Kromatografi fasa terbalik

Kromatografi fasa terbalik atau kromatografi hidrofobik adalah metode kromatografi yang menggunakan fasa diam hidrofobik. RPC merujuk pada kromatografi cair, bukan kromatografi gas. Istilah "fasa terbalik" mempunyai latar belakang sejarah. Pada tahun 1970an, sebagian besar kromatografi cair dilakukan menggunakan pendukung fasa diam berisi resin silika atau alumina yang tidak dimodifikasi. Metode ini disebut "kromatografi fasa normal". Pada kromatografi fasa normal, fasa diam adalah hidrofilik sehingga mempunyai afinitas yang kuat terhadap molekul hidrofilik dalam fasa gerak. Oleh karena itu, molekul-molekul hidrofilik dalam fasa gerak cenderung untuk terikat pada kolom, sementara molekul-molekul hidrofobik mengalir melalui kolom dan dielusi pertama kali. Dalam kromatografi fasa normal, molekul hidrofilik dapat dielusi dari kolom dengan menaikkan polaritas larutan dalam fasa gerak. Teknik ini diperkenalkan menggunakan rantai alkil yang berikatan kovalen pada fasa pendukung, menciptakan fasa diam hidrofobik yang mempunyai afinitas yang lebih kuat terhadap senyawa-senyawa hidrofobik. Penggunaan fasa diam hidrofobik diperhitungkan sebagai lawan atau "kebalikan" dari kromatografi fasa normal, sehingga muncullah istilah "kromatografi fasa terbalik". Kromatografi fasa terbalik melibatkan fasa gerak polar (aqueous). Akibatnya, molekul-molekul hidrofobik cenderung teradsorpsi pada fasa diam hidrofobik, dan molekul-molekul hidrofilik dalam fasa gerak akan melewati kolom dan terelusi lebih dulu. Molekul-molekul hidrofobik dapat dielusi dari kolom dengan menurunkan polaritas fasa gerak menggunakan pelarut organik (non-polar), yang dapat mengurangi interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik suatu molekul, semakin kuat terikat pada fasa diam, dan semakin tinggi konsentrasi pelarut organik yang diperlukan untuk mengelusi molekul tersebut. Banyak perhitungan matematis dan eksperimental yang digunakan dalam metode kromatografi lainnya juga diterapkan pada RPC. Hal ini dapat digunakan untuk pemisahan molekul-molekul dengan variasi luas. Tetapi RPC tidak dapat digunakan untuk pemisahan protein, karena pelarut organik yang digunakan dalam RPC dapat mendenaturasi sebagian besar protein. Berdasarkan alasan inilah, kromatografi fasa normal lebih umum digunakan untuk pemisahan protein. Saat ini, RPC merupakan teknik analisis yang sering digunakan. Tersedia berbagai macam fasa diam yang digunakan dalam RPC, memungkinkan fleksibilitas dalam pengembangan metode pemisahan.