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état tout à fait particulier. Le sérum, prélevé dans les conditions énoncées, est parfaitement limpide et presque optiquement vide (LECOMTE DU NOUY) [14]. Dans certains cas physiologiques (sérum d'anguille) ou pathologiques (sérum de néphrose lipoïdique) le taux des lipides peut s'élever au chiffre énorme de 40 gr. par litre sans que le sérum cesse d'être parfaitement clair et homogène. D'ailleurs si les lipides qui sont insolubles dans l'eau se trouvaient à l'état libre dans le sérum, ils formeraient une suspension fortement opalescente, extrêmement riche en particules décelables à l'ultramicroscope. Les solvants des graisses (éther, benzène, chloroforme etc...) n'en arrachent au sérum que des quantités infimes (1 à 5 % en moyenne). MACHEBŒUF et WAHL, (1931) montrent l'extraordinaire résistance des lipides du sérum à l'extraction éthérée. Ainsi au bout de 5 mois d'extractions répétées trois fois par semaine, ils n'avaient libéré que le tiers des lipides totaux ; au bout d'un an, un peu moins de la moitié. Les lipides sont entraînés avec les protéides dans les précipités réversibles que donnent avec le sérum les solutions concentrées de sulfates alcalins et alcalino-terreux. Ainsi, il existe en solution homogène dans le milieu aqueux des lipides cachés à leurs réactifs et des protéides qui réagissent avec les leurs. Tout se passe comme si les protéides du sérum augmentaient la solubilité des lipides dans la phase aqueuse et les stabilisaient par un processus de « protection colloïdale ». NEUSCHLOSZ parle de solution d'un colloïde dans un autre ; cela ne résout pas le problème. Les travaux sur les relations entre protéides et lipides du sérum sont très nombreux mais souvent confus, cette question n'étant généralement traitée qu'accessoirement au cours de recherches sur le fractionnement des protéides ou le dosage des substances lipoïdiques. PHOSPHORE DES PROTÉIDES ARONHEIM, élève de HOPPE-SEYLER, semble être le premier auteur qui se soit attaché à l'étude du phosphore des protéides. Il montre que la globuline du sérum de cheval contient du phosphore extractible par l'alcool et l'éther. A ce protéide est donc lié un lecithide. Vers le début du siècle, le fractionnement des globulines faisait l'objet de nombreux travaux ;
qui réagissent avec les leurs. Tout se passe comme si les protéides du sérum augmentaient la solubilité des lipides dans la phase aqueuse et les stabilisaient par un processus de « protection colloïdale ». NEUSCHLOSZ parle de solution d'un colloïde dans un autre ; cela ne résout pas le problème. Les travaux sur les relations entre protéides et lipides du sérum sont très nombreux mais souvent confus, cette question n'étant généralement traitée qu'accessoirement au cours de recherches sur le fractionnement des protéides ou le dosage des substances lipoïdiques. PHOSPHORE DES PROTÉIDES ARONHEIM, élève de HOPPE-SEYLER, semble être le premier auteur qui se soit attaché à l'étude du phosphore des protéides. Il montre que la globuline du sérum de cheval contient du phosphore extractible par l'alcool et l'éther. A ce protéide est donc lié un lecithide. Vers le début du siècle, le fractionnement des globulines faisait l'objet de nombreux travaux ; certains savants se demandent si les différentes fractions globuliniques ne peuvent être caractérisées par leur teneur en phosphore. Ces vues théoriques sont le point de départ des recherches de HARDY (1905) et HASLAM (1913) qui montrent que le phosphore caractérise l'euglobuline alors que la pseudoglobuline en est dépourvue. Cette constatation donne naissance à une théorie d'abord soutenue par HANDOWSKY et WAGNER puis par Mme Harriette CHICK qui essaie d'établir que l'euglobuline est un complexe formé par l'union de la pseudoglobuline avec un phosphoaminolipide. H. CHICK sépare l'euglobuline par le sulfate d'ammonium au tiers de saturation, puis la pseudoglobuline par ce sel à demi-saturation. Par dialyse de la pseudoglobuline il précipite un protéide ayant les caractères de l'euglobuline et contenant toujours de la lécithine. Après avoir séparé l'euglobuline ainsi formée, il reste un protéide qui ne contient plus de phosphore. Si on ajoute de la lécithine au milieu, il y a néoformation d'euglobuline jusqu'à ce que toute la lécithine soit utilisée. SÉPARATION QUANTITATIVE DES SUBSTANCES LIPOIDIQUES A côté de ces recherches d'ordre théorique, il faut citer des travaux qui ont pour but le dosage des lipides et des protéides. Les méthodes de séparation précédemment employées étaient défectueuses ; l'extraction des lipides
donne naissance à une théorie d'abord soutenue par HANDOWSKY et WAGNER puis par Mme Harriette CHICK qui essaie d'établir que l'euglobuline est un complexe formé par l'union de la pseudoglobuline avec un phosphoaminolipide. H. CHICK sépare l'euglobuline par le sulfate d'ammonium au tiers de saturation, puis la pseudoglobuline par ce sel à demi-saturation. Par dialyse de la pseudoglobuline il précipite un protéide ayant les caractères de l'euglobuline et contenant toujours de la lécithine. Après avoir séparé l'euglobuline ainsi formée, il reste un protéide qui ne contient plus de phosphore. Si on ajoute de la lécithine au milieu, il y a néoformation d'euglobuline jusqu'à ce que toute la lécithine soit utilisée. SÉPARATION QUANTITATIVE DES SUBSTANCES LIPOIDIQUES A côté de ces recherches d'ordre théorique, il faut citer des travaux qui ont pour but le dosage des lipides et des protéides. Les méthodes de séparation précédemment employées étaient défectueuses ; l'extraction des lipides était incomplète. KUMAGAWA et SUTO (1908) instituent leur méthode de dosage des lipides sur un matériel de recherches unique : la poudre de viande desséchée. Elle comporte essentiellement une saponification aqueuse suivie d'une extraction éthérée. C'est LEATHES (1909) qui conseille l'emploi d'alcool pour permettre la dissolution des savons formés et SHIMIDZU (1910) qui met au point la méthode d'extraction continue par l'alcool bouillant dans l'appareil de KUMAGAWA, technique dont le principe est universellement adopté aujourd'hui. GRIGAUT (1912) indique deux méthodes de dosage du cholestérol. Sa méthode colorimétrique est la plus connue ; elle consiste essentiellement à rendre le cholestérol soluble dans l'éther par l'alcool en milieu alcalin. Le dosage est ensuite effectué en utilisant la réaction colorimétrique de LIEBERMANN. Le cholestérol ne se trouvant pas à l'état libre dans le sérum, l'auteur suppose qu'il est engagé avec les protéides dans des complexes qu'il appelle protéocholestérides mais il ne donne aucune preuve directe de leur existence. Ce terme, d'ailleurs, non conforme aux règles actuelles de la nomenclature chimique, ne peut être conservé. EXTRACTION DES LIPIDES DU SÉRUM À BASSE TEMPÉRATURE Pour étudier le rôle des lipides sériques, la méthode la plus rigoureuse consistait à comparer au sérum intact le sérum privé,
SHIMIDZU (1910) qui met au point la méthode d'extraction continue par l'alcool bouillant dans l'appareil de KUMAGAWA, technique dont le principe est universellement adopté aujourd'hui. GRIGAUT (1912) indique deux méthodes de dosage du cholestérol. Sa méthode colorimétrique est la plus connue ; elle consiste essentiellement à rendre le cholestérol soluble dans l'éther par l'alcool en milieu alcalin. Le dosage est ensuite effectué en utilisant la réaction colorimétrique de LIEBERMANN. Le cholestérol ne se trouvant pas à l'état libre dans le sérum, l'auteur suppose qu'il est engagé avec les protéides dans des complexes qu'il appelle protéocholestérides mais il ne donne aucune preuve directe de leur existence. Ce terme, d'ailleurs, non conforme aux règles actuelles de la nomenclature chimique, ne peut être conservé. EXTRACTION DES LIPIDES DU SÉRUM À BASSE TEMPÉRATURE Pour étudier le rôle des lipides sériques, la méthode la plus rigoureuse consistait à comparer au sérum intact le sérum privé, tout au moins partiellement, de ses lipides. HARDY et GARDINER montrent que cette opération est réalisable par d'autres procédés que la dénaturation par l'alcool chaud. Cette méthode, employée par les auteurs précédemment cités, modifie complètement les propriétés physiques des complexes lipoprotéidiques. W. B. HARDY et Mme S. GARDINER (1910) ont pu délipider presque totalement le sérum sans dénaturer les protéides. Leur méthode consiste à faire agir l'alcool absolu refroidi à −10° sur le sérum préalablement maintenu dans la glace fondante ; lorsque celui-ci est complètement desséché, on l'épuise par l'éther anhydre à froid dans un appareil de SOXHLET, et on chasse l'éther dans le vide sulfurique. La précipité a gardé ses propriétés caractéristiques : il est soluble dans l'eau ; de sa solution on peut précipiter la globuline par le sulfate d'ammonium à demi-saturation puis l'albumine par acidification. L'intérêt de ces recherches est considérable ; elles ont permis à SÕRENSEN puis à MACHEBŒUF d'étudier comparativement les propriétés des complexes lipoprotéidiques et des protéides délipidés. YOUNG (1922), se basant sur des mesures polarimétriques estime que la serum-albumine est liée peu énergiquement aux esters du cholestérol. Il obtient par délipidation une albumine purifiée avec un rendement excellent. ETUDE DES LIAISONS LIPIDES-PROTÉIDES Certains
pu délipider presque totalement le sérum sans dénaturer les protéides. Leur méthode consiste à faire agir l'alcool absolu refroidi à −10° sur le sérum préalablement maintenu dans la glace fondante ; lorsque celui-ci est complètement desséché, on l'épuise par l'éther anhydre à froid dans un appareil de SOXHLET, et on chasse l'éther dans le vide sulfurique. La précipité a gardé ses propriétés caractéristiques : il est soluble dans l'eau ; de sa solution on peut précipiter la globuline par le sulfate d'ammonium à demi-saturation puis l'albumine par acidification. L'intérêt de ces recherches est considérable ; elles ont permis à SÕRENSEN puis à MACHEBŒUF d'étudier comparativement les propriétés des complexes lipoprotéidiques et des protéides délipidés. YOUNG (1922), se basant sur des mesures polarimétriques estime que la serum-albumine est liée peu énergiquement aux esters du cholestérol. Il obtient par délipidation une albumine purifiée avec un rendement excellent. ETUDE DES LIAISONS LIPIDES-PROTÉIDES Certains auteurs s'attachèrent à étudier avec quelles fractions protéidiques sont entraînés les lipides au cours des différents procédés de fractionnement physico-chimique. a) Précipitation fractionnée HANDOWSKY, LOHMANN et BOSSE (1925) et BOSSE (1925) étudient les liaisons lipides-protéides dans le sérum de bœuf. Ils précipitent le sérum à chaud en milieu acidulé par l'acide acétique ou bien par le sulfate d'ammonium ; la totalité des phosphatides et 70 à 80 % du cholestérol passent dans le filtrat ; la précipitation de la globuline seule n'entraîne que 20 à 30 % du cholestérol. Les auteurs concluent que seuls les complexes cholestérol-globuline et cholestérol-phosphatides sont bien caractérisés et que les liaisons des protéides avec les phosphatides sont lâches. Ces recherches faites dans des conditions de température qui altèrent la structure lipoprotéidique ne sont pas bien probantes. Ils extraient ensuite le sérum avec de l'éther mais dans des conditions de température et d'agitation telles qu'on peut se demander ce que devient la structure du système lipoprotéidique dans ces conditions. Les conclusions de ces expériences sont les suivantes : plus il y a d'euglobuline dans un sérum, moins on peut extraire de cholestérol par l'éther, plus il y a d'albumine, plus les complexes lipoprotéidiques sont fragiles. La
l'acide acétique ou bien par le sulfate d'ammonium ; la totalité des phosphatides et 70 à 80 % du cholestérol passent dans le filtrat ; la précipitation de la globuline seule n'entraîne que 20 à 30 % du cholestérol. Les auteurs concluent que seuls les complexes cholestérol-globuline et cholestérol-phosphatides sont bien caractérisés et que les liaisons des protéides avec les phosphatides sont lâches. Ces recherches faites dans des conditions de température qui altèrent la structure lipoprotéidique ne sont pas bien probantes. Ils extraient ensuite le sérum avec de l'éther mais dans des conditions de température et d'agitation telles qu'on peut se demander ce que devient la structure du système lipoprotéidique dans ces conditions. Les conclusions de ces expériences sont les suivantes : plus il y a d'euglobuline dans un sérum, moins on peut extraire de cholestérol par l'éther, plus il y a d'albumine, plus les complexes lipoprotéidiques sont fragiles. La présence de glucose et de sels minéraux influerait sur le phénomène. TROENSEGAARD et KOUDAHL [32] (1926) préparent les globulines et les albumines par précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium, les coagulent et les déshydratent complètement par l'alcool. L'extraction est faite à l'aide d'éther à froid à partir de ces poudres protéidiques. Les auteurs extraient des albumines une quantité notable de lipides alors que les globulines n'en livrent que des traces. Les globulines contiennent pourtant du cholestérol car leur acétylation donne des carbures d'hydrogène identiques à ceux que donne ce stérol par acétylation. Les auteurs en concluent que le cholestérol est un groupement prosthétique de la globuline. Ces recherches, faites sur des protéides dénaturés et par conséquent dans un état physico-chimique très différent de celui des protéides naturels ne peuvent nous convaincre. Les modifications qui se produisent dans le sérum au cours de processus aussi doux que le vieillissement (*) nous apprennent qu'il faut être très circonspect en pareille matière. En 1927, GARDNER et GAINSBOROUGH [33] constatent que la précipitation des globulines par le sulfate d'ammonium à demi-saturation entraîne environ 30 % du cholestérol ; mais il reste encore 70 % dans les eaux-mères contenant les albumines, celles-ci sont parfaitement limpides, malgré
Les auteurs extraient des albumines une quantité notable de lipides alors que les globulines n'en livrent que des traces. Les globulines contiennent pourtant du cholestérol car leur acétylation donne des carbures d'hydrogène identiques à ceux que donne ce stérol par acétylation. Les auteurs en concluent que le cholestérol est un groupement prosthétique de la globuline. Ces recherches, faites sur des protéides dénaturés et par conséquent dans un état physico-chimique très différent de celui des protéides naturels ne peuvent nous convaincre. Les modifications qui se produisent dans le sérum au cours de processus aussi doux que le vieillissement (*) nous apprennent qu'il faut être très circonspect en pareille matière. En 1927, GARDNER et GAINSBOROUGH [33] constatent que la précipitation des globulines par le sulfate d'ammonium à demi-saturation entraîne environ 30 % du cholestérol ; mais il reste encore 70 % dans les eaux-mères contenant les albumines, celles-ci sont parfaitement limpides, malgré leur teneur élevée en lipides. b) Fractionnement par électrophorèse FRANKENTHAL [34] (1925) puis WOLFF et FRANKENTHAL [35] (1926) fractionnent le sérum par électrodialyse et admettent aussi que la majeure partie des lipides est liée à la globuline. Dans les sérums qui donnent une réaction de WASSERMANN positive, les lipides accompagneraient la sérine. C'est également au fractionnement électrophorétique du sérum que MELLANDER (1935) fait appel pour essayer de résoudre le problème du mode de liaison des lipides aux protéides [36]. Employant le procédé de THEORELL [37], l'auteur constate que, par cataphorèse du sérum total, le cholestérol puis la sérine se transportent à l'anode. Le compartiment cathodique au contraire s'enrichit en globuline. Le cholestérol existerait donc à l'état libre en dehors de tout complexe protéidique. TRAVAUX DE M. MACHEBÉUF : I. — Isolement d'un complexe lipido-protéidique Tâchons de préciser l'état de la question après les recherches de GARDNER et GAINSBOROUGH. Les derniers travaux que nous venons de citer, dont on ne peut méconnaître le très grand intérêt, montrent que l'existence de complexes lipoprotéidiques est très probable. Leurs auteurs sont presque d'accord pour reconnaître que la globuline forme avec le cholestérol un système d'une stabilité assez grande, mais les preuves qu'ils en donnent
la sérine. C'est également au fractionnement électrophorétique du sérum que MELLANDER (1935) fait appel pour essayer de résoudre le problème du mode de liaison des lipides aux protéides [36]. Employant le procédé de THEORELL [37], l'auteur constate que, par cataphorèse du sérum total, le cholestérol puis la sérine se transportent à l'anode. Le compartiment cathodique au contraire s'enrichit en globuline. Le cholestérol existerait donc à l'état libre en dehors de tout complexe protéidique. TRAVAUX DE M. MACHEBÉUF : I. — Isolement d'un complexe lipido-protéidique Tâchons de préciser l'état de la question après les recherches de GARDNER et GAINSBOROUGH. Les derniers travaux que nous venons de citer, dont on ne peut méconnaître le très grand intérêt, montrent que l'existence de complexes lipoprotéidiques est très probable. Leurs auteurs sont presque d'accord pour reconnaître que la globuline forme avec le cholestérol un système d'une stabilité assez grande, mais les preuves qu'ils en donnent sont toutes indirectes. D'autre part, il est admis à ce moment que ces complexes sont les seuls et qu'en particulier l'albumine ne forme avec les lipides que des composés éphémères et très mal définis qui ne sauraient présenter le même intérêt que ceux de la globuline avec le cholestérol. Or c'est précisément au système albuminique que MACHEBÉUF s'attaque (1929) ; il en isole un complexe lipoprotéidique bien défini, fournissant ainsi la preuve directe de l'existence dans le sérum de cheval de liaisons protéides-lipides. L'auteur sépare les globulines du sérum par le sulfate d'ammonium à demi-saturation et montre que, si l'on ajoute un excès de sulfate d'ammonium et de l'acide sulfurique dilué jusqu'à pH = 3,8, la précipitation des albumines et des lipides est à très peu près quantitative. Le précipité, séparé de ses eaux-mères, se remet parfaitement en solution limpide si l'on ramène le pH aux environs de 7 à l'aide d'un peu d'ammoniaque dilué [38]. Une seconde acidification à pH = 3,8, donne un nouveau précipité, mais la teneur en sels étant plus faible, une notable partie des protéides reste en solution. A chaque opération de dissolution à pH = 7 et de précipitation à pH = 3,8 avec
c'est précisément au système albuminique que MACHEBÉUF s'attaque (1929) ; il en isole un complexe lipoprotéidique bien défini, fournissant ainsi la preuve directe de l'existence dans le sérum de cheval de liaisons protéides-lipides. L'auteur sépare les globulines du sérum par le sulfate d'ammonium à demi-saturation et montre que, si l'on ajoute un excès de sulfate d'ammonium et de l'acide sulfurique dilué jusqu'à pH = 3,8, la précipitation des albumines et des lipides est à très peu près quantitative. Le précipité, séparé de ses eaux-mères, se remet parfaitement en solution limpide si l'on ramène le pH aux environs de 7 à l'aide d'un peu d'ammoniaque dilué [38]. Une seconde acidification à pH = 3,8, donne un nouveau précipité, mais la teneur en sels étant plus faible, une notable partie des protéides reste en solution. A chaque opération de dissolution à pH = 7 et de précipitation à pH = 3,8 avec élimination des eaux-mères, il obtient une substance de plus en plus riche en lipides et de plus en plus pauvre en protéides mais dont la constitution tend à se fixer. Vers la septième précipitation elle devient constante (60 % de protéides et 40 % de lipides : stérides et phosphatides). Malgré sa teneur énorme en lipides, la substance est très soluble dans l'eau et d'une grande résistance à l'extraction éthérée. L'alcool ne précipite les protéides que très lentement et incomplètement. Ainsi, dans ce complexe, non seulement les lipides sont solubles dans l'eau et insolubles dans leurs solvants (éther, benzène...) mais les protéides eux-mêmes sont masqués à leur réactif coagulant, l'alcool. Ces propriétés particulières sont dues à leur action réciproque et non à une substance possédant propriété de solubiliser les lipides comme l'a vérifié l'auteur. Ce qui constitue l'intérêt de ces recherches c'est la constance de composition du complexe de MACHEBÉUF au cours des précipitations et dissolutions successives. On est en droit de penser que lipides et protéides sont liés entre eux non par simple adsorption comme le pense SÖRENSEN, mais par des forces chimiques. MACHEBÉUF a proposé (1936) le terme de cénapse [39] pour désigner les produits biologiques résultant de
Malgré sa teneur énorme en lipides, la substance est très soluble dans l'eau et d'une grande résistance à l'extraction éthérée. L'alcool ne précipite les protéides que très lentement et incomplètement. Ainsi, dans ce complexe, non seulement les lipides sont solubles dans l'eau et insolubles dans leurs solvants (éther, benzène...) mais les protéides eux-mêmes sont masqués à leur réactif coagulant, l'alcool. Ces propriétés particulières sont dues à leur action réciproque et non à une substance possédant propriété de solubiliser les lipides comme l'a vérifié l'auteur. Ce qui constitue l'intérêt de ces recherches c'est la constance de composition du complexe de MACHEBÉUF au cours des précipitations et dissolutions successives. On est en droit de penser que lipides et protéides sont liés entre eux non par simple adsorption comme le pense SÖRENSEN, mais par des forces chimiques. MACHEBÉUF a proposé (1936) le terme de cénapse [39] pour désigner les produits biologiques résultant de l'union par des forces connues ou inconnues de deux ou plusieurs constituants de la matière vivante. Les mélanges sont évidemment exclus de ce terme qui implique la modification des propriétés des constituants. Ainsi, l'auteur appelle cénapses lipoprotéidiques les produits de l'union de lipides avec les protéides. II. — Étude de la néphrose lipoïdique : Pour connaître le rôle de chaque constituant des cénapses lipoprotéidiques, MACHEBÉUF [40] avec WAHL puis SANETUDIE le sérum sanguin dans une maladie caractérisée par un déséquilibre lipoprotéidique : la néphrose lipoïdique Les malades présentent des œdèmes abondants et une albuminurie intense. L'examen histologique des reins montre des lésions particulières dont l'élément principal est une infiltration des tubuli par des substances lipoïdiques sans lésion inflammatoire nette. Le sérum est très riche en lipides et pauvre en protéides, mais cette hyperlipémie est surtout manifeste pour la fraction albuminique qui peut contenir presque autant de lipides que de protéides. Ces lipides sont cependant très stables à l'extraction éthérée. Une analyse physico-chimique détaillée de la sérum albumine des néphrosiques montre qu'elle contient des cénapses précipitables à pH = 3,8 comme chez les individus normaux et en quantité à peu près égale. Des cénapses acido solubles très stables et faciles à