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de la dose ingérée a un peu amélioré les résultats des cultures, en d'autres termes : que la possibilité de cultiver les bacilles BCG qui se trouvent dans les ganglions lymphatiques d'animaux vaccinés per os dépend surtout du nombre de ces bacilles dans les organes examinés. De cette façon, l'hypothèse que nous avons émise en nous appuyant sur des examens bactériologiques d'enfants autopsiés, nous semble justifiée par le résultat de nos expériences : la vitalité du BCG dans l'organisme vacciné peut diminuer, ou du moins, la souche de BCG cultivée par nous (depuis le 21 juillet 1932 nous avons la souche 441-S1 de l'Institut Pasteur) a perdu sa vitalité ancienne au cours des années. Nous tenons à souligner ici qu'il ne s'agit que de la vitalité dans les tissus de l'organisme humain et animal vacciné et qu'en attirant l'attention sur ce problème nous n'avons aucune raison de mettre en doute les autres qualités du BCG. Nous-mêmes, nous nous assurons constamment par l'observation du développement d'enfants vaccinés et par les résultats de nos récentes expériences sur le pouvoir immunisant dans la tuberculose de cobayes, de la valeur vaccinale du BCG. Mais une fois la question posée, il faut l'étudier dans d'autres laboratoires, il faut trouver la cause de cette diminution de vitalité du BCG et prévenir son affaiblissement ultérieur, peut-être en la cultivant sur d'autres milieux. Il faut aussi prendre en considération la dose vaccinale et le mode de vaccination pour conserver dans l'avenir les bonnes propriétés immunisantes que l'on observe maintenant. Dans notre centre de vaccinations antituberculeuses nous employons la méthode des injections sous-cutanées qui causent parfois (même après la petite dose de 0,1 milligr. de BCG) des abcès froids, contenant des bacilles BCG très facilement recultivables même trois mois après la vaccination. CONCLUSIONS. L'examen bactériologique systématique des enfants vaccinés au BCG et autopsiés démontre qu'il n'est plus possible de reculer les bacilles-vaccins, bien qu'on ait employé la même technique que celle utilisée de 1928 à 1929. De même, une répétition des expériences faites sur des cobayes nouveau-nés auxquels on avait fait ingérer de fortes doses de BCG n'a plus
laboratoires, il faut trouver la cause de cette diminution de vitalité du BCG et prévenir son affaiblissement ultérieur, peut-être en la cultivant sur d'autres milieux. Il faut aussi prendre en considération la dose vaccinale et le mode de vaccination pour conserver dans l'avenir les bonnes propriétés immunisantes que l'on observe maintenant. Dans notre centre de vaccinations antituberculeuses nous employons la méthode des injections sous-cutanées qui causent parfois (même après la petite dose de 0,1 milligr. de BCG) des abcès froids, contenant des bacilles BCG très facilement recultivables même trois mois après la vaccination. CONCLUSIONS. L'examen bactériologique systématique des enfants vaccinés au BCG et autopsiés démontre qu'il n'est plus possible de reculer les bacilles-vaccins, bien qu'on ait employé la même technique que celle utilisée de 1928 à 1929. De même, une répétition des expériences faites sur des cobayes nouveau-nés auxquels on avait fait ingérer de fortes doses de BCG n'a plus donné les mêmes résultats qu'en 1929. Il s'agit donc très probablement d'une diminution de la vitalité du BCG dans l'organisme vacciné. Il convient de prendre les mesures nécessaires pour prévenir une diminution ultérieure de cette vitalité, diminution qui pourrait influencer le pouvoir vaccinant, très efficace jusqu'à présent du BCG. TITRAGE DES SERUMS ANTIPNEUMOCOCCIDES TYPES I ET II PAR LA RÉACTION DE PRÉCIPITATION SPÉCIFIQUE par L.-K. VIKTOROFF, L.-A. GUINTZE-VERNER et M.-W. DEMIDOVA. (Institut Tarassevitch de Contrôle des Sérums et Vaccins. Laboratoire des travaux expérimentaux. Directeur : Professeur L.-M. HATENEVER; Chef du Laboratoire : Dr L.-K. VIKTOROFF.) Le pouvoir curatif des sérums antipneumococciques était jusqu'à présent évalué par leur effet préventif dans l'infection de la souris. Plusieurs méthodes ont été préconisées pour ce titrage in vivo : les méthodes anciennes, proposées par Avery, Chickering, Cole, Dochez, à l'Institut Rockefeller à New-York, celles de Neufeld et Handel, à l'Institut Robert Koch à Berlin; les modifications de Fellon, Parish, Trevan et autres. Or, la grande sensibilité des souris aux pneumocoques, la nécessité où l'on se trouve d'avoir toujours une souche de virulence constante et un sérum-étalon pour comparer les résultats (d'ailleurs souvent contradictoires) rendent ces méthodes trop compliquées. Beard et Clapp affirment qu'un seul
DES SERUMS ANTIPNEUMOCOCCIDES TYPES I ET II PAR LA RÉACTION DE PRÉCIPITATION SPÉCIFIQUE par L.-K. VIKTOROFF, L.-A. GUINTZE-VERNER et M.-W. DEMIDOVA. (Institut Tarassevitch de Contrôle des Sérums et Vaccins. Laboratoire des travaux expérimentaux. Directeur : Professeur L.-M. HATENEVER; Chef du Laboratoire : Dr L.-K. VIKTOROFF.) Le pouvoir curatif des sérums antipneumococciques était jusqu'à présent évalué par leur effet préventif dans l'infection de la souris. Plusieurs méthodes ont été préconisées pour ce titrage in vivo : les méthodes anciennes, proposées par Avery, Chickering, Cole, Dochez, à l'Institut Rockefeller à New-York, celles de Neufeld et Handel, à l'Institut Robert Koch à Berlin; les modifications de Fellon, Parish, Trevan et autres. Or, la grande sensibilité des souris aux pneumocoques, la nécessité où l'on se trouve d'avoir toujours une souche de virulence constante et un sérum-étalon pour comparer les résultats (d'ailleurs souvent contradictoires) rendent ces méthodes trop compliquées. Beard et Clapp affirment qu'un seul essai de titrage sur la souris ne suffit pas pour évaluer la quantité d'unités d'un sérum antipneumococcique, même dans les cas où compte est tenu des facteurs capables d'influencer les résultats de l'expérience, et où une série parallèle d'essais avec un sérum étalon plusieurs fois vérifié sert de contrôle. Ces auteurs pensent qu'un titrage précis du pouvoir préventif nécessite au moins deux séries d'expériences parallèles avec 10 souris pour chaque dilution de sérum. De l'avis de Parish et Trevan, ce n'est qu'en prenant 20 ou 40 souris pour chaque dose qu'on arrive à des résultats nets dans la détermination du titre des sérums antipneumococciques. Smith s'est servi de 50 souris pour chaque dilution de sérum qu'il titrait. Il est donc naturel que, depuis longtemps, plusieurs auteurs se soient efforcés de substituer à l'évaluation peu précise et très coûteuse du pouvoir préventif in vivo une méthode de titrage in vitro. C'est ainsi qu'on a voulu mesurer l'effet curatif par l'appréciation de la quantité d'autres anticorps : agglutinines et précipitines. Les résultats obtenus n'étant pas assez sûrs, ces méthodes ne sont pas entrées dans la pratique. Depuis que Avery et Heidelberger ont extrait des cultures pneumococciques des polysaccharides spécifiques, plusieurs auteurs se
auteurs pensent qu'un titrage précis du pouvoir préventif nécessite au moins deux séries d'expériences parallèles avec 10 souris pour chaque dilution de sérum. De l'avis de Parish et Trevan, ce n'est qu'en prenant 20 ou 40 souris pour chaque dose qu'on arrive à des résultats nets dans la détermination du titre des sérums antipneumococciques. Smith s'est servi de 50 souris pour chaque dilution de sérum qu'il titrait. Il est donc naturel que, depuis longtemps, plusieurs auteurs se soient efforcés de substituer à l'évaluation peu précise et très coûteuse du pouvoir préventif in vivo une méthode de titrage in vitro. C'est ainsi qu'on a voulu mesurer l'effet curatif par l'appréciation de la quantité d'autres anticorps : agglutinines et précipitines. Les résultats obtenus n'étant pas assez sûrs, ces méthodes ne sont pas entrées dans la pratique. Depuis que Avery et Heidelberger ont extrait des cultures pneumococciques des polysaccharides spécifiques, plusieurs auteurs se sont attachés à l'étude de la réaction de précipitation du sérum antipneumococcique avec le polysaccharide spécifique en vue d'en faire usage dans le titrage des sérums. Ce sont Friedlander, Sabotka et Banzhaf qui, les premiers, ont démontré que le pouvoir préventif d'un sérum antipneumococcique varie en raison directe de son titre précipitant (ce dernier étant obtenu par précipitation avec le polysaccharide spécifique). Zozaya, Boyer et Clark, Smith, Browne, titrent leurs sérums en déterminant la dernière dilution donnant une précipitation optimale avec le polysaccharide spécifique. Heidelberger, Sia et Kendall, et Felton, recommandent, pour apprécier la qualité du sérum, de doser la protéine spécifique précipitée. Ainsi tous ces savants ont constaté l'existence de rapports entre le pouvoir préventif du sérum et son titre précipitant. Nous avons cherché, dans ce travail, à établir les relations qui existent entre les différents anticorps contenus dans un sérum antipneumococcique et à comparer leurs valeurs dans l'appréciation du titre de ce sérum in vitro. Des sérums antipneumococciques du type I et II ont donc été examinés au point de vue de leur richesse en anticorps : précipitines, agglutinines, bactériotropines et pouvoir préventif; le titre préventif déterminé sur souris nous servait de critère pour apprécier le pouvoir curatif
titre précipitant (ce dernier étant obtenu par précipitation avec le polysaccharide spécifique). Zozaya, Boyer et Clark, Smith, Browne, titrent leurs sérums en déterminant la dernière dilution donnant une précipitation optimale avec le polysaccharide spécifique. Heidelberger, Sia et Kendall, et Felton, recommandent, pour apprécier la qualité du sérum, de doser la protéine spécifique précipitée. Ainsi tous ces savants ont constaté l'existence de rapports entre le pouvoir préventif du sérum et son titre précipitant. Nous avons cherché, dans ce travail, à établir les relations qui existent entre les différents anticorps contenus dans un sérum antipneumococcique et à comparer leurs valeurs dans l'appréciation du titre de ce sérum in vitro. Des sérums antipneumococciques du type I et II ont donc été examinés au point de vue de leur richesse en anticorps : précipitines, agglutinines, bactériotropines et pouvoir préventif; le titre préventif déterminé sur souris nous servait de critère pour apprécier le pouvoir curatif du sérum. MÉTÉOROLOGIE D'EXPÉRIENCES. Nous avons eu à notre disposition 21 sérums antipneumococciques, provenant de différents Instituts de l'URSS et de plusieurs Instituts étrangers, tels que le Bureau of Laboratories de New-York, l'Institut Lister de Londres, l'Institut Pasteur de Paris et l'Institut Sérothérapique de Vienne. 12 sur les 21 sérums mis à notre disposition étaient de type I, 7 du type II, 2 étaient bivalents (type I et II); 2 sérums du type I, 3 du type II avaient été envoyés comme sérums agglutinants; pour le reste, il s'agissait de sérums thérapeutiques. DÉTERMINATION DU TITRE PRÉVENTIF CHEZ LES SOURIS. Le pouvoir préventif des sérums était défini d'après la méthode du Felton. L'unité préventive était représentée par la plus petite quantité de sérum en centimètres cubes, protégeant pendant au moins quatre-vingt seize-heures 2 souris sur 3 contre 1 million de doses mortelles d'une culture de pneumocoque de virulence constante; 0,5 c. c. 5 en injection intrapéritonéale de cette culture, diluée à 10−8 (contenant de 3 à 5 pneumocoques) tuait en trente-six à quarante-huit heures les 2 souris. Cette dose représente la DLM. Nous avons opéré comme suit : Des souris blanches pesant 16 à 20 grammes reçoivent en injection intrapéritonéale 0,5
mis à notre disposition étaient de type I, 7 du type II, 2 étaient bivalents (type I et II); 2 sérums du type I, 3 du type II avaient été envoyés comme sérums agglutinants; pour le reste, il s'agissait de sérums thérapeutiques. DÉTERMINATION DU TITRE PRÉVENTIF CHEZ LES SOURIS. Le pouvoir préventif des sérums était défini d'après la méthode du Felton. L'unité préventive était représentée par la plus petite quantité de sérum en centimètres cubes, protégeant pendant au moins quatre-vingt seize-heures 2 souris sur 3 contre 1 million de doses mortelles d'une culture de pneumocoque de virulence constante; 0,5 c. c. 5 en injection intrapéritonéale de cette culture, diluée à 10−8 (contenant de 3 à 5 pneumocoques) tuait en trente-six à quarante-huit heures les 2 souris. Cette dose représente la DLM. Nous avons opéré comme suit : Des souris blanches pesant 16 à 20 grammes reçoivent en injection intrapéritonéale 0,5 c. c. d'une culture de pneumocoques de dix-huit heures diluée à raison de 1/200, de sorte que 0,5 c. c. 5 de cette culture contiennent 300.000 DLM. On y ajoute 0,5 c. c. de chaque dilution de sérum homologue à la culture. Les dilutions de culture sont faites avec une solution stérile de 1 p. 100 de peptone (NaCl, 0 grammes; peptone, 10 grammes, pour 1 litre d'eau) de pH = 7,6. Le sérum est dilué avec de l'eau physiologique stérile. Dilutions et injections ont été effectuées suivant les règles adoptées pour le titrage des sérums en général (pipettes de précision pour chaque dilution, plusieurs seringues, etc). Pour apprécier les sérums de titre inconnu nous avons toujours procédé à une évaluation approximative avec des dilutions : à 1/23, 1/30, 1/100, 1/200, 1/400, 1/600, etc., en utilisant une seule souris par dilution; dans la suite, pour préciser le titre, 3 souris ont été employées pour chaque dilution. La culture une fois diluée, on introduit la dose d'essai dans autant de flacons qu'on a préparé de dilutions de sérum. On aspire dans une seringue 0,5 c. c. 3 de culture et autant de sérum dilué, on agite prudemment et on injecte le
solution stérile de 1 p. 100 de peptone (NaCl, 0 grammes; peptone, 10 grammes, pour 1 litre d'eau) de pH = 7,6. Le sérum est dilué avec de l'eau physiologique stérile. Dilutions et injections ont été effectuées suivant les règles adoptées pour le titrage des sérums en général (pipettes de précision pour chaque dilution, plusieurs seringues, etc). Pour apprécier les sérums de titre inconnu nous avons toujours procédé à une évaluation approximative avec des dilutions : à 1/23, 1/30, 1/100, 1/200, 1/400, 1/600, etc., en utilisant une seule souris par dilution; dans la suite, pour préciser le titre, 3 souris ont été employées pour chaque dilution. La culture une fois diluée, on introduit la dose d'essai dans autant de flacons qu'on a préparé de dilutions de sérum. On aspire dans une seringue 0,5 c. c. 3 de culture et autant de sérum dilué, on agite prudemment et on injecte le tout dans la cavité péritonéale de la souris. On répète ces opérations avec chaque dilution de sérum. Comme contrôle, on se sert d'un sérum dont le titre en unités préventives est connu. Deux dilutions du sérum-étalon sont préparées : une, correspondant au titre donné, et une autre, deux fois plus petite; culture et dilution sont inoculées à 3 souris; en cas de survie du lot qui a reçu la plus petite dose de sérum, on pensera à une diminution de virulence de la souche. Cette méthode dont nous nous sommes servis pour titrer 14 sérums du type I et 9 du type II nous a fourni l'occasion de voir à quelles difficultés se heurte l'expérimentateur dans l'évaluation du titre préventif des sérums antipneumococciques par la méthode biologique. Pour arriver à un titre plus ou moins précis, il fallait recommencer plusieurs fois l'essai de titrage dans des conditions strictement égales, en se servant d'une souche de virulence définitive et d'un sérum-étalon. Dans nos expériences, nous avons toujours opéré avec des souches très virulentes de pneumocoques types I et II qui avaient été mises à notre disposition par le Professeur W. Park du Bureau of Laboratories de New-York. La virulence de nos
petite; culture et dilution sont inoculées à 3 souris; en cas de survie du lot qui a reçu la plus petite dose de sérum, on pensera à une diminution de virulence de la souche. Cette méthode dont nous nous sommes servis pour titrer 14 sérums du type I et 9 du type II nous a fourni l'occasion de voir à quelles difficultés se heurte l'expérimentateur dans l'évaluation du titre préventif des sérums antipneumococciques par la méthode biologique. Pour arriver à un titre plus ou moins précis, il fallait recommencer plusieurs fois l'essai de titrage dans des conditions strictement égales, en se servant d'une souche de virulence définitive et d'un sérum-étalon. Dans nos expériences, nous avons toujours opéré avec des souches très virulentes de pneumocoques types I et II qui avaient été mises à notre disposition par le Professeur W. Park du Bureau of Laboratories de New-York. La virulence de nos souches était plusieurs fois vérifiée et maintenue au même niveau par passages successifs (souris); la dose mortelle minimale restait toujours égale à 0,5 c. c 3 d'une culture de dix-huit heures diluée à 10−8 fois. Le sérum thérapeutique, série 493, type 1, et le sérum agglutinant, série 9, type II, aimablement envoyés par M. le Dr A. Wadsworth de New-York nous servait d'étalon. De nombreux titrages soignés ont permis de fixer pour le sérum type I le titre préventif à 300 unités et pour le sérum type II à 100 unités. En déterminant la valeur préventive de ces 14 sérums (12 monovalents et 2 bivalents), nous avons constaté que la quantité d'unités était différente pour chaque sérum et variait de 3.600 UP (sérum thérapeutique concentré, série 21), jusqu'à 20 UP (série 31). Donc, nous avons eu à notre disposition plusieurs sérums, dont la valeur en unités prophylactiques présentait une large amplitude. Les sérums du type II (7 monovalents et 2 bivalents) à l'exception de 3 sérums agglutinants américains à titre préventif relativement bas, ne contenaient pas d'anticorps en quantité décelables. DÉTERMINATION DE LA QUANTITÉ DE PRÉCIPITINES SPÉCIFIQUES DANS LES SÉRUMS. La quantité des précipitines spécifiques a été évaluée suivant deux
aimablement envoyés par M. le Dr A. Wadsworth de New-York nous servait d'étalon. De nombreux titrages soignés ont permis de fixer pour le sérum type I le titre préventif à 300 unités et pour le sérum type II à 100 unités. En déterminant la valeur préventive de ces 14 sérums (12 monovalents et 2 bivalents), nous avons constaté que la quantité d'unités était différente pour chaque sérum et variait de 3.600 UP (sérum thérapeutique concentré, série 21), jusqu'à 20 UP (série 31). Donc, nous avons eu à notre disposition plusieurs sérums, dont la valeur en unités prophylactiques présentait une large amplitude. Les sérums du type II (7 monovalents et 2 bivalents) à l'exception de 3 sérums agglutinants américains à titre préventif relativement bas, ne contenaient pas d'anticorps en quantité décelables. DÉTERMINATION DE LA QUANTITÉ DE PRÉCIPITINES SPÉCIFIQUES DANS LES SÉRUMS. La quantité des précipitines spécifiques a été évaluée suivant deux méthodes : 1° en précipitant différentes dilutions de sérum par le polysaccharide spécifique; 2° en déterminant la quantité d'azote dans le précipité spécifique. Les polysaccharides spécifiques des pneumocoques de type I et II ont été extraits d'après la méthode classique, élaborée par Avery et Heidelberger, et modifiée un peu par Heidelberger, Sia et Kendall. Les pneumocoques étaient ceux dont nous nous servions pour l'évaluation du pouvoir prophylactique des sérums. MÉTHODE EMPLOYÉE POUR EXTRAIRE LE POLYSACCHARIDE DU PNEUMOCOQUE DE TYPE I (suivant Heidelberger, Sia et Kendall). 20 litres d'une culture en bouillon phosphaté, âgée de cinq jours, contenant 0,3 p. 100 g de glucose, tuée dans l'appareil de Koch, sont évaporées au bain-marie jusqu'au volume de 1 litre. Cette solution concentrée additionnée de 1 lit. 4 d'alcool à 96° est laissée telle quelle jusqu'au lendemain. Le liquide se sépare en 2 couches : la supérieure, noire et transparente, l'inférieure, jaune et opaque. On jette la première; la seconde est centrifugée à grande vitesse pendant une demi-heure. Après centrifugation, 3 couches se forment : la supérieure est brune et trouble, celle du milieu visqueuse, l'inférieure transparente. On se débarrasse des couches supérieure et inférieure; seule, la couche moyenne est dissoute dans 200
Heidelberger, Sia et Kendall. Les pneumocoques étaient ceux dont nous nous servions pour l'évaluation du pouvoir prophylactique des sérums. MÉTHODE EMPLOYÉE POUR EXTRAIRE LE POLYSACCHARIDE DU PNEUMOCOQUE DE TYPE I (suivant Heidelberger, Sia et Kendall). 20 litres d'une culture en bouillon phosphaté, âgée de cinq jours, contenant 0,3 p. 100 g de glucose, tuée dans l'appareil de Koch, sont évaporées au bain-marie jusqu'au volume de 1 litre. Cette solution concentrée additionnée de 1 lit. 4 d'alcool à 96° est laissée telle quelle jusqu'au lendemain. Le liquide se sépare en 2 couches : la supérieure, noire et transparente, l'inférieure, jaune et opaque. On jette la première; la seconde est centrifugée à grande vitesse pendant une demi-heure. Après centrifugation, 3 couches se forment : la supérieure est brune et trouble, celle du milieu visqueuse, l'inférieure transparente. On se débarrasse des couches supérieure et inférieure; seule, la couche moyenne est dissoute dans 200 à 250 c. c. d'eau chaude. On centrifuge de nouveau, le culot est lavé deux fois dans une petite quantité d'eau. La solution transparente et les eaux de lavage réunies, refroidies et additionnées d'acide chlorhydrique concentré jusqu'à l'apparition de coloration au rouge Congo sont laissées jusqu'au lendemain à la glacière. Nouvelle centrifugation. Le précipité est lavé dans une petite quantité de 0,01 N d'acide chlorhydrique. La solution transparente avec l'eau de lavage (dont la quantité ne doit pas dépasser 500 centimètres cubes) est précipitée par 1 lit. 5 d'alcool refroidi, après forte agitation elle est remise à la glacière. Le lendemain, le précipité, séparé par centrifugation, est dissous dans l'eau additionnée de NaOH jusqu'à réaction alcaline. On ajoute de l'eau jusqu'à dissolution complète du polysaccharide spécifique; les substances non dissoutes sont séparées par centrifugation et rejetées. La solution transparente en quantité de 100 à 125 centimètres cubes est additionnée de 10 grammes d'acétate de sodium; après dissolution du sel, on refroidit le liquide et on le précipite par 70 centimètres cubes d'alcool refroidi. Le lendemain, on centrifuge à froid. Le culot additionné de 200 centimètres cubes d'eau est centrifugé de nouveau. Le liquide transparent, acidifié par de l'acide acétique jusqu'à