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au cobaye avec succès. Au mois d'août 1938, nous expédiions à l'Institut d'Hygiène de la Faculté de Médecine de Zagreb, au docteur Trausmiller, du virus sec qui permettait le passage positif au cobaye. Au mois de septembre 1938, à Amsterdam, pendant le Congrès international de Médecine tropicale, nous remettions au professeur Du Toit une ampoule de virus sec qu'il emportait en Afrique du Sud. « I am sure, nous écrivait-il par la suite, you will be interested to learn that the murine typhus virus which you were good enough to give me in Amsterdam in september proved virulent inoculated into guinea pigs in november. At the present moment, the strain is in its third passage and is producing good temperature and scrotal reaction. The survival of the virus is most interesting, particularly because i was unable to hold it at a low temperature until i arrived back at Onderstepoort ». Ce virus était conservé depuis 275 jours. Enfin, nous avons envoyé à Paris, fin mars 1939, au professeur Veintemillas, du virus sec du même lot 1. Quelque temps plus tard, notre correspondant écrivait : « El virus tifoideo murino africano transportado en el maletín de viaje a la temperatura ambiente, bajo la forma seca del excremento de pulgas, procedente de Casablanca y resembrado sobre cobayos en La Paz (Bolivia) después de 68 días se mantiene vivo y virulento ». Ce virus était conservé depuis 453 jours (1). Dans la suite, de très nombreux envois de virus conservé depuis un temps plus ou moins long, ont pu être faits, pour les besoins d'expérimentateurs étrangers. Professeur Weigl, Lwow (Pologne) Docteur J. Starzyk, Lwow (Pologne) Docteur P. Giroud, Institut Pasteur, Paris Docteur H. Mosing, Lwow (Pologne) Docteur Wohlrab, Frankfurt a/Main (Allemagne) Docteur Mariani, Addis-Abeba (Ethiopie) Professeur Ciuca, Bucarest (Roumanie) Docteur Burnet, Melbourne (Australie) Docteur Jude, Alger (Algérie) Professeur Violle, Marseille (France) Docteur Trigueros, Tetouan (Maroc espagnol) Docteur Najera, Madrid (Espagne) Docteur Durieux, Dakar (Sénégal) Les expériences continuent d'être poursuivies avec le virus du même lot 1 ; la dernière en date (février 1941) montre que la conservation du virus sec des déjections de
bajo la forma seca del excremento de pulgas, procedente de Casablanca y resembrado sobre cobayos en La Paz (Bolivia) después de 68 días se mantiene vivo y virulento ». Ce virus était conservé depuis 453 jours (1). Dans la suite, de très nombreux envois de virus conservé depuis un temps plus ou moins long, ont pu être faits, pour les besoins d'expérimentateurs étrangers. Professeur Weigl, Lwow (Pologne) Docteur J. Starzyk, Lwow (Pologne) Docteur P. Giroud, Institut Pasteur, Paris Docteur H. Mosing, Lwow (Pologne) Docteur Wohlrab, Frankfurt a/Main (Allemagne) Docteur Mariani, Addis-Abeba (Ethiopie) Professeur Ciuca, Bucarest (Roumanie) Docteur Burnet, Melbourne (Australie) Docteur Jude, Alger (Algérie) Professeur Violle, Marseille (France) Docteur Trigueros, Tetouan (Maroc espagnol) Docteur Najera, Madrid (Espagne) Docteur Durieux, Dakar (Sénégal) Les expériences continuent d'être poursuivies avec le virus du même lot 1 ; la dernière en date (février 1941) montre que la conservation du virus sec des déjections de puces peut atteindre 3 ans, dans les conditions naturelles à la température du laboratoire. D'autres essais nous ont enfin montré que le virus sec résiste parfaitement aux températures les plus élevées qu'il pourait avoir à affronter lors des expériences ou du stockage dans les infirmeries : l'alternance de la chaleur et du froid (+ 52° 20°) poursuivie pendant des semaines se montre également sans action. L'égalité de virulence est assurée par le mode même de récolte et de titrage des lots de virus. En effet, l'expérimentation nous ayant montré que la puce garde l'infection toute sa vie et émet pendant toute la durée de son infection des déjections de virulence constante, les puces productrices de virus sont nourries pendant toute la durée des récoltes, uniquement sur rats blancs infectés de typhus murin, afin de renforcer encore la constance de cette virulence. Cette constance jointe à la résistance du virus permet de mélanger de nombreuses récoltes de déjections, échelonnées par exemple sur plusieurs mois, et d'en obtenir des lots d'un stock-virus parfaitement homogène ; c'est sur ce stock-virus que sont poursuivies les expériences qui sont ainsi rigoureusement comparables entre elles. Ainsi, sur chacun des lots récoltés peuvent être pratiqués de véritables
et du froid (+ 52° 20°) poursuivie pendant des semaines se montre également sans action. L'égalité de virulence est assurée par le mode même de récolte et de titrage des lots de virus. En effet, l'expérimentation nous ayant montré que la puce garde l'infection toute sa vie et émet pendant toute la durée de son infection des déjections de virulence constante, les puces productrices de virus sont nourries pendant toute la durée des récoltes, uniquement sur rats blancs infectés de typhus murin, afin de renforcer encore la constance de cette virulence. Cette constance jointe à la résistance du virus permet de mélanger de nombreuses récoltes de déjections, échelonnées par exemple sur plusieurs mois, et d'en obtenir des lots d'un stock-virus parfaitement homogène ; c'est sur ce stock-virus que sont poursuivies les expériences qui sont ainsi rigoureusement comparables entre elles. Ainsi, sur chacun des lots récoltés peuvent être pratiqués de véritables titrages de virulence. Avec le virus frais de cobaye, le titrage par dilutions échelonnées de broyats d'organes, chez l'homme ou les animaux d'expérience, ne pouvait parvenir à aucune exactitude. Le broyage des organes infectés ne peut en effet prétendre réaliser autre chose qu'une grossière dissociation tissulaire et l'émulsion virulente doit être considérée comme une suspension de cellules ou de groupes de cellules infectées ou non. La quantité de virus et de cellules infectées varie de surcroît d'un virus, c'est-à-dire d'un cobaye à un autre. Avec le virus des déjections de puces au contraire, virus qui doit, après conservation à sec, être considéré comme strictement extracellulaire, la suspension dans le solvant est d'une homogénéité parfaite et, pratiquement, la quantité de virus contenue dans chaque centimètre cube est constante. D'autre part, l'homogénéité du stock-virus, c'est-à-dire l'égalité de virulence de toutes les particules mélangées, permet d'étendre les résultats de titrages pratiqués sur quelques milligrammes d'un lot à l'ensemble de ce lot. Enfin la parfaite conservation du virus autorise, ainsi que le montrent de très nombreuses expériences, à considérer ces résultats de titrage comme valables pendant toute la durée d'utilisation du lot. Le nombre de titrages à faire étant ainsi très réduit (deux ou
être considérée comme une suspension de cellules ou de groupes de cellules infectées ou non. La quantité de virus et de cellules infectées varie de surcroît d'un virus, c'est-à-dire d'un cobaye à un autre. Avec le virus des déjections de puces au contraire, virus qui doit, après conservation à sec, être considéré comme strictement extracellulaire, la suspension dans le solvant est d'une homogénéité parfaite et, pratiquement, la quantité de virus contenue dans chaque centimètre cube est constante. D'autre part, l'homogénéité du stock-virus, c'est-à-dire l'égalité de virulence de toutes les particules mélangées, permet d'étendre les résultats de titrages pratiqués sur quelques milligrammes d'un lot à l'ensemble de ce lot. Enfin la parfaite conservation du virus autorise, ainsi que le montrent de très nombreuses expériences, à considérer ces résultats de titrage comme valables pendant toute la durée d'utilisation du lot. Le nombre de titrages à faire étant ainsi très réduit (deux ou trois lots de stock-virus seulement étant constitués chaque année), il est possible de multiplier pour chacun d'eux les opérations et d'arriver à une précision très grande. Grâce à ce mode de titrage, nous pouvions déterminer avec précision la dose minima infectante pour le cobaye et l'homme et mettre en évidence leur différence de réceptivité. Chez l'homme, le 1/100e de milligramme se montre régulièrement infectant, le 1/1000e de milligramme ne donnant plus que des résultats inconstants. Chez le cobaye, inoculé dans le péritoine, l'infection ne peut être constamment obtenue qu'avec des doses de 10 milligrammes. 1 jour de conservation 6 mois de conservation La précision de ces doses permettait de comparer la virulence de différents lots et nous pouvions montrer que dans des conditions de récolte et de stockage identiques, la virulence était la même d'un lot à l'autre. D'autre part, nous pouvions recueillir sur la qualité de la conservation du virus sec, des précisions intéressantes. Si nous savions, en effet, que le virus sec peut rester vivant pendant un temps considérable, nous ignorions encore si cette conservation était partielle ou totale. L'expérimentation sur le cobaye, obligeant à utiliser des doses relativement énormes, ne pouvait permettre de titrer la quantité de
leur différence de réceptivité. Chez l'homme, le 1/100e de milligramme se montre régulièrement infectant, le 1/1000e de milligramme ne donnant plus que des résultats inconstants. Chez le cobaye, inoculé dans le péritoine, l'infection ne peut être constamment obtenue qu'avec des doses de 10 milligrammes. 1 jour de conservation 6 mois de conservation La précision de ces doses permettait de comparer la virulence de différents lots et nous pouvions montrer que dans des conditions de récolte et de stockage identiques, la virulence était la même d'un lot à l'autre. D'autre part, nous pouvions recueillir sur la qualité de la conservation du virus sec, des précisions intéressantes. Si nous savions, en effet, que le virus sec peut rester vivant pendant un temps considérable, nous ignorions encore si cette conservation était partielle ou totale. L'expérimentation sur le cobaye, obligeant à utiliser des doses relativement énormes, ne pouvait permettre de titrer la quantité de virus avec suffisamment de précision. Utilisant la dose minima infectante : 1/100e de mg, qui, avec du virus fraîchement récolté, donne chez l'homme l'infection dans 100 cas (dont 90 % de maladies apparentes), nous avons pu procéder à des expériences échelonnées qui mettent en évidence l'intégrité absolue de la virulence au cours de la conservation. 3° Enfin le dernier inconvénient de notre première méthode, le défaut d'homogénéité de l'émulsion, se trouve également supprimé : le virus sec des déjections de puces, libre, extracellulaire, donnant une véritable « solution » virulente, d'homogénéité absolue, toutes les doses sont comparables entre elles et l'action de la bile identique sur toutes les unités virulentes. Malgré le caractère un peu étrange du mode de production du virus que nous utilisons pour cette vaccination, nous n'avons pas cherché à en modifier le principe, considérant, d'une part, les avantages considérables qu'il nous apportait et, d'autre part, qu'il s'agissait là d'un stade naturel du virus tout à fait particulier. En effet, dans le cycle évolutif de beaucoup d'êtres parasites stricts, c'est-à-dire ne pouvant survivre en dehors de leur hôte, existe un stade extraparasitaire qui est le stade de dispersion naturelle. Ce stade où le parasite devra vivre dans
au cours de la conservation. 3° Enfin le dernier inconvénient de notre première méthode, le défaut d'homogénéité de l'émulsion, se trouve également supprimé : le virus sec des déjections de puces, libre, extracellulaire, donnant une véritable « solution » virulente, d'homogénéité absolue, toutes les doses sont comparables entre elles et l'action de la bile identique sur toutes les unités virulentes. Malgré le caractère un peu étrange du mode de production du virus que nous utilisons pour cette vaccination, nous n'avons pas cherché à en modifier le principe, considérant, d'une part, les avantages considérables qu'il nous apportait et, d'autre part, qu'il s'agissait là d'un stade naturel du virus tout à fait particulier. En effet, dans le cycle évolutif de beaucoup d'êtres parasites stricts, c'est-à-dire ne pouvant survivre en dehors de leur hôte, existe un stade extraparasitaire qui est le stade de dispersion naturelle. Ce stade où le parasite devra vivre dans la nature, en dépit de l'action des agents physiques et sans échanges nutritifs, est toujours assuré par une forme de résistance (œuf, spore, kyste, etc...) issue d'une multiplication intense. Grâce à sa grande résistance et sa pullulation, ce stade constitue en général le vrai « réservoir de virus ». Contaminant un nouvel hôte, il perd aussitôt sa forme de résistance pour reprendre sa forme parasitaire vraie, inséparable de l'organisme parasité. Le virus des déjections de puces nous apparaît, dans l'évolution naturelle du typhus murin, comme ce stade de multiplication, de résistance et de dispersion. Sa très haute virulence, son émission constante par la puce infectée signent la multiplication ; sa conservation considérable à sec, dans des conditions climatiques normales, montre sa résistance ; enfin la connaissance de la non transmission de la maladie par piqûre de la puce, l'évidence de la contamination par voie muqueuse incitent à voir dans ces déjections la forme de dispersion et le réservoir de virus du typhus murin. De même la rapide destruction du virus en milieu aqueux montre que cette forme transitoire perd sa résistance dès qu'elle est mise dans des conditions analogues à celles où, dans la nature, se fait le retour à
un nouvel hôte, il perd aussitôt sa forme de résistance pour reprendre sa forme parasitaire vraie, inséparable de l'organisme parasité. Le virus des déjections de puces nous apparaît, dans l'évolution naturelle du typhus murin, comme ce stade de multiplication, de résistance et de dispersion. Sa très haute virulence, son émission constante par la puce infectée signent la multiplication ; sa conservation considérable à sec, dans des conditions climatiques normales, montre sa résistance ; enfin la connaissance de la non transmission de la maladie par piqûre de la puce, l'évidence de la contamination par voie muqueuse incitent à voir dans ces déjections la forme de dispersion et le réservoir de virus du typhus murin. De même la rapide destruction du virus en milieu aqueux montre que cette forme transitoire perd sa résistance dès qu'elle est mise dans des conditions analogues à celles où, dans la nature, se fait le retour à la vie parasitaire. La vaccination avec ce virus présente donc, en dehors des avantages matériels que nous avons énumérés, celui d'utiliser la forme même, qui, dans la nature, constitue le réservoir de virus et assure la contamination du vertébré. TECHNIQUE DE RÉCOLTE ET DE CONSERVATION DU VIRUS SEC Nous nous sommes adressés, pour la production massive de virus sec, à la puce du rat « Xenopsylla cheopis » sur laquelle nous poursuivions depuis plusieurs années des travaux expérimentaux, qui nous avaient donné l'expérience, et des questions techniques d'élevage, de manipulation, etc..., et des détails de comportement chez cette puce du virus du typhus murin. Des élevages importants ont été constitués en partant d'un élevage originel formé de Xenopsylla cheopis récoltées dans la nature et identifiées une à une sous la loupe binoculaire. Ce genre de manipulation a été rendu commode et sans danger d'évasion, par l'emploi de la technique suivante. Les nasses contenant des rats sauvages capturés dans la nature sont apportées au laboratoire; ces nasses sont déposées sur un petit plateau retourné au centre d'un grand plateau en tôle émaillée blanche (1 m x 60 cm) rempli d'eau à mi-hauteur. Dans cette eau, on a vidé le contenu de
sommes adressés, pour la production massive de virus sec, à la puce du rat « Xenopsylla cheopis » sur laquelle nous poursuivions depuis plusieurs années des travaux expérimentaux, qui nous avaient donné l'expérience, et des questions techniques d'élevage, de manipulation, etc..., et des détails de comportement chez cette puce du virus du typhus murin. Des élevages importants ont été constitués en partant d'un élevage originel formé de Xenopsylla cheopis récoltées dans la nature et identifiées une à une sous la loupe binoculaire. Ce genre de manipulation a été rendu commode et sans danger d'évasion, par l'emploi de la technique suivante. Les nasses contenant des rats sauvages capturés dans la nature sont apportées au laboratoire; ces nasses sont déposées sur un petit plateau retourné au centre d'un grand plateau en tôle émaillée blanche (1 m x 60 cm) rempli d'eau à mi-hauteur. Dans cette eau, on a vidé le contenu de trois tiroirs de glacière soit environ une centaine de petits cubes de glace, la température de l'eau descend à environ +8°. Les rats sont étranglés dans la nasse, à travers le grillage, à l'aide d'une longue pince (type pince à col). Les puces abandonnent aussitôt le cadavre et l'on chasse les dernières d'entre elles de la fourrure des rats en soufflant à rebrousse poil sur le cadavre soit avec la bouche, soit mieux avec le courant d'air froid d'un petit séchoir à cheveux. Les puces sautent dans l'eau du grand plateau où elles sont immédiatement immobilisées par le froid et peuvent être facilement recueillies et manipulées. Ainsi, pour l'examen en série des puces sous la loupe binoculaire, les puces immobiles sont rangées par files de 10 sur des lames également refroidies ; apportées sous la loupe, les lames sont déposées sur le fond d'un tiroir de glace retourné, ce qui permet de prolonger l'examen aussi longtemps qu'il est nécessaire. Tant que dure l'action du froid, les puces sont strictement paralysées et reprennent leur activité dès que cesse cette action. Les puces, ainsi récoltées et triées, sont mises dans un tonneau de verre de 10 litres, au fond garni d'un lit
les dernières d'entre elles de la fourrure des rats en soufflant à rebrousse poil sur le cadavre soit avec la bouche, soit mieux avec le courant d'air froid d'un petit séchoir à cheveux. Les puces sautent dans l'eau du grand plateau où elles sont immédiatement immobilisées par le froid et peuvent être facilement recueillies et manipulées. Ainsi, pour l'examen en série des puces sous la loupe binoculaire, les puces immobiles sont rangées par files de 10 sur des lames également refroidies ; apportées sous la loupe, les lames sont déposées sur le fond d'un tiroir de glace retourné, ce qui permet de prolonger l'examen aussi longtemps qu'il est nécessaire. Tant que dure l'action du froid, les puces sont strictement paralysées et reprennent leur activité dès que cesse cette action. Les puces, ainsi récoltées et triées, sont mises dans un tonneau de verre de 10 litres, au fond garni d'un lit de son d'une épaisseur de 5 cm environ. Dans ce tonneau est mis un rat blanc dont les incisives inférieures ont été sectionnées, ce rat est nourri de pain mouillé et de morceaux de feuilles de chou. Les puces piquent et s'accouplent, les femelles vont pondre dans le son, où l'humidité entretenue par les urines du rat, les débris végétaux et la condensation favorisera l'éclosion des œufs. Les larves trouveront leur nourriture dans les déjections des puces et les débris de toutes sortes ainsi que la poussière de son. Dès le dixième jour de fonctionnement d'un tel bocal, les larves grouillent dans le son. Après 20 à 40 jours, selon la saison et la température, le rat est sorti de la cuve avec ses puces et mis dans un autre bocal. Trois à quatre jours plus tard, les dernières puces restées dans le son montent à la surface et sont récoltées. Les larves forment leur cocon et s'immobilisent, le bocal est mis à l'obscurité à l'étuve à 28°. Puis les éclosions commencent ; les puces nouvelles écloses, reconnaissables à leur couleur claire, sautent en très grand nombre à la surface du son. C'est avec ces puces, qui ont devant elles
l'humidité entretenue par les urines du rat, les débris végétaux et la condensation favorisera l'éclosion des œufs. Les larves trouveront leur nourriture dans les déjections des puces et les débris de toutes sortes ainsi que la poussière de son. Dès le dixième jour de fonctionnement d'un tel bocal, les larves grouillent dans le son. Après 20 à 40 jours, selon la saison et la température, le rat est sorti de la cuve avec ses puces et mis dans un autre bocal. Trois à quatre jours plus tard, les dernières puces restées dans le son montent à la surface et sont récoltées. Les larves forment leur cocon et s'immobilisent, le bocal est mis à l'obscurité à l'étuve à 28°. Puis les éclosions commencent ; les puces nouvelles écloses, reconnaissables à leur couleur claire, sautent en très grand nombre à la surface du son. C'est avec ces puces, qui ont devant elles des mois de longévité, que sont entreprises les expériences. La nécessité d'intensifier nos élevages nous amenait rapidement à abandonner le système du bocal, difficile à multiplier sans risque d'insécurité. Au début de 1938, nous commandions à une fabrique de céramique 10 cuves en granit-porcelaine d'un modèle spécial, devant permettre l'expérimentation avec tous les ectoparasites aptères, et plus spécialement l'élevage en grand de Xenopsylla cheopis. Ces cuves, destinées à être dans la suite enchâssées dans une banquette de maçonnerie carrelée et à faire partie d'un bâtiment spécialement conçu pour cette sorte d'expérimentation, étaient mises provisoirement dans une pièce isolée, à tambour et double porte. étanche. Profondes, à parois absolument lisses, de large ouverture défendue par une rigole pleine d'huile, ces cuves pouvaient permettre toutes les manipulations nécessaires sans aucun danger d'évasion ; très vastes, elles pouvaient contenir plusieurs rats ou cobayes permettant l'élevage de plus de 50.000 puces dans chaque cuve. Plusieurs de ces cuves furent réservées pour l'élevage des puces neuves, deux d'entre elles étant consacrées à la récolte du virus murin, selon la technique suivante. Dans chaque cuve contenant 50.000 Xenopsylla cheopis environ, neuves, récemment écloses, n'ayant encore jamais piqué, on met deux rats blancs, inoculés 48 heures plus
avec tous les ectoparasites aptères, et plus spécialement l'élevage en grand de Xenopsylla cheopis. Ces cuves, destinées à être dans la suite enchâssées dans une banquette de maçonnerie carrelée et à faire partie d'un bâtiment spécialement conçu pour cette sorte d'expérimentation, étaient mises provisoirement dans une pièce isolée, à tambour et double porte. étanche. Profondes, à parois absolument lisses, de large ouverture défendue par une rigole pleine d'huile, ces cuves pouvaient permettre toutes les manipulations nécessaires sans aucun danger d'évasion ; très vastes, elles pouvaient contenir plusieurs rats ou cobayes permettant l'élevage de plus de 50.000 puces dans chaque cuve. Plusieurs de ces cuves furent réservées pour l'élevage des puces neuves, deux d'entre elles étant consacrées à la récolte du virus murin, selon la technique suivante. Dans chaque cuve contenant 50.000 Xenopsylla cheopis environ, neuves, récemment écloses, n'ayant encore jamais piqué, on met deux rats blancs, inoculés 48 heures plus tôt avec le virus de typhus murin T.M.C. III de passage-cobaye. Ces rats meurent, en général, rapidement ou sont sacrifiés au bout de 48 heures ; les cadavres sont débarrassés de leurs puces et incinérés. On met aussitôt dans les cuves d'autres rats blancs inoculés de la même manière et ainsi de suite tous les deux jours. Dès la fin de la deuxième semaine, toutes les puces étant dûment infectées, les récoltes commencent. Toutes les 48 heures, les rats agonisants sont sacrifiés et soigneusement épilés. Les poils, englués de déjections de puces sont mis au dessiccateur, sous le vide, en présence de chlorure de calcium anhydre. Le lendemain, les déjections desséchées sont facilement séparées des poils par tamisage sur des soies à bluter de calibre décroissant ; après la récolte, la poudre fine obtenue est conservée dans des ampoules scellées sous le vide d'une pompe rotative à l'huile. Tous les quinze jours, les puces infectées sont transférées dans une autre cuve, afin d'éviter l'éclosion de puces neuves, nées de leurs pontes. Pendant toute la durée des récoltes d'ailleurs, on ne mettra dans la cuve que des rats inoculés avec le virus de passage-cobaye, de façon à obtenir un renforcement continuel