Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Varianten des respiratorischen Komplex I Zusammenfassung: Reactive oxygen species (ROS) are suspected to be involved in the development of neurodegenerative diseases such as Parkinsons disease and Alzheimers disease. In addition ROS is ascribed an important role in the aging process. The NADH:ubiquinone oxidoreductase also called respiratory complex I is the most important source of ROS in the mitochondrion. The enzyme complex couples the electron transfer from NADH to ubiquinone with the translocation of protons across the membrane. Because of its simpler structure of the bacterial complex I is considered as a model system for the eukaryotic complex. The Escherichia coli complex I consists of 13 subunits which are named NuoA to NuoN. The enzyme carries nine iron sulfur (Fe S) clusters and one flavin mononucleotide (FMN) as cofactors. In this work specific questions concerning the mechanism of complex I were clarified by characterization of site directed mutants. Effects of mutations on the enzymatic activity were tested using the E. coli complex I. The structural changes of the mutations were if possible characterized by a soluble subcomplex consisting of subunits NuoE and F of the Aquifex aeolicus complex I. By mutagenesis of Glu183(NuoF) and characterization of variants this amino acid has been identified as a key position for the substrate discrimination of NADH and NADPH by complex I. The increased ROS production of the variants during NADH consumption could be explained by the structure of the A. aeolicus NuoEF variant E185D(NuoF) with bound NAD+. The mutation Tyr204Cys(NuoF) was detected in a patient suffering from Leigh like syndrome. The cause of this disease has been studied by mutagenesis of E. coli complex I. The characterized variants showed up to 80% reduction in catalytic efficiency and 13 fold increase in ROS production. In a cooperation project with the group of Dr. Judy Hirst (MRC Cambridge ) the midpoint potential of the Fe S cluster N1a was lowered up to 100 mV by site directed mutagenesis. N1a of the produced E. coli complex I variant could not be reduced by NADH. This led to an increased H2O2 production by 60 % and shows the functional significance of this cluster as a protection against increased ROS production. The structures of NuoEF with bound substrate and product show a conformational change of the peptide bond of Glu95(NuoF). This reorientation seems to be a kind of product ejection mechanism . By mutagenesis this peptide bond was fixed in the conformati ... Zusammenfassung: Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species; ROS) stehen im Verdacht an der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen wie Morbus Parkinson und Morbus Alzheimer beteiligt zu sein. Zusätzlich wird ROS eine wesentliche Rolle beim Alterungsprozess zugeschrieben. Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase auch respiratorischer Komplex I genannt gilt als die bedeutendste Quelle von ROS im Mitochondrium. Der Enzymkomplex koppelt den Elektronentransfer von NADH auf Ubichinon mit der Translokation von Protonen über die Membran. Aufgrund seines einfacheren Aufbaus wird der bakterielle Komplex I als Modellsystem für den eukaryotischen Komplex angesehen. Der Escherichia coli Komplex I besteht aus 13 Untereinheiten die mit NuoA bis NuoN bezeichnet werden und trägt neun Eisen Schwefel (Fe S) Zentren sowie ein Flavinmononukleotid (FMN) als Kofaktoren. In dieser Arbeit wurden spezifische Fragen zum Mechanismus des Komplex I durch Charakterisierung ortsgerichteter Mutanten geklärt. Auswirkungen der Mutationen auf die enzymatische Aktivität wurden mit dem E. coli Komplex I untersucht. Die strukturellen Änderungen der Mutationen wurden falls möglich mit dem löslichen Subkomplex aus den Untereinheiten NuoE und F des Aquifex aeolicus Komplex I charakterisiert. Durch Mutagenese des Glu183(NuoF) und durch Charakterisierung der Varianten konnte diese Position als Schlüsselposition für die Substratunterscheidung von NADH und NADPH durch Komplex I identifiziert werden. Die erhöhte ROS Produktion der Varianten bei der Umsetzung von NADH konnte durch die Struktur der A. aeolicus Variante E185D(NuoF) mit gebundenem Produkt erklärt werden. Die Mutation Tyr204Cys(NuoF) wurde bei einem am Leigh like Syndrom erkrankten Patienten nachgewiesen. Die Ursache dieser Erkrankung wurde mit durch die Mutagenese des E. coli Komplex I untersucht. Die charakterisierten Varianten zeigten eine bis zu 80% verringerte katalytische Effizienz und 13 fach erhöhte ROS Produktion. In einem Kooperations Projekt mit der Gruppe von Dr. Judy Hirst (MRC Cambridge) wurde das Mittenpunktspotential des Fe S Zentrums N1a durch ortsgerichtete Mutagenese um bis zu 100 mV abgesenkt. Das Zentrum konnte in der dargestellten Variante nicht mit NADH reduziert werden was eine um 60% erhöhte H2O2 Produktion zur Folge hatte und funktionelle Bedeutung dieses Zentrums als Schutz vor einer erhöhten ROS Produktion zeigt. Die Strukturen des NuoEF mit gebundenem Produkt un ...