Evaluation of fertilization capacity of cryopreserved stallion sperm directly after thawing and after cooled storage In the modern equine breeding industry use of cryopreserved semen is increasing. In comparison to using fresh or cooled semen however costs are higher and pregnancy rates lower. This is associated with the fact that using cryopreserved sperm requires special equipment for transport storage and handling. Furthermore sperm viability is reduced after cryopreservation and cryopreserved semen therefore needs to be used for insemination close to ovulation. The aim of the studies described in this thesis was to investigate if cryopreserved semen maintains its fertilizing ability after thawing and cooled overnight transport (i.e. 24 h storage at 4°C). Furthermore it was tested if performing insemination at a defined time point after hCG application was as effective as performing insemination close to ovulation (with inspection every 6 h). These simplifications would reduce costs and make cryopreserved insemination doses available to more practitioners and breeders. This study was divided in three parts. (1) First viability of cryopreserved stallion sperm was determined in vitro; directly after thawing after dilution with different extenders as well as an additional 24 h cooled storage. For cooled storage to mimic transport conditions thawed cryopreserved semen was diluted transferred to a syringe and placed in a polystyrene transport box with a cool pack for maintenance at 4°C. Sperm plasma and acrosomal membrane integrity was determined using flow cytometric analysis. Motility characteristics were evaluated using computer assisted sperm analysis (CASA). Only small differences were found between percentages of membrane intact sperm directly after thawing and after an additional 24 h cooled storage irrespective of the extender used for dilution. Furthermore percentages of progressively motile sperm were only 3−8% decreased after 1 d cooled storage. (2) Then for testing fertilizing potential of cryopreserved sperm in vitro a heterologous oocyte binding assay was used. Therefore cryopreserved stallion sperm was co incubated with porcine oocytes in capacitation as well as control medium after which nuclei were stained and the number of sperm per oocyte zona was counted. Sperm oocyte binding was determined to be higher in capacitation than in control medium and if using diluted versus cryopreserved sperm. Furthermore the number of sperm bound per oocyte was not negatively affected if cryopreserved sperm was subjected to dilution and 1 d cooled storage after thawing suggesting that fertilizing capacity was maintained. (3) Finally an insemination trial was performed to determine mare pregnancy rates using cryopreserved stallion sperm directly after thawing as well as after 24−36 h cooled storage after thawing. In addition different insemination regimes were tested including insemination after a defined duration after hCG administration as well as maximally 6 h after ovulation (i.e. determined according to ultrasound ovulation controls). The insemination trial revealed that pregnancy rates achieved with using cryopreserved sperm after thawing and 1 d cooled storage (13 25 52%) were not significantly different from when using freshly thawed sperm (7 10 70%) nor were pregnancy rates negatively affected if insemination was planned according to the moment of hCG application instead of ovulation controls. Taken together viability and fertilizing capacity of cryopreserved stallion semen is not negatively affected if stored at 4°C for up to 24−36 h after thawing. Moreover if used for artificial insemination mare pregnancy rates are similar as those obtained with using freshly thawed sperm. Der Einsatz von Tiefgefriersamen in der modernen Pferdezucht nimmt zu ist jedoch im Vergleich zu Frisch und Kühlsamen mit höheren Kosten und geringeren Trächtigkeitsraten verbunden. Ursachen dafür sind dass für die Verwendung von Tiefgefriersamen eine spezielle Ausrüstung für Transport Lagerung und Besamung benötigt wird und eine Besamung nah am Zeitpunkt der Ovulation erfolgen muss. Das Ziel der in dieser Arbeit beschriebenen Studien war herauszufinden ob Tiefgefriersamen seine Fertilisationsfähigkeit nach Auftauen und gekühltem Transport über Nacht (also 24 Stunden Lagerung bei 4°C) erhält. Außerdem wurde getestet ob eine Besamung zu definierten Zeitpunkten nach hCG Applikation genauso effektiv ist wie eine Besamung nah am Zeitpunkt der Ovulation (nach Ultraschallkontrolle alle 6 Stunden). Dieses Vorgehen würde Kosten reduzieren und Tiefgefriersamen einer breiteren Masse an Züchtern und Praktikern zugänglich machen. Diese Studie besteht aus drei Teilen: (1) als erstes wurde die Viabilität von Tiefgefriersamen in vitro bestimmt; direkt nach dem Auftauen nach Verdünnung mit verschiedenen Verdünnern und nach einer 24 stündigen Lagerung bei 4°C. Der Samen wurde nach Auftauen und Verdünnung in einer Spritze in einer Polystyrol Kühlbox bei 4°C wie Kühlsamen gelagert. Die Plasma und Akrosommembranintegrität wurde durch flowzytometrische Messungen bestimmt die Motilität und Bewegungsmuster der Spermien mittels Computer assistierter Spermienanalyse (CASA). Es wurden nur geringe Unterschiede membranintakter Spermien zwischen direkt nach dem Auftauen und nach 24 Stunden gekühlter Lagerung gefunden unabhängig vom verwendeten Verdünner. Außerdem waren die Anteile progressiv motiler Spermien nur 3 8% niedriger nach 24 Stunden gekühlter Lagerung. (2) Zur Bestimmung der Fertilisationsfähigkeit kryokonservierter Spermien in vitro wurden heterologe Oozyten Bindungsassays durchgeführt. Kryokonservierte equine Spermien wurden mit porcinen Oozyten in Kapazitations und Kontrollmedium koinkubiert anschließend wurden die Zellkerne angefärbt und die Anzahl der gebundenen Spermen pro Oozyte bestimmt. Die Spermien Oozyten Bindung ist höher in Kapazitäts als in Kontrollmedium und höher bei Verwendung verdünnter versus kryokonservierter Spermien. Außerdem wird die Anzahl gebundener Spermien nicht negativ beeinflusst durch die Verdünnung und gekühlte Lagerung von kryokonservierten Spermien nach dem Auftauen für 24h was darauf schließen lässt dass die Fertilisationsfähigkeit erhalten bleibt. (3) Schließlich wurde ein Besamungsversuch durchgeführt zur Bestimmung der Trächtigkeitsraten von Stuten unter Verwendung kryokonservierter Spermien direkt nach dem Auftauen sowie nach 24 36 Stunden gekühlter Lagerung nach dem Auftauen. Es wurden verschiedene Besamungsregimes verglichen einschließlich Besamung nach einer definierten Zeit nach hCG Applikation sowie maximal 6 Stunden nach Ovulation welche per Ultraschallkontrolle bestimmt wurde. Der Besamungsversuch zeigte dass Trächtigkeitsraten weder bei Nutzung von kryokonservierten Spermien nach Auftauen und 24 Stunden Lagerung (12 22 59%) signifikant niedriger sind als bei Nutzung von frisch aufgetautem Sperma (7 10 70%) noch bei Planung von Besamungen anhand des Zeitpunkts der Applikation von hCG anstatt per Ovulationskontrolle. Zusammengefasst ist die Viabilität und Fertilisationskapazität von kryokonservierten Spermien nicht negativ beeinflusst nach Lagerung für 24 36 Stunden bei 4°C nach dem Auftauen. Bei Verwendung dieser Spermien für die Besamung sind die Trächtigkeitsraten von Stuten ähnlich wie bei Verwendung von frisch aufgetautem Samen.