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souvent négatives); dans des biopsies tissulaires diverses (métastases cutanées, cérébrales, rénales, osseuses); par écouvillonnage de divers sites (nez, conduit auditif). Le prélèvement doit être adressé tout de suite au laboratoire. En cas d’empêchement, il peut être conservé 24 h à +4°C. Il convient de préciser le diagnostic suspecté sur le bon de demande, les éléments cliniques, et si le prélèvement doit faire l’objet d’une analyse histologique et mycologique (dans ce dernier cas ne jamais utiliser de fixateurs). Examen direct Il se fait par examen microscopique d’une lame de verre à partir du culot de centrifugation d’un LBA, d’une apposition de biopsie ou d’un étalement que l’on peut éventuellement colorer au Gram. En pratique, le diagnostic de présomption repose sur la mise en évidence à l’examen direct de filaments mycéliens hyalins. Les hyphes sont très ramifiés (aspect en brosse), à angles aigus et leur largeur est de 2,5 à 5 µ. Exceptionnellement peut être mise en évidence la structure morphologique caractéristique des Aspergillus (tête) dans les produits pathologiques. L’examen direct, (au mieux avec un fluorochrome tel que le calcofluor), est toujours nécessaire pour donner une réponse immédiate au clinicien. Autre avantage, si la culture est positive secondairement, le risque qu’il s’agisse d’une contamination devient minime. Cependant, cette dernière est incontournable car la présence de filaments dans un prélèvement ou une biopsie ne signe pas automatiquement la nature aspergillaire de ceux-ci. Ensemencement Le matériel prélevé est ensemencé sur tube Sabouraud additionné d’antibiotiques ou sur milieu plus spécifique. Deux milieux de culture de référence sont actuellement recommandés pour l’identification des Aspergillus : le MEA (Malt Extract Agar) et le CYA (Czapek Yeast Agar) (milieux au malt). Dans tous les cas, on vérifie l’absence d’inhibiteurs. L’écouvillon y est déchargé en une strie centrale et les biopsies (coupées), culots ou suppurations, simplement déposés sur la gélose. Bien que les Aspergillus soient peu exigeants et croissent rapidement, l’ensemencement doit être rapide pour l’écouvillon (risque de dessication). Il est impératif d’avoir une série de milieux d’ensemencements chez un même fournisseur pour éviter de trop grandes variations morphologiques suivant sa composition. On placera les tubes à l’étuve à
d’une contamination devient minime. Cependant, cette dernière est incontournable car la présence de filaments dans un prélèvement ou une biopsie ne signe pas automatiquement la nature aspergillaire de ceux-ci. Ensemencement Le matériel prélevé est ensemencé sur tube Sabouraud additionné d’antibiotiques ou sur milieu plus spécifique. Deux milieux de culture de référence sont actuellement recommandés pour l’identification des Aspergillus : le MEA (Malt Extract Agar) et le CYA (Czapek Yeast Agar) (milieux au malt). Dans tous les cas, on vérifie l’absence d’inhibiteurs. L’écouvillon y est déchargé en une strie centrale et les biopsies (coupées), culots ou suppurations, simplement déposés sur la gélose. Bien que les Aspergillus soient peu exigeants et croissent rapidement, l’ensemencement doit être rapide pour l’écouvillon (risque de dessication). Il est impératif d’avoir une série de milieux d’ensemencements chez un même fournisseur pour éviter de trop grandes variations morphologiques suivant sa composition. On placera les tubes à l’étuve à 25°C 37°C pendant au moins 1 semaine. L’absence de croissance après 15 jours permet d’éliminer la présence d’Aspergillus dans le prélèvement. Les hémocultures seront également conservées 15 jours. Culture La culture est une étape indispensable pour l’identification du genre et de l’espèce. La majorité des Aspergillus pousse très bien sur milieu de Sabouraud. La culture est obtenue en 48h et la production de têtes aspergillaires entre 3 et 5 jours suivant les milieux utilisés. L’incubation se fait à 25°C et 37°C pendant 5 à 7 jours. La croissance des Aspergillus est en général rapide à 25°C. L’aptitude à se développer à 37°C est un caractère important en pathologie. Les colonies d’Aspergillus sont colorées, caractère primordial pour l’identification. Leur texture poudreuse à granuleuse dépend de l’organisation des têtes et de la production abondante des conidies qui donnent la couleur à la colonie. La présence de cléistothèces, petites boules colorées visibles à l’œil nu, témoigne de la reproduction de type sexué. Les clés d’identification sont basées en premier lieu sur la couleur macroscopique des colonies (verte, brune, ocre-jaune, blanche ou noire), puis au microscope sur la morphologie des têtes, unisériées (phialides portées directement sur le renflement), bisériées (phialides avec couche de métules)
milieu de Sabouraud. La culture est obtenue en 48h et la production de têtes aspergillaires entre 3 et 5 jours suivant les milieux utilisés. L’incubation se fait à 25°C et 37°C pendant 5 à 7 jours. La croissance des Aspergillus est en général rapide à 25°C. L’aptitude à se développer à 37°C est un caractère important en pathologie. Les colonies d’Aspergillus sont colorées, caractère primordial pour l’identification. Leur texture poudreuse à granuleuse dépend de l’organisation des têtes et de la production abondante des conidies qui donnent la couleur à la colonie. La présence de cléistothèces, petites boules colorées visibles à l’œil nu, témoigne de la reproduction de type sexué. Les clés d’identification sont basées en premier lieu sur la couleur macroscopique des colonies (verte, brune, ocre-jaune, blanche ou noire), puis au microscope sur la morphologie des têtes, unisériées (phialides portées directement sur le renflement), bisériées (phialides avec couche de métules) ou mixtes. Ensuite viennent des caractères plus fins tels que la forme et la taille des vésicules, la disposition des phialides à leur surface, la taille et l’ornementation des stipes et des conidies. L’optimum thermique et la production de pigments et d’exsudats viennent compléter les clés. L’aspect microscopique peut être précisé en effilochant la culture à l’aide d’un écouvillon en coton ou en appuyant un morceau de scotch tenu avec la pince et placé ensuite dans une goutte de bleu de lactophénol entre lame et lamelle. L’observation se fait au X40 en faisant varier la réfringence grâce au condenseur eu microscope. Identification des espèces importantes en mycologie médicale : A. flavus (Fig. 6-8) Colonies vert-jaune, revers incolore à blanc rosé parfois foncé. Têtes conidiennes radiées de 300 à 400 p. La tête présente des rayons sur tout le tour de la vésicule qui est sphérique. Phialides seules ou portées par des métules. Conidies hyalines, rondes à piriformes, échinulées de 3,5 à 4,5 p. A. fumigatus (Fig. 9) Croissance très rapide à 37°C, possible à 50°C. Colonies blanches à vertes, puis d’un vert foncé à gris noirâtre. Revers incolore puis beige à rouge. Vésicule en massue. Phialides directement portées par la
précisé en effilochant la culture à l’aide d’un écouvillon en coton ou en appuyant un morceau de scotch tenu avec la pince et placé ensuite dans une goutte de bleu de lactophénol entre lame et lamelle. L’observation se fait au X40 en faisant varier la réfringence grâce au condenseur eu microscope. Identification des espèces importantes en mycologie médicale : A. flavus (Fig. 6-8) Colonies vert-jaune, revers incolore à blanc rosé parfois foncé. Têtes conidiennes radiées de 300 à 400 p. La tête présente des rayons sur tout le tour de la vésicule qui est sphérique. Phialides seules ou portées par des métules. Conidies hyalines, rondes à piriformes, échinulées de 3,5 à 4,5 p. A. fumigatus (Fig. 9) Croissance très rapide à 37°C, possible à 50°C. Colonies blanches à vertes, puis d’un vert foncé à gris noirâtre. Revers incolore puis beige à rouge. Vésicule en massue. Phialides directement portées par la vésicule (unisériées), présentes sur les 2/3 du sommet. Conidies rondes vertes et échinulées de 2,5 à 3 µ de diamètre. Elles sont en chaîne et parallèles à l’axe du conidiophore. A. nidulans (Fig. 10-12) Colonies vertes, jaunâtres pour les souches formant des cleistothèces. Revers rougeâtre. Têtes conidiennes en colonne, vésicule sphérique, phialides portées par des métules et situées sur la partie supérieure de la vésicule. Conidies rondes, vertes, échinulées de 3 à 3,5 m. A. niger (Fig. 13, 14) Colonies poudreuses noires. Revers incolore ou jaunâtre. Têtes conidiennes radiées et bisériées de couleur noire. Stipes (pieds) épais, lisses et incolores. Vésicules sphériques, phialides portées par des métules sur tout le pourtour. Conidies noires et rondes, échinulées, de 4 à 5 m. A. terreus (Fig. 15-17) Colonies duveteuses parfois crevassées, beiges à brun foncé, revers jaune à brun. Vésicule sphérique, globuleuse avec des phialides bisériées sur la partie supérieure. Les conidies sont petites (1,5 m) et d'aspect elliptique. Le diagnostic de l'aspergillose pulmonaire répond à un faisceau d'arguments retenus par Morin et Germaud. Présence de filaments mycéliens septés aux examens microscopiques des prélèvements pulmonaires (fibroscopie) et cultures positives sur chaque milieu ensemencé dans un délai < 4 jours (excepté si le
sphérique, phialides portées par des métules et situées sur la partie supérieure de la vésicule. Conidies rondes, vertes, échinulées de 3 à 3,5 m. A. niger (Fig. 13, 14) Colonies poudreuses noires. Revers incolore ou jaunâtre. Têtes conidiennes radiées et bisériées de couleur noire. Stipes (pieds) épais, lisses et incolores. Vésicules sphériques, phialides portées par des métules sur tout le pourtour. Conidies noires et rondes, échinulées, de 4 à 5 m. A. terreus (Fig. 15-17) Colonies duveteuses parfois crevassées, beiges à brun foncé, revers jaune à brun. Vésicule sphérique, globuleuse avec des phialides bisériées sur la partie supérieure. Les conidies sont petites (1,5 m) et d'aspect elliptique. Le diagnostic de l'aspergillose pulmonaire répond à un faisceau d'arguments retenus par Morin et Germaud. Présence de filaments mycéliens septés aux examens microscopiques des prélèvements pulmonaires (fibroscopie) et cultures positives sur chaque milieu ensemencé dans un délai < 4 jours (excepté si le malade est déjà traité par amphotéricine B). L'interprétation des hémocultures qui sont le plus souvent négatives est très délicate et fait également appel à des critères. Les critères de positivité de Denning : certaine : présence d'Aspergillus dans l'hémoculture avec présence de filaments à l'histologie ou d'une culture positive sur prélèvement profond; probable: présence d'Aspergillus dans l'hémoculture avec signes cliniques évocateurs de fongémie aspergillaire sans autre agent pathogène isolé; contamination: présence d'Aspergillus dans l'hémoculture sans terrain prédisposant ou sans clinique évocatrice, sans autre prélèvement positif et/ou présence d'Aspergillus dans le laboratoire. Figure 18 Diagnostic histologique de l'aspergillose-présence de filament (Coll Dr Arborio). Figure 19 Diagnostic histologique de l'aspergillose-présence de filaments (Coll Dr Arborio). Figure 20 Aspect histologique d'aspergillome (Coll Dr Arborio). Diagnostic histologique Le diagnostic d'aspergillose est rarement le fait du seul examen anatomo pathologique, reposant le plus souvent sur la clinique et la culture. Cependant, l'aspect histologique est suffisamment caractéristique pour permettre le diagnostic de genre. Le prélèvement adressé au laboratoire d'anatomie pathologique est fixé dans du formol tamponné à 10%. Puis après un temps de fixation adapté, généralement 24 heures, les colorations trichromiques usuelles (hématéine éosine safran ou H.E.S) suffisent à assurer le diagnostic. On peut s'aider de
prélèvement profond; probable: présence d'Aspergillus dans l'hémoculture avec signes cliniques évocateurs de fongémie aspergillaire sans autre agent pathogène isolé; contamination: présence d'Aspergillus dans l'hémoculture sans terrain prédisposant ou sans clinique évocatrice, sans autre prélèvement positif et/ou présence d'Aspergillus dans le laboratoire. Figure 18 Diagnostic histologique de l'aspergillose-présence de filament (Coll Dr Arborio). Figure 19 Diagnostic histologique de l'aspergillose-présence de filaments (Coll Dr Arborio). Figure 20 Aspect histologique d'aspergillome (Coll Dr Arborio). Diagnostic histologique Le diagnostic d'aspergillose est rarement le fait du seul examen anatomo pathologique, reposant le plus souvent sur la clinique et la culture. Cependant, l'aspect histologique est suffisamment caractéristique pour permettre le diagnostic de genre. Le prélèvement adressé au laboratoire d'anatomie pathologique est fixé dans du formol tamponné à 10%. Puis après un temps de fixation adapté, généralement 24 heures, les colorations trichromiques usuelles (hématéine éosine safran ou H.E.S) suffisent à assurer le diagnostic. On peut s'aider de colorations habituelles en pathologie infectieuse (Gomori Grocott ou encore le P.A.S.) qui colorent les parois du champignon. Histologiquement, le diagnostic est évocateur lorsqu'on met en évidence la présence de filaments hyalins cloisonnés, ramifiés, de diamètre constant, avec des têtes aspergillaires (caractéristiques). Les filaments mycéliens apparaissent septés, rayonnant, formant des angles de 45°. Il existe volontiers une nécrose associée entourée de polynucléaires et lymphocytes (Fig. 18, Fig. 19). L'aspergillome correspond à un amas presque exclusif de germes enchevêtrés et vésiculeux (Fig. 20), où se mêlent parfois quelques cellules géantes. Il est volontiers de localisation nasale. Dans les cas douteux, sont disponibles actuellement des anticorps spécifiques d'espèce utilisables en immuno-histochimie (immunofluorescence plutôt qu'en immunoperoxydase). Des techniques d'hybridation fluorescence in situ (FISH) ont déjà été appliquées à l'identification d'Aspergillus dans les tissus. Aspects immunologiques Pour améliorer le diagnostic dans l'aspergillose invasive, la recherche de galactomannane, antigène sécrété en grande quantité par Aspergillus (et Penicillium), au niveau du sérum par une technique ELISA-sandwich a été récemment proposée et commercialisée. Ce test à une sensibilité de 70 à 100% suivant les équipes, mais avec un taux de faux positifs de 5 à 15% particulièrement élevé dans les urines. Une positivité est donc à confirmer sur
de 45°. Il existe volontiers une nécrose associée entourée de polynucléaires et lymphocytes (Fig. 18, Fig. 19). L'aspergillome correspond à un amas presque exclusif de germes enchevêtrés et vésiculeux (Fig. 20), où se mêlent parfois quelques cellules géantes. Il est volontiers de localisation nasale. Dans les cas douteux, sont disponibles actuellement des anticorps spécifiques d'espèce utilisables en immuno-histochimie (immunofluorescence plutôt qu'en immunoperoxydase). Des techniques d'hybridation fluorescence in situ (FISH) ont déjà été appliquées à l'identification d'Aspergillus dans les tissus. Aspects immunologiques Pour améliorer le diagnostic dans l'aspergillose invasive, la recherche de galactomannane, antigène sécrété en grande quantité par Aspergillus (et Penicillium), au niveau du sérum par une technique ELISA-sandwich a été récemment proposée et commercialisée. Ce test à une sensibilité de 70 à 100% suivant les équipes, mais avec un taux de faux positifs de 5 à 15% particulièrement élevé dans les urines. Une positivité est donc à confirmer sur un deuxième prélèvement. À l'inverse, en aucun cas un résultat négatif ne permet d'éliminer le diagnostic d'aspergillose invasive. Les résultats étant quantitatifs en relation avec la charge fongique, il est possible de suivre l'évolution sous traitement avec des prélèvements bi-hebdomadaires. La positivité de l'antigénémie anticipe souvent l'isolement du champignon. Les tests sérologiques (Aspergillose invasive) sont à interpréter avec une grande prudence, pour plusieurs raisons : la plupart des malades présentant une aspergillose invasive sont immunodéprimés, beaucoup de sujets indemnes présentent des anticorps anti-aspergillaires (inhalation fréquente de spores) et un test de haute sensibilité (ELISA) les détecte. Il existe des réactions croisées entre les différentes espèces d'Aspergillus, enfin, la sérologie peut rester positive 6 mois après l'infection. En pratique sont utilisées des techniques d'immunodiffusion (recherche de lignes de précipitation), ou ELISA. Lors de l'exploration des manifestations allergiques sont demandées la recherche d'IgE spécifiques anti-aspergillaires. Envoi aux laboratoires spécialisés L'identification précise fait souvent appel aux laboratoires spécialisés : Centre National de Référence des Mycoses et des Antifongiques/Institut Pasteur, Unité des Aspergillus (JP Latgé), 25-28 rue du Dr Roux 75724 Paris Cedex 15, Tel : 01 45 68 83 55. Recherche fondamentale Les techniques de biologie moléculaire sont actuellement en cours de développement
tests sérologiques (Aspergillose invasive) sont à interpréter avec une grande prudence, pour plusieurs raisons : la plupart des malades présentant une aspergillose invasive sont immunodéprimés, beaucoup de sujets indemnes présentent des anticorps anti-aspergillaires (inhalation fréquente de spores) et un test de haute sensibilité (ELISA) les détecte. Il existe des réactions croisées entre les différentes espèces d'Aspergillus, enfin, la sérologie peut rester positive 6 mois après l'infection. En pratique sont utilisées des techniques d'immunodiffusion (recherche de lignes de précipitation), ou ELISA. Lors de l'exploration des manifestations allergiques sont demandées la recherche d'IgE spécifiques anti-aspergillaires. Envoi aux laboratoires spécialisés L'identification précise fait souvent appel aux laboratoires spécialisés : Centre National de Référence des Mycoses et des Antifongiques/Institut Pasteur, Unité des Aspergillus (JP Latgé), 25-28 rue du Dr Roux 75724 Paris Cedex 15, Tel : 01 45 68 83 55. Recherche fondamentale Les techniques de biologie moléculaire sont actuellement en cours de développement dans les laboratoires de référence et semblent intéressantes chez les immunodéprimés. Elles permettent une identification précise du genre ou de l'espèce à partir d'ADN extrait de tissus puis amplifié. On distingue les méthodes d'hybridation par des sondes spécifiques, les méthodes de PCR nichée (nested PCR) ou de séquençage direct qui sont sans aucun doute des méthodes d'avenir dans le domaine de la mycologie. Le typage moléculaire peut être un complément de choix dans l'identification, rapide, fiable, et objectif car indépendant de l'expérience de l'observateur. Traitement Le taux de mortalité classiquement élevé (> 50%) de l'aspergillose invasive résulte tant du fréquent retard de diagnostic que de l'efficacité variable des antifongiques in vivo. L'amphotéricine B (Fungizone®) reste le traitement de référence ; la posologie est de 1 à 1,5 mg/kg/j en perfusion de 4 à 6 heures pour une dose totale de 1,5 à 4 g sur une période d'au moins deux semaines. Les formes liposomales (Ambisome®, Abelcet®) sont moins néphrotoxiques et utilisées à raison de 3 à 5 mg/kg/j. L'alternative est constituée par l'itraconazole (Sporanox®) à une dose de 400 à 600 mg/j et désormais le voriconazole (Vfend® 6 mg/kg/12h le premier jour puis 4 mg/kg/12h/quelques jours puis) et/ou la caspofungine
sont sans aucun doute des méthodes d'avenir dans le domaine de la mycologie. Le typage moléculaire peut être un complément de choix dans l'identification, rapide, fiable, et objectif car indépendant de l'expérience de l'observateur. Traitement Le taux de mortalité classiquement élevé (> 50%) de l'aspergillose invasive résulte tant du fréquent retard de diagnostic que de l'efficacité variable des antifongiques in vivo. L'amphotéricine B (Fungizone®) reste le traitement de référence ; la posologie est de 1 à 1,5 mg/kg/j en perfusion de 4 à 6 heures pour une dose totale de 1,5 à 4 g sur une période d'au moins deux semaines. Les formes liposomales (Ambisome®, Abelcet®) sont moins néphrotoxiques et utilisées à raison de 3 à 5 mg/kg/j. L'alternative est constituée par l'itraconazole (Sporanox®) à une dose de 400 à 600 mg/j et désormais le voriconazole (Vfend® 6 mg/kg/12h le premier jour puis 4 mg/kg/12h/quelques jours puis) et/ou la caspofungine (70 mg le premier jour puis 50 mg/j en perfusion intra-veineuse les jours suivants). Les localisations aspergillaires cérébrales, cardiaques ou rhinosinusiennes bénéficient généralement d'une approche médico-chirurgicale, ainsi que les atteintes pulmonaires à haut risque vasculaire hémorragique. Les méthodes prophylactiques demeurent fondamentales pour les malades souffrant d'hémopathies malignes et devant bénéficier d'une greffe de moelle osseuse ; elles comportent surtout des mesures de filtration d'air avec ou sans flux laminaire. L'utilisation de thérapeutiques antifongiques à visée préventive n'est pas encore standardisée pour l'aspergillose. Remerciements -Les auteurs remercient les Docteurs Bonnet (pneumologie, HIA Laveran), Belliot (radiologie, HIA Laveran) pour l'iconographie radiologique. EnÉEEMBB~ * KLICH MA, PITT JI A laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs. CSIRO ed, North Ryde, Australia. 1988. * LATGÉ JP -The pathobiology of Aspergillus fumigatus. Trends in Microbiol 2001 ; 9 : 382-389. * MORIN O, GERMAUD P L'aspergillose pulmonaire invasive. Rev Prat 1989 ; 39 : 1669-1674. * DENNING DW Aspergillose invasive au cours du sida. Revue générale. J Mycol Med 1992 ; 2 : 35-41. * DAVIES SF Fungal pneumonia. Med Clin N Amer 1994 ; 78: 1049-1065. * DENNING DW, STEVENS DA Antifungal and surgical treatment of invasive aspergillosis: review of 2121 published
d'une greffe de moelle osseuse ; elles comportent surtout des mesures de filtration d'air avec ou sans flux laminaire. L'utilisation de thérapeutiques antifongiques à visée préventive n'est pas encore standardisée pour l'aspergillose. Remerciements -Les auteurs remercient les Docteurs Bonnet (pneumologie, HIA Laveran), Belliot (radiologie, HIA Laveran) pour l'iconographie radiologique. EnÉEEMBB~ * KLICH MA, PITT JI A laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs. CSIRO ed, North Ryde, Australia. 1988. * LATGÉ JP -The pathobiology of Aspergillus fumigatus. Trends in Microbiol 2001 ; 9 : 382-389. * MORIN O, GERMAUD P L'aspergillose pulmonaire invasive. Rev Prat 1989 ; 39 : 1669-1674. * DENNING DW Aspergillose invasive au cours du sida. Revue générale. J Mycol Med 1992 ; 2 : 35-41. * DAVIES SF Fungal pneumonia. Med Clin N Amer 1994 ; 78: 1049-1065. * DENNING DW, STEVENS DA Antifungal and surgical treatment of invasive aspergillosis: review of 2121 published cases. Rev Infect Dis 1990; 12: 1147-1201. * BOHLER K, METZE D, POITSCHEK C, JURECKA W Cutaneous aspergillosis. Clin Exp Dermatol 1990 ; 15 : 6, 446-50. * CORNET M, FLEURY L, MASLO C et Coll Epidemiology of invasive aspergillosis in France : a six-year multicentric survey in the greater Paris area. J Hosp Infect 2002; 51 288-296. * DEL GIUDICE P, MOULONGUET L, RANCHIN B et Coll Cutaneous aspergillosis invasion from sinusitis. Clin Infect Dis 1999 ; 29 : 690-691. * GREENBERGER PA Allergie bronchopulmonaire aspergillosis. J Allergy Clin Immunol 2002 ; 110: 685-692. * HERBRECHT R, DENNING DW, PATTERSON TF, BENNETT JE Voriconazole versus amphotericin B for primary therapy of invasive aspergillosis. N Engl J Med 2002 ; 347 : 408-415. * PEREA S, PATTERSON TF Invasive aspergillosis in hematologic malignancy patients. Semin Respir Infect 2002: 17 99-105. * PHILIPPE B. LATGÉ JP Aspergillose chez l'immunodéprimé. Med Thérapeutique 2000; 6 : 442-449. * SOUBANI AO, CHANDRASEKAR PH The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Chest 2002; 121 1988-1999. * TIENDREBEOGO H. SANGARE SI, ROUDAUT M et Coll Un cas d'aspergillose pulmonaire en Côte d'Ivoire. Med Trop 1982; 42 : 47-52. Médecine tropicale et parasitologie Wallace Peters et Geoffroy Pasvol