jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
bilirubin alone. The rate of protein synthesis increased significantly in all experimental conditions as early as 1h after the onset of the insult and at 48h post reoxygenation. It increased again at 72h in the cells exposed to bilirubin or to bilirubin and hypoxia. These sequential changes in synthesis of specific proteins seem to be involved in delayed neuronal death. Bilirubin decreased significantly [3H]2-deoxyglucose incorporation at 24h while it increased when the neurons were exposed to both bilirubin and hypoxia (+60 %, p<0.001) and decreased thereafter. These data confirm the deleterious effects of bilirubin on neuronal viability, on protein synthesis and metabolic rates. The combination of bilirubin with hypoxia resulted in stronger detrimental effects on neurons than bilirubin alone. Key-words (Index Medicus): Infant, newborn. Bilirubin. Brain diseases, metabolic. Kernicterus. Neurons. Anoxia. Analyse de la viabilité La viabilité des neurones a été évaluée par une méthode spectrophotométrique utilisant un sel de tétrazolium (MTT) dont la molécule est clivée au niveau des mitochondries des cellules vivantes conduisant à l’accumulation d’un sel de formazan [10]. Les caractéristiques morphologiques de l’apoptose et de la nécrose cellulaires étaient visualisées après fixation nucléaire d’un fluorochrome, le 4,6-diamidino-2-phényl-indole ou DAPI. Cette méthode permet de reconnaître les neurones normaux avec leur noyau arrondi à la fluorescence diffuse ; les cellules nécrotiques ont des noyaux plus petits, très réfringents avec une chromatine uniformément dispersée ; les neurones en apoptose se caractérisent par des noyaux très rétrécis à la chromatine fragmentée et très condensée [25], Les comptages cellulaires étaient réalisés sur un minimum de 3 zones de 100 neurones par boîte de culture. Synthèse protéique et activité fonctionnelle Témoin de la vitalité cellulaire, mais aussi de l’expression de protéines pro ou anti-apoptotiques, la synthèse protéique a été mesurée par spectrométrie à scintillation après incorporation de L-leucine marquée au tritium. L’activité fonctionnelle des neurones a été évaluée par l’incorporation cellulaire de 2-D-désoxyglucose[ 3 H] avec mesure de radioactivité par compteur à scintillation dans la fraction insoluble des cultures. RÉSULTATS Viabilité et morphologie cellulaire Après 6 jours de culture, les neurones témoins ont un cytoplasme polygonal et sont interconnectés par un réseau
normaux avec leur noyau arrondi à la fluorescence diffuse ; les cellules nécrotiques ont des noyaux plus petits, très réfringents avec une chromatine uniformément dispersée ; les neurones en apoptose se caractérisent par des noyaux très rétrécis à la chromatine fragmentée et très condensée [25], Les comptages cellulaires étaient réalisés sur un minimum de 3 zones de 100 neurones par boîte de culture. Synthèse protéique et activité fonctionnelle Témoin de la vitalité cellulaire, mais aussi de l’expression de protéines pro ou anti-apoptotiques, la synthèse protéique a été mesurée par spectrométrie à scintillation après incorporation de L-leucine marquée au tritium. L’activité fonctionnelle des neurones a été évaluée par l’incorporation cellulaire de 2-D-désoxyglucose[ 3 H] avec mesure de radioactivité par compteur à scintillation dans la fraction insoluble des cultures. RÉSULTATS Viabilité et morphologie cellulaire Après 6 jours de culture, les neurones témoins ont un cytoplasme polygonal et sont interconnectés par un réseau fibrillaire dense. Un marquage immunohistochimique par anticorps anti-énolase spécifique (3-9) confirme que les cultures comportent 92,5 ± 2,8 % (DS) de neurones. La diminution du pourcentage de cellules vivantes 48, 72 et 96 heures après les agressions cellulaires est présentée sur le Tableau 1. L’hypoxie et la bilirubine réduisent cette proportion de façon significative à 72 et 96 heures. L’effet conjugué de l’hypoxie et de la bilirubine est plus précoce, et aux trois temps de l’étude, significativement plus marqué que pour l’hypoxie ou la bilirubine seule. Tableau 1. — Viabilité neuronale et morphologie cellulaire 96 heures après exposition à l’hypoxie, à la bilirubine ou à bilirubine et hypoxie ( ± DS). Viabilité (%) vs témoins Nécrose p. 100 cel. Apoptose p. 100 cel. Témoins 100 5,2 ± 1,4 2,4 ± 0,8 Hypoxie 77,3 ± 2,1** 9,2 ± 0,6** 13,4 ± 1,1** Bilirubine 75,5 ± 1,9** 12,0 ± 1,3** 16,2 ± 1,5** Hypoxie + bilirubine 66,0 ± 2,5** 16,9 ± 3,3** 22,6 ± 3,1** ** p. < 0,01 comparé aux témoins-test de Dunnett. 00 p. < 0,01 comparé à l’hypoxie seule. Bull. Acad. Natle Méd., 2001,185, n° 8, 1417-1428, séance du 6 novembre 2001 Les signes de nécrose et d’apoptose neuronale
proportion de façon significative à 72 et 96 heures. L’effet conjugué de l’hypoxie et de la bilirubine est plus précoce, et aux trois temps de l’étude, significativement plus marqué que pour l’hypoxie ou la bilirubine seule. Tableau 1. — Viabilité neuronale et morphologie cellulaire 96 heures après exposition à l’hypoxie, à la bilirubine ou à bilirubine et hypoxie ( ± DS). Viabilité (%) vs témoins Nécrose p. 100 cel. Apoptose p. 100 cel. Témoins 100 5,2 ± 1,4 2,4 ± 0,8 Hypoxie 77,3 ± 2,1** 9,2 ± 0,6** 13,4 ± 1,1** Bilirubine 75,5 ± 1,9** 12,0 ± 1,3** 16,2 ± 1,5** Hypoxie + bilirubine 66,0 ± 2,5** 16,9 ± 3,3** 22,6 ± 3,1** ** p. < 0,01 comparé aux témoins-test de Dunnett. 00 p. < 0,01 comparé à l’hypoxie seule. Bull. Acad. Natle Méd., 2001,185, n° 8, 1417-1428, séance du 6 novembre 2001 Les signes de nécrose et d’apoptose neuronale sont, à 96 heures, significativement plus fréquents que dans la population témoin pour chacun des groupes cellulaires exposés soit à l’hypoxie soit à la bilirubine seule, et l’addition des deux modes pathogènes donne des résultats encore plus sévères. L’étude de la synthèse protéique par incorporation de leucine[ 3 H] (Fig. 2), comparée à celle des témoins, montre une évolution multiphasique : augmentation significative rapide une heure après l’exposition à la bilirubine et/ou à l’hypoxie avec un effet additif des deux modes toxiques (+53 % comparé à respectivement + 44 % pour l’hypoxie seule et +25 % pour la bilirubine seule). La synthèse protéique est diminuée de façon homogène à 6 et à 24 heures. Elle augmente à nouveau à 48 heures et sera marquée pour l’agression combinée jusqu’à 72 heures. À 96 heures, l’hypoxie avec ou sans bilirubine associée induit une réduction de synthèse protéique de l’ordre de 35 à 40 %. Valeurs +/DS. * p<0.05 ; ** p<0,01 vs témoins ♦ ♦ p<0,01 vs bilirubine (Test de Student) Fig. 2. — Étude du taux de synthèse des protéines dans la fraction insoluble des neurones par incorporation de L-leucine tritiée, en fonction du temps après exposition à la bilirubine associée
2), comparée à celle des témoins, montre une évolution multiphasique : augmentation significative rapide une heure après l’exposition à la bilirubine et/ou à l’hypoxie avec un effet additif des deux modes toxiques (+53 % comparé à respectivement + 44 % pour l’hypoxie seule et +25 % pour la bilirubine seule). La synthèse protéique est diminuée de façon homogène à 6 et à 24 heures. Elle augmente à nouveau à 48 heures et sera marquée pour l’agression combinée jusqu’à 72 heures. À 96 heures, l’hypoxie avec ou sans bilirubine associée induit une réduction de synthèse protéique de l’ordre de 35 à 40 %. Valeurs +/DS. * p<0.05 ; ** p<0,01 vs témoins ♦ ♦ p<0,01 vs bilirubine (Test de Student) Fig. 2. — Étude du taux de synthèse des protéines dans la fraction insoluble des neurones par incorporation de L-leucine tritiée, en fonction du temps après exposition à la bilirubine associée ou non à l’hypoxie. L’étude fonctionnelle par l’incorporation du desoxyglucose[ 3 H] (Fig. 3) montre initialement, 6 et 24 heures après l’agression hypoxique, une augmentation de la demande métabolique comparable, qu'il y ait ou pas de bilirubine dans le milieu. La bilirubine seule induit au contraire une diminution de l’incorporation du desoxyglucose. À 48, 72 et 96 heures, la demande métabolique est réduite après hypoxie et bilirubine seules. L’addition des deux agressions maintient paradoxalement un accroissement métabolique modéré à 48 et 72 heures, et une diminution moins marquée à 96 heures. Valeurs +/DS. * p<0,05 ; ** p<0,01 vs témoins ♦ ♦ p<0,01 vs bilirubine ♦ ♦ p<0,01 vs hypoxie (Test de Student) Fig. 3. — Incorporation de désoxyglucose [ 3 H] dans les neurones en cultures entre 6 et 96 heures après exposition à l’hypoxie et/ou à la bilirubine. DISCUSSION Les effets de l’hypoxie sur ce modèle de neurones en culture ont été décrits par notre groupe [3-9], Ils sont retrouvés ici dans les cellules exposées à l’hypoxie seule. La viabilité cellulaire est réduite. Nécrose et apoptose se manifestent à partir de 48 heures après réoxygénation. Le profil de synthèse protéique correspond à celui d’une expression précoce de protéines
du desoxyglucose. À 48, 72 et 96 heures, la demande métabolique est réduite après hypoxie et bilirubine seules. L’addition des deux agressions maintient paradoxalement un accroissement métabolique modéré à 48 et 72 heures, et une diminution moins marquée à 96 heures. Valeurs +/DS. * p<0,05 ; ** p<0,01 vs témoins ♦ ♦ p<0,01 vs bilirubine ♦ ♦ p<0,01 vs hypoxie (Test de Student) Fig. 3. — Incorporation de désoxyglucose [ 3 H] dans les neurones en cultures entre 6 et 96 heures après exposition à l’hypoxie et/ou à la bilirubine. DISCUSSION Les effets de l’hypoxie sur ce modèle de neurones en culture ont été décrits par notre groupe [3-9], Ils sont retrouvés ici dans les cellules exposées à l’hypoxie seule. La viabilité cellulaire est réduite. Nécrose et apoptose se manifestent à partir de 48 heures après réoxygénation. Le profil de synthèse protéique correspond à celui d’une expression précoce de protéines anti-apoptotiques telles que Bcl 2 et HSP70, puis à partir de 48 heures de protéines pro-apoptotiques de type Bax [3]. L’augmentation de l’incorporation de 2-désoxyglucose à 6 et à 24 heures correspond à l’élévation du métabolisme glucosé observée dans d’autres modèles, en particulier in vivo. Elle traduit une épuisante tentative de maintenir le métabolisme oxydatif, malgré l’anaérobiose, au prix d’une sorte de gaspillage énergétique (deux molécules d’ATP pour une molécule de glucose au lieu de 38 en aérobiose) et d’une acidose lactique. Ce phénomène serait médié par une libération massive d’acides aminés excitateurs, en particulier le glutamate. Cette excito-toxicité est rendue possible par une expression accrue des récepteurs au glutamate (N-methyl-D-aspartate ou NMDA) commandant l’ouverture d’un canal ionique avec intrusion de calcium intracellulaire [13-18]. L’exposition des neurones à des concentrations relativement faibles de bilirubine, 40 à 10 5 fois inférieures à d’autres études [5-22], induit des troubles qui pourraient paraître comparables à ceux que provoque l’hypoxie. Cependant, il y a des différences. La mort par apoptose est plus précoce, doublée par rapport à l’hypoxie dans l’examen à 48 heures (8 % vs 4 %). Cette différence n’est plus retrouvée ultérieurement. En revanche, à 96 heures, c’est la proportion de cellules
de maintenir le métabolisme oxydatif, malgré l’anaérobiose, au prix d’une sorte de gaspillage énergétique (deux molécules d’ATP pour une molécule de glucose au lieu de 38 en aérobiose) et d’une acidose lactique. Ce phénomène serait médié par une libération massive d’acides aminés excitateurs, en particulier le glutamate. Cette excito-toxicité est rendue possible par une expression accrue des récepteurs au glutamate (N-methyl-D-aspartate ou NMDA) commandant l’ouverture d’un canal ionique avec intrusion de calcium intracellulaire [13-18]. L’exposition des neurones à des concentrations relativement faibles de bilirubine, 40 à 10 5 fois inférieures à d’autres études [5-22], induit des troubles qui pourraient paraître comparables à ceux que provoque l’hypoxie. Cependant, il y a des différences. La mort par apoptose est plus précoce, doublée par rapport à l’hypoxie dans l’examen à 48 heures (8 % vs 4 %). Cette différence n’est plus retrouvée ultérieurement. En revanche, à 96 heures, c’est la proportion de cellules nécrotiques qui devient plus importante sous l’effet de la bilirubine (14 % vs 9 %). Pour ce dernier phénomène, on peut invoquer l’inhibition par la bilirubine d’enzymes essentielles au fonctionnement cellulaire comme la protéine-kinase C ou la kinase II Ca2+ calmoduline dépendante. Le profil de la synthèse protéique dans les neurones exposés à la bilirubine seule n’est pas significativement différent de ce qu’il est après 6 heures d’hypoxie, dans les 48 premières heures, avec l’aspect multiphasique : synthèse augmentée à 1 heure et à 48 heures. Au contraire de l’effet de l’hypoxie, l’exposition à la bilirubine n’induit pas d’augmentation de l’incorporation du 2-désoxyglucose après 6 et 24 heures ; cette incorporation est même diminuée de 55 à 65 % respectivement. Elle reste significativement diminuée aux autres temps de l’observation. On retrouve ici les effets délétères déjà décrits de la bilirubine sur le métabolisme énergétique. Son effet inhibiteur sur l’hexokinase, responsable de la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate, a été décrit mais avec des concentrations 60 fois supérieures (30 μM). L’excitotoxicité du glutamate induite par la bilirubine a été proposée par Churn, McDonald, sur le rat Gunn atteint d’une hyperbilirubinémie par déficit génétique en glucuronyl-transférase, montre que les lésions cérébrales peuvent
neurones exposés à la bilirubine seule n’est pas significativement différent de ce qu’il est après 6 heures d’hypoxie, dans les 48 premières heures, avec l’aspect multiphasique : synthèse augmentée à 1 heure et à 48 heures. Au contraire de l’effet de l’hypoxie, l’exposition à la bilirubine n’induit pas d’augmentation de l’incorporation du 2-désoxyglucose après 6 et 24 heures ; cette incorporation est même diminuée de 55 à 65 % respectivement. Elle reste significativement diminuée aux autres temps de l’observation. On retrouve ici les effets délétères déjà décrits de la bilirubine sur le métabolisme énergétique. Son effet inhibiteur sur l’hexokinase, responsable de la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate, a été décrit mais avec des concentrations 60 fois supérieures (30 μM). L’excitotoxicité du glutamate induite par la bilirubine a été proposée par Churn, McDonald, sur le rat Gunn atteint d’une hyperbilirubinémie par déficit génétique en glucuronyl-transférase, montre que les lésions cérébrales peuvent être en partie prévenues par administration d’un antagoniste (MK801) du récepteur au glutamate NMDA. Dans une autre étude, nous avons confirmé l’effet protecteur de cet antagoniste sur l’apoptose neuronale en présence de bilirubine. L’association des effets de l’hypoxie et de l’hyperbilirubinémie constituait le point essentiel de notre hypothèse de travail. De fait, il est confirmé que 48, 72 et 96 heures après l’exposition des cultures à ces deux modes d’agression, la viabilité cellulaire est considérablement compromise et de façon significativement plus marquée que pour chacun de ces modes séparément. La synthèse protéique est plus marquée d’emblée, une heure après l’agression (+ 53 %) puis son rythme semble suivre celui que l’on obtient dans les autres groupes cellulaires. À 48 et 72 heures, cette synthèse redevient forte (+ 45 % et 80 %). C’est à propos de l’effet de la combinaison hypoxie bilirubine sur l’incorporation du 2-désoxyglucose que les différences sont les plus remarquables. Tout se passe comme si l’effet de la bilirubine était annulé par l’hypoxie à 6 et à 24 heures. Bien plus, la présence de bilirubine après hypoxie maintient une élévation significative de cette incorporation du 2-désoxyglucose à 48 et 72 heures. Cet effet paraît paradoxal alors que
De fait, il est confirmé que 48, 72 et 96 heures après l’exposition des cultures à ces deux modes d’agression, la viabilité cellulaire est considérablement compromise et de façon significativement plus marquée que pour chacun de ces modes séparément. La synthèse protéique est plus marquée d’emblée, une heure après l’agression (+ 53 %) puis son rythme semble suivre celui que l’on obtient dans les autres groupes cellulaires. À 48 et 72 heures, cette synthèse redevient forte (+ 45 % et 80 %). C’est à propos de l’effet de la combinaison hypoxie bilirubine sur l’incorporation du 2-désoxyglucose que les différences sont les plus remarquables. Tout se passe comme si l’effet de la bilirubine était annulé par l’hypoxie à 6 et à 24 heures. Bien plus, la présence de bilirubine après hypoxie maintient une élévation significative de cette incorporation du 2-désoxyglucose à 48 et 72 heures. Cet effet paraît paradoxal alors que tout semble par ailleurs montrer un effet délétère de la présence de bilirubine sur des neurones exposés à l’hypoxie. On ne peut manquer d’évoquer ici l’effet « scavenger » de la bilirubine supposé protéger les cellules des radicaux libres. Dans des travaux en cours sur les radicaux libres, cette hypothèse ne semble pas se confirmer sur notre modèle. À 96 heures, les trois groupes de cultures neuronales montrent une altération homogène de l’incorporation du 2-désoxyglucose. La conclusion de cette étude montrant l’effet toxique cumulatif de l’hypoxie et de la bilirubine sur la vitalité des neurones a une signification clinique d’une portée considérable, tant sont fréquentes les situations où ces deux types d’agression sont, soit contemporains, soit séquentiels à court terme. L’hypoxie peut avoir précédé l’hyperbilirubinémie — c’est le cas de l’asphyxie intranatale — l’accompagner en cas d’anémie profonde ou d’apnées récidivantes. De même, cette fragilisation neuronale par l’hypoxie pourrait expliquer des observations de la littérature où un ictère nucléaire est apparu malgré des taux de bilirubine plasmatique en-deçà des seuils considérés comme dangereux. Ces constatations s’inscrivent dans un profond remaniement récent des conceptions physiopathologiques sur le métabolisme de la bilirubine. Que ce soit l’induction de l’hème-oxygénase, initiatrice du phénomène hémolytique,
ne semble pas se confirmer sur notre modèle. À 96 heures, les trois groupes de cultures neuronales montrent une altération homogène de l’incorporation du 2-désoxyglucose. La conclusion de cette étude montrant l’effet toxique cumulatif de l’hypoxie et de la bilirubine sur la vitalité des neurones a une signification clinique d’une portée considérable, tant sont fréquentes les situations où ces deux types d’agression sont, soit contemporains, soit séquentiels à court terme. L’hypoxie peut avoir précédé l’hyperbilirubinémie — c’est le cas de l’asphyxie intranatale — l’accompagner en cas d’anémie profonde ou d’apnées récidivantes. De même, cette fragilisation neuronale par l’hypoxie pourrait expliquer des observations de la littérature où un ictère nucléaire est apparu malgré des taux de bilirubine plasmatique en-deçà des seuils considérés comme dangereux. Ces constatations s’inscrivent dans un profond remaniement récent des conceptions physiopathologiques sur le métabolisme de la bilirubine. Que ce soit l’induction de l’hème-oxygénase, initiatrice du phénomène hémolytique, par l’infection et l’hypoxie, le passage de la barrière hémato-encéphalique aggravé par le déficit en glycoprotéine-P sous l’effet de l’hypoxie, enfin la destruction de la bilirubine intraneuronale ou intragliale par une bilirubine-oxydase dont la synthèse est, là encore, altérée par l’hypoxie. On ne saurait, sans artifice, transposer ces données expérimentales pour édicter de nouvelles règles thérapeutiques. Cependant, les médecins néonatologistes ou réanimateurs devraient tenir compte de l’hypoxie subie par l’enfant en abaissant les seuils décisionnels d’hyperbilirubinémie dans les indications de photothérapie ou d’exsanguino-transfusion. Des études cliniques prospectives seraient à entreprendre pour tenter de discerner ce qui, dans l’aggravation de certains dommages neurologiques, peut revenir à cette funeste association pathogène, bilirubine-hypoxie. Neurol., 2000,166, 334-341. [10] Hansen M.B., Nielsen S.E., Berg K. — Re-examination and further development of a précis and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods, 1989, 119, 203-210. [11] Hansen T.W.R., Mathiesen S.B., Walaas S.I. — Bilirubin has widespread effects on protein phosphorylation. Pediatr. Res., 1996, 39, 1072-1077. [12] Hervieux J.F.E. — De l’ictère des nouveau-nés. Paris : Thèse de Doctorat en Médecine, 1847. [13] Hoffman D.J., Zanelli S.A., Kubin J., Mishra O.P., Delivoria-Papadopoulos M. — The in vivo effect of bilirubin on the N-methyl-D-aspartate
pour édicter de nouvelles règles thérapeutiques. Cependant, les médecins néonatologistes ou réanimateurs devraient tenir compte de l’hypoxie subie par l’enfant en abaissant les seuils décisionnels d’hyperbilirubinémie dans les indications de photothérapie ou d’exsanguino-transfusion. Des études cliniques prospectives seraient à entreprendre pour tenter de discerner ce qui, dans l’aggravation de certains dommages neurologiques, peut revenir à cette funeste association pathogène, bilirubine-hypoxie. Neurol., 2000,166, 334-341. [10] Hansen M.B., Nielsen S.E., Berg K. — Re-examination and further development of a précis and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods, 1989, 119, 203-210. [11] Hansen T.W.R., Mathiesen S.B., Walaas S.I. — Bilirubin has widespread effects on protein phosphorylation. Pediatr. Res., 1996, 39, 1072-1077. [12] Hervieux J.F.E. — De l’ictère des nouveau-nés. Paris : Thèse de Doctorat en Médecine, 1847. [13] Hoffman D.J., Zanelli S.A., Kubin J., Mishra O.P., Delivoria-Papadopoulos M. — The in vivo effect of bilirubin on the N-methyl-D-aspartate receptor/ion channel complex in the brains of newborn piglets. Pediatr. Res., 1996, 40, 804-808. [14] Ives N.K., Cox D.W.G., Gardiner R.M., Bachelard H.S. — The effects of bilirubin on brain energy metabolism during normoxia and hypoxia. An in vitro study using 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Pediatr. Res., 1988,23, 569-573. [15] Jones M.H., Sands R., Hyman C.B. — Longitudinal study of the incidence of central nervous System damage following erythroblastosis fetalis. Pediatrics, 1954,14, 346. [16] Mayor F.J., Pages M., Diez-Guerra J., Valdivieso F., Mayor F. — Effect of postnatal anoxia on bilirubin levels in rat brain. Pediatr. Res., 1985,19, 231-236. [17] McDonald J.W., Shapiro S.M., Silverstein F.S., Johnston M.V. — Role of glutamate receptor mediated excitotoxicity in bilirubin-induced brain injury in the Gunn rat model. Exp. Neurol., 1998,150, 21-29. [18] Mitani A., Takeyasu S., Yanase H., Nakamura Y., Kataoka K. — Changes in intracellular Ca2+ and energy levels during in vitro ischemia in the gerbil hippocampal slice. J. Neurochem., 1994, 62, 626-634. [19] Oghoa E.L.M., Wennberg R., An Y., Tandon T., Takashima T., Nguyen T., Chui A. — Interactions of bilirubin with isolated presynaptic nerve terminals : functional effects on the uptake and release of neurotransmitters. Cell. Mol. Biol., 1993,13,