jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
A. A., Stearns T. 1992. Spindle positioning and cell polarity. Current Biology 2: 469-71. 24. Briedis A., Elinson R. P. 1982. Suppression of male pronuclear movement in frog eggs by hydrostatic pressure and deuterium oxide yields gynogenetic haploids. J. Exp. Zool. 222: 45-57. 25. Félix M. A., Antony C, Wright M., Maro B. 1994. Centrosome assembly in vitro: role of α-tubulin recruitment in Xenopus sperm aster formation. J. Cell Biol. 124: 19-31. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, 1994; 317 : 411-8 Biologie et pathologie animale/Animal biology and pathology Effet d'extraits de glandes du sinus sur la physiologie osmoregulatrice des branchies perfusées du crabe Pachygrapsus marmoratus Effect of sinus gland extracts on the osmoregulatory physiology of perfused gills from the crab Pachygrapsus marmoratus CÉLINE PIERROT (1), ERIK ECKHARDT (2), FRANÇOIS VAN HERP (2), MIREILLE CHARMANTIER-DAURES (1), GUY CHARMANTIER (1), JEAN-PAUL TRILLES (1), PIERRE THUET (1) 1 Laboratoire d'Écophysiologie des Invertébrés, Université Montpellier II, Sciences et Techniques du Languedoc, CP 092, place Eugène Bataillon, 34095 Montpellier Cedex 5, France. 2 Vakgroep Experimentele Dierkunde, Faculteit Natuurwetenschappen, Katholieke Universiteit Nijmegen, Toernooiveld NL-6525 ED Nijmegen, Pays-Bas. Tirés à part : C. Pierrot RÉSUMÉ Des branchies postérieures isolées de crabes adaptés à une eau de mer diluée de salinité 10 °/00 ont été perfusées par des extraits de glandes du sinus provenant de crabes acclimatés à l'eau de mer ou à l'eau de mer diluée. Ces perfusions ont entraîné, pour les deux types d'extrait, une augmentation forte et rapide de la différence de potentiel transépithélial (environ 45 %) et du flux entrant de sodium (environ 150 %). Les perfusions d'extraits dilués de glandes du sinus de crabes acclimatés à 10 °/00 ont montré que cette augmentation est fonction de la concentration de l'extrait utilisé. Ces résultats suggèrent une action de la glande du sinus sur le contrôle de l'osmoregulation du crabe Pachygrapsus marmoratus. Mots clés : Pachygrapsus, branchies, glande du sinus, osmoregulation, perfusion. ABSTRACT Isolated posterior gills from crabs adapted to diluted sea water at 10 °/00 salinity were perfused with extracts of sinus glands from sea water or diluted sea water-acclimated crabs. The perfusion
mer diluée de salinité 10 °/00 ont été perfusées par des extraits de glandes du sinus provenant de crabes acclimatés à l'eau de mer ou à l'eau de mer diluée. Ces perfusions ont entraîné, pour les deux types d'extrait, une augmentation forte et rapide de la différence de potentiel transépithélial (environ 45 %) et du flux entrant de sodium (environ 150 %). Les perfusions d'extraits dilués de glandes du sinus de crabes acclimatés à 10 °/00 ont montré que cette augmentation est fonction de la concentration de l'extrait utilisé. Ces résultats suggèrent une action de la glande du sinus sur le contrôle de l'osmoregulation du crabe Pachygrapsus marmoratus. Mots clés : Pachygrapsus, branchies, glande du sinus, osmoregulation, perfusion. ABSTRACT Isolated posterior gills from crabs adapted to diluted sea water at 10 °/00 salinity were perfused with extracts of sinus glands from sea water or diluted sea water-acclimated crabs. The perfusion experiments with both extracts caused a high and rapid increase of the transépithelial potential difference (about 45 %) and of the sodium influx (about 150 %). These effects were dose-dependent, which was determined by perfusion of extracts of sinus glands from crabs acclimated to diluted sea water. These results suggest that the sinus gland is involved in the control of osmoregulation of the crab Pachygrapsus marmoratus. Key words : Pachygrapsus, gills, sinus gland, osmoregulation, perfusion. See Abridged version (p. 416) Les crabes hyper-osmoregulateurs possèdent des mécanismes leur permettant de maintenir un équilibre hydrominuclé par une diminution de la perméabilité de surface à l'eau et aux ions et par un transport ionique actif du milieu extérieur vers le milieu intérieur, en particulier au niveau des branchies [1, 2]. Les branchies postérieures des crabes sont le site majeur d'absorption d'ions et présentent une forte activité de l'ATPase Na+-K+ [3], enzyme qui joue un rôle prépondérant dans le transport actif du sodium [4-6]. Note présentée par Jules Hoffmann. Actuellement, de nombreuses données expérimentales Note remise le 12 octobre 1993, acceptée après révision le 4 avril 1994. tendent à montrer une implication du système neuro-endocrin dans le contrôle de l'osmoregulation des crustacés [7-9]. Ainsi,
that the sinus gland is involved in the control of osmoregulation of the crab Pachygrapsus marmoratus. Key words : Pachygrapsus, gills, sinus gland, osmoregulation, perfusion. See Abridged version (p. 416) Les crabes hyper-osmoregulateurs possèdent des mécanismes leur permettant de maintenir un équilibre hydrominuclé par une diminution de la perméabilité de surface à l'eau et aux ions et par un transport ionique actif du milieu extérieur vers le milieu intérieur, en particulier au niveau des branchies [1, 2]. Les branchies postérieures des crabes sont le site majeur d'absorption d'ions et présentent une forte activité de l'ATPase Na+-K+ [3], enzyme qui joue un rôle prépondérant dans le transport actif du sodium [4-6]. Note présentée par Jules Hoffmann. Actuellement, de nombreuses données expérimentales Note remise le 12 octobre 1993, acceptée après révision le 4 avril 1994. tendent à montrer une implication du système neuro-endocrin dans le contrôle de l'osmoregulation des crustacés [7-9]. Ainsi, les mouvements d'eau à travers les branchies seraient régulés par des facteurs localisés dans les ganglions thoraciques [10, 11], alors que les flux ioniques semblent être contrôlés par des substances issues des organes péricardiques, telles que la dopamine ou l'octopamine [8, 9, 12]. La glande du sinus est un organe neurohémal situé dans les pédoncules oculaires des crustacés, qui assure la mise en réserve et la libération de plusieurs produits de neurosécrétion. L'intervention du système neuroendocrin des pédoncules oculaires dans le contrôle de la régulation hydrominuclé a pu être démontrée chez plusieurs crustacés par diverses opérations affectant les pédoncules oculaires [7, 8, 13-16]. Un contrôle des glandes du sinus sur la régulation osmotique et ionique au niveau du tissu branchial n'a pourtant pas été mis en évidence jusqu'à présent, car les expériences citées précédemment ont été menées sur des animaux entiers. Or, la technique de perfusion de branchies isolées permet de tester directement l'action de facteurs divers sur la différence de potentiel et les flux ioniques au niveau de l'épithélium branchial. C'est pourquoi nous avons adapté la technique de perfusion branchiale [17] aux branchies du crabe Pachygrapsus marmoratus, espèce fortement hyper-hypoosmoregulatrice [18]. L'objectif de ce travail a été de déterminer
neurohémal situé dans les pédoncules oculaires des crustacés, qui assure la mise en réserve et la libération de plusieurs produits de neurosécrétion. L'intervention du système neuroendocrin des pédoncules oculaires dans le contrôle de la régulation hydrominuclé a pu être démontrée chez plusieurs crustacés par diverses opérations affectant les pédoncules oculaires [7, 8, 13-16]. Un contrôle des glandes du sinus sur la régulation osmotique et ionique au niveau du tissu branchial n'a pourtant pas été mis en évidence jusqu'à présent, car les expériences citées précédemment ont été menées sur des animaux entiers. Or, la technique de perfusion de branchies isolées permet de tester directement l'action de facteurs divers sur la différence de potentiel et les flux ioniques au niveau de l'épithélium branchial. C'est pourquoi nous avons adapté la technique de perfusion branchiale [17] aux branchies du crabe Pachygrapsus marmoratus, espèce fortement hyper-hypoosmoregulatrice [18]. L'objectif de ce travail a été de déterminer l'action éventuelle d'extraits de glandes du sinus sur la différence de potentiel transépithélial et le flux entrant de sodium des branchies isolées et perfusées de P. marmoratus, dans le cadre d'une étude du contrôle neuroendocrin du métabolisme hydrominuclé chez cette espèce. Matériel et méthodes Des individus mâles et femelles de P. marmoratus ont été capturés sur la côte méditerranéenne, près de Montpellier. Au laboratoire, ils ont été élevés individuellement dans des circuits d'eau de mer, filtrée et aérée, de salinité 36 %o environ, à la température de 20,0 ± 0,5 °C et sous une photopériode 12L/12D, leur nourriture consistant en fragments de moules. Après une mue en élevage, des crabes en stade C4 d'intermue (déterminé selon la méthode de Drach et Tchemigovtzeff [19]) ont été acclimatés pendant une semaine à une eau de mer diluée de salinité 10 %o, avant d'être utilisés expérimentalement. Pour les perfusions, deux solutions physiologiques, de composition proche de celle de l'hémolymphe des crabes, sont utilisées : pEM pour les crabes acclimatés à l'eau de mer de salinité 36 %o (composition en mM : NaCl = 460, K2SO4 = 5, CaCl2 = 12,5, MgSO4 = 7,5) et pEMD pour les crabes acclimatés à l'eau de mer
P. marmoratus ont été capturés sur la côte méditerranéenne, près de Montpellier. Au laboratoire, ils ont été élevés individuellement dans des circuits d'eau de mer, filtrée et aérée, de salinité 36 %o environ, à la température de 20,0 ± 0,5 °C et sous une photopériode 12L/12D, leur nourriture consistant en fragments de moules. Après une mue en élevage, des crabes en stade C4 d'intermue (déterminé selon la méthode de Drach et Tchemigovtzeff [19]) ont été acclimatés pendant une semaine à une eau de mer diluée de salinité 10 %o, avant d'être utilisés expérimentalement. Pour les perfusions, deux solutions physiologiques, de composition proche de celle de l'hémolymphe des crabes, sont utilisées : pEM pour les crabes acclimatés à l'eau de mer de salinité 36 %o (composition en mM : NaCl = 460, K2SO4 = 5, CaCl2 = 12,5, MgSO4 = 7,5) et pEMD pour les crabes acclimatés à l'eau de mer diluée de salinité 10 %o (composition en mM : NaCl = 390, K2SO4=4, CaCl2 = 10, MgSO4 = 7,5). Chaque solution contient 8,8 mM de tampon borate et le pH est ajusté à 7,6 avec du Tris. La technique de perfusion branchiale repose sur la double canulation d'une branchie. La base de la branchie est sectionnée de sorte que les vaisseaux afférent et efférent soient parallèles. Un cathéter rempli du liquide de perfusion est introduit dans le vaisseau afférent et l'hémolymphe est rapidement chassée de la branchie pour éviter sa coagulation, puis un deuxième cathéter est placé dans le vaisseau efférent. Celui-ci permet de recueillir le liquide de perfusion après passage dans la branche. À l'aide d’une colle cyanoacrylate, les deux cathètes sont collés à la branche qui est alors immergée dans un bain contenant le milieu d'incubation. Ce milieu est également utilisé pour la perfusion interne des branchies grâce à une pompe péristaltique qui maintient un débit de perfusion constant de 0,10 ± 0,01 ml.min-1. La branche est oxygénée pendant toute la durée de l'expérience par un système de bullage dans le milieu d'incubation. La différence de potentiel transépithélial (ddp) du milieu intérieur par rapport au milieu extérieur est
base de la branchie est sectionnée de sorte que les vaisseaux afférent et efférent soient parallèles. Un cathéter rempli du liquide de perfusion est introduit dans le vaisseau afférent et l'hémolymphe est rapidement chassée de la branchie pour éviter sa coagulation, puis un deuxième cathéter est placé dans le vaisseau efférent. Celui-ci permet de recueillir le liquide de perfusion après passage dans la branche. À l'aide d’une colle cyanoacrylate, les deux cathètes sont collés à la branche qui est alors immergée dans un bain contenant le milieu d'incubation. Ce milieu est également utilisé pour la perfusion interne des branchies grâce à une pompe péristaltique qui maintient un débit de perfusion constant de 0,10 ± 0,01 ml.min-1. La branche est oxygénée pendant toute la durée de l'expérience par un système de bullage dans le milieu d'incubation. La différence de potentiel transépithélial (ddp) du milieu intérieur par rapport au milieu extérieur est mesurée grâce à deux électrodes au calomel reliées à des ponts d'agar agar et connectées à un pHmètre-millivoltmètre. Le flux entrant de sodium est mesuré en suivant le passage du 22Na (activité spécifique : 0,3 pCi.ml-1) du milieu extérieur vers le milieu intérieur de la branche. Le flux entrant de Na+ est calculé d'après l'équation suivante : où 22Na = radioactivité du perfusat collecté durant une période de 10 min (cpm), R.A.S. = radioactivité spécifique du milieu d'incubation (cpm.mEqNa+), P = poids frais (mg) de la branche sectionnée sous la zoïe recouverte de colle et séchée dans un papier filtre. Chaque extrait de glandes du sinus est préparé à partir de deux glandes isolées des pédoncules oculaires d’un crabe en stade d'intermue C4. Les glandes du sinus sont immédiatement homogénéisées dans 100 μl d'HCl 0,1 N à 80 °C pendant 5 min. L'homogène est ensuite placé à la glace avant l'ajout de 100 μl de PEM concentré 2 fois (pH = 7,6) pour compenser la dilution, puis de 4,6 ml de PEM. Le pH est ajusté à 7,6 avec NaOH 0,1 N et même volume de PEM concentré 2 fois est ajouté, bien que la pression osmotique de l'extrait final
Na+ est calculé d'après l'équation suivante : où 22Na = radioactivité du perfusat collecté durant une période de 10 min (cpm), R.A.S. = radioactivité spécifique du milieu d'incubation (cpm.mEqNa+), P = poids frais (mg) de la branche sectionnée sous la zoïe recouverte de colle et séchée dans un papier filtre. Chaque extrait de glandes du sinus est préparé à partir de deux glandes isolées des pédoncules oculaires d’un crabe en stade d'intermue C4. Les glandes du sinus sont immédiatement homogénéisées dans 100 μl d'HCl 0,1 N à 80 °C pendant 5 min. L'homogène est ensuite placé à la glace avant l'ajout de 100 μl de PEM concentré 2 fois (pH = 7,6) pour compenser la dilution, puis de 4,6 ml de PEM. Le pH est ajusté à 7,6 avec NaOH 0,1 N et même volume de PEM concentré 2 fois est ajouté, bien que la pression osmotique de l'extrait final (dont volume est ajusté à 5 ml avec PEM) soit légèrement inférieure à celle de la solution PEM. Deux types d'extraits ont été préparés : l'un avec des glandes du sinus de crabes acclimatés à une salinité de 10 %o (= extrait EMD), l'autre avec des glandes du sinus de crabes maintenus à une salinité de 36 %o (= extrait EM). Ces extraits ont été perfusés du côté interne de la branche. L'extrait EMD a également été perfusé après avoir été dilué 5 fois et 10 fois. Les tests non paramétriques de Wilcoxon, et de Kruskal Wallis suivi du test de comparaisons multiples, ont été utilisés pour l'analyse statistique des résultats [20]. Les moyennes sont données avec leur erreur standard (SEM). Résultats Lorsque le milieu de perfusion est le même du côté interne et externe de la branche, seules les branchies postérieures des crabes acclimatés à une salinité de 10 %o présentent une ddp non nulle, électronégative, d'une moyenne de -9,0 mV (Tableau I). Ceci suggère l'existence d'un transport ionique actif au niveau de l'épithélium de ces branchies. Les extraits de glandes du sinus ont été testés sur ces branchies (d'où l'utilisation du PEMD pour la fabrication des extraits). Trois
crabes maintenus à une salinité de 36 %o (= extrait EM). Ces extraits ont été perfusés du côté interne de la branche. L'extrait EMD a également été perfusé après avoir été dilué 5 fois et 10 fois. Les tests non paramétriques de Wilcoxon, et de Kruskal Wallis suivi du test de comparaisons multiples, ont été utilisés pour l'analyse statistique des résultats [20]. Les moyennes sont données avec leur erreur standard (SEM). Résultats Lorsque le milieu de perfusion est le même du côté interne et externe de la branche, seules les branchies postérieures des crabes acclimatés à une salinité de 10 %o présentent une ddp non nulle, électronégative, d'une moyenne de -9,0 mV (Tableau I). Ceci suggère l'existence d'un transport ionique actif au niveau de l'épithélium de ces branchies. Les extraits de glandes du sinus ont été testés sur ces branchies (d'où l'utilisation du PEMD pour la fabrication des extraits). Trois expériences préliminaires de perfusion avec des solutions d'extraction préparées sans glande du sinus ont montré que le protocole de préparation de l'extrait n'a pas d'effet important sur la ddp et le flux entrant de Na+ (Tableau II). Huit perfusions avec des extraits EMD et six perfusions avec des extraits EM, chaque extrait correspondant à deux glandes du sinus, ont été réalisées ; toutes ont induit de fortes augmentations significatives de la ddp et du flux entrant de Na+ (Tableau III). Avec les extraits EMD, on observe une augmentation moyenne de 44 % pour la ddp et de 148 % pour le flux entrant de Na+. Les extraits EM ont induit une augmentation moyenne de la ddp de 48 % et une augmentation de 158 % du flux entrant de Na+. Ces résultats présentent peu de différence entre les extraits EM et EMD contenant l'intégralité des glandes du sinus d'un même animal. De plus, les Figures 1 et 2 montrent que les effets sont obtenus très rapidement, dès le début de la perfusion des extraits, et que la ddp et le flux entrant de Na+ reviennent plus ou moins lentement à leur valeur initiale lorsque les branchies sont à nouveau perfusées
chaque extrait correspondant à deux glandes du sinus, ont été réalisées ; toutes ont induit de fortes augmentations significatives de la ddp et du flux entrant de Na+ (Tableau III). Avec les extraits EMD, on observe une augmentation moyenne de 44 % pour la ddp et de 148 % pour le flux entrant de Na+. Les extraits EM ont induit une augmentation moyenne de la ddp de 48 % et une augmentation de 158 % du flux entrant de Na+. Ces résultats présentent peu de différence entre les extraits EM et EMD contenant l'intégralité des glandes du sinus d'un même animal. De plus, les Figures 1 et 2 montrent que les effets sont obtenus très rapidement, dès le début de la perfusion des extraits, et que la ddp et le flux entrant de Na+ reviennent plus ou moins lentement à leur valeur initiale lorsque les branchies sont à nouveau perfusées sans extrait. Des perfusions ont également été réalisées avec l'extrait EMD dilué 5 fois et 10 fois. Les effets mesurés sur la différence de potentiel transépithélial et le flux entrant de Na+ dépendent de la dose d'extrait perfusée : en effet, l'intensité de la réponse s'accroît quand la concentration de l'extrait perfusé augmente. Une augmentation significative du flux entrant de Na+ (p<0,01) a pu être enregistrée avec un extrait faiblement concentré : extrait EMD dilué 10 fois (Fig. 3). Discussion Nos résultats montrent que des extraits de glandes du sinus modifient la différence de potentiel transépithélial et le flux entrant de Na+ des branchies postérieures isolées et perfusées de Pachygrapsus marmoratus ; l'intensité de la réponse à la perfusion d'un extrait de glandes du sinus augmente avec la concentration d'extrait utilisée. Ces observations suggèrent qu'un facteur, probablement de nature neuroendocrine, intervenant dans la régulation ionique est présent dans les glandes du sinus de P. marmoratus. Avec les extraits bruts contenant les 2 glandes du sinus de l'animal, les résultats sont sensiblement identiques pour les extraits de glandes du sinus provenant de crabes acclimatés à l'eau de mer ou à l'eau de mer diluée. Une étude plus approfondie sera cependant nécessaire
l'extrait perfusé augmente. Une augmentation significative du flux entrant de Na+ (p<0,01) a pu être enregistrée avec un extrait faiblement concentré : extrait EMD dilué 10 fois (Fig. 3). Discussion Nos résultats montrent que des extraits de glandes du sinus modifient la différence de potentiel transépithélial et le flux entrant de Na+ des branchies postérieures isolées et perfusées de Pachygrapsus marmoratus ; l'intensité de la réponse à la perfusion d'un extrait de glandes du sinus augmente avec la concentration d'extrait utilisée. Ces observations suggèrent qu'un facteur, probablement de nature neuroendocrine, intervenant dans la régulation ionique est présent dans les glandes du sinus de P. marmoratus. Avec les extraits bruts contenant les 2 glandes du sinus de l'animal, les résultats sont sensiblement identiques pour les extraits de glandes du sinus provenant de crabes acclimatés à l'eau de mer ou à l'eau de mer diluée. Une étude plus approfondie sera cependant nécessaire pour comparer le contenu des glandes du sinus des 2 groupes d'animaux. A partir d'expériences réalisées sur des animaux entiers, il a été démontré la présence dans les glandes du sinus de Homarus americanus, d'un facteur neuroendocrine intervenant dans le contrôle du métabolisme hydrominéral. Cependant, jusqu'à présent, peu d'expériences ont été menées pour étudier l'effet d'extraits de glandes du sinus sur les branchies isolées et perfusées de Crustacés. Kamemoto et Oyama ont montré qu'un extrait de glandes du sinus perfusé dans les branchies isolées de Callinectes sapidus augmente fortement le taux de GMPc dans les branchies, mais ne modifie pas le taux d'AMPc. Des extraits de glandes du sinus affectent également les taux de GMPc dans différents tissus de l'écrevisse Orconectes limosus. En revanche, Berlind et Kamemoto ont montré qu'un extrait de glandes du sinus n'a aucun effet sur la perméabilité à l'eau des branchies isolées et perfusées de Carcinus maenas. A notre connaissance, il n'a pas été montré jusqu'ici d'action de la glande du sinus sur la différence de potentiel ou les mouvements ioniques au niveau du tissu branchial. Notre étude montre donc pour la première fois que la glande du sinus contient un facteur qui stimule la régulation
été menées pour étudier l'effet d'extraits de glandes du sinus sur les branchies isolées et perfusées de Crustacés. Kamemoto et Oyama ont montré qu'un extrait de glandes du sinus perfusé dans les branchies isolées de Callinectes sapidus augmente fortement le taux de GMPc dans les branchies, mais ne modifie pas le taux d'AMPc. Des extraits de glandes du sinus affectent également les taux de GMPc dans différents tissus de l'écrevisse Orconectes limosus. En revanche, Berlind et Kamemoto ont montré qu'un extrait de glandes du sinus n'a aucun effet sur la perméabilité à l'eau des branchies isolées et perfusées de Carcinus maenas. A notre connaissance, il n'a pas été montré jusqu'ici d'action de la glande du sinus sur la différence de potentiel ou les mouvements ioniques au niveau du tissu branchial. Notre étude montre donc pour la première fois que la glande du sinus contient un facteur qui stimule la régulation ionique au niveau des branchies du crabe P. marmoratus. Des extraits d'autres tissus neuroendocrins ont été essayés sur branchies isolées. Ainsi, les ganglions thoraciques augmentent le taux d'AMPc dans les branchies de C. sapidus et affectent les mouvements d'eau au niveau des branchies de C. maenas et Thalamita crenata. Des extraits d'organes péricardiques augmentent le taux d'AMPc et le flux entrant de Na+ chez C. sapidus et chez C. maenas, mais ils n'agissent pas sur la perméabilité à l'eau des branchies de ce dernier. La dopamine, contenue dans les organes péricardiques, augmente également le taux d'AMPc des branchies de C. sapidus et de C. maenas, et elle agirait sur l'ATPase Na+-K+ et le flux entrant de Na+ par l'intermédiaire d'un second messager, l'AMPc. Or, la perfusion d'un extrait de glandes du sinus ne provoque pas d'augmentation du taux d'AMPc chez C. sapidus. Des études effectuées récemment ont montré qu'un facteur contenu dans les glandes du sinus de H. americanus et intervenant dans la régulation hydrominérale serait de nature protéique : en effet, des fractions séparées par chromatographie HPLC, dont l'une correspond à une isoforme de la CHH (hormone hyperglycémiantenne des crustacés), agissent sur l'osmoregulation du homard. D'après nos premiers résultats,