Photoinactivation of bioluminescent bacteria by porphyrinic compounds

Field: Pharmacology, Toxicology and Pharmaceutics (Life Sciences)

A terapia fotodinâmica antimicrobiana representa uma alternativa promissora para inactivar eficientemente microrganismos patogénicos como bactérias, vírus, fungos e protozoários. Esta terapia baseia-se na utilização de um fotossensibilizador, que quando é activado por luz, gera espécies citotóxicas que destroem as células-alvo. A inactivação fotodinâmica das células microbianas pode ocorrer através de dois mecanismos oxidativos: a via do tipo I que envolve reacções de transferência de electrões/átomos de hidrogénio do fotossensibilizador com produção de radicais iónicos e a via do tipo II que envolve a transferência de energia do fotossensibilizador para oxigénio molecular com a subsequente formação de oxigénio singuleto. Tendo em conta os mecanismos de inactivação envolvidos no processo fotodinâmico das células microbianas alvo, o aparecimento de estratégias de resistência à terapia fotodinâmica e a recuperação da viabilidade microbiana parecem ser improváveis. O objectivo deste trabalho foi investigar o(s) mecanismo(s) envolvido(s) na inactivação fotodinâmica da bactéria recombinante bioluminescente Escherichia coli, utilizando três porfirinas catiónicas meso-substituídas como fotossensibilizadores. Foi também avaliada a possibilidade de recuperação da viabilidade bacteriana após fotoinactivação e a probabilidade de desenvolvimento de resistência bacteriana à terapia fotodinâmica antimicrobiana, utilizando duas bactérias Gram-negativas: Vibrio fischeri e E. coli bioluminescente. Para investigar o(s) mecanismo(s) de fotoinactivação dos três fotossensibilizadores, foram usados vários inibidores de oxigénio singuleto e de radicais livres. Suspensões de E. coli a 107 UFC mL-1 foram distribuídas em copos esterilizados e adicionadas de porfirina à concentração final de 5.0 μM para os derivados porfirínicos Tetra-Py+-Me e Tri-SPy+-Me-PF e 0.5 μM para a porfirina Tri-Py+-Me-PF. Para testar o mecanismo do tipo I foram usados como inibidores de radicais livres L-cisteína e D-manitol (100 mM). Para testar o mecanismo do tipo II foi usada a azida sódica (100 mM) como inibidor do oxigénio singuleto. As amostras foram expostas durante 270 minutos à luz branca (4 mW cm-2). A recuperação bacteriana foi testada através de um ensaio de fotoinactivação de 270 minutos a luz branca (4 mW cm-2) expondo as as suspensões bacterianas de V. fischeri e E. coli a 5.0 μM do derivado porfirínico Tri-Py+-Me-PF e mantendo as amostras no escuro durante uma semana de incubação após o tratamento. Para avaliar o possível desenvolvimento de resistência pelas células bacterianas à terapia fotodinâmica, suspensões bacterianas de V. fischeri e de E. coli foram expostas a luz branca (4 mW cm-2) durante 25 minutos com 5.0 μM de porfirina Tri-Py+-Me-PF. Colónias isoladas de células sobreviventes após o primeiro tratamento foram novamente expostas à luz visível usando o mesmo protocolo de irradiação. Este procedimento foi repetido dez vezes para cada estirpe. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as reacções mediadas pelo oxigénio singuleto (mecanismo do tipo II) têm um papel predominante sobre o mecanismo do tipo I no processo de fotoinactivção da bactéria bioluminescente E. coli pelos derivados Tri-Py+-Me-PF, Tetra-Py+-Me e Tri-SPy+-Me-PF. As bactérias inactivadas através da terapia fotodinâmica não recuperaram a sua actividade após uma semana de incubação no escuro. As estirpes V. fischeri e E. coli não desenvolveram resistência a esta terapia ao fim de dez gerações. Apesar do uso de inibidores representar um método simples e eficiente para determinar qual(is) a(s) via(s) implicada(s) no processo de inactivação fotodinâmica, a escolha dos inibidores deve ter em conta a estrutura química do fotossensibilizador. A ausência de desenvolvimento de resistência bacteriana e a não recuperação da viabilidade bacteriana após uma semana de incubação indica que a terapia fotodinâmica antimicrobiana representa um método adequado para inactivar bactérias de forma eficaz usando Tri-Py+-Me-PF.