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la classification mycologique, finiront par se résoudre en une facilité et une sûreté plus grandes des déterminations. Et, si je ne me trompe, c’est précisément ce que désirent les amateurs et les débutants. Qu'ils s’efforcent donc de suivre, sans récriminations, les sentiers frayés par les explorateurs dans la forêt vierge, en attendant qu'il devienne possible de les transformer en belles allées carrossables. Développement et biologie du Ramularia repentis Oud. par Ch. KILLAN. Professeur à la Faculté des Sciences d'Alger. (PLANCHES IV et V). Mes observations sur le genre Ramularia, poursuivies depuis la publication de mon dernier mémoire, m’ont fait connaître un nouveau cas très particulier, différent de ce que j’avais vu auparavant. Il s’agit du Ramularia repentis Oud., parasite du Ranunculus repens L. Morphologie. Les premiers symptômes de la maladie se trahissent par la production de taches foliaires. Rouges et allongées, elles apparaissent d’abord entre les nervures de la face supérieure. Elles brunissent rapidement et se couvrent, sur le côté inférieur du limbe, d’une efflorescence de conidiophores blancs. La plage envahie vire ensuite au noir et, de proche en proche, cette teinte est communiquée au secteur tout entier ; finalement la région environnante prend une coloration jaunâtre. Tous ces symptômes réunis confèrent à la feuille parasitée un aspect extrêmement typique, spécifique pour la maladie en question. Développement. L'étude microscopique de la phase initiale de l'infection ne présente rien qui ne sorte de la banalité. Une coupe dans une tache foliaire d'origine récente nous montre des conidiophores à tous les degrés de développement. Ces organes, ayant percé l’épiderme foliaire de leurs filaments allongés, sont illustrés par la figure 1 (pl. IV). A un état plus avancé la base des conidiophores brunit et évolue en bourrelet compact ; les filaments conidifères, au contraire, restent incolores et présentent des callosités aux endroits où se sont formées les conidies. Celles-ci se sont détachées dans le cas figuré (2, à droite) ; légèrement allongées, elles sont arrondies aux extrémités et présentent parfois une constriction centrale. Elles ont des dimensions plus grandes que chez les autres espèces parasitant les Renoncules (de 31 à 50 µm, avec
réunis confèrent à la feuille parasitée un aspect extrêmement typique, spécifique pour la maladie en question. Développement. L'étude microscopique de la phase initiale de l'infection ne présente rien qui ne sorte de la banalité. Une coupe dans une tache foliaire d'origine récente nous montre des conidiophores à tous les degrés de développement. Ces organes, ayant percé l’épiderme foliaire de leurs filaments allongés, sont illustrés par la figure 1 (pl. IV). A un état plus avancé la base des conidiophores brunit et évolue en bourrelet compact ; les filaments conidifères, au contraire, restent incolores et présentent des callosités aux endroits où se sont formées les conidies. Celles-ci se sont détachées dans le cas figuré (2, à droite) ; légèrement allongées, elles sont arrondies aux extrémités et présentent parfois une constriction centrale. Elles ont des dimensions plus grandes que chez les autres espèces parasitant les Renoncules (de 31 à 50 µm, avec un optimum de 44 µm et une moyenne de 10 µm). Grâce à ce caractère l'identification du Champignon ne présente aucune difficulté. La sporulation ayant cessé, les filaments conidiophères disparaissent et le bourrelet basal subsiste seul ; il s’étend pendant un certain temps et constitue le point de départ d’un mycélium qui envahit tous les tissus environnants (fig. 3) (1). Incolore et transparent dans les couches plus profondes, ce mycélium brunit à mesure qu'il s'approche de la surface (fig.4). Les hyphes se multiplient surtout lorsque le limbe s’est desséché par l’infection parasitaire. Elles se massent de préférence à l’intérieur des cellules épidermiques dont elles remplissent la lumière. Les plecténchymes peuvent même momifier des tissus entiers et leur imprimer un aspect très différent de celui qu'ils présentaient antérieurement. C’est ce que démontre la figure 3 où l’on voit une cavité soustomatique complètement remplie d’un plecténchyme, bruni en surface. Dans un autre exemple, illustré par la figure 6, c’est une cellule épidermique qui est momifiée. Pareils plecténchymes évoluent généralement en pycnides. Les hyphes, en particulier celles de la surface, s'élargissent et finissent par soulever la paroi tangentielle de la feuille (fig. 7). L’ébauche ainsi constituée s’étend en profondeur, en même temps que
mycélium qui envahit tous les tissus environnants (fig. 3) (1). Incolore et transparent dans les couches plus profondes, ce mycélium brunit à mesure qu'il s'approche de la surface (fig.4). Les hyphes se multiplient surtout lorsque le limbe s’est desséché par l’infection parasitaire. Elles se massent de préférence à l’intérieur des cellules épidermiques dont elles remplissent la lumière. Les plecténchymes peuvent même momifier des tissus entiers et leur imprimer un aspect très différent de celui qu'ils présentaient antérieurement. C’est ce que démontre la figure 3 où l’on voit une cavité soustomatique complètement remplie d’un plecténchyme, bruni en surface. Dans un autre exemple, illustré par la figure 6, c’est une cellule épidermique qui est momifiée. Pareils plecténchymes évoluent généralement en pycnides. Les hyphes, en particulier celles de la surface, s'élargissent et finissent par soulever la paroi tangentielle de la feuille (fig. 7). L’ébauche ainsi constituée s’étend en profondeur, en même temps que sa surface se creuse en cupule (fig. 8). La cavité de cette cupule se tapisse d’une couche d'hyphes sporifères effilées (fig. 6, à droite); elles produisent, à leur sommet, quantité de microspores, globuleuses ou légèrement allongées que représente, au grossissement de 710, la figure 9. Par leur accumulation elles finissent par remplir toute la cavité pycnidienne (fig. 10). Arrivée à maturité, la pycnide s'ouvre par l’effritement irrégulier de son sommet; elle se vide souvent à travers la cavité stomatique ; mais le cas peut aussi se présenter que les microspores se dégagent avant la formation complète d’une paroi pycnidienne. On peut repérer les pycnides, pendant tout l’hiver, à l’intérieur de la feuille morte où elles sont enfoncées plus ou moins profondément. Suivant leur emplacement, elles présentent un aspect différent : tantôt elles épousent les contours des tissus qui les encastraient primitivement, tantôt elles les dépassent considérablement, parfois même il y a fusion de plusieurs pycnides en un strome renfermant des loges sporifères ; ou bien l’enveloppe s'épaissit aux frais des loges et les pycnides se réduisent finalement à de simples sclérotes non différenciées. Outre les pycnides qui n’avaient pas encore été signalées pour le Ramularia repentis, ce Champignon possède une
par remplir toute la cavité pycnidienne (fig. 10). Arrivée à maturité, la pycnide s'ouvre par l’effritement irrégulier de son sommet; elle se vide souvent à travers la cavité stomatique ; mais le cas peut aussi se présenter que les microspores se dégagent avant la formation complète d’une paroi pycnidienne. On peut repérer les pycnides, pendant tout l’hiver, à l’intérieur de la feuille morte où elles sont enfoncées plus ou moins profondément. Suivant leur emplacement, elles présentent un aspect différent : tantôt elles épousent les contours des tissus qui les encastraient primitivement, tantôt elles les dépassent considérablement, parfois même il y a fusion de plusieurs pycnides en un strome renfermant des loges sporifères ; ou bien l’enveloppe s'épaissit aux frais des loges et les pycnides se réduisent finalement à de simples sclérotes non différenciées. Outre les pycnides qui n’avaient pas encore été signalées pour le Ramularia repentis, ce Champignon possède une autre catégorie de carpophores. Ce sont les apothéces. Ces organes s'ébauchent dès le début de l'hiver, quand le mycélium commence à momifier les tissus foliaires. A l'état très jeune, on pourrait les confondre avec les débuts des pycnides. Les uns et les autres se présentent sous forme de stromes, plectenchymateux et incolores, brunis en surface ; mais dans la suite se manifestent leurs caractères distinctifs : les ébauches ascosporées sont généralement plus massives et le tissu incolore prédomine (fig. 11, pl. V). A leur centre on observe régulièrement des ascogones spiralés, précurseurs des asques. Stromes pyenidiens et stromes ascospores entrent indubitablement dans le cycle évolutif du Ramularia repentis ; c’est le mycélium brun qui relie les uns et les autres aux conidiophores ; leur connexion a été observée à plusieurs reprises. Les stromes ascosporés sont en connexion directe avec les stromes pyenidiens, ce dont témoigne la figure 12. Dans le plectenchyme qu’elle représente on distingue, à droite, un ascogone ; à gauche on voit s’ébaucher une cavité pyenidienne, typique par ses filaments sporifères. La différence, parfois nette, entre les deux catégories de stromes, n'est pas toujours très prononcée. Les uns et les autres peuvent être brunis ou incolores, étendus ou
et incolores, brunis en surface ; mais dans la suite se manifestent leurs caractères distinctifs : les ébauches ascosporées sont généralement plus massives et le tissu incolore prédomine (fig. 11, pl. V). A leur centre on observe régulièrement des ascogones spiralés, précurseurs des asques. Stromes pyenidiens et stromes ascospores entrent indubitablement dans le cycle évolutif du Ramularia repentis ; c’est le mycélium brun qui relie les uns et les autres aux conidiophores ; leur connexion a été observée à plusieurs reprises. Les stromes ascosporés sont en connexion directe avec les stromes pyenidiens, ce dont témoigne la figure 12. Dans le plectenchyme qu’elle représente on distingue, à droite, un ascogone ; à gauche on voit s’ébaucher une cavité pyenidienne, typique par ses filaments sporifères. La différence, parfois nette, entre les deux catégories de stromes, n'est pas toujours très prononcée. Les uns et les autres peuvent être brunis ou incolores, étendus ou localisés ; en général dans les stromes bruns les loges pyenidiennes sont plus fréquentes que les ascogones. Or la structure de ces stromes dépend principalement de l'état de dégradation des tissus parasités. Lorsque le strome se développe dans des parties minces et fragiles du limbe, bien aérées, il brunit rapidement. Il reste, au contraire, incolore, lorsqu’il se trouve placé dans une feuille épaisse, encore vivante. Il y a donc un rapport très net entre la constitution du milieu et la configuration des stromes. Ce fait est prouvé par mes observations dans la nature ; mais il ressort aussi de mes essais de culture. J’y reviendrai tout à l'heure. Le développement ultérieur de la forme parfaite du Ramularia repentis se présente autrement que chez les espèces étudiées précédemment. Au lieu de rester inclus dans les tissus foliaires les stromes ascosporés en sortent de plus en plus et s’étalent en surface. Dans la figure 13 nous voyons cette émersion à moitié accomplie. La base brunie de l'enveloppe renferme une cavité cupuliforme remplie d’un tissu, lâchement enchevêtré, de paraphyses et d'hyphes ascogènes. La figure 14 ensuite représente un stade voisin de la maturité. On y reconnaît un strome, complètement dégagé, aplati à sa
Il reste, au contraire, incolore, lorsqu’il se trouve placé dans une feuille épaisse, encore vivante. Il y a donc un rapport très net entre la constitution du milieu et la configuration des stromes. Ce fait est prouvé par mes observations dans la nature ; mais il ressort aussi de mes essais de culture. J’y reviendrai tout à l'heure. Le développement ultérieur de la forme parfaite du Ramularia repentis se présente autrement que chez les espèces étudiées précédemment. Au lieu de rester inclus dans les tissus foliaires les stromes ascosporés en sortent de plus en plus et s’étalent en surface. Dans la figure 13 nous voyons cette émersion à moitié accomplie. La base brunie de l'enveloppe renferme une cavité cupuliforme remplie d’un tissu, lâchement enchevêtré, de paraphyses et d'hyphes ascogènes. La figure 14 ensuite représente un stade voisin de la maturité. On y reconnaît un strome, complètement dégagé, aplati à sa face supérieure et présente tous les caractères d’une apothécie. L'hyménium étalé renferme des paraphyses, en forme de massues, brunies au sommet. Il s’est produit, en même temps, à son intérieur, des asques dont quelques-uns ont atteint leur maturité ; allongés, en forme de fuseaux, ils mesurent, dans mon matériel emparaffiné, 50 à 60 µm de long et contiennent 8 ascospores, disposées en deux rangées. La forme de ces dernières est variable, suivant leur degré d'évolution ; ovales à l'état jeune (fig. 15 « à droite ») elles s’allongent et deviennent bicellulaires par cloisonnement. Arrivées à maturité les ascospores sont orientées obliquement, arrondies au sommet et pointues à leur base, incolores, mesurant, dans mes coupes, 12 à 13 µm. La maturation des apothécies, et voici un fait inattendu et frappant pour un Ramularia, peut s'effectuer dès l'automne sur les feuilles brunies, à moitié sèches, lorsqu’on les place en chambre humide. Ce développement précoce des carpophores contraste avec ce que j’ai observé dans toutes les autres espèces : là il n'y a généralement plus de forme ascosporée du tout ou bien elle se produit dans des conditions exceptionnelles et toujours en nombre plus ou moins restreint. Bref, le Ramularia repentis par la
50 à 60 µm de long et contiennent 8 ascospores, disposées en deux rangées. La forme de ces dernières est variable, suivant leur degré d'évolution ; ovales à l'état jeune (fig. 15 « à droite ») elles s’allongent et deviennent bicellulaires par cloisonnement. Arrivées à maturité les ascospores sont orientées obliquement, arrondies au sommet et pointues à leur base, incolores, mesurant, dans mes coupes, 12 à 13 µm. La maturation des apothécies, et voici un fait inattendu et frappant pour un Ramularia, peut s'effectuer dès l'automne sur les feuilles brunies, à moitié sèches, lorsqu’on les place en chambre humide. Ce développement précoce des carpophores contraste avec ce que j’ai observé dans toutes les autres espèces : là il n'y a généralement plus de forme ascosporée du tout ou bien elle se produit dans des conditions exceptionnelles et toujours en nombre plus ou moins restreint. Bref, le Ramularia repentis par la structure et la biologie de sa forme parfaite se place à l’écart des autres espèces de ce genre si polymorphe. Culture. Les observations qui précèdent et les conclusions qui s’en dégagent ont été vérifiées par mes essais de culture. La culture du Champignon ne présente aucune difficulté lorsqu'on choisit les conidies comme matériel d'ensemencement. Les colonies qu'elles produisent sont typiques par la pigmentation noire, pareille à la teinte du limbe infecté, qu'elles communiquent aux milieux. Sur ce fond noir tranche le mycélium aérien, cotonneux et blanc ; de faible dimension dans les premières cultures, cet amas duveteux s’étend de plus en plus au cours des repiquages (fig. 16). La gélose elle-même est parcourue de nombreux filaments bruns ; en outre on y découvre des corpuscules noirs, parfois saillants qui correspondent à des pycnides. Pareilles aux pycnides d’hiver, elles sont entourées d’un épais plectenchyme brun. Mais elles n’atteignent que lentement leur maturité définitive, dans les conditions artificielles : les cellules mères des pycnospores, à leur centre, sont polinucléées, riches en protoplasme et restent indivises (fig. 18). Ce n’est que dans les cultures âgées de plus d'un mois que les microspores mûres exsudent sous forme d’un mucus rose. La substitution, aux milieux
conidies comme matériel d'ensemencement. Les colonies qu'elles produisent sont typiques par la pigmentation noire, pareille à la teinte du limbe infecté, qu'elles communiquent aux milieux. Sur ce fond noir tranche le mycélium aérien, cotonneux et blanc ; de faible dimension dans les premières cultures, cet amas duveteux s’étend de plus en plus au cours des repiquages (fig. 16). La gélose elle-même est parcourue de nombreux filaments bruns ; en outre on y découvre des corpuscules noirs, parfois saillants qui correspondent à des pycnides. Pareilles aux pycnides d’hiver, elles sont entourées d’un épais plectenchyme brun. Mais elles n’atteignent que lentement leur maturité définitive, dans les conditions artificielles : les cellules mères des pycnospores, à leur centre, sont polinucléées, riches en protoplasme et restent indivises (fig. 18). Ce n’est que dans les cultures âgées de plus d'un mois que les microspores mûres exsudent sous forme d’un mucus rose. La substitution, aux milieux à décoctions, de géloses synthétiques, n'a pas stimulé davantage la maturation de ces organes. De même, l'aspect extérieur des colonies demeure à peu près inaltéré : celles-ci sont généralement cotonneuses et blanches; mais elles deviennent glabres en présence de sulfate d’ammonium comme source azotée ; enfin avec asparagine elles s’enfoncent légèrement dans le milieu de culture. En coupes, elles se présentent sous forme d’un plectenchyme brun, plus ou moins compact, identique à celui qu'on trouve dans les feuilles ; il peut, sur certains milieux synthétiques, se condenser en glomérules massifs. Ceci est le cas lorsqu’on le cultive sur agar renfermant du glucose à 0,1 p. 100 et la peptone à 1 p. 100 (fig. 18). Cultivé sur lames le Ramularia repentis produit un mycélium à cellules polinucléées qui présente la même particularité que dans la nature ; c'est-à-dire il s'imbibe rapidement d’un pigment brun. En outre, les hyphes s'enchevâtrent les uns autour des autres par leurs ramifications et produisent ainsi des glomérules, fait très particulier pour une culture sur lames (fig. 19). Filles donnent, par contre, rarement des conidies et celles-ci, lorsqu'elles se forment, sont confinées aux parties anciennes centrales des colonies ; de toute façon elles sont absolument identiques
légèrement dans le milieu de culture. En coupes, elles se présentent sous forme d’un plectenchyme brun, plus ou moins compact, identique à celui qu'on trouve dans les feuilles ; il peut, sur certains milieux synthétiques, se condenser en glomérules massifs. Ceci est le cas lorsqu’on le cultive sur agar renfermant du glucose à 0,1 p. 100 et la peptone à 1 p. 100 (fig. 18). Cultivé sur lames le Ramularia repentis produit un mycélium à cellules polinucléées qui présente la même particularité que dans la nature ; c'est-à-dire il s'imbibe rapidement d’un pigment brun. En outre, les hyphes s'enchevâtrent les uns autour des autres par leurs ramifications et produisent ainsi des glomérules, fait très particulier pour une culture sur lames (fig. 19). Filles donnent, par contre, rarement des conidies et celles-ci, lorsqu'elles se forment, sont confinées aux parties anciennes centrales des colonies ; de toute façon elles sont absolument identiques aux conidies qu’on trouve dans la nature (cf. fig. 20 et fig. 2). Mais la faculté de sporuler se perd complètement chez les cultures fréquemment repiquées. Au contraire, la capacité de donner des pycnides se maintient inaltérée pendant au moins deux ans. J'ai répété, avec le même succès, mes essais de culture en prélevant cette fois-ci les conidies sur un autre matériel, récolté à une nouvelle station. J’ai repris finalement mes expériences en choisissant des ascopores comme matériel d’origine. Or les cultures ascogènes sont absolument pareilles aux cultures conidigènes en ce qui concerne leur aspect et leur fructification. En particulier, les micropycnides, nées soit en profondeur, soit en surface, sont tout à fait identiques, malgré l’origine différente des cultures (fig. 21). La même observation s'applique aux cultures sur lames ascogènes ; on y trouve les mêmes glomérules bruns que dans les cultures conidigènes. Bref l'expérience de culture prouve d’une façon irréfutable qu’il faut attribuer les conidies, les pycnospores et les ascopores toutes à la même espèce : Ramularia repentis. Expériences d’infection. J’ai enfin démontré la pureté de mes cultures en les inoculant sur l'hôte lui-même. Dans ce but, j'ai placé des gouttelettes sporifères, issues des cultures conidigènes, à la surface
de culture en prélevant cette fois-ci les conidies sur un autre matériel, récolté à une nouvelle station. J’ai repris finalement mes expériences en choisissant des ascopores comme matériel d’origine. Or les cultures ascogènes sont absolument pareilles aux cultures conidigènes en ce qui concerne leur aspect et leur fructification. En particulier, les micropycnides, nées soit en profondeur, soit en surface, sont tout à fait identiques, malgré l’origine différente des cultures (fig. 21). La même observation s'applique aux cultures sur lames ascogènes ; on y trouve les mêmes glomérules bruns que dans les cultures conidigènes. Bref l'expérience de culture prouve d’une façon irréfutable qu’il faut attribuer les conidies, les pycnospores et les ascopores toutes à la même espèce : Ramularia repentis. Expériences d’infection. J’ai enfin démontré la pureté de mes cultures en les inoculant sur l'hôte lui-même. Dans ce but, j'ai placé des gouttelettes sporifères, issues des cultures conidigènes, à la surface des feuilles du Ranunculus repens. Ces inoculations faites en serre, le 20 mars 1920, sur des pieds empois, ont abouti au brunissement sectorial des limbes (le 7 mai). Sur les plages ainsi infectées, les conidies ont apparu tardivement, le 20 mai seulement, et leur production a augmenté, dans de fortes proportions, jusqu'au 26 mai. L’infection a réussi également sur Ranunculus acer, mais non sur Ranunculus bulbosus. Il ne m’a pas été donné d’inoculer le Ranunculus repens avec des cultures ascogènes. Mais de pareilles infections ascogènes ont réussi à Gousseva dont les résultats seront exposés ci-dessous. Conclusions. Si l’on compare le Ramularia repentis aux autres espèces étudiées dans des mémoires précédents, il se constate des différences importantes. Le genre Ramularia est caractérisé en général par la suppression complète de la forme ascosporée ; lorsqu'elle se produit, elle se produit rarement, et dans des conditions très particulières. Au contraire, chez le Ramularia repentis, elle apparaît régulièrement et peut encore mûrir sur les feuilles languissantes, dès l’automne. Un autre caractère différentiel réside dans le fait que la forme parfaite ne reste pas encastrée à l’intérieur des tissus de son hôte, sous forme d’un périthèce de pyrenomycète, mais qu’elle s’en dégage pour constituer, à