jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
Chemical Zoology, 7, 1972, p. 307. J. W. CAMPBELL et K. V. SPEEG, Comp. Biochem. Physiol., 25, 1968, p. 3-32. F. E. FRIEDL, J. Parasitol., 47, 1961, p. 773-776. D. E. GILBERTSON et L. S. SCHMID, Comp. Biochem. Physiol., 51 B, 1975, p. 201-203. G. DUCHATEAU, M. FLORKIN et M. SARLET, Arch. Intern. Physiol., 62, 1954, p. 512. G. DUCHATEAU et M. FLORKIN, in M. FLORKIN et S. BRICTEUX-GREGOIRE, Chemical Zoology, 7, 1972, p. 304-305. A. C. GIESSE, Physiol. Rev. 46, 1966, p. 244-298. L. MASSE, C.R. Acad. Sci. Paris 263, 1966, n. 781-784. J. CITHAREL, Thèse Doct-ès-Sc. Nat., Rennes, 1971. Laboratoire de Zoologie générale et d'Ecophysiologie, Faculté des Sciences biologiques. Université de Rennes, avenue du Général-Leclerc. 35000 Rennes. BIOCHIMIE. Mise en évidence d'un récepteur du 5α-androstane-3β, 17β-diol dans le cytosol de l'hypophyse antérieure du rat mâle prépubère. Note de Marie-Lise Thieulant, Suzanne Sampérez et Pierre Jouan, présentée par M. Jean Roche. Le cytosol de l'hypophyse antérieure du rat mâle prépubère renferme un récepteur spécifique du 5α-androstane-3β, 17β-diol. Ses principales caractéristiques sont les suivantes: KA = 5.2 x 10⁷ M-1, Kd = 1.9 x 10-8 M, nombre de sites = 8.7 x 10¹⁴ molles par mg de protéines. Sa constante de sédimentation est d'environ 3 S. Seuls le 3β-diol et les œstrogènes sont compétitifs aux sites du 3β-diol. Les androgènes, y compris le 5α-androstane-3α, 17β-diol, n'ont aucun effet de compétition. Ce récepteur est présent dans l'hypophyse mais absent dans l'hypothalamus et le cerveau. Cette localisation particulière semble indiquer que cet androgène joue un rôle spécifique dans cette glande. The presence of a specific receptor for 5α-androstan-3β, 17β-diol (3β-diol) in the pituitary cytosol from prepubertal male rats was demonstrated. Its characteristics were: KA = 5.2 10⁷ M, KD = 1.9 x 10-8 M, number of specific binding sites = 8.7 10¹⁴ molles per mg of proteins. Its sedimentation constant was 3 S. Competition assays showed that only 3β-diol itself and estrogens were able to compete for the binding sites for 3β-diol. Androgens, including 3α-diol, were inefficient. This receptor was found only in pituitary cytosol. It was missing from hypothalamic or cortical
de sédimentation est d'environ 3 S. Seuls le 3β-diol et les œstrogènes sont compétitifs aux sites du 3β-diol. Les androgènes, y compris le 5α-androstane-3α, 17β-diol, n'ont aucun effet de compétition. Ce récepteur est présent dans l'hypophyse mais absent dans l'hypothalamus et le cerveau. Cette localisation particulière semble indiquer que cet androgène joue un rôle spécifique dans cette glande. The presence of a specific receptor for 5α-androstan-3β, 17β-diol (3β-diol) in the pituitary cytosol from prepubertal male rats was demonstrated. Its characteristics were: KA = 5.2 10⁷ M, KD = 1.9 x 10-8 M, number of specific binding sites = 8.7 10¹⁴ molles per mg of proteins. Its sedimentation constant was 3 S. Competition assays showed that only 3β-diol itself and estrogens were able to compete for the binding sites for 3β-diol. Androgens, including 3α-diol, were inefficient. This receptor was found only in pituitary cytosol. It was missing from hypothalamic or cortical cytosols. This special localization seemed to foreshadow a specific role for 3β-diol in the anterior hypophysis. INTRODUCTION. — Dans l'hypophyse antérieure du rat mâle, la testostérone est métabolisée principalement en dihydrotestostérone (DHT) et en 5α-androstane-3α, 17β-diol (3α-diol) [e)-C')]. Outre ces métabolites, on trouve aussi de petites quantités de 5α-androstane-3β, 17β-diol (3β-diol) [b]. Après avoir mis en évidence la présence de récepteurs de la testostérone et de la DHT [C)-())]. puis l'absence de liaison spécifique du 3α-diol (9) dans l'hypophyse antérieure du rat mâle, nous avons recherché la présence éventuelle d'un récepteur du 3β-diol dans le cytosol de cette glande. Les résultats obtenus démontrent l'existence d'un récepteur spécifique du 3β-diol dans le cytosol d'hypophyses antérieures de rats prépubères. PARTIE EXPÉRIMENTALE. Nous avons utilisé des rats mâles prépubères (36-38 jours) de souche Wistar (Elevage Janvier, Le Genest). Après sacrifice par décapitation sans anesthésie, les hypophyses antérieures ont été rapidement prélevées et homogénéisées dans une solution tampon phosphate 0,05 M, à pH 7,4. Après centrifugation de l'homogénat à 600 x g, le surnageant est soumis à une centrifugation à 105 000 x g pendant 1 h. Le cytosol obtenu est ensuite dilué avec une quantité appropriée de tampon phosphate 0,05 M afin d'obtenir
(3β-diol) [b]. Après avoir mis en évidence la présence de récepteurs de la testostérone et de la DHT [C)-())]. puis l'absence de liaison spécifique du 3α-diol (9) dans l'hypophyse antérieure du rat mâle, nous avons recherché la présence éventuelle d'un récepteur du 3β-diol dans le cytosol de cette glande. Les résultats obtenus démontrent l'existence d'un récepteur spécifique du 3β-diol dans le cytosol d'hypophyses antérieures de rats prépubères. PARTIE EXPÉRIMENTALE. Nous avons utilisé des rats mâles prépubères (36-38 jours) de souche Wistar (Elevage Janvier, Le Genest). Après sacrifice par décapitation sans anesthésie, les hypophyses antérieures ont été rapidement prélevées et homogénéisées dans une solution tampon phosphate 0,05 M, à pH 7,4. Après centrifugation de l'homogénat à 600 x g, le surnageant est soumis à une centrifugation à 105 000 x g pendant 1 h. Le cytosol obtenu est ensuite dilué avec une quantité appropriée de tampon phosphate 0,05 M afin d'obtenir une concentration en protéines de 2.9 mg par ml de cytosol. Des parties aliquotes de cytosol sont incubées à 0°C et à l'équilibre (3 h) en présence de 5α-androstane-3β, 17β-diol-3H] (Act. spécifique = 46 Ci/mmole). A la fin de la période d'incubation, le récepteur et son ligand sont précipités par addition au cytosol d'un volume égal d'une solution de sulfate de protamine à 1.5 mg par ml d'eau. Le mélange est agité puis maintenu à 0°C pendant 15 mn. Les différents échantillons sont ensuite déposés sur des filtres en fibre de verre. « Whatman GF/C » de 2,5 cm de diamètre. Les filtres sont lavés, sous un vide léger, quatre fois par addition de 10 ml de solution tampon phosphate 0,05 M (4 x 10 ml). La radioactivité adsorbée par le filtre est mesurée par comptage en scintillation liquide. Des expériences témoins sont effectuées dans les mêmes conditions en utilisant de l'hormone tritiée en solution dans le tampon phosphate 0,05 M. La nature du stéroïde lié au récepteur cytosolique est déterminée, après extraction de la radioactivité adsorbée sur le filtre par un mélange chloroforme-méthanol (2 : 1 v/v), par chromatographie sur papier Whatman n° 2 dans le système de solvants
addition au cytosol d'un volume égal d'une solution de sulfate de protamine à 1.5 mg par ml d'eau. Le mélange est agité puis maintenu à 0°C pendant 15 mn. Les différents échantillons sont ensuite déposés sur des filtres en fibre de verre. « Whatman GF/C » de 2,5 cm de diamètre. Les filtres sont lavés, sous un vide léger, quatre fois par addition de 10 ml de solution tampon phosphate 0,05 M (4 x 10 ml). La radioactivité adsorbée par le filtre est mesurée par comptage en scintillation liquide. Des expériences témoins sont effectuées dans les mêmes conditions en utilisant de l'hormone tritiée en solution dans le tampon phosphate 0,05 M. La nature du stéroïde lié au récepteur cytosolique est déterminée, après extraction de la radioactivité adsorbée sur le filtre par un mélange chloroforme-méthanol (2 : 1 v/v), par chromatographie sur papier Whatman n° 2 dans le système de solvants de Kochakian et Stidworthy ("). La constante de sédimentation du récepteur du 3β-diol a été déterminée par ultracentrifugation dans un gradient de saccharose de 5 à 20 %. Pour ces expériences, des lots de 24 hypophyses antérieures sont homogénéisées dans une solution tampon Tris HCl 0,01 M, EDTA 0,0015 M, dithiothréitol 0,001 M, à pH 7,5. La concentration en protéines du cytosol obtenu est de 10 mg par ml. Des fractions de 400 μl de cytosol sont incubées pendant 3 h à 0°C en présence de 3β-diol-3H à la concentration de 5 x 10-8 M ou 1 x 10-9 M. Après incubation, l'hormone libre est éliminée par addition de charbon-dextran. 0,5 g de charbon et 0,05 g de dextran sont mis en suspension dans 100 ml de tampon Tris — HCl. Des fractions de 400 μl de cette suspension sont centrifugées à 2 000 x g pendant 15 mn. Le cytosol (400 μl) est ensuite mélangé avec le culot charbon-dextran et maintenu à 0°C pendant 15 mn. Après centrifugation à 2 000 x g pendant 15 mn, des fractions de 200 μl du surnageant à 2 000 x g sont ensuite déposées sur le gradient de saccharose. La solution de
dithiothréitol 0,001 M, à pH 7,5. La concentration en protéines du cytosol obtenu est de 10 mg par ml. Des fractions de 400 μl de cytosol sont incubées pendant 3 h à 0°C en présence de 3β-diol-3H à la concentration de 5 x 10-8 M ou 1 x 10-9 M. Après incubation, l'hormone libre est éliminée par addition de charbon-dextran. 0,5 g de charbon et 0,05 g de dextran sont mis en suspension dans 100 ml de tampon Tris — HCl. Des fractions de 400 μl de cette suspension sont centrifugées à 2 000 x g pendant 15 mn. Le cytosol (400 μl) est ensuite mélangé avec le culot charbon-dextran et maintenu à 0°C pendant 15 mn. Après centrifugation à 2 000 x g pendant 15 mn, des fractions de 200 μl du surnageant à 2 000 x g sont ensuite déposées sur le gradient de saccharose. La solution de saccharose est préparée dans le tampon Tris - HCl décrit ci-dessus et renfermant 10 % de glycérol. Les gradients sont centrifugés à 200 000 x g, pendant 15 à 17 h dans un rotor « SW 65 ». Des fractions du gradient (6 gouttes) sont collectées au moyen d'un fractionneur de gradient (ISCO) et les protéines sont analysées à 280 nm au moyen d'un analyseur UV (ISCO). Les protéines sont déterminées par la méthode de Lowry et al. (n). La radioactivité des chromatogrammes est mesurée comme il a été précédemment indiqué (12). Celle des filtres GF/C est dosée dans du liquide de Bray (10 ml) et celle des gradients après addition d'« Instagel » (10 ml). Les comptages de la radioactivité sont effectués au moyen d'un compteur à scintillation liquide, « ISOCAP 300 ». RÉSULTATS. — Après incubation du cytosol à 0°C, en présence de 3P-diol-3H à la concentration de 2 x 10-8 M, on constate que le taux de liaison de ce stéroïde aux protéines cytosoliques est maximum au bout d'une heure et reste constant pendant 24 h. L'analyse chromatographique du stéroïde lié, à l'équilibre, démontre l'absence de métabolisme du ligand. L'incubation à 0°C et à l'équilibre des fractions
de gradient (ISCO) et les protéines sont analysées à 280 nm au moyen d'un analyseur UV (ISCO). Les protéines sont déterminées par la méthode de Lowry et al. (n). La radioactivité des chromatogrammes est mesurée comme il a été précédemment indiqué (12). Celle des filtres GF/C est dosée dans du liquide de Bray (10 ml) et celle des gradients après addition d'« Instagel » (10 ml). Les comptages de la radioactivité sont effectués au moyen d'un compteur à scintillation liquide, « ISOCAP 300 ». RÉSULTATS. — Après incubation du cytosol à 0°C, en présence de 3P-diol-3H à la concentration de 2 x 10-8 M, on constate que le taux de liaison de ce stéroïde aux protéines cytosoliques est maximum au bout d'une heure et reste constant pendant 24 h. L'analyse chromatographique du stéroïde lié, à l'équilibre, démontre l'absence de métabolisme du ligand. L'incubation à 0°C et à l'équilibre des fractions de cytosols en présence de 3p-diol-3H à des concentrations allant de 1 x 10-9 M à 3 x 10-7 M montre l'existence d'un récepteur saturable. La constante d'association déterminée selon la méthode de Scatchard (4) est de 5,2 x 107 M-1, la constante de dissociation de 1,9 x 10-8 M et le nombre de sites de 8,7 x 10-14 moles par mg de protéines. Le degré de spécificité de la liaison a été mesuré par incubation de fractions de cytosol en présence du 3β-diol-3H à la concentration de 1,2 x 10-8 M, et de stéroïdes non radioactifs à des concentrations allant de 5 x 10-9 M à 5 x 10-7 M. Seuls le 3β-diol, le 17β-œstradiol, l'œstrone et le diéthylstilbœstrol (DES) sont compétitifs. Pour diminuer de 50 % le taux de liaison du 3P-diol, il faut une concentration de 4 x 10-8 M en 17β-œstradiol, 7 x 10-8 M en 3β-diol et 3,5 x 10-7 M en DES. Par contre, la testostérone, la DHT, le 3α-diol et la progestérone n'ont aucune efficacité de compétition. L'analyse des gradients d'ultracentrifugation montre l'existence de deux pics radioactifs. Le plus important a une constante de sédimentation voisine de 3 S, le second, beaucoup plus
et le nombre de sites de 8,7 x 10-14 moles par mg de protéines. Le degré de spécificité de la liaison a été mesuré par incubation de fractions de cytosol en présence du 3β-diol-3H à la concentration de 1,2 x 10-8 M, et de stéroïdes non radioactifs à des concentrations allant de 5 x 10-9 M à 5 x 10-7 M. Seuls le 3β-diol, le 17β-œstradiol, l'œstrone et le diéthylstilbœstrol (DES) sont compétitifs. Pour diminuer de 50 % le taux de liaison du 3P-diol, il faut une concentration de 4 x 10-8 M en 17β-œstradiol, 7 x 10-8 M en 3β-diol et 3,5 x 10-7 M en DES. Par contre, la testostérone, la DHT, le 3α-diol et la progestérone n'ont aucune efficacité de compétition. L'analyse des gradients d'ultracentrifugation montre l'existence de deux pics radioactifs. Le plus important a une constante de sédimentation voisine de 3 S, le second, beaucoup plus faible, a une constante d'environ 8,7 S. En présence de 3P-diol non radioactif, ces deux fractions radioactives disparaissent. DISCUSSION DES RÉSULTATS. — Les résultats obtenus démontrent l'existence d'un récepteur spécifique du 3P-diol dans le cytosol de l'hypophyse antérieure du rat mâle prépubère. Une éventuelle contamination du cytosol par des protéines sériques liant le 3P-diol-3H est exclue, car celles-ci ne sont pas précipitées par le sulfate de protamine. L'un des caractères essentiels de ce récepteur est sa spécificité. En effet, seuls le 3P-diol et les œstrogènes sont compétitifs aux sites de ce récepteur. Les androgènes n'ont aucun effet compétiteur. Ces constatations laisseraient à penser à une identité entre le récepteur du 3P-diol et celui du 17β-œstradiol. En réalité, deux récepteurs distincts, l'un du 3P-diol, l'autre du 17β-œstradiol semblent coexister dans l'hypophyse du rat mâle. Ces deux récepteurs spécifiques diffèrent, en effet, par leurs constantes d'association, leur nombre de sites et leurs constantes de sédimentation. Un autre argument en faveur de leur différentiation réside dans leur localisation tissulaire puisque le récepteur du 3P-diol semble absent du cerveau et de l'hypothalamus alors que le récepteur du 17P-œstradiol est présent dans ce dernier (recherches en cours). La présence d'un récepteur spécifique du 3P-diol dans
sériques liant le 3P-diol-3H est exclue, car celles-ci ne sont pas précipitées par le sulfate de protamine. L'un des caractères essentiels de ce récepteur est sa spécificité. En effet, seuls le 3P-diol et les œstrogènes sont compétitifs aux sites de ce récepteur. Les androgènes n'ont aucun effet compétiteur. Ces constatations laisseraient à penser à une identité entre le récepteur du 3P-diol et celui du 17β-œstradiol. En réalité, deux récepteurs distincts, l'un du 3P-diol, l'autre du 17β-œstradiol semblent coexister dans l'hypophyse du rat mâle. Ces deux récepteurs spécifiques diffèrent, en effet, par leurs constantes d'association, leur nombre de sites et leurs constantes de sédimentation. Un autre argument en faveur de leur différentiation réside dans leur localisation tissulaire puisque le récepteur du 3P-diol semble absent du cerveau et de l'hypothalamus alors que le récepteur du 17P-œstradiol est présent dans ce dernier (recherches en cours). La présence d'un récepteur spécifique du 3P-diol dans l'hypophyse antérieure du rat mâle, son absence dans les centres nerveux supérieurs dont l'hypothalamus semblerait indiquer que cet androgène joue un rôle particulier au niveau de cette glande. M. le Docteur P. Robel nous a aidé de ses conseils pour l'utilisation de la méthode de précipitation au sulfate de protamine. Séance du 14 mars 1977. (1) R. B. JAFFE, Steroids, 14, 1969, p. 483. (2) F. F. G. ROMMETS et H. J. VAN DER MOLEN, Biochem. Biophys. Acta, 248, 1971, p. 489. (3) C. DENEF, C. MAGNUS et B. S. McEWEN, J. Endocr., 59, 1973, p. 605. (4) NGUYEN CONG THIEN, J. DUVAL, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, Biochimie, 56, 1974, p. 899. (5) NGUYEN CONG THIEN, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1165. (6) A. GENOT, B. LORAS, M. MONBON et J. BERTRAND, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1247. (7) S. SAMPEREZ, M. L. THIEULANT, L. MERCIER et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 5, 1974, p. 911. (8) M. L. THIEULANT, L. MERCIER, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1257. (9) L. MERCIER, C. LE GUELLEC, M. L. THIEULANT, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 7,
Séance du 14 mars 1977. (1) R. B. JAFFE, Steroids, 14, 1969, p. 483. (2) F. F. G. ROMMETS et H. J. VAN DER MOLEN, Biochem. Biophys. Acta, 248, 1971, p. 489. (3) C. DENEF, C. MAGNUS et B. S. McEWEN, J. Endocr., 59, 1973, p. 605. (4) NGUYEN CONG THIEN, J. DUVAL, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, Biochimie, 56, 1974, p. 899. (5) NGUYEN CONG THIEN, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1165. (6) A. GENOT, B. LORAS, M. MONBON et J. BERTRAND, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1247. (7) S. SAMPEREZ, M. L. THIEULANT, L. MERCIER et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 5, 1974, p. 911. (8) M. L. THIEULANT, L. MERCIER, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1257. (9) L. MERCIER, C. LE GUELLEC, M. L. THIEULANT, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 7, 1976, p. 779. (10) Ch. KOCHAKIAN et G. STIDWORTHY, J. Biol. Chem., 119, 1952, p. 607. (11) O. H. LOWRY, N. J. ROSEBROUGH, A. L. FARR et R. J. RANDALL, J. Biol. Chem., 193, 1951, p. 265. (12) P. JOUAN, S. SAMPEREZ et M. L. THIEULANT, J. Steroid Biochem., 4, 1973, p. 65. (13) G. BRAY, Anal. Biochem., 1, 1960, p. 279. (14) G. SCATCHARD, Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 1949, p. 660. Laboratoire de Neurologie moléculaire, Équipe de Recherche associée au C.N.R.S. n° 567, Faculté des Sciences biologiques, avenue du Général-Leclerc, 35031 Rennes Cedex. Une valeur absolue des pi beaucoup plus significative est obtenue en électrofocalisation en veine liquide, la technique en gel de polyacrylamide doit donc être réservée uniquement pour des mesures comparatives. Analytical isoelectric focusing in polyacrylamide gels and preparative electrofocusing in density gradients may give very different pi determination for the same β-lactamase. This difference seems due to a lack of enzyme migration in some parts of the cross-linked polyacrylamide gel. This migration appears easier in density gradient isoelectric focusing, and thus this technique yields more significant absolute pi values. Analytical isoelectric focusing should only be used for comparison studies. Les points isoélectriques (pi) des
1973, p. 65. (13) G. BRAY, Anal. Biochem., 1, 1960, p. 279. (14) G. SCATCHARD, Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 1949, p. 660. Laboratoire de Neurologie moléculaire, Équipe de Recherche associée au C.N.R.S. n° 567, Faculté des Sciences biologiques, avenue du Général-Leclerc, 35031 Rennes Cedex. Une valeur absolue des pi beaucoup plus significative est obtenue en électrofocalisation en veine liquide, la technique en gel de polyacrylamide doit donc être réservée uniquement pour des mesures comparatives. Analytical isoelectric focusing in polyacrylamide gels and preparative electrofocusing in density gradients may give very different pi determination for the same β-lactamase. This difference seems due to a lack of enzyme migration in some parts of the cross-linked polyacrylamide gel. This migration appears easier in density gradient isoelectric focusing, and thus this technique yields more significant absolute pi values. Analytical isoelectric focusing should only be used for comparison studies. Les points isoélectriques (pi) des enzymes et, en particulier, des β-lactamases peuvent être déterminés par électrofocalisation en veine liquide sur colonne ou en gel de polyacrylamide en couche mince. Cette dernière technique est souvent considérée comme « analytique » puisque la révélation in situ selon la technique des zymogrammes permet de comparer diverses préparations de β-lactamases et de mettre en évidence de très faibles différences de pl. Utilisateurs, depuis quelques années, de l'électrofocalisation en veine liquide sur colonne, nous avons adapté plus récemment la électrofocalisation analytique en gel de polyacrylamide selon un protocole qui ne diffère de celui de Matthew et coll. que dans le système révélateur de l'activité β-lactamase. TABLEAU pi Souches bactériennes 1 2 3 E. coli P 111 (TEM 1) 5.4 5.4 5.4 (1) p.a. E. coli RP 4 (TEM 2) 5.6 5,6 5,6 (2) p.a. E. coli P 453 (type 2) 7,7 7,1 7,7 (3) V.L. P. morganii NCTC 235 8,3 7,3 7,3 (4) p.a. Ps aeruginosa NCTC 8203 8.7 7.5 7.5 (5) p.a. 7.7 (4) p.a. pi déterminés 1, en veine liquide: 2. en gel de polyacrylamide; 3. références de la littérature, (p.a. polyacrylamide; V.L. veine liquide). Vis-à-vis de quelques β-lactamases, nous avons constaté que les pl déterminés par électrofocalisation
β-lactamases et de mettre en évidence de très faibles différences de pl. Utilisateurs, depuis quelques années, de l'électrofocalisation en veine liquide sur colonne, nous avons adapté plus récemment la électrofocalisation analytique en gel de polyacrylamide selon un protocole qui ne diffère de celui de Matthew et coll. que dans le système révélateur de l'activité β-lactamase. TABLEAU pi Souches bactériennes 1 2 3 E. coli P 111 (TEM 1) 5.4 5.4 5.4 (1) p.a. E. coli RP 4 (TEM 2) 5.6 5,6 5,6 (2) p.a. E. coli P 453 (type 2) 7,7 7,1 7,7 (3) V.L. P. morganii NCTC 235 8,3 7,3 7,3 (4) p.a. Ps aeruginosa NCTC 8203 8.7 7.5 7.5 (5) p.a. 7.7 (4) p.a. pi déterminés 1, en veine liquide: 2. en gel de polyacrylamide; 3. références de la littérature, (p.a. polyacrylamide; V.L. veine liquide). Vis-à-vis de quelques β-lactamases, nous avons constaté que les pl déterminés par électrofocalisation en veine liquide ou en gel de polyacrylamide sont en bon accord. Par contre, vis-à-vis de certaines enzymes, des différences très grandes de pl apparaissent entre les 2 techniques. Nous nous sommes proposés d'éclairer ce point. MÉTODES. — Souches bactériennes. — Nous avons utilisé 2 souches de collection : Proteus morganii NCTC 235 et Pseudomonas aeruginosa 8203, ainsi que les E. coli K 12, P 111 et P 453 respectivement producteurs de β-lactamases extrachromosomiques type 1 et type 2 (Pr. Pitton de Genève) et le E. coli RP 4 producteur de β-lactamase extrachromosomique TEM 2 (Pr. Chabbert, Institut Pasteur). Cultures bactériennes des β-lactamases. — Un protocole précédemment décrit a été respecté. Cependant, dans le cas des Proteus et Pseudomonas dont les β-lactamases sont inductibles, la pénicilline G a été introduite dans le bouillon de culture, en milieu de phase exponentielle de croissance 3 h avant la récolte, aux concentrations finales de 500 et 5 000 µg/ml respectivement. Électrofocalisation en veine liquide sur colonne. — Nous avons respecté le protocole décrit antérieurement. La durée de la focalisation est de 72 h. Cliché 1. — Électrofocalisation de la β-lactamase du E. coli P 111, l'enzyme est déposé sous forme de gouttes selon