jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
soit de type JSM2, soit JSM35, au pouvoir de résolution de 70 A. RÉSULTATS. — 1. Apport de la nouvelle technique de métallisation et de l'étude morphologique de divers protoplastes. — Dans un premier temps, nous nous sommes proposés de reprendre l'observation des divers protoplastes déjà étudiés dans des conditions analogues d'obtention. Les protoplastes proviennent tous de culture de levures de 12 h, sur milieu de base n° 392 « Difco »; leur fixation a toujours été réalisée moins de 30 mn après leur formation. Alors que tous les protoplastes observés nous étaient jusqu'à présent apparus sensiblement identiques, cette observation plus précise du matériel nous permet de décrire avec plus de détails la surface du plasmalemme. Les protoplastes observés à des grossissements moyens (40 000) présentent des sillons plus ou moins profonds suivant les espèces considérées pour des paramètres de fixation identiques. Ces sillons correspondent à des invaginations en doigt de gant de la membrane cytoplasmique que la microscopie électronique à transmission fait très nettement apparaître. À plus fort grossissement (100 000), il se dégage de cette étude d'approche trois catégories cellulaires : (a) chez Saccharomyces cerevisiae, la surface de la membrane limitante pratiquement lisse, ne laisse apparaître qu'à un très fort grossissement (100 000) des petits reliefs de 200 A de diamètre et de densité très faible; par contre, les sillons marquant les invaginations du plasmalemme sont très profonds et délimitent des secteurs de surface relativement importante (5 000 Å) (pl. I, photos 1 a et 1 b); (b) chez Candida macedoniensis, C. guillermondii, Pichia membranaceus et Hansenula anomala, l'observation à très fort grossissement nous montre la présence de microsphérules d'un diamètre moyen de 500 Å et d'une densité assez élevée. On remarquera l'association dans certains cas de ces microsphérules en « grain de café ». Les sillons sont pour toutes ces espèces moyennement marqués et semblent délimiter des zones d'une surface comprise entre 2 500 Å et 4 000 Å (pl. I, photos 2 a et 2 b); (c) chez Candida albicans, les microsphérules, très nombreuses, ont un volume plus élevé (diamètre moyen 600 Å) ; par contre
très fort grossissement (100 000) des petits reliefs de 200 A de diamètre et de densité très faible; par contre, les sillons marquant les invaginations du plasmalemme sont très profonds et délimitent des secteurs de surface relativement importante (5 000 Å) (pl. I, photos 1 a et 1 b); (b) chez Candida macedoniensis, C. guillermondii, Pichia membranaceus et Hansenula anomala, l'observation à très fort grossissement nous montre la présence de microsphérules d'un diamètre moyen de 500 Å et d'une densité assez élevée. On remarquera l'association dans certains cas de ces microsphérules en « grain de café ». Les sillons sont pour toutes ces espèces moyennement marqués et semblent délimiter des zones d'une surface comprise entre 2 500 Å et 4 000 Å (pl. I, photos 2 a et 2 b); (c) chez Candida albicans, les microsphérules, très nombreuses, ont un volume plus élevé (diamètre moyen 600 Å) ; par contre les sillons sont ici très peu marqués et délimitent de petites surfaces de l'ordre de 2 500 Å (pl. I, photos 3 a et 3 b). Ces premières observations mettant en évidence des différences morphologiques chez les divers protoplastes étudiés nous donnent bon espoir dans l'avenir, d'établir une classification d'après les caractères morphologiques des plasmamèmes. 2. Étude de la morphologie des protoplastes en fonction de leur âge et de leur activité physiologique. — (a) étude en fonction de l'âge du protoplaste : des protoplastes ont été obtenus à partir de cultures de levures de 12, 24 et 48 h. EXPLICATIONS DES PLANCHES Planche I Fig. 1 a. — Protoplaste de Saccharomyces cerevisiae, fixation 30 mn après sa formation. Présence de sillons très marqués (G x 36 000). Fig. 1 b. — Observation à très fort grossissement d'une portion de protoplaste de Saccharomyces cerevisiae. Présence de microsphérules à faible relief sur la surface du plasmalemme. Ces éléments isolés ont un diamètre moyen de 200 Â (G x 100 000). Fig. 2 a. — Protoplaste de Hansenula anomala. On remarquera le relief plus accentué de la surface de la membrane cytoplasmique ainsi que les sillons moyennement profonds (G x 36 000). Fig.
les caractères morphologiques des plasmamèmes. 2. Étude de la morphologie des protoplastes en fonction de leur âge et de leur activité physiologique. — (a) étude en fonction de l'âge du protoplaste : des protoplastes ont été obtenus à partir de cultures de levures de 12, 24 et 48 h. EXPLICATIONS DES PLANCHES Planche I Fig. 1 a. — Protoplaste de Saccharomyces cerevisiae, fixation 30 mn après sa formation. Présence de sillons très marqués (G x 36 000). Fig. 1 b. — Observation à très fort grossissement d'une portion de protoplaste de Saccharomyces cerevisiae. Présence de microsphérules à faible relief sur la surface du plasmalemme. Ces éléments isolés ont un diamètre moyen de 200 Â (G x 100 000). Fig. 2 a. — Protoplaste de Hansenula anomala. On remarquera le relief plus accentué de la surface de la membrane cytoplasmique ainsi que les sillons moyennement profonds (G x 36 000). Fig. 2 b. — Observation à très fort grossissement de la surface du plasmalemme d'un protoplaste de Hansenula anomala. Les microsphérules de diamètre moyen de 500 A se présentent pour certains en « grain de café » (G x 100 000). Fig. 3 a. — Aspect très tourmenté de la surface d'un protoplaste de Candida albicans (G x 30 000). Fig. 3 b. — Présence de très nombreuses microsphérules d'un diamètre moyen de 600 A. Les surfaces délimitées par les sillons peu profonds sont petites (environ 2 500 Â) (G x 100 000). PLANCHE Il Planche II Fig. 1 a et 1 b. — Comparaison de deux protoplastes de Candida guiledoniensis provenant d'une culture de levures de 12 h et fixés 30 mn après leur formation. On remarque que le protoplaste de la photo 1 b (G x 48 000), plus petit, donc provenant d'une levure plus jeune que celui de la photo 1 a (G x 30 000), présente des sillons beaucoup plus profonds. Fig. 2 a et 2 b. — Protoplastes de Candida guiledoniensis maintenus en solution tampon isotonique dans du Hanks et fixés 2 h (2 a) et 48 h (2 b) après leur formation. On constate une
d'un protoplaste de Candida albicans (G x 30 000). Fig. 3 b. — Présence de très nombreuses microsphérules d'un diamètre moyen de 600 A. Les surfaces délimitées par les sillons peu profonds sont petites (environ 2 500 Â) (G x 100 000). PLANCHE Il Planche II Fig. 1 a et 1 b. — Comparaison de deux protoplastes de Candida guiledoniensis provenant d'une culture de levures de 12 h et fixés 30 mn après leur formation. On remarque que le protoplaste de la photo 1 b (G x 48 000), plus petit, donc provenant d'une levure plus jeune que celui de la photo 1 a (G x 30 000), présente des sillons beaucoup plus profonds. Fig. 2 a et 2 b. — Protoplastes de Candida guiledoniensis maintenus en solution tampon isotonique dans du Hanks et fixés 2 h (2 a) et 48 h (2 b) après leur formation. On constate une disparition totale des sillons et un début de reconstitution de la coque de la levure (G x 20 000). Fig. 3 a. — Protoplaste de Saccharomyces cerevisiae, obtenu à partir d'un moût de raisin à concentration élevée de sucre après 48 h de faible fermentation. On constate que les sillons sont presque inexistants (G x 20 000). Fig. 3 b. — Protoplaste de Saccharomyces cerevisiae obtenu à partir d'un moût de raisin à faible concentration de sucre, après 48 h de forte fermentation. Les éléments globuleux caractéristiques de l'activité physiologique de la cellule y sont nombreux et volumineux (G x 20 000). Sur les protoplastes de petite taille provenant de culture de levures de 12 h, on note la présence de sillons très profonds; par contre, dès ce stade, les protoplastes plus volumineux, donc provenant de levures plus âgées, présentent une diminution sensible de ces sillons (pl. II, photos 1 a et 1 b). Des observations, réalisées à partir de protoplastes provenant de levures plus âgées (cultures de 24 ou 48 h) montrent une réduction très importante des sillons (pl. II, photo 3 a). Il est également possible de remarquer de telles modifications dans l'étude de protoplastes provenant d'une même
sont presque inexistants (G x 20 000). Fig. 3 b. — Protoplaste de Saccharomyces cerevisiae obtenu à partir d'un moût de raisin à faible concentration de sucre, après 48 h de forte fermentation. Les éléments globuleux caractéristiques de l'activité physiologique de la cellule y sont nombreux et volumineux (G x 20 000). Sur les protoplastes de petite taille provenant de culture de levures de 12 h, on note la présence de sillons très profonds; par contre, dès ce stade, les protoplastes plus volumineux, donc provenant de levures plus âgées, présentent une diminution sensible de ces sillons (pl. II, photos 1 a et 1 b). Des observations, réalisées à partir de protoplastes provenant de levures plus âgées (cultures de 24 ou 48 h) montrent une réduction très importante des sillons (pl. II, photo 3 a). Il est également possible de remarquer de telles modifications dans l'étude de protoplastes provenant d'une même culture de levures, mais fixés à des temps différents après leur formation. Des protoplastes, maintenus en solution tampon isotomique dans du Hanks et fixés 48 h après leur formation, montrent une disparition totale des sillons. On obtient alors probablement un début de reconstitution de la coque (pl. II, photos 2 a et 2 b). Les sillons observés appartiennent donc sans équivoque à la morphologie du plasmalemme, ceci est en plein accord avec les résultats obtenus lors de notre précédent travail. (b) étude en fonction de l'activité physiologique de la cellule : dans le cadre d'un travail entrepris avec l'Institut œnologique de Bordeaux, nous avons été amenés à préparer des protoplastes à partir de levures provenant d'un même jus de raisin porté à deux concentrations de sucre différentes. Le lot n° 1 correspond à une activité fermentaire beaucoup plus faible que le lot n° 2 qui, lui correspond à une fermentation très intense mais de durée assez courte (les détails de cette expérimentation seront exposés ultérieurement). Nous constatons que les protoplastes obtenus à partir de cultures de levures de 48 h ne présentent pratiquement plus de sillons. Les cellules physiologiquement très actives (provenant du lot n° 2) montrent des émissions bulleuses
a et 2 b). Les sillons observés appartiennent donc sans équivoque à la morphologie du plasmalemme, ceci est en plein accord avec les résultats obtenus lors de notre précédent travail. (b) étude en fonction de l'activité physiologique de la cellule : dans le cadre d'un travail entrepris avec l'Institut œnologique de Bordeaux, nous avons été amenés à préparer des protoplastes à partir de levures provenant d'un même jus de raisin porté à deux concentrations de sucre différentes. Le lot n° 1 correspond à une activité fermentaire beaucoup plus faible que le lot n° 2 qui, lui correspond à une fermentation très intense mais de durée assez courte (les détails de cette expérimentation seront exposés ultérieurement). Nous constatons que les protoplastes obtenus à partir de cultures de levures de 48 h ne présentent pratiquement plus de sillons. Les cellules physiologiquement très actives (provenant du lot n° 2) montrent des émissions bulleuses dont le nombre et le volume sont très nettement supérieurs à celles observées sur les protoplastes obtenus à partir des levures du lot n° 1 (pl. II, photos 3 a et 3 b). Cette observation vient pleinement confirmer nos hypothèses avec lesquelles ces éléments globuleux de 0,20 Î¼m de diamètre correspondent à des substances excrétées provenant de l'intérieur du protoplaste et figées au moment de la fixation. Il est alors possible d'affirmer qu'il existe une relation entre la présence ou l'absence de ces sphérules et l'état physiologique de la cellule. CONCLUSION. — L'étude actuelle nous montre qu'il existe une morphologie évolutive du protoplaste en fonction de l'âge de la levure à partir de laquelle il a été obtenu ainsi qu'en fonction de son état physiologique. Les éléments variables de cette morphologie sont représentés par la profondeur des sillons du plasmalemme, laquelle semble se réduire avec le vieillissement de la levure et par la présence de sphérules au volume et au nombre d'autant plus élevés que l'activité cellulaire est importante. Les éléments constants de cette morphologie correspondent aux microsphérules au relief plus ou moins prononcé que l'on retrouve à la surface du plasmalemme sur tous les protoplastes étudiés et qui apparaissent
correspondent à des substances excrétées provenant de l'intérieur du protoplaste et figées au moment de la fixation. Il est alors possible d'affirmer qu'il existe une relation entre la présence ou l'absence de ces sphérules et l'état physiologique de la cellule. CONCLUSION. — L'étude actuelle nous montre qu'il existe une morphologie évolutive du protoplaste en fonction de l'âge de la levure à partir de laquelle il a été obtenu ainsi qu'en fonction de son état physiologique. Les éléments variables de cette morphologie sont représentés par la profondeur des sillons du plasmalemme, laquelle semble se réduire avec le vieillissement de la levure et par la présence de sphérules au volume et au nombre d'autant plus élevés que l'activité cellulaire est importante. Les éléments constants de cette morphologie correspondent aux microsphérules au relief plus ou moins prononcé que l'on retrouve à la surface du plasmalemme sur tous les protoplastes étudiés et qui apparaissent représentatifs des diverses espèces. Cette étude a été réalisée dans le cadre du Groupe de Recherches en Mycologie fondamentale et appliquée. Cette étude a été réalisée dans le cadre du Groupe de Recherches en Mycologie fondamentale et appliquée. 1976, p. 417. (3) M. BASTIDE, P. TRAVE et J. M. BASTIDE, Ann. Microbiol. Institut Pasteur, 126 A, 1975, p. 275-294. (4) J. MULLER, C. DOUCHET et S. SAKUMA, Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., II, n° 1, 1972, p. 75-84. Laboratoire de Parasitologie et Pathologie exotique, Professeur C. Vermeil, U.E.R. de Médecine, 1, rue Gaston-Veil, 44000 Nantes. MICROBIOLOGIE APPLIQUÉE. Les stéroïdes « facteurs de survie » des levures dans le cours de la fermentation alcoolique du moût de raisin. Note de Suzanne Lafon-Lafourcade, Françoise Larue, Paul Bréchot et Pascal Ribéreau-Gayon, présentée par M. André-Romain Prévot. Certains stérols (ergostérol) d'une part, l'acide oléanolique d'autre part, sont des « facteurs de survie » de la levure, dans les conditions particulières de la vinification ; ils n'autorisent pas une meilleure croissance des cellules, mais favorisent leur maintien à l'état viable et prolongent leur activité fermentaire. Le mode d'action de chacun d'eux est différent. Certain sterols (ergosterol) on one hand, oleanolic acid on the other, are
Ann. Microbiol. Institut Pasteur, 126 A, 1975, p. 275-294. (4) J. MULLER, C. DOUCHET et S. SAKUMA, Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., II, n° 1, 1972, p. 75-84. Laboratoire de Parasitologie et Pathologie exotique, Professeur C. Vermeil, U.E.R. de Médecine, 1, rue Gaston-Veil, 44000 Nantes. MICROBIOLOGIE APPLIQUÉE. Les stéroïdes « facteurs de survie » des levures dans le cours de la fermentation alcoolique du moût de raisin. Note de Suzanne Lafon-Lafourcade, Françoise Larue, Paul Bréchot et Pascal Ribéreau-Gayon, présentée par M. André-Romain Prévot. Certains stérols (ergostérol) d'une part, l'acide oléanolique d'autre part, sont des « facteurs de survie » de la levure, dans les conditions particulières de la vinification ; ils n'autorisent pas une meilleure croissance des cellules, mais favorisent leur maintien à l'état viable et prolongent leur activité fermentaire. Le mode d'action de chacun d'eux est différent. Certain sterols (ergosterol) on one hand, oleanolic acid on the other, are survival factors of the yeast within certain wine-making conditions ; they do not increase the growth rate of the cells, but allow them to remain in a viable state for a longer time and so prolong their fermenting activity. Each of them acts in a different way. INTRODUCTION. — On sait que certains stérols et molécules voisines, tel l'acide oléanolique constituant de la cire cuticulaire du raisin (1), agissent, en mélange avec des acides gras non saturés à longue chaîne, sur la levure cultivée en anaérobiose, comme des facteurs de croissance; ils permettent de doubler les populations de cellules viables qui apparaissent en 24 ou 48 h (2). (3). Cependant, dans le cas particulier de la vinification, il a été montré (4) que cette intervention est surtout manifeste à la fin de la fermentation; on pouvait supposer qu'ils n'agissent pas alors simplement comme des activateurs de la croissance. Nous décrivons dans cette Note certains résultats concernant le mode d'action de ces substances sur la levure, dans les conditions propres de la vinification, caractérisées par : 1) la grande richesse du milieu en substrat énergétique (le moût de raisin contient couramment 180 g/l de sucre, quelquefois 400 g/l); 2) la saturation
sait que certains stérols et molécules voisines, tel l'acide oléanolique constituant de la cire cuticulaire du raisin (1), agissent, en mélange avec des acides gras non saturés à longue chaîne, sur la levure cultivée en anaérobiose, comme des facteurs de croissance; ils permettent de doubler les populations de cellules viables qui apparaissent en 24 ou 48 h (2). (3). Cependant, dans le cas particulier de la vinification, il a été montré (4) que cette intervention est surtout manifeste à la fin de la fermentation; on pouvait supposer qu'ils n'agissent pas alors simplement comme des activateurs de la croissance. Nous décrivons dans cette Note certains résultats concernant le mode d'action de ces substances sur la levure, dans les conditions propres de la vinification, caractérisées par : 1) la grande richesse du milieu en substrat énergétique (le moût de raisin contient couramment 180 g/l de sucre, quelquefois 400 g/l); 2) la saturation en oxygène du moût; 3) l'existence d'une population levurienne initiale importante (10h cellules par ml) résultant d'une prolifération aérobie entre le foulage du raisin et la mise en cuve. Ainsi donc la fermentation est conduite pendant un temps relativement court (2 à 5 jours) par des levures proliférantes, puis pendant un temps beaucoup plus long (1 à 5 semaines) par une population essentiellement non proliférante, en situation de « survie », correspondant à un découplage énergétique total, c'est-à-dire capable de transformer le sucre en alcool sans croissance (5). On conçoit que les difficultés de fermentation puissent provenir moins d'un défaut de croissance que d'une altération du métabolisme de ces cellules en survie (5). On comprend aussi que les conditions totalement anaérobies dans lesquelles a été étudiée l'action des stéroïdes sur la levure (2), (3), traduisent imparfaitement leur intervention en vinification. MÉTHODES ET TECHNIQUES. — On utilise soit des moûts de raisin frais, avec leur ensemencement naturel, prélevés dans les conditions de la pratique, soit des moûts de raisin pasteurisés. aérés et ensemencés avec des préparations industrielles de levures Saccharomyces cerevisiae, développées elles-mêmes en aérobiose. Les stéroïdes sont dissous dans l'alcool absolu à chaud, en présence de « tween 80 »
un temps beaucoup plus long (1 à 5 semaines) par une population essentiellement non proliférante, en situation de « survie », correspondant à un découplage énergétique total, c'est-à-dire capable de transformer le sucre en alcool sans croissance (5). On conçoit que les difficultés de fermentation puissent provenir moins d'un défaut de croissance que d'une altération du métabolisme de ces cellules en survie (5). On comprend aussi que les conditions totalement anaérobies dans lesquelles a été étudiée l'action des stéroïdes sur la levure (2), (3), traduisent imparfaitement leur intervention en vinification. MÉTHODES ET TECHNIQUES. — On utilise soit des moûts de raisin frais, avec leur ensemencement naturel, prélevés dans les conditions de la pratique, soit des moûts de raisin pasteurisés. aérés et ensemencés avec des préparations industrielles de levures Saccharomyces cerevisiae, développées elles-mêmes en aérobiose. Les stéroïdes sont dissous dans l'alcool absolu à chaud, en présence de « tween 80 » (2 ml) et d'acide oléique (20 mg/l), les témoins reçoivent un volume équivalent d'alcool. Les moûts (600 ml) sont répartis en flacons de 750 ml obturés par un barboteur à mercure qui assure des conditions strictement anaérobies. Les fermentations sont suivies par le dosage des sucres exprimé en sucre interverti (méthode de Bertrand). Les populations sont dénombrées par les colonies formées sur milieu nutritif solide: ce milieu est constitué de volumes égaux d'une solution gélosée à 20 g/l et de moût de raisin (180 g/l de sucre, pH 3,2) dilué au demi. Les stérols totaux des levures sont dosés par la méthode Liebermann (6) après double extraction : 1) par le mélange chloroforme-méthanol sous reflux; 2) par l'éther après saponification (b). TABLEAU 1 Action des mélanges ergostérol-acide oléique, acide oléanolique-acide oléique, sur la croissance des levures indigènes Saccharomyces et la fermentation d'un moût de raisin frais. Sucre initial après enrichissement : 246 g/l. Population initiale viable : 1,7 106 cell/ml. Température 25°C. Ergostérol Acide oléanolique (25 mg/l) (50 mg/l) + acide oléique + acide oléique Témoin (20 mg/l) (20 mg/l) cell. viables (106/ml) 22 20 17 sucre fermenté (g/l) 37 36 23 stérols (mg ergostérol pour 100 mg de levure
(méthode de Bertrand). Les populations sont dénombrées par les colonies formées sur milieu nutritif solide: ce milieu est constitué de volumes égaux d'une solution gélosée à 20 g/l et de moût de raisin (180 g/l de sucre, pH 3,2) dilué au demi. Les stérols totaux des levures sont dosés par la méthode Liebermann (6) après double extraction : 1) par le mélange chloroforme-méthanol sous reflux; 2) par l'éther après saponification (b). TABLEAU 1 Action des mélanges ergostérol-acide oléique, acide oléanolique-acide oléique, sur la croissance des levures indigènes Saccharomyces et la fermentation d'un moût de raisin frais. Sucre initial après enrichissement : 246 g/l. Population initiale viable : 1,7 106 cell/ml. Température 25°C. Ergostérol Acide oléanolique (25 mg/l) (50 mg/l) + acide oléique + acide oléique Témoin (20 mg/l) (20 mg/l) cell. viables (106/ml) 22 20 17 sucre fermenté (g/l) 37 36 23 stérols (mg ergostérol pour 100 mg de levure sèche)... 1.6 1,4 1,7 cell. viables (106/ml) 13 10 12 sucre fermenté (g/l) 113 111 105 stérols (mg ergostérol pour 100 mg de levure sèche)... 0,6 1 , 1 0,4 cell. viables (106/ml) 5 7 5 9 jour sucre fermenté (g/l) 164 169 154 stérols (mg ergostérol pour 100 mg de levure sèche)... 0,4 1,0 0,3 11 jour cell. viables (106/ml) 0,05 0,5 0,1 sucre fermenté (g/l) 170 199 185 stérols (mg ergostérol pour 100 mg de levure sèche)... 0,3 0,6 0,2 RÉSULTATS ET DISCUSSION. — Une première expérience conduite à 25°C, sur moût de raisin frais riche en sucre, avec un fort inoculum de levures sauvages développées en aérobiose, montre que, malgré les conditions d'anaérobiose stricte imposées à la fermentation, l'addition d'ergostérol (25 mg/l) et d'acide oléanolique (50 mg/l) n'augmente pas le nombre de cellules totales qui demeure de l'ordre de 4.107 ml dans les trois conditions précitées, du 1er au 20e jour. Également au cours de la première phase (jusqu'au 5e jour), la vitesse fermentaire n'est pas accélérée, elle est même parfois diminuée; les populations viables sont du même ordre. Par contre, dans la 2e phase de la fermentation (du 5e au 30e jour), avec ces mêmes additions,