jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
by addition of purified immunoglobulins. The reference cell contained either the buffer (Fig. 3) or the buffer and substrate (Fig. 4). Figure 3. Isomerization of androst-5-ene-3,17-dione at 140 μM concentration, catalyzed by 9D5H12 at a final concentration of 3 μM in 100 mM phosphate buffer, pH 7.0 (•), and in 100 mM phosphate buffer alone (o). Results Screening of antibodies elicited against 3-fluoro-4-azaestradiol-17-hemisuccinate-BSA (1-BSA) led to 5 different monoclonal purified antibodies binding tightly to the hapten (1), the substrate (2) and product (4) to various degrees. The subtype study of the selected antibodies showed that all antibodies were IgG1. The antibodies were judged to be homogeneous by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS/PAGE). However, in the case of IgGs purified from hybridoma supernatants, two closely spaced bands could be observed for the non-reduced IgGs and for the heavy chain of mercaptoethanol-reduced IgGs. These double bands were not observed in the case of ascites IgGs. The 5 purified IgG antibodies (3 μM) have been tested for their ability to catalyze the isomerization of substrates (2) and (3) (100 μM). The catalytic activity was monitored spectroscopically by measuring the increase of absorbances at 248 nm. None of the 5 antibodies produced any measurable isomerization of 5,10-estren-17β-ol-3-one (2). However, one of them (9D5H12) proved to enhance significantly the rate of isomerization of androst-5-ene-3,17-dione (3) (Fig. 3). This enhancement was inhibited by the hapten. The initial rates of isomerization of androst-5-ene-3,17-dione (3) were measured as a function of substrate concentrations (7-35 mM) in the presence of 0.44 μM purified 9D5H12 immunoglobulin. The reaction followed Michaelis-Menten kinetics (Fig. 4). Kinetic parameters (Table I) were determined using a Lineweaver-Burk analysis. As expected, the spontaneous reaction followed first order kinetics (kuncat = 2.7 x 10−3 min−1). Isomerization of (3) by the antibody was thus accelerated by a factor of 830. Inhibition studies performed at two fixed concentrations of the inhibitor (1) using the same substrate and antibody concentrations demonstrated a competitive inhibition with a Ki of 130 μM. The catalytic activity associated with 9D5H12 monoclonal antibody was destroyed by thermal denaturation of the antibodies at 95 °C for 30
of 5,10-estren-17β-ol-3-one (2). However, one of them (9D5H12) proved to enhance significantly the rate of isomerization of androst-5-ene-3,17-dione (3) (Fig. 3). This enhancement was inhibited by the hapten. The initial rates of isomerization of androst-5-ene-3,17-dione (3) were measured as a function of substrate concentrations (7-35 mM) in the presence of 0.44 μM purified 9D5H12 immunoglobulin. The reaction followed Michaelis-Menten kinetics (Fig. 4). Kinetic parameters (Table I) were determined using a Lineweaver-Burk analysis. As expected, the spontaneous reaction followed first order kinetics (kuncat = 2.7 x 10−3 min−1). Isomerization of (3) by the antibody was thus accelerated by a factor of 830. Inhibition studies performed at two fixed concentrations of the inhibitor (1) using the same substrate and antibody concentrations demonstrated a competitive inhibition with a Ki of 130 μM. The catalytic activity associated with 9D5H12 monoclonal antibody was destroyed by thermal denaturation of the antibodies at 95 °C for 30 min. Figure 4. Lineweaver-Burk plot for isomerization of androst-5-ene-3,17-dione by 9D5H12. Velocities were determined as described in Table I. (•) no inhibitor present (A) inhibited by 1.33 μM hapten (o) inhibited by 1.87 μM hapten. Discussion The first step in the production of catalytic antibodies is the design of the hapten. Steroids with planar A or A rings are competitive inhibitors of the isomerase and have been considered as analogs of the high-energy dienol intermediate [10]. We thus chose a molecule with an aromatic A ring. The electronegative fluorine at position 3 should induce an acidic side-chain in the antibody leading to a strong hydrogen bond. We initially planned to quaternize the 4-nitrogen to induce a complementary basic group. As the corresponding compound could not be obtained, we used (1) as a hapten. The hybridoma selection procedure is the second crucial phase in the successful production of catalytic monoclonal antibodies [11]. We selected antibodies by competition ELISA [9] measuring their relative affinities (a) for the hapten (b), for molecule (2) which is a potential substrate, (c) for the corresponding product (4). Antibody should recognize the hapten with a high affinity, the substrate with a medium affinity and the product with
hapten. Steroids with planar A or A rings are competitive inhibitors of the isomerase and have been considered as analogs of the high-energy dienol intermediate [10]. We thus chose a molecule with an aromatic A ring. The electronegative fluorine at position 3 should induce an acidic side-chain in the antibody leading to a strong hydrogen bond. We initially planned to quaternize the 4-nitrogen to induce a complementary basic group. As the corresponding compound could not be obtained, we used (1) as a hapten. The hybridoma selection procedure is the second crucial phase in the successful production of catalytic monoclonal antibodies [11]. We selected antibodies by competition ELISA [9] measuring their relative affinities (a) for the hapten (b), for molecule (2) which is a potential substrate, (c) for the corresponding product (4). Antibody should recognize the hapten with a high affinity, the substrate with a medium affinity and the product with a much lower affinity to avoid product inhibition. Among known substrates of A5-3-ketosteroid isomerase, (2) was preferred to (3) for this selection step since the spontaneous isomerization of (3) is much faster. Five antibodies exhibited the required relative affinities and were purified in larger amounts from 2 ascitic fluids and 3 hybridoma supernatants. Though antibodies were virtually the only proteins present in the purified preparations from the SDS-electrophoresis gels stained with Coomassie blue, very close double bands could be observed when IgGs arose from hybridoma supernatants. This double band concerned the heavy chain of IgGs only. Horse serum present in culture medium of hybridomas was specified low-IgG serum. It is however likely that the remaining horse IgGs were not perfectly separated from mouse IgGs on protein A. These horse IgGs cannot be involved in the catalytic activity observed for antibody 9D5H12 since other antibodies purified in the same manner from hybridoma supernatants did not show any catalytic potency. When initial rates of isomerization of substrate (3) by 9D5H12 antibody as a function of substrate concentration were measured, saturation kinetics were observed. This finding is consistent with the formation of a Michaelis complex between the substrate and the antibody prior to
3 hybridoma supernatants. Though antibodies were virtually the only proteins present in the purified preparations from the SDS-electrophoresis gels stained with Coomassie blue, very close double bands could be observed when IgGs arose from hybridoma supernatants. This double band concerned the heavy chain of IgGs only. Horse serum present in culture medium of hybridomas was specified low-IgG serum. It is however likely that the remaining horse IgGs were not perfectly separated from mouse IgGs on protein A. These horse IgGs cannot be involved in the catalytic activity observed for antibody 9D5H12 since other antibodies purified in the same manner from hybridoma supernatants did not show any catalytic potency. When initial rates of isomerization of substrate (3) by 9D5H12 antibody as a function of substrate concentration were measured, saturation kinetics were observed. This finding is consistent with the formation of a Michaelis complex between the substrate and the antibody prior to isomerization. At 20 °C the value of kcat and Km were determined to be respectively 2.25 min−1 and 160 μM. The observed rates were corrected automatically for the uncatalyzed isomerization of androst-5-ene-3,17-dione since the substrate was present in the two spectrophotometric cells (differential measurements). However, spontaneous reaction in the absence of antibodies was measured at the same temperature for the determination of kcat/kuncat ratio, which gave evidence of a substantial enhancement of the catalysis by the antibody. Convincing evidence that substrate reacts in the induced binding pocket of the antibody was obtained by examining the kinetics in the presence of the hapten molecule. As shown in Figure 3, the isomerization of androst-5-ene3,17-dione to androst-4-ene-3,17-dione is competitively inhibited by hapten with a Ki value of 130 μM. This Ki value is relatively high and reveals that the structure of the hapten is likely to be far different from that of the transition state. The activity is probably rather due to the presence in the binding site of the proper acidic and basic residues. No significant isomerization of substrate (2) could be detected with 9D5H12 antibody, which may be explained by the non-flexibility of amino acid residues in the binding site of
of antibodies was measured at the same temperature for the determination of kcat/kuncat ratio, which gave evidence of a substantial enhancement of the catalysis by the antibody. Convincing evidence that substrate reacts in the induced binding pocket of the antibody was obtained by examining the kinetics in the presence of the hapten molecule. As shown in Figure 3, the isomerization of androst-5-ene3,17-dione to androst-4-ene-3,17-dione is competitively inhibited by hapten with a Ki value of 130 μM. This Ki value is relatively high and reveals that the structure of the hapten is likely to be far different from that of the transition state. The activity is probably rather due to the presence in the binding site of the proper acidic and basic residues. No significant isomerization of substrate (2) could be detected with 9D5H12 antibody, which may be explained by the non-flexibility of amino acid residues in the binding site of the antibody. In conclusion, using a rationally designed hapten, we have successfully elicited an antibody that accelerates the rate of A5-3-ketosteroid isomerization. Preparation of larger amounts of this immunoglobulin purified from ascites is in progress. This will allow a more complete study of the mechanism of this abzyme. This paper is dedicated to the memory of Nicole Cittanova (1938-1993) who initiated this work. VERSION ABRGÉE La A5-3-cétostéroïde isomerase joue un rôle essentiel au niveau des glandes endocrines pour la biosynthèse des hormones aussi bien qu'au niveau du foie pour le catabolisme du cholestérol. Le mécanisme d'action de cette isomerase, très étudié avec l'enzyme de Pseudomonas testosteroni fait intervenir essentiellement un acide et une base du site enzymatique, la tyrosine 14 et l'aspartate 38, qui catalysent l'enolisation de la cétone en 3 du stéroïde. La reprotonation du dienol intermédiaire conduit à la cétone conjuguée. Dans ce travail, nous avons cherché à obtenir des anticorps monoclonaux capables de mimer l'activité catalytique de la A -3-cétostéroïde isomerase. L'haptène choisi, le 3-fluoro-4-aza-estradiol-17-hémisuccinate, possède un noyau plan, présentant une analogie avec l'intermédiaire réactionnel dienol et une polarité susceptible d'induire des groupes catalytiques dans l'anticorps. L'immunisation des souries, la fusion cellulaire et les clonages ont été
is dedicated to the memory of Nicole Cittanova (1938-1993) who initiated this work. VERSION ABRGÉE La A5-3-cétostéroïde isomerase joue un rôle essentiel au niveau des glandes endocrines pour la biosynthèse des hormones aussi bien qu'au niveau du foie pour le catabolisme du cholestérol. Le mécanisme d'action de cette isomerase, très étudié avec l'enzyme de Pseudomonas testosteroni fait intervenir essentiellement un acide et une base du site enzymatique, la tyrosine 14 et l'aspartate 38, qui catalysent l'enolisation de la cétone en 3 du stéroïde. La reprotonation du dienol intermédiaire conduit à la cétone conjuguée. Dans ce travail, nous avons cherché à obtenir des anticorps monoclonaux capables de mimer l'activité catalytique de la A -3-cétostéroïde isomerase. L'haptène choisi, le 3-fluoro-4-aza-estradiol-17-hémisuccinate, possède un noyau plan, présentant une analogie avec l'intermédiaire réactionnel dienol et une polarité susceptible d'induire des groupes catalytiques dans l'anticorps. L'immunisation des souries, la fusion cellulaire et les clonages ont été réalisés de manière habituelle. Les anticorps ont été sélectionnés d'après leurs affinités relatives vis-à-vis de l'haptène. Les immunoglobulines purifiées ont été obtenues soit à partir d'ascites soit à partir de surnageants d'hybridome, par précipitation au sulfate d'ammonium et chromatographie d'affinité sur protéine A. L'électrophorèse en SDS/polyacrylamide en conditions réductrices et non-réductrices a confirmé la pureté des immunoglobulines provenant des ascites. Par contre, pour les immunoglobulines provenant des surnageants d'hybridomes, deux bandes très proches ont été observées, que ce soit avant réduction ou au niveau des chaînes lourdes. Une explication possible pourrait être une contamination par les immunoglobulines de cheval présentes en très faible pourcentage dans le milieu de culture des hybridomes et imparfaitement séparées des immunoglobulines de souris sur protéine A. Les tests d'activité catalytique, réalisés en présence de deux substrats de l'isomérase, le 5,10-estren-3-one-17S-ol et l'androst-5-ene3,17-dione, ont été réalisés en mesurant par spectrophotométrie l'augmentation des absorbances à 248 nm. Aucun des anticorps ne catalyse l'isomérisation du 5,10-estren-3-one-17P-ol. Par contre, la vitesse d'isomérisation de l'androst-5-ene-3,17-dione en présence de l'anticorps 9D5H12 est nettement augmentée par rapport à l'isomérisation spontanée mesurée en absence d'anticorps. La dénaturation thermique de l'anticorps fait disparaître cette activité catalytique. L'étude des vitesses initiales en fonction de la
non-réductrices a confirmé la pureté des immunoglobulines provenant des ascites. Par contre, pour les immunoglobulines provenant des surnageants d'hybridomes, deux bandes très proches ont été observées, que ce soit avant réduction ou au niveau des chaînes lourdes. Une explication possible pourrait être une contamination par les immunoglobulines de cheval présentes en très faible pourcentage dans le milieu de culture des hybridomes et imparfaitement séparées des immunoglobulines de souris sur protéine A. Les tests d'activité catalytique, réalisés en présence de deux substrats de l'isomérase, le 5,10-estren-3-one-17S-ol et l'androst-5-ene3,17-dione, ont été réalisés en mesurant par spectrophotométrie l'augmentation des absorbances à 248 nm. Aucun des anticorps ne catalyse l'isomérisation du 5,10-estren-3-one-17P-ol. Par contre, la vitesse d'isomérisation de l'androst-5-ene-3,17-dione en présence de l'anticorps 9D5H12 est nettement augmentée par rapport à l'isomérisation spontanée mesurée en absence d'anticorps. La dénaturation thermique de l'anticorps fait disparaître cette activité catalytique. L'étude des vitesses initiales en fonction de la concentration du substrat a montré que la réaction suit une cinétique michaélienne. L'haptène est un inhibiteur compétitif par rapport au substrat, ce qui confirme que l'isomérisation du stéroïde a lieu dans le site de liaison de l'anticorps. Le rapport kat/kunat démontre une accélération de 830 fois de la vitesse d'isomérisation. La présence possible d'un artefact dans la préparation d'immunoglobulines, par exemple les immunoglobulines de cheval non séparées au cours de la purification, ne peut expliquer l'activité catalytique mesurée puisqu'aucune activité n'a pu être observée pour trois autres anticorps liant l'haptène et qui ont été produits et purifiés dans les mêmes conditions. En conclusion, par le choix rationnel de la molécule d'haptène utilisée pour induire les anticorps, il a été possible d'obtenir un anticorps catalysant l'isomérisation des A -3-cétostéroïdes. La préparation d'une quantité plus importante d'immunoglobulines parfaitement purifiées à partir d'ascites est en cours. Ceci permettra d'étudier plus complètement le mécanisme de la catalyse. À jour 1. Pauling L. 1948. Nature of forces between large molecules of biological interest., Nature 161: 707-9. 2. Lerner R. A., Benkovic S. J., Schultz P. G. 1991. At the crossroads of chemistry and immunology: catalytic antibodies. Science 252: 659-67. 3. Li Y. K., Kuliopulos A.,
La présence possible d'un artefact dans la préparation d'immunoglobulines, par exemple les immunoglobulines de cheval non séparées au cours de la purification, ne peut expliquer l'activité catalytique mesurée puisqu'aucune activité n'a pu être observée pour trois autres anticorps liant l'haptène et qui ont été produits et purifiés dans les mêmes conditions. En conclusion, par le choix rationnel de la molécule d'haptène utilisée pour induire les anticorps, il a été possible d'obtenir un anticorps catalysant l'isomérisation des A -3-cétostéroïdes. La préparation d'une quantité plus importante d'immunoglobulines parfaitement purifiées à partir d'ascites est en cours. Ceci permettra d'étudier plus complètement le mécanisme de la catalyse. À jour 1. Pauling L. 1948. Nature of forces between large molecules of biological interest., Nature 161: 707-9. 2. Lerner R. A., Benkovic S. J., Schultz P. G. 1991. At the crossroads of chemistry and immunology: catalytic antibodies. Science 252: 659-67. 3. Li Y. K., Kuliopulos A., Mildwan A. S., Talalay P. 1993. Environment and mechanism roles of the tyrosine residues of A5-3-ketosteroid isomerase. Biochemistry 32: 1816-24 and références citées. 4. Viger A., Coustal S., Marquet A. 1981. A reinvestigation of the mechanism of Pseudomonas testosteroni A5-3-ketosteroid isomerase. J. Am. Chem. Soc, 103: 451-8. 5. Ushida S. et al. Results to be published. 6. Viger A., Coustal S., Marquet A. 1978. Synthèse des 4a, 4p-déuterio3p, 17p-dihydroxy androsta-5-ene. Tetrahedron 34: 3285-90. 7. Erlanger B. F., Borek F., Bliser S. M., Lieberman S. 1957. Steroid-protein conjugates. 1. Preparation and characterization of conjugates of bovine serum albumin with testosterone and with cortisone. J. Biol. Chem., 228: 713-27. 8. de tauzon S., Desfosses B., Moreau M. F., Le Trang N., Rajkowski K., Cittanova N. 1990. Comparison of monoclonal antibodies to estradiol obtained from structurally different immunogens. Hybridoma 9: 481-91. 9. Iverson B. L, Cameron K. E., Jahangiri G. K., Pasternak D. S. 1990. Selective cleavage of trityl protecting groups catalyzed by an antibody. J. Am. Chem. Soc. 112: 5320-3. 10. Wolfenden R. 1977. Transition state analogs as potential affinity labeling reagents. Meth. Enzymol. 46: 15-28. 11. Tawfik D. S., Green B. S., Ehrenberg Z. 1992. Detection of catalytic monoclonal antibodies. Anal.
et al. Results to be published. 6. Viger A., Coustal S., Marquet A. 1978. Synthèse des 4a, 4p-déuterio3p, 17p-dihydroxy androsta-5-ene. Tetrahedron 34: 3285-90. 7. Erlanger B. F., Borek F., Bliser S. M., Lieberman S. 1957. Steroid-protein conjugates. 1. Preparation and characterization of conjugates of bovine serum albumin with testosterone and with cortisone. J. Biol. Chem., 228: 713-27. 8. de tauzon S., Desfosses B., Moreau M. F., Le Trang N., Rajkowski K., Cittanova N. 1990. Comparison of monoclonal antibodies to estradiol obtained from structurally different immunogens. Hybridoma 9: 481-91. 9. Iverson B. L, Cameron K. E., Jahangiri G. K., Pasternak D. S. 1990. Selective cleavage of trityl protecting groups catalyzed by an antibody. J. Am. Chem. Soc. 112: 5320-3. 10. Wolfenden R. 1977. Transition state analogs as potential affinity labeling reagents. Meth. Enzymol. 46: 15-28. 11. Tawfik D. S., Green B. S., Ehrenberg Z. 1992. Detection of catalytic monoclonal antibodies. Anal. Biochem. 202: 35-9. 12. Benkovic S. J., Napper A. D., Lerner R. A. 1988. Catalysis of a stereospecific bimolecular amide synthesis by an antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5355-8. Amplification de la myoadenylate désaminase au cours de l'évolution. Une approche comparative JEAN-PAUL RAFFIN, MARIE-THÉRÈSE THÉBAULT CNRS-UPR 4601, Laboratoire de Physiologie Cellulaire, UFR Sciences et Techniques, BP 452, 29275 Brest Cedex, France. Collège de France, Laboratoire de Biologie Marine, BP 225, 29182 Concarneau Cedex, France. Tirés à part : J.-P. Raffin RÉSUMÉ L'activité de la myoadenylate désaminase a été déterminée, par une technique de mesure spécifique, sur un large éventail d'espèces animales incluant des invertébrés, un cyclostome, 13 chondrostéens, un téléostéen et un mammifère. Les résultats sont discutés en considérant les modifications génétiques ayant conduit à l'apparition de la forme enzymatique musculaire chez les vertébrés supérieurs. Il est proposé qu'au cours des duplications génétiques, qui sont intervenues au moment de l'apparition des vertébrés une modification génétique de l'AMP désaminase a eu lieu au moins dans deux branches : celle qui a évolué vers les poissons élamobranches rajiformes et celle qui a conduit aux vertébrés supérieurs. Mots clés : myoadenylate désaminase, évolution, forme musculaire, forme ancestrale. ABSTRACT Myoadenylate deaminase activity
de Physiologie Cellulaire, UFR Sciences et Techniques, BP 452, 29275 Brest Cedex, France. Collège de France, Laboratoire de Biologie Marine, BP 225, 29182 Concarneau Cedex, France. Tirés à part : J.-P. Raffin RÉSUMÉ L'activité de la myoadenylate désaminase a été déterminée, par une technique de mesure spécifique, sur un large éventail d'espèces animales incluant des invertébrés, un cyclostome, 13 chondrostéens, un téléostéen et un mammifère. Les résultats sont discutés en considérant les modifications génétiques ayant conduit à l'apparition de la forme enzymatique musculaire chez les vertébrés supérieurs. Il est proposé qu'au cours des duplications génétiques, qui sont intervenues au moment de l'apparition des vertébrés une modification génétique de l'AMP désaminase a eu lieu au moins dans deux branches : celle qui a évolué vers les poissons élamobranches rajiformes et celle qui a conduit aux vertébrés supérieurs. Mots clés : myoadenylate désaminase, évolution, forme musculaire, forme ancestrale. ABSTRACT Myoadenylate deaminase activity was measured, by using a spécifique assay technique, in a wide range of animal species, including four invertebrates, one cyclostome, 13 chondrosteans, one teleost and one mammal. The results are discussed considering the known genetic events that have led to the appearance of the higher vertebrates myoadenylate deaminase molecular form. It is proposed that, during the extensive gène duplication that occurred in the beginning of vertebrate évolution, genetic modification of the myoadenylate deaminase-molécule took place in at least two différent taxa : the one that evolved to rajiform elasmobranch fishes and the other to the land vertebrates. Key words : myoadenylate deaminase, évolution, muscular form, ancestral form. Voir Version abrégée (p. 389) ML MP deaminase (AMP aminohydrolase, EC 3.5.4.6), œuvre catalysant la réversible déamination de l'AMP en IMP est connue être très active dans le muscle squeletique rapide [1]. Chez les vertébrés supérieurs, cette enzyme a été montrée être l'origine de la production d'ammoniac pendant l'exercice d'intensité élevée [2, 3], mais espèces présentant une activité très faible de l'AMP désaminase ont un pattern différent de dégradation des adényles [4, 5]. L'évolution génétique de l'AMP désaminase comprend une importante augmentation de son activité dans le squelette muscle, modification de ses propriétés