die prognostizierte Nachfrage und Erzeugung entsprechend den unter Ziffer 5.5 und Ziffer 5.6 angegebenen Zeitrastern. Die ÜNB veröffentlichen auch die relevanten Informationen, die für den grenzüberschreitenden Ausgleichsmarkt erforderlich sind.
 5.8
 Für die Veröffentlichung von Prognosen gilt, dass in Bezug auf die prognostizierten Informationen auch die ex post tatsächlich realisierten Werte in dem auf die Prognose folgenden Zeitraum oder spätestens am Folgetag (d+1) zu veröffentlichen sind.
 5.9
 Sämtliche von den ÜNB veröffentlichten Informationen werden in leicht zugänglicher Form unentgeltlich zur Verfügung gestellt. Ferner müssen alle Daten über adäquate und standardisierte Mittel des Datenaustauschs, die in enger Zusammenarbeit mit den Marktteilnehmern festzulegen sind, zugänglich sein. Zu den Daten gehören u. a. Informationen über vergangene Zeiträume - mindestens über die letzten zwei Jahre -, damit neu in den Markt eintretende Unternehmen auch Zugang zu solchen Daten haben.
 5.10
 Die ÜNB tauschen regelmäßig einen Satz ausreichend genauer Netz- und Lastflussdaten aus, um dem ÜNB in ihrem jeweiligen Gebiet die Berechnung von Lastflüssen zu ermöglichen. Der gleiche Datensatz ist den Regulierungsbehörden und der Europäischen Kommission auf Anfrage zur Verfügung zu stellen. Die Regulierungsbehörden und die Europäische Kommission gewährleisten, dass sie und jedweder Berater, der für sie auf der Grundlage dieser Daten analytische Arbeiten durchführt, diesen Datensatz vertraulich behandeln.
 6. Verwendung von engpasserlösen
 6.1
 Außer bei neuen Verbindungsleitungen, die eine Ausnahmeregelung nach Artikel 7 der Verordnung in Anspruch nehmen können, dürfen Engpassmanagementverfahren, die für ein vorher festgelegtes Zeitraster gelten Erlöse nur aus Engpässen erzielen, die in Bezug auf dieses Zeitraster entstehen. Das Verfahren für die Verteilung dieser Erlöse wird von den Regulierungsbehörden überprüft und darf weder die Vergabe zugunsten einer Kapazität oder Energie nachfragenden Partei verzerren noch einen Negativanreiz für die Verringerung von Engpässen darstellen.
 6.2
 Die nationalen Regulierungsbehörden müssen hinsichtlich der Verwendung der Erlöse aus der Vergabe von Verbindungskapazität Transparenz walten lassen.
 6.3
 Die Engpasserlöse teilen


text:
sich die beteiligten ÜNB gemäß den zwischen den beteiligten ÜNB vereinbarten und von den jeweiligen Regulierungsbehörden überprüften Kriterien.
 6.4
 Die ÜNB legen im Voraus genau fest, wie sie etwaige Engpasserlöse verwenden werden, und erstatten über die tatsächliche Verwendung dieser Erlöse Bericht. Die Regulierungsbehörden prüfen, ob die Verwendung mit dieser Verordnung und diesen Leitlinien übereinstimmt und ob die Gesamterlöse aus der Vergabe von Verbindungskapazität für mindestens einen der drei in Artikel 6 Absatz 6 der Verordnung genannten Zwecke bestimmt sind.
 6.5
 Die Regulierungsbehörden veröffentlichen jährlich bis zum 31. Juli eines jeden Jahres einen Bericht, in dem die Erlöse für den Zeitraum von 12 Monaten bis zum 30. Juni desselben Jahres und die Verwendung der betreffenden Erlöse dargelegt werden, sowie das Prüfergebnis, demzufolge die Verwendung mit dieser Verordnung und diesen Leitlinien übereinstimmt und die gesamten Engpasserlöse für mindestens einen der drei vorgeschriebenen Zwecke bestimmt sind.
 6.6
 Die Verwendung von Engpasserlösen für den Erhalt oder den Ausbau der Verbindungskapazität ist vorzugsweise für spezielle, im Voraus festgelegte Projekte bestimmt, die zur Behebung des jeweiligen Engpasses beitragen und auch, insbesondere hinsichtlich des Genehmigungsverfahrens, innerhalb eines vernünftigen zeitlichen Rahmens verwirklicht werden können.
 (1) Betriebssicherheit bedeutet, dass „das Übertragungsnetz innerhalb der vereinbarten Sicherheitsgrenzen gehalten wird“.