Engineering of phosphoserine aminotransferase and new metabolic pathways for microbial production of 1 3 propanediol and 1 2 4 butanetriol from sugar 1 3 Propandiol (1 3 PDO) ist eine wichtige chemische Substanz die vielfältige Anwendung im Bereich der Polymere Kosmetika und Pharmazie findet. Die maßgeblichen Entwicklungen des Metabolic Engineering in den letzten 30 Jahren ermöglichen die Entwicklung effizienter Stämme für die Produktion von 1 3 PDO aus verschiedenen Ausgangsstoffen. Ein Meilenstein in der mikrobiellen Produktion von 1 3 PDO ist der Prozess von DuPont & Tate and Lyle der ausgehend von Zuckern über Gylcerol verläuft. Um die Verwendung des teuren B12 Vitamins im Zucker Glycerol PDO Prozess zu vermeiden wurde von Chen et al. (2015) ein komplett neuer Stoffwechselweg entwickelt in dem die PDO Generierung über L Homoserin erfolgt. In diesem Stoffwechselweg wird 1 3 PDO mittels dreier heterologer enzymatischer Reaktionen aus L Homoserin gewonnen. Der Engpass dieses Stoffwechselweges ist die erste Deaminierung von L Homoserin zu 4 Hydroxy 2 oxobutansäure (HOBA). In dieser Arbeit wurde eine Phosphoserineaminotransferase (SerC) aus E. coli untersucht und so modifiziert dass die notwendige Deaminierung von L Homoserin erzielt wird. Um die Substratspezifität von SerC von L Phosphoserin zu L Homoserin zu ändern wurde eine rationale computergestützte Methode angewandt. Die entscheidenden Reste von SerC die verantwortlich sind für die Substratspezifität wurden identifiziert indem die freie Bindungsenergie über Moleküldynamiksimulationen bestimmt wurde. Anschließend wurde eine ortsgerichtete Mutagenese in silico durchgeführt. Nach insgesamt drei Screeningdurchgängen wurden die vielversprechendsten Kandidaten ausgewählt und experimentell verifiziert. Die spezifische Aktivität bezüglich L Homoserin der am besten geeigneten Mutante SerC(R42W R77W) wurde um das 4 2 fache verbessert im Vergleich zum Wildtyp wobei die spezifische Aktivität von L Phosphoserin um das 43 fache gesenkt wurde. Jedoch ist die Verbesserung von SerC noch nicht zufriedenstellend. Durch die Limitationen des rationalen Design Konzepts war es notwendig auch andere Mutation und Screening Methoden zu entwickeln um bessere SerC Mutanten zu erzeugen. Neben der ortsgerichteten Mutagenese wurden auch die zufällige Mutagenese und die semi rationale Design Methode angewandt um eine größere und diversere Mutantenbibliothek zu generieren. Im Anschluss wurden drei verschiedene Strategien benutzt um die Mutantenbibliothek zu screenen: a) Konstruktion und Anwendung eines glutamatabhängigen auxotrophen Stammes b) GDH gekoppelte photometrische Detektion c) Mercaptopyruvatsulfurtransferase (MPST) gekoppeltes kolorimetrisches Screening Schlussendlich wurde eine verbesserte SerC Mutante identifiziert (R42W R77W R329P). Diese Mutante zeigte im Vergleich zum Wildtyp eine 5 5 fach erhöhte Aktivität bezüglich L Homoserin und keine Aktivität gegenüber L Phosphoserin. Die KM Konstante von SerC (R42W R77W R329P) wurde um das 68 fache gesenkt im Vergleich zum Wildtyp bei einer Substratzugabe von 3 mM L Homoserin. Um die Leistung der verbesserten SerC Mutante zu untersuchen wurde der komplette Stoffwechselweg von L Homoserin zu 1 3 PDO konstruiert indem SerC mit einer Pyruvatdecarboxylase (PDC) und Alkoholdehydrogenase (YqhD) kombiniert und in E. coli eingebracht wurde. Die Bereitstellung von L Homoserin als Substrat wurde dadurch verbessert dass ein homoserinproduzierender Stamm konstruiert wurde indem eine Aspartatkinase III (LysC) und eine Homoserindehydrogenase (MetL) mit einem medium copy Plasmid überexprimiert wurden. Zusätzlich wurden die codierenden Gene ldhA für die Lactatdehydrogenase und adhE für die Aldehyd Alkoholdehydrogenase aus dem Genom von E. coli entfernt um die NADH Bereitstellung zu fördern und die Bildung von Nebenprodukten unter sauerstofflimitierten Bedingungen zu senken. Schlussendlich wurde der gentechnisch veränderte rekombinante E. coli Organismus in Schüttelkolben und fed batch Kultivierungen auf 1 3 PDO Produktion untersucht. Der mutante Stamm von E. coli (S147) erzielte eine 1 3 PDO Konzentration von 3 03 g L nach 62 h Kultivierung. Dies ist 13mal höher als die Endkonzentration des Wildtypstammes (S144 0 24 g L). Aufgrund der stark gesteigerten Leistung der gentechnisch veränderten SerC Mutante für die 1 3 PDO Produktion wurde ein neuer Stoffwechselweg für die biosynthetische Erzeugung von 1 2 4 Butantriol (BT) ausgehend von L Homoserin konstruiert. BT ist am bekanntesten als Ausgangsstoff für die Herstellung von 1 2 4 Butantrioltrinitrat (BTTN) was als Treibstoff und Weichmacher verwendet wird. Der neue Stoffwechselweg umfasst fünf konsekutive enzymatische Reaktionen die von vier heterologen Enzymen katalysiert werden. Darunter befindet sich eine gentechnisch veränderte SerC Mutante eine Lactatdehydrogenase eine 4 Hydroxybutyrat CoA transferase und eine Aldehyd Alkoholdehydrogenase. Das Einbringen dieses Stoffwechselweges in E. coli erzielte einen Produkttiter von 19 6 ± 5 9 mg L BT in einer fed batch Kultivierung was deutlich höher als der in der Literatur veröffentlichte Wert von 120 ng L ausgehend von L Malat ist. Zusammenfassend kann man sagen dass verschiedenste Strategien angewandt wurden um eine SerC Mutante mit einer erhöhten Aktivität gegenüber L Homoserin zu entwickeln und diese erfolgreich identifiziert werden konnten. Indem diese SerC Mutanten in den Homoserin basierten 1 3 PDO und den neuartigen BT Stoffwechselweg eingebaut wurden konnte die jeweilige Produktionsleistung drastisch erhöht werden. Diese Untersuchungen bilden zudem die Grundlage für die Entwicklung potenzieller mikrobieller Produktionswege die ebenfalls auf biosynthetischen L Homoserin basierten Stoffwechselwegen fußen. 1 3 Propanediol (1 3 PDO) is an important chemical compound with lots of applications in the fields of polymers cosmetics food and pharmaceutical. The significant advances of metabolic engineering in the past thirty years have made it possible to develop efficient industrial strains to synthesize 1 3 PDO from different resources. A milestone for microbial production of 1 3 PDO is the DuPont Tate & Lyle process from sugar via glycerol. To circumvent the use of expensive vitamin B12 in the ‘glucose glycerol PDO’ process a completely new homoserine derived 1 3 PDO pathway was developed by Chen et al. (2015) in our lab. In this pathway 1 3 PDO is produced from L homoserine via three heterologous enzymatic reactions. The bottleneck step is the first deamination step of L homoserine to 4 hydroxy 2 oxobutanoic acid (HOBA). In this work a phosphoserine aminotransferase (SerC) from E. coli was investigated and engineered to achieve the crucial deamination of L homoserine. To alter the substrate specificity of SerC from L phosphoserine to L homoserine a computation based rational method was firstly implemented. Key residues responsible for the substrate binding specificity were identified by calculating the binding free energy based on molecular dynamics simulations and this was followed by in silico site directed saturation mutagenesis. After three rounds of screening a few candidates were selected and experimentally verified. The specific activity of the best mutant SerC(R42W R77W) was improved by 4.2 fold towards L homoserine in comparison to the wild type while its activity towards the natural substrate L phosphoserine was decreased by 43 fold. However the improvement of SerC is still not satisfactory. Considering the limitations of rational design other screening strategies have also been developed in order to achieve better mutants of SerC. Apart from the method of site directed mutagenesis random mutagenesis and semi rational design method were also used to generate larger and more diverse libraries of mutants. Afterwards three different strategies were employed to screen the mutant libraries: a) generation and use of glutamate dependent auxotrophic strain; b) GDH coupled photometric detection; and c) mercaptopyruvate sulfurtransferase (MPST) coupled colorimetric screening. Finally a better mutant SerC(R42W R77W R329P) was identified. This mutant showed an increased activity towards L homoserine by 5.5 fold compared to the wild type and its activity towards L phosphoserine was completely deactivated. With 3 mM L homoserine as the substrate the Km of SerC(R42W R77W R329P) was decreased by 68 fold compared to that of the wild type. To examine the performance of the improved SerC the complete “homoserine to 1 3 PDO” pathway was constructed by combining SerC with pyruvate decarboxylase (PDC) and alcohol dehydrogenase (YqhD) and introduced into E. coli. To enhance the L homoserine supply a homoserine producing strain was constructed by overexpressing aspartate kinase III (LysC) and homoserine dehydrogenase (MetL) with a medium copy plasmid. In addition the genes ldhA and adhE encoding lactate dehydrogenase and aldehyde alcohol dehydrogenase (AdhE2) respectively were also removed from the E. coli genome to increase NADH supplementation and decrease byproduct formation under oxygen limited conditions. Finally the engineered recombinant E. coli was tested for 1 3 PDO production in both shake flask and fed batch fermentation. The mutant strain S147 was able to produce 3.03 g L 1 3 PDO after 62 h of fermentation which is 13 fold higher than the wild type strain (S144 0.24 g L). Given the largely improved performance of the engineered SerC for 1 3 PDO production a new pathway for 1 2 4 butanetriol (BT) biosynthesis was also constructed from L homoserine. BT is best known as a precursor for the production of 1 2 4 butanetriol trinitrate (BTTN) which is of interest as propellant and energetic plasticizer. The new BT pathway involves five consecutive enzymatic reactions catalyzed by four heterologous enzymes including an engineered SerC a lactate dehydrogenase a 4 hydroxybutyrate CoA transferase and an aldehyde alcohol dehydrogenase. Implementation of this new pathway in an engineered E. coli resulted in a production of up to 19.6  5.9 mg L BT in fed batch fermentations which is much higher than that (120 ng L) reported in literature for the production route from L malate. In summary different strategies were employed to develop SerC with an increased activity towards L homoserine and mutants with improved performance were successfully identified. By integrating these SerC mutants into the homoserine derived 1 3 PDO pathway and the new BT pathway their production can be dramatically increased. These studies also provide a basis for developing potential microbial processes for other homoserine derived biosynthetic pathways.