Structural characterization of the metal binding ligands S100A8 S100A9 and S100B of the receptor for advanced glycation end products Zusammenfassung: S100B S100A8 and S100A9 are members of the family of S100 proteins only found in vertebrates. They feature a four α helical structure with two Ca2+ binding EF hand loops per monomer forming dimers or higher oligomers. Homodimeric S100B is mainly expressed in astrocytes and is involved e. g. in neurite extension or apoptosis dependent on its concentration. Besides Ca2+ it also binds Zn2+ and Cu2+ with high affinity. In the C terminus S100B contains a cysteine residue (Cys84) that is conserved in many S100 proteins. This Cys84 is located in helix IV of S100B and influences the neurotrophic function and binding affinity of S100B towards target molecules or Zn2+. Its structural impact was investigated by X ray crystallographic analysis of the Cys84 to Ser mutant (S100BMT). S100BMT was expressed purified and crystallized in the presence and absence of Zn2+. Crystals of S100BMT Ca Zn diffracted to a resolution of 1.2 Å crystals of S100BMT Ca to a resolution of 1.7 Å. Both structures were solved by molecular replacement. Like in wild type S100B Zn2+ is coordinated tetrahedrally by residues His15 and His25 of one subunit and His85 and Glu89 from the second subunit. Two additional unspecific Zn2+ sites were observed in S100BMT Ca Zn where Zn2+ is coordinated by His42 and by an acetate from the crystallization buffer. Superposition of the structures of wild type S100B and S100BMT revealed that the C terminal helix IV of S100BMT Ca was shortened by six residues. Zn2+ binding to S100BMT reversed the effect of the mutation and stabilized full length helix IV. Thus Cys84 is required for the stabilization of helix IV in S100B. S100A8 and S100A9 are highly expressed by monocytes and neutrophils and secreted at sites of pathogenic invasion and inflammation. Both proteins act in their heteromeric form as chemokines or cytokines and activate the receptor for advanced glycation end products (RAGE) and the Toll like receptor 4 (TLR 4) of the innate immunity. The quinoline 3 carboxamide compound ABR 215757 and the monoclonal antibody Fab43 8 block the interaction of S100A9 with these receptors. They therefore can inhibit specifically the activation of signaling pathways leading to pathologies associated with RAGE and TLR 4. To get detailed insight into the binding mechanism of S100A9 with its inhibitors S100A9 was expressed and purified. Moreover a complex of S100A9 and Fab43 8 was successfully purified. S100A9 was crystallized and crystals w ... Zusammenfassung: S100B S100A8 und S100A9 gehören zur Familie der S100 Proteine welche nur in Vertebraten vorkommen. Gemeinsames Merkmal dieser Proteine ist ihre Struktur mit vier α Helices und zwei Ca2+ bindenden EF Händen je Monomer. S100 Proteine bilden Dimere oder höhere Oligomere. Das Homodimer S100B wird hauptsächlich in Astrozyten exprimiert und reguliert im ZNS Wachstum von Neuriten oder Apoptose von Neuronen abhängig von der Konzentration dieses Proteins. Neben Ca2+ bindet S100B auch Zn2+ und Cu2+ mit hoher Affinität. S100B enthält im C Terminus ein hochkonserviertes Cystein (Cys84) welches für die Funktion von S100B eine zentrale Rolle zu spielen scheint. Cys84 liegt in Helix IV von S100B und beeinflusst die Bindung von Zn2+ die Bindung von S100B regulierten Zielproteinen und dessen neurotrophe Funktion. Welche strukturelle Rolle dieses Cys84 für S100B spielt wurde hier mittels Röntgenstrukturanalyse der Cys84 Ser84 Mutante von S100B (S100BMT) kristallographisch untersucht. Hierfür wurde S100BMT exprimiert isoliert und in Anwesenheit und Abwesenheit von Zn2+ kristallisiert. Kristalle von S100BMT Ca Zn beugten die Röntgenstrahlung bis zu einer Auflösung von 1.2 Å S100BMT Ca Kristalle bis zu einer Auslösung von 1.7 Å. Beide Strukturen wurden durch die Methode des Molekularen Ersatzes gelöst. Wie im Wildtyp Protein war auch in S100BMT Ca Zn das Zn2+ tetrahedral durch die Reste His15 und His25 der einen Untereinheit und durch His85 und Glu89 der zweiten Untereinheit des Homodimers koordiniert. His42 und ein Azetat des Kristallisationspuffers bildeten zwei weitere unspezifische Zn2+ Bindestellen in S100BMT Ca Zn. Strukturüberlagerungen von S100BWT Ca und S100BMT Ca zeigten in der Struktur von S100BMT Ca eine Verkürzung der C terminalen Helix IV um sechs Reste. Diese Strukturänderung wurde durch die Bindung von Zn2+ wieder aufgehoben wie die Struktur von S100BMT Ca Zn zeigte. Cys84 ist somit essentiell für die Stabilisierung von Helix IV in S100B. S100A8 und S100A9 werden von Monozyten und Neutrophilen exprimiert und an Entzündungsherden sowie bei der Invasion verschiedener Pathogene sekretiert. Beide Proteine wirken in ihrer heteromeren Form als Chemokine oder Zytokine und aktivieren den Rezeptor für Advanced Glycation Endproducts (RAGE) und den Toll like Rezeptor 4 (TLR4) des angeborenen Immunsystems. Die Quinolin 3 Carboxamid Verbindung ABR 215757 und der monoklonale Antikörper Fab43 8 blo ...