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qui piège les particules minérales et des éléments très fins (fig. 8). Les surfaces observées montrent les mêmes structures que celles rencontrées dans le milieu naturel pour d'autres espèces : les orifices des puits de drainage sont surmontés d'un « tissage » de filaments mucilagineux (fig. 9) laissant subsister des orifices libres correspondant au passage des Diatomées. EXPLICATION DES PLANCHES Planche I Microscopie optique Fig. 1. — Microphotographie en contraste de phase d'une culture de N. ramosissima (liquide de montage milieu de culture). Fig. 2. — Microphotographie en contraste de phase de la même culture après calcination incomplète le thalle mucilagineux s'est rétracté. Microscopie électronique à balayage Fig. 3. — Navicules d'une culture de 7 jours soumises à l'action de l'acide nitrique à 50 % pendant 10 h à 70°C les frustules débarrassés de leur mucilage permettent l'identification de l'espèce (12 à 14 stries en 10 μm). Fig. 4. — Détails d'un fragment de couche superficielle de kaolinite montrant les puits de drainage. Fig. 5. — Thalle initial provenant de la culture-mère venant d'être ensemencée sur kaolinite. Fig. 6. — Multiplication des individus nouvellement ensemencés sur kaolinite (10 jours de culture). PLANCHE 1 JEAN-MICHEL ROBERT PLANCHE II Planche II Fig. 7. — Début d'individualisation de filaments mucilagineux entre les individus qui colonisent la couche superficielle de kaolinite. Fig. 8. — « Tissage » mucilagineux entourant une cellule et partiellement masqué par l'agglutination de particules minérales (culture de 20 jours). Fig. 9. — Filaments mucilagineux formant des alvéoles au-dessus des puits de drainage. Fig. 10. — Voile mucilagineux d'une vieille culture (4 mois) recouvrant les Diatomées dont il ne reste que quelques individus perceptibles. Fig. 11. — Coupe longitudinale de la couche superficielle de kaolinite des filaments liés à l'enfouissement des Navicules subsistent dans les interstices. Fig. 12. — N. ramosissima var. mucosa observé à partir de prélèvements effectués in situ : le voile mucilagineux recouvre et protège la pellicule superficielle de vase naturelle. 2.4. Après 4 mois de culture, les navicules ont pratiquement recouvert toute la surface de la kaolinite. Les colonies réunies par de nombreux filaments épaissis par l'accrétion
7. — Début d'individualisation de filaments mucilagineux entre les individus qui colonisent la couche superficielle de kaolinite. Fig. 8. — « Tissage » mucilagineux entourant une cellule et partiellement masqué par l'agglutination de particules minérales (culture de 20 jours). Fig. 9. — Filaments mucilagineux formant des alvéoles au-dessus des puits de drainage. Fig. 10. — Voile mucilagineux d'une vieille culture (4 mois) recouvrant les Diatomées dont il ne reste que quelques individus perceptibles. Fig. 11. — Coupe longitudinale de la couche superficielle de kaolinite des filaments liés à l'enfouissement des Navicules subsistent dans les interstices. Fig. 12. — N. ramosissima var. mucosa observé à partir de prélèvements effectués in situ : le voile mucilagineux recouvre et protège la pellicule superficielle de vase naturelle. 2.4. Après 4 mois de culture, les navicules ont pratiquement recouvert toute la surface de la kaolinite. Les colonies réunies par de nombreux filaments épaissis par l'accrétion de particules minérales (fig. 10), présentent un aspect compact. L'interface vue en coupe longitudinale montre de nombreux interstices tapissés par les mêmes filaments que ceux observés en surface, résultant de la migration des Diatomées jusqu'à une profondeur d'au moins 200 μm (fig. 11). DISCUSSION ET CONCLUSION. — Si la nature chimique et colloïdale du mucilage varie selon les espèces, la morphologie du « tissage » varie aussi en fonction du substrat sur lequel la Diatomée prolifère. L'environnement cellulaire dans le milieu naturel contribue donc à la formation d'archéothalles différents : la teneur en eau liée à l'émersion, l'abondance de puits de drainage selon les substrats, l'accolement d'espèces variées dont les polysaccharides composant le mucilage sont chimiquement différents, sont autant de paramètres qui influent sur la constitution du thalle. L'expérience nous a permis d'en décrire un type dans des conditions précises (milieu toujours immergé, sans agitation) sur un substrat artificiel. La variété mucosa (Aleem) comb. nov. de l'espèce, retrouvée en grande abondance dans la baie de Bourgneuf, présente un thalle de filaments ténus, néanmoins comparable à celui décrit ci-dessus (fig. 12). Dans l'état actuel de nos investigations, il est possible d'affirmer que les formations mucilagineuses décrites par D. Gouleau à la
chimique et colloïdale du mucilage varie selon les espèces, la morphologie du « tissage » varie aussi en fonction du substrat sur lequel la Diatomée prolifère. L'environnement cellulaire dans le milieu naturel contribue donc à la formation d'archéothalles différents : la teneur en eau liée à l'émersion, l'abondance de puits de drainage selon les substrats, l'accolement d'espèces variées dont les polysaccharides composant le mucilage sont chimiquement différents, sont autant de paramètres qui influent sur la constitution du thalle. L'expérience nous a permis d'en décrire un type dans des conditions précises (milieu toujours immergé, sans agitation) sur un substrat artificiel. La variété mucosa (Aleem) comb. nov. de l'espèce, retrouvée en grande abondance dans la baie de Bourgneuf, présente un thalle de filaments ténus, néanmoins comparable à celui décrit ci-dessus (fig. 12). Dans l'état actuel de nos investigations, il est possible d'affirmer que les formations mucilagineuses décrites par D. Gouleau à la surface des vasières ont bien pour origine les Diatomées et correspondent aux « filaments muqueux » qu'elles laissent sur leur passage lors de leurs déplacements horizontaux ou verticaux. Le caractère axénique de la culture éprouvée par ensemencement sur milieu gélosé additionné de Yeast Extract (500 mg/l), ainsi que l'observation en microscopie électronique à balayage ne nous permettent pas d'attribuer ces formations à des bactéries. L'expérience effectuée in vitro permet de décrire les filaments secrétés par N. ramosissima, espèce intertidale très fréquente en baie de Bourgneuf et de confirmer les observations précédentes réalisées in situ sur des populations naturelles de Diatomées benthiques. Les différents types de thalles formés par d'autres espèces communes dans ces faciès littoraux ainsi que leurs interactions restent encore à étudier. (*) Séance du 28 février 1977. (1) Collaboration technique de M. A. Barreau. (2) A. F. HOLLAND, R. G. ZINGMARK et J. M. DEAN, Marine Biology, 27, 1974, p. 191-196. (3) D. GOULEAU, Comptes rendus, 283, série D, 1976, p. 21. (4) J. M. ROBERT, Biométrie cytologique appliquée à l'étude des stades de développement du Navicula ostrearia Bory en rapport avec le verdissement des claires de la baie de Bourgneuf, Thèse de 3e cycle (vol. 1), Nantes,
microscopie électronique à balayage ne nous permettent pas d'attribuer ces formations à des bactéries. L'expérience effectuée in vitro permet de décrire les filaments secrétés par N. ramosissima, espèce intertidale très fréquente en baie de Bourgneuf et de confirmer les observations précédentes réalisées in situ sur des populations naturelles de Diatomées benthiques. Les différents types de thalles formés par d'autres espèces communes dans ces faciès littoraux ainsi que leurs interactions restent encore à étudier. (*) Séance du 28 février 1977. (1) Collaboration technique de M. A. Barreau. (2) A. F. HOLLAND, R. G. ZINGMARK et J. M. DEAN, Marine Biology, 27, 1974, p. 191-196. (3) D. GOULEAU, Comptes rendus, 283, série D, 1976, p. 21. (4) J. M. ROBERT, Biométrie cytologique appliquée à l'étude des stades de développement du Navicula ostrearia Bory en rapport avec le verdissement des claires de la baie de Bourgneuf, Thèse de 3e cycle (vol. 1), Nantes, 1974, 52 p. e) J. M. ROBERT, Rev. Trav. Inst. Pêches marit., 37, (3), 1973, p. 363-368. (6) Isolement par J. M. Robert; détermination par M. H. Germain. (7) A. WATANABE, J. Gen. appl. Microbiol., 6, p. 283-292. (8) D. GOULEAU, les premiers stades de la sédimentation fine sur les vasières littorales découvrantes. Rôle de l'émersion, Thèse d'État (2 vol), Nantes, 1975, 241 + 123 pages. (9) J. A. HELLEBUST, Extracellular Products, in Algal physiology and biochemistry, W. D. P. Stewart, Blackwell, Oxford, 1974, p. 838-863. (11) K. IWASA et A. SHIMIZU, Experimental Cell Research, 74, 1972, p. Laboratoire de Biologie marine et d’Écologie animale, Laboratoire de Géologie marine et appliquée, U.E.R. Sciences de la Nature, 38, boulevard Michelet, B. P. n° 1044, 44037 Nantes Cedex. BIOLOGIE DU DÉVELOPPEMENT. — Les fragments monovalents d’immunoglobulines de Lapin anti-F 9 empêchent la formation de blastocystes chez la Souris. Note de Charles Babinet, Rolf Kemler, Philippe Dubois et François Jacob, Membre de l’Académie. Les fragments Fab de sérum de Lapin anti-F 9 ne perturbent pas la segmentation d’embryons de Souris en culture mais empêchent la formation de blastocystes. Cet effet est réversible pendant quelques heures. On ne l’observe ni avec des fragments Fab
vasières littorales découvrantes. Rôle de l'émersion, Thèse d'État (2 vol), Nantes, 1975, 241 + 123 pages. (9) J. A. HELLEBUST, Extracellular Products, in Algal physiology and biochemistry, W. D. P. Stewart, Blackwell, Oxford, 1974, p. 838-863. (11) K. IWASA et A. SHIMIZU, Experimental Cell Research, 74, 1972, p. Laboratoire de Biologie marine et d’Écologie animale, Laboratoire de Géologie marine et appliquée, U.E.R. Sciences de la Nature, 38, boulevard Michelet, B. P. n° 1044, 44037 Nantes Cedex. BIOLOGIE DU DÉVELOPPEMENT. — Les fragments monovalents d’immunoglobulines de Lapin anti-F 9 empêchent la formation de blastocystes chez la Souris. Note de Charles Babinet, Rolf Kemler, Philippe Dubois et François Jacob, Membre de l’Académie. Les fragments Fab de sérum de Lapin anti-F 9 ne perturbent pas la segmentation d’embryons de Souris en culture mais empêchent la formation de blastocystes. Cet effet est réversible pendant quelques heures. On ne l’observe ni avec des fragments Fab dirigés contre un autre antigène de surface des blastomères, ni avec la concanavaline A monovalente. Fab fragments of a Rabbit anti-F 9 serum do not disturb cleavage of Mouse embryos in culture but prevent blastocyst formation. This effect is reversible for a few hours. It is observed neither with Fab fragments directed against another surface antigen of blastomers nor with monovalent concanavalin A. L’immunisation de souris syngéniques par des cellules de carcinome embryonnaire isolées d’un tératocarcinome testiculaire a permis de montrer, sur ces cellules, la présence d’un antigène de surface appelé F 9. Chez l’adulte cet antigène est présent sur les cellules de la lignée germinale mâle mais non sur les cellules somatiques examinées. Chez l’embryon, où il peut être décelé quelques heures après fécondation, on le trouve en abondance sur les cellules en segmentation. Dans le blastocyste, il est présent sur les cellules du trophectoderme et de la masse interne. Pour préciser le rôle éventuel de l’antigène F 9 dans la différenciation, on a recherché si, en culture, l’addition de sérum anti-F 9 à des embryons précoces empêchait la transition morule-blastocyste. MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les embryons provenaient de croisements entre hybrides C57BL/6 x CBA. Ils étaient récoltés par
fragments directed against another surface antigen of blastomers nor with monovalent concanavalin A. L’immunisation de souris syngéniques par des cellules de carcinome embryonnaire isolées d’un tératocarcinome testiculaire a permis de montrer, sur ces cellules, la présence d’un antigène de surface appelé F 9. Chez l’adulte cet antigène est présent sur les cellules de la lignée germinale mâle mais non sur les cellules somatiques examinées. Chez l’embryon, où il peut être décelé quelques heures après fécondation, on le trouve en abondance sur les cellules en segmentation. Dans le blastocyste, il est présent sur les cellules du trophectoderme et de la masse interne. Pour préciser le rôle éventuel de l’antigène F 9 dans la différenciation, on a recherché si, en culture, l’addition de sérum anti-F 9 à des embryons précoces empêchait la transition morule-blastocyste. MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les embryons provenaient de croisements entre hybrides C57BL/6 x CBA. Ils étaient récoltés par lavage des oviductes à des temps variables du développement, le plus souvent au stade 2. Ils étaient cultivés en milieu de Whitten selon la technique en microgoutte sous huile de paraffine à 37°. Selon les cas, les embryons avaient ou non été débarrassés de leur zone pellucide. Deux lignées de cellules dérivées d’un tératocarcinome, F 9 et PYS-2, celle-ci dépourvue d’antigène F 9, ont été utilisées. Un lapin a été immunisé avec des cellules F 9 (5 injections de 5. 10^2 cellules en 2 mois). Après inactivation par la chaleur (30 mn à 56°), le sérum a été absorbé sur cellules PYS-2 et sur lymphocytes de Souris C57BL/6 x CBA. En présence de complément, ce sérum absorbé reste cytotoxique pour les cellules F 9 (titre : 1/160 à 1 /320) et sera désigné « Lapin anti-F 9 ». En fluorescence indirecte, il marque les cellules de morule (titre : 1/80). Cette fixation est inhibée par un traitement préalable des morules avec du sérum de Souris syngénique anti-F 9. Ce sérum de Lapin contient une autre activité dirigée contre un antigène de surface commun aux cellules F 9 et aux lymphocytes. Cette activité, qui peut être séparée de l’activité anti-F 9
cellules dérivées d’un tératocarcinome, F 9 et PYS-2, celle-ci dépourvue d’antigène F 9, ont été utilisées. Un lapin a été immunisé avec des cellules F 9 (5 injections de 5. 10^2 cellules en 2 mois). Après inactivation par la chaleur (30 mn à 56°), le sérum a été absorbé sur cellules PYS-2 et sur lymphocytes de Souris C57BL/6 x CBA. En présence de complément, ce sérum absorbé reste cytotoxique pour les cellules F 9 (titre : 1/160 à 1 /320) et sera désigné « Lapin anti-F 9 ». En fluorescence indirecte, il marque les cellules de morule (titre : 1/80). Cette fixation est inhibée par un traitement préalable des morules avec du sérum de Souris syngénique anti-F 9. Ce sérum de Lapin contient une autre activité dirigée contre un antigène de surface commun aux cellules F 9 et aux lymphocytes. Cette activité, qui peut être séparée de l’activité anti-F 9 par absorption sur lymphocytes suivie d’élution, sera appelée « Lapin anti-lymphocyte ». En présence de complément, elle est cytotoxique pour les cellules F 9 et les lymphocytes (titre : 1/600). La fraction immunoglobuline (Ig)G du sérum de Lapin non absorbé a été purifiée et des fragments monovalents (Fab) préparés. La fraction Fab anti-F 9 a été obtenue par absorption de cette préparation sur cellules PYS-2 et lymphocytes; la fraction Fab anti-lymphocytes par absorption sur lymphocytes et élution comme précédemment. L’activité de ces préparations sur les cellules ou les embryons a été déterminée par immunofluorescence indirecte selon la technique décrite. La préparation Fab anti-F 9 marque les morules jusqu’au 1/80; la préparation Fab anti-lymphocyte jusqu’au 1/160. RÉSULTATS. — Dans les conditions de culture utilisées, les embryons prélevés au stade 2 poursuivent leur développement : sur 167 embryons, 149 se sont bien développés (122 blastocystes et 27 morules après 66 h), 18 seulement s’arrêtant à des stades précoces. On a recherché si la fixation d’anticorps sur l’antigène F 9 perturbait ce développement. On a donc ajouté au milieu du sérum de Souris ou de Lapin anti-F 9 en concentrations variables et renouvelé toutes les 24 heures le milieu contenant le sérum. Aucun
fraction Fab anti-F 9 a été obtenue par absorption de cette préparation sur cellules PYS-2 et lymphocytes; la fraction Fab anti-lymphocytes par absorption sur lymphocytes et élution comme précédemment. L’activité de ces préparations sur les cellules ou les embryons a été déterminée par immunofluorescence indirecte selon la technique décrite. La préparation Fab anti-F 9 marque les morules jusqu’au 1/80; la préparation Fab anti-lymphocyte jusqu’au 1/160. RÉSULTATS. — Dans les conditions de culture utilisées, les embryons prélevés au stade 2 poursuivent leur développement : sur 167 embryons, 149 se sont bien développés (122 blastocystes et 27 morules après 66 h), 18 seulement s’arrêtant à des stades précoces. On a recherché si la fixation d’anticorps sur l’antigène F 9 perturbait ce développement. On a donc ajouté au milieu du sérum de Souris ou de Lapin anti-F 9 en concentrations variables et renouvelé toutes les 24 heures le milieu contenant le sérum. Aucun effet n’a été observé ni avec le sérum de Souris au 1/20 (31 blastocystes formés en 68 h sur 40 embryons) ni avec le sérum de Lapin au 1/20 (19 blastocystes sur 23 embryons). Certains effets biologiques dus à des anticorps dirigés contre des antigènes de surface ne se produisent que si l’on utilise non des anticorps divalents mais des fragments monovalents Fab. En effet l’addition de fragments Fab de Lapins anti-F 9 — solution à 3,4 mg de protéines par millilitre (correspondant à la concentration du sérum initial en IgG) diluée à 1/20 ou 1/40 — aux cultures d’embryons exerce un effet prononcé : la segmentation à partir du stade 2 se poursuit normalement ; après 48 h, quand les embryons des cultures témoins forment des morules compactes aux limites cellulaires mal visibles, les embryons cultivés en présence de Fab présentent une structure en grappe de raisin aux cellules bien individualisées (fig.). Dans les 2 cultures, une petite fraction (10 à 15 %) des embryons ne s’est pas développée. Après 66 h, la majorité des embryons témoins ont atteint le stade blastocyste; les embryons cultivés en Fab n’ont pas formé de blastocyste et conservent leur structure en grappe. Si
que si l’on utilise non des anticorps divalents mais des fragments monovalents Fab. En effet l’addition de fragments Fab de Lapins anti-F 9 — solution à 3,4 mg de protéines par millilitre (correspondant à la concentration du sérum initial en IgG) diluée à 1/20 ou 1/40 — aux cultures d’embryons exerce un effet prononcé : la segmentation à partir du stade 2 se poursuit normalement ; après 48 h, quand les embryons des cultures témoins forment des morules compactes aux limites cellulaires mal visibles, les embryons cultivés en présence de Fab présentent une structure en grappe de raisin aux cellules bien individualisées (fig.). Dans les 2 cultures, une petite fraction (10 à 15 %) des embryons ne s’est pas développée. Après 66 h, la majorité des embryons témoins ont atteint le stade blastocyste; les embryons cultivés en Fab n’ont pas formé de blastocyste et conservent leur structure en grappe. Si ces cultures sont maintenues en présence de Fab, des vacuoles apparaissent dans les cellules qui se lysent après 5 ou 6 jours. On a obtenu des résultats semblables sans enlever la zone pellucide et sans renouveler régulièrement le milieu et les FAB. Pour préciser la spécificité de cet effet, plusieurs expériences ont été effectuées. 1° Après absorption de la suspension de FAB anti-F9 par des cellules F9, l'effet sur les embryons disparaît. 2° L’addition de fragments FAB anti-lymphocytes (1/20) aux cultures d’embryons ne perturbe pas leur développement (sur 58 embryons, 48 forment des blastocystes en 66 h et 3 des morules avancées). 3° À la concentration de 50 μg/ml, la concanavaline (Con) A monovalente se fixe sur les blastomères : les anticorps anti-Con A conjugués à la rhodamine les marquent fortement; à la même concentration, la Con A monovalente ne perturbe pas le développement des embryons. La première de ces expériences montre que l’effet des FAB anti-F9 est bien dû au blocage d’un site de surface commun aux cellules F9 et aux blastomères; les 2 autres que cet effet n’est pas obtenu en bloquant n’importe quel site à la surface des blastomères. Les FAB anti-F9 ne modifient pas la segmentation.
expériences ont été effectuées. 1° Après absorption de la suspension de FAB anti-F9 par des cellules F9, l'effet sur les embryons disparaît. 2° L’addition de fragments FAB anti-lymphocytes (1/20) aux cultures d’embryons ne perturbe pas leur développement (sur 58 embryons, 48 forment des blastocystes en 66 h et 3 des morules avancées). 3° À la concentration de 50 μg/ml, la concanavaline (Con) A monovalente se fixe sur les blastomères : les anticorps anti-Con A conjugués à la rhodamine les marquent fortement; à la même concentration, la Con A monovalente ne perturbe pas le développement des embryons. La première de ces expériences montre que l’effet des FAB anti-F9 est bien dû au blocage d’un site de surface commun aux cellules F9 et aux blastomères; les 2 autres que cet effet n’est pas obtenu en bloquant n’importe quel site à la surface des blastomères. Les FAB anti-F9 ne modifient pas la segmentation. Ils semblent agir en perturbant les interactions cellulaires, empêchant ainsi la formation du blastocyste. L’effet devrait donc être réversible pendant quelque temps. Des embryons ont été cultivés en présence de FAB anti-F9 pendant 50 h, puis lavés et maintenus en culture sans FAB ou transplantés dans des femelles en pseudogestation (par accouplement avec des mâles stériles). Dans une première expérience, 41 embryons au stade 2 ont été cultivés en présence de FAB à 1/20. Après 53 h, 27 embryons avaient 30 cellules ou plus, 5 de 10 à 12 et 9 de 4 à 8. Les 27 premiers ont été lavés et remis en culture sans FAB. Après 2 h, 10 embryons ont été implantés dans 2 femelles au 3e jour de pseudogestation. Les 17 autres ont été laissés en culture pendant 12 h supplémentaires : 12 avaient alors formé des blastocystes et les 5 autres présentaient un aspect normal de morules compactes. 10 des 12 blastocystes ont été réimplantés dans une femelle en pseudogestation. De ces 3 femelles, seule la dernière a donné naissance à 2 souris. Dans une autre expérience, 57 embryons ont été cultivés en présence de FAB anti-F9 à 1/20. Après 50 h, 41 embryons comprenant
(par accouplement avec des mâles stériles). Dans une première expérience, 41 embryons au stade 2 ont été cultivés en présence de FAB à 1/20. Après 53 h, 27 embryons avaient 30 cellules ou plus, 5 de 10 à 12 et 9 de 4 à 8. Les 27 premiers ont été lavés et remis en culture sans FAB. Après 2 h, 10 embryons ont été implantés dans 2 femelles au 3e jour de pseudogestation. Les 17 autres ont été laissés en culture pendant 12 h supplémentaires : 12 avaient alors formé des blastocystes et les 5 autres présentaient un aspect normal de morules compactes. 10 des 12 blastocystes ont été réimplantés dans une femelle en pseudogestation. De ces 3 femelles, seule la dernière a donné naissance à 2 souris. Dans une autre expérience, 57 embryons ont été cultivés en présence de FAB anti-F9 à 1/20. Après 50 h, 41 embryons comprenant 30 cellules ou plus ont été lavés et remis en culture sans FAB. Après 3 h ils ont été réimplantés dans 4 femelles en pseudogestation. Seules 3 d’entre elles (33 embryons implantés) ont mis bas : 16 souris soit 48 % des embryons réimplantés. Il est donc clair que des embryons tout d’abord perturbés dans leur développement par des FAB anti-F9 peuvent, après lavage, produire non seulement 1 blastocyste, mais même 1 souris. DISCUSSION. — La présence de fragments monovalents d’IgG de Lapin anti-F9 dans les cultures d’embryons, 1° ne perturbe pas la segmentation, 2° empêche la formation du blastocyste en modifiant, semble-t-il, les interactions des blastomères, 3° n’altère pas, pendant quelques heures, les potentialités de ceux-ci qui, débarrassés des FAB, peuvent produire un animal viable. Tout se passe donc comme si le blocage d’un site de surface cellulaire par le fragment monovalent d’IgG empêchait une interaction des blastomères nécessaire à la différenciation du blastocyste. Ce site paraît être spécifique puisque ni les FAB dirigés contre un autre site, ni la Con A monovalente n’exercent cet effet. Des expériences préliminaires indiquent que les FAB de Lapin anti-F9 inhibent aussi la différenciation in vitro des cellules de carcinome embryonnaire isolées de