jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
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1990. Electrophoretic karyotype and linkage groups of the amoeba-flagellate Naegleria gruberi. J. Protozool. 37: 400-8. Fan J. B., Korman S. H., Cantor C. R., Smith L. C. 1991. Giardia lamblia: Haploid genome size determined by pulsed field gel electrophoresis is less than 12 Mb. Nucleic Acids Res. 1905-8. Yoganathan T., Lin H., Buck G. A. 1989. An electrophoretic karyotype and assignment of ribosomal genes to resolved chromosomes of Pneumocystis carinii. Mol. Microbiol. 3: 1473-80. Zhang J., Cushion M., Giuntoli D., Hong S. T., Meade J. C., Smulian A. G., Stringer S. L, Stringer J. J. 1991. Analysis of the Pneumocystis carinii genome. J. Protozool. 38: 69S. Weinberg G. A., Bartlett M. S. 1991. Comparison of pulsed field gel electrophoresis karyotypes of Pneumocystis carinii derived from rat lung, Cell Culture and Ferret Lung. J. Protozool. 38: 64S-5. Mead J. R., Arrowood M. J., Current W. L, Sterling C. R. 1988. Field inversion gel electrophoretic separation of Cryptosporidium spp. chromosome-sized DNA. J. Parasitol. 74: 366-9. Giannini S. H., Schittini M., Keithly J. S., Warburton P. W., Cantor C. R., Van Der Ploeg L. H. T. 1986. Karyotype analysis of Leishmania species and its use in classification and clinical diagnosis. Science 232: 762-5. Van Der Ploeg L. H. T., Schwartz D. C, Cantor C. R., Borst P. 1984. Antigenic variation in Trypanosoma brucei analyzed by electrophoretic separation of chromosome-sized DNA molecules. Cell 37: 77-84. Bastien P., Blaineau C, Taminh M., Rioux J. A., Roizès G., Pages M. 1990. Interclonal variations in molecular karyotype in Leishmania infantum imply a "mosaic" strain culture. Mol. Biochem. Parasitol. 40: 53-62. Bastien P., Blaineau C, Pages M., 1992. Leishmania: Sex, lies and karyotype. Parasitol. Today 8: 174-7. Moreover, in most cases, large areas of the blastula remained uncleaved, interfering with gastrulation and blocking further development. Key words: blastula, parthenogenesis, Xenopus. Voir Version abrégée (p.409) Le centrosome est un organite cytoplasmique associé physiquement au noyau et présent à un seul exemplaire dans la cellule animale interphasique. Classiquement, le centrosome d'une cellule animale est constitué de deux cylindres centriolaires inscrits dans une matrice protéique complexe [1, 2]. Il organise le
Van Der Ploeg L. H. T., Schwartz D. C, Cantor C. R., Borst P. 1984. Antigenic variation in Trypanosoma brucei analyzed by electrophoretic separation of chromosome-sized DNA molecules. Cell 37: 77-84. Bastien P., Blaineau C, Taminh M., Rioux J. A., Roizès G., Pages M. 1990. Interclonal variations in molecular karyotype in Leishmania infantum imply a "mosaic" strain culture. Mol. Biochem. Parasitol. 40: 53-62. Bastien P., Blaineau C, Pages M., 1992. Leishmania: Sex, lies and karyotype. Parasitol. Today 8: 174-7. Moreover, in most cases, large areas of the blastula remained uncleaved, interfering with gastrulation and blocking further development. Key words: blastula, parthenogenesis, Xenopus. Voir Version abrégée (p.409) Le centrosome est un organite cytoplasmique associé physiquement au noyau et présent à un seul exemplaire dans la cellule animale interphasique. Classiquement, le centrosome d'une cellule animale est constitué de deux cylindres centriolaires inscrits dans une matrice protéique complexe [1, 2]. Il organise le réseau microtubulaire de la cellule, en interphase et en mitose. Dans les cellules somatiques, le cycle de duplication du centrosome se déroule sur l'ensemble des quatre phases du cycle cellulaire [3]. Le mode de duplication semiconservatif [4] demeure incompris au niveau moléculaire. On distingue quatre événements structuraux distincts dans les cellules animales : la dissociation des deux centrioles orthogonaux issus de la mitose en phase G1 précoce, le bourgeonnement orthogonal de deux procentrioles sur les deux centrioles du centrosome en G1/S, leur allongement au cours des phases S et G2, et la séparation des deux centrosomes-fils en fin de phase G2 pour former les pôles de la mitose [3]. Au cours du premier cycle de segmentation, l'oeuf d'amphibien subit une série de remaniements corticaux et cytoplasmiques dans lesquels le réseau microtubulaire est largement impliqué [5, 6]. L'ovocyte mature de xénope ne possède pas de centrosome fonctionnel et est incapable d'assembler de novo un centrosome. Un centrosome fonctionnel est formé après la fécondation à partir des deux structures centriolaires situées à la base du flagelle du spermatozoïde. Une piqûre de l'ovocyte ou un choc électrique provoque la remise en route du cycle cellulaire [7, 8] et un remaniement du réseau microtubulaire
cellules animales : la dissociation des deux centrioles orthogonaux issus de la mitose en phase G1 précoce, le bourgeonnement orthogonal de deux procentrioles sur les deux centrioles du centrosome en G1/S, leur allongement au cours des phases S et G2, et la séparation des deux centrosomes-fils en fin de phase G2 pour former les pôles de la mitose [3]. Au cours du premier cycle de segmentation, l'oeuf d'amphibien subit une série de remaniements corticaux et cytoplasmiques dans lesquels le réseau microtubulaire est largement impliqué [5, 6]. L'ovocyte mature de xénope ne possède pas de centrosome fonctionnel et est incapable d'assembler de novo un centrosome. Un centrosome fonctionnel est formé après la fécondation à partir des deux structures centriolaires situées à la base du flagelle du spermatozoïde. Une piqûre de l'ovocyte ou un choc électrique provoque la remise en route du cycle cellulaire [7, 8] et un remaniement du réseau microtubulaire [5] sans aboutir à une cellularisation. Le clivage de l'ovocyte mature nécessite de manière exclusive l'injection soit d'une fraction spermatique contenant les centrioles soit d'un centrosome de cellule somatique. De manière remarquable, ces fractions actives peuvent être d'origine hétérologue [1, 8, 9, 10]. Après l'injection, comme lors de la fécondation, le centrosome doit assembler les microtubules à partir de la tubuline endogène, se dupliquer en phase avec le cycle cellulaire de l'ovocyte, et interagir correctement avec les compartiments nucléaire et cytoplasmique. Dans ces conditions, des blastulas parthénogénétiques et dans quelques cas des stades de développement plus tardifs ont été obtenus [1, 8-12]. Nous montrons ici que le développement parthénogénétique peut franchir la métamorphose et permettre le développement d'une grenouille parthénogénétique. Nous montrons par ailleurs que le succès du développement dépend de la simultanéité de l'activation de l'ovocyte, conduisant à la remise en route de l'horloge cytoplasmique qui gouverne le cycle cellulaire, et de l'injection d'un centrosome. Matériel et méthodes Culture cellulaire Les cellules lymphoblastiques humaines d'origine T (lignée KE37) sont cultivées en suspension dans du RPMI (Eurobio) contenant 10 % de sérum de veau foetal à 37 °C, 5 % CO2. Isolement des centrosomes Les centrosomes sont isolés à partir
le centrosome doit assembler les microtubules à partir de la tubuline endogène, se dupliquer en phase avec le cycle cellulaire de l'ovocyte, et interagir correctement avec les compartiments nucléaire et cytoplasmique. Dans ces conditions, des blastulas parthénogénétiques et dans quelques cas des stades de développement plus tardifs ont été obtenus [1, 8-12]. Nous montrons ici que le développement parthénogénétique peut franchir la métamorphose et permettre le développement d'une grenouille parthénogénétique. Nous montrons par ailleurs que le succès du développement dépend de la simultanéité de l'activation de l'ovocyte, conduisant à la remise en route de l'horloge cytoplasmique qui gouverne le cycle cellulaire, et de l'injection d'un centrosome. Matériel et méthodes Culture cellulaire Les cellules lymphoblastiques humaines d'origine T (lignée KE37) sont cultivées en suspension dans du RPMI (Eurobio) contenant 10 % de sérum de veau foetal à 37 °C, 5 % CO2. Isolement des centrosomes Les centrosomes sont isolés à partir des cellules KE37 asynchrones [1] ou des cellules KE37 synchronisées en phase G1 par élutriation (Beckman, rotor JE-5) [11]. Test parthénogénétique Les grenouilles femelles (Xenopus laevis) proviennent du Centre d'élevage de xénopes du CNRS (Montpellier). 100 U.l. PMSG (pregnant mare sérum gonadotropin, Intervet, Angers) sont injectées aux grenouilles 3 à 10 jours avant la ponte pour induire la maturation des ovocytes. La veille, 1 000 U.l. HCG (human sérum gonadotropin, Sigma) sont injectées par femelle. La gangue des ovocytes est éliminée par traitement avec une solution de cystéine 2 % (pH 7,8). Les ovocytes sont ensuite rinçés plusieurs fois dans du tampon MMR (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM Hepes, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Essai parthénogénétique Les ovocytes sont disposés dans des boîtes plastiques (Nunc) contenant du MMR. La microinjection est effectuée à 20-22 °C. Les centrosomes sont dilués dans du Pipes 10 mM (pH 7,2 avec KOH) et injectés dans un volume constant de 50 nl par ovocyte suivant des dilutions décroissantes (0,4 ; 1 ; 10 ; 50 centrosomes dans 50 nl). 8-15 ovocytes sont injectés pour chaque dilution. Dans les expériences où le développement a été suivi au-delà
10 jours avant la ponte pour induire la maturation des ovocytes. La veille, 1 000 U.l. HCG (human sérum gonadotropin, Sigma) sont injectées par femelle. La gangue des ovocytes est éliminée par traitement avec une solution de cystéine 2 % (pH 7,8). Les ovocytes sont ensuite rinçés plusieurs fois dans du tampon MMR (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM Hepes, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Essai parthénogénétique Les ovocytes sont disposés dans des boîtes plastiques (Nunc) contenant du MMR. La microinjection est effectuée à 20-22 °C. Les centrosomes sont dilués dans du Pipes 10 mM (pH 7,2 avec KOH) et injectés dans un volume constant de 50 nl par ovocyte suivant des dilutions décroissantes (0,4 ; 1 ; 10 ; 50 centrosomes dans 50 nl). 8-15 ovocytes sont injectés pour chaque dilution. Dans les expériences où le développement a été suivi au-delà du stade blastula, le tampon MMR est remplacé une heure environ après l'injection par du 0,2 MMR puis le lendemain par de l'eau déchlorée. Décalage entre activation et injection Les ovocytes sont placés dans une boîte de plexiglass recouverte d'agarose 1 % [8] et activés par un choc électrique (2", 12 V). Les centrosomes non dupliés, isolés à partir de cellules KE37 synchronisées en G1, sont dilués dans du Pipes 10 mM (pH 7,2 avec KOH) jusqu'à une dilution voisine de 1 centrosome dans 50 nl et injectés régulièrement entre le moment de l'activation et le temps du premier clivage (100 min en moyenne). 8-15 ovocytes matures non activés sont injectés à la même dilution (temps 0). Résultats L'injection d'un centrosome hétérologue dans un ovocyte mature de xénope peut conduire au développement d'une grenouille parthénogénétique Lorsque des ovocytes matures de xénope (Fig. la) sont piqués avec une aiguille d'injection, la reprise du cycle cellulaire conduit à des remaniements cytoplasmiques que l'on peut déceler par la redistribution du pigment cortical (Fig. 1b). Cependant, aucun clivage n'est observé. L'injection d'un centrosome permet la cellularisation (Fig. 1 c). Les suspensions de centrosomes sont injectées sous un même volume à des dilutions décroissantes dans
12 V). Les centrosomes non dupliés, isolés à partir de cellules KE37 synchronisées en G1, sont dilués dans du Pipes 10 mM (pH 7,2 avec KOH) jusqu'à une dilution voisine de 1 centrosome dans 50 nl et injectés régulièrement entre le moment de l'activation et le temps du premier clivage (100 min en moyenne). 8-15 ovocytes matures non activés sont injectés à la même dilution (temps 0). Résultats L'injection d'un centrosome hétérologue dans un ovocyte mature de xénope peut conduire au développement d'une grenouille parthénogénétique Lorsque des ovocytes matures de xénope (Fig. la) sont piqués avec une aiguille d'injection, la reprise du cycle cellulaire conduit à des remaniements cytoplasmiques que l'on peut déceler par la redistribution du pigment cortical (Fig. 1b). Cependant, aucun clivage n'est observé. L'injection d'un centrosome permet la cellularisation (Fig. 1 c). Les suspensions de centrosomes sont injectées sous un même volume à des dilutions décroissantes dans les ovocytes matures (voir Matériel et méthodes). Nous avions montré que le meilleur pourcentage de blastulas était obtenu pour une dilution voisine de 1 centrosome injecté par ovocyte [10, 11]. Dans l'ensemble des expériences présentées ici, 62 % des ovocytes injectés avec un centrosome nominal se développent en blastulas (Tableau I). Des scores plus importants sont enregistrés dans des expériences individuelles : ils dépendent principalement de la qualité des pontes des femelles. Beaucoup de ces expériences ont été volontairement interrompues au stade blastula, suffisant pour décider du pouvoir parthénogénétique des centrosomes injectés. Dans six expériences indépendantes, nous avons suivi le développement des blastulas. Les résultats sont rapportés dans le Tableau I, 12% des ovocytes injectés se développent en têtards parthénogénétiques (10/80). Dans un cas, nous avons obtenu une métamorphose (Fig. 1 e-f). Dans d'autres séries d’expériences utilisant des centrosomes d’autres mammifères (rat, bovin), deux embryons parthénogénétiques se sont développés au-delà de la métamorphose (résultats non publiés). n = nombre d’expériences indépendantes. La symétrie du premier clivage de segmentation dépend de la simultanéité de l'activation de l'ovocyte et de l’injection d’un centrôsome Le test parthénogénétique possède un avantage expérimental que la fécondation ne peut procurer ; il est possible de décaler
I). Des scores plus importants sont enregistrés dans des expériences individuelles : ils dépendent principalement de la qualité des pontes des femelles. Beaucoup de ces expériences ont été volontairement interrompues au stade blastula, suffisant pour décider du pouvoir parthénogénétique des centrosomes injectés. Dans six expériences indépendantes, nous avons suivi le développement des blastulas. Les résultats sont rapportés dans le Tableau I, 12% des ovocytes injectés se développent en têtards parthénogénétiques (10/80). Dans un cas, nous avons obtenu une métamorphose (Fig. 1 e-f). Dans d'autres séries d’expériences utilisant des centrosomes d’autres mammifères (rat, bovin), deux embryons parthénogénétiques se sont développés au-delà de la métamorphose (résultats non publiés). n = nombre d’expériences indépendantes. La symétrie du premier clivage de segmentation dépend de la simultanéité de l'activation de l'ovocyte et de l’injection d’un centrôsome Le test parthénogénétique possède un avantage expérimental que la fécondation ne peut procurer ; il est possible de décaler l’activation de l’ovocyte et l’injection du centrôsome. Nous avons tiré parti de cet avantage pour savoir si un délai entre l’activation de l’ovocyte et l’injection du centrôsome était compatible avec un développement parthénogénétique. Pour éliminer toute variation due au choix du point d’injection des centrosomes, nous les avons injectés systématiquement dans l’hémisphère animal, sous la tâche de maturation. Des centrosomes ont été isolés à partir des cellules KE37 synchronisées en phase G1 afin d’obtenir une population homogène de centrosomes n’ayant pas, d’après des critères structuraux, amorcé une duplication. Ils ont été injectés à différents temps après l’activation par choc électrique des ovocytes. Un nombre optimal de centrosomes (1 centrôsome nominal par ovocyte) a été injecté dans une dizaine d’ovocytes pour chaque point. Dans les expériences témoins, où l’activation de l’ovocyte est provoquée par l’injection même du centrôsome (t = 0), le premier segmentation intervient en moyenne à 100 min. Lorsque l’injection du centrôsome a lieu pendant la première moitié du premier cycle embryonnaire (activation à t = 0 et injection entre 0 et 50 min), des clivages sont observés. Toutefois, la capacité d’induire un clivage décroît en proportion du temps écoulé après l’activation, et au-delà de 60 min, l’injection de
dans l’hémisphère animal, sous la tâche de maturation. Des centrosomes ont été isolés à partir des cellules KE37 synchronisées en phase G1 afin d’obtenir une population homogène de centrosomes n’ayant pas, d’après des critères structuraux, amorcé une duplication. Ils ont été injectés à différents temps après l’activation par choc électrique des ovocytes. Un nombre optimal de centrosomes (1 centrôsome nominal par ovocyte) a été injecté dans une dizaine d’ovocytes pour chaque point. Dans les expériences témoins, où l’activation de l’ovocyte est provoquée par l’injection même du centrôsome (t = 0), le premier segmentation intervient en moyenne à 100 min. Lorsque l’injection du centrôsome a lieu pendant la première moitié du premier cycle embryonnaire (activation à t = 0 et injection entre 0 et 50 min), des clivages sont observés. Toutefois, la capacité d’induire un clivage décroît en proportion du temps écoulé après l’activation, et au-delà de 60 min, l’injection de centrosomes n’entraîne aucun clivage (Fig. 2a). D’autre part, les blastulas obtenues dans ces conditions sont majoritairement des blastulas partielles (Fig. 2b) : une région de la blastule n’est pas segmentée (Fig. 2c-d). Discussion Nos résultats montrent qu’un développement parthénogénétique provoqué par l’injection d’un centrôsome hétérologue peut conduire à une métamorphose complète. Chez l’amphibien, aucun centriole maternel n’est détectable dans l’ovocyte mature. Les centrioles présents aux pôles du premier fuseau de segmentation proviennent de la duplication des centrioles apportés par le spermatozoïde. Ces derniers subissent une maturation dans le cytoplasme de l’ovocyte [13, 25] et forment un aster de microtubules qui s’étend dans l’ensemble du cytoplasme de l’œuf [6]. Cet aster microtubulaire est impliqué dans la migration des pronuclei mâle et femelle au centre de l’œuf [14, 15] et dans la ségrégation de déterminants impliqués dans la mise en place de l’axe dorso-ventral [16]. La simple activation par piqûre d’un ovocyte mature est suffisante pour établir un réseau radial de microtubules centré sur le pronucleus femelle [17]. Un stock maternel de composants centrosomiques redistribués à la surface du pronucleus femelle en l’absence de centrioles pourrait permettre cette organisation [6]. Néanmoins, aucun clivage n’a lieu. L’injection d’un centrôsome, fut-il hétérologue, mime la
complète. Chez l’amphibien, aucun centriole maternel n’est détectable dans l’ovocyte mature. Les centrioles présents aux pôles du premier fuseau de segmentation proviennent de la duplication des centrioles apportés par le spermatozoïde. Ces derniers subissent une maturation dans le cytoplasme de l’ovocyte [13, 25] et forment un aster de microtubules qui s’étend dans l’ensemble du cytoplasme de l’œuf [6]. Cet aster microtubulaire est impliqué dans la migration des pronuclei mâle et femelle au centre de l’œuf [14, 15] et dans la ségrégation de déterminants impliqués dans la mise en place de l’axe dorso-ventral [16]. La simple activation par piqûre d’un ovocyte mature est suffisante pour établir un réseau radial de microtubules centré sur le pronucleus femelle [17]. Un stock maternel de composants centrosomiques redistribués à la surface du pronucleus femelle en l’absence de centrioles pourrait permettre cette organisation [6]. Néanmoins, aucun clivage n’a lieu. L’injection d’un centrôsome, fut-il hétérologue, mime la fécondation et permet par conséquent la cellularisation nécessaire au développement d’un embryon parthénogénétique qui se poursuit dans quelques cas jusqu’au stade têtard (Tableau II). On s’attendrait, dans les conditions expérimentales du test parthénogénétique, à obtenir des embryons haploïdes. Or, la gastrulation des embryons haploïdes est atypique et conduit à un arrêt du développement [18]. Nous avons analysé la ploïdie de deux têtards et d’une grenouille parthénogénétiques et confirmé que, dans les trois cas, les parthénogénotes étaient diploïdes : la quantité d’ADN par cellule est comparable à celle de cellules de têtards fécondés (résultats non montrés). Ces développements tardifs sont donc probablement le résultat d’une diploïdisation du zygote, soit par la non expulsion du deuxième globule polaire après l’activation de l’ovocyte, soit par un défaut de segmentation des deux premiers blastomères [19, 20]. Cette deuxième possibilité pourrait être favorisée par la présence de centrioles « célibataires » dans les préparations de centrosomes utilisées [21]. Un ovocyte injecté avec un centriole unique ne pourrait organiser qu’un fuseau monopolaire à l’issue du premier cycle théorique de segmentation (100 min). Un nouveau cycle de duplication centrosomique serait nécessaire pour former un fuseau bipolaire fonctionnel. Deux cycles de duplication de l’ADN maternel se produiraient pendant