Design of Novel DMBT1-derived CPP-siRNA Nanocomplexes and Two-step purification of the Human Recombinant Protein DMBT1

Field: Biochemistry, Genetics and Molecular Biology (Life Sciences)

RNA interferens (RNAi) er en biologisk proces, der gennem tilførslen af korte interfererende RNA strenge (short interfering RNAs; siRNA), hæmmer ekspressionen af et givent protein ved at binde til mRNA-strengen og forårsage dens nedbrydning. Selektiviteten og potensen af mekanismen gør RNAi til et kraftfuldt værktøj med stor potentiale som lægemiddel mod så forskellige gen-relaterede sygdomme som kræft, virusinfektioner og genetiske sygdomme. siRNA molekyler er udsat for enzymatisk nedbrydning og da de samtidig har en lav optagelsesgrad i celler, er det svært at få siRNA bragt ind i målcellerne. Der er derfor behov for et transportmolekyle, der kan forbedre stabiliteten af siRNAet, og øge det cellulære optag. Blandt de senest foreslåede vektorer til levering af siRNA er især cellepenetrerende peptider lovende kandidater, og testes for tiden for i kliniske forsøg for deres evne til at levere konventionelle samt nukleinsyre baserede lægemidler.
Det humane protein DMBT1 er et mønstergenkendelsesmolekyle. Det er involveret i det primære immune respons, hvor det genkender og aggregerer bakterier. Under studier af interaktionsmekanismen mellem proteinet og bakterier, blev syntetiske DMBT1-deriverede peptider vist at interagere med polyanioner og nukleinsyrer. På grund af tilstedeværelsen af arginin rester, blev det antaget at DMBT1 peptider potentielt var cellepenetrerende, og velegnet til kompleksdannelse med siRNA molekyler.
Det første mål med dette projekt var at undersøge muligheden for at bruge syntetiske DMBT1- deriverede peptider til design af peptid-siRNA leverings systemer.
Det første manuskript (Manuscript II), havde til formål at udforme DMBT1-deriverede peptidsiRNA nanokomplekser fra de mindste, funktionelle DMBT1 sekvenser. Da disse er deriveret fra et humant protein er de potentielt mere biokompatible end designede cellepenetrerende peptid-siRNA komplekser. De to bedste DMBT1 peptid kandidater blev udvalgt baseret på evnen til siRNA indkapsling evalueret ved Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) og ved analyse af UV spektra. Baseret på gel-skift morfologi og Dextran Sulfate Sodium Competition Assay postulerer vi at indkapslingen af siRNA foregår ved selv-og ko-konstruerende elektrostatiske mekanismer. Stabiliteten af komplekserne blev evalueret i mindst to timer i tilstedeværelse af enten FBS eller RNAse A, og beskyttelsen af siRNA molekylerne blev fundet til at være peptidafhængigt. Karakterisering af nanopartiklerne ved ζ-potentiale, circular dichroism, dynamic light scattering og transmission electron microscopy afslørede negativt ladede nanopartikler med en gennemsnitlig diameter på 10 til 800 nm afhængigt af forholdene, og en sfærisk eller ris-formet morfologi afhængigt af peptidet og β-helix konformationen. FITC-DMBT1 peptider og FITC-DMBT1-peptidCy3-siRNA komplekser blev administreret til MCF7 celler hvor koncentrationen af Cy3siRNA blev holdt konstant, og koncentrationen af FITC-peptider steg. Dette resulterede i en dosisafhængig FITC-DMBT1-peptid internalisering og FITC-DMBT1-peptid afhængig Cy3-siRNA internalisering, betydende at cellernes siRNA optag steg ved tilstedeværelse af DMBT1 peptider. Konfokal mikroskopi af MCF7 celler transficeret med FITC-DMBT1-peptider and FITC-DMBT1- peptid-Cy3-siRNA komplekser bekræftede internaliseringen af peptider og peptid-siRNA komplekser i cellerne. MCF7 celler der stabilt udtrykte genet for det fluorescerende protein tdTomato blev transficeret med DMBT1 peptider i kompleks med siRNA der targeterer tdTomato genet udviste en gen silencing med omkring 50% knockdown efter 96 timer, ved fravær af FBS.
Manuskript III sigtede mod at forbedre de begrænsninger som blev åbenbaret ved administrationen af de undersøgte DMBT1-deriverede peptidkomplekser, herunder især stabiliteten i FBS, for at forbedre den biologiske effekt efter administration til celler.
Nye DMBT1-deriverede peptidsekvenser blev designet in silico med potentielt forbedret optag i celler og evne til indkapsling af siRNA. Der blev brugt en systematisk tilgang hvor kandidater blev kanaliseret igennem en række undersøgelser med formål at finde de bedst egnede. Med DMBT1- deriverede peptid sekvenser som udgangsmateriale blev softwaren CELLPDD blev brugt til at forudsige nye cellepenetrerende peptider in silico. Denne tilgang kombinerede to forudsigelsesmetoder; support vector machine (SVM), og motif baseret metode. Gennem ”CPP design cycle” blev der opnået en cyklisk generering af de bedste kandidater. Denne tilgang tillod generering af nye kandidater, hvoraf de syv kandidater der var forudset til at have de bedste cellepenetrerende egenskaber blev udvalgt. Disse blev analyseret in vitro, med henblik på evne til siRNA indkapsling og stabilitet af peptid-siRNA komplekserne i FBS. Denne procedure førte til identifikation af fire nye lovende DMBT1 deriverede peptider, der aktuelt undersøges nærmere for at teste forudsigelsen om forbedret cellulært optag, ved at teste knockdown effektiviteten i cellekultur.
Den anden del af afhandlingen (manuskript IV) fokuserede på produktion og oprensning af 6kb varianten af det rekombinante DMBT1 protein (rDMBT1 6kb). Proteinet rDMBT1 6kb kan produceres in vitro ved at generere rekombinante humane celler der stabilt overudtrykker rDMBT1 6kb. Der er tidligere etableret to protokoller til oprensning af proteinet fra enten spyt eller cellekulturmedium: den ene er en to- eller tre-trins FPLC, og den anden er en mulitstep affinitets oprensning med bakterie. Den sidste bliver nogen gange efterfulgt af en size-exclusion chromatography (SEC). I dette arbejde gik vi ud fra en antagelse om at proteinet secerneres fra cellen om en oligomer, der samles til større aggregater, og at en en-trins FPLC-SEC oprensning var tilstrækkeligt til separation af disse aggregater. rDMBT1 6kb varianten blev produceret ved brug af rekombinante A549 celler der stabil overudtrykker proteinet. Efterfølgende blev rDMBT1 6kb isoleret fra mediummet, til hvilket det var secerneret. Dernæst blev den nye et-trins FPLC-SEC oprensningsprotokol sammenlignet med den mest brugte bakterie-affinitets protokol baseret på udbytte, renhed og kvalitet af det oprensede rDMBT1 6kb. Den korte FPLC-SEC protokol førte til sammenligneligt udbytte og renhed sammenlignet med den lange bakterie-baserede protokol. Derudover observerede vi en reduceret affinitet til S. mutans efter den bakterielle oprensning, sammenlignet med det FPLC-SEC-oprensede protein. Disse data indikerer at FPLC-SEC metoden ikke blot er mere praktisk og med tilsvarende udbytte, men også sikrer en bedre integritet af proteinet.