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équilibre osmotique avec le milieu ambiant, ne le sera bientôt plus. Le contenu cellulaire sera plus concentré que le milieu ambiant. La cellule absorbera de l'eau, gonnera et il en résultera les graves dommages histologiques que l'on connaît éclatements, émission de boules sarcodiques, etc. Ces phénomènes sont précoces. Ils dépendent de l'activité cellulaire elle-même et, en fin de compte, se ramènent à une action fermentaire. Or, nous possédons un moyen de réduire au minimum ces actions diastasiques et leurs conséquences fâcheuses: c'est l'abaissement de température. Au voisinage de 0°, les actions diastasiques autolytiques sont nulles, donc les conséquences qui en dérivent. Pour empêcher les cellules du centre de la pièce de subir les graves altérations que l'on sait, il suffit d'abaisser la température du milieu. La théorie conseille donc, en même temps que de réduire l'épaisseur de la pièce, d'opérer à froid la fixation. Il nous est possible de donner un exemple qui montre l'importance du facteur température dans ces phénomènes, en particulier dans le gonflement cellulaire. Dans deux récipients contenant du liquide de Ringer (1) placés l'un à l'étuve à 37°, l'autre à la glacière à 4 ou 5°, immergeons les reins d'une Grenouille. ### CORRECTION ### Cette cloison, issue du mésoderme vésiculaire, donne implantation à l'épithélium qui, à ce stade, est remarquable par sa grande hauteur, par son étroitesse et par la saillie que forme le pôle apical de chacun des éléments de l'endoderme vitellin. Notons encore qu'aucune différence fondamentale de structure ne différencie les éléments sécréteurs de la vésicule, chez les embryons de Lapin du dixième au vingt-deuxième jour. Et sur chaque les grains de secrétion sont assez rares. Laboratoire des travaux pratiques d'histologie de la Faculté de Médecine de Paris. LA « FIXATION FROIDE » SES AVANTAGES EN TECHNIQUE HISTOLOGIQUE Par A. POLICARD Dans ses leçons sur les phénomènes de la vie communs aux animaux et aux végétaux, Cl. Bernard a créé l'expression et étudié l'état de vie cessée. La vie manifestée dépend de certaines conditions essentielles. Si l'une d'elles manque, la vie est suspendue ou même arrêtée. Parmi ces conditions, une des plus fondamentales est
issue du mésoderme vésiculaire, donne implantation à l'épithélium qui, à ce stade, est remarquable par sa grande hauteur, par son étroitesse et par la saillie que forme le pôle apical de chacun des éléments de l'endoderme vitellin. Notons encore qu'aucune différence fondamentale de structure ne différencie les éléments sécréteurs de la vésicule, chez les embryons de Lapin du dixième au vingt-deuxième jour. Et sur chaque les grains de secrétion sont assez rares. Laboratoire des travaux pratiques d'histologie de la Faculté de Médecine de Paris. LA « FIXATION FROIDE » SES AVANTAGES EN TECHNIQUE HISTOLOGIQUE Par A. POLICARD Dans ses leçons sur les phénomènes de la vie communs aux animaux et aux végétaux, Cl. Bernard a créé l'expression et étudié l'état de vie cessée. La vie manifestée dépend de certaines conditions essentielles. Si l'une d'elles manque, la vie est suspendue ou même arrêtée. Parmi ces conditions, une des plus fondamentales est la chaleur. Il suffit d'abaisser autour d'un être simple ou d'un tissu la température ambiante pour mettre cet être ou ce tissu en état de mort. Ces phénomènes, de connaissance élémentaire aujourd'hui, ont fait l'objet depuis longtemps d'applications pratiques. Citons par exemple leur utilisation en bactériologie pour la conservation des virus, en biologie générale pour la conservation des pièces destinées à la greffe; il suffit de rappeler les intéressantes applications du cold shock d'Alexis Carrel. Nous avons tenté l'application de ces données à la nation histologique. Incidemment, certains auteurs, et en particulier Borrel (1) (à propos de son liquide chromo-acéto-osmique), Bethe et les histologistes qui instituèrent des variantes de la méthode d'Ehrlich, avaient signalé que certaines opérations techniques donnaient de meilleurs résultats à froid qu'à la température ambiante. Nous apportons aujourd'hui une série de faits et de considérations qui démontrent l'intérêt d'opérer toujours la fixation à basse température et d'adopter la méthode générale de la fixation froide. BASES THÉORIQUES DE LA MÉTHODE Pour donner un exposé clair des bases théoriques de la méthode que nous proposons, nous allons envisager successivement et dans leur ordre chronologique les phénomènes qui se passent successivement dans les couches les plus périphériques de la pièce
virus, en biologie générale pour la conservation des pièces destinées à la greffe; il suffit de rappeler les intéressantes applications du cold shock d'Alexis Carrel. Nous avons tenté l'application de ces données à la nation histologique. Incidemment, certains auteurs, et en particulier Borrel (1) (à propos de son liquide chromo-acéto-osmique), Bethe et les histologistes qui instituèrent des variantes de la méthode d'Ehrlich, avaient signalé que certaines opérations techniques donnaient de meilleurs résultats à froid qu'à la température ambiante. Nous apportons aujourd'hui une série de faits et de considérations qui démontrent l'intérêt d'opérer toujours la fixation à basse température et d'adopter la méthode générale de la fixation froide. BASES THÉORIQUES DE LA MÉTHODE Pour donner un exposé clair des bases théoriques de la méthode que nous proposons, nous allons envisager successivement et dans leur ordre chronologique les phénomènes qui se passent successivement dans les couches les plus périphériques de la pièce parfaitement fraîche et au centre de celle-ci, après son immersion dans le réactif fixateur, que nous supposerons être ici un coagulateur salin, mélange bichromate ou osmique par exemple. Nous ne préjugerons quoi que ce soit de la nature intime de la fixation. A. Aussitôt après l'immersion, il se passe entre les couches périphériques de la pièce et le fixateur une sorte de conflit. En particulier, il se produit une contraction brusque non seulement des organes contractiles, mais même de tout protoplasma. C'est un fait que les zoologistes connaissent bien. Cette contraction brusque et intense peut être l'origine de ruptures, d'altérations de l'architecture cellulaire. Pour combattre cette contractilité, les zoologistes ont l'habitude d'anesthésier les animaux avec du chlorate, de la cocaïne, du chloroforme, de la nicotine ou de la fumée de tabac, etc. C'est là une pratique bien connue. Récemment, Rubenthaler (1) a eu l'idée d'expliquer et de combattre d'une façon analogue les altérations dues à la fixation des tissus des Vertébrés. Mais nous pensons que, dans ce dernier cas, cette contractilité nuisible est bien plus facilement annihilée par l'abaissement de la température ambiante que par les anesthésiques. C'est un fait bien connu en physiologie générale que le froid diminue ou
les couches périphériques de la pièce et le fixateur une sorte de conflit. En particulier, il se produit une contraction brusque non seulement des organes contractiles, mais même de tout protoplasma. C'est un fait que les zoologistes connaissent bien. Cette contraction brusque et intense peut être l'origine de ruptures, d'altérations de l'architecture cellulaire. Pour combattre cette contractilité, les zoologistes ont l'habitude d'anesthésier les animaux avec du chlorate, de la cocaïne, du chloroforme, de la nicotine ou de la fumée de tabac, etc. C'est là une pratique bien connue. Récemment, Rubenthaler (1) a eu l'idée d'expliquer et de combattre d'une façon analogue les altérations dues à la fixation des tissus des Vertébrés. Mais nous pensons que, dans ce dernier cas, cette contractilité nuisible est bien plus facilement annihilée par l'abaissement de la température ambiante que par les anesthésiques. C'est un fait bien connu en physiologie générale que le froid diminue ou supprime la contractilité du protoplasma. Vers 0°, la contraction brusque du protoplasma au contact du gazateur sera infiniment réduite, presque annihilée. C'est là un premier avantage de la fixation froide que de réduire au minimum les altérations techniques dues à la contraction brusque du protoplasma sous l'influence du réactif fixateur. B. Mais pendant que les couches périphériques de la pièce subissent l'action du fixateur, les éléments du centre n'ont pris aucun contact avec ce dernier. Séparées de l'organisme, en dehors de la circulation, les cellules du centre de la pièce vont subir l'autolyse, c'est-à-dire la digestion intracellulaire sous l'action désordonnée de fermentats dont le rôle est normalement réglé dans la cellule non livrée à elle-même. Cette autolyse, variable avec les cellules, a une double action au point de vue spécial qui nous intéresse a) Par digestion d'organes, d'inclusions, etc., préexistants dans la cellule, par dépôt de substances nouvelles (corps myéliniques) résultant du processus lui-même, etc., cette autolyse modifie considérablement l'aspect de la cellule. b) Mais les troubles les plus importants relèvent aussi d'un tout autre mécanisme. L'autolyse, processus digestif de la substance moléculaire, a pour effet de transformer les grosses molécules protoplasmiques en molécules plus petites, mais plus nombreuses. La
B. Mais pendant que les couches périphériques de la pièce subissent l'action du fixateur, les éléments du centre n'ont pris aucun contact avec ce dernier. Séparées de l'organisme, en dehors de la circulation, les cellules du centre de la pièce vont subir l'autolyse, c'est-à-dire la digestion intracellulaire sous l'action désordonnée de fermentats dont le rôle est normalement réglé dans la cellule non livrée à elle-même. Cette autolyse, variable avec les cellules, a une double action au point de vue spécial qui nous intéresse a) Par digestion d'organes, d'inclusions, etc., préexistants dans la cellule, par dépôt de substances nouvelles (corps myéliniques) résultant du processus lui-même, etc., cette autolyse modifie considérablement l'aspect de la cellule. b) Mais les troubles les plus importants relèvent aussi d'un tout autre mécanisme. L'autolyse, processus digestif de la substance moléculaire, a pour effet de transformer les grosses molécules protoplasmiques en molécules plus petites, mais plus nombreuses. La pression osmotique dépendant du nombre des molécules, le contenu cellulaire va augmenter de tension osmotique. Ce fait va avoir des conséquences importantes. La cellule, à l'origine, en équilibre osmotique avec le milieu ambiant, ne le sera bientôt plus. Le contenu cellulaire sera plus concentré que le milieu ambiant. La cellule absorbera de l'eau, gonnera et il en résultera les graves dommages histologiques que l'on connaît éclatements, émission de boules sarcodiques, etc. Ces phénomènes sont précoces. Ils dépendent de l'activité cellulaire elle-même et, en fin de compte, se ramènent à une action fermentaire. Or, nous possédons un moyen de réduire au minimum ces actions diastasiques et leurs conséquences fâcheuses: c'est l'abaissement de température. Au voisinage de 0°, les actions diastasiques autolytiques sont nulles, donc les conséquences qui en dérivent. Pour empêcher les cellules du centre de la pièce de subir les graves altérations que l'on sait, il suffit d'abaisser la température du milieu. La théorie conseille donc, en même temps que de réduire l'épaisseur de la pièce, d'opérer à froid la fixation. Il nous est possible de donner un exemple qui montre l'importance du facteur température dans ces phénomènes, en particulier dans le gonflement cellulaire. Dans deux récipients contenant du liquide
absorbera de l'eau, gonnera et il en résultera les graves dommages histologiques que l'on connaît éclatements, émission de boules sarcodiques, etc. Ces phénomènes sont précoces. Ils dépendent de l'activité cellulaire elle-même et, en fin de compte, se ramènent à une action fermentaire. Or, nous possédons un moyen de réduire au minimum ces actions diastasiques et leurs conséquences fâcheuses: c'est l'abaissement de température. Au voisinage de 0°, les actions diastasiques autolytiques sont nulles, donc les conséquences qui en dérivent. Pour empêcher les cellules du centre de la pièce de subir les graves altérations que l'on sait, il suffit d'abaisser la température du milieu. La théorie conseille donc, en même temps que de réduire l'épaisseur de la pièce, d'opérer à froid la fixation. Il nous est possible de donner un exemple qui montre l'importance du facteur température dans ces phénomènes, en particulier dans le gonflement cellulaire. Dans deux récipients contenant du liquide de Ringer (1) placés l'un à l'étuve à 37°, l'autre à la glacière à 4 ou 5°, immergeons les reins d'une Grenouille. ### CORRECTION ### Cette cloison, issue du mésoderme vésiculaire, donne implantation à l'épithélium qui, à ce stade, est remarquable par sa grande hauteur, par son étroitesse et par la saillie que forme le pôle apical de chacun des éléments de l'endoderme vitellin. Notons encore qu'aucune différence fondamentale de structure ne différencie les éléments sécréteurs de la vésicule, chez les embryons de Lapin du dixième au vingt-deuxième jour. Et sur chaque les grains de secrétion sont assez rares. Laboratoire des travaux pratiques d'histologie de la Faculté de Médecine de Paris. LA « FIXATION FROIDE » SES AVANTAGES EN TECHNIQUE HISTOLOGIQUE Par A. POLICARD Dans ses leçons sur les phénomènes de la vie communs aux animaux et aux végétaux, Cl. Bernard a créé l'expression et étudié l'état de vie cessée. La vie manifestée dépend de certaines conditions essentielles. Si l'une d'elles manque, la vie est suspendue ou même arrêtée. Parmi ces conditions, une des plus fondamentales est la chaleur. Il suffit d'abaisser autour d'un être simple ou d'un tissu la température ambiante pour mettre cet être ou ce tissu en
la saillie que forme le pôle apical de chacun des éléments de l'endoderme vitellin. Notons encore qu'aucune différence fondamentale de structure ne différencie les éléments sécréteurs de la vésicule, chez les embryons de Lapin du dixième au vingt-deuxième jour. Et sur chaque les grains de secrétion sont assez rares. Laboratoire des travaux pratiques d'histologie de la Faculté de Médecine de Paris. LA « FIXATION FROIDE » SES AVANTAGES EN TECHNIQUE HISTOLOGIQUE Par A. POLICARD Dans ses leçons sur les phénomènes de la vie communs aux animaux et aux végétaux, Cl. Bernard a créé l'expression et étudié l'état de vie cessée. La vie manifestée dépend de certaines conditions essentielles. Si l'une d'elles manque, la vie est suspendue ou même arrêtée. Parmi ces conditions, une des plus fondamentales est la chaleur. Il suffit d'abaisser autour d'un être simple ou d'un tissu la température ambiante pour mettre cet être ou ce tissu en état de mort. Ces phénomènes, de connaissance élémentaire aujourd'hui, ont fait l'objet depuis longtemps d'applications pratiques. Citons par exemple leur utilisation en bactériologie pour la conservation des viruses, en biologie générale pour la conservation des pièces destin Ces reins, détachés sans lésions, soigneusement asséchés à la feuille de soie, ont été préalablement pesés très exactement, au demimilligramme, à la grande balance de Nemetz. À des intervalles variables, ces reins sont retirés du liquide de Ringer, asséchés et pesés. L'augmentation de poids observée nous donnera une mesure de l'eau absorbée, et indirectement nous permettra d'apprécier la grandeur du gonflement et des lésions que celui-ci produit. Voici les résultats obtenus TABLEAU Composition du liquide de Ringer employé Chlorure de sodium. 6 gr. Chlorure de potassium. 0,1 Chlorure de calcium. 0,1 Bicarbonate de soude. 0,1 Eau 1000 À partir du point de vue cryoscopique, cette solution donne environ A = 0.5. (2) Technique exactement calquée sur celle d'Overton, Lœb, etc., dans leurs travaux sur les propriétés osmotiques du muscle. Rein de Grenouille dans du liquide de Ringer. À LA GLACIERE À L'ÉTUVE POIDS POIDS AUGMENTATION POIDS A LA FIXATION Initia. 0,086 0,036 – Après immersion dans le liquide. 0,053 0.039 -28 Après treize
été préalablement pesés très exactement, au demimilligramme, à la grande balance de Nemetz. À des intervalles variables, ces reins sont retirés du liquide de Ringer, asséchés et pesés. L'augmentation de poids observée nous donnera une mesure de l'eau absorbée, et indirectement nous permettra d'apprécier la grandeur du gonflement et des lésions que celui-ci produit. Voici les résultats obtenus TABLEAU Composition du liquide de Ringer employé Chlorure de sodium. 6 gr. Chlorure de potassium. 0,1 Chlorure de calcium. 0,1 Bicarbonate de soude. 0,1 Eau 1000 À partir du point de vue cryoscopique, cette solution donne environ A = 0.5. (2) Technique exactement calquée sur celle d'Overton, Lœb, etc., dans leurs travaux sur les propriétés osmotiques du muscle. Rein de Grenouille dans du liquide de Ringer. À LA GLACIERE À L'ÉTUVE POIDS POIDS AUGMENTATION POIDS A LA FIXATION Initia. 0,086 0,036 – Après immersion dans le liquide. 0,053 0.039 -28 Après treize minutes. 0,053 1 0,051 -41 Après six heures 0,086 –1 0,088 +2 Après huit heures trente 0,055 – 1 0,092 +37 Après sept heures trente 0,065 – 1 0,076 -11 Traduit en courbe, ce tableau nous donne le graphique suivant TT~ ~A~0' 1 ~/7~~ &lt;~ ~~i?M2. a~cif &lt;&amp; ix~ 7~/Mët Une expérience analogue avec de la substance corticale de rein de Chien nous donnera des résultats semblables. Fragment de substance corticale de rein de Chien normal. Plongé dans HCl à r «/o. À LA GLACIERE (+ 6°) À L'ÉTUVE (+ 380) POIDS À LA GLACE (+ .) À (+) POIDS À LA FIXATION POIDS AUGMENTATION Initial 0,127 – 0,1't.3 – Après treize minutes 0,133 +1 0,196 +8 Après une heure. 0,131 +5 0,172 -)-19 Après treize minutes trente 0,134 -(-5 5 0,176 -j-20 Il résulte des considérations ci-dessus et des faits expérimentaux qui les appuient qu'il y a un grand avantage à opérer à froid l'opération de la fixation. Cette pratique a cependant un inconvénient que nous devons étudier théoriquement et apprécier quantitativement. La diffusion du fixateur dans la pièce joue un rôle non négligeable dans la réalisation d'une bonne fixation. Le fixateur doit pénétrer vite. Or, la vitesse de
Une expérience analogue avec de la substance corticale de rein de Chien nous donnera des résultats semblables. Fragment de substance corticale de rein de Chien normal. Plongé dans HCl à r «/o. À LA GLACIERE (+ 6°) À L'ÉTUVE (+ 380) POIDS À LA GLACE (+ .) À (+) POIDS À LA FIXATION POIDS AUGMENTATION Initial 0,127 – 0,1't.3 – Après treize minutes 0,133 +1 0,196 +8 Après une heure. 0,131 +5 0,172 -)-19 Après treize minutes trente 0,134 -(-5 5 0,176 -j-20 Il résulte des considérations ci-dessus et des faits expérimentaux qui les appuient qu'il y a un grand avantage à opérer à froid l'opération de la fixation. Cette pratique a cependant un inconvénient que nous devons étudier théoriquement et apprécier quantitativement. La diffusion du fixateur dans la pièce joue un rôle non négligeable dans la réalisation d'une bonne fixation. Le fixateur doit pénétrer vite. Or, la vitesse de diffusion, mesurée par le coefficient de diffusion, varie avec la température. Dans les conditions simples d'un corps diffusant dans un liquide, l'augmentation du coefficient de diffusion est de 2 par degré (d'après V. Henri, Chimie Physique, p. 163). Mais dans le cas de la fixation histologique, les conditions sont beaucoup plus complexes il s'agit de la diffusion d'un corps dans un complexe collagène de très grande viscosité qui se modifie au contact du corps diffusant (condensation). Mais la pratique nous a montré que la diminution de la pénétration d'un fixateur du fait de l'abaissement de la température était presque négative; en tout cas elle représente un inconvénient faible à côté de l'avantage que cet abaissement de température offre d'autre part. BASES PRATIQUES DE LA MÉTHODE La fixation opérée comparativement à la glacière, à la température ambiante et à l'étuve à 31°-38°, toutes autres conditions étant égales d'ailleurs, nous a montré que les pièces fixées à froid étaient toujours le mieux fixées. En particulier, le centre des pièces était toujours correctement fixé dans ce cas au contraire, dans les pièces laisses à la température du laboratoire (16° à 19°) et surtout à l'étuve, la fixation au centre de pièces un peu
plus complexes il s'agit de la diffusion d'un corps dans un complexe collagène de très grande viscosité qui se modifie au contact du corps diffusant (condensation). Mais la pratique nous a montré que la diminution de la pénétration d'un fixateur du fait de l'abaissement de la température était presque négative; en tout cas elle représente un inconvénient faible à côté de l'avantage que cet abaissement de température offre d'autre part. BASES PRATIQUES DE LA MÉTHODE La fixation opérée comparativement à la glacière, à la température ambiante et à l'étuve à 31°-38°, toutes autres conditions étant égales d'ailleurs, nous a montré que les pièces fixées à froid étaient toujours le mieux fixées. En particulier, le centre des pièces était toujours correctement fixé dans ce cas au contraire, dans les pièces laisses à la température du laboratoire (16° à 19°) et surtout à l'étuve, la fixation au centre de pièces un peu volumineuses était toujours très mauvaise (avec le liquide de Fiesching, le bichromate formol, le bichromate acétique). Un des avantages pratiques de cette méthode est d'obtenir des colorations excellentes de pièces un peu volumineuses. Il y a lieu de faire ici une remarque. Quand on compare la fixation de pièces fixées, toutes conditions semblables d'autre part, à l'étuve (37°-38°) et à la température ordinaire (16°-18°), on ne constate entre les deux pièces que peu de différences, malgré la diversité des températures. Au contraire, entre la pièce fixée à la température du laboratoire et celle laissée à la glacière à -16°, il y a des différences très nettes, et cependant, dans ce cas, il y a en valeur absolue une moindre différence de température que dans le premier cas (10° à 13° dans le second cas, 22° à 25° dans le premier cas). En réalité, ce pseudo-paradoxe est très facile à expliquer. La courbe qui exprime graphiquement l'intensité des phénomènes vitaux en fonction de la température n'est pas une droite. La variation n'est pas régulièrement proportionnelle. À mesure que s'élève la température, on observe la marche suivante de la courbe elle s'élève d'abord très vite, puis s'incline peu à peu et met