Experimental analysis of biaxial mechanical tension in cell monolayers and cultured three dimensional tissues : the CellDrum technology Die biomechanische Integrität und Leistungsfähigkeit von Gewebe und Organen beeinflusst die Gesundheit des Menschen in extremer Weise. Weitverbreitete Erkrankungen wie Hernienbildung (Eingeweidebruch) und Beckenbodendefekte (jährlich alleine zehn Million Patientinnen in den USA) stehen mit einer verminderten biomechanischen Gewebefunktionalität in einem klaren Zusammenhang. Diese exemplarisch genannten Erkrankungen aber auch Dysfunktionen des Herz Kreislaufsystems sind auf biomechanische Veränderungen auf zellulärer Ebene zurückzuführen. Grundlagenforschung hierzu am Menschen ist aus ethischen und praktischen Gründen insbesondere bei der Erprobung aktiver Substanzen problematisch. In der Literatur werden zur Evaluierung biologischer Materialeigenschaften in vitro Testsysteme vorgeschlagen welche relativ unkritisch aus Methoden der konventionellen Materialprüfung abgeleitet worden sind. Dies betrifft insbesondere einachsiale Zugversuche. Die meisten Spannungssituationen in biologischen Systemen sind aber dreiachsial oder zweiachsial. Der einachsiale Spannungszustand tritt allenfalls in dünnen Sehnenstrukturen auf. In dieser Arbeit wurde ein Messprinzip entwickelt welches es erlaubt Zellmonolayer und dünne Gewebeschichten unter biaxialer Belastung zu züchten und mechanisch zu analysieren. Ein grundlegender Bestandteil des Messverfahrens ist das CellDrum genannte Zellkultivierungsmodul. Die entwickelte CellDrum besteht aus einem biokompatiblen Polycarbonatzylinder welcher mit einer ebenfalls biokompatiblen dünnen (< 1 mikron) und extrem flexiblen Siliconmembran einseitig verschlossen ist. Die Silikonmembran kann einerseits mit Zellmonolayern besiedelt werden oder dient als Halte und Unterstützungschicht bei der Kultivierung von auf Zell Kollagengel basierenden Gewebeäquivalenten. Die CellDrum Technologie ist universell verwendbar für beinahe jede Art der Materialprüfung dünner Schichten. Untersuchungen können prinzipiell dynamisch und quasistatisch durchgeführt werden. Im dynamischen Ansatz wird die Resonanzfrequenz und somit die Eigenspannung des Gewebeverbundes analysiert welcher durch einen Druckimpuls zum Schwingen angeregt wird. Der quasistatische Ansatz ermöglicht die Untersuchung des Spannungs Dehnungsverhaltens der Testmaterialien (in dieser Arbeit: Zellmonolayer und Gewebeäquivalente). Den verschiedenen Fragestellungen und Testsituationen angepasst wurden Technologien entwickelt die von der Herstellung flexibler biokompatibler Membranen mit Dicken im Mikrometerbereich über Hard und Softwarelösungen bis hin zur biomechanischen Problemanalyse zur Ableitung geeigneter biomechanischer Parameter reichten. Es war diese extreme Interdisziplinarität zwischen Zell und Molekularbiologie Polymerchemie Mechanik und anderen Ingenieurwissenschaften die gleichermaßen gut beherrscht werden mussten was die Herausforderung dieser Arbeit darstellte. Zellbasierte Systeme reagieren hinsichtlich Orientierung Morphologie Stoffwechsel sowie Protein und Genexpression auf Veränderungen ihrer mechanischen Umgebung. Diese Problematik wurde bei der CellDrumkonzeption bedacht experimentell evaluiert sowie technisch und theoretisch realisiert. Neben den zuvor genannten Problemlösungen mussten Tests zur Eignung verschiedener Adhäsionsproteine durchgeführt werden. Ungeeignete Proteine zeigten im statischen Spannungszustand biokompatibles Verhalten; bei dynamischer Belastung initiierten dieselben Proteine ein Zellsterben. Ein anderes nicht kleines Problem war die Verankerung des Randes der künstlichen Gewebeschicht an der Peripherie. Das Zusammenspiel zwischen Gewebespannung Zellproliferation und Zellkonzentration wurde in der Vergangenheit mit verschiedenen Verfahren experimentell analysiert. Die Neuheit des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens besteht darin die Zellverbände über lange Zeiten (Wochen) statisch oder dynamisch unter genau definierten mechanischen Randbedingungen kultivieren zu können und gleichzeitig die Möglichkeit zu haben den mechanischen Spannungszustand des gezüchteten Konstruktes zu beliebigen Zeiten zu messen. Es wurde hier der Zusammenhang zwischen Gewebespannung und Zellproliferation für mit Fibroblasten besiedelte Gewebeäquivalente exemplarisch dargestellt. Die gewonnenen Erkenntnisse insbesondere Plateaueffekte bei der Gewebespannungsgeneration lassen aufschlussreiche Rückschlüsse auf die Spannungshomeostase im Gewebe zu. Die Stimulierung von Gewebeäquivalenten durch Wirkstoffe und die Variation von Prozessparameteren während der Zellkultivierung bestimmen Eigenspannung und E Modul des Messobjektes mit. Durch die Anpassung bestehender Verfahren der Mikrosystemtechnik konnte ein Verfahren in die biologische Materialprüfung transferiert werden. Dieses quasistatische Verfahren ermöglicht die Messung von Gewebeeigenspannung und E Modul in nur einem Messdurchlauf.Die Zellaktivität (Morphologie Metabolik Protein und Genexpression) wird durch ihr mechanisches Umfeld determiniert. Viele in der Literatur beschriebene Messverfahren induzieren ein inhomogenes Spannungsfeld mit van Mieses Vergleichsspannungen die im selben Gewebekonstrukt um mehr als 75% variieren. Die kreisrunde Geometrie der CellDrum erlaubt ein weitestgehend homogenes Spannungsfeld. Zur Untersuchung von autolog und synchron schlagenden Kardiomyozyten (Herzmuskelzellen) wurden geeignete Zellkulturtechniken entwickelt um diese als Monolayer oder Gewebeäquivalente mit der CellDrum Technik untersuchen zu können. Es wurde eine Methode entwickelt um primäre Kardiomyozyten aus zehn Tage alten Embryos angebrüteter Hühnereier zu gewinnen. Die Methode wurde später mit einem Partner auf neonatale Rattenmyocyten transferiert. Zur Entwicklung Optimierung und Standardisierung zellbiologischer Messprotokolle ist insbesondere die Möglichkeit einer optischen Überwachung während der Kultivierungsphase von großer Bedeutung. Die Möglichkeit der kontinuierlichen mikroskopischen Evaluierung bei gleichzeitig minimaler Störung der Messumgebung ist einmalig und in der beschriebenen Apparatur gewährleistet. In allen Anwendungen ist für die Interpretation von Meßdaten auch die Zelldichte ein entscheidender Parameter. In Verbindung mit einem invertierten konfokalen Lasermikroskop können Zelldichte und Orientierung während der Kultivierungsperiode ermittelt werden. Neben der weitgehend unbefriedigenden biomechanischen Situation früherer Methoden war oft auch die Versuchsdurchführung kritisch kompliziert und fehlerbehaftet. Zum Sekundärscreening potentieller therapeutischer Wirksubstanzen müssen zehntausende Substanzen funktionell getestet werden. Das CellDrum Verfahren liefert als bisher einzige Technik die Grundlage für ein automatisierbares Hochdurchsatz Screening Konzept. Dies wurde an Fibroblasten Kollagen Verbunden exemplarisch gezeigt.