Binuclear CuA formation and the influence of calcium ions on metal cluster maturation in recombinant nitrous oxide reductase from Shewanella denitrificans Zusammenfassung: Distickstoffmonooxid hat schädliche Auswirkungen auf unser globales Klima und dessen Konzentration in der Atmosphäre steigt stetig. Verschiedene NOx Verbindungen die aus Distickstoffmonooxid entstehen führen zum Abbau der Ozonschicht.Das Enzym Distickstoffmonooxid Reduktase (N2OR) welches in denitrifizierenden Bakterien entdeckt wurde besitzt die Fähigkeit unter anaeroben Bedingungen Distickstoffmonooxidzu molekularem Stickstoff zu reduzieren. Distickstoffmonooxid Reduktase ist ein 130 kDa großes kupferhaltiges Homodimer dass ein katalytisch aktives tetranukleares CuZ Zentrum und einen gemischt valenten zweikernigen CuA Cluster für Elektronentransfer enthält. In den letzten Jahren wurden Strukturen von verschiedenen N2OR die aus verschiedenen Bakterien isoliert wurden veröffentlicht.In dieser Arbeit wurde erstmals die Kristallstruktur von Dinitrogenmonooxide Reduktase aus Shewanella denitrificans die heterolog in E. coli exprimiert wurde gelöst. Die apo Form der N2OR besitzt eine Dimerstruktur die im Allgemeinen identisch zu den bekannten N2OR Strukturen ist aber flexible Abschnitte nahe des CuA Zentrums zeigt. Die strukturelle Flexibilität erlaubt den Einbau von Kupferionen in die Koordinationszentren des dimeren Proteins. Calciumionen spielen eine entscheidende Rolle in der Stabilisierung des CuA Zentrums und in der Assemblierung der Metallcluster. Wir konnten zeigen dass bei hohen Ca2+ Konzentrationen der Zugang für Kupferionen geschlossen ist und die Bindung von Ca2+ zur Stabilisierung der CuA Koordinationsstelle führt. Unter physiologischen Bedingungen haben Calciumionen einen positiven Einfluss auf die CuA Assemblierung.Der Prozess der CuA Assemblierung von SdN2OR wurde mit Hilfe von Stopped flow Spektroskopie durch Zugabe von Kupferionen zum Wildtyp Protein und mehreren Varianten untersucht. Anhand der durchgeführten Experimente kann ein Assemblierungsmechanismus mit einem einkernigen Typ 2 Kupfer Intermediat postuliert werden. Die Untersuchung von N2OR Varianten bei denen Cystein und Histidin Liganden mutiert wurden führt zu der Vermutung dass das T2 Kupferzentrum durch die Reste Cys613 und His617 komplexiert wird. Durch die Mutation von beiden Cysteinresten im Aktivzentrum wurde nur eine sehr geringen Bildung des T2 Kupferzentrums beobachtet und eine verminderte Reduktionsgeschwindigkeit des Intermediates festgestellt was vermuten lässt dass Elektronen auch durch intermolekulare ... Zusammenfassung: Nitrous oxide has a deleterious effect on our global climate and its level in the atmosphere is on a steady rise. In the stratosphere various NOx compounds generated from nitrous oxide lead to ozone depletion. The enzyme nitrous oxide reductase (N2OR) found in denitrifying bacteria uniquely reduces nitrous oxide to dinitrogen but depends on anoxic conditions. Nitrous oxide reductase is a 130 kDa homodimeric multicopper enzyme that contains the catalytically active tetranuclear CuZ site and the mixed valent dinuclear CuA center for electron transfer. In recent years structures of nitrous oxide reductases from a variety of different bacteria were published.In this thesis the first crystal structure of Shewanella denitrificans nitrous oxide reductase heterologously expressed in E.coli was solved. The apo form of N2OR shows a dimeric structure that is almost identical to native N2OR structures but shows flexible regions near the CuA binding site. The structural flexibility enables the copper incorporation into the cluster binding sites of the dimeric protein. Calcium ions play a crucial role in the stabilization of the CuA cluster and the CuA assembly process. We have shown that calcium ions can close the entry point for copper ions at high calcium concentration whereby the CuA binding site gets stabilized. Under physiological conditions calcium ions have a positive effect on CuA assembly.The process of CuA assembly on SdN2OR was investigated by Stopped flow spectroscopy by addition of copper ions to the wild type protein and several variants. These experiments allow the postulation of a assembly mechanism with one intermediate species namely a type 2 copper site. By studying N2OR variants where the Cys and His ligands are mutated we propose a complexation of the T2 copper site by the residues Cys613 and His617. The mutation of both active site cysteine residues results also in very low accumulation of the T2 copper site and its reduction which suggests that electrons can be provided as well by intermolecular disulfide bond formation.The crystal structure of Pseudomonas stutzeri N2OR form I shows a flip of CuA coordinating residue His583 towards the protein surface during the turnover of N2O. We were able to mimic this open state by substitution of this histidine residue and reconstitution of the CuA site in vitro which is the basis for further investigations