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Cellulaire et Moléculaire, URA 1180, Université Pierre-et-Marie-Curie, 4, place Jussieu, 75252 Paris Cedex 05, France. Tirés à part : P. Mazliak RÉSUMÉ Les phospho-inositides présents dans les coléoptiles et premières feuilles de germinations de maïs ont été marqués à partir d'inositolC ou d'acétateC. Pour des incubations allant de 1 à 24 h, plus de 90 % de la radioactivité se retrouvent dans le phosphatidylinositol (PI) 5 à 7 % dans le phosphatidylinositolmonophosphate (PIp) et 1 % dans le phosphatidylinositolbiphosphate (PIp2) ; les espèces moléculaires de PI et Plp ont pu être séparées et analysées par radio-HPLC combinée à la chromatographie en phase gazeuse des acides gras. La même espèce moléculaire (16:0/18:2) est dominante (à 60 mol % ou plus) dans PI et PIp. Cinq autres espèces minoritaires sont présentes dans les deux phospho-inositides. Ces résultats suggèrent que la Pl-kinase n'exerce aucune sélectivité pour faire entrer les diverses espèces moléculaires de PI dans le cycle cellulaire de réception des signaux donnant les messagers secondaires à inositol. Mots clés : phospho-inositides, espèces moléculaires. The inositol phospholipids present in the coléoptiles and first leaves of maize have been labeled from C-inositol or C-acetate. For incubation periods between 1 and 24 h, more than 90 % of total radioactivity was recovered in phosphatidylinositol (PI), 5 to 7 % in phosphatidylinositol monophosphate (PIp) and about 1 % in phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIp2). The molecular species of PI and PIp have been separated and analyzed by radio-HPLC combined with gas chromatography of fatty acids. The same molecular species (16:0/18:2) was predominant (forming at least 60 mol %) in PI and PIp. Five other molecular species, less abundant, were present in both inositol phospholipids. These observations suggest that Pl-kinase has no clear selectivity with respect to various molecular species of PI when initiating the inositol-lipid signaling pathway through production of the second messengers inositol 1,4,5-triphosphate and 1,2-diacylglycerol. Key words : inositol phospholipids, molecular species. See Abstract version (p. 423) Note présentée par Michel Thellier. Note remise le 31 janvier 1994, acceptée après révision le 9 mars 1994. 419 A. Chichara et al. Le système de transduction des signaux,
90 % of total radioactivity was recovered in phosphatidylinositol (PI), 5 to 7 % in phosphatidylinositol monophosphate (PIp) and about 1 % in phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIp2). The molecular species of PI and PIp have been separated and analyzed by radio-HPLC combined with gas chromatography of fatty acids. The same molecular species (16:0/18:2) was predominant (forming at least 60 mol %) in PI and PIp. Five other molecular species, less abundant, were present in both inositol phospholipids. These observations suggest that Pl-kinase has no clear selectivity with respect to various molecular species of PI when initiating the inositol-lipid signaling pathway through production of the second messengers inositol 1,4,5-triphosphate and 1,2-diacylglycerol. Key words : inositol phospholipids, molecular species. See Abstract version (p. 423) Note présentée par Michel Thellier. Note remise le 31 janvier 1994, acceptée après révision le 9 mars 1994. 419 A. Chichara et al. Le système de transduction des signaux, au niveau du plasmalemme, impliquant des messagers secondaires tels que dérivés du phosphatidylinositol (PI), a été mis en évidence dans plusieurs tissus animaux [1, 2]. Dans ces cellules animales, après réception du signal, le récepteur du plasmalemme active une protéine-G qui diffuse dans la membrane et active à son tour une phospholipase C qui hydrolyse le phosphatidylinositol-biphosphate (PIp2) en diacylglycerol (DAG) et inositol-triphosphate (IP3). Le DAG est un messager activant une ou plusieurs protéines kinases ; IP3 est un autre messager secondaire qui provoque la libération de calcium au niveau du réticulum endoplasmique. Pour que ces processus soient possibles, il faut que le PI du plasmalemme soit successivement phosphorylé (par des kinases utilisant l'ATP) en phosphatidylinositolmonophosphate (PIp), puis en PIp2. La plupart des intermédiaires du cycle de transduction des signaux impliquant les polyphospho-inositides ont aussi été mis en évidence dans les tissus végétaux [3-5]. Cependant ces intermédiaires n'existent qu'en très faibles quantités et la participation effective des phospho-inositides (ou de leurs dérivés) dans les mécanismes de réception des signaux délivrés par l'environnement continue à poser problème chez les plantes : une dégradation des phosphoinositides a été observée, par exemple, dans des cellules de Catharanthus roseus traitées par l'auxine [6], dans
une phospholipase C qui hydrolyse le phosphatidylinositol-biphosphate (PIp2) en diacylglycerol (DAG) et inositol-triphosphate (IP3). Le DAG est un messager activant une ou plusieurs protéines kinases ; IP3 est un autre messager secondaire qui provoque la libération de calcium au niveau du réticulum endoplasmique. Pour que ces processus soient possibles, il faut que le PI du plasmalemme soit successivement phosphorylé (par des kinases utilisant l'ATP) en phosphatidylinositolmonophosphate (PIp), puis en PIp2. La plupart des intermédiaires du cycle de transduction des signaux impliquant les polyphospho-inositides ont aussi été mis en évidence dans les tissus végétaux [3-5]. Cependant ces intermédiaires n'existent qu'en très faibles quantités et la participation effective des phospho-inositides (ou de leurs dérivés) dans les mécanismes de réception des signaux délivrés par l'environnement continue à poser problème chez les plantes : une dégradation des phosphoinositides a été observée, par exemple, dans des cellules de Catharanthus roseus traitées par l'auxine [6], dans les pulvini des feuilles de Sensitive stimulées par contact [7] ou après choc osmotique de l'algue Dunaliella salina [8] ou de cellules de carotte en culture in vitro [5]. Les temps de réponse aux stimuli se sont révélés extrêmement variables (de quelques secondes à plusieurs heures dans ces exemples) et la participation directe des phospho-inositides au mécanisme de réception du signal peut toujours être mise en question. D'autres problèmes sont posés par le métabolisme des phospho-inositides dans les cellules végétales. Nous avons montré, dans un travail récent [9], que le site principal (et peut-être exclusif) de biosynthèse du PI par la Pl-synthase est le réticulum endoplasmique. Le problème du transport du PI du réticulum vers le plasmalemme est donc posé : ce transport exige-t-il la participation des protéines de transfert des phospholipides [10] ou bien un flux de vésicules membranaires [11], allant du réticulum à l'appareil de Golgi, puis au plasmalemme? Par ailleurs, les deux kinases (Pl-kinase et PIp-kinase) qui existent dans le plasmalemme [12] et qui transforment le PI en PIp puis en PIp2 (substrat de la phospholipase C spécifique du PI) utilisent-elles comme substrats toutes les espèces moléculaires de PI présentes dans les cellules ou bien n'en retiennent-elles
la participation directe des phospho-inositides au mécanisme de réception du signal peut toujours être mise en question. D'autres problèmes sont posés par le métabolisme des phospho-inositides dans les cellules végétales. Nous avons montré, dans un travail récent [9], que le site principal (et peut-être exclusif) de biosynthèse du PI par la Pl-synthase est le réticulum endoplasmique. Le problème du transport du PI du réticulum vers le plasmalemme est donc posé : ce transport exige-t-il la participation des protéines de transfert des phospholipides [10] ou bien un flux de vésicules membranaires [11], allant du réticulum à l'appareil de Golgi, puis au plasmalemme? Par ailleurs, les deux kinases (Pl-kinase et PIp-kinase) qui existent dans le plasmalemme [12] et qui transforment le PI en PIp puis en PIp2 (substrat de la phospholipase C spécifique du PI) utilisent-elles comme substrats toutes les espèces moléculaires de PI présentes dans les cellules ou bien n'en retiennent-elles que certaines pour faire fonctionner le « cycle des polyphospho-inositides » ? Pour répondre à cette dernière question, nous avons comparé les espèces moléculaires de PI trouvées dans le coléoptile contenant les premières feuilles de germination de maïs avec les espèces moléculaires de PIp trouvées dans les mêmes tissus. Matériel et méthodes Préparation des germinations Des graines de maïs (Zea mays L. cv Mona), fournies par France-Maïs (Toulouse, France), ont été mises à germer à 30 °C, dans de la vermiculite humide, à l'obscurité. Les germinations sont récoltées après 4 jours et les coléoptiles (ainsi que les premières feuilles qu'ils contiennent) sont sectionnés. Marquage des polyphospho-inositides Pour étudier les phospho-inositides présents dans les tissus en très faibles quantités, nous avons marqué les lipides en incubant les tissus soit avec de l'inositol-14C (11,2 GBq/mMole, Amersham, Angleterre), soit avec de l'acétate-14C (2,07 GBq/mMole, Amersham, Angleterre). Nous avons mis en incubation 250 mg de coléoptiles (contenant les jeunes feuilles) découpés en fragments de 5 mm de long dans 0,5 ml d'une solution de précurseur radioactif (inositol-14C, 1,6 x 106 dpm ; acétate-14C, 220 x 106 dpm), pendant 1 à 24 h, à 30 °C et à l'obscurité. À la fin de l'incubation, les
et méthodes Préparation des germinations Des graines de maïs (Zea mays L. cv Mona), fournies par France-Maïs (Toulouse, France), ont été mises à germer à 30 °C, dans de la vermiculite humide, à l'obscurité. Les germinations sont récoltées après 4 jours et les coléoptiles (ainsi que les premières feuilles qu'ils contiennent) sont sectionnés. Marquage des polyphospho-inositides Pour étudier les phospho-inositides présents dans les tissus en très faibles quantités, nous avons marqué les lipides en incubant les tissus soit avec de l'inositol-14C (11,2 GBq/mMole, Amersham, Angleterre), soit avec de l'acétate-14C (2,07 GBq/mMole, Amersham, Angleterre). Nous avons mis en incubation 250 mg de coléoptiles (contenant les jeunes feuilles) découpés en fragments de 5 mm de long dans 0,5 ml d'une solution de précurseur radioactif (inositol-14C, 1,6 x 106 dpm ; acétate-14C, 220 x 106 dpm), pendant 1 à 24 h, à 30 °C et à l'obscurité. À la fin de l'incubation, les tissus sont rinçés et les lipides extraits. Extraction des lipides Cette extraction est réalisée par le mélange acide chloroforme-méthanol-HCl 1N (1/1/1 en volumes) selon la méthode de Sandelius et Sommarin [12]. Séparation des phospho-inositides Cette séparation est réalisée par chromatographie sur une couche mince de silice imprégnée par une solution à 1 % d'oxalate de potassium [12]. Les spots de PI, PIp et PIp2 révélés à la primuline sont élués pendant 16 h dans un mélange méthanol-acide acétique (1 goutte d'acide acétique pur dans 5 ml de méthanol). Après une nouvelle extraction acide, les lipides sont finalement repris dans 0,5 ml de méthanol. La radioactivité des extraits est déterminée par scintillation liquide. Des autoradiographies des couches minces sont aussi réalisées en utilisant des films Amersham Bmax, après une semaine d'exposition. Séparation des espèces moléculaires de PI Elle est réalisée en combinant la chromatographie HPLC et la chromatographie en phase gazeuse comme décrit précédemment [13]. La détection de la radioactivité des espèces moléculaires marquées par le 14C est réalisée par un compteur à flux continu (Flow-one 1C, Radiomatic Instruments) placé à la sortie de la colonne HPLC [13]. Séparation des espèces moléculaires de PIp Le PIp est hydrolysé par la phosphatase
à 1 % d'oxalate de potassium [12]. Les spots de PI, PIp et PIp2 révélés à la primuline sont élués pendant 16 h dans un mélange méthanol-acide acétique (1 goutte d'acide acétique pur dans 5 ml de méthanol). Après une nouvelle extraction acide, les lipides sont finalement repris dans 0,5 ml de méthanol. La radioactivité des extraits est déterminée par scintillation liquide. Des autoradiographies des couches minces sont aussi réalisées en utilisant des films Amersham Bmax, après une semaine d'exposition. Séparation des espèces moléculaires de PI Elle est réalisée en combinant la chromatographie HPLC et la chromatographie en phase gazeuse comme décrit précédemment [13]. La détection de la radioactivité des espèces moléculaires marquées par le 14C est réalisée par un compteur à flux continu (Flow-one 1C, Radiomatic Instruments) placé à la sortie de la colonne HPLC [13]. Séparation des espèces moléculaires de PIp Le PIp est hydrolysé par la phosphatase acide pour transformer ce composé en PI. L'extrait de PIp, évaporé à sec, est dissous dans 0,5 ml de tampon citrate 100 mM pH 5,8 puis on ajoute 10 units de solution de phosphatase acide (60 unités/ml) (Boehringer, Allemagne). L'incubation dure 30 min à 30 °C. Les lipides sont ensuite extraits comme précédemment (avec HCl 2N), puis séparés sur plaque de silice imprégnée d'oxalate de potassium [12]. Le rendement de l'hydrolyse du PIp par la phosphatase est de l'ordre de 50 %. Le PI récupéré est analysé par HPLC [13]. Résultats Pour étudier les polyphospho-inositides présents à l'état de traces dans les tissus végétaux, nous avons décidé de marquer ces substances par le 14C. En utilisant l'inositol-14C comme précurseur, nous nous assurons que les seuls lipides marqués sont des phospho-inositides : le marquage du PI, du PIp et du Plp2 de fragments de germinations de maïs a été suivi au cours d'incubations variant de 1 à 24 h. Dans ces expériences, la plus grande partie de la radioactivité se retrouve dans trois composés principaux : PI, PIp et Plp2 (Fig. I). Sous chaque spot, un très faible marquage apparaît dans des constituants présents à l'état de traces, correspondant vraisemblablement d'après
extraits comme précédemment (avec HCl 2N), puis séparés sur plaque de silice imprégnée d'oxalate de potassium [12]. Le rendement de l'hydrolyse du PIp par la phosphatase est de l'ordre de 50 %. Le PI récupéré est analysé par HPLC [13]. Résultats Pour étudier les polyphospho-inositides présents à l'état de traces dans les tissus végétaux, nous avons décidé de marquer ces substances par le 14C. En utilisant l'inositol-14C comme précurseur, nous nous assurons que les seuls lipides marqués sont des phospho-inositides : le marquage du PI, du PIp et du Plp2 de fragments de germinations de maïs a été suivi au cours d'incubations variant de 1 à 24 h. Dans ces expériences, la plus grande partie de la radioactivité se retrouve dans trois composés principaux : PI, PIp et Plp2 (Fig. I). Sous chaque spot, un très faible marquage apparaît dans des constituants présents à l'état de traces, correspondant vraisemblablement d'après leur Rf [14] aux composés lyso-PI, lyso-Plp et lyso-Plp2. La Figure 2 montre que la plus grande partie de la radioactivité des lipides totaux se retrouve dans le PI dès 1 h d'incubation, le PIp ne renferme que 7 % de la radioactivité totale après 24 h d'incubation (Tableau I). Le marquage du Plp2 reste constamment très faible dans nos conditions d'incubation. L'emploi de l'acétate-14C comme précurseur donne des résultats très semblables (Tableau I) et aboutit, en outre, à marquer au 14C les acides gras des phospho-inositides; cela nous permettra ultérieurement d'étudier, par radiochromatographie en phase gazeuse, les différents acides gras présents dans les espèces moléculaires, ce qui est impossible après un marquage à l'inositol-14C. Des résultats de marquage similaires aux précédents ont aussi été obtenus avec des membranes de blé incubées avec de l'ATP Py-32P [12]. Figure 1. Incorporation du 14C-inositol dans les germinations de maïs (autoradiographie). Marquage des phospho-inositides par le 14C. Conditions d'incubation comme décrit dans Matériel et méthodes. Temps d'incubation, de gauche à droite : 1, 2 et 3 h. Pour étudier les espèces moléculaires de PIp et les comparer à celles du PI présentes dans les tissus de maïs, nous avons fait 20 incubations de
Le marquage du Plp2 reste constamment très faible dans nos conditions d'incubation. L'emploi de l'acétate-14C comme précurseur donne des résultats très semblables (Tableau I) et aboutit, en outre, à marquer au 14C les acides gras des phospho-inositides; cela nous permettra ultérieurement d'étudier, par radiochromatographie en phase gazeuse, les différents acides gras présents dans les espèces moléculaires, ce qui est impossible après un marquage à l'inositol-14C. Des résultats de marquage similaires aux précédents ont aussi été obtenus avec des membranes de blé incubées avec de l'ATP Py-32P [12]. Figure 1. Incorporation du 14C-inositol dans les germinations de maïs (autoradiographie). Marquage des phospho-inositides par le 14C. Conditions d'incubation comme décrit dans Matériel et méthodes. Temps d'incubation, de gauche à droite : 1, 2 et 3 h. Pour étudier les espèces moléculaires de PIp et les comparer à celles du PI présentes dans les tissus de maïs, nous avons fait 20 incubations de tissus dans une solution d'acétate-1-14C, pendant 24 h. Les extraits lipidiques des 20 incubations ont été regroupés et les phosphoinositides des extraits marqués au 14C ont été séparés par chromatographie sur couche mince, puis récupérés par élution de la silice. PIp et Plp2 ont été soumis à l'action d'une phosphatase acide (comme indiqué dans Matériel et méthodes) de façon à transformer ces substances en PI. Le rendement d'hydrolyse par la phosphatase est d'environ 50 % et seul le PIp contenait suffisamment de radioactivité pour fournir du PI marqué en quantité suffisante pour les études ultérieures. Les espèces moléculaires de PI et celles du PI dérivé de PIp ont été ensuite séparées par radiochromatographie-HPLC. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 3 et le Tableau II. On constate que, pour le PI, la distribution des espèces moléculaires en masse ou en radioactivité (après marquage à l'inositol-14C) est très semblable. L'espèce prédominante est le 16:0/18:2-PI formant 75 % de la masse totale du PI; viennent ensuite 5 espèces moléculaires représentant chacune 3 à 7 % de la masse du PI : 16:0/18:1, 16:0/18:3, 18:0/18:2, 18:1/18:2 et 18:2/18:2-PI. Après marquage à l'acétate-14C (Tableau II), la distribution de la radioactivité entre les espèces
acide (comme indiqué dans Matériel et méthodes) de façon à transformer ces substances en PI. Le rendement d'hydrolyse par la phosphatase est d'environ 50 % et seul le PIp contenait suffisamment de radioactivité pour fournir du PI marqué en quantité suffisante pour les études ultérieures. Les espèces moléculaires de PI et celles du PI dérivé de PIp ont été ensuite séparées par radiochromatographie-HPLC. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 3 et le Tableau II. On constate que, pour le PI, la distribution des espèces moléculaires en masse ou en radioactivité (après marquage à l'inositol-14C) est très semblable. L'espèce prédominante est le 16:0/18:2-PI formant 75 % de la masse totale du PI; viennent ensuite 5 espèces moléculaires représentant chacune 3 à 7 % de la masse du PI : 16:0/18:1, 16:0/18:3, 18:0/18:2, 18:1/18:2 et 18:2/18:2-PI. Après marquage à l'acétate-14C (Tableau II), la distribution de la radioactivité entre les espèces moléculaires du PI diffère légèrement de celle observée précédemment. L'espèce moléculaire majoritaire, 16:0/18:2-PI, ne renferme plus maintenant que 60 % de la radioactivité totale (contre 75 % précédemment) et 2 espèces moléculaires (16:0/18:3-PI et 18:0/18:2-PI) renferment chacune 10% de la radioactivité totale. Après marquage, pendant 24 h, à l’acétate-14C, on retrouve une distribution très semblable de la radioactivité entre les espèces moléculaires du PIp (Tableau II). Pour ce lipide aussi, l’espèce moléculaire prédominante (contenant 60 % de la radioactivité totale) est le 16:0/18:2-PIp. Le reste de la radioactivité du PIp se partage entre les autres espèces moléculaires, également présentes dans le PI. La trop faible radioactivité totale du PIp nous a forcés à grouper ensemble 16:0/18:3 et 18:2/18:2-PIp, d’une part, 18:0/18:2 et 16:0/18:1-PIp, d’autre part. Discussion et conclusions Les intermédiaires du cycle des polyphospho-inositides ne sont présents dans les tissus végétaux qu’à l’état de traces. Il faut donc marquer ces lipides par des atomes radioactifs pour les détecter et les analyser. C’est ce que nous avons fait avec l’inositol-14C ou l’acétate-14C, ce qui nous a permis de mettre en évidence la présence de PIp et Plp2 dans les germinations de maïs. Nous avons constaté que PIp se marquait beaucoup moins
retrouve une distribution très semblable de la radioactivité entre les espèces moléculaires du PIp (Tableau II). Pour ce lipide aussi, l’espèce moléculaire prédominante (contenant 60 % de la radioactivité totale) est le 16:0/18:2-PIp. Le reste de la radioactivité du PIp se partage entre les autres espèces moléculaires, également présentes dans le PI. La trop faible radioactivité totale du PIp nous a forcés à grouper ensemble 16:0/18:3 et 18:2/18:2-PIp, d’une part, 18:0/18:2 et 16:0/18:1-PIp, d’autre part. Discussion et conclusions Les intermédiaires du cycle des polyphospho-inositides ne sont présents dans les tissus végétaux qu’à l’état de traces. Il faut donc marquer ces lipides par des atomes radioactifs pour les détecter et les analyser. C’est ce que nous avons fait avec l’inositol-14C ou l’acétate-14C, ce qui nous a permis de mettre en évidence la présence de PIp et Plp2 dans les germinations de maïs. Nous avons constaté que PIp se marquait beaucoup moins que PI et que Plp2 ne renfermait qu’une très faible radioactivité, même après 24 h de marquage. Nous avons pu comparer les compositions en espèces moléculaires de PI et de PIp; dans les deux composés, la même espèce moléculaire (16:0/18:2) est largement prédominante et 5 espèces moléculaires secondaires se retrouvent à la fois dans PI et PIp. C’est la première fois, à notre connaissance, que les espèces moléculaires du PIp sont analysées (dans un tissu animal ou végétal). Les compositions semblables, en espèces moléculaires, de PI et de PIp nous invitent à conclure que la Pl-kinase qui transforme PI en PIp n’est pas sélective vis-à-vis des espèces moléculaires de PI et que, donc, toutes ces espèces pourraient participer au cycle des polyphospho-inositides. Il faut cependant faire une réserve : pour marquer de façon significative le PIp, nous avons dû faire des incubations de 24 h; il se pourrait que la Pl-kinase utilise, dans les temps courts, préférentiellement certaines espèces moléculaires de PI. Des difficultés techniques, pour le moment non surmontées, nous interdisent d'analyser le PIp marqué au 14C après des temps très courts. Le marquage au 32P ne nous donnerait pas le moyen d'analyser les espèces moléculaires de PIp, puisque