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HIGOUNET retrouve ces résultats et propose l'emploi d'un anticoagulant type antiferment : l'anéthol disulfonate de soude polymérisé. Les anticoagulants modifient aussi l'équilibre lipidique entre hématies et plasma (BOYD et MURRAY). Il semble donc rationnel d'étudier le sérum plutôt qu'un plasma adultéré par l'addition de substances étrangères. La défibrination est un procédé peu pratique pour l'obtention de quantités importantes de sérum. Celui-ci a toujours été obtenu par coagulation spontanée du sang. CONDITIONS DE PRELEVEMENT DU SANG 1. — Moment du prélèvement. Le sang n'est comparable à lui-même qu'en dehors des périodes digestives ; de nombreux travaux l'ont établi. M. LAUDAT a montré qu'après l'absorption d'un repas comprenant 50 grammes de beurre, la lipidémie passait 5-6 à 8-10 grs. Mme P. JUNG et R. WOLFF ont étudié les variations très considérables que présente le sérum de chien au cours de la période digestive ; excès de lipides à la suite d'un repas riche en viande, excès d'acides gras à la suite d'un repas de féculents. BROCQ ROUSSEAU a montré que le rendement en sérum augmente du début à la fin de la saignée. Nous avons fait quelques analyses comparatives pour connaître la composition du sérum au début, au milieu et à la fin de la saignée. Elles permettent d'établir que sa teneur en protéides et en lipides diminue au cours de la saignée. L'indice de réfraction varie dans le même sens. 3. — Séjour du sérum sur le caillot. Le temps de contact du sérum sur le caillot influe légèrement sur la composition du sérum. Le sérum conservé 48 heures sur le caillot est moins riche en lipides que le sérum récolté au bout de 24 heures. Les variations observées sont constantes. Elles ne sont pas très considérables mais nettement en dehors des erreurs expérimentales. TECHNIQUE EMPLOYÉE POUR LA PRÉPARATION DU SERUM Ces données justifient le mode opératoire que nous avons adopté : Dans la mesure du possible les animaux reçoivent une nourriture uniforme pendant le cours des expériences. Ils sont mis à la diète complète et au repos 15 à 16 heures avant la saignée. Chez les gros animaux, (équidés, bovidés)
fin de la saignée. Elles permettent d'établir que sa teneur en protéides et en lipides diminue au cours de la saignée. L'indice de réfraction varie dans le même sens. 3. — Séjour du sérum sur le caillot. Le temps de contact du sérum sur le caillot influe légèrement sur la composition du sérum. Le sérum conservé 48 heures sur le caillot est moins riche en lipides que le sérum récolté au bout de 24 heures. Les variations observées sont constantes. Elles ne sont pas très considérables mais nettement en dehors des erreurs expérimentales. TECHNIQUE EMPLOYÉE POUR LA PRÉPARATION DU SERUM Ces données justifient le mode opératoire que nous avons adopté : Dans la mesure du possible les animaux reçoivent une nourriture uniforme pendant le cours des expériences. Ils sont mis à la diète complète et au repos 15 à 16 heures avant la saignée. Chez les gros animaux, (équidés, bovidés) le sang est prélevé aseptiquement par ponction de la veine jugulaire et récolté dans un vase à saignée stérile ; on laisse tomber la masse de fonte lorsque le caillot est bien formé (une heure après la prise de sang, en général). Chez les petits animaux (rongeurs) le prélèvement est fait par ponction cardiaque. Pour les séries d'expériences comparatives, on prélève une quantité de sang à peu près uniforme (600 à 700 cc chez les gros animaux). Le sérum est décanté au bout de 24 heures et centrifugé. S'il n'est pas utilisé le jour même, on le conserve à la glacière à une température voisine de + 3°. ÉNONCÉ DE QUELQUES RÉSULTATS L'étude de la technique d'obtention du sérum nous a permis incidemment d'établir les faits suivants : a) La teneur en protéides et en lipides diminue du commencement à la fin de la saignée. b) La teneur en lipides diminue quand le sérum reste en contact avec le caillot. CHIFFRES EXPÉRIMENTAUX Protocole de l'expérience I : Au cours de la saignée, on a recueilli le sang de la façon suivante : Environ 50 cc dans un premier récipient (I) Environ 600 cc dans un deuxième récipient (II) Environ 50
fait par ponction cardiaque. Pour les séries d'expériences comparatives, on prélève une quantité de sang à peu près uniforme (600 à 700 cc chez les gros animaux). Le sérum est décanté au bout de 24 heures et centrifugé. S'il n'est pas utilisé le jour même, on le conserve à la glacière à une température voisine de + 3°. ÉNONCÉ DE QUELQUES RÉSULTATS L'étude de la technique d'obtention du sérum nous a permis incidemment d'établir les faits suivants : a) La teneur en protéides et en lipides diminue du commencement à la fin de la saignée. b) La teneur en lipides diminue quand le sérum reste en contact avec le caillot. CHIFFRES EXPÉRIMENTAUX Protocole de l'expérience I : Au cours de la saignée, on a recueilli le sang de la façon suivante : Environ 50 cc dans un premier récipient (I) Environ 600 cc dans un deuxième récipient (II) Environ 50 cc dans un troisième récipient (III) Protéides totaux du sérum : Dosage sur 2 cc par la méthode de KAYSER. Dosage par réfractométrie. Cholestérol : Dosage par la méthode colorimétrique de GRIGAUT. Résultats exprimés en gr/litre de sérum. à : Différence entre la composition du sérum au début et à la fin de la saignée rapportée au chiffre moyen % Génisse 60 Génisse 66 Cheval 67 H Protéides Protéides totaux Protéides 3 totaux K ser Réfrac Cholestérol totaux S Q. (Kayser) y tométrie (Kayser) 1 60.2 78.8 79.1 1.50 92.1 II 76.1 76.9 77.6 1.45 91.3 III 75.8 74.6 76.5 1.40 90.6 A 5,7 % 5.4 % 3.3 % 7 % 1.6 % Protocole de l'expérience II : On prélève à un cheval 4 litres de sang que l'on récolle dans deux vases à saignée 1 et II : la moitié du sérum de chacun des récipients est séparée du caillot au bout de 24 heures, l'autre moitié au bout de 48 heures. On fait le dosage des lipides totaux. (Lipides totaux exprimés en mgr. pour 25 cc. de sérum) 1 II Sérum 24 h. sur caillot 61,0 57,3 Sérum 48 h. sur caillot 56,5 54,1 BIBLIOGRAPHIE 1 — BORDET
la fin de la saignée rapportée au chiffre moyen % Génisse 60 Génisse 66 Cheval 67 H Protéides Protéides totaux Protéides 3 totaux K ser Réfrac Cholestérol totaux S Q. (Kayser) y tométrie (Kayser) 1 60.2 78.8 79.1 1.50 92.1 II 76.1 76.9 77.6 1.45 91.3 III 75.8 74.6 76.5 1.40 90.6 A 5,7 % 5.4 % 3.3 % 7 % 1.6 % Protocole de l'expérience II : On prélève à un cheval 4 litres de sang que l'on récolle dans deux vases à saignée 1 et II : la moitié du sérum de chacun des récipients est séparée du caillot au bout de 24 heures, l'autre moitié au bout de 48 heures. On fait le dosage des lipides totaux. (Lipides totaux exprimés en mgr. pour 25 cc. de sérum) 1 II Sérum 24 h. sur caillot 61,0 57,3 Sérum 48 h. sur caillot 56,5 54,1 BIBLIOGRAPHIE 1 — BORDET (J.) et DELANGE (L.) : La coagulation du sang et la genèse de la thrombine. Ann. Inst. Pasteur, 1912, 26, 657 et 737. 2 — GUILLAUMIN (Ch. O.) : Influence de quelques anticoagulants sur la répartition entre le plasma et les globules des constituants sanguins. Bull. Soc. Chim. biol., 1930, 12, 491. 3 — HIGOUNET (H.) : Influence des anticoagulants sur la répartition des ions Clentre le plasma et les hématies. Bull. Soc. Chim. biol., 1937, 19, 53. 4 — BOYD (Eldon M.) et MURRAY (Ronald B.) : The effects of anticoagulants on blood lipids. The J. biol. Chem., 1937, 117, 629. 5 — LAUDAT (M.) : Thèse doct. Pharm. Paris, 1913. 6 — JUNG (Mme P.) et WOLFF (R.) : Sur la teneur comparée du plasma et du sérum en lipoïdes. Bull. Soc. Chim. biol., 1923, 5, 137. 7 — BROCQ ROUSSEAU : Du rendement en sérum à la suite des saignées successives. C. R. Soc. Biol., 1926, 95, 68. Les auteurs sont à peu près d'accord pour adopter une première lixiviation par l'alcool et une seconde par l'éther dans un appareil à extraction continue du type KUMAGAWA. Les conditions d'évaporation des solvants et de séchage de l'extrait ne
12, 491. 3 — HIGOUNET (H.) : Influence des anticoagulants sur la répartition des ions Clentre le plasma et les hématies. Bull. Soc. Chim. biol., 1937, 19, 53. 4 — BOYD (Eldon M.) et MURRAY (Ronald B.) : The effects of anticoagulants on blood lipids. The J. biol. Chem., 1937, 117, 629. 5 — LAUDAT (M.) : Thèse doct. Pharm. Paris, 1913. 6 — JUNG (Mme P.) et WOLFF (R.) : Sur la teneur comparée du plasma et du sérum en lipoïdes. Bull. Soc. Chim. biol., 1923, 5, 137. 7 — BROCQ ROUSSEAU : Du rendement en sérum à la suite des saignées successives. C. R. Soc. Biol., 1926, 95, 68. Les auteurs sont à peu près d'accord pour adopter une première lixiviation par l'alcool et une seconde par l'éther dans un appareil à extraction continue du type KUMAGAWA. Les conditions d'évaporation des solvants et de séchage de l'extrait ne sont pas toujours bien fixées. Certains auteurs opèrent à température aussi basse que possible afin de ne perdre aucune fraction de l'extrait ; d'autres estiment au contraire qu'un chauffage approprié est nécessaire pour éliminer les impuretés volatiles et rendre insolubles dans l'éther des substances résineuses qui ne doivent pas être comptées dans l'extrait lipoïdique. Nous ne discuterons pas ce problème qui sort des cadres de cette étude. Il semble à cet égard que les sérums des différentes espèces animales ne se comportent pas toujours de façon identique. La connaissance chimique et le rôle physiologique des substances que nous voulons doser sont souvent insuffisants. C'est pourquoi les méthodes qu'emploie la chimie biologique ne sont pas toujours parfaites. Il importe donc de ne comparer entre eux que des chiffres obtenus à l'aide d'une même technique dont les différents temps soient très exactement précisés. Un exemple illustrera mieux ces prescriptions. Parmi les nombreuses méthodes de dosage du glucose sanguin, celle de BAUDOIN et LEWIN d'une part, celle de FONTES et THIVOLLE d'autre part sont parmi les plus sensibles et les plus fidèles. Or la première donne des résultats systématiquement plus faibles que la deuxième parce que la défécation mercurielle qu'elle utilise élimine une
comptées dans l'extrait lipoïdique. Nous ne discuterons pas ce problème qui sort des cadres de cette étude. Il semble à cet égard que les sérums des différentes espèces animales ne se comportent pas toujours de façon identique. La connaissance chimique et le rôle physiologique des substances que nous voulons doser sont souvent insuffisants. C'est pourquoi les méthodes qu'emploie la chimie biologique ne sont pas toujours parfaites. Il importe donc de ne comparer entre eux que des chiffres obtenus à l'aide d'une même technique dont les différents temps soient très exactement précisés. Un exemple illustrera mieux ces prescriptions. Parmi les nombreuses méthodes de dosage du glucose sanguin, celle de BAUDOIN et LEWIN d'une part, celle de FONTES et THIVOLLE d'autre part sont parmi les plus sensibles et les plus fidèles. Or la première donne des résultats systématiquement plus faibles que la deuxième parce que la défécation mercurielle qu'elle utilise élimine une substance réductrice (glucide X de FONTES et THIVOLLE) qui passe dans le filtrat de défécation tungstique. La nature chimique de cette substance est inconnue et son rôle, surtout dans le diabète, mal précisé. La question n'est pas tranchée de savoir si l'on doit doser ce glucide x avec le sucre du sang ou au contraire l'éliminer. DOSAGE DE L'UREE Les deux procédés les plus employés pour le dosage de l'urée sont : La méthode de FOSSE. Le sérum convenablement déféqué est additionné de xanthydrol qui précipite l'urée à l'état de xanthylurée. La méthode à l'hypobromite, Ce réactif décompose l'urée en gaz carbonique, qu'on absorbe par la soude, et azote dont on mesure le volume. En réalité l'azote n'est pas entièrement libéré mais par contre il se dégage un peu d'oxygène. Des expériences témoins permettent de dresser des tableaux de correspondance entre la teneur en urée et le volume gazeux recueilli. Elle donne des résultats supérieurs d'environ 25 % à la méthode de FOSSE, mais de plus, comme l'a montré LAUDAT, cet écart n'est pas constant ; il peut tomber à 3 % chez les azotémiques et croître chez certains hépatiques jusqu'à 75 % Cette remarque apporte une nouvelle justification aux
du sang ou au contraire l'éliminer. DOSAGE DE L'UREE Les deux procédés les plus employés pour le dosage de l'urée sont : La méthode de FOSSE. Le sérum convenablement déféqué est additionné de xanthydrol qui précipite l'urée à l'état de xanthylurée. La méthode à l'hypobromite, Ce réactif décompose l'urée en gaz carbonique, qu'on absorbe par la soude, et azote dont on mesure le volume. En réalité l'azote n'est pas entièrement libéré mais par contre il se dégage un peu d'oxygène. Des expériences témoins permettent de dresser des tableaux de correspondance entre la teneur en urée et le volume gazeux recueilli. Elle donne des résultats supérieurs d'environ 25 % à la méthode de FOSSE, mais de plus, comme l'a montré LAUDAT, cet écart n'est pas constant ; il peut tomber à 3 % chez les azotémiques et croître chez certains hépatiques jusqu'à 75 % Cette remarque apporte une nouvelle justification aux prescriptions énoncées précédemment. Technique personnelle La méthode que nous utilisons est essentiellement celle de FOSSE. La technique de séparation de la xanthylurée nous est personnelle. Nous l'employons depuis plusieurs années déjà avec d'excellents résultats. L'emploi de papier filtre est peu pratique et peu sûr, la pellicule que l'on détache est fragile et risque de contenir quelques bribes de ce papier. La préparation des filtres d'amiante est assez longue, minutieuse et ne donne de bons résultats qu'avec certaines qualités d'amiante. Avec les filtres à plaque de verre poreux il y a souvent des pertes importantes. Aussi avons-nous été amenés à utiliser des filtres d'Iéna garnis d'amiante. Voici la technique employée : Dans un tube à centrifuger de 30 à 50 cc, ajouter volumes égaux de sérum et de réactif de FOSSE (P. ex. 10 cc). Mélanger soigneusement avec une baguette de verre, centrifuger et, s'il y a lieu, filtrer. Au volume prélevé du filtrat, ajouter dans un bécher un égal volume d'acide acétique cristallisable et le dixième environ de ce volume d'une solution à 5 % de xanthydrol dans l'alcool méthylique pur. Attendre deux à trois heures. Au bout de ce temps l'insolubilisation est totale et la filtration se fait très
fragile et risque de contenir quelques bribes de ce papier. La préparation des filtres d'amiante est assez longue, minutieuse et ne donne de bons résultats qu'avec certaines qualités d'amiante. Avec les filtres à plaque de verre poreux il y a souvent des pertes importantes. Aussi avons-nous été amenés à utiliser des filtres d'Iéna garnis d'amiante. Voici la technique employée : Dans un tube à centrifuger de 30 à 50 cc, ajouter volumes égaux de sérum et de réactif de FOSSE (P. ex. 10 cc). Mélanger soigneusement avec une baguette de verre, centrifuger et, s'il y a lieu, filtrer. Au volume prélevé du filtrat, ajouter dans un bécher un égal volume d'acide acétique cristallisable et le dixième environ de ce volume d'une solution à 5 % de xanthydrol dans l'alcool méthylique pur. Attendre deux à trois heures. Au bout de ce temps l'insolubilisation est totale et la filtration se fait très facilement. Pendant ce temps, on prépare le filtre. Prendre un filtre d'Iéna de porosité G3 de 2 cm, 5 de diamètre sur 10 cm de hauteur ; le garnir d'une petite couche d'amiante en fibres. Laver à l'acide acétique, à l'eau, à l'alcool. Déssécher à 100° (une heure au moins) laisser refroidir une demiheure dans un exsiccateur à vide puis peser. Effectuer la filtration de la xanthylurée en s'aidant d'une légère dépression, rincer le bécher à trois reprises avec de petites quantités d'alcool éthylique saturé de xanthylurée en employant un agitateur muni d'un bout de caoutchouc. Dessécher à l'étuve à 100°, laisser refroidir et peser dans les mêmes conditions que pour le filtre vide. Le poids de xanthylurée exprimé en mgr., divisé par 7 et par la moitié du nombre de cc du filtrat donne la quantité d'urée en gr. par litre de sérum. DOSAGE DU PHOSPHORE A. Phosphore total. Nous avons employé la méthode de MACHEBŒUF à quelques détails de technique près. Dans un matras de KJELDAHL de 30 cc environ introduire 2 cc de sérum et 1 cc d'acide sulfurique concentré (d = 1.84). Chauffer jusqu'à apparition de fumées blanches, Après refroidissement ajouter 2 cc d'acide nitrique pur
laisser refroidir une demiheure dans un exsiccateur à vide puis peser. Effectuer la filtration de la xanthylurée en s'aidant d'une légère dépression, rincer le bécher à trois reprises avec de petites quantités d'alcool éthylique saturé de xanthylurée en employant un agitateur muni d'un bout de caoutchouc. Dessécher à l'étuve à 100°, laisser refroidir et peser dans les mêmes conditions que pour le filtre vide. Le poids de xanthylurée exprimé en mgr., divisé par 7 et par la moitié du nombre de cc du filtrat donne la quantité d'urée en gr. par litre de sérum. DOSAGE DU PHOSPHORE A. Phosphore total. Nous avons employé la méthode de MACHEBŒUF à quelques détails de technique près. Dans un matras de KJELDAHL de 30 cc environ introduire 2 cc de sérum et 1 cc d'acide sulfurique concentré (d = 1.84). Chauffer jusqu'à apparition de fumées blanches, Après refroidissement ajouter 2 cc d'acide nitrique pur (d = 1.38) et porter à l'ébullition. Si la liqueur reste colorée en brun après disparition des vapeurs nitreuses, ajouter encore un peu d'acide nitrique et poursuivre la destruction jusqu'à décoloration complète ou simple persistance d'une légère teinte jaune paille. Après refroidissement, ajouter 6 cc d'eau et 2 cc de nitrate d'ammonium en solution saturée. Porter au bain marie bouillant pendant 10 minutes environ. Ajouter alors 6 cc de molybdate d'ammonium à 5 % et laisser au bain marie bouillant pendant 10 minutes exactement. Laisser refroidir et ajouter 5 cc d'alcool à 95°. Le précipité se rassemble au fond du tube. Jeter le liquide surnageant sur un filtre d'Iéna monté sur fiole à vide. Rincer avec de l'alcool à 50° jusqu'à ce que le filtrat ne précipite plus par addition de chlorure de baryum. La fiole à vide est vidée et rincée. Dissoudre alors le précipité dans le matras à l'aide de quelques cc d'ammoniaque au quart et jeter ce liquide sur le filtre d'Jena. Rincer à plusieurs reprises avec de l'eau additionnée d'un peu d'ammoniaque jusqu'à ce que tout le précipité soit dissous. Transvaser ensuite le contenu de la fiole à vide dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 cc
nitrate d'ammonium en solution saturée. Porter au bain marie bouillant pendant 10 minutes environ. Ajouter alors 6 cc de molybdate d'ammonium à 5 % et laisser au bain marie bouillant pendant 10 minutes exactement. Laisser refroidir et ajouter 5 cc d'alcool à 95°. Le précipité se rassemble au fond du tube. Jeter le liquide surnageant sur un filtre d'Iéna monté sur fiole à vide. Rincer avec de l'alcool à 50° jusqu'à ce que le filtrat ne précipite plus par addition de chlorure de baryum. La fiole à vide est vidée et rincée. Dissoudre alors le précipité dans le matras à l'aide de quelques cc d'ammoniaque au quart et jeter ce liquide sur le filtre d'Jena. Rincer à plusieurs reprises avec de l'eau additionnée d'un peu d'ammoniaque jusqu'à ce que tout le précipité soit dissous. Transvaser ensuite le contenu de la fiole à vide dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 cc environ, ajouter 10 cc de soude et porter à l'ébullition jusqu'à ce que l'ammoniaque soit entièrement chassé (15 à 20 minutes d'ébullition). L'ébullition sera régularisée par l'introduction dans la fiole conique d'une petite cloche capillaire. Puis ajouter 20 cc d'acide sulfurique, porter à nouveau à rébullition pendant quelques minutes et titrer à la N sous A "20 sans laisser refroidir en présence de phénolphtaléine. Après l'apparition du virage, on laisse refroidir quelques minutes et on porte à nouveau à l'ébullition. Le virage disparaît. On ajoute alors la quantité de soude nécessaire pour le faire réapparaître. Le nombre de cc de soude lu à la burette multiplié par 0,056 donne le poids en mgr. du phosphore de la prise d'essai. B. Phosphore lipoïdique. M. JAVILLIER a montré la nécessité, pour faire des évaluations correctes des différentes formes de phosphore, d'opérer sur des produits stabilisés aussitôt que possible après leur prélèvement. Le mode opératoire que nous avons suivi s'inspire de ces recommandations. On recueille 20 cc de sang environ dans un flacon de 200 à 250 cc contenant des billes de verre. Après agitation énergique on jette le sang défibriné sur un entonnoir et on centrifuge aussitôt. A l'aide d'une pipette, on
titrer à la N sous A "20 sans laisser refroidir en présence de phénolphtaléine. Après l'apparition du virage, on laisse refroidir quelques minutes et on porte à nouveau à l'ébullition. Le virage disparaît. On ajoute alors la quantité de soude nécessaire pour le faire réapparaître. Le nombre de cc de soude lu à la burette multiplié par 0,056 donne le poids en mgr. du phosphore de la prise d'essai. B. Phosphore lipoïdique. M. JAVILLIER a montré la nécessité, pour faire des évaluations correctes des différentes formes de phosphore, d'opérer sur des produits stabilisés aussitôt que possible après leur prélèvement. Le mode opératoire que nous avons suivi s'inspire de ces recommandations. On recueille 20 cc de sang environ dans un flacon de 200 à 250 cc contenant des billes de verre. Après agitation énergique on jette le sang défibriné sur un entonnoir et on centrifuge aussitôt. A l'aide d'une pipette, on prélève 8 à 10 cc de sérum que l'on verse goutte à goutte et en agitant dans un bêcher contenant 200 cc d'alcool à 96° pour avoir une matière finement coagulée. On porte à l'ébullition que l'on Prolonge pendant une vingtaine de minutes si l'extraction n'est pas effectuée aussitôt. Les opérations sont ensuite les mêmes que pour le dosage de l'extrait lipoïdique total. Le dosage du phosphore dans cet extrait est fait par la méthode de MACHEBŒUF. DOSAGE DES LIPIDES A. — EXTRAIT LIPOÏDIQUE TOTAL : On verse goutte à goutte le sérum dans l'alcool; on obtient ainsi un précipité finement coagulé. Celui-ci est porté au bain marie; quand l'alcool a bouilli quelques minutes, les protéides sont sûrement dénaturés. On filtre alors sur cartouche de DURIEUX (soigneusement dégraissée par une extraction êthérée au KUMAGAWA). L'alcool est recueilli et le coagulum épuisé à l'alcool dans l'appareil de KUMAGAWA pendant dix heures et à l'éther pendant trois heures suivant les prescriptions de M. JAVILLIER. On distille les liqueurs alcoolique et éthérée dans un ballon à fond rond de un litre en s'aidant du vide. Le résidu est désséché par deux affusions successives d'alcool absolu. La distillation dans le vide diminue l'altération de