jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
appareillage est adapté par l’adjonction de filtres de manière à reproduire fidèlement le spectre lumineux naturel. Pour les irradiations UVA, une lampe haute pression (Tecimax — Verre et Quartz — Dixwell France ou UVAsun Mutzhas — Allemagne) émettant électivement dans l’UVAl (340 à 450 nm avec une émission maximale à 365 nm) a été utilisée. Enfin les irradiations UVB ont été faites avec un appareil Biotronic (Vilbert Lourmat — France) équipé de tubes fluorescents de 40 watts émettant entre 280 et 320 nm avec un pic d’émission à 312 nm. Les doses lumineuses reçues par les cellules ont été mesurées à chaque expérience avec un photomètre calibré. Techniques d’analyse Mesures de viabilité des cellules La viabilité cellulaire a été évaluée : par la méthode colorimétrique au tétrazolinum (dit méthode au MTT) décrite par Mossman [7] ; par la mesure de la capacité d’adhérence-prolifération. Le nombre de cellules adhérentes est déterminé par dosage des protéines cellulaires totales selon la méthode de Shopsis et MacKay [8] ; les résultats sont exprimés en pourcentage de survie ou de cytotoxicité par rapport aux cellules non irradiées. Peroxydation lipidique Les lipides insaturés, constituants principaux de la membrane cellulaire, sont une cible préférentielle de l’attaque radicalaire en raison de la présence de leur double liaison. Sous l’effet initiateur d’une ERO, ces lipides insaturés subissent une cascade de réactions radicalaires connue sous le nom de péroxydation lipidique. La phase finale est la formation de produits stables qui sont des aldéhydes. Le malondialdéhyde (MDA) est le produit final de cette oxydation lipidique le plus connu. Il est de ce fait le plus utilisé comme marqueur de la péroxydation lipidique. Sa mesure repose sur une technique fluorométrique qui utilise la réaction du MDA avec l’acide thiobarbiturique (TBA) (Sobiok Kit — Grenoble — France) [9], En fait, cette réaction mesure en même temps que le MDA d’autres substances qui réagissent avec le TBA et il est préférable de parler de mesure des TBARs (produits réactifs à la TBA) plutôt que de mesure du MDA. Analyse des dommages photo-induits à l’ADN Une cible biologique privilégiée pour les ERO est l'ADN qui
en raison de la présence de leur double liaison. Sous l’effet initiateur d’une ERO, ces lipides insaturés subissent une cascade de réactions radicalaires connue sous le nom de péroxydation lipidique. La phase finale est la formation de produits stables qui sont des aldéhydes. Le malondialdéhyde (MDA) est le produit final de cette oxydation lipidique le plus connu. Il est de ce fait le plus utilisé comme marqueur de la péroxydation lipidique. Sa mesure repose sur une technique fluorométrique qui utilise la réaction du MDA avec l’acide thiobarbiturique (TBA) (Sobiok Kit — Grenoble — France) [9], En fait, cette réaction mesure en même temps que le MDA d’autres substances qui réagissent avec le TBA et il est préférable de parler de mesure des TBARs (produits réactifs à la TBA) plutôt que de mesure du MDA. Analyse des dommages photo-induits à l’ADN Une cible biologique privilégiée pour les ERO est l'ADN qui subit des oxydations de bases, des pontages nucléobases-protéines, des ruptures de chaînes. Détermination des cassures de brins de l’ADN La perte de la configuration en double hélice de l’ADN peut servir à qualifier les altérations causées à l’ADN du type de celles que peut provoquer une exposition aux UV. Les cassures de brins d’ADN (strand breaks) constituent un dommage oxydatif typique ; elles sont préférentiellement induites par le radical hydroxyle et l’oxygène singulet. Il a été démontré que les cassures de brins sont responsables d’une augmentation du déroulement de l’ADN ; le taux de déroulement de l’ADN peut dès lors être utilisé comme une mesure sensible des cassures de brins. La détermination des strand breaks a donc été faite en utilisant la méthode décrite par Birnboim et Jevcak, Cette méthode évalue le degré d’ADN en double brin par la mesure de la liaison à un colorant fluorescent, le bromure d’éthidium ; la mesure utilise un spectromètre à fluorescence. Les strand breaks sont détectés après exposition des lysats cellulaires à des solutions alcalines. Le pourcentage de DNA en double brin (D) est déterminé par l’équation % D = 100 x (L(p)-Lb)/ (F(t)-L(p)) où F(p) est la fluorescence de l’échantillon, F(t) la
cassures de brins d’ADN (strand breaks) constituent un dommage oxydatif typique ; elles sont préférentiellement induites par le radical hydroxyle et l’oxygène singulet. Il a été démontré que les cassures de brins sont responsables d’une augmentation du déroulement de l’ADN ; le taux de déroulement de l’ADN peut dès lors être utilisé comme une mesure sensible des cassures de brins. La détermination des strand breaks a donc été faite en utilisant la méthode décrite par Birnboim et Jevcak, Cette méthode évalue le degré d’ADN en double brin par la mesure de la liaison à un colorant fluorescent, le bromure d’éthidium ; la mesure utilise un spectromètre à fluorescence. Les strand breaks sont détectés après exposition des lysats cellulaires à des solutions alcalines. Le pourcentage de DNA en double brin (D) est déterminé par l’équation % D = 100 x (L(p)-Lb)/ (F(t)-L(p)) où F(p) est la fluorescence de l’échantillon, F(t) la fluorescence maximale et F(b) la fluorescence basale. Test des comètes La technique dite des comètes ou « Single Cell Gel Electrophoresis » permet de mettre en évidence les dommages de l’ADN au sein de la cellule entière. Initialement décrite par Ostling et Johanson, cette technique simple et rapide est basée sur les propriétés de migration de l'ADN dans un champs électrique. Après électrophorèse, l’ADN est visualisé au moyen d’un marqueur fluorescent spécifique, le bromure d’éthidium. L’application d’un traitement alcalin permet en outre de mettre en évidence non seulement les coupures simples et doubles brins de l’ADN mais aussi les sites alcalis labiles, témoins d'un dégât oxydatif sur l’ADN. Après le marquage fluorescent, l’image de l’électrophorèse est celle d’une « boule » pour un ADN intact. À l’inverse, lorsque la structure de l’ADN est altérée, l’image ressemble à une comète avec, derrière la « boule » d’ADN intact, un halo en forme de tramée. Ce halo est d’autant plus étiré que l’ADN a été altéré. L’analyse de 50 noyaux, choisis au hasard sur la préparation au moyen du logiciel Komet 3.0, permet de déterminer différents critères des dommages à l’ADN. Parmi ceux-ci, nous avons retenu le « tail moment », défini
sur les propriétés de migration de l'ADN dans un champs électrique. Après électrophorèse, l’ADN est visualisé au moyen d’un marqueur fluorescent spécifique, le bromure d’éthidium. L’application d’un traitement alcalin permet en outre de mettre en évidence non seulement les coupures simples et doubles brins de l’ADN mais aussi les sites alcalis labiles, témoins d'un dégât oxydatif sur l’ADN. Après le marquage fluorescent, l’image de l’électrophorèse est celle d’une « boule » pour un ADN intact. À l’inverse, lorsque la structure de l’ADN est altérée, l’image ressemble à une comète avec, derrière la « boule » d’ADN intact, un halo en forme de tramée. Ce halo est d’autant plus étiré que l’ADN a été altéré. L’analyse de 50 noyaux, choisis au hasard sur la préparation au moyen du logiciel Komet 3.0, permet de déterminer différents critères des dommages à l’ADN. Parmi ceux-ci, nous avons retenu le « tail moment », défini comme le produit entre le pourcentage d’ADN dans la queue de la comète et la distance qui sépare le milieu de la tête du milieu de la queue de la comète. L’ADN est d’autant plus endommagé que le tail moment a une valeur élevée. Protection contre la cytotoxicité des UV Ces études ont été conduites sur fibroblastes humains en culture. L’évaluation de la cytotoxicité a été faite soit par le test au MTT soit par la mesure de la capacité d’adhérence-prolifération. L'addition de zinc au milieu de culture sous forme de chlorure de zinc (ZnCl2) protège de la cytotoxicité des UVB. Elle protège encore mieux de la cytotoxicité des UVA surtout lors d’irradiations à hautes doses d’UVAl. L’irradiation des cellules par les UVA1 induit en effet un très fort effet cytotoxique ; l’apport supplémentaire aux cellules de ZnCl2 procure une protection contre cet effet cytotoxique avec une très haute significativité (p < 0,0001). L'apport de sélénium sous forme de sélénite de sodium au milieu de culture induit la synthèse de GPX et parallèlement augmente très significativement (p < 0,0001) la résistance cellulaire à la cytotoxicité des UVA1. L'apport de 3 donneurs de cystéine, N-acétyl-cystéine ou NAC, N-acétylhomocystéine-thiolactone ou CIT, L-2-oxothiazolidine-4-carboxylate
Ces études ont été conduites sur fibroblastes humains en culture. L’évaluation de la cytotoxicité a été faite soit par le test au MTT soit par la mesure de la capacité d’adhérence-prolifération. L'addition de zinc au milieu de culture sous forme de chlorure de zinc (ZnCl2) protège de la cytotoxicité des UVB. Elle protège encore mieux de la cytotoxicité des UVA surtout lors d’irradiations à hautes doses d’UVAl. L’irradiation des cellules par les UVA1 induit en effet un très fort effet cytotoxique ; l’apport supplémentaire aux cellules de ZnCl2 procure une protection contre cet effet cytotoxique avec une très haute significativité (p < 0,0001). L'apport de sélénium sous forme de sélénite de sodium au milieu de culture induit la synthèse de GPX et parallèlement augmente très significativement (p < 0,0001) la résistance cellulaire à la cytotoxicité des UVA1. L'apport de 3 donneurs de cystéine, N-acétyl-cystéine ou NAC, N-acétylhomocystéine-thiolactone ou CIT, L-2-oxothiazolidine-4-carboxylate ou OTC induit une protection contre l’effet cytotoxique noté sur les cellules témoin non supplémentées lors d’une irradiation UVA. Cet effet protecteur est dose-dépendant et équivalent pour les trois produits lors d’irradiations à doses faible et moyenne (9 à 15 Joules/cm2). À forte dose d’UVAl (20 J/cm2), il existe en revanche une différence d’efficacité puisque l’OTC augmente le taux de cellules survivantes d’un facteur 3, le CIT d’un facteur 2, la NAC d’un facteur 1,4 comparativement aux cellules témoin irradiées et non supplémentées. L’apport simultané au milieu de survie de NAC et de sélénium conduit à une remarquable augmentation de la protection par la NAC des fibroblastes humains contre l’irradiation UVA1 (p < 0,05) à toutes les doses d’irradiation. Le même effet synergique avec le sélénium est noté pour la CIT ; en revanche, il n’existe pas pour OTC. Dans la même étude, il apparaît que l’apport de NAC ou de CIT augmente significativement le taux de glutathion réduit dans la cellule alors que l’OTC n’a pas cet effet inducteur. Protection contre la peroxydation lipidique Parallèlement à leur effet protecteur contre la cytotoxicité des UVA, le zinc et le sélénium protègent la cellule contre la peroxydation lipidique. En effet, l’élévation
revanche une différence d’efficacité puisque l’OTC augmente le taux de cellules survivantes d’un facteur 3, le CIT d’un facteur 2, la NAC d’un facteur 1,4 comparativement aux cellules témoin irradiées et non supplémentées. L’apport simultané au milieu de survie de NAC et de sélénium conduit à une remarquable augmentation de la protection par la NAC des fibroblastes humains contre l’irradiation UVA1 (p < 0,05) à toutes les doses d’irradiation. Le même effet synergique avec le sélénium est noté pour la CIT ; en revanche, il n’existe pas pour OTC. Dans la même étude, il apparaît que l’apport de NAC ou de CIT augmente significativement le taux de glutathion réduit dans la cellule alors que l’OTC n’a pas cet effet inducteur. Protection contre la peroxydation lipidique Parallèlement à leur effet protecteur contre la cytotoxicité des UVA, le zinc et le sélénium protègent la cellule contre la peroxydation lipidique. En effet, l’élévation du taux de TBARS mesurée dans le surnageant des fibroblastes humains irradiés par UVA1 et non supplémentés est réduite significativement (p = 0,05) par l’apport supplémentaire de sélénium au milieu de culture et très significativement (p = 0,008) par celui de zinc. Protection contre les dommages à l’ADN Les analyses des dégâts génomiques ont été faites immédiatement après l’irradiation et la cinétique de réparation spontanée après irradiation n’a pas été explorée dans les présents travaux. Effet du zinc sur l'intégrité de l'ADN après irradiation UVB Des kératinocytes HaCat ont été soit privés de zinc par addition du TPEN au milieu de culture, soit au contraire supplémentés en chlorure de zinc avant d’être soumis à une irradiation UVB. Les dommages à l’ADN ont alors été évalués par la mesure des strand breaks. Le traitement des cellules avec le TPEN majore le taux de dommages à l’ADN induits par les UVB alors qu’à l’inverse la supplémentation en ZnCl2 réduit significativement l’élévation du taux de strand breaks induite par l’irradiation UVB. Effet du zinc, du sélénium et de la NAC sur les dégâts à l'ADN induits par les UVA1 L’addition de ZnCl2 au milieu de culture de fibroblastes humains réduit significativement le taux
des dégâts génomiques ont été faites immédiatement après l’irradiation et la cinétique de réparation spontanée après irradiation n’a pas été explorée dans les présents travaux. Effet du zinc sur l'intégrité de l'ADN après irradiation UVB Des kératinocytes HaCat ont été soit privés de zinc par addition du TPEN au milieu de culture, soit au contraire supplémentés en chlorure de zinc avant d’être soumis à une irradiation UVB. Les dommages à l’ADN ont alors été évalués par la mesure des strand breaks. Le traitement des cellules avec le TPEN majore le taux de dommages à l’ADN induits par les UVB alors qu’à l’inverse la supplémentation en ZnCl2 réduit significativement l’élévation du taux de strand breaks induite par l’irradiation UVB. Effet du zinc, du sélénium et de la NAC sur les dégâts à l'ADN induits par les UVA1 L’addition de ZnCl2 au milieu de culture de fibroblastes humains réduit significativement le taux de Strand breaks induits par une irradiation UVA1 à une dose comparable à celle reçue lors d’une exposition solaire naturelle. Les dommages causés à l’ADN par des doses croissantes d’UVAl de 1 à 6 J/cm2 ainsi que l’éventuel effet protecteur procuré par la NAC, le sélénium et le zinc ont été analysés en utilisant le test des comètes. Comparativement aux cellules témoin non irradiées, le tail moment augmente de 45 % pour une irradiation de 1 J/cm2 et de 89 % pour une irradiation à 6 J/cm2 dans les cellules non supplémentées (p < 0,01). À l’inverse, pour des irradiations de 1 à 4 J/cm2, la NAC, le sélénium et le zinc réduisent de manière identique le tail moment montrant une efficacité significative (p < 0,01) contre les altérations UVA1 induites de l’ADN. Pour les doses plus élevées d’UVAl (6 J/cm2), la protection offerte est globalement moins nette ; le sélénium et le zinc sont alors significativement plus performants (p <0,01) que la NAC. Il est à noter que dans cette étude, l’association NAC n’est pas plus protectrice que le sélénium seul, contrairement à ce que nous avions constaté pour la cytotoxicité. DISCUSSION La surexposition à laquelle le mode de
été analysés en utilisant le test des comètes. Comparativement aux cellules témoin non irradiées, le tail moment augmente de 45 % pour une irradiation de 1 J/cm2 et de 89 % pour une irradiation à 6 J/cm2 dans les cellules non supplémentées (p < 0,01). À l’inverse, pour des irradiations de 1 à 4 J/cm2, la NAC, le sélénium et le zinc réduisent de manière identique le tail moment montrant une efficacité significative (p < 0,01) contre les altérations UVA1 induites de l’ADN. Pour les doses plus élevées d’UVAl (6 J/cm2), la protection offerte est globalement moins nette ; le sélénium et le zinc sont alors significativement plus performants (p <0,01) que la NAC. Il est à noter que dans cette étude, l’association NAC n’est pas plus protectrice que le sélénium seul, contrairement à ce que nous avions constaté pour la cytotoxicité. DISCUSSION La surexposition à laquelle le mode de vie actuel soumet notre peau dépasse les capacités des moyens naturels de photoprotection. L’augmentation constante du nombre de carcinomes et de mélanomes en est une preuve évidente. Cette augmentation justifie une véritable stratégie de photoprotection. Effets moléculaires des UV Les connaissances sur les effets moléculaires des UV ont grandement progressé ces dernières années, en particulier ceux sur l’ADN cellulaire. Les UV ont une action directe sur certains chromophores cellulaires. Sur l’ADN, cette action directe aboutit à la formation de photo-produits, dimères cyclobutane de pyrimidine (CPD) et de photo-produits 6-4 pyrimidine-pyrimidone (6-4 pp). L’absence de réparation de ces lésions de l’ADN, qui sont le fait essentiellement des UVB, conduit à des mutations. Les UV génèrent aussi des espèces réactives de l’oxygène (ERO) comme l’oxygène singulet ou l’anion superoxyde soit directement soit surtout par le biais de réactions de photosensibilisation impliquant des photosensibilisants endogènes tels les riboflavines, les bilirubines, la phéomélanine et les dérivés porphyriniques. L’oxygène singulet et l’anion superoxyde sont ensuite convertis, par des mécanismes variés, en d’autres ERO (peroxyde d’hydrogène et radicaux hydroxyle). Ce processus chimique en cascade aggrave le stress oxydant. Cette production d’ERO, certes induite également par les UVB, représente le mécanisme principal de l’action délétère des UVA
ces dernières années, en particulier ceux sur l’ADN cellulaire. Les UV ont une action directe sur certains chromophores cellulaires. Sur l’ADN, cette action directe aboutit à la formation de photo-produits, dimères cyclobutane de pyrimidine (CPD) et de photo-produits 6-4 pyrimidine-pyrimidone (6-4 pp). L’absence de réparation de ces lésions de l’ADN, qui sont le fait essentiellement des UVB, conduit à des mutations. Les UV génèrent aussi des espèces réactives de l’oxygène (ERO) comme l’oxygène singulet ou l’anion superoxyde soit directement soit surtout par le biais de réactions de photosensibilisation impliquant des photosensibilisants endogènes tels les riboflavines, les bilirubines, la phéomélanine et les dérivés porphyriniques. L’oxygène singulet et l’anion superoxyde sont ensuite convertis, par des mécanismes variés, en d’autres ERO (peroxyde d’hydrogène et radicaux hydroxyle). Ce processus chimique en cascade aggrave le stress oxydant. Cette production d’ERO, certes induite également par les UVB, représente le mécanisme principal de l’action délétère des UVA qui n’occasionnent que peu de dégâts moléculaires directs comparativement aux UVB. Les ERO provoquent des oxydations des bases, des pontages nucléobases-protéines et des ruptures de chaînes de l’ADN. Elles sont également à l’origine d’une peroxydation lipidique pour la cellule qui se traduit par une modification de la fluidité et de la perméabilité des membranes ; de plus, les aldéhydes, produits finaux de la peroxydation lipidique, peuvent altérer l’ADN. Elles sont également à l’origine d’une peroxydation lipidique pour la cellule qui se traduit par une modification de la fluidité et de la perméabilité des membranes ; de plus, les aldéhydes, produits finaux de la peroxydation lipidique, peuvent altérer l’ADN. Enfin, les ERO oxydent les protéines, comme certains facteurs de transcription, modifiant leur activité fonctionnelle. Le rôle de la défense antioxydante endogène faite d’enzymes (superoxyde dismutases, catalase peroxydases) et de piégeurs d’ERO (thiols, vitamines E et C, bétacarotène, oligo-éléments) est de maintenir le potentiel redox de la cellule lors d’un stress oxydatif. Les dommages moléculaires induits par le stress oxydant bouleversent en effet gravement le fonctionnement cellulaire par altération des voies de transduction des signaux, par modification de la transcription des gènes redox-sensibles, par induction de mutations. Mécanismes de photocarcinogénèse Les mécanismes
la perméabilité des membranes ; de plus, les aldéhydes, produits finaux de la peroxydation lipidique, peuvent altérer l’ADN. Elles sont également à l’origine d’une peroxydation lipidique pour la cellule qui se traduit par une modification de la fluidité et de la perméabilité des membranes ; de plus, les aldéhydes, produits finaux de la peroxydation lipidique, peuvent altérer l’ADN. Enfin, les ERO oxydent les protéines, comme certains facteurs de transcription, modifiant leur activité fonctionnelle. Le rôle de la défense antioxydante endogène faite d’enzymes (superoxyde dismutases, catalase peroxydases) et de piégeurs d’ERO (thiols, vitamines E et C, bétacarotène, oligo-éléments) est de maintenir le potentiel redox de la cellule lors d’un stress oxydatif. Les dommages moléculaires induits par le stress oxydant bouleversent en effet gravement le fonctionnement cellulaire par altération des voies de transduction des signaux, par modification de la transcription des gènes redox-sensibles, par induction de mutations. Mécanismes de photocarcinogénèse Les mécanismes intimes de la photocarcinogénèse sont mal élucidés. Deux phénomènes paraissent intervenir de manière prépondérante : les mutations consécutives aux dommages à l’ADN, directs ou indirects par les ERO, et la photo-immunosuppression. Les mutations induites sur les gènes suppresseurs de tumeurs (p53, CDKN2/p16INK4 ou PTCH) paraissent les plus déterminantes. L’immunosuppression induite par les UV, largement démontrée tant chez la souris que chez l’homme, en empêchant le rejet des cellules mutées paraît avoir un rôle central dans la promotion et la progression tumorales. La photo-immunosuppression est un phénomène particulièrement complexe. Les UVB semblent avoir un rôle prédominant, probablement par une action directe sur deux chromophores initiateurs, l’acide urocanique et l’ADN. Cependant, les UVA participent par une stimulation de la production de cytokines immunosuppressives telle l’interleukine 10 (IL-10) sous l’effet des ERO. Ces notions laissent percevoir la place que peuvent avoir les ERO produites lors de l’exposition UV dans la photocarcinogénèse et l’intérêt de contrôler cette surproduction d’ERO avant qu’elle n’ait des conséquences cellulaires irréversibles. Comment protéger contre les cancers photo-induits La stratégie la plus simple de photoprotection est d’empêcher la pénétration du rayonnement jusqu’aux cibles vitales de la cellule de manière passive par les vêtements ou les produits antisolaires. Les photoprotecteurs externes