jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
Puis 5 min après, la chambre est à nouveau fermée et le contrôle respiratoire est mesuré comme précédemment. Les témoins sont traités dans les mêmes conditions mais sans anoxie. Des concentrations croissantes de résveratrol sont introduites dans la chambre d’incubation, soit avant les deux séquences, soit au moment de la réoxygénation. La suspension mitochondriale est ensuite centrifugée, le cytochrome c est mesuré dans le surnageant par une méthode immuno-enzymatique. La production de O2°' au cours de la réoxygénation est quantifiée par la méthode du bleu de nitrotétrazolium. L’anisotropie des membranes mitochondriales est mesurée à l’aide d’une sonde, le 1,6-diphényl - 1, 3, 5 hexatriène (DPH) par polarisation de fluorescence selon les méthodes décrites par Mecocci et coll. [10] et Ricchelli et coll. [11], Injection chronique de résveratrol Les rats sont anesthésiés par une injection SC de chloral (400 mg/kg). Une petite incision interscapulaire permet d’implanter une mini-pompe osmotique délivrant 1 pl/h de solution de façon continue pendant 7 jours. Le résveratrol est injecté à différentes concentrations 0,4, 2 et 10 mg/kg/j dissous dans un mélange de diméthylsulfoxyde-polyéthylène glycol (1/9), les rats témoins reçoivent le seul solvant. Le 8e jour, les animaux sont sacrifiés. Les mitochondries de l’encéphale sont isolées. On les utilise pour mesurer les contrôles respiratoires avant et après les avoir soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation. Analyses statistiques Les valeurs moyennes des CR ou les pourcentages de variation sont comparés selon les méthodes d’analyse de variance et le test de Dunnett. Les EC50 sont calculées par régression non-linéaire à l’aide d’un logiciel Micropharm® [12], Résultats Les effets du résveratrol dans le protocole d'anoxie-réoxygénation Restauration partielle du contrôle respiratoire mitochondrial Après les séquences successives d’anoxie puis de réoxygénation, le CR diminue d’environ 50 % (Fig. 1). La respiration basale (V4) augmente de 39,7 ± 1,8 à 50,4 ± 1,8 nmoles O2/min/mg de protéines. log [résveratrol] M Fig. 1. — Modifications par le résveratrol des paramètres respiratoires des mitochondries cérébrales de Rat soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation. Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 4 déterminations. Les consommations d’oxygène correspondant à la respiration basale (V4) et à la phosphorylation oxydative
les utilise pour mesurer les contrôles respiratoires avant et après les avoir soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation. Analyses statistiques Les valeurs moyennes des CR ou les pourcentages de variation sont comparés selon les méthodes d’analyse de variance et le test de Dunnett. Les EC50 sont calculées par régression non-linéaire à l’aide d’un logiciel Micropharm® [12], Résultats Les effets du résveratrol dans le protocole d'anoxie-réoxygénation Restauration partielle du contrôle respiratoire mitochondrial Après les séquences successives d’anoxie puis de réoxygénation, le CR diminue d’environ 50 % (Fig. 1). La respiration basale (V4) augmente de 39,7 ± 1,8 à 50,4 ± 1,8 nmoles O2/min/mg de protéines. log [résveratrol] M Fig. 1. — Modifications par le résveratrol des paramètres respiratoires des mitochondries cérébrales de Rat soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation. Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 4 déterminations. Les consommations d’oxygène correspondant à la respiration basale (V4) et à la phosphorylation oxydative (V3). Le coefficient respiratoire, CR, est égal à V3/V4. La phosphorylation oxydative (V3) diminue de 103,6 ± 4,8 à 82,8 ± 4,0 nmoles O2/min/mg de protéines. Lorsque le résveratrol est appliqué avant les deux séquences, il limite la chute de V4, restaure en partie V3 et limite ainsi partiellement mais significativement la diminution du CR. Les caractéristiques de ces effets sont qu’ils commencent à de très faibles concentrations (10-12 M), sont concentration-dépendants et ne sont que partiels. La restauration de V3 et la normalisation de V4 suivent des évolutions biphasiques dont les caractéristiques sont indiquées sur le Tableau I. Il n’existe pratiquement pas de différence d’intensité d’effet du résveratrol lorsqu’il est administré avant les deux séquences ou seulement après l’anoxie. Son effet porte donc essentiellement sur l’étape de réoxygénation. Inhibition de la libération de cytochrome c Il existe une libération spontanée de cytochrome c par les préparations mitochondriales, évaluée à 226,4 ± 30,7 ng/mg de protéines. La séquence d’anoxie-réoxygénation augmente significativement cette libération : 425,1 ± 38,6 ng/mg de protéines. Quel que soit son temps d’application, le résveratrol inhibe la libération de cytochrome c induite et restaure totalement l’état initial à la concentration de 10 nM (Fig. 2). Ses effets
significativement la diminution du CR. Les caractéristiques de ces effets sont qu’ils commencent à de très faibles concentrations (10-12 M), sont concentration-dépendants et ne sont que partiels. La restauration de V3 et la normalisation de V4 suivent des évolutions biphasiques dont les caractéristiques sont indiquées sur le Tableau I. Il n’existe pratiquement pas de différence d’intensité d’effet du résveratrol lorsqu’il est administré avant les deux séquences ou seulement après l’anoxie. Son effet porte donc essentiellement sur l’étape de réoxygénation. Inhibition de la libération de cytochrome c Il existe une libération spontanée de cytochrome c par les préparations mitochondriales, évaluée à 226,4 ± 30,7 ng/mg de protéines. La séquence d’anoxie-réoxygénation augmente significativement cette libération : 425,1 ± 38,6 ng/mg de protéines. Quel que soit son temps d’application, le résveratrol inhibe la libération de cytochrome c induite et restaure totalement l’état initial à la concentration de 10 nM (Fig. 2). Ses effets sont concentration-dépendants. Tableau 1. — Effets du résveratrol sur les paramètres respiratoires des mitochondries soumises au protocole anoxie-réoxygénation. Les conditions opératoires sont identiques à celles de la Figure 1. Les résultats sont exprimés en EC50 et en effet maximal observé, Emax en % des valeurs des témoins. Les effets du résveratrol sont biphasiques, quel que soit le moment de son application, les concentrations efficaces étant de l’ordre du picomolaire puis du nanomolaire. v3 v4 CR résveratrol avant anoxie-réoxygénation EC50 1 (pM) Emax 1 (%) 1.56 ± 0.33 10.4 ± 0.35 4.17 ± 1.46 7.99 ± 0.37 5.79 ± 1.23 11.83 ± 0.48 EC50 2 (nM) Emax 2 (%) 2.64 ± 0.68 7.57 ± 0.31 8.50 ± 1.41 12.02 ± 0.56 11.61 ± 2.64 11.51 ± 0.58 résveratrol avant réoxygénation EC50 1 (pM) Emax 1 (%) 2.93 ± 0.53 10.60 ± 0.27 2.95 ± 0.63 11.31 ± 0.47 1.47 ± 0.25 II. 39 ± 0.48 EC50 2 (nM) Emax 2 (%) 1.03 ± 0.68 51 4.26 ± 0.28 3.70 ± 1.24 11.66 ± 0.71 2.27 ± 0.38 11.33 ± 0.38 Inhibition de l’augmentation de production de O2°'. Les deux séquences successives augmentent significativement la génération de O2°'. Le résveratrol, quel que
résveratrol sont biphasiques, quel que soit le moment de son application, les concentrations efficaces étant de l’ordre du picomolaire puis du nanomolaire. v3 v4 CR résveratrol avant anoxie-réoxygénation EC50 1 (pM) Emax 1 (%) 1.56 ± 0.33 10.4 ± 0.35 4.17 ± 1.46 7.99 ± 0.37 5.79 ± 1.23 11.83 ± 0.48 EC50 2 (nM) Emax 2 (%) 2.64 ± 0.68 7.57 ± 0.31 8.50 ± 1.41 12.02 ± 0.56 11.61 ± 2.64 11.51 ± 0.58 résveratrol avant réoxygénation EC50 1 (pM) Emax 1 (%) 2.93 ± 0.53 10.60 ± 0.27 2.95 ± 0.63 11.31 ± 0.47 1.47 ± 0.25 II. 39 ± 0.48 EC50 2 (nM) Emax 2 (%) 1.03 ± 0.68 51 4.26 ± 0.28 3.70 ± 1.24 11.66 ± 0.71 2.27 ± 0.38 11.33 ± 0.38 Inhibition de l’augmentation de production de O2°'. Les deux séquences successives augmentent significativement la génération de O2°'. Le résveratrol, quel que soit le moment de son application, réduit cette augmentation (Fig. 3). Son effet est concentration-dépendant et commence dès 1 nM. Restauration de la fluidité membranaire mitochondriale. L’anisotropie des membranes mitochondriales est significativement augmentée par la séquence d’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol la restaure de façon identique, quel que soit le moment de son application (Fig. 4). Les effets du résveratrol sur les stades précoces de l'apoptose mitochondriale. Le stade précocce de l’apoptose mitochondriale est reproduit en provoquant un flux d’électrons (e') dans la matrice mitochondriale à travers les deux membranes. Celui-ci active la cytochrome c oxydase (complexe IV) qui réduit l’oxygène en eau. Il en résulte une augmentation de la consommation d’oxygène. Le résveratrol la réduit partiellement mais significativement (Fig. 5). Les effets du résveratrol sur le découplage provoqué des mitochondries. Le résveratrol réduit de façon partielle mais significative le découplage induit par le CCCP. L’effet est là aussi biphasique comme observé avec le CR des mitochondries soumises à la séquence d’anoxie-réoxygénation (Fig. 6). 500 S .S 450 ! 400 ^ 350 bû i 300 I 250 ■a 200 Xi 150 CJ g 100 o ■S 50 Témoins en anoxie-réoxygénation + résveratrol avant anoxie + résveratrol avant réoxygénation -12 -11 -10 Log
son application (Fig. 4). Les effets du résveratrol sur les stades précoces de l'apoptose mitochondriale. Le stade précocce de l’apoptose mitochondriale est reproduit en provoquant un flux d’électrons (e') dans la matrice mitochondriale à travers les deux membranes. Celui-ci active la cytochrome c oxydase (complexe IV) qui réduit l’oxygène en eau. Il en résulte une augmentation de la consommation d’oxygène. Le résveratrol la réduit partiellement mais significativement (Fig. 5). Les effets du résveratrol sur le découplage provoqué des mitochondries. Le résveratrol réduit de façon partielle mais significative le découplage induit par le CCCP. L’effet est là aussi biphasique comme observé avec le CR des mitochondries soumises à la séquence d’anoxie-réoxygénation (Fig. 6). 500 S .S 450 ! 400 ^ 350 bû i 300 I 250 ■a 200 Xi 150 CJ g 100 o ■S 50 Témoins en anoxie-réoxygénation + résveratrol avant anoxie + résveratrol avant réoxygénation -12 -11 -10 Log [résveratrol] M * p<0.05, ** p<0.01 Fig. 2. — Suppression par le résveratrol de l’augmentation de la libération de cytochrome induite par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation soit avant les deux séquences, soit après l’anoxie avant la réoxygénation. L'effet du pré traitement chronique par le résveratrol sur le contrôle respiratoire mitochondrial. Le résveratrol appliqué aux mitochondries isolées des encéphales des rats traités ne modifie par leurs paramètres respiratoires. Lorsque ces mitochondries sont soumises aux deux séquences d’anoxie puis de réoxygénation, on observe que le pré traitement réduit partiellement mais significativement les altérations produites chez les témoins (Fig. 7). Le CR est significativement augmenté à la dose de 10 mg/kg (SC, une semaine). Ces résultats montrent que le résveratrol administré par voie sous-cutanée développe des effets analogues à ceux observés in vitro sur des mitochondries d’animaux non traités. Fig. 3. — Inhibition par le résveratrol de la production d’anion superoxyde (O2°') induite par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation avant les deux séquences ou après l’anoxie avant la réoxygénation. DISCUSSION. Le protocole d’anoxie-réoxygénation utilisé provoque une augmentation de la consommation basale d’oxygène des mitochondries, une diminution de leur capacité de phosphorylation et en conséquence
sur le contrôle respiratoire mitochondrial. Le résveratrol appliqué aux mitochondries isolées des encéphales des rats traités ne modifie par leurs paramètres respiratoires. Lorsque ces mitochondries sont soumises aux deux séquences d’anoxie puis de réoxygénation, on observe que le pré traitement réduit partiellement mais significativement les altérations produites chez les témoins (Fig. 7). Le CR est significativement augmenté à la dose de 10 mg/kg (SC, une semaine). Ces résultats montrent que le résveratrol administré par voie sous-cutanée développe des effets analogues à ceux observés in vitro sur des mitochondries d’animaux non traités. Fig. 3. — Inhibition par le résveratrol de la production d’anion superoxyde (O2°') induite par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation avant les deux séquences ou après l’anoxie avant la réoxygénation. DISCUSSION. Le protocole d’anoxie-réoxygénation utilisé provoque une augmentation de la consommation basale d’oxygène des mitochondries, une diminution de leur capacité de phosphorylation et en conséquence une chute de leur coefficient respiratoire. Le découplage des mitochondries résulte d’une diminution du potentiel de la membrane interne mitochondriale, il s’accompagne d’une augmentation de la perméabilité de celle-ci aux protons qui rentrent dans la matrice sans passer par le complexe V. Sur ce modèle, le résveratrol limite l’intensité des altérations induites. Ses effets sont seulement partiels sur le coefficient respiratoire (restauration de 22 % à 10-7 M) : ils s’observent aussi bien lorsque le résveratrol est appliqué avant la double séquence que lorsqu’il est introduit après l’anoxie et avant la réoxygénation. ** p<0.01 versus témoins #p<0.01 versus anoxie-réoxygénation Fig. 4. — Restauration partielle par le résveratrol de l’anisotropie membranaire mitochondriale augmentée par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation avant les deux séquences ou après l’anoxie comme précédemment. log [résveratrol] M Fig. 5. — Inhibition partielle par le résveratrol de la consommation d’oxygène induite par le cytochrome c (5 μM) et le NADH (10 μM). Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 6 expériences. Bull. Acad. Natl. de Méd., 2001,185, n° 8, 1429-1445, séance du 13 novembre 2001 Fig. 6. — Inhibition par le résveratrol de l’augmentation de la consommation d’oxygène induite par le
altérations induites. Ses effets sont seulement partiels sur le coefficient respiratoire (restauration de 22 % à 10-7 M) : ils s’observent aussi bien lorsque le résveratrol est appliqué avant la double séquence que lorsqu’il est introduit après l’anoxie et avant la réoxygénation. ** p<0.01 versus témoins #p<0.01 versus anoxie-réoxygénation Fig. 4. — Restauration partielle par le résveratrol de l’anisotropie membranaire mitochondriale augmentée par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation avant les deux séquences ou après l’anoxie comme précédemment. log [résveratrol] M Fig. 5. — Inhibition partielle par le résveratrol de la consommation d’oxygène induite par le cytochrome c (5 μM) et le NADH (10 μM). Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 6 expériences. Bull. Acad. Natl. de Méd., 2001,185, n° 8, 1429-1445, séance du 13 novembre 2001 Fig. 6. — Inhibition par le résveratrol de l’augmentation de la consommation d’oxygène induite par le CCCP. Les consommations d’oxygène sont comparées après ajout de CCCP (10 μM) en présence de concentrations croissantes de résveratrol. Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 5 expériences. La valeur basale du témoin est 162 ± 4 nmoles d’O2 / min/mg de protéines. Dans les deux cas on observe que l’effet est bimodal aussi bien dans la restauration de la phosphorylation oxydative que dans la normalisation (diminution) de la respiration basale. Le fait que l’effet soit légèrement mais significativement plus grande lorsqu’il est appliqué avant la double séquence montre que si son effet majeur porte sur la réoxygénation, il est déjà actif au stade de l’anoxie. L’effet prépondérant du résveratrol sur la réoxygénation s’explique facilement par ses propriétés antioxydantes qui sont bien établies [7, 12, 14, 15]. L’effet recouplant observé sur ce modèle est confirmé par la réversion des effets découplants induits par le CCCP : le fait que ces deux résultats aient été observés à des concentrations voisines (EC50 = 5,79 pM et EC50 = 10 pM) permet d’affirmer que le résveratrol est un agent recouplant dans les états d’anoxie suivie de réoxygénation. Les mitochondries ont été isolées d’encéphale de rats traités par des doses variables
on observe que l’effet est bimodal aussi bien dans la restauration de la phosphorylation oxydative que dans la normalisation (diminution) de la respiration basale. Le fait que l’effet soit légèrement mais significativement plus grande lorsqu’il est appliqué avant la double séquence montre que si son effet majeur porte sur la réoxygénation, il est déjà actif au stade de l’anoxie. L’effet prépondérant du résveratrol sur la réoxygénation s’explique facilement par ses propriétés antioxydantes qui sont bien établies [7, 12, 14, 15]. L’effet recouplant observé sur ce modèle est confirmé par la réversion des effets découplants induits par le CCCP : le fait que ces deux résultats aient été observés à des concentrations voisines (EC50 = 5,79 pM et EC50 = 10 pM) permet d’affirmer que le résveratrol est un agent recouplant dans les états d’anoxie suivie de réoxygénation. Les mitochondries ont été isolées d’encéphale de rats traités par des doses variables de resvératrol, injectées par voie sous-cutanée, pendant une semaine. La phosphorylation oxydative ne reprend qu’en partie car le flux normal d’électrons dans la chaîne respiratoire est limité par l’auto-oxydation de chaque cytochrome encore sous forme réduite. Il en résulte une flambée de radicaux libres, issus en particulier du complexe III. C’est la raison pour laquelle de nombreux auteurs ont souligné que le stade de réoxygénation était plus toxique que celui de l’anoxie car il génère des radicaux libres, en particulier O2•, H2O2 puis en l’absence de quantités suffisantes de superoxyde dismutase (Mn SOD), OH• qui en présence de NO• est transformé en peroxynitrite (ONO2) [20]. Tous ces radicaux libres de l’oxygène provoquent une oxydation sévère donc une destruction des lipides et des protéines membranaires. Ces altérations s’observent dans les accidents vasculaires cérébraux [19]. Nous avons vérifié que, dans notre modèle, sans protection, les mêmes dégradations se produisent (mise en évidence de peroxydations par la réduction du bleu de nitrotétrazolium). Le resvératrol inhibe partiellement l’augmentation d’O2•‘ de façon concentration-dépendante. L’effet s’observe lorsqu’il est appliqué à l’ensemble des séquences ou avant la seule réoxygénation. Il est plus important dans le premier cas ce qui confirme qu’un excès de RLO est déjà produit
C’est la raison pour laquelle de nombreux auteurs ont souligné que le stade de réoxygénation était plus toxique que celui de l’anoxie car il génère des radicaux libres, en particulier O2•, H2O2 puis en l’absence de quantités suffisantes de superoxyde dismutase (Mn SOD), OH• qui en présence de NO• est transformé en peroxynitrite (ONO2) [20]. Tous ces radicaux libres de l’oxygène provoquent une oxydation sévère donc une destruction des lipides et des protéines membranaires. Ces altérations s’observent dans les accidents vasculaires cérébraux [19]. Nous avons vérifié que, dans notre modèle, sans protection, les mêmes dégradations se produisent (mise en évidence de peroxydations par la réduction du bleu de nitrotétrazolium). Le resvératrol inhibe partiellement l’augmentation d’O2•‘ de façon concentration-dépendante. L’effet s’observe lorsqu’il est appliqué à l’ensemble des séquences ou avant la seule réoxygénation. Il est plus important dans le premier cas ce qui confirme qu’un excès de RLO est déjà produit pendant la phase d’anoxie. Il s’explique par l’effet de piégeage des RLO du resvératrol, mais beaucoup plus vraisemblablement par l’inhibition de leur production par le complexe III, que nous avons décrite précédemment [7], On peut observer en effet que l'EC50 de l’inhibition de l’activité enzymatique du complexe III, 5,49 nM, est voisine du seuil d’inhibition de la production de O2•‘, 1 nM (Fig. 4). Le modèle d’anoxie-réoxygénation provoque aussi la dissociation du cytochrome c de son ancrage à la membrane interne. Il reproduit ainsi une étape précoce des effets du stress oxydatif [21] et déclenche, par sa libération dans le tampon d’incubation, l’étape mitochondriale de l’apoptose [22], Le cytochrome c en présence de NADH, d'oxygène et de NADH-cytochrome b5 oxydo-réductase, provoque le transfert direct d’équivalents réducteurs (e-) de l’extérieur à l’intérieur de la matrice mitochondriale. Il génère ainsi un potentiel de membrane qui permet l’activation du complexe IV puis la synthèse d’ATP (l’activation du complexe V) nécessaire au développement de l’apoptose [22, 23], On observe que le resvératrol inhibe totalement à 10-7 M, la libération de cytochrome c induite par l’anoxie-réoxygénation. Son efficacité n’est pas différente lorsqu’il est appliqué avant la double séquence ou avant la seule réoxygénation, ce qui
est voisine du seuil d’inhibition de la production de O2•‘, 1 nM (Fig. 4). Le modèle d’anoxie-réoxygénation provoque aussi la dissociation du cytochrome c de son ancrage à la membrane interne. Il reproduit ainsi une étape précoce des effets du stress oxydatif [21] et déclenche, par sa libération dans le tampon d’incubation, l’étape mitochondriale de l’apoptose [22], Le cytochrome c en présence de NADH, d'oxygène et de NADH-cytochrome b5 oxydo-réductase, provoque le transfert direct d’équivalents réducteurs (e-) de l’extérieur à l’intérieur de la matrice mitochondriale. Il génère ainsi un potentiel de membrane qui permet l’activation du complexe IV puis la synthèse d’ATP (l’activation du complexe V) nécessaire au développement de l’apoptose [22, 23], On observe que le resvératrol inhibe totalement à 10-7 M, la libération de cytochrome c induite par l’anoxie-réoxygénation. Son efficacité n’est pas différente lorsqu’il est appliqué avant la double séquence ou avant la seule réoxygénation, ce qui suggère que le phénomène apoptotique mitochondrial est déclenché par le retour de l’oxygène. En diminuant la consommation d’oxygène en présence d’un excès d’ADP, le resvératrol diminue la synthèse d’ATP qui exécute l’apoptose (à partir de 9 M). Comme il a été déjà démontré qu’il est sans effet sur le complexe IV [7], il ne peut être que soit un inhibiteur direct de la NADH cytochrome b5 oxydoréductase, soit agir par son effet recouplant. Le fait que la diminution de synthèse d’ATP par le système bitransmembranaire ne soit que partielle est peu compatible avec une inhibition enzymatique, mais suggère que c’est l’effet recouplant du resvératrol qui est opérant. L’anoxie suivie de la réoxygénation provoque une augmentation de l’anisotropie des membranes mitochondriales, qui indique une rigidification de leur architecture et donc une diminution de leur fluidité. Elle est due principalement aux effets des RLO. Le resvératrol (10-7 M) inhibe totalement cette perte de fluidité : ses effets ne sont pas différents s’il est appliqué avant la double séquence ou avant la seule réoxygénation. Ce résultat confirme, par une méthode physique, les effets protecteurs membranaires déjà observés du resvératrol. Bull. Acad. Natle Méd., 2001,185, n° 8, 1429-1445, séance du 13 novembre 2001 CONCLUSION