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opérations sont ensuite les mêmes que pour le dosage de l'extrait lipoïdique total. Le dosage du phosphore dans cet extrait est fait par la méthode de MACHEBŒUF. DOSAGE DES LIPIDES A. — EXTRAIT LIPOÏDIQUE TOTAL : On verse goutte à goutte le sérum dans l'alcool; on obtient ainsi un précipité finement coagulé. Celui-ci est porté au bain marie; quand l'alcool a bouilli quelques minutes, les protéides sont sûrement dénaturés. On filtre alors sur cartouche de DURIEUX (soigneusement dégraissée par une extraction êthérée au KUMAGAWA). L'alcool est recueilli et le coagulum épuisé à l'alcool dans l'appareil de KUMAGAWA pendant dix heures et à l'éther pendant trois heures suivant les prescriptions de M. JAVILLIER. On distille les liqueurs alcoolique et éthérée dans un ballon à fond rond de un litre en s'aidant du vide. Le résidu est désséché par deux affusions successives d'alcool absolu. La distillation dans le vide diminue l'altération de l'extrait (et surtout des phosphatides) en abaissant la température à laquelle le solvant est chassé et en permettant d'opérer à l'abri de l'air. On laisse refroidir sous vide et on reprend par l'éther anhydre sous réfrigérant ascendant à l'ébullition pendant 10 à 15 minutes; on recommence deux fois cette opération. Les liqueurs éthérées sont filtrées dans une fiole tarée, l'éther évaporé et le résidu désséché pendant 8 heures à 50°. On met la fiole à l'exsiccateur à vide et on pèse après une demi-heure. B. INSAPONIFIABLE ET ACIDES GRAS TOTAUX : Cette technique est à quelques détails près celle qui est indiquée par LEMELAND. 1) Saponification : A l'extrait lipoïdique on ajoute 25 cc de potasse alcoolique 2N et on porte au bain marie bouillant sous réfrigérant ascendant pendant deux heures pour saponifier les lipides. Le volume est amené à 100 cc, le titre alcoolique à 50° et l'alcalinité à 1, par addition de : 40 cc d'acide chlorhydrique — Par un nouveau chauffage à reflux de 20 minutes, on assure la salification totale des acides gras qui ont pu être libérés par adjonction brusque d'acide; on laisse refroidir. 2) Séparation quantitative de l'insaponifiable total : On fait passer le
Les liqueurs éthérées sont filtrées dans une fiole tarée, l'éther évaporé et le résidu désséché pendant 8 heures à 50°. On met la fiole à l'exsiccateur à vide et on pèse après une demi-heure. B. INSAPONIFIABLE ET ACIDES GRAS TOTAUX : Cette technique est à quelques détails près celle qui est indiquée par LEMELAND. 1) Saponification : A l'extrait lipoïdique on ajoute 25 cc de potasse alcoolique 2N et on porte au bain marie bouillant sous réfrigérant ascendant pendant deux heures pour saponifier les lipides. Le volume est amené à 100 cc, le titre alcoolique à 50° et l'alcalinité à 1, par addition de : 40 cc d'acide chlorhydrique — Par un nouveau chauffage à reflux de 20 minutes, on assure la salification totale des acides gras qui ont pu être libérés par adjonction brusque d'acide; on laisse refroidir. 2) Séparation quantitative de l'insaponifiable total : On fait passer le contenu du ballon dans une ampoule à décanter de 200 cc. A l'aide d'une éprouvette graduée, on mesure 100 cc d'éther de pétrole léger (E < 60°; 0,650 < d < 0,660) qu'on verse dans un ballon et de celui-ci dans l'ampoule (on évite ainsi l'emploi du liquide de rinçage) Après une forte agitation, on soutire la couche hydro-alcoolique dans le ballon de 1 litre et on verse la couche éthéro-pétrolique par le goulot de l'ampoule dans une autre ampoule à décanter. On recommence une deuxième fois cette opération avec 50 cc d'éther de pétrole, une troisième fois avec 40 cc, une quatrième fois avec 40 cc. On lave alors ces 230 cc d'éther de pétrole avec 50 cc d'eau additionnée de quelques gouttes de soude que l'on verse le long des parois sans agiter pour éviter l'émulsion. 3) Séparation des acides gras : Le liquide contenu dans le ballon de un litre est versé dans un bécher de 250 cc. On y ajoute les 50 cc d'eau de lavage de la solution éthéro-pétrolique en ayant soin d'éviter tout passage de cette solution dans le liquide contenant les acides gras. On évapore au bain-marie le liquide hydro-alcoolique contenant les acides
Après une forte agitation, on soutire la couche hydro-alcoolique dans le ballon de 1 litre et on verse la couche éthéro-pétrolique par le goulot de l'ampoule dans une autre ampoule à décanter. On recommence une deuxième fois cette opération avec 50 cc d'éther de pétrole, une troisième fois avec 40 cc, une quatrième fois avec 40 cc. On lave alors ces 230 cc d'éther de pétrole avec 50 cc d'eau additionnée de quelques gouttes de soude que l'on verse le long des parois sans agiter pour éviter l'émulsion. 3) Séparation des acides gras : Le liquide contenu dans le ballon de un litre est versé dans un bécher de 250 cc. On y ajoute les 50 cc d'eau de lavage de la solution éthéro-pétrolique en ayant soin d'éviter tout passage de cette solution dans le liquide contenant les acides gras. On évapore au bain-marie le liquide hydro-alcoolique contenant les acides gras pour chasser l'éther de pétrole et l'alcool. Cette opération est réalisée quand on a évaporé le liquide jusqu'à moitié environ de son volume primitif. Cette solution alcaline est alors transvasée dans une ampoule de 250 cc, acidifiée nettement (5 cc d'acide chlorhydrique au tiers) et épuisée trois fois par l'éther en suivant la technique qui vient d'être décrite pour l'éther de pétrole. 4) Dosage de l'insaponifiable total : La solution éthéro-pétrolique de 1'1. T. est versée dans un ballon à long col et à fond rond de 500 cc et distillée au bain-marie électrique pour chasser le solvant. Dès que le volume est réduit à quelques cc, on branche sur la trompe à vide, le vide étant poussé à son maximum. Les dernières traces d'éther de pétrole sont alors aspirées, on laisse refroidir sous le vide et on reprend par 10 cc d'alcool absolu contenant 10 % de soude. On transvase quantitativement dans une fiole de FOURNEAU en rinçant avec quelques cc d'alcool absolu et on évapore au bain-marie bouillant. Dès siccité, on place la fiole dans l'étuve à 50°. On l'enlève au bout de 8 heures et on verse 15 à 20 cc d'éther de pétrole léger (30<E<50")
l'éther en suivant la technique qui vient d'être décrite pour l'éther de pétrole. 4) Dosage de l'insaponifiable total : La solution éthéro-pétrolique de 1'1. T. est versée dans un ballon à long col et à fond rond de 500 cc et distillée au bain-marie électrique pour chasser le solvant. Dès que le volume est réduit à quelques cc, on branche sur la trompe à vide, le vide étant poussé à son maximum. Les dernières traces d'éther de pétrole sont alors aspirées, on laisse refroidir sous le vide et on reprend par 10 cc d'alcool absolu contenant 10 % de soude. On transvase quantitativement dans une fiole de FOURNEAU en rinçant avec quelques cc d'alcool absolu et on évapore au bain-marie bouillant. Dès siccité, on place la fiole dans l'étuve à 50°. On l'enlève au bout de 8 heures et on verse 15 à 20 cc d'éther de pétrole léger (30<E<50") dans la fiole encore chaude. Après dissolution, on filtre sur filtre d'amiante dans une fiole de FOURNEAU tarée en rinçant la fiole à trois ou quatre reprises avec de l'éther de pétrole. On laisse évaporer doucement, ce qui se fait très commodément en laissant toute la nuit la fiole couverte d'un papier filtre sur le dessus de l'étuve à 50°. Le lendemain matin, le solvant est évaporé. On place à nouveau une heure dans l'étuve à 50°, on laisse refroidir sous vide dans un exsiccateur à acide sulfurique et on pèse au bout d'une demi-heure, 5) Dosage des acides gras totaux : La solution éthérée des A. G. est transvasée dans un ballon de 500 cc, distillée et séchée dans le vide, on reprend le résidu par l'éther de pétrole léger, on filtre sur amiante dans une fiole de FOURNEAU tarée. L'évaporation, la dessiccation et la pesée sont faites dans les mêmes conditions que pour l'I. T. (*) I.T. désigne l'insaponifiable total. A.G. désigne les acides gras totaux. 6) Dosage du cholestérol : Le cholestérol est dosé par la méthode de WINDAUS modifiée par CAMINADE [8]. On dissout dans la fiole de FOURNEAU même l'I. T. dans la quantité minima
d'un papier filtre sur le dessus de l'étuve à 50°. Le lendemain matin, le solvant est évaporé. On place à nouveau une heure dans l'étuve à 50°, on laisse refroidir sous vide dans un exsiccateur à acide sulfurique et on pèse au bout d'une demi-heure, 5) Dosage des acides gras totaux : La solution éthérée des A. G. est transvasée dans un ballon de 500 cc, distillée et séchée dans le vide, on reprend le résidu par l'éther de pétrole léger, on filtre sur amiante dans une fiole de FOURNEAU tarée. L'évaporation, la dessiccation et la pesée sont faites dans les mêmes conditions que pour l'I. T. (*) I.T. désigne l'insaponifiable total. A.G. désigne les acides gras totaux. 6) Dosage du cholestérol : Le cholestérol est dosé par la méthode de WINDAUS modifiée par CAMINADE [8]. On dissout dans la fiole de FOURNEAU même l'I. T. dans la quantité minima de liquide E. A. C. (*) nécessaire pour le dissoudre à l'ébullition. On ajoute alors quatre à six fois (suivant les cas) son poids de digitonide dissous dans le liquide E. A. C. et on porte à nouveau au bain-marie jusqu'à commencement d'ébullition. Après quelques minutes, on jette le précipité sur un filtre d'amiante monté sur fiole à vide. On lave trois fois à l'eau bouillante, ensuite avec quelques cc de mélange E. A. C. et enfin à l'éther. On sèche environ 45 minutes à l'étuve à 100° et on laisse refroidir 30 minutes dans un exsiccateur sous vide en présence d'acide sulfurique dans les mêmes conditions que le filtre vide. Le poids obtenu, multiplié par 0,2431 représente le cholestérol de la prise d'essai. DOSAGE DES PROTEÏDES A. PROTEÏDES TOTAUX Il existe de nombreuses méthodes pour doser les protides totaux du sérum. 1. Réfractométrie : REISS a montré que l'indice de réfraction du sérum était surtout fonction de sa teneur en protides. Il a donné un tableau de correspondance entre le chiffre lu au réfractomètre à immersion et le taux albumineux. Cette méthode est rapide et commode mais ne donne que des résultats tout à fait approximatifs (GUILLAUMIN, WAHL et
sur un filtre d'amiante monté sur fiole à vide. On lave trois fois à l'eau bouillante, ensuite avec quelques cc de mélange E. A. C. et enfin à l'éther. On sèche environ 45 minutes à l'étuve à 100° et on laisse refroidir 30 minutes dans un exsiccateur sous vide en présence d'acide sulfurique dans les mêmes conditions que le filtre vide. Le poids obtenu, multiplié par 0,2431 représente le cholestérol de la prise d'essai. DOSAGE DES PROTEÏDES A. PROTEÏDES TOTAUX Il existe de nombreuses méthodes pour doser les protides totaux du sérum. 1. Réfractométrie : REISS a montré que l'indice de réfraction du sérum était surtout fonction de sa teneur en protides. Il a donné un tableau de correspondance entre le chiffre lu au réfractomètre à immersion et le taux albumineux. Cette méthode est rapide et commode mais ne donne que des résultats tout à fait approximatifs (GUILLAUMIN, WAHL et LAURENCIN) [9] et d'autant plus inexacts que le sérum est plus riche en lipides. Nous ne l'avons employée qu'à titre indicatif. 2. Azotométrie : Cette méthode consiste à doser l'azote et à multiplier par l'équivalent azotométrique. Mais celui-ci est assez variable et dépend des proportions de globulines et d'albumines; Nous n'avons pas employé cette méthode. 3. Pesée : La meilleure méthode est celle qui a été décrite par GRIGAUT, BOUTROUX et CODOUNIS [10] et que nous appliquons ainsi : Le résidu protidique délipidé contenu dans la cartouche de l'appareil de KUMAGAWA après les épuisements alcoolique et éthéré, est introduit dans un filtre à plaque de verre poreux d'Iéna, lavé à l'eau bouillante jusqu'à ce que celle-ci ne précipite plus par le nitrate d'argent, séché à 100° jusqu'à poids constant et pesé. Quand on veut simplement doser les protides sans tenir compte des lipides on peut se servir de la méthode de KAYSER qui donne des protides moins bien débarrassés de lipides et de sels mais qui convient dans un grand nombre de cas. Méthode de KAYSER : [11] Dans un vase à précipiter, verser 50 cc d'un mélange à volumes égaux d'alcool et d'acétone. Agiter et verser par petites portions,
n'avons pas employé cette méthode. 3. Pesée : La meilleure méthode est celle qui a été décrite par GRIGAUT, BOUTROUX et CODOUNIS [10] et que nous appliquons ainsi : Le résidu protidique délipidé contenu dans la cartouche de l'appareil de KUMAGAWA après les épuisements alcoolique et éthéré, est introduit dans un filtre à plaque de verre poreux d'Iéna, lavé à l'eau bouillante jusqu'à ce que celle-ci ne précipite plus par le nitrate d'argent, séché à 100° jusqu'à poids constant et pesé. Quand on veut simplement doser les protides sans tenir compte des lipides on peut se servir de la méthode de KAYSER qui donne des protides moins bien débarrassés de lipides et de sels mais qui convient dans un grand nombre de cas. Méthode de KAYSER : [11] Dans un vase à précipiter, verser 50 cc d'un mélange à volumes égaux d'alcool et d'acétone. Agiter et verser par petites portions, et en agitant continuellement, 5 cc de sérum sanguin, attendre quelques minutes et filtrer sur un filtre d'Iéna G3. Recueillir les parcelles de précipité qui adhèrent au fond du vase, au moyen de quelques centimètres cubes d'alcool à 95°. Laver deux fois le filtre avec un peu d'alcool. Dessécher le filtre à l'étuve jusqu'à poids constant. Ce poids multiplié par 200 exprime le poids des protides totaux contenus dans un litre de sérum. On peut aussi utiliser 2 cc, 5 cc de sérum avec 30 cc du mélange alcool-acétone, 1 cc de sérum avec 20 cc du mélange. B. GLOBULINES ET ALBUMINES Nous avons employé deux méthodes différentes suivant la quantité de sérum dont nous pouvions disposer. Celle de MACHEBÉAU appliquée généralement à 25 cc de sérum, celle de HOWE modifiée par LEFROUX et BONNET, appliquée à 1 ou 2 cc de sérum. A. Méthode de MACHEBÉAU ; [12]. Au volume prélevé de sérum on ajoute un égal volume d'une solution saturée de sulfate d'ammonium neutralisée par l'ammoniaque. Après quinze à vingt minutes de contact, le précipité est centrifugé, séparé de ses eaux-mères, remis en solution par addition d'un demi-volume d'eau distillée et précipité à nouveau par un demi-volume de
filtre à l'étuve jusqu'à poids constant. Ce poids multiplié par 200 exprime le poids des protides totaux contenus dans un litre de sérum. On peut aussi utiliser 2 cc, 5 cc de sérum avec 30 cc du mélange alcool-acétone, 1 cc de sérum avec 20 cc du mélange. B. GLOBULINES ET ALBUMINES Nous avons employé deux méthodes différentes suivant la quantité de sérum dont nous pouvions disposer. Celle de MACHEBÉAU appliquée généralement à 25 cc de sérum, celle de HOWE modifiée par LEFROUX et BONNET, appliquée à 1 ou 2 cc de sérum. A. Méthode de MACHEBÉAU ; [12]. Au volume prélevé de sérum on ajoute un égal volume d'une solution saturée de sulfate d'ammonium neutralisée par l'ammoniaque. Après quinze à vingt minutes de contact, le précipité est centrifugé, séparé de ses eaux-mères, remis en solution par addition d'un demi-volume d'eau distillée et précipité à nouveau par un demi-volume de sulfate d'ammonium. On recommence encore une fois cette opération pour avoir des globulines ne contenant plus d'albumines. Le culot de globulines est dissous dans la quantité minima d'eau distillée. La totalité des eaux-mères est additionnée du dixième de son volume de sulfate d'ammonium saturé et d'acide sulfurique jusqu'à pH 3,8 ou 3,9 (nous opérons par le procédé à la touche en employant le bleu de bromophénol comme indicateur). On laisse en contact une vingtaine de minutes et on centrifuge. Les eaux-mères sont éliminées (on s'assure au préalable qu'elles ne contiennent plus que des traces de protéides en ajoutant quelques centimètres cubes d'acide trichloracétique et en chauffant). Le culot d'albumine est délayé dans une faible quantité d'eau distillée (2 à 3 cc) ajoutée très progressivement quelques gouttes d'ammoniaque diluée suffisent alors à opérer la dissolution, dès que la neutralité est réalisée. Les solutions globulinique et albuminique sont ensuite précipitées par l'alcool à 96°. Le coagulum obtenu est traité comme celui qui provient du sérum. B. — Méthode de HOWE (modifiée par LEFROU et BONNET) [13]. a) Dosage de la sérine. — Dans un Erlenmeyer de 150 cc bouché à l'embout verser : 1 cc de sérum et 30 cc de solution
ou 3,9 (nous opérons par le procédé à la touche en employant le bleu de bromophénol comme indicateur). On laisse en contact une vingtaine de minutes et on centrifuge. Les eaux-mères sont éliminées (on s'assure au préalable qu'elles ne contiennent plus que des traces de protéides en ajoutant quelques centimètres cubes d'acide trichloracétique et en chauffant). Le culot d'albumine est délayé dans une faible quantité d'eau distillée (2 à 3 cc) ajoutée très progressivement quelques gouttes d'ammoniaque diluée suffisent alors à opérer la dissolution, dès que la neutralité est réalisée. Les solutions globulinique et albuminique sont ensuite précipitées par l'alcool à 96°. Le coagulum obtenu est traité comme celui qui provient du sérum. B. — Méthode de HOWE (modifiée par LEFROU et BONNET) [13]. a) Dosage de la sérine. — Dans un Erlenmeyer de 150 cc bouché à l'embout verser : 1 cc de sérum et 30 cc de solution à 222 grs. par litre de sulfate de soude anhydre. Cette solution tombera goutte à goutte en imprimant un mouvement de rotation au vase, pour éviter que le précipité adhère au fond du récipient. Ajouter un cristal de thymol, porter à l'étuve à 37° (pour éviter la cristallisation du sel à basse température) au moins 3 heures. Jeter le précipité obtenu sur filtre d'Iéna G4. Recueillir le liquide dans un vase très propre, en prélever 25 cc que l'on additionnera de 0,5 cc de formol et de 10 gouttes d'acide acétique. Porter à l'ébullition, laisser refroidir. Le précipité albuminique est jeté sur filtre d'Iéna G4. Laver abondamment ce précipité avec de l'eau chaude additionnée d'acide acétique (5 cc d'acide pour un litre d'eau). Arrêter les lavages lorsque le filtrat ne précipite plus par quelques gouttes de chlorure de baryum au 1/10ème, ce qui indique que le précipité de sérine n'est plus souillé par le sulfate de soude. Laver alors le filtre avec quelques centimètres cubes d'alcool-éther (à parties égales), ce qui permettra une dessication plus rapide. Porter à l'étuve jusqu'à poids constant. Soit p le poids trouvé. La quantité de sérine par litre de sérum sera donc : S =
à basse température) au moins 3 heures. Jeter le précipité obtenu sur filtre d'Iéna G4. Recueillir le liquide dans un vase très propre, en prélever 25 cc que l'on additionnera de 0,5 cc de formol et de 10 gouttes d'acide acétique. Porter à l'ébullition, laisser refroidir. Le précipité albuminique est jeté sur filtre d'Iéna G4. Laver abondamment ce précipité avec de l'eau chaude additionnée d'acide acétique (5 cc d'acide pour un litre d'eau). Arrêter les lavages lorsque le filtrat ne précipite plus par quelques gouttes de chlorure de baryum au 1/10ème, ce qui indique que le précipité de sérine n'est plus souillé par le sulfate de soude. Laver alors le filtre avec quelques centimètres cubes d'alcool-éther (à parties égales), ce qui permettra une dessication plus rapide. Porter à l'étuve jusqu'à poids constant. Soit p le poids trouvé. La quantité de sérine par litre de sérum sera donc : S = p x 1 x 1.000 = p x 1,24 x 1.000 b) Dosage direct de la globuline. — Le précipité de globuline obtenu par la méthode précédente a été recueilli sur filtre taré. Lorsque la filtration est complètement terminée et que l'on a prélevé les 25 cc de filtrat nécessaires au dosage de la sérine, on lave le précipité de globuline avec la solution de sulfate de soude pour entraîner les dernières traces de sérine. On s'aperçoit qu'il n'y a plus de sérum-albumine sur le filtre en additionnant le filtrat d'acide acétique et de formol et en portant à l'ébullition, aucun roux ne doit se produire. Le filtre est alors desséché à l'air et porté à l'étuve à 100° pour coaguler la globuline. Ce résultat obtenu, il est lavé à l'eau bouillante acétique pour enlever les dernières traces de sulfate de soude (précipitation du chlorure de baryum à 10 %), enfin additionné de quelques centimètres cubes d'alcool-éther. Il est alors reporté à l'étuve jusqu'à poids constant ; on obtient ainsi le poids de globuline contenue dans 1 cc de sérum. BIBLIOGRAPHIE 1 — LAUDAT (M.) : Le dosage de l'urée dans le sang à l'état normal et au cours des
au dosage de la sérine, on lave le précipité de globuline avec la solution de sulfate de soude pour entraîner les dernières traces de sérine. On s'aperçoit qu'il n'y a plus de sérum-albumine sur le filtre en additionnant le filtrat d'acide acétique et de formol et en portant à l'ébullition, aucun roux ne doit se produire. Le filtre est alors desséché à l'air et porté à l'étuve à 100° pour coaguler la globuline. Ce résultat obtenu, il est lavé à l'eau bouillante acétique pour enlever les dernières traces de sulfate de soude (précipitation du chlorure de baryum à 10 %), enfin additionné de quelques centimètres cubes d'alcool-éther. Il est alors reporté à l'étuve jusqu'à poids constant ; on obtient ainsi le poids de globuline contenue dans 1 cc de sérum. BIBLIOGRAPHIE 1 — LAUDAT (M.) : Le dosage de l'urée dans le sang à l'état normal et au cours des états pathologiques. Résultats comparatifs obtenus par les méthodes à l'hypobromite et au xanthydrol. C. R. Soc. Biol., 1920, 83, 730. 2 — FLEURY (P.) : Techniques de chimie biologique. Faculté de Pharmacie de Paris (1930). 3 — ROBERT (J.) : Sur l'emploi des filtres d'amiante pour le microdosage de l'urée. Bull. Soc. Chim. Biol., 1931, 13, 1178. 4 — MACHEBŒUF (M ) : Méthode permettant le dosage exact du phosphore dans de petites quantités de sang. Bull. Soc. Chim. biol., 1926, 8, 464. 5 — JAVILLIER (M.) et FABRYKANT (M.) : Le phosphore sanguin chez l'homme. Bull. Soc. Chim. biol., 1931, 13, 685. 6 — JAVILLIER (M.) et ALLAIRE (H.) : Sur la technique de dosage du phosphore nucléoprotéidique. Bull Soc. Chim. biol., 1931, 13, 678. 7 — LEMELAND (P.) : Recherches sur le dosage des lipoïdes dans le sang et les tissus. Nouvelle méthode de dosage de l'insaponifiable total et des acides gras totaux. Bull. Soc. Chim. biol., 1923, 5, 110. 8 — CAMINADE (R.) : Sur quelques modifications apportées au dosage de la cholestérine par la méthode de Windaus. Bull. Soc. Chim. biol., 1922, 4, 601. 9 — GUILLAUMIN (Ch. O.) WAHL et LAURENCIN ; Sur le dosage