Rakukultuur

Rakukultuur on toimingute kogum, mis võimaldab kasvatada elusorganismide rakke väljaspool organismi ehk in vitro. Tüüpiliselt kasvatatakse inimese eri kudedest eraldatud rakke, kuid on üsna levinud ka rakud muudest organismidest, sh imetajad (nt hiina hamster, rohepärdik, kodukoer) kui loomad üldisemalt (nt uitöölane). Taime-, seene- ja bakterirakkude kasvatamise kohta kasutatakse enamasti täpsustavaid mõisteid (nt bakterikultuur).

Enamasti kasvavad ühes kultuuris ühte tüüpi rakud, nii algse elundi (nt kopsud, nahk) kui ka rakutüübi (nt fibroblastid või epiteelirakud) mõistes. Samas kuulub rakukultuuri arengusuundade hulka ka rakkude nn kooskultiveerimine (inglise keeles co-culturing). Rakukultuur loob väärtuslikke mudelsüsteeme, milles on võimalik läbi viia teaduslikke uuringuid: näiteks mõõta ravimikandidaatide omadusi, teha kindlaks teatud valgu rolli elusrakus, jäljendada füsioloogilisi protsesse või toota terapeutilisi antikehi või vaktsiine.

Rakkude üldised kasvutingimused 
Rakukultuuris on oluline tagada rakkudele kasvutingimused, mis võimaldaksid neil võimalikult kestvalt kasvada ja jaguneda. Seejuures mängivad rolli paljud tegurid, millest olulisimad on kasvukeskkonna temperatuur ja pH ning toitainete ja hapniku olemasolu.

Temperatuur ja valgustus 

Rakukultuuri korduvaid toiminguid teostatakse enamasti toatemperatuuril ja kunstliku valgustuse käes, bioohutuskapi ehk laminaari all. Muul ajal kasvavad aga rakud inkubaatoris, kus on pime, niiske ja soe atmosfäär. Suuremat osa inimorganismist pärit rakkudest kasvatatakse 37 °C juures, kuid teiste organismide rakud võivad vajada normaalseks talitluseks teisi temperatuure: nt uitöölasest (Spodoptera frugiperda) pärit rakuliin Sf9 kasvab eelistatult 24-28 °C juures.

Toitained 
Rakkude kasvatamine teostatakse viisil, kus rakke ümbritseb toitev veepõhine keskkond (nn rakusööde). Rakusööde sisaldab süsivesikuid (nt glükoos), aminohappeid (nt glutamiin), valgulisi lisandeid (nt kasvufaktoreid sisaldav veise looteseerum; inglise keeles fetal bovine serum, lühendina FBS), ioontugevust kindlustavaid ja vajalikke metalliioone sisaldavaid soolasid (nt NaCl, KCl, CaCl2), vitamiine ja muid koostisaineid. Erinevad rakud vajavad optimaalseks kasvuks erinevaid söötmeid ja täiendavaid lisandeid (nt insuliin, östradiool vms). Söötme koostis võib mõjutada ka rakkudega tehtavate katsete tulemusi (nt teatud metallisoolade kontsentratsioon võib mõjutada rakkude plasmamembraanil paiknevate retseptorite omadusi). Rakusöötme kasutamisel on oluline jälgida ka veesisaldust, kuna soolade suur kontsentratsioon võib viia rakud osmootse šokini; inkubaatori niiskusrežiim tagab rakusöötmes sisalduva vee minimaalset aurustumist.

pH 
Samuti sisaldab rakusööde koostisaineid, mis vastutavad pH puhverdamise eest. Kuna vere normaalne pH organismis on ligi 7,4, siis see on ka optimaalne pH paljude rakukultuuris kasvavate rakkude jaoks. Kuivõrd rakud võivad aga olla tundlikud puhvri komponentide suhtes (näiteks vähendab mõningate rakkude elumust oluliselt HEPES, mis on tüüpiliseks pH-puhverdamist tagavaks komponendiks paljudes biokeemilistes katsetes), siis kasutatakse sageli nn karbonaatpuhvrit. Karbonaatpuhver vajab toimimiseks kindlat süsihappegaasi sisaldust (enamasti 5% ruumala järgi ning ülejäänud 95% on õhk) rakusöötme kohal ehk rakkude kasvatamiseks kasutatava inkubaatori atmosfääris.

Sageli lisatakse rakusöötme koostisse sageli pH indikaatorit (fenoolpunane), mille värvuse alusel saab otsustada, kas rakkude kasvutingimused on sobilikud. Tüüpiliselt omab fenoolpunane olenevalt konkreetsest söötmest ja kasvatatavatest rakkudest värvust õrnroosast kuni oranžini. Rakkude tiheduse suurenemisel (millega kaasneb keskkonna happelisuse tõus rakkude hingamise käigus) või saastatuse tekkimisel muutub indikaatori värvus kollaseks. Kui aga sööde muutub liialt aluseliseks (nt juhul, kui rakke hoitakse pikalt väljaspool inkubaatorit või kui inkubaatori CO2 sensor ei toimi normaalselt), omandab fenoolpunane lillakat varjundit.

Hapnik 
Hapniku juurdepääsu tagamiseks rakkudele on määravaks mitu tegurit: rakusöötme hulk rakkude kohal/ümber, rakkude kasvatamiseks kasutatava nõu avatus, hapnikusisaldus inkubaatori atmosfääris ja kasvavate rakkude hapniku tarbimine kasvavate rakkude. Iga rakunõu tüübi puhul (nt Petri tass, kolb, kuue süvendiga plaat vms) tuleb arvestada tootja soovitatud rakusöötme ruumalaga, mis tagab rakkudele optimaalsed kasvutingimused nii hapniku kui ka toitainetega varustatuse seisukohalt.

Viimastel aastatel on teadlaste seas intensiivistunud arutelu mõistete „hüpoksia“ ja „normoksia“ üle rakukultuuri kontekstis. Hüpoksiaks nimetatakse üldistatult olukorda, kus keskkonna hapnikusisaldus on väiksem kui tavaolukorras (ehk normoksias). Tavaolukorra defineerimisel tuleb aga arvestada sellega, et organismi sees ei ole hapniku osarõhk nii suur kui õhus. Normaalrõhul (760 mmHg) on hapniku osarõhk atmosfääris veidi ligi 150 mmHg; terve inimese arteriaalses veres on aga hapniku osarõhk 100 mHg ja perifeersetes kudedes on see veelgi madalam, keskmiselt 40 mmHg. Mõnedes vähkkasvajates võib hapniku osarõhk olla isegi 3 mmHg. Seega on pakutud välja uus mõiste, füsoksia või füsioksia, kus hapniku osarõhk kasutatavas gaasisegus on 38 mmHg (vastab 5% sisaldusele ruumala järgi). Siiski toimub enamikus laborites rakkude rutiinne kasvatamine atmosfääris, mille hapnikusisaldus on ligi 19%; vähendatud hapnikusisaldust kasutatakse küll paljudes rakkudega tehtavates teaduskatsetes.

Antibiootikumid 
Vältimaks bakteriaalse või seenelise saastatuse teket toitvas rakusöötmes ja/või imetajate rakukultuuris, lisatakse söötmele sageli antibiootikume (nt penitsilliin, streptomütsiin) ja antimükootikume (nt amfoteritsiin B). Kuna on näidatud, et selliste lisandite kasutamine võib mõjutada rakkude kasvu, geenide avaldumist ja rakkude diferentseerumist, soovitavad mitmed protokollid vältida antibiootikumide ja antimükootikumide pidevat kasutamist rakukultuuris.

Rakkude kasvatamise viisid 
Kaks põhilist rakkude kasvatamise viisi rakukultuuris on suspensioonikultuur (vabalt hõljuvana kasvatamine) ja kinnituv kultuur (monokihina kasvatamine). Viimase aastakümne jooksul on rakkude kasvatamisel kogunud populaarsust ka nn 3D-rakukultuur (mis mõnevõrra vastandab ennast tüüpilisele pinnale kinnituvale ja seega kahemõõtmelisele rakukultuurile).

Suspensioonikultuur 
Suspensioonikultuuri puhul kasvavad rakud üle terve söötme ruumala, kinnitumata pindadele. Vältimaks rakkude väljasadenemist raskusjõu toimel ning tagamaks toitainete ja hapniku juurdepääsu võrdselt kõigile rakkudele, tuleb suspensioonikultuuris rakke pidevalt segada. Tehniliselt lahendatakse see kas spetsiaalsete magnetsegajate kasutamisega, kus rakkudega kolvi/pudeli sees pöörleb magnetsegajapulk, või nn orbitaalloksutite kasutamisega, kus liigub terve kolb/pudel koos selle sisuga. Suspensioonis kasvatatakse nt mitmeid vereloomega seotud rakke.

Kinnituv kultuur 

Kinnituva rakukultuuri puhul kasutatakse nõusid (nt Petri tassid või kindla mahuga horisontaalselt asetatavad kolvid), mille sisepind on kaetud spetsiaalse kihiga, kuhu rakud kinnituvad hästi. Rakkude kinnitumiseks sobivad enamasti hüdrofiilsed kihid, mida saavutatakse pinna töötlemisel polülüsiini, kollageeni või laminiiniga. Näiteks polülüsiin on rakusöötme pH juures positiivselt laetud ning rakud kinnituvad sellele põhiliselt tänu laeng-laeng vastastikmõjudele (kuna rakumembraani välisküljel paiknevad fosfolipiidide negatiivselt laetud rühmad). Mõned rakuliinid on võimelised kohanduma nii suspensioonikultuuris kui ka kinnituvas kultuuris kasvamisega.

3D-rakukultuur 
3D-rakukultuuri puhul püütakse kasvatada rakud ruumilise tihedama kogumina, mis peaks paremini jäljendama kehasisest olukorda (kuigi ka see mudel süsteem ei ole täiuslik: nt paiknevad organismis ühe koe rakkude lähinaabruses sageli ka teiste kudede rakud, on toimiv immuunsüsteem ja hormonaalne regulatsioon jms). 3D-rakukultuuris eristatakse omakorda ankurdatud, ankurdamata ning mikrovedelikundust (mikrofluiidikat) kasutavaid süsteeme. 

Ankurdatud süsteemide korral kasvatatakse rakud 3D-võrgustikku (st toestavat struktuuri) moodustavas materjalis, mis võib olla kas bioloogilise (nt alginaat, želatiin jt) või sünteetilise päritoluga (nt polüetüleenglükoolil põhinev hüdrogeel). Ankurdamata süsteemides toimub rakkude omavahelisel kleepumisel tekkinud klastrite (nn sferoidide) kasvatamine suhteliselt väikeses rakusöötme ruumalas. Tehniliste lahendustena kasutatakse näiteks hüdrofoobse pinnaga mikrotiiterplaate, millele rakud ei kinnitu, või rakkude kasvatamist rippuva tilga meetodil. Mikrovedelikundusega seotud lähenemiste puhul kasvatatakse rakud mikrokiibi süvendites, milleni viib kapillaaride võrgustik. Sel viisil püütakse jäljendada füsioloogilist vereringet ja veresoonte võrgustikku, mille kaudu nii toitained kui ka hapnik jõuavad elundite sisemusse (organismi kontekstis) või sferoidi sisemusse (kiibi kontekstis, sellest ka meetodi inglisekeelne nimetus organ-on-a-chip).

Rakkude kooskultiveerimine 
Mitmed hiljutised baasteaduslikud ja rakenduslikud uuringud rakukultuuris on näidanud ka rakkude kooskultiveerimise vajadust, mida on hakatud mõnedes teaduslaborites ka ellu viima. Näiteks on rõhutatud kooskultiveerimise relevantsust organismi immuunvastuse uuringute ja sünteetilise bioloogia tehnikate puhul. Tehniliselt teostatakse kooskultiveerimine kas rakkude n-ö kokkusegamisel ühes kasvatamisnõus või rakkudevahelise kontakti tagamisega söötme kaudu. Viimasel juhul kasutatakse kas spetsiaalseid nõusid, mille puhul on kaks kultiveeritavat rakutüüpi eraldatud membraaniga (see laseb läbi vaid teatud rakusöötmesse sekreteeritavaid komponente, kuid mitte rakke), või söötmete ülekandmist eraldatud kasvatamisanumate vahel. Kooskultiveerimine on kombineeritav muude rakukultuuris kasutatavate võtetega (nt vaata eespool alapealkiri 3D-rakukultuur).

Olulisimad toimingud rakukultuuris 
Rakukultuurile on omane rakkude (eriti rakuliinide) passeerimine ehk edasitõstmine, mille käigus hõrendatakse rakkude arv pindala- või ruumalaühiku kohta. Passeerimise tulemusena tekib ka genotüübi (kromosoomide komplekti) ja fenotüübi (välimuse ja funktsiooni) poolest ühtlasem ehk homogeensem rakkude kogum.

Teadusharidusega seotud platvormid ja ka mitmed firmad, mille toodete kataloogis on tooted rakukultuuri jaoks, pakuvad virtuaalseid koolitusi rakukultuuri rutiinsete toimingute treenimiseks online-režiimis.

Passeerimine 

Suspensioonikultuuri hõrendamiseks teostatakse olemasoleva suspensiooni lahjendus värskesse rakusöötmesse uues kolvis/pudelis. Kinnituva kultuuri puhul tuleb rakud võta pinna küljest lahti (polü-L-lüsiiniga kaetud pindade puhul kasutatakse selleks trüpsiini), lahjendada saadud suspensioon samuti värskesse söötmesse ning kanda rakud üle kasutamata nõusse, mille pinnale saavad rakud ajapikku taas kinnituda. 

Passeerimisel on kombeks üles märkida passaaži number (ehk mitmel korral on rakke hõrendatud) ja lahjendusfaktor (ehk passeeritava suspensiooni ruumala ja värske söötme ruumala suhe). Rakkude passeerimise sagedus oleneb rakkude jagunemise kiirusest: mida kiiremini rakud jagunevad, seda sagedamini tuleb neid passeerida. Lahjendusfaktori valikul tuleb silmas pidada, et rakkude liiga suure ruumilise tiheduse või pinnatiheduse puhul kuluvad toitained kiiresti ära ning rakkudel võib esineda ka nn kontaktinhibeerimist. Samas liiga suure lahjenduse korral rakkudevaheline "suhtlus" (nt kasvufaktorite ja muude signaalide vahetamine lähinaabritega) häirub, mis viib samuti rakkude kasvutempo aeglustumiseni.

Külmutamine 

Kui rakke ei soovita aktiivselt kultuuris hoida, kuid neid plaanitakse kasutada tulevikus, siis saab rakke külmutada spetsiaalses söötmes ning säilitada temperatuuridel –80 °C või alla selle (nt vedelas lämmastikus). Külmutussööde kaitseb rakke jääkristallide tekke eest, mis lõhuksid rakkude plasmamembraani ja sisemust mehaaniliselt ära. Enamasti koosneb külmutussööde rakkude kasvusöötmest, milles suurendatakse toitainete hulka (nt veise looteseerumi lisamise kaudu) ja millele lisatakse ruumala järgi 5–10% dimetüülsulfoksiidi (rakukultuuri puhtusega). Rakkude töötlemisel külmutussöötmega tuleb silmas pidada, et dimetüülsulfoksiid võib toatemperatuuril põhjustada rakumembraani komponentide lahustumist. Kirjanduses leidub vasturääkivat infot rakkude külmutamise mõjust rakkude passaažinumbrile, kuid igal juhul on soovitatav külmutada võimalikult madala passaažinumbriga rakke.

Rakkude tüübid päritolu ja modifitseerimise alusel 
Rakukultuuris võivad kasvada nii primaarsed rakud kui ka rakuliinid:
 Primaarsed rakud on rakud, mida ei ole varem kultuuris pikaaegselt hoitud, ehk mis on organismist saadud proovist suhteliselt värskelt eraldatud. Värskuse suhtelisus tähendab antud juhul seda, et koeproove võib enne primaarrakkude eraldamist säilitada üsna pikka aega (aastate skaalal) külmutatud kujul, sarnaselt eespool rakkude jaoks kirjeldatud protseduuriga.
 Rakuliinide rakud on algselt samuti pärit elusorganismidest saadud koeproovidest, kuid neid rakke on juba pikemalt kultiveeritud. Enamasti tähendab see, et rakud on ka lähtematerjaliga võrreldes geneetiliselt muundatud, kindlustamaks nende pidevat jagunemist. Inglise keeles kasutatakse selle protsessi kohta mõistet immortalization, mida võiks eesti keelde tõlkida kui „surematuse tagamine“ (immortaliseerimine).

Primaarsed rakud 
Inimese primaarrakkude allikaks on enamasti kas luuüdi proov või mõne operatsiooni (nt vähkkasvaja kirurgiline eemaldamine, aga ka laparoskoopia) või lahkamise käigus saadud koetükk. 

Luuüdi proovist eraldatakse huvipakkuvad rakud näiteks voolutsütomeetria abiga. Primaarrakkude saamiseks koetükist tuleb seda töödelda viisil, mis lagundab ekstratsellulaarse maatriksi tihedat võrgustikku. Selleks kasutatakse nii mehaanilist lagundamist (nt skalpelliga), ensümaatilist lagundamist (nt kollagenaasiga), keemilist töötlust (nt etüleendiamiintetraatsetaadiga) kui ka nende kombinatsioone. Kuna tahked koeproovid sisaldavad sageli mitmesuguseid rakutüüpe, tuleb rakkude kindla populatsiooni eraldamiseks rakendada sageli lisavõtteid, mis mõnevõrra sarnanevad afiinsuskromatograafiaga. Näiteks saab kasutada magnetosakesi, mille pinnale on kinnitatud selektiivsust sidumist tagavad molekulid (nt antikehad): need seostuvad vaid teatud rakkude pinnal esinevate retseptorite külge, võimaldades just selliste rakkude „väljapüüdmist“ proovist.

Primaarsete rakkude kultuuri puhul tuleb enamasti arvestada asjaoluga, et need rakud ei jagune piiramatult: juba mõne passaaži järel toimub rakkude kasvu ja jagunemise kiiruse järsk langus. Erandiks on mõned vähirakud, näiteks sellised, kus on ekspresseerunud ensüüm telomeraas. Telomeraas hoiab ära telomeeride lühenemise (see on vaikimisi rakkudesse programmeeritud mehhanism, mis on seotud normaalse vananemisega ja mida nimetatakse ka bioloogiliseks kellaks). Täiskasvanud organismi enamiku kudede terved rakud ei ekspresseeri telomeraasi, kuid seda leidub embrüonaalsetes tüvirakkudes ja ka mõningates vähirakkudes.

Primaarseid rakke peetakse füsioloogiliselt relevantsemaks mudelsüsteemiks kui rakuliine, sest primaarrakud säilitavad rohkem elusorganismis kasvavatele rakkudele omaseid jooni (näiteks östradiooli tootmise võime munasarja granuloosarakkude puhul või detsidualiseerumise võime endomeetriumist eraldatud stroomarakkude puhul). Samas tuleb primaarsete rakkudega töötamisel arvestada tulemuste suurema varieeruvusega, mis on tingitud rakkude doonorispetsiifilistest erinevustest.

Rakuliinid 
Immortaliseerimiseks viiakse rakkude genoomi püsivalt sisse (nn püsitransfektsiooni tehnikaga) kas telomeraasi katalüütilise alaühiku geen (hTERT) või Polyomaviridae perekonna viiruseliigi ahviviiruse 40 (SV40) T-antigeen. hTERT toimemehhanism on kirjeldatud eespool (vt alapealkiri Primaarsed rakud). SV40 T-antigeeni toimemehhanism on lõplikult ebaselge, kuid selles mängib rolli SV40 T-antigeeni seostumine kasvajate supressorvalkude p53 ja Rb külge, millega kaasneb rakkude programmeeritud surma ehk apoptoosi mahasurumine.

Suur osa kommertsiaalselt kättesaadavatest rakuliinidest ei pärine tervetest kudedest, vaid vähkkasvajatest. Sellest tingituna esineb nendel rakkudel sageli polüploidia, anomaalne kasvajate supressorvalkude ja onkogeensete valkude ekspressioonitase ja muud vähirakkudele omased tunnused. Seepärast ei sobi sellised rakuliinid üldjuhul terve koe rakkude mudeliks.

Vaatamata sellele, et rakuliinide hoidmisel kultuuris on neid teoreetiliselt võimalik passeerida piiramatu arv kordi, eelistatakse siiski töötada rakkudega, mille passaažinumber on võimalikult madal. Mõnikord kasutatakse piiranguna 20 passeerimist, kuigi selle piirangu jälgimine ei ole alati tehniliselt võimalik (eriti kommertsiaalselt kättesaadavate rakuliinide puhul). Näiteks vähirakkudele omane DNA parandusmehhanismide ja rakutsükli kontrollpunktide vigasus tingib rakkude genoomi ebapüsivust, mistõttu ühes laboris korduvalt passeeritud rakud võivad oluliselt erineda teise labori omadest või algsest rakuliinist. Samuti on näidatud, et sama rakuliini hilisem passaaž võib varasema passaažiga võrreldes omada teistsugust kasvutempot ning madalamat tundlikkust rakutsükliga seotud bioloogiliste sihtmärkide inhibiitorite suhtes.

Mitmetes teadusajakirjades on autoritele suunatud avaldamisnõuete seas mainitud vajadus käsikirjas kasutatud rakuliine autentida, näitamaks rakuliini päritolu kehtivust ja saastatuse puudumist. Enamasti pakuvad rakuliinide autentimist kommertsiaalse teenusena samad firmad, kust on võimalik rakuliine teadustöö tarbeks ka osta: näiteks American Type Culture Collection (ATCC), The Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) või European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC).

Ohutusnõuded 

Rakukultuuris on äärmiselt oluline pöörata tähelepanu ohutus- ja puhtusnõuete täitmisele, mis tagavad ühelt poolt eksperimentaatori ja teiselt poolt rakkude heaolu.

Eksperimentaatori ohutus 
Imetajate rakuliinid ja eriti primaarsed rakud võivad olla bioloogiliste ohtude allikaks, kuna nende kaudu võivad edasi kanduda inimest nakatavad viirused, mis pärinevad kas algsest organismist või on sisse viidud rakuliinide immortaliseerimise käigus. Näiteks inimese emakakaelavähi rakuliin HeLa sisaldab inimese papilloomiviirust 18 (HPV-18). Inimese embrüo neerudest saadud rakuliin HEK293 immortaliseeriti aga 1973. aastal, kasutades adenoviiruse Ad5 fragmenti; seepärast võib HEK293 rakkude transfekteerimisel adenoviirusel põhinevate vektoritega toimuda rekombinatsioon, mille tulemuseks on nakatamisvõimelise adenoviiruse teke.

Potentsiaalse bioloogilise ohuga seotud objekte tuleb Euroopa Liidus käsitleda vastavuses direktiivis 2000/54/EC mainitud bioohutusreeglitega. Seejuures eristatakse töötamisel bioohutuse erinevaid tasemeid (inglise keeles biosafety level ehk BSL), mis on seotud potentsiaalse haigustekitaja hinnangulise ohtlikkusega. Bioohutuse madalaim tase on 1 (BSL1: hästi iseloomustatud bioloogilised objektid, mis ei ole võimelised tekitama tervete täiskasvanute haigestumist) ning kõrgeim tase 4 (BSL4: bioloogilised objektid, mis levivad aerosoolina ja võivad põhjustada potentsiaalselt surmavat haigust, millele puudub teadaolevalt ravi või vaktsiin). Selleks, et teaduslabor kvalifitseeruks töötama teatud BSL tasemel, peab olema tagatud sobiv varustatus (sh ventilatsioonisüsteemid, eraldatus ehitise muudest ruumidest jms) ja töötajate väljaõpe. Tüüpiliste imetajate rakukultuuris kasvatatavate rakkudega töötamisel kehtivad enamasti BSL1 või BSL2 nõuded, kuid kui rakukultuuri kasutatakse ohtlikumate patogeenide uurimiseks, võib olla vajalik ka kõrgem BSL tase. Seejuures juba BSL2 rakuliinide ostmisel peab ostja enamasti tõendama labori vastavust BSL2 reeglitele ning kirjutama alla materjalide üleandmise lepingule (inglise keeles material transfer agreement ehk MTA), mis välistab soetatud materjali edasise levitamise kõrvalistele isikutele.

Puhtuse tagamine rakukultuuris 
Kuna toitaineterikas rakusööde on suurepärane kasvukeskkond ka bakteritele ja pärmseentele, tuleb loomsete rakkude kasvatamisel rangelt täita steriilse töö nõudeid:

 Rakuruumis tuleb kasutada laborikitlit, kaitsekindaid ja vahetusjalatseid. 
 Pinnad, millele asetatakse kinnised nõud rakkude või rakusöötmega, peavad olema puhastatud etanooli või muu sobiva desinfitseeriva vahendiga. 
 Rakkude, rakusöötme ja muude rakukultuuris kasutatavate lahustega anumaid tohib avada ainult töötava bioohutuskapis ehk laminaari all. Laminaari all töötades eeldatakse vaikimisi, et steriilne on ainult laminaari õhk, kuid mitte pinnad (millele võib sattuda lahuste pritsmeid, laborikitli niite, tolmu vms).
 Rakukultuuris kasutatavat ühekordset plastikut (nt plaadid, pipetiotsikud, tsentrifuugituubid), lahuseid (nt rakusöötmed, puhverlahused) ja korduvkasutatavaid laborivahendeid (nt automaatpipetid, statiivid) tuleb enne tööd kas autoklaavida või steriliseerida UV-kiirguse abil. Paljud firmad müüvad rakukultuuri jaoks tarvikuid ja reagente, mis on gamma- või röntgenikiirgusega eelnevalt steriliseeritud ja hermeetiliselt pakendatud. 
 Rakkude kasvatamiseks kasutatavaid inkubaatoreid tuleb regulaarselt puhastada tootja manuaalis kirjeldatud viisil ja vahetada välja vesi inkubaatori veevannis. Sageli lisatakse nii inkubaatori veevanni kui ka rakusöötmete soojendamiseks kasutatavasse veevanni spetsiaalseid lisandeid, mis pärsivad bakterite ja pärmseente kasvu; inkubaatori puhul tuleb jälgida, et lisand ei oleks aurustuv ega takistaks rakkude kasvu.
 Korduvkasutatavaid vahendeid (nt kolvid suspensioonikultuuri jaoks) tuleb pärast kasutamist puhastada pehme detergendiga ja seejärel rohke veega. Sageli kasutatakse enne detergendiga pesu ka desinfitseerivaid lahuseid, sh pleegiteid. 
 Nii vedelaid kui ka tahkeid jääke, mis rakukultuuris tekivad, kogutakse, desinfitseeritakse ja käsitletakse bioloogiliselt ohtliku prügina.

Vaatamata rangetele nõuetele võib bioloogiline saastatus ikkagi tekkida.

Bioloogiline saastatus 
Saastatuse likvideerimiseks rakukultuuris on olemas üldised protokollid, mis võivad varieeruda olenevalt bioohutustasemest ja konkreetse labori eripäradest. Enamasti tuleb likvideerida kõik saastunud rakud (harvem rakendatakse nt antibiootikumravi, sest see võib viia nn peidetud saastatuseni) ja rakud, mis on kasvanud nende vahetus läheduses (kui saastatuse märke pole esialgu näha, võib sellised rakud asetada mõneks ajaks ka nn karantiiniinkubaatorisse). Paljude inkubaatorite tootjad võimaldavad kasutada oma aparaatides ka kuumutustsüklit (inglise keeles decontamination cycle) või pikaaegset UV-töötlust. Olenevalt saastatuse mastaapidest ja esinemise sagedusest võib tekkida vajadus ka põhjalikuma puhastusprotseduuri järele, mis hõlmab näiteks ruumide osoneerimist.

Tugev saastatus enamiku bakterite või pärmseentega on tuvastatav visuaalse vaatluse teel: rakusööde muutub häguseks, söötmes sisalduva indikaatori värvus muutub kollakaks, rakkude elumus väheneb järsult. Mõned saastatuse liigid võivad aga püsida rakukultuuris pikka aega märkamatult, eriti rakuliinide kasvatamisel. Tuntud probleemiks on näiteks mõni mükoplasma liik; värsket statistikat on teaduskirjanduses raske leida, kuid üle 10 aasta vanuste uuringute tulemused on näidatud, et tol ajal oli maailma teaduslaborites mõne mükoplasma liigiga saastunud kuni 35% (kohati ka kuni 80%) kasutatavatest rakuliinidest. Mükoplasma ei põhjusta drastilist elumuse muutust imetajarakkude populatsioonis, kuid mõjutab oluliselt saastunud rakkude ainevahetust, plasmamembraani läbitavust, tundlikkust tsütotoksilistele ühenditele jms. Seepärast soovitatakse regulaarselt kontrollida, ega rakukultuuris esine mükoplasmaga saastatust. Seda kontrolli võib tehniliselt teostada nii selektiivsete (nt PCR-test) kui ka üldisemate meetodite abil (nt fikseeritud rakkudes DAPI värvingu lokalisatsiooni jälgimine).

Muud saastatuse liigid ja riskid 
Lisaks saastatusele bakterite või pärmseentega on üheks ohuks rakukultuuris mitmete rakuliinide kasvatamisel ristsaastatuse (inglise keeles cross-contamination) teke, kus toimub ühe rakuliini soovimatu ülekanne teise rakuliini kasvukeskkonda. Näiteks on raporteeritud juhtumeid mitmete rakuliinide saastumisest kiirekasvuliste HeLa rakkudega, mis on rakukultuuris hoidmise käigus ajapikku asendanud algset rakuliini. Ristsaastatuse tuvastamiseks on kindlaim viis viia läbi kasutatava rakuliini autentimine (vt eespool alapealkiri Rakuliinid).

Eraldi saastatuse liigina käsitletakse rakukultuuris ka saastatust endotoksiinidega: need on bakteriaalse päritoluga lipopolüsahhariidid, mis on vastupidavad kõrge temperatuuri suhtes. Rakkude tundlikkus endotoksiinide suhtes on väga varieeruv, kuid on näidatud, et endotoksiinid võivad mõjutada rakkude elumust ja jagunemist, samuti rakumembraanide omadusi jpm. Endotoksiinid võivad kanduda edasi nii vedelike kui ka pindade kaudu, seepärast on rakukultuuris oluline kasutada lahuseid ja vahendeid, mille puhul on tootja garanteerinud endotoksiinidega saastatuse puudumist.

Lisaks bioloogilisele saastatusele eristatakse rakukultuuris ka teisi saastatuse liike: nt vee saastatus raskmetallide või orgaaniliste kemikaalidega, puhverdamiseks kasutatava CO2 saastatus teiste gaasidega jms.

Rakukultuuriga seotud eetilised aspektid 
Põhilisi eetilisi probleeme ja kitsaskohti, mis seostuvad rakukultuuris kasutatavate objektidega, võib liigitada vastavalt rakkude päritolule: kas tegemist on embrüost eraldatud rakkudega, täiskasvanud inimese organismist pärit rakkudega või muude loomade organismist pärit rakkudega.

Embrüonaalsete tüvirakkudega seotud eetikaküsimused 
Embrüote tüvirakud on erilised, sest nendest tekivad edasise diferentseerumise käigus kõigi teiste kudede rakud. Seega on embrüonaalsed tüvirakud unikaalseks mudelsüsteemiks, mis võimaldab uurida organismi arengut ja luua uusi lahendusi regeneratiivse meditsiini jaoks. Neid tüvirakke eraldatakse blastotsüsti staadiumis (5–7 päeva vanustest) embrüotest, mida saadakse kehavälise viljastamise teel. Eetika-alased diskussioonid embrüote tüvirakkude kohta taanduvad suuresti sellele, kas blastotsüsti võib/tuleb käsitleda sündimata lapsena või mitte.

Euroopa Liidus on ametlikud regulatsioonid tüvirakkudega seotud teadustöö kohta riigiti erinevad. Eestis allub embrüonaalsete tüvirakkudega seotud uurimistöö kunstliku viljastamise ja embrüokaitse seadusele, mille kohaselt võib teadustööks kasutada embrüot, mida ei ole kunstliku viljastamise edukuse nimel või lapse ja ema tervise huvides naisele üle kantud, ning samuti embrüot, mis on osutunud liigseks seaduses defineeritud kriteeriumite alusel. Embrüo kasutamiseks teaduslikuks uurimistööks peab olema isikute nõusolek, kellelt sugurakud pärinevad.

Lahendusena embrüonaalsete tüvirakkudega seotud probleemidele on pakutud välja indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude (iPSC-d) kasutamist teadustöös. iPSC-d saadakse täiskasvanud doonorite mitmetest kehakudedest (nt nahk või veri) eraldatud rakkude geneetilisel muundamisel, mis võimaldab vältida embrüote ex utero hävitamisega seotud eetikaprobleeme. Samas on näidatud, et iPSC-d on geneetiliselt oluliselt erinevad, võrreldes embrüonaalsete tüvirakkudega, mistõttu ei pruugi viimased olla iPSC-dega täielikult asendatavad.

Täiskasvanud inimorganismist pärineva bioloogilise materjaliga seotud eetikaküsimused 
Täiskasvanud doonorite primaarrakkude, aga ka rakuliinide lähtematerjali kogumine on kaasajal reguleeritud eetikanormidega, mis on muutunud rahvusvaheliseks standardiks. Täpsemalt tuleb proovide kogumisel, töötlemisel ja säilitamisel lähtuda inimestel tehtavate meditsiiniuuringute eetilistest põhimõtetest, mida sõnastati Maailma Arstide Liidu (WMA) Helsingi deklaratsioonis 1964. aastal. Näiteks:

 Enne doonorite kaasamist teadusuuringusse peab olema sõnastatud uuringu detailne protokoll, mis kirjeldab muuhulgas tehtava uuringu põhimõtteid, teaduslikku taustinfot, rahastust, kogutud andmete töötlemise põhimõtteid ja tagasiside andmist doonoritele. Protokolli peab olema kinnitanud eetikakomitee (nt Eestis võib valida Tartu Ülikooli inimuuringute eetika komitee ja Tervise Arengu Instituudi inimuuringute eetikakomitee vahel).
 Peab olema tagatud uuringutes osalevate isikute privaatsus ja nendega seotud uuringu jaoks kogutud info konfidentsiaalsus. Isikuandmete säilitamise ja anonümiseerimise aspekt on äärmiselt oluline ka biopankade loomisel.
 Doonorlus peab olema vabatahtlik ja iga doonor peab kinnitama oma informeeritud nõusolekut uuringus osalemise kohta. Kui doonor ei ole võimeline informeeritud nõusolekut andma, peavad seda tegema tema seaduslikud esindajad; sellisel juhul peab doonori seisund olema uuringus osalemise kindlaks kriteeriumiks.

Juba arendatud rakuliinide ostmiseks ametlikest allikatest ja nende kasutamiseks oma teadustöös ei pea ostja taotlema eetikakomitee luba.

Rahvusvahelise avalikkuse teadlikkus rakukultuuriga seotud eetikaküsimuste suhtes on oluliselt tõusnud pärast tõsielusündmustel põhineva raamatu "The Immortal Life of Henrietta Lacks" (autor: Rebecca Skloot) ilmumist 2010. aastal. Henrietta Lacksi 1951. aasta vähibiopsiast eraldatud rakkude alusel loodi teadaolevalt esimene rakuliin HeLa, mis on edaspidi leidnud intensiivset rakendust teaduslaborites üle maailma. Samas ei küsitud Henrietta Lacksi käest nõusolekut tema bioloogilise materjali kasutamiseks teadustöös ning rakuliini loomisest ei teavitatud ka doonori seaduslikke järglasi (kuni infolekkeni 1970. aastatel, mil selgus doonori nimi). 2021. aasta 4. oktoobril, täpselt 70 aastat pärast Henrietta Lacksi surma, esitasid doonori järeltulijad kohtuhagi firma Thermo Fisher Scientific vastu, kes on teeninud kasumit HeLa rakuliini müügist.

Loomse päritoluga bioloogilise materjaliga seotud eetikaküsimused 
Koeproovide võtmine katseloomadest, mis on vajalik primaarsete rakkude eraldamiseks ja rakuliinide arendamiseks, allub loomkatsete jaoks kehtestatud eetikastandarditele. Kehtiv Euroopa Liidu direktiiv 2010/63/EL sätestab järgnevat:

 Elusloomade kasutamine katsetes on soovitav asendada muude meetoditega. Euroopa Liidu komisjon ja liikmesriigid peaksid aitama teadusuuringute ja muude vahenditega kaasa alternatiivsete meetodite väljatöötamisele ja valideerimisele.
 Kui katseloomade kasutamine on vältimatu, siis teadustöös peaks kasutama meetodit, mis võimaldab saavutada kõige rahuldavamaid tulemusi ja põhjustab tõenäoliselt kõige vähem valu, kannatusi ja stressi. 
 Väljavalitud meetodid peaksid kasutama minimaalset arvu katseloomi, mis on vajalik usaldusväärsete tulemuste saamiseks, ja peaksid nõudma selliste loomaliikide kasutamist, kelle võime tunda valu, kannatusi ja stressi on madalaim ning kellele põhjustatavad püsivad kahjustused on kõige väiksemad.
 Väljavalitud meetodid peaksid võimaluse korral vältima lõpp-punktina surma.

Sarnaselt inimuuringutega tuleb ka loomkatseteks taotleda luba.

Kui loom hukatakse muudel põhjustel (nt tegemist on põllumajandusloomaga) ja koeproovid teadusuuringu jaoks saadakse hukatud loomalt, siis ei ole Eesti loomakaitseseaduse kohaselt tegemist katseloomaga. Katseloom on „lubatud teaduslikul või hariduslikul eesmärgil läbiviidavas loomkatses kasutatav, loomkatses kasutamiseks või kudede ja elundite saamiseks kasvatatud". Seega ei vaja Eesti seaduste järgi eetikaluba selline teadusuuring, kus kasutatakse muul põhjusel hukatud looma bioloogilist materjali. Enamasti saadakse see materjal tapamajast; inglisekeelses teaduskirjanduses kasutatakse sellisel juhul väljendit slaughterhouse/abattoir-collected tissues. Riigiti on aga vastavad seadused erinevad. Näiteks USAs ja Austraalias ei ole muul põhjusel hukatud loomade bioloogilise materjali kasutamiseks teadustöös eetikaluba samuti vaja, samas Lõuna-Aafrika Vabariigi seaduste kohaselt tuleb eetikaluba siiski taotleda. USAs on küll laialdaselt arutletud teadlaste ja tapamajade koostöö eetilisuse üle, eriti juhul, kui tegemist on mahukate teadusuuringutega.

Rakukultuuris võivad loomse päritoluga olla mitte ainult kasvatatavad rakud, vaid ka rakusöötme lisandid. Väga levinud on näiteks veise looteseerumi ehk FBS kasutamine (vt ka eespool alapealkiri Toitained), mis sisaldab mitmeid toitvaid ja rakkude kasvu soodustavaid komponente (sh albumiin, kasvufaktorid, alipoproteiinid). FBS on lihatööstuse kõrvalprodukt – seda toodetakse, kasutades tapamajja viidud tiinetest lehmadest pärit looteid. Lehma emakast eraldatud loote südamesse sisestatakse nõel, mis on ühendatud koagulanti sisaldava kogumisanumaga; kuna loode ei ole seejuures anesteesiat saanud, võib see protseduur põhjustada suuri kannatusi enne loote paratamatut surma. FBS tootmisega seotud eetilised probleemid ning ka FBS eri partiide kvaliteedi ja koostise varieeruvus, mis põhjustab varieeruvust ka katsetes FBS juuresolekul kasvatatud rakkudega, on põhjuseks, miks on mitmetes teaduslaborites võetud suund nn seerumivabade söötmete kasutamisele. FBS asendusena on pakutud ka kindla kvantitatiivse koostisega asenduslisandeid nagu UltroSer G.

Rakukultuuriga seotud märksõnade kasutamise statistika teaduskirjanduses 
Teema kokkuvõtteks on allpool esitatud statistikat teaduskirjanduse andmebaasi PubMed põhjal, näitamaks rakukultuuriga seotud märksõnade kasutamise sagedust teadusartiklites eri aastatel. Keskendutud on just antud Vikipeedia artiklis esinevatele terminitele. PubMed on USA Rahvusliku Terviseinstituudi (National Institutes of Health, NIH) hallatud avalik andmebaas, mis refereerib eelistatult meditsiini-, bioloogia- ja biokeemiauuringutega seotud teadusajakirju. 2022. aasta seisuga sisaldab PubMed üle 34 miljoni viite teadusartiklitele, mis on ilmunud alates aastast 1946 (mõningad viited pärinevad ka varasemast ajast, kuid ajakirju pole enne 1946. aastat süstemaatiliselt refereeritud).

Terminite otsing sai tehtud 5.–6. novembril 2022. Statistika on esitatud jooniste vormis ning väljavõte samast statistikast on esitatud ka tabeli vormis, et illustreerida paremini vanemate teadusartiklite panust (- tähistab, et vastava märksõnaga pole aasta jooksul kunagi nii palju artikleid avaldatud). Võrdluseks on tabelisse lisatud andmed ka märksõnade kohta, kus termin culture (kultuur) pole otsingusse lisatud (näitamaks, et see mõnevõrra muudab otsingut). 2022. aasta puhul esinev süstemaatiline langustrend on seotud asjaoluga, et otsing teostati enne aasta lõppu, seega ei kajastu selle aasta statistikas kõik relevantsed teadustööd (mis võivad olla teadusajakirja avaldamiseks vastu võetud, kuid pole veel ilmunud).

Viited 

Rakubioloogia