jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
66 (x + y) d'où : x/y = 1,06. Le d-glucose et le d-galactose existent donc dans le polysaccharide en proportions à peu près égales. La micro-analyse du produit purifié indique : Trouvé : C p. 100 = 41,96. Calculé pour (C6H10O5)n : C p. 100 = 44,44. H p. 100 = 6,06. H p. 100 = 6,17. REMARQUE. — Avec une souche de B. megatherium différente de celle qui nous servit pour ce travail, nous avons extrait un polysaccharide qui contenait, en plus du glucose et du galactose, un acide uronique. Ces résultats ont été publiés en 1949 [1], en même temps que paraissait une note d'auteurs anglais sur la nature des polysaccharides formés par certains bacilles aérobies [4]. Ces auteurs signalaient, dans le polysaccharide formé par B. megatherium cultivé en milieu complexe gélosé, l'existence du glucose identifié par la phénylglucosazone et d'un acide uronique caractérisé par la réaction au naphtoresorcinol. Les résultats des auteurs anglais et les nôtres n'ont jamais été retrouvés avec la souche utilisée ici. Extraction et étude chimique d'un second polysaccharide. Les bactéries traitées à l'eau bouillante contiennent encore environ 13,5 p. 100 du poids sec initial d'une substance saccharifiable non extractible par cette méthode (le pourcentage réel est plus élevé, l'eau bouillante extrayant d'autres substances que le polysaccharide I). I. — RECHERCHES PRÉLIMINAIRES. Après hydrolyse acide des bactéries traitées à l'eau bouillante, neutralisation et décoloration, la solution donne naissance, avec l'acétate de phénylhydrazine à chaud, à la phénylglucosazone. La chromatographie sur papier révèle l'existence d'une seule tache ayant le même Rf que le glucose. Les bactéries se colorent d'une manière assez nette en brun avec le lugol, aussi avons-nous pensé à l'existence du glycogène ou d'une substance voisine. Soucieux de ne pas trop dégrader la substance que nous voulions extraire, nous avons essayé plusieurs modalités du traitement alcalin à chaud et avons choisi le traitement à la potasse deux fois normale pendant deux heures au bain-marie bouillant, qui extrait 50 p. 100 du polysaccharide restant et en dégrade 20 p. 100. II. — PRÉPARATION DU POLYSACCHARIDE II. A. EXTRACTION ET PRÉCIPITATION. — Les poudres
(le pourcentage réel est plus élevé, l'eau bouillante extrayant d'autres substances que le polysaccharide I). I. — RECHERCHES PRÉLIMINAIRES. Après hydrolyse acide des bactéries traitées à l'eau bouillante, neutralisation et décoloration, la solution donne naissance, avec l'acétate de phénylhydrazine à chaud, à la phénylglucosazone. La chromatographie sur papier révèle l'existence d'une seule tache ayant le même Rf que le glucose. Les bactéries se colorent d'une manière assez nette en brun avec le lugol, aussi avons-nous pensé à l'existence du glycogène ou d'une substance voisine. Soucieux de ne pas trop dégrader la substance que nous voulions extraire, nous avons essayé plusieurs modalités du traitement alcalin à chaud et avons choisi le traitement à la potasse deux fois normale pendant deux heures au bain-marie bouillant, qui extrait 50 p. 100 du polysaccharide restant et en dégrade 20 p. 100. II. — PRÉPARATION DU POLYSACCHARIDE II. A. EXTRACTION ET PRÉCIPITATION. — Les poudres provenant de la première extraction à l'eau bouillante sont traitées deux fois de la même manière pour enlever le polysaccharide I qui n'aurait pas été extrait des bactéries. Les microbes ainsi traités sont mis en suspension dans une solution de KOH2n à raison de 100 g de poudre par litre. La suspension est portée au bain-marie bouillant sous azote pendant deux heures. Après refroidissement et neutralisation à l'acide acétique, on centrifuge pour enlever les détritus microbiens et le liquide surnageant est additionné de 1,5 vol. d'alcool. On obtient un précipité gommeux qui est lavé à l'alcool et à l'éther puis séché sous vide. Pour 100 g de poudre au départ, on obtient environ 4 g de précipité. B. FRACTIONNEMENT. — Ce produit est remis en suspension à froid dans 200 ml d'une solution à 10 p. 100 d'acétate de sodium. On laisse reposer une heure puis on centrifuge. Le liquide surnageant est additionné de 1 vol. d'alcool, on obtient un précipité (précipité I) qui est séché, ainsi que le culot non dissous (précipité II), à la manière habituelle. Si on extrait à nouveau les résidus microbiens de la même manière, on obtient encore environ 2 g de produit brut. III.
La suspension est portée au bain-marie bouillant sous azote pendant deux heures. Après refroidissement et neutralisation à l'acide acétique, on centrifuge pour enlever les détritus microbiens et le liquide surnageant est additionné de 1,5 vol. d'alcool. On obtient un précipité gommeux qui est lavé à l'alcool et à l'éther puis séché sous vide. Pour 100 g de poudre au départ, on obtient environ 4 g de précipité. B. FRACTIONNEMENT. — Ce produit est remis en suspension à froid dans 200 ml d'une solution à 10 p. 100 d'acétate de sodium. On laisse reposer une heure puis on centrifuge. Le liquide surnageant est additionné de 1 vol. d'alcool, on obtient un précipité (précipité I) qui est séché, ainsi que le culot non dissous (précipité II), à la manière habituelle. Si on extrait à nouveau les résidus microbiens de la même manière, on obtient encore environ 2 g de produit brut. III. ÉTUDE CHIMIQUE DES PRÉCIPITÉS. A. PRÉCIPITÉ I. Il est purifié par la méthode de Sevag et par dialyse. On obtient ainsi un produit qui se présente sous l'aspect d'une poudre parfaitement blanche (1 g de produit brut donne 750 mg environ de produit purifié). Ce produit se dissout assez facilement dans l'eau et donne une solution très opalescente qui se colore en rouge brun avec l'iode et dont D = + 112° (c = 0,25 p. 100). Le dosage d'azote indique 1,7 p. 100, la recherche du phosphore est négative. Par hydrolyse dans H2SO4 conc. pendant quatre heures d'une solution à 0,25 p. 100, on obtient 95,7 p. 100 de sucres réducteurs exprimés en glucose. Cet ose est caractérisé par chromatographie sur papier, formation de phénylglucosazone et du saccharate acide de potassium. Enfin, le pouvoir rotatoire de la solution hydrolysée, en admettant une concentration finale en glucose de 95,7 p. 100, est \[el J:\] = +53°. Tous ces caractères permettent de conclure que ce polyoside est un polymère du d-glucose. Ce produit, sans doute voisin du glycogène, possède cependant un pouvoir rotatoire plus faible et s'apparente davantage aux dextrines. B. PRÉCIPITÉ II. — Très peu soluble dans l'eau à froid,
dans l'eau et donne une solution très opalescente qui se colore en rouge brun avec l'iode et dont D = + 112° (c = 0,25 p. 100). Le dosage d'azote indique 1,7 p. 100, la recherche du phosphore est négative. Par hydrolyse dans H2SO4 conc. pendant quatre heures d'une solution à 0,25 p. 100, on obtient 95,7 p. 100 de sucres réducteurs exprimés en glucose. Cet ose est caractérisé par chromatographie sur papier, formation de phénylglucosazone et du saccharate acide de potassium. Enfin, le pouvoir rotatoire de la solution hydrolysée, en admettant une concentration finale en glucose de 95,7 p. 100, est \[el J:\] = +53°. Tous ces caractères permettent de conclure que ce polyoside est un polymère du d-glucose. Ce produit, sans doute voisin du glycogène, possède cependant un pouvoir rotatoire plus faible et s'apparente davantage aux dextrines. B. PRÉCIPITÉ II. — Très peu soluble dans l'eau à froid, le précipité II a été purifié préalablement par lavage avec une solution d'acétate de sodium à 10 p. 100 pour le débarrasser complètement du précipité I, puis dissolution dans une solution alcaline à chaud et précipitation à l'alcool. Le produit purifié est une poudre légèrement jaunâtre qui contient 3,2 p. 100 d'azote dont l'[aJ^° = + 167°, et qui présente d'ailleurs tous les caractères du glycogène : réaction de coloration intense à l'iode, caractérisation dans la solution d'hydrolyse du seul d-glucose. Il n'a pas été possible de savoir si ces deux substances existent ainsi différentes dans les corps microbiens ou si le précipité I est un produit de dégradation du précipité II, formé au cours de l'extraction alcaline. Étude physiologique des polyosides. Une étude physiologique complète ferait, à elle seule, l'objet d'un long travail. Nous rapporterons seulement ici des résultats utiles pour l'étude du rendement, et nous nous contenterons de préciser l'influence de différents facteurs sur la formation des polyosides et le rôle joué par ces corps ainsi que leur évolution lors du développement des bactéries sur le milieu S glucosé. La formule brute des polyosides I et II étant (C6H10O5)n, les poids ne seront plus exprimés désormais en milligrammes
100 d'azote dont l'[aJ^° = + 167°, et qui présente d'ailleurs tous les caractères du glycogène : réaction de coloration intense à l'iode, caractérisation dans la solution d'hydrolyse du seul d-glucose. Il n'a pas été possible de savoir si ces deux substances existent ainsi différentes dans les corps microbiens ou si le précipité I est un produit de dégradation du précipité II, formé au cours de l'extraction alcaline. Étude physiologique des polyosides. Une étude physiologique complète ferait, à elle seule, l'objet d'un long travail. Nous rapporterons seulement ici des résultats utiles pour l'étude du rendement, et nous nous contenterons de préciser l'influence de différents facteurs sur la formation des polyosides et le rôle joué par ces corps ainsi que leur évolution lors du développement des bactéries sur le milieu S glucosé. La formule brute des polyosides I et II étant (C6H10O5)n, les poids ne seront plus exprimés désormais en milligrammes de glucose, mais en milligrammes de polyoside, et seront calculés en multipliant le poids de glucose par 162/180, soit 0,9. I. — CONDITIONS DE FORMATION DES POLYOSIDES. A. INFLUENCE DE LA NATURE DU SUBSTRAT CARBONÉ. — Dans le milieu S on remplace le glucose par différents substrats carbonés, et le taux de polyoside est obtenu par hydrolyse acide des bactéries selon la technique décrite précédemment. Le tableau III exprime les résultats. TABLEAU III. SUBSTRATS POLYOSIDE P. 100 SUBSTRATS du poids sec microbien Glucose 2 p. 100. 19,0 Glucose 1 p. 100. 19,1 Saccharose 2 p. 100. 18,5 Maltose 2 p. 100. 18,4 Xylose 2 p. 100 10,2 Glycérol 2 p. 100 11,7 2-3 butanediol 1 p. 100 : 2,2 Le taux de polyoside, constant avec des substrats contenant du glucose, est nettement plus faible avec le xylose et le glycérol, et pratiquement nul avec le 2-3 butanediol. Les bactéries cultivées sur glycérol contiennent 3,6 p. 100 d'un polyoside extractible à l'eau bouillante dont les constituants sont les mêmes que ceux du polyoside 1 obtenu avec le glucose comme substrat, et 8,1 p. 100 de glycogène. Les bactéries cultivées sur 2-3 butanediol ne contiennent pratiquement aucun polyoside. Les extractions à l'eau
taux de polyoside est obtenu par hydrolyse acide des bactéries selon la technique décrite précédemment. Le tableau III exprime les résultats. TABLEAU III. SUBSTRATS POLYOSIDE P. 100 SUBSTRATS du poids sec microbien Glucose 2 p. 100. 19,0 Glucose 1 p. 100. 19,1 Saccharose 2 p. 100. 18,5 Maltose 2 p. 100. 18,4 Xylose 2 p. 100 10,2 Glycérol 2 p. 100 11,7 2-3 butanediol 1 p. 100 : 2,2 Le taux de polyoside, constant avec des substrats contenant du glucose, est nettement plus faible avec le xylose et le glycérol, et pratiquement nul avec le 2-3 butanediol. Les bactéries cultivées sur glycérol contiennent 3,6 p. 100 d'un polyoside extractible à l'eau bouillante dont les constituants sont les mêmes que ceux du polyoside 1 obtenu avec le glucose comme substrat, et 8,1 p. 100 de glycogène. Les bactéries cultivées sur 2-3 butanediol ne contiennent pratiquement aucun polyoside. Les extractions à l'eau bouillante et à la potasse à chaud donnent des résultats négatifs. B. INFLUENCE DE LA NATURE DU MILIEU. — Le milieu S glucosé a été gelé, puis coulé dans des boîtes de Roux à plat. Les bactéries sont récoltées vingt-quatre heures après l'ensemencement, elles sont morphologiquement normales. Le tableau IV exprime le taux de polyoside en fonction de la concentration en glucose du milieu. TABLEAU IV. CONCENTRATION EN GLUCOSE POLYOSIDE P. 100 1 3 p. 100. 12,4 2 p. 1011. 10,2 1 p. 100. 8,8 Pour des concentrations plus faibles le développement est très mauvais. Le pourcentage de polyoside chez les bactéries cultivées sur milieu solide est donc inférieur au pourcentage de celles cultivées en milieu liquide. La concentration du glucose intervient rapidement, alors qu'en milieu liquide, dans les mêmes conditions, elle est sans effet. Une question de diffusion doit intervenir là, et ces résultats se rapprochent de ceux de Lemoigne et coll. [9] qui ont montré que pareil phénomène existait avec le lipide B-hydroxybutyrique : cultivées sur un milieu très voisin du nôtre, avec une concentration de 3 p. 100 en glucose, les bactéries renferment 25 p. 100 de lipide sur milieu solide et 45 p. 100 en milieu
exprime le taux de polyoside en fonction de la concentration en glucose du milieu. TABLEAU IV. CONCENTRATION EN GLUCOSE POLYOSIDE P. 100 1 3 p. 100. 12,4 2 p. 1011. 10,2 1 p. 100. 8,8 Pour des concentrations plus faibles le développement est très mauvais. Le pourcentage de polyoside chez les bactéries cultivées sur milieu solide est donc inférieur au pourcentage de celles cultivées en milieu liquide. La concentration du glucose intervient rapidement, alors qu'en milieu liquide, dans les mêmes conditions, elle est sans effet. Une question de diffusion doit intervenir là, et ces résultats se rapprochent de ceux de Lemoigne et coll. [9] qui ont montré que pareil phénomène existait avec le lipide B-hydroxybutyrique : cultivées sur un milieu très voisin du nôtre, avec une concentration de 3 p. 100 en glucose, les bactéries renferment 25 p. 100 de lipide sur milieu solide et 45 p. 100 en milieu liquide. Nous reprendrons ultérieurement tous ces résultats lors de l'étude du rendement. II. — NATURE DES POLYOSIDES. Dans une note précédente publiée en collaboration avec Mlle J. Millet [2], nous avons montré que le polyoside 1 est de nature capsulaire. S'il n'est pas possible actuellement de connaître le rôle joué par ce polyoside, on peut cependant affirmer que cette substance est solidement liée à l'organisme, car il est impossible de mettre en évidence l'existence de polyoside dans le milieu soit par extraction directe, soit par hydrolyse acide. Quand les bactéries décapsulées sont colorées au lugol, on distingue à l'intérieur du protoplasme des points chromophiles. Cette coloration est positive avec les bactéries cultivées sur glucose ou glycérol, négative avec celles cultivées sur butanediol qui prennent uniformément le colorant. Il est probable que ces points chromophiles se forment à l'emplacement du polyoside II de type glycogénique. III. — EVOLUTION DU TAUX DES POLYOSIDES AU COURS DE LA CROISSANCE. Plusieurs occasions se présenteront, par la suite, d'étudier l'évolution des polyosides au cours du développement exponentiel des bactéries, mais aucune de suivre cette variation pendant et après la phase stationnaire. C'est le seul point qui sera précisé ici. Le tableau V rapporte les résultats
par ce polyoside, on peut cependant affirmer que cette substance est solidement liée à l'organisme, car il est impossible de mettre en évidence l'existence de polyoside dans le milieu soit par extraction directe, soit par hydrolyse acide. Quand les bactéries décapsulées sont colorées au lugol, on distingue à l'intérieur du protoplasme des points chromophiles. Cette coloration est positive avec les bactéries cultivées sur glucose ou glycérol, négative avec celles cultivées sur butanediol qui prennent uniformément le colorant. Il est probable que ces points chromophiles se forment à l'emplacement du polyoside II de type glycogénique. III. — EVOLUTION DU TAUX DES POLYOSIDES AU COURS DE LA CROISSANCE. Plusieurs occasions se présenteront, par la suite, d'étudier l'évolution des polyosides au cours du développement exponentiel des bactéries, mais aucune de suivre cette variation pendant et après la phase stationnaire. C'est le seul point qui sera précisé ici. Le tableau V rapporte les résultats de cette évolution lorsque B. megatherium se développe sur le milieu S glucosé réparti dans des flacons d'Erlenmeyer (100 ml par flacon de 1 1, cultures agitées). TABLEAU V. en M — "a M e 80 ::.. ;::J ëg 0 8 .r.:: .c: en en 0 £ s og oBg S -ËjS g ° ° go OBSERVATIONS f-d f -«1 ° o S 5" O ri Ori0, g ~~)~ g U S g g 0 985 0 14 615 370 196 38 19,4 Microbes normaux. 15 211 774 371 71 19,1 Microbes normaux. 17 0 985 473 84 17,8 Microbes normaux. 10 0 985 451 78 17,3 Quelques spores internes. 24 0 985 401 62 13,5 Nombreuses spores internes. 38 0 985 201 7,3 3,6 Spores libres. Nota. Les chiffres sont exprimés en milligrammes pour 100 ml de milieu. La synthèse des polyosides se poursuit donc jusqu'à l'épuisement du glucose, puis le taux de ces produits diminue à partir de la phase stationnaire jusqu'à devenir pratiquement nul lorsque la culture est sporulée. Cette expérience indique la disparition des polyosides à l'intérieur des corps microbiens après l'épuisement du glucose, mais elle ne renseigne pas sur leur devenir : diffusent-ils dans le
S -ËjS g ° ° go OBSERVATIONS f-d f -«1 ° o S 5" O ri Ori0, g ~~)~ g U S g g 0 985 0 14 615 370 196 38 19,4 Microbes normaux. 15 211 774 371 71 19,1 Microbes normaux. 17 0 985 473 84 17,8 Microbes normaux. 10 0 985 451 78 17,3 Quelques spores internes. 24 0 985 401 62 13,5 Nombreuses spores internes. 38 0 985 201 7,3 3,6 Spores libres. Nota. Les chiffres sont exprimés en milligrammes pour 100 ml de milieu. La synthèse des polyosides se poursuit donc jusqu'à l'épuisement du glucose, puis le taux de ces produits diminue à partir de la phase stationnaire jusqu'à devenir pratiquement nul lorsque la culture est sporulée. Cette expérience indique la disparition des polyosides à l'intérieur des corps microbiens après l'épuisement du glucose, mais elle ne renseigne pas sur leur devenir : diffusent-ils dans le milieu en substance, sous forme de sucres réducteurs, ou bien sont-ils plus fortement métabolisés ? On ne pouvait guère songer à suivre la disparition des polyosides en faisant des analyses au cours d'une expérience semblable à la précédente, puisqu'il est impossible de déterminer le moment précis où tout le glucose est consommé. Aussi avons-nous employé l'artifice suivant : le contenu de 5 flacons d'Erlenmeyer, correspondant environ à 1 200 mg de matière sèche, est centrifugé stérilement, puis les microbes sont remis en suspension dans 250 ml de milieu S non glucosé stérile dans un flacon d'Erlenmeyer de 3 l qu'on fixe aussitôt sur l'agitateur à l'étuve. Les bactéries sont ainsi placées dans des conditions voisines de celles où elles se trouvent en fin de culture lorsque le glucose joue le rôle de facteur limitant. En prélevant toutes les heures des parties aliquotes, on dose, dans le culot microbien, le polyoside total restant, dans le liquide le polyoside qui aurait pu diffuser et les sucres réducteurs. En ramenant le poids sec au départ à 100 mg, on obtient les résultats suivants : TABLEAU VI. SUCRES POLYOSIDE POLYOSIDE TEMPS MATIÈRE réducteurs p. 100 de en heures sèche dans dans dans la matière
est consommé. Aussi avons-nous employé l'artifice suivant : le contenu de 5 flacons d'Erlenmeyer, correspondant environ à 1 200 mg de matière sèche, est centrifugé stérilement, puis les microbes sont remis en suspension dans 250 ml de milieu S non glucosé stérile dans un flacon d'Erlenmeyer de 3 l qu'on fixe aussitôt sur l'agitateur à l'étuve. Les bactéries sont ainsi placées dans des conditions voisines de celles où elles se trouvent en fin de culture lorsque le glucose joue le rôle de facteur limitant. En prélevant toutes les heures des parties aliquotes, on dose, dans le culot microbien, le polyoside total restant, dans le liquide le polyoside qui aurait pu diffuser et les sucres réducteurs. En ramenant le poids sec au départ à 100 mg, on obtient les résultats suivants : TABLEAU VI. SUCRES POLYOSIDE POLYOSIDE TEMPS MATIÈRE réducteurs p. 100 de en heures sèche dans dans dans la matière le liquide le liquide les microbes sèche 0 100 0 9 19,1 19,1 f 95 0 0 18,4 19,4 2 87 0 0 16,7 19,2 3 79 0 0 14,7 18,6 5 70 0 0 12,3 17,6 6 65 0 0 10,7 16,5 22 45 0 0,9 1,8 4,0 Les microbes ne varient guère morphologiquement jusqu'à la troisième heure ; à la cinquième apparaissent quelques spores internes, plus nombreuses à la sixième. A la vingt-deuxième le milieu contient presque uniquement des spores libres. La quantité totale de polyoside décroît régulièrement. Comme il n'apparaît dans le milieu ni sucres réducteurs, ni polyoside, c'est que les constituants glucidiques sont fortement métabolisés. Si l'on essaie de cultiver B. megatherium sur le milieu S en lui fournissant comme substrat carboné soit le polyoside capsulaire, soit l'une ou l'autre fraction du polyoside II, on observe un développement nul avec le polyoside capsulaire, et une très bonne culture avec le polyoside II. Le polyoside capsulaire ne pouvant servir d'aliment, il est difficile de savoir à quoi correspond sa métabolisation en fin de culture. Le glycogène, en revanche, peut être considéré comme une réserve conservée intacte tant qu'il reste du glucose dans le milieu, mais utilisée pendant
microbes ne varient guère morphologiquement jusqu'à la troisième heure ; à la cinquième apparaissent quelques spores internes, plus nombreuses à la sixième. A la vingt-deuxième le milieu contient presque uniquement des spores libres. La quantité totale de polyoside décroît régulièrement. Comme il n'apparaît dans le milieu ni sucres réducteurs, ni polyoside, c'est que les constituants glucidiques sont fortement métabolisés. Si l'on essaie de cultiver B. megatherium sur le milieu S en lui fournissant comme substrat carboné soit le polyoside capsulaire, soit l'une ou l'autre fraction du polyoside II, on observe un développement nul avec le polyoside capsulaire, et une très bonne culture avec le polyoside II. Le polyoside capsulaire ne pouvant servir d'aliment, il est difficile de savoir à quoi correspond sa métabolisation en fin de culture. Le glycogène, en revanche, peut être considéré comme une réserve conservée intacte tant qu'il reste du glucose dans le milieu, mais utilisée pendant et après la phase stationnaire, alors que les microbes se trouvent dans les conditions de vie végétative précédant la sporulation. Résumé. Nous avons extrait, des bactéries cultivées en présence de glucose, deux types de polyosides : l'un extractible à l'eau bouillante, de nature capsulaire, formé de glucose et de galactose et dont le taux représente 6,7 p. 100 du poids sec microbien, l'autre extractible en solution alcaline à chaud, de type glycogénique et dont le taux représente 12,3 p. 100 du poids sec. De nombreux facteurs influent sur le métabolisme des polyosides : en particulier la nature de l'aliment carboné, la nature du substrat, le stade et les conditions de développement. La connaissance de la nature et du taux des principaux constituants de la cellule, en moyenne 20 p. 100 de glucides (C6H12O6) n, 30 p. 100 de lipides (C4H62O2) n, 50 p. 100 de protides et de cendres, et les résultats généraux relatifs à la physiologie des polyosides et du lipide, permettent maintenant d'étudier le rendement matériel de croissance. C'est ce qui fera l'objet de prochaines notes. BIBLIOGRAPHIE [1] J.-P. AUBERT. C. R. Acad. Sci., 1949, 229, 477. [2] J.-P. AUBERT et J. MILLET. Ces Annales, 1950, 79, 468.