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naturelles (66 jours). Quelque temps auparavant, Ch. Nicolle, lui-même, écrivait (Arch. des Instituts Pasteur de l'Afrique du Nord, 1921) à propos d'expériences sur la non hérédité du virus chez le pou : « Les éclosions demandent un minimum de 8 jours, temps plus que suffisant pour que les crottes, qui demeurent au contact des carapaces des poux et que les jeunes poussent pourraient peut-être emporter à l'état de traces à leurs pattes, perdent toute virulence ». FEJGIN B. C.R. Soc. Biol., 1936, 123, 37. STARZYK J. C.R. Soc. Biol., 1936, 123, 121 et Arch. Inst. Pasteur Tunis, 1936, 27, 263. Or, à cette époque, où la vaccination par virus murin vivant bilié (broyats d'organes de cobayes infectés) s'étendait de plus en plus au Maroc, devant la menace d'une épidémie exceptionnellement grave, nous cherchions par tous les moyens à conserver le virus de typhus murin utilisé pour les vaccinations. En effet, la question de l'application massive de ce vaccin, sorti de son stade expérimental, n'était pas simple. Le virus d'organes de cobaye, très fragile, ne pouvait être conservé, non plus que transporté sur de longues distances, sa préparation était délicate. Une équipe spécialisée devait donc se rendre au lieu de la vaccination, emportant avec elle les cobayes infectés et un important matériel d'autopsie, de stérilisation et de préparation du vaccin. Afin d'éviter à cette équipe de trop nombreux et souvent difficiles déplacements, les populations à vacciner étaient rassemblées, en grandes foules, dépassant parfois 30.000 personnes. Ces concentrations, où pouvaient se trouver mélangés des gens venant de points infectés, avec d'autres appartenant à des régions encore épargnées par l'épidémie, n'étaient pas sans danger au point de vue de la dispersion de la maladie. D'autre part, cette même fragilité obligeait à ne préparer le virus, puis le vaccin, qu'au fur et à mesure de la cadence suivie par les équipes de vaccinateurs. Considérant, en effet, qu'une destruction aussi rapide n'est pas un phénomène brutal et tardif, mais bien continu et précoce, nous nous efforcions d'utiliser le virus dès que possible après sa préparation. L'expérimentation nous montrait, en effet, qu'à la température moyenne du
vaccination, emportant avec elle les cobayes infectés et un important matériel d'autopsie, de stérilisation et de préparation du vaccin. Afin d'éviter à cette équipe de trop nombreux et souvent difficiles déplacements, les populations à vacciner étaient rassemblées, en grandes foules, dépassant parfois 30.000 personnes. Ces concentrations, où pouvaient se trouver mélangés des gens venant de points infectés, avec d'autres appartenant à des régions encore épargnées par l'épidémie, n'étaient pas sans danger au point de vue de la dispersion de la maladie. D'autre part, cette même fragilité obligeait à ne préparer le virus, puis le vaccin, qu'au fur et à mesure de la cadence suivie par les équipes de vaccinateurs. Considérant, en effet, qu'une destruction aussi rapide n'est pas un phénomène brutal et tardif, mais bien continu et précoce, nous nous efforcions d'utiliser le virus dès que possible après sa préparation. L'expérimentation nous montrait, en effet, qu'à la température moyenne du laboratoire, de 20 à 25°, la survie n'atteignait pas, le plus souvent, 48 heures. Les rickettsias, parasites stricts du réticulo-endothélium, semblaient ne pouvoir survivre à la cellule-hôte et leur conservation, pendant 48 heures, devait se confondre avec celle de cette cellule. Seule, l'action du froid (-20°), qui arrête les échanges physicochimiques intracellulaires, parvenait à suspendre la mort pendant un laps de temps qui pouvait être considérable si les organes virulents n'étaient pas broyés et, mieux encore, si l'animal infecté était congelé in toto. Paul Giroud, cherchant à conserver le virus typhique, utilisait la dessiccation qui donne, pour de nombreux virus, une survie très longue, à la température du laboratoire. Il coupait en tranches minces des organes virulents de cobayes, cerveau et rate, ou les broyait finement ; il desséchait, soit à la température du laboratoire, soit à basse température, sous un vide très poussé et en présence d'anhydride phosphorique. Les résultats obtenus étaient nuls, le virus ne résistait pas à l'opération. D'autres essais, faits par Zinsser, avec des vaginales de cobayes infectés de virus murin, desséchées en présence de chlorure de calcium, ne donnaient pas de meilleurs résultats. Laigret et Durand, par contre, réussissaient à maintenir vivant du virus soumis
physicochimiques intracellulaires, parvenait à suspendre la mort pendant un laps de temps qui pouvait être considérable si les organes virulents n'étaient pas broyés et, mieux encore, si l'animal infecté était congelé in toto. Paul Giroud, cherchant à conserver le virus typhique, utilisait la dessiccation qui donne, pour de nombreux virus, une survie très longue, à la température du laboratoire. Il coupait en tranches minces des organes virulents de cobayes, cerveau et rate, ou les broyait finement ; il desséchait, soit à la température du laboratoire, soit à basse température, sous un vide très poussé et en présence d'anhydride phosphorique. Les résultats obtenus étaient nuls, le virus ne résistait pas à l'opération. D'autres essais, faits par Zinsser, avec des vaginales de cobayes infectés de virus murin, desséchées en présence de chlorure de calcium, ne donnaient pas de meilleurs résultats. Laigret et Durand, par contre, réussissaient à maintenir vivant du virus soumis à la dessiccation. Les résultats les plus constants étaient obtenus avec des cerveaux de rats infectés. Ces auteurs recommandaient de faire une dessiccation très rapide et insistaient sur la nécessité d'employer le chlorure de calcium et non l'acide sulfurique ou l'anhydride phosphorique. Le vide devait être poussé à quelques millimètres de mercure. Avec un tel virus, ils parvenaient à infecter des cobayes et des hommes, et ce virus, enrobé dans l'huile, donnait encore à l'homme, dans 1 p. 100 des cas environ, une infection fébrile avec réaction de Weil-Felix positive. La survie du virus, dans le vide de 3 à 4 millimètres de mercure, pouvait être constatée, dans certains cas, après 5, 7, 15 et peut-être 30 jours, après enrobage dans l'huile et conservation à la température du laboratoire. Les résultats cependant n'étaient pas uniformes, il arrivait qu'après dessiccation le produit n'était plus virulent, et Laigret et Durand écrivaient : « À la température ordinaire, la conservation n'est pas sûre au-delà de 48 heures ». Nous-mêmes, avions essayé, à plusieurs reprises, de conserver à sec le virus du typhus murin. Nous desséchions, dans le vide, en présence de chlorure de calcium, l'organe virulent (cerveau, rate ou vaginale de cobaye) broyé
de mercure. Avec un tel virus, ils parvenaient à infecter des cobayes et des hommes, et ce virus, enrobé dans l'huile, donnait encore à l'homme, dans 1 p. 100 des cas environ, une infection fébrile avec réaction de Weil-Felix positive. La survie du virus, dans le vide de 3 à 4 millimètres de mercure, pouvait être constatée, dans certains cas, après 5, 7, 15 et peut-être 30 jours, après enrobage dans l'huile et conservation à la température du laboratoire. Les résultats cependant n'étaient pas uniformes, il arrivait qu'après dessiccation le produit n'était plus virulent, et Laigret et Durand écrivaient : « À la température ordinaire, la conservation n'est pas sûre au-delà de 48 heures ». Nous-mêmes, avions essayé, à plusieurs reprises, de conserver à sec le virus du typhus murin. Nous desséchions, dans le vide, en présence de chlorure de calcium, l'organe virulent (cerveau, rate ou vaginale de cobaye) broyé avec du phos (1) GIROUD P. Arch. Inst. Pasteur Tunis, 1935, 41, 480. (2) LAIGRET J., BELFORT J. et DURAND R. La Tunisie Médicale, 1937, 31, 167. (3) LAIGRET J. et DURAND R. Arch. Inst. Pasteur Tunis, 1936, 25, 570. (4) LAIGRET J. et DURAND R. Arch. Inst. Pasteur Tunis, 1936, 25, 92, phosphate de soude. Les résultats obtenus étaient négatifs : les cobayes inoculés avec le produit desséché ne s'infectaient pas et réagissaient à l'inoculation d'épreuve. De même, deux hommes ne faisaient ni infection ni immunité à la suite de l'inoculation d'une forte dose de virus desséché. L'expérimentation nous montrait en même temps que la dessiccation d'organes broyés ne pouvait être ni parfaite ni rapide. En effet, des organes broyés et mélangés à du phosphate de soude anhydre soumis à un vide au centième de millimètre de mercure, en présence de chlorure de calcium, perdent : En 15 minutes .......... 33 % d'eau En 3 heures 79 % d'eau En 6 heures ............ 82 % d'eau Dans un tel milieu, qui n'est que partiellement et lentement déshydraté, les échanges entre les cellules que le broyage a laissées intactes et leurs parasites peuvent continuer et la mort des rickettsias accompagne
1936, 25, 92, phosphate de soude. Les résultats obtenus étaient négatifs : les cobayes inoculés avec le produit desséché ne s'infectaient pas et réagissaient à l'inoculation d'épreuve. De même, deux hommes ne faisaient ni infection ni immunité à la suite de l'inoculation d'une forte dose de virus desséché. L'expérimentation nous montrait en même temps que la dessiccation d'organes broyés ne pouvait être ni parfaite ni rapide. En effet, des organes broyés et mélangés à du phosphate de soude anhydre soumis à un vide au centième de millimètre de mercure, en présence de chlorure de calcium, perdent : En 15 minutes .......... 33 % d'eau En 3 heures 79 % d'eau En 6 heures ............ 82 % d'eau Dans un tel milieu, qui n'est que partiellement et lentement déshydraté, les échanges entre les cellules que le broyage a laissées intactes et leurs parasites peuvent continuer et la mort des rickettsias accompagne celle des cellules. La lecture du travail de J. Starzyk, sur la longue résistance du virus épidémique à sec dans les déjections de poux, nous incitait à rechercher le même phénomène dans les déjections de puces infectées de typhus murin. La question présentait un double intérêt. Intérêt d'ordre spéculatif, puisqu'il avait été démontré par Dyer, puis par nous-mêmes, que le virus du typhus murin ne pouvait être transmis par piqûre de la puce, et que les déjections de l'insecte devaient jouer le rôle principal dans la transmission : une conservation du virus dans ces déjections confirmerait cette façon de voir. Intérêt d'ordre utilitaire, pour la conservation du virus au laboratoire et, mieux encore, pour son stockage et, si possible, son utilisation comme vaccin. Dès les premiers essais faits en février 1937, nous constations que la conservation du virus du typhus murin dans les déjections de puces infectées pouvait atteindre, dans les conditions naturelles, 7 jours, puis 21 jours. Ces délais, plus que suffisants pour permettre déjà d'envisager l'envoi de ce virus sec au moins dans le Maroc, nous amenaient à commencer immédiatement les essais de mise au point d'un vaccin à partir de ces déjections. Dès le mois de septembre
avait été démontré par Dyer, puis par nous-mêmes, que le virus du typhus murin ne pouvait être transmis par piqûre de la puce, et que les déjections de l'insecte devaient jouer le rôle principal dans la transmission : une conservation du virus dans ces déjections confirmerait cette façon de voir. Intérêt d'ordre utilitaire, pour la conservation du virus au laboratoire et, mieux encore, pour son stockage et, si possible, son utilisation comme vaccin. Dès les premiers essais faits en février 1937, nous constations que la conservation du virus du typhus murin dans les déjections de puces infectées pouvait atteindre, dans les conditions naturelles, 7 jours, puis 21 jours. Ces délais, plus que suffisants pour permettre déjà d'envisager l'envoi de ce virus sec au moins dans le Maroc, nous amenaient à commencer immédiatement les essais de mise au point d'un vaccin à partir de ces déjections. Dès le mois de septembre 1937, nous pouvions publier les premiers résultats obtenus, d'autant plus encourageants qu'entre temps nous avions atteint 40, puis 100 jours de conservation du virus sec, délais qui permettaient d'envisager non seulement l'envoi, mais le stockage du virus. Au cours de la première moitié de l'année suivante, l'expérimentation apportait des précisions sur le virus sec des déjections. 200, puis 325 jours de conservation étaient successivement atteints, sans que se traduise chez le cobaye ou l'homme aucun abaissement de la virulence. Par contre, nous pouvions constater que ce même virus, mis en dilution, ne résistait pas mieux que celui des broyats d'organes et était détruit en moins de 24 heures, à la température du laboratoire. Enfin, nous pouvions, en cherchant à déterminer la dose minima infectante pour l'homme, constater que la virulence des déjections était considérable : 1/100e de milligramme, soit le 1/5" environ d'une déjection, d'un seul grain, suffisant toujours à infecter l'homme. D'autre part, l'étude expérimentale nous montrait que l'infection apparente provoquée par l'inoculation de virus sec, était bien du même type que celle obtenue avec le virus de cobaye ; cependant, chez l'homme comme chez le cobaye, ce virus, utilisé à la dose minima infectante, avait tendance à provoquer
sur le virus sec des déjections. 200, puis 325 jours de conservation étaient successivement atteints, sans que se traduise chez le cobaye ou l'homme aucun abaissement de la virulence. Par contre, nous pouvions constater que ce même virus, mis en dilution, ne résistait pas mieux que celui des broyats d'organes et était détruit en moins de 24 heures, à la température du laboratoire. Enfin, nous pouvions, en cherchant à déterminer la dose minima infectante pour l'homme, constater que la virulence des déjections était considérable : 1/100e de milligramme, soit le 1/5" environ d'une déjection, d'un seul grain, suffisant toujours à infecter l'homme. D'autre part, l'étude expérimentale nous montrait que l'infection apparente provoquée par l'inoculation de virus sec, était bien du même type que celle obtenue avec le virus de cobaye ; cependant, chez l'homme comme chez le cobaye, ce virus, utilisé à la dose minima infectante, avait tendance à provoquer l'infection inapparente dans un pourcentage de cas beaucoup plus élevé que le virus d'organes broyés de cobaye, même très dilué. De très nombreuses expériences d'immunité croisée pratiquées chez le cobaye et surtout chez l'homme, entre ce virus et le virus de passage-cobaye ainsi que le virus épidémique humain, nous montraient que l'immunité conférée par l'infection apparente ou inapparente due au virus sec, était également très forte et polyvalente vis-à-vis de toutes les souches. Enfin, une longue série d'expériences montrait que le virus sec, extracellulaire, était plus sensible à l'action de la bile que le virus d'organes broyés, et permettait de fixer au 1/150' le taux des essais en grand de vaccination humaine. Ces essais portèrent au total sur 1.380 personnes dont 142 femmes et 224 enfants. Les résultats confirmèrent les espoirs que nous avions fondés sur la nouvelle forme de virus utilisée : le taux des réactions vaccinales s'abaissa d'emblée de façon considérable ; en même temps, les épreuves d'immunité pratiquées sur 93 volontaires avec de très fortes doses de virus sec ou de virus de passage-cobaye, montraient que l'immunité obtenue était de qualité égale à celle conférée par notre première méthode. Au mois de novembre 1938, la méthode était
que l'immunité conférée par l'infection apparente ou inapparente due au virus sec, était également très forte et polyvalente vis-à-vis de toutes les souches. Enfin, une longue série d'expériences montrait que le virus sec, extracellulaire, était plus sensible à l'action de la bile que le virus d'organes broyés, et permettait de fixer au 1/150' le taux des essais en grand de vaccination humaine. Ces essais portèrent au total sur 1.380 personnes dont 142 femmes et 224 enfants. Les résultats confirmèrent les espoirs que nous avions fondés sur la nouvelle forme de virus utilisée : le taux des réactions vaccinales s'abaissa d'emblée de façon considérable ; en même temps, les épreuves d'immunité pratiquées sur 93 volontaires avec de très fortes doses de virus sec ou de virus de passage-cobaye, montraient que l'immunité obtenue était de qualité égale à celle conférée par notre première méthode. Au mois de novembre 1938, la méthode était fixée sous sa forme actuelle et l'application en commençait au Maroc. Les avantages obtenus étaient considérables et faisaient disparaître tous les inconvénients de notre première méthode, c'est-à-dire : 1° La fragilité du virus. La destruction rapide du virus dans les émulsions d'organes de cobaye, obligeait, ainsi que nous l'avons dit, à préparer le vaccin sur place. Cette préparation, délicate, devait être faite par un médecin de l'Institut Pasteur qui sacrifiait les cobayes et préparait le vaccin au fur et à mesure des besoins des équipes, de façon à éviter toute destruction, même partielle, du virus. Les organes d'un cobaye donnant 2.000 doses de vaccin, que la meilleure organisation ne peut permettre d'inoculer en moins d'une heure, il était pratiquement impossible, le plus souvent, de préparer plusieurs émulsions virulentes à partir de plusieurs cobayes et de mélanger ces émulsions, ce qui eût permis, au moins à l'intérieur d'une même séance de vaccination de diminuer le deuxième inconvénient, c'est-à-dire : 2° l'inégalité de virulence. En effet, le facteur le plus variable était précisément la quantité de virus fournie par chaque cobaye : le facteur individuel, l'âge de l'animal, influant sur l'importance de la réaction ; le poids même des organes utilisés étant
à préparer le vaccin sur place. Cette préparation, délicate, devait être faite par un médecin de l'Institut Pasteur qui sacrifiait les cobayes et préparait le vaccin au fur et à mesure des besoins des équipes, de façon à éviter toute destruction, même partielle, du virus. Les organes d'un cobaye donnant 2.000 doses de vaccin, que la meilleure organisation ne peut permettre d'inoculer en moins d'une heure, il était pratiquement impossible, le plus souvent, de préparer plusieurs émulsions virulentes à partir de plusieurs cobayes et de mélanger ces émulsions, ce qui eût permis, au moins à l'intérieur d'une même séance de vaccination de diminuer le deuxième inconvénient, c'est-à-dire : 2° l'inégalité de virulence. En effet, le facteur le plus variable était précisément la quantité de virus fournie par chaque cobaye : le facteur individuel, l'âge de l'animal, influant sur l'importance de la réaction ; le poids même des organes utilisés étant extrêmement variable, selon la taille de l'animal. L'optimum de la réaction, c'est-à-dire le maximum de virulence des organes ayant été expérimentalement fixé au deuxième jour de la réaction thermique et de la périorchite, et le temps d'incubation variant d'un passage à l'autre, de 2 à 6 jours, il était, d'autre part, difficile de fixer avec précision le moment où devaient être inoculés les animaux destinés à une vaccination, dont la date, à cause des difficultés de rassemblement, devait évidemment être fixée à l'avance. Certains cobayes devaient donc être utilisés au premier jour de leur réaction, d'autres tout à la fin, moments où la virulence est sinon moindre, du moins différente. Ainsi, chaque lot de 2.000 individus pouvait-il recevoir un vaccin très différent. Enfin à l'intérieur d'un même lot, se marquaient des différences dues à l'inconvénient le plus grave : le défaut d'homogénéité de l'émulsion. Le broyage des organes le plus poussé, s'il parvient à dissocier le tissu, c'est-à-dire à séparer les cellules les uns des autres, n'atteint point la cellule elle-même et ne peut libérer le virus qui y est contenu. Si donc il existe dans l'émulsion un virus extracellulaire, libéré lors du broyage, la majeure partie du virus reste
part, difficile de fixer avec précision le moment où devaient être inoculés les animaux destinés à une vaccination, dont la date, à cause des difficultés de rassemblement, devait évidemment être fixée à l'avance. Certains cobayes devaient donc être utilisés au premier jour de leur réaction, d'autres tout à la fin, moments où la virulence est sinon moindre, du moins différente. Ainsi, chaque lot de 2.000 individus pouvait-il recevoir un vaccin très différent. Enfin à l'intérieur d'un même lot, se marquaient des différences dues à l'inconvénient le plus grave : le défaut d'homogénéité de l'émulsion. Le broyage des organes le plus poussé, s'il parvient à dissocier le tissu, c'est-à-dire à séparer les cellules les uns des autres, n'atteint point la cellule elle-même et ne peut libérer le virus qui y est contenu. Si donc il existe dans l'émulsion un virus extracellulaire, libéré lors du broyage, la majeure partie du virus reste contenue dans les cellules ou groupes de cellules en suspension dans le liquide. D'où inégalité physique de l'action de la bile, inégalité matérielle des doses inoculées, plus ou moins riches en matériel virulent selon qu'elles contiennent plus ou moins de cellules. Le vaccin obtenu à partir du virus sec supprimait, comme nous l'avons dit, ces inconvénients. La résistance du virus devait permettre l'envoi, la conservation dans les formations sanitaires, l'attaque immédiate des foyers détectés, la décentralisation, entraînant l'extension numérique et géographique et enfin la vaccination door à door sans mouvements de populations. Cette résistance se montrait en effet considérable. La grande quantité de déjections du lot (lot 1 = 13.320 mgs) récoltée pendant l'hiver 1937-1938 avec lequel avaient été faits les premiers essais, permettait de multiplier au laboratoire les expériences d'étude et de conservation pendant que se poursuivait, au Maroc, la vaccination avec le virus du même lot. Le virus continuait de se montrer égal à lui-même quant à son pouvoir infectant pour le cobaye, à la durée de l'incubation (8 à 9 jours), au pouvoir antigénique. Nous donnons ci-joint, à titre d'exemple, les courbes de cobayes inoculés avec ce virus après 6 mois, 1 an, 2 ans et 2
comme nous l'avons dit, ces inconvénients. La résistance du virus devait permettre l'envoi, la conservation dans les formations sanitaires, l'attaque immédiate des foyers détectés, la décentralisation, entraînant l'extension numérique et géographique et enfin la vaccination door à door sans mouvements de populations. Cette résistance se montrait en effet considérable. La grande quantité de déjections du lot (lot 1 = 13.320 mgs) récoltée pendant l'hiver 1937-1938 avec lequel avaient été faits les premiers essais, permettait de multiplier au laboratoire les expériences d'étude et de conservation pendant que se poursuivait, au Maroc, la vaccination avec le virus du même lot. Le virus continuait de se montrer égal à lui-même quant à son pouvoir infectant pour le cobaye, à la durée de l'incubation (8 à 9 jours), au pouvoir antigénique. Nous donnons ci-joint, à titre d'exemple, les courbes de cobayes inoculés avec ce virus après 6 mois, 1 an, 2 ans et 2 ans 1/2 de conservation. Par ailleurs, la résistance de ce virus permettait son envoi à plusieurs de nos correspondants. Au mois de mai 1938, nous envoyions au docteur Peltier, directeur de l'Institut Pasteur de Dakar, des déjections sèches du lot 1 conservées depuis 120 jours ; ce virus était inoculé au cobaye avec succès. Au mois d'août 1938, nous expédiions à l'Institut d'Hygiène de la Faculté de Médecine de Zagreb, au docteur Trausmiller, du virus sec qui permettait le passage positif au cobaye. Au mois de septembre 1938, à Amsterdam, pendant le Congrès international de Médecine tropicale, nous remettions au professeur Du Toit une ampoule de virus sec qu'il emportait en Afrique du Sud. « I am sure, nous écrivait-il par la suite, you will be interested to learn that the murine typhus virus which you were good enough to give me in Amsterdam in september proved virulent inoculated into guinea pigs in november. At the present moment, the strain is in its third passage and is producing good temperature and scrotal reaction. The survival of the virus is most interesting, particularly because i was unable to hold it at a low temperature until i arrived back at Onderstepoort ».