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America Inc., 875-81 Massachusetts Avenue, Cambridge, MA 02139, U.S.A. Tél.: (1) 617.354.78.75 Fax: (1) 617.354.68.75 Bureau A. Hosoya, Stork Yotsuya 104, 24-5 Sakamachi, Shinjuku-ku, Tokyo 160, Japan Abonnements/Subscriptions C. D. R./ Centrale des Revues, 11, rue Gossin, 92543 Montrouge Cedex, France. Tél. : (33-1) 46.56.52.66 Fax (33-1) 47.46.81.21 Tarifs d'abonnement France (12 numéros par an, frais de port inclus). Série III, Sciences de la vie : 2 730 FF. Deux séries : 5 200 FF. Trois séries : 6 550 FF. Subscriptions rates Rest of world (12 issues per year, included postage). Série III, Life sciences : 3860 FF. Two séries : 7380 FF. Three séries : 9150 FF. Réclamations/daims : Les réclamations pour les numéros manquants ne sont recevables dans un délai de 6 mois après la date de publication/Claims for missing issues should be made within 6 months of the publication date. Imprimerie Gauthier-Villars : 1, boulevard Ney, 75018 Paris, France Tél. : (33-1) 42.39.14.15 Fax : (33-1) 40.34.67.19 Indexation/Abstracted/Indexed : Chemical Abstracts, Current Contents, C.A.B.S., Ecological Abstracts, Excerpta Medica, Geoabstracts, Pascal. Photo de couverture : Préparation de cortex temporal de sujet atteint de la maladie d'Alzheimer. Mobilisation de cellules microgliales autour d'une plaque sénile. Les cellules microgliales sont révélées par l'anti-ferritine (en bleu) et la plaque sénile classique par l'anti-fi/A4 amyloïde (en brun) ; colocalisation dans les cellules ferritine-positives de substance $/A4 amyloïde. Z. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, vol. 317 n° 5, mai 1994. 377 C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, vol. 317 n° 5, mai 1994. No. 5 May 1994 A Biochimie/Biochemistry 381 A catalytic antibody isomerizing a A5-3-ketosteroid. Un anticorps catalytique isomérisant un hP-3-cétostéroïde. Bachra Khettal, Solange de Lauzon, Bernard Desfosses, Satoshi Ushida, Andrée Marquet 386 Amplification of myoadenylate deaminase during evolution. A comparative study. Amplification de la myoadenylate désaminase au cours de l'évolution. Une approche comparée. Jean-Paul Raffin, Marie-Thérèse Thébault A Biologie et génétique moléculaire/Molecular biology and genetics 392 A physical and genomic map of the prokaryote Spiroplasma melliferum and its comparison with the Spiroplasma citri map. Carte physique et génomique du procaryote Spiroplasma melliferum
sont révélées par l'anti-ferritine (en bleu) et la plaque sénile classique par l'anti-fi/A4 amyloïde (en brun) ; colocalisation dans les cellules ferritine-positives de substance $/A4 amyloïde. Z. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, vol. 317 n° 5, mai 1994. 377 C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, vol. 317 n° 5, mai 1994. No. 5 May 1994 A Biochimie/Biochemistry 381 A catalytic antibody isomerizing a A5-3-ketosteroid. Un anticorps catalytique isomérisant un hP-3-cétostéroïde. Bachra Khettal, Solange de Lauzon, Bernard Desfosses, Satoshi Ushida, Andrée Marquet 386 Amplification of myoadenylate deaminase during evolution. A comparative study. Amplification de la myoadenylate désaminase au cours de l'évolution. Une approche comparée. Jean-Paul Raffin, Marie-Thérèse Thébault A Biologie et génétique moléculaire/Molecular biology and genetics 392 A physical and genomic map of the prokaryote Spiroplasma melliferum and its comparison with the Spiroplasma citri map. Carte physique et génomique du procaryote Spiroplasma melliferum et sa comparaison avec celle de Spiroplasma citri. Fengchun Ye, Frédéric Laigret, Joseph-Marie Bové 399 On small genomes in eukaryotic organisms: molecular karyotypes of two microsporidian species (Protozoa) parasites of vertebrates. Recherches sur les petits génomes chez les eucaryotes : caryotypes moléculaires de deux espèces de microsporidies (protozoaires) parasites de vertébrés. Corinne Biderre, Michel Pages, Guy Metenier, Danièle David, Jacqueline Bâta, Christian P. Vivares ▲ Biologie du développement/Development biology 405 Production de blastulas partielles par parthénogenèse chez le xénope. Parthénogenèse production of partial blastulas in Xenopus. Frédéric Tournier, Anne Joly, Michel Bornens A Biologie et pathologie animale/Animal biology and pathology 411 Effets d'extraits de glandes du sinus sur la physiologie osmorégulatrice de branchies perfusées du crabe Pochygraspus marmoratus. Effects of sinus gland extracts on the osmoregulatory physiology of perfused gills from the crab Pachygraspus marmoratus. Céline Pierrot, Erik Eckhardt, François van Herp, Mireille Charmantier-Daures, Guy Charmantier, Jean-Paul Trilles, Pierre Thuet ▲ Biologie et pathologie végétale/Plant biology and pathology 419 Les espèces moléculaires de phosphatidylinositol et de phosphatidylinositolphosphate présentes dans les coléoptiles et premières feuilles de maïs (Zea mays L.). The molecular species of phosphatidylinositol and phosphatidylinositolphosphate evidenced in the coléoptiles and the first leaves of maize (Zea mays L.). Ahmed
vertébrés. Corinne Biderre, Michel Pages, Guy Metenier, Danièle David, Jacqueline Bâta, Christian P. Vivares ▲ Biologie du développement/Development biology 405 Production de blastulas partielles par parthénogenèse chez le xénope. Parthénogenèse production of partial blastulas in Xenopus. Frédéric Tournier, Anne Joly, Michel Bornens A Biologie et pathologie animale/Animal biology and pathology 411 Effets d'extraits de glandes du sinus sur la physiologie osmorégulatrice de branchies perfusées du crabe Pochygraspus marmoratus. Effects of sinus gland extracts on the osmoregulatory physiology of perfused gills from the crab Pachygraspus marmoratus. Céline Pierrot, Erik Eckhardt, François van Herp, Mireille Charmantier-Daures, Guy Charmantier, Jean-Paul Trilles, Pierre Thuet ▲ Biologie et pathologie végétale/Plant biology and pathology 419 Les espèces moléculaires de phosphatidylinositol et de phosphatidylinositolphosphate présentes dans les coléoptiles et premières feuilles de maïs (Zea mays L.). The molecular species of phosphatidylinositol and phosphatidylinositolphosphate evidenced in the coléoptiles and the first leaves of maize (Zea mays L.). Ahmed Chicha, Chantal Demandré, Anne-Marie Justin, Paul Mazliak 424 Sélection clonale d'iris à parfum. Clonal selection of iris species for parfumery. Huguette Jehan, Didier Courtois, Charles Ehret, Konrad Lerch, Vincent Petiard ▲ Pharmacologie/Pharmacology 430 Potentiation of 2',3'-dideoxycytidine (ddc) by hydroxyurea and thymidine on the moloney murine leukemia virus (MoMLV) early replicative steps. Potentiation de l'effet du 2',3'-didéoxycytidine (ddc) par l'hydroxyurée et la thymidine sur les étapes précoces du cycle réplicatif du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMLV). Hélène Goulaouic, Frédéric Subra, Jean-François Mouscadet, Sandrine Carteau, Christian Auclair ▲ Sciences médicales/Medical sciences 437 Hb Taybe (a 38 or 39 THR deleted): an a-globin defect, silent in the heterozygous state and producing severe hemolytic anemia in the homozygous. L'Hb Taybe (a. 38 ou 39 THR délitée) : une anomalie de la chaîne a de la globuline, muette à l'état hétérozygote mais responsable d'une anémie hémolytique sévère à l'état homozygote. Frédéric Galacteros, Emmanuelle Girodon, Amel M'Rad, Josiane Martin, Michel Goossens, Lutfi Jaber, lan J. Cohen, Hannah Tamary, Yakov Goshen, Rina Zaizov, Henri Wajcman 445 Do microglial cells phagocyte the p7A4-amyloid senile plaque core of Alzheimer disease? Les cellules microgliales phagocytent-elles la substance $/A4 amyloïde du coeur de la plaque sénile de la
steps. Potentiation de l'effet du 2',3'-didéoxycytidine (ddc) par l'hydroxyurée et la thymidine sur les étapes précoces du cycle réplicatif du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMLV). Hélène Goulaouic, Frédéric Subra, Jean-François Mouscadet, Sandrine Carteau, Christian Auclair ▲ Sciences médicales/Medical sciences 437 Hb Taybe (a 38 or 39 THR deleted): an a-globin defect, silent in the heterozygous state and producing severe hemolytic anemia in the homozygous. L'Hb Taybe (a. 38 ou 39 THR délitée) : une anomalie de la chaîne a de la globuline, muette à l'état hétérozygote mais responsable d'une anémie hémolytique sévère à l'état homozygote. Frédéric Galacteros, Emmanuelle Girodon, Amel M'Rad, Josiane Martin, Michel Goossens, Lutfi Jaber, lan J. Cohen, Hannah Tamary, Yakov Goshen, Rina Zaizov, Henri Wajcman 445 Do microglial cells phagocyte the p7A4-amyloid senile plaque core of Alzheimer disease? Les cellules microgliales phagocytent-elles la substance $/A4 amyloïde du coeur de la plaque sénile de la maladie d'Alzheimer ? Khalid Hamid El Hachimi, Jean-François Foncin 452 Intérêt de la linsidomine (SIN 1) pour l'évaluation de la viabilité myocardique par scintigraphie au 2°lTl après effort. Value of linsidomine (SIN 1) for assessment of myocardial viability by exercise 201 Tl scintigraphy. André Vacheron, Pierre de Vernejoul Écologie/ Ecology Incidence écophysiologique de l’absorption épithéliale d’acides aminés dissous par Crassostrea gigas. Ecophysiological relevance of dissolved amino acid transepidermal uptake in Crassostrea gigas. Solange Le Gall, Christian Bechemin Évolution/Evolution Widespread occurrence of the proteobacteria Wolbachia and partial cytoplasmic incompatibility in Drosophila melanogaster. Infection par la protéobactérie Wolbachia et incompatibilité cytoplipoparticielle sont fréquentes chez Drosophila melanogaster. Michel Solignac, Dominique Vautrin, François Rousset Les Tropidophiidae (Serpentes ; Alethinophidia) sont-ils réellement monophylétiques ? Arguments en faveur de leur polyphylétisme. Are the Tropidophiidae (Serpentes; Alethinophidia) really monophyletic? Arguments in favor of their polyphyletic status. Hussam Zaher C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, vol. 317 n° 5, mai 1994. COMPTES RENDUS DE L’ACADÉMIE DES SCIENCES SÉRIE III SCIENCES DE LA VIE/LIFE SCIENCES Biologie et pathologie animale/ Animal biology and pathology Biologie et pathologie végétale/Plant biology and pathology Biologie du développement/Development biology Biologie cellulaire/ Cell biology Biologie du développement/Development biology Epidémiologie/Epidemiology Écologie/Ecology Évolution/Evolution
Incidence écophysiologique de l’absorption épithéliale d’acides aminés dissous par Crassostrea gigas. Ecophysiological relevance of dissolved amino acid transepidermal uptake in Crassostrea gigas. Solange Le Gall, Christian Bechemin Évolution/Evolution Widespread occurrence of the proteobacteria Wolbachia and partial cytoplasmic incompatibility in Drosophila melanogaster. Infection par la protéobactérie Wolbachia et incompatibilité cytoplipoparticielle sont fréquentes chez Drosophila melanogaster. Michel Solignac, Dominique Vautrin, François Rousset Les Tropidophiidae (Serpentes ; Alethinophidia) sont-ils réellement monophylétiques ? Arguments en faveur de leur polyphylétisme. Are the Tropidophiidae (Serpentes; Alethinophidia) really monophyletic? Arguments in favor of their polyphyletic status. Hussam Zaher C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, vol. 317 n° 5, mai 1994. COMPTES RENDUS DE L’ACADÉMIE DES SCIENCES SÉRIE III SCIENCES DE LA VIE/LIFE SCIENCES Biologie et pathologie animale/ Animal biology and pathology Biologie et pathologie végétale/Plant biology and pathology Biologie du développement/Development biology Biologie cellulaire/ Cell biology Biologie du développement/Development biology Epidémiologie/Epidemiology Écologie/Ecology Évolution/Evolution Taxonomie/Taxonomy Agronomie/Agronomy Anthropologie/Anthropology Biochimie/Biochemistry Microbiologie/Microbiology Pharmacologie/Pharmacology Sciences médicales/Medical sciences Biologie des populations/Populations biology Biologie et génétique animale/Animal biology and genetics Biologie et génétique végétale/Plant biology and genetics Biologie et génétique moléculaire/Molecular biology and genetics Biophysique/Biophysics Immunologie/Immunology Physiologie/Physiology C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, 1994; 317: 381-385 Biochimie/Biochemistry A catalytic antibody isomerizing a A5-3-ketosteroid Un anticorps catalytique isomérisant un A5 -3-cétostéroïde BACHRA KHETTAL, SOLANGE de LAUZON, BERNARD DESFOSSES, SATOSHI USHIDA, ANDRÉE MARQUET URA 400, CNRS, UFR Biomédicale des Saints-Pères, 45, rue des Saints-Pères, 75270 Paris Cedex 06, France. 2' Mukogawa Women's University, Ikeda-Cho, Nishinomiya 663, Japon. 3) URA 493, CNRS, Université Paris-VI, 2, place Jussieu, 75005 Paris, France. Tirés à part : S. de Lauzon. RÉSUMÉ Des anticorps ont été produits à partir du 3-fluoro-4-aza-estradiol-17-hémisuccinate afin d’obtenir des abzymes capables d’isomériser les A5-3-cétostéroïdes. L’haptène choisi possède un noyau A plan présentant une analogie avec l’intermédiaire réactionnel dienol et une polarité susceptible d’induire des groupes catalytiques dans l’anticorps. Les anticorps liant fortement l’haptène ont été clones et purifiés soit à partir d’ascites soit à partir de surnageant d’hybridomes. L’activité catalytique a été évaluée vis-à-vis de l'androst-5-ene-3,17-dione. Parmi les cinq anticorps monoclonaux différents obtenus, l’un s’est révélé capable d’augmenter
Biochimie/Biochemistry A catalytic antibody isomerizing a A5-3-ketosteroid Un anticorps catalytique isomérisant un A5 -3-cétostéroïde BACHRA KHETTAL, SOLANGE de LAUZON, BERNARD DESFOSSES, SATOSHI USHIDA, ANDRÉE MARQUET URA 400, CNRS, UFR Biomédicale des Saints-Pères, 45, rue des Saints-Pères, 75270 Paris Cedex 06, France. 2' Mukogawa Women's University, Ikeda-Cho, Nishinomiya 663, Japon. 3) URA 493, CNRS, Université Paris-VI, 2, place Jussieu, 75005 Paris, France. Tirés à part : S. de Lauzon. RÉSUMÉ Des anticorps ont été produits à partir du 3-fluoro-4-aza-estradiol-17-hémisuccinate afin d’obtenir des abzymes capables d’isomériser les A5-3-cétostéroïdes. L’haptène choisi possède un noyau A plan présentant une analogie avec l’intermédiaire réactionnel dienol et une polarité susceptible d’induire des groupes catalytiques dans l’anticorps. Les anticorps liant fortement l’haptène ont été clones et purifiés soit à partir d’ascites soit à partir de surnageant d’hybridomes. L’activité catalytique a été évaluée vis-à-vis de l'androst-5-ene-3,17-dione. Parmi les cinq anticorps monoclonaux différents obtenus, l’un s’est révélé capable d’augmenter significativement la vitesse d’isomérisation du substrat (kcat/kuncat = 830). La réaction d’isomérisation suit une cinétique michaelienne et est inhibée de manière compétitive par l’haptène. Mots clés : anticorps catalytique, A5-3-cétostéroïde, isomérisation, cinétique. ABSTRACT Antibodies were raised against 3-fluoro-4-aza-estradiol-17-hemisuccinate to elicit abzymes capable of isomerizing A'-3-ketosteroids. The hapten was designed to présent a planar A ring showing some analogy with the intermediate dienol and a polarity capable of inducing catalytic groups. Antibodies binding the hapten tightly were cloned and purified from either ascites or hybridoma supernatants. Catalytic activity was tested with androst-5-ene-3,17-dione. Among the five different monoclonal antibodies binding the hapten, one proved to enhance significantly the substrate isomerization rate (kcat = 830). Initial rates followed Michaelis kinetics and the activity was competitively inhibited by the hapten. Key words : catalytic antibody, A5-3-ketosteroid, isomerization, kinetics. Voir Version abrégée (p. 384) The Pauling theory of enzymatic catalysis [1], throwing light on the close structural complementarity of the enzymatic site with the transition state of the reaction, has been the starting point in the generation of catalytic antibodies elicited against stable analogs of the transition state of an enzymatic reaction. Moreover, adequate basic or acidic, nucleophilic or electrophilic amino acid side chains should
présent a planar A ring showing some analogy with the intermediate dienol and a polarity capable of inducing catalytic groups. Antibodies binding the hapten tightly were cloned and purified from either ascites or hybridoma supernatants. Catalytic activity was tested with androst-5-ene-3,17-dione. Among the five different monoclonal antibodies binding the hapten, one proved to enhance significantly the substrate isomerization rate (kcat = 830). Initial rates followed Michaelis kinetics and the activity was competitively inhibited by the hapten. Key words : catalytic antibody, A5-3-ketosteroid, isomerization, kinetics. Voir Version abrégée (p. 384) The Pauling theory of enzymatic catalysis [1], throwing light on the close structural complementarity of the enzymatic site with the transition state of the reaction, has been the starting point in the generation of catalytic antibodies elicited against stable analogs of the transition state of an enzymatic reaction. Moreover, adequate basic or acidic, nucleophilic or electrophilic amino acid side chains should be présent and precisely positioned into antibody combining sites [2]. The mammalian A5-3-ketosteroid isomerase plays an essential biological role since it is implicated in cholesterol hepatic detoxification and in steroid hormone biosynthesis. A great deal is known about this enzyme due to intensive study of bacterial A5-3-ketosteroid isomerase of Pseudomonas testosteroni which promotes the highly efficient isomerization of a variety of A5 or A5-6-3-ketosteroids to A4-3-ketosteroids at a rate approaching the diffusion limit. This reaction has been shown to occur via the enolization of the A5-3-ketosteroid to form a dienolic intermediate [3, 4]. In the active site of the enzyme, Tyr-14 acts as an acid to protonate the 3-keto group and Asp-38 acts as a base to remove the axial proton at position 4 (Fig. 1). The présent challenge was to induce antibodies able to catalyze this transformation of A5-3-ketosteroids into A4-3-ketosteroids. Note présentée par Marianne Grunberg-Manago. Note remise le 7 mars 1994, acceptée après révision le 11 avril 1994. B. Khettal et al. Figure 1. Reaction mechanism of A5-3-ketosteroid isomerase of Pseudomonas testosteroni. In this study we présent preliminary data showing the unequivocal catalytic activity of a monoclonal antibody raised against 3-fluoro-4-aza-estradiol-17-hemisuccinate. Material and methods Synthesis of hapten and
testosteroni which promotes the highly efficient isomerization of a variety of A5 or A5-6-3-ketosteroids to A4-3-ketosteroids at a rate approaching the diffusion limit. This reaction has been shown to occur via the enolization of the A5-3-ketosteroid to form a dienolic intermediate [3, 4]. In the active site of the enzyme, Tyr-14 acts as an acid to protonate the 3-keto group and Asp-38 acts as a base to remove the axial proton at position 4 (Fig. 1). The présent challenge was to induce antibodies able to catalyze this transformation of A5-3-ketosteroids into A4-3-ketosteroids. Note présentée par Marianne Grunberg-Manago. Note remise le 7 mars 1994, acceptée après révision le 11 avril 1994. B. Khettal et al. Figure 1. Reaction mechanism of A5-3-ketosteroid isomerase of Pseudomonas testosteroni. In this study we présent preliminary data showing the unequivocal catalytic activity of a monoclonal antibody raised against 3-fluoro-4-aza-estradiol-17-hemisuccinate. Material and methods Synthesis of hapten and substrates The structures of hapten, substrates and products are given in Figure 2. 3-Fluoro-4-aza-estradiol-17-hemisuccinate (1) was synthesized from 19-nor-testosterone [5]. 5(10)-Estradiol-17-one (2) was a gift from Roussel UCLAF and androst-5-ene-3,17-dione (3) was obtained by oxidation of 3|3-hydroxy-17-oxo-androst-5-ene [6]. Preparation of conjugates, immunization, immunoassays, and monoclonal antibody production The mixed anhydride method [7] was used to couple the hapten to the carrier proteins, bovine serum albumin (BSA) and ß-lactoglobulin. Mice were immunized with the BSA conjugate. After fusion of mouse spleen cells with myeloma cells according to standard protocols, the resulting hybridomas were screened by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for binding to the hapten ß-lactoglobulin conjugate using peroxidase-linked rabbit anti-mouse antibodies [8]. Hybridoma cells that secreted IgG spécifique for the hapten were cloned at least twice before further sélection by compétition ELISA [9] using hapten (1), substrate (2) and product (4) competitors. Large amounts of selected monoclonal antibodies were produced and purified from either ascites or from hybridoma supernatants. Purification included a 45 % saturated ammonium sulfate précipitation and protein A affinity chromatography. Purity of immunoglobulins was examined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Enzymatic assays The purified antibodies were tested for catalytic activity by measuring the rate of isomerization of 5,10-estren-3-one-17β-ol
method [7] was used to couple the hapten to the carrier proteins, bovine serum albumin (BSA) and ß-lactoglobulin. Mice were immunized with the BSA conjugate. After fusion of mouse spleen cells with myeloma cells according to standard protocols, the resulting hybridomas were screened by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for binding to the hapten ß-lactoglobulin conjugate using peroxidase-linked rabbit anti-mouse antibodies [8]. Hybridoma cells that secreted IgG spécifique for the hapten were cloned at least twice before further sélection by compétition ELISA [9] using hapten (1), substrate (2) and product (4) competitors. Large amounts of selected monoclonal antibodies were produced and purified from either ascites or from hybridoma supernatants. Purification included a 45 % saturated ammonium sulfate précipitation and protein A affinity chromatography. Purity of immunoglobulins was examined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Enzymatic assays The purified antibodies were tested for catalytic activity by measuring the rate of isomerization of 5,10-estren-3-one-17β-ol (2) and androst-5-ene-3,17-dione (3). The release of 19-nor-testosterone (4) or of androst-4-ene-3,17-dione [5] was monitored by UV spectroscopy at 248 nm at 20 °C. The assay cell contained defined concentrations of substrate in 1 ml of 100 mM phosphate buffer pH 7.0, containing 5 % ethanol (v/v). Reactions were initiated by addition of purified immunoglobulins. The reference cell contained either the buffer (Fig. 3) or the buffer and substrate (Fig. 4). Figure 3. Isomerization of androst-5-ene-3,17-dione at 140 μM concentration, catalyzed by 9D5H12 at a final concentration of 3 μM in 100 mM phosphate buffer, pH 7.0 (•), and in 100 mM phosphate buffer alone (o). Results Screening of antibodies elicited against 3-fluoro-4-azaestradiol-17-hemisuccinate-BSA (1-BSA) led to 5 different monoclonal purified antibodies binding tightly to the hapten (1), the substrate (2) and product (4) to various degrees. The subtype study of the selected antibodies showed that all antibodies were IgG1. The antibodies were judged to be homogeneous by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS/PAGE). However, in the case of IgGs purified from hybridoma supernatants, two closely spaced bands could be observed for the non-reduced IgGs and for the heavy chain of mercaptoethanol-reduced IgGs. These double bands were not observed in the case of