Phosphoinositides in blood platelet : mapping of molecular species and evidence for a new localization and role of PI3P

Field: Biochemistry, Genetics and Molecular Biology (Life Sciences)

Les phosphoinositides (PIs) sont des phospholipides membranaires qui jouent un rôle crucial dans le contrôle de \n \nl'organisation spatio-temporelle de nombreuses voies de signalisation intracellulaire, du réarrangement du cytosquelette \n \nd'actine et du trafic de vésicules. Dans la plaquette, le métabolisme des PIs est particulièrement actif et génère, par le \n \njeu de kinases, phosphatases et phospholipases spécifiques, des seconds messagers indispensables à l'activation \n \nplaquettaire, notamment le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). \n \nLa première partie de la thèse concerne l'étude des différentes espèces moléculaires (composition en acides gras) des 4 \n \ngrandes classes de PIs (PI, PIP, PIP2 et PIP3) dans les plaquettes humaines et de souris au repos ou lors de leur \n \nactivation. Cette analyse, jamais réalisée précédemment, a été possible grâce à une technique de spectrométrie de masse \n \n(LC-MS), basée sur la méthylation avec le TMS-diazomethane des groupements phosphates des PIs. Cette étude montre une \n \naugmentation rapide et transitoire de 2 espèces moléculaires majoritaires de PIP3 lors d'une stimulation plaquettaire avec \n \nune réactivité différente des plaquettes humaines et de souris en réponse aux agonistes plaquettaires (thrombine et CRP). En \n \nutilisant des modèles murins présentant une inactivation des PI3-kinases (PI3K) dans la lignée mégacaryocytaire et des \n \ninhibiteurs spécifiques de PI3K, j'ai montré que l'isoforme PI3Kß (p110ß) de classe I est très majoritairement responsable \n \nde la production des diverses espèces moléculaires de PI(3,4,5)P3 en réponse à la thrombine ou au CRP alors que la PI3Ka \n \n(p110a) est faiblement impliquée. Les résultats montrent également une grande variété d'espèces moléculaires de PI et \n \nseulement 2 espèces moléculaires prédominantes pour les PIP, PIP2 et PIP3, aussi bien chez l'homme que chez la souris malgré \n \ndes régimes alimentaires très différents. Nous montrons des différences importantes dans le métabolisme des espèces \n \nmoléculaires de PI, PIP et PIP2 dans les plaquettes humaines et de souris lors de la stimulation. Dans cette étude, nous \n \navons identifié pour la première fois des espèces moléculaires minoritaire de PIP2 mais qui augmentent de façon importante \n \nlors de la stimulation plaquettaire. Ce travail permet de dresser la première cartographie des différentes espèces \n \nmoléculaires de PIs présents dans les plaquettes humaines et de souris et les modifications induites par leur activation. \nLa deuxième partie de la thèse montre pour la première fois une localisation atypique du phosphatidylinositol 3- \n \nmonophosphate (PI3P), dans le feuillet externe de la membrane plasmique plaquettaire. Je démontre que ce lipide minoritaire \n \n(environ 10% de PIP), connu pour être intracellulaire et impliqué dans le trafic vésiculaire, est également présent à la \n \nsurface des plaquettes au repos. Aucun autre PI n'a pu être détecté dans le feuillet externe de la membrane plasmique \n \nplaquettaire. Ce résultat a été obtenu en utilisant différentes sondes fluorescentes se liant spécifiquement au PI3P et \n \nleurs contrôles mutées. Nous montrons que le traitement des plaquettes avec des enzymes métabolisant spécifiquement le PI3P \n \n(MTM1 et ABH) réduit significativement ce pool de PI3P. Les plaquettes de souris déficientes en PI3K de classe II et III \n \nprésentent une diminution du PI3P de surface. De manière intéressante, ce pool externe de PI3P permet l'endocytose des \n \nprotéines circulantes liant le PI3P, in vitro, ex vivo et in vivo. Les sondes PI3P spécifiques internalisées dans la \n \nplaquette sont stockées dans les granules a puis sécrétées lors de l'activation plaquettaire. Cette étude montre que le PI3P se comporte comme un récepteur permettant l'endocytose de protéines plasmatiques spécifiques.