jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
le milieu de culture ne modifie pas l'activité phosphatase alcaline des cellules transformées EHSVi; au contraire, l'effet de ce facteur est net sur les cellules normales EHB (fig. 1) : on observe une augmentation d'activité proportionnelle à la concentration en théophylline, et déjà visible à la concentration de 10-5 M. Cet effet est annulé par le cycloheximide. Il semble que la stimulation atteigne un maximum à partir d'une concentration de 10-3 M en théophylline. Fig. 1 Fig. 2 Fig. 1. — Effet de la théophylline sur l'activité phosphatase alcaline des cellules normales EHB et transformées EHSVi. La théophylline a été ajoutée un jour après l'ensemencement des cellules et l'activité mesurée 24 h après. I, + théophylline 10-1 M; II, + théophylline 10-3 M; III, + théophylline 10-3 M; IV, + théophylline 10-2 M. Fig. 2. — Effet inhibiteur de la théophylline sur l'activité phosphatase alcaline des cellules normales EHB. Abscisse : concentration en théophylline du milieu réactionnel. Ordonnée en pourcentages d'activité résiduelle. 0 -0 Cellules normales EHB. A A Cellules transformées EHSVi. L'addition de théophylline lors de la mesure de l'activité enzymatique a été étudiée et les résultats sont exprimés en pourcentage d'activité résiduelle en fonction de la concentration en théophylline (fig. 2). On constate là aussi, une différence de comportement entre cellules normales et cellules transformées : alors que la phosphatase alcaline de ces dernières reste pratiquement insensible à la théophylline et garde 90 % de son activité en présence de théophylline 10-2 M, l'enzyme des cellules normales EHB est inhibée par la théophylline, l'activité résiduelle étant d'environ 10 % pour une concentration de 10-2 M d'inhibiteur. L'inhibition de la phosphatase alcaline des cellules normales par la théophylline semble être de caractère non compétitif (fig. 3). La valeur du Km apparent n'étant pas modifiée. Ainsi, dans les cellules normales, la théophylline est à la fois inhibiteur et stimulateur de la synthèse. Pour savoir si l'induction observée en présence de théophylline résulte de l'effet propre de ce facteur ou de son effet sur le taux intracellulaire d'AMP cyclique, nous avons comparé son action à celle d'un autre inhibiteur de la
théophylline (fig. 2). On constate là aussi, une différence de comportement entre cellules normales et cellules transformées : alors que la phosphatase alcaline de ces dernières reste pratiquement insensible à la théophylline et garde 90 % de son activité en présence de théophylline 10-2 M, l'enzyme des cellules normales EHB est inhibée par la théophylline, l'activité résiduelle étant d'environ 10 % pour une concentration de 10-2 M d'inhibiteur. L'inhibition de la phosphatase alcaline des cellules normales par la théophylline semble être de caractère non compétitif (fig. 3). La valeur du Km apparent n'étant pas modifiée. Ainsi, dans les cellules normales, la théophylline est à la fois inhibiteur et stimulateur de la synthèse. Pour savoir si l'induction observée en présence de théophylline résulte de l'effet propre de ce facteur ou de son effet sur le taux intracellulaire d'AMP cyclique, nous avons comparé son action à celle d'un autre inhibiteur de la phosphodiestérase : la caféine. Le tableau montre l'effet de ces deux facteurs sur la croissance et l'activité enzymatique des deux types cellulaires. Les cellules transformées EHSVi sont insensibles Fig. 3. — Détermination des caractéristiques cinétiques de la phosphatase alcaline. Courbes 1/V = 1/s. 0 O Cellules normales EHB. # # Cellules normales EHB + théophylline 10-3 M. V est exprimée en nanomoles/h/mg protéines. à la présence de théophylline ou de caféine 10-3 M dans le milieu. La caféine, comme la théophylline, inhibe la croissance des cellules normales EHB, mais à un degré moindre. Par contre, alors qu'on observe une stimulation de 500 % avec la théophylline, la caféine n'augmente que faiblement l'activité (environ 40 %). Dans ces mêmes cellules, la caféine n'inhibe que faiblement l'activité phosphatase alcaline (inhibition de l'ordre de 15% à la concentration de 10-3 M) alors que nous avons vu (fig. 2) que la théophylline 10-3 M inhibe l'enzyme à 80 %. Il semble donc que l'on puisse faire une relation entre le caractère d'inhibiteur compétitif de la théophylline et son effet stimulateur de la synthèse. TABLEAU Effet de la théophylline et de la caféine 10-3 M sur la croissance et sur l'activité phosphatase alcaline des cellules.
Cellules normales EHB + théophylline 10-3 M. V est exprimée en nanomoles/h/mg protéines. à la présence de théophylline ou de caféine 10-3 M dans le milieu. La caféine, comme la théophylline, inhibe la croissance des cellules normales EHB, mais à un degré moindre. Par contre, alors qu'on observe une stimulation de 500 % avec la théophylline, la caféine n'augmente que faiblement l'activité (environ 40 %). Dans ces mêmes cellules, la caféine n'inhibe que faiblement l'activité phosphatase alcaline (inhibition de l'ordre de 15% à la concentration de 10-3 M) alors que nous avons vu (fig. 2) que la théophylline 10-3 M inhibe l'enzyme à 80 %. Il semble donc que l'on puisse faire une relation entre le caractère d'inhibiteur compétitif de la théophylline et son effet stimulateur de la synthèse. TABLEAU Effet de la théophylline et de la caféine 10-3 M sur la croissance et sur l'activité phosphatase alcaline des cellules. Les facteurs ont été ajoutés un jour après la mise en culture des cellules et la durée de l'effet est de 24 h. Cellules normales EHB Cellules transformées EHSVi - Addition Th 10-3 M Caf. 10-3 M Th 10-3 M Caf. 10-3 M mg protéines/flacon.. 1 350 ± 200 1 050 ± 100 1 200 ± 100 2 450 ± 250 2 400 ± 200 2 430 ± 230 Activité phosphatase alcaline 25 ± 5 150 ± 20 35 ± 5 10 ± 2 9 ±2 10 ± 2 DISCUSSION. — En ce qui concerne les cellules normales, l'addition de théophylline au milieu de culture entraîne une stimulation de la synthèse de la phosphatase alcaline alors que ce facteur est un inhibiteur non compétitif de l'enzyme. Dans les cellules transformées, la théophylline n'est ni stimulateur ni inhibiteur. Il est possible d'imaginer que la présence dans le milieu de culture d'un inhibiteur non compétitif de l'enzyme puisse entraîner un phénomène de dérépression au niveau des gènes régulateurs, selon le schéma suivant : la phosphatase alcaline pourrait faire partie d'une chaîne métabolique conduisant à un produit final répresseur de l'enzyme, selon le modèle classique. La théophylline, inhibiteur non compétitif de la phosphatase
050 ± 100 1 200 ± 100 2 450 ± 250 2 400 ± 200 2 430 ± 230 Activité phosphatase alcaline 25 ± 5 150 ± 20 35 ± 5 10 ± 2 9 ±2 10 ± 2 DISCUSSION. — En ce qui concerne les cellules normales, l'addition de théophylline au milieu de culture entraîne une stimulation de la synthèse de la phosphatase alcaline alors que ce facteur est un inhibiteur non compétitif de l'enzyme. Dans les cellules transformées, la théophylline n'est ni stimulateur ni inhibiteur. Il est possible d'imaginer que la présence dans le milieu de culture d'un inhibiteur non compétitif de l'enzyme puisse entraîner un phénomène de dérépression au niveau des gènes régulateurs, selon le schéma suivant : la phosphatase alcaline pourrait faire partie d'une chaîne métabolique conduisant à un produit final répresseur de l'enzyme, selon le modèle classique. La théophylline, inhibiteur non compétitif de la phosphatase alcaline, en diminuant la concentration du produit final répresseur entraînerait une augmentation de la synthèse de l'enzyme (ce processus est inhibé par le cycloheximide). Toutefois, le rôle de la phosphatase alcaline et les voies métaboliques auxquelles elle pourrait participer étant encore mal connus, il est difficile de vérifier cette hypothèse. Il est de plus malaisé de dissocier cet effet éventuel propre de la théophylline de son effet par l'intermédiaire du taux intracellulaire d'AMP cyclique. Il semble en effet [(6), C] que l'AMP cyclique soit également stimulateur de la synthèse de la phosphatase alcaline. Enfin, la différence de sensibilité à la théophylline de la phosphatase alcaline des cellules normales et transformées pourrait être liée à l'existence d'isoenzymes différents dans les deux types cellulaires. (*) Séance du 21 mars 1977. (1) C. W. LIN et M. SASAKI, J. Histochem. Cytochem., 24. 1976, p. 659. (2) H. M. NITOWSKY, F. HERZ et S. GELLER, Biochem. Biophys. Res. Com., 12, 1963, p. 293. (3) D. BULMER, J. Cell. Physiol., 87, 1976, p. 357. (4) R. P. Cox et C. M. MACLEOD, Nature, 190, 1961. p. 85. (5) N. K. GHOSH, A. RUKENSTEIN, R. BALTIMORE et R. P. Cox, Biochem. Biophys. Acta, 286, 1972, p.
Il est de plus malaisé de dissocier cet effet éventuel propre de la théophylline de son effet par l'intermédiaire du taux intracellulaire d'AMP cyclique. Il semble en effet [(6), C] que l'AMP cyclique soit également stimulateur de la synthèse de la phosphatase alcaline. Enfin, la différence de sensibilité à la théophylline de la phosphatase alcaline des cellules normales et transformées pourrait être liée à l'existence d'isoenzymes différents dans les deux types cellulaires. (*) Séance du 21 mars 1977. (1) C. W. LIN et M. SASAKI, J. Histochem. Cytochem., 24. 1976, p. 659. (2) H. M. NITOWSKY, F. HERZ et S. GELLER, Biochem. Biophys. Res. Com., 12, 1963, p. 293. (3) D. BULMER, J. Cell. Physiol., 87, 1976, p. 357. (4) R. P. Cox et C. M. MACLEOD, Nature, 190, 1961. p. 85. (5) N. K. GHOSH, A. RUKENSTEIN, R. BALTIMORE et R. P. Cox, Biochem. Biophys. Acta, 286, 1972, p. 175. H. KOYAMA, R. KATO et T. ONO, Biochem. Biophys. Res. Comm., 46, 1972, p. 305. J. C. MAZIÈRE, C. MAZIÈRE et J. POLONOVSKI, Biochimie, 1977 (sous presse). E. MIEDEMA, Exp. Cell. Res., 53, 1968, p. 488. M. ABERCOMBIE et E. S. AMBROSE, Cancer Res., 22, 1962, p. 525. J. SHEPPARD, Proc. Natl. Acad. Sci., 68, 1971, p. 1316. P. TOURNIER et R. CASSINGENA, Int. J. Cancer, 2, 1967, p. 117. SERVICE DE CHIMIE BIOL. 27, rue Chaligny 75571 Paris Cedex 12. BIOLOGIE CELLULAIRE. — Isolement et purification de fractions membranaires chez les ovocytes de Perinereis cultrifera Grube (Annélide Polychète). Note de François Caner, Maurice Porchet, André Dhainaut et Claude Dissous, transmise par M. Maurice Durchon. Une technique de fractionnement cellulaire est décrite permettant la préparation et la purification des enveloppes et des dictyosomes des ovocytes de Perinereis cultrifera. Les examens en microscopie électronique montrent que ces membranes ont une morphologie très comparable à celle observée in situ. Les substances muqueuses des alvéoles corticaux sont également purifiées. A cell fractionation procedure is described which allows the preparation and the purification from Perinereis cultrifera of oocyte envelopes and dictyosomes. Electron microscope examinations revealed that morphology of both membrane fractions were very
SHEPPARD, Proc. Natl. Acad. Sci., 68, 1971, p. 1316. P. TOURNIER et R. CASSINGENA, Int. J. Cancer, 2, 1967, p. 117. SERVICE DE CHIMIE BIOL. 27, rue Chaligny 75571 Paris Cedex 12. BIOLOGIE CELLULAIRE. — Isolement et purification de fractions membranaires chez les ovocytes de Perinereis cultrifera Grube (Annélide Polychète). Note de François Caner, Maurice Porchet, André Dhainaut et Claude Dissous, transmise par M. Maurice Durchon. Une technique de fractionnement cellulaire est décrite permettant la préparation et la purification des enveloppes et des dictyosomes des ovocytes de Perinereis cultrifera. Les examens en microscopie électronique montrent que ces membranes ont une morphologie très comparable à celle observée in situ. Les substances muqueuses des alvéoles corticaux sont également purifiées. A cell fractionation procedure is described which allows the preparation and the purification from Perinereis cultrifera of oocyte envelopes and dictyosomes. Electron microscope examinations revealed that morphology of both membrane fractions were very similar to that observed in situ. Mucous compounds of cortical alveoli were also purified. Les études d'Endocrinologie poursuivies chez les Néréidiens, au niveau cellulaire, concernent très souvent l'ovocyte. Si les recherches ultrastructurales, autoradiographiques et biochimiques relatives à cette cellule « cible » sont nombreuses, on ne possède, par contre, aucune donnée sur le mode d'action de l'hormone cérébrale au niveau subcellulaire. C'est pourquoi, nous avons entrepris le fractionnement des organites cytoplasmiques de l'ovocyte de Perinereis cultrifera. Les techniques habituelles employées à cet effet étant révélées inadaptées à notre matériel, nous avons mis au point un procédé original. MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Préparation des ovocytes. — Les ovocytes isolés, 1 g environ, sont lavés dans du saccharose 0,25 M, préparé comme toutes les autres solutions de saccharose dans du tampon Tris/Hcl, 50 mM, pH 7,4. Ils sont ensuite homogénéisés. Préparation des fractions selon Dissous. — L'homogénéat est amené à une concentration finale en saccharose de 1,89 M. 15 ml sont déposés au fond de tubes de 60 ml et ensuite recouverts par 25 ml de saccharose 1,80 M et 10 ml de saccharose 1,15 M. Après centrifugation en rotor « SW 25-2 » (Beckman) (39 000 g, 90 mn) le matériel
donnée sur le mode d'action de l'hormone cérébrale au niveau subcellulaire. C'est pourquoi, nous avons entrepris le fractionnement des organites cytoplasmiques de l'ovocyte de Perinereis cultrifera. Les techniques habituelles employées à cet effet étant révélées inadaptées à notre matériel, nous avons mis au point un procédé original. MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Préparation des ovocytes. — Les ovocytes isolés, 1 g environ, sont lavés dans du saccharose 0,25 M, préparé comme toutes les autres solutions de saccharose dans du tampon Tris/Hcl, 50 mM, pH 7,4. Ils sont ensuite homogénéisés. Préparation des fractions selon Dissous. — L'homogénéat est amené à une concentration finale en saccharose de 1,89 M. 15 ml sont déposés au fond de tubes de 60 ml et ensuite recouverts par 25 ml de saccharose 1,80 M et 10 ml de saccharose 1,15 M. Après centrifugation en rotor « SW 25-2 » (Beckman) (39 000 g, 90 mn) le matériel ovocytaire se répartit en trois fractions (culot, interphases des solutions de saccharose 1,80/1,89 M et 1,15/1,80 M) plus une fraction surnageante, de nature lipidique, qui est éliminée. Purification des fractions. — (a) Fraction de l'interphase 1,15/1,80 M. — 7 ml de cette fraction sont déposés au fond de tubes de 34 ml puis recouverts par trois couches de saccharose (1,25; 1,15; 0,90 M) de même volume. Après centrifugation (30 000 g, 120 mn) en rotor « SW 25-1 », on obtient quatre sous-fractions : M1, M2, M3 et M4 (fig. 1). (b) Fraction du culot. — Le culot de la centrifugation initiale est repris par du saccharose 0,90 M et homogénéisé à nouveau. 7 ml de cette suspension sont déposés sur un gradient discontinu composé de 5 ml de 2,30 M, 10 ml de 1,80 M, et 5 ml de 1,15 M en saccharose. La fraction purifiée sédimente et constitue le culot après centrifugation en rotor « SW 25-1 » (63 500 g, 150 mn). Examen des fractions. — Toutes les fractions sont sédimentées à nouveau dans du saccharose 1 M (80 000 g, 45 mn) en « rotor SW 40 ». Les culots sont fixés pour la microscopie électronique
34 ml puis recouverts par trois couches de saccharose (1,25; 1,15; 0,90 M) de même volume. Après centrifugation (30 000 g, 120 mn) en rotor « SW 25-1 », on obtient quatre sous-fractions : M1, M2, M3 et M4 (fig. 1). (b) Fraction du culot. — Le culot de la centrifugation initiale est repris par du saccharose 0,90 M et homogénéisé à nouveau. 7 ml de cette suspension sont déposés sur un gradient discontinu composé de 5 ml de 2,30 M, 10 ml de 1,80 M, et 5 ml de 1,15 M en saccharose. La fraction purifiée sédimente et constitue le culot après centrifugation en rotor « SW 25-1 » (63 500 g, 150 mn). Examen des fractions. — Toutes les fractions sont sédimentées à nouveau dans du saccharose 1 M (80 000 g, 45 mn) en « rotor SW 40 ». Les culots sont fixés pour la microscopie électronique par la glutaraldéhyde à 3 p. 100 (Tampon phosphate 0,2 M, pH 7,2) puis par l'osmium. RÉSULTATS. — La bonne connaissance de la morphologie in situ des ovocytes (1), (2), (3) a permis de retenir, comme seul critère de mise au point du fractionnement, l'examen en microscopie électronique des fractions. Les conditions d'utilisation des enzymes marqueurs ne sont, en effet, pas définies pour ce matériel. Schéma de fractionnement de quelques constituants cytoplasmiques des ovocytes de P. cultrifera. L, lipides surnageants; MI, membranes internes; AC, alvéoles corticaux; E, enveloppes ovocytaires; M1, M2, M3, et M4, différents niveaux de membranes (explication dans le texte). I. Isolement de l'appareil de Golgi et des membranes ovocytaires. — L'ensemble des membranes internes de l'ovocyte (dictyosomes, réticulum, vésicules...) migre à l'interphase des solutions de saccharose 1,15/1,80 M lors de la centrifugation initiale. C'est une fraction hétérogène, contaminée par des mitochondries, quelques alvéoles corticaux et parfois des lobules de vitellus (pl I, fig. 1). La purification de l'ensemble conduit aux quatre sous-fractions : M1, M2, M3 et M4 (voir Matériel et Méthodes) : La sous-fraction M1, très pauvre en organites, n'a pas été analysée. La sous-fraction M2, située à l'interphase 1,15/1,25 M est riche en dictyosomes et
Les conditions d'utilisation des enzymes marqueurs ne sont, en effet, pas définies pour ce matériel. Schéma de fractionnement de quelques constituants cytoplasmiques des ovocytes de P. cultrifera. L, lipides surnageants; MI, membranes internes; AC, alvéoles corticaux; E, enveloppes ovocytaires; M1, M2, M3, et M4, différents niveaux de membranes (explication dans le texte). I. Isolement de l'appareil de Golgi et des membranes ovocytaires. — L'ensemble des membranes internes de l'ovocyte (dictyosomes, réticulum, vésicules...) migre à l'interphase des solutions de saccharose 1,15/1,80 M lors de la centrifugation initiale. C'est une fraction hétérogène, contaminée par des mitochondries, quelques alvéoles corticaux et parfois des lobules de vitellus (pl I, fig. 1). La purification de l'ensemble conduit aux quatre sous-fractions : M1, M2, M3 et M4 (voir Matériel et Méthodes) : La sous-fraction M1, très pauvre en organites, n'a pas été analysée. La sous-fraction M2, située à l'interphase 1,15/1,25 M est riche en dictyosomes et en membranes. Elle est contaminée par de rares mitochondries et par de petites inclusions (0,5 à 1 µm) qui pourraient provenir de la dissociation du vitellus lipidique. Les dictyosomes (pl. I, fig. 2 et 3) ne subissent pas de fragmentation et conservent leur taille (10 μm) et leur structure qu'ils avaient in situ. Ils sont constitués par l'empilement de cinq à six saccules. Ceux de la zone moyenne sont les moins modifiés. Les saccules des faces de formation et de maturation tendent à présenter un aspect très dilaté, ce qui rend difficile l'interprétation de la polarité des dictyosomes. Des vésicules d'un diamètre d'environ 500 Å sont fréquemment observées au voisinement des corps de Golgi. La fraction membranaire est constituée de membranes disposées en formations circulaires dont le diamètre varie entre 0,3 et 0,9 μm. La sous-fraction M3, à l'interphase 1,25/1,50 M, est très homogène. Elle renferme deux catégories d'organites (pl. I, fig. 5) : — des mitochondries dont la matrice est dense et les crêtes dilatées. Ces modifications traduisent l'influence de l'environnement hypertonique des différentes solutions de saccharose ; — des membranes en formation circulaire. Cette sous-fraction M3 est contaminée par quelques alvéoles corticaux muqueux. La sous-fraction Mc est plus
avaient in situ. Ils sont constitués par l'empilement de cinq à six saccules. Ceux de la zone moyenne sont les moins modifiés. Les saccules des faces de formation et de maturation tendent à présenter un aspect très dilaté, ce qui rend difficile l'interprétation de la polarité des dictyosomes. Des vésicules d'un diamètre d'environ 500 Å sont fréquemment observées au voisinement des corps de Golgi. La fraction membranaire est constituée de membranes disposées en formations circulaires dont le diamètre varie entre 0,3 et 0,9 μm. La sous-fraction M3, à l'interphase 1,25/1,50 M, est très homogène. Elle renferme deux catégories d'organites (pl. I, fig. 5) : — des mitochondries dont la matrice est dense et les crêtes dilatées. Ces modifications traduisent l'influence de l'environnement hypertonique des différentes solutions de saccharose ; — des membranes en formation circulaire. Cette sous-fraction M3 est contaminée par quelques alvéoles corticaux muqueux. La sous-fraction Mc est plus hétérogène. En plus de quelques enveloppes ovocytaires, elle renferme les parois membranaires des alvéoles corticaux ayant éclaté lors de l'homogénéisation. Le culot présente, dans certains cas, du matériel alvéolaire incomplètement expulsé. II. Isolement des alvéoles corticaux muqueux. — Les alvéoles corticaux apparaissent, in situ, entourés par une membrane limitant un contenu muqueux de texture fibrillaire. Après la centrifugation initiale, les substances muqueuses se concentrent dans la zone de saccharose 1,89 M. Elles conservent leur nature fibrillaire mais ont perdu leur individualité d'alvéoles (pl. I, fig. 4). Les membranes limitantes migrent à d'autres niveaux : soit dans la sous-fraction M2, soit avec les enveloppes ovocytaires. III. Isolement des enveloppes ovocytaires. — Matériel très dense, les enveloppes ovocytaires constituent systématiquement le culot de toutes les centrifugations réalisées. Leur structure (pl. I, fig. 6) est en général bien préservée. Sous le chorion d'épaisseur constante, la membrane plasmique est par endroit fragmentée et forme alors des vésicules. Les microvillosités persistent partout et conservent leur disposition en quinconce. CONCLUSION. — La technique de fractionnement que nous avons décrite aboutit à la purification de fractions membranaires de l'ovocyte de P. cultrifera et permet d'envisager, dans l'immédiat, deux perspectives de recherche. D'une part, l'incubation in vitro de