Structural and functional diversity of bacillus thuringiensis toxins on animal, plant and microbial cells

Field: Agricultural and Biological Sciences (Life Sciences)

Debido a los efectos nocivos de los insecticidas químicos en los ecosistemas y sobre los organismos beneficiosos, la implementación de agentes de control biológico ha recibido considerable atención. Entre los agentes de control biológico, se ha dedicado gran interés a los entomopatógenos, debido a su potencial para controlar plagas agrícolas y domésticas, vectores de enfermedades humanas y animales, sin introducir material no degradable en el medio ambiente. Bacillus thuringiensis (Bt) es el agente de control microbiano comercial más utilizado en la actualidad, con efectividad contra diferentes especies de insectos plaga. Las cepas de Bt producen cristales paraesporales proteináceos durante la fase de esporulación del crecimiento bacteriano llamados proteínas δ-endotoxina o Cry (de cristal). Además, esta bacteria, durante la fase de crecimiento vegetativo, produce otro tipo de proteínas insecticidas, como son las Cry1I, Vip y Sip. Las proteínas Cry1I no forman parte del cristal Bt, pero también se denominan "Cry" porque comparten una estructura de 3 dominios con la mayoría de las proteínas cristalinas. Las proteínas insecticidas Cry de Bt son altamente selectivas, no tóxicas para los vertebrados y rápidamente degradables. Debido a estas características, Bt ha ganado una gran importancia en el control de plagas de insectos agrícolas y muchos estudios se han centrado, en el pasado y presente, en el aislamiento y la caracterización de nuevas cepas que puedan conducir a encontrar nuevas toxinas con un espectro de actividad más amplio y mayor toxicidad insecticida.\nObjectivos\nLa importancia de Bt en el control biologico de plagas, hizo que esta tesis tuviese los siguientes objetivos:\n-\t- Caracterización de nuevos aislados de Bt iraníes\n-\t- Expresión, aislamiento y purificación de nuevas proteínas insecticidas (Cry1Ia)\n-\t- Evaluación de la actividad insecticida y citotóxica de las toxinas Cry1Ia\n-\t- Estudio de la oligomerización en el modo de acción de las proteínas Cry1Ia\n-\t- Evaluación de la actividad antimicrobiana de las cepas Bt.\n-\tDeterminación de los efectos bioquímicos de las cepas de Bt en células vegetales\n\nDe acuerdo con estos objetivos, la tesis se ha dividido en seis partes principales que corresponden a cada uno de ellos. \nMateriales y Métodos\nLos materiales y métodos generales utilizados en este trabajo se describen a continuación. Las metodologías específicas utilizadas para alcanzar cada uno de los seis objetivos principales de esta tesis, se describirán posteriormente, bajo el título de cada uno de ellos.\n-\tCepas bacterianas\nEn este estudio se utilizaron un total de 130 cepas de Bt iraníes, del stock de Bt del Biological Control Laboratory (Universidad de Teherán). Además, las cepas B. thuringiensis HD1 (HD1S2005, proporcionada por Valent Bioscience, Inc., Libertyville, IL, EE. UU.) y B. thuringiensis subesp thuringiensis HD2 (Berliner, obtenida del Bacillus Genetic Stock Centre, BGSC, Universidad Estatal de Ohio, Ohio, EE. UU.), se usaron como cepas de referencia. Las cepas DHα5 y BL21 (DE3) de Escherichia coli se emplearon para la clonación de genes y la expresión de proteínas.\n-\tCría de insectos\nPara realizar los experimentos de toxicidad (bioensayos) y los ensayos de formación de oligómeros, se utilizaron ocho especies de lepidópteros plaga y una de coleópteros. Las especies de insectos lepidópteros utilizados en los bioensayos fueron Spodoptera exigua, S. littoralis, Mamestra brassicae y Helicoverpa armígera, que pertenecen a la familia Noctuidae, y Grapholita molesa, Plodia interpunctella y Ostrinia nubilalis, que pertenecen a las familias Tortricidae, Pyralidae y Crambidae, respectivamente. Lobesia botrana (Tortricidae), O. nubilalis y el coleóptero Leptinotarsa decemlineata (familia Chrysomelidae), se usaron para la preparación de vesículas de membrana de borde en cepillo (BBMV) y la realización de los ensayos de formación de oligómeros. Todas las colonias de insectos se criaron en dieta artificial y se mantuvieron a 25 ± 1 °C, humedad relativa (HR) de 70 ± 5% y con fotoperiodo de 16:8 horas de luz/oscuridad (L/O).\n-\tLíneas celulares de insecto\nSe utilizaron cuatro líneas celulares: BTI-Tn-5B1-4 (Hi5) de células de ovario de Trichoplusia ni, RP-HzGUTAW1 (HzGUT) de células de intestino de Helicoverpa zea , UCR-SE de S. exigua y Sf21 (de células de ovario de S. frugiperda). Las líneas celulares se cultivaron en medios de cultivo celular apropiados y se mantuvieron en las condiciones recomendadas por los proveedores.\n-\tPreparación de vesículas de membrana de borde en cepillo (BBMV) \nLas vesículas de membrana de borde en cepillo (BBMV) se realizaron a partir de intestinos de larvas de último estadio de O. nubilalis y L. decemlineata, o de larvas enteras de L. botrana, mediante el método de precipitación diferencial con magnesio (Wolfersberger et al., 1987), modificado por Escriche et al., (1995). Las BBMV se cuantificaron mediante Bradford y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.\n-\tProducción, solubilización y activación de protoxinas\nLas cepas de B. thuringiensis se crecieron en medio CCY y se incubaron 2 días a 29°C. La producción y la solubilización de las proteínas cristalinas de Bt se realizó según lo descrito por Estela. et al., (2004). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford (Bradford, 1976). La activación de la protoxina se llevó a cabo añadiendo 10% de tripsina e incubando la muestra 2 horas a 37 ° C. Las proteínas solubilizadas y activadas se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) siguendo Laemmli 1970.\n-\tExpresión, purificación y activación de proteínas Cry clonadas\nLa proteína Cry1Ab se obtuvo de una cepa recombinante de E. coli GG094-208 (Dr. R. A. de Maagd, Universidad de Wageningen, Países Bajos). La proteína Cry1Ia7 (Martínez et al., 2004), fue cedida por el Dr. Primitivo Caballero (Universidad Pública de Navarra, Pamplona, España). Las proteínas Cry1Ia38, Cry1Ia38-I116V y Cry1Ia7 se expresaron en las células recombinantes de E. coli, BL21 (DE3) en esta tesis.\nLa expresión, purificación, solubilización y activación de Cry1Ab, se realizó siguiendo Sayyed et al. (2005). La purificación de la toxina activada se realizó por cromatografía de intercambio aniónico con una columna MonoQ 5/5 usando el Äkta 100 Explorer (GE Healthcare, Reino Unido). Las fracciones eluidas se analizaron individualmente mediante SDS-PAGE.\nLa expresión de las proteínas Cry1Ia38, Cry1Ia38-I116V y Cry1Ia7 en células BL21 (DE3) de E. coli, su purificación por cromatografía de afinidad usando columnas HisTrapTM FF crude (GE Healthcare Bio-Sciences, Upsala, Suecia), diálisis y activación con tripsina, se realizaron según Khorramnejad et al. (2018).\nLas concentraciones de Cry1Ab, Cry1Ia38, Cry1Ia38-I116V y Cry1Ia7, se estimaron por densitometría mediante el programa TotalLab Quant, version 12.3, usando BSA (albúmina de suero bovino) como estándar.\n\nMetodología específica por objetivos\nPrimera parte: Caracterización de cepas Iraníes de B. thuringiensis \nAislamiento de las cepas de Bt\nSe usó el método de selección con acetato para aislar, inicialmente, cepas Bt de diferentes muestras. El acetato de sodio inhibe selectivamente la germinación de esporas de Bt. Las esporas germinadas y otras bacterias no esporulantes, se eliminaron por tratamiento térmico (7 min a 80 ºC). Posteriormente las muestras se plaquearon en agar nutritivo y se dejaron crecer o/n a 29 °C. Las colonias obtenidas se examinaron mediante tinción de Gram y se observó la presencia de cristales paraesporales mediante microscopía de contraste de fases. Los aislados de Bt se clasificaron como tales tras observar su capacidad de producir cristales paraesporales.\nBioensayos\nLa selección preliminar de las cepas de Bt, se realizó observando su toxicidad contra larvas de segundo estadio de P. interpunctella. Los bioensayos se realizaron con una concentración única discriminante de 108 células/ml (superior a la CL50 calculada) mediante el método de incorporación en dieta. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando 20 larvas, con tres repeticiones. Como control negativo se usó agua. La mortalidad se registró tras 72 horas de tratamiento. Como resultado, se seleccionaron siete cepas de Bt y se bioensayaron contra larvas neonatas de S. exigua, G. molesta, O. nubilalis y M. brassicae por el método de contaminación de la dieta en superficie (Hernández-Martínez et al., 2008). Los bioensayos se realizaron con protoxinas y toxinas activadas, y se repitieron tres veces, con 48 larvas por réplica. El tampón de solubilización y HD1 se usaron como control negativo y cepa de referencia, respectivamente. Los bioensayos se realizaron a 25 ± 1°C, 60 ± 5% HR y 16:8 L/O. La mortalidad se registró a los 7 días.\n-\tEnsayos de viabilidad celular\nLa viabilidad celular se registró usando CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent (Promega Co., Madison, WI, EE. UU.), basado en la detección de la reducción de sal de tetrazolio (MTT- 3- (4,5-Dimetil-2-tiazolil) 2,5-difenil-2H). Los ensayos se realizaron utilizando cuatro líneas celulares de los lepidópteros T. ni (Hi5), H. zea (HzGUT), S. exigua (UCR-SE) y S. frugiperda (Sf21). La actividad citotóxica fue investigada mediante observación microscópica, ensayo de dosis única y ensayo de dosis-respuesta. Para determinar dicha actividad, se realizó un ensayo de dosis única con las proteínas de los cristales de las cepas Bt seleccionadas solubilizadas y activadas, frente a cada una de las cuatro líneas celulares. Posteriormente, se realizaron ensayos de dosis-respuesta para las cepas más tóxicas contra las líneas celulares de insectos más susceptibles. Para los ensayos de dosis única, se usaron 10 μg de proteína solubilizada o 7 μg de toxina activada. Para el ensayo de dosis-respuesta, las células se trataron con diferentes concentraciones de toxina (0,64, 3,2, 16, 80 y 400 μg/ml). Los cambios mo