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et L. M. G. VANGOLDE, Biochim. Biophys. Acta, 234, 1971, p. 222-225. B. CHANCE et G. R. WILLIAMS, J. Biol. Chem., 217, 1955, p. 383-393. G. S. GETZ, W. BARTLEY, F. STIRPE, B. M. NOTTON et A. RENSHAW, Biochem. J., 83, 1962, p. 181-191. Laboratoire de Physiologie cellulaire, 12, rue Cuvier, 75005 Paris. BIOCHIMIE. — Solubilisation et purification de l'ATPase (Na+-K+) de la membrane des erythrocytes humains sous l'action du déoxycholate de sodium. Note de Josette Chuijon, Monique Thuet et Marie-Hélène Authier, présentée par M. Jean Roche. Une préparation ATPasique (Na+-K+) de la membrane du globule rouge humain est purifiée par traitement avec le déoxycholate de sodium à force ionique élevée. Après purification, 60 % de l'activité ATPasique liée aux membranes natives est retrouvée. The (Na+-K+)-dependent ATPase prepared from human erythrocyte ghosts has been purified with sodium deoxycholate in a high ionic medium. After the purification, 60 % of the native activity bound to the membranes was recovered. OBJET DU TRAVAIL. — Nous nous proposons d'essayer d'obtenir, grâce à l'action solubilisante du déoxycholate de sodium sur les membranes de globules rouges, une préparation ATPasique lipoprotéinique purifiée. Cela, en vue ultérieurement, de dissocier le complexe lipoprotéinique et de tenter les expériences de recombinaison sélective avec les phospholipides et le cholestérol. MÉTHODES ET RÉSULTATS. — A. Préparation des membranes. — Les globules rouges humains sont recueillis sur citrate. La préparation de membranes s'effectue selon la méthode de Post, en présence de 1 mM d'EDTA. Les protéines de ces préparations sont déterminées d'après la technique de Lowry. La mesure des phospholipides est effectuée selon la méthode de Bartlett, après l'extraction par le chloroforme-méthanol et la minéralisation réalisées selon la méthode de Bradford. Le rapport môle de phospholipides/mg de protéines = 0,77 ± 0,08, sert de contrôle de préparation. Ces préparations sont lyophilisées et conservées à −20°C. B. Extraction et purification des préparations ATPasiques. — Les membranes sont remises en suspension dans du tampon histidine-imidazole 0,02 M (pH = 7,1) : le taux de protéines de la suspension est d'environ 5 mg/ml. La solubilisation par le déoxycholate est réalisée selon la méthode d'Ottolenghi, de
de recombinaison sélective avec les phospholipides et le cholestérol. MÉTHODES ET RÉSULTATS. — A. Préparation des membranes. — Les globules rouges humains sont recueillis sur citrate. La préparation de membranes s'effectue selon la méthode de Post, en présence de 1 mM d'EDTA. Les protéines de ces préparations sont déterminées d'après la technique de Lowry. La mesure des phospholipides est effectuée selon la méthode de Bartlett, après l'extraction par le chloroforme-méthanol et la minéralisation réalisées selon la méthode de Bradford. Le rapport môle de phospholipides/mg de protéines = 0,77 ± 0,08, sert de contrôle de préparation. Ces préparations sont lyophilisées et conservées à −20°C. B. Extraction et purification des préparations ATPasiques. — Les membranes sont remises en suspension dans du tampon histidine-imidazole 0,02 M (pH = 7,1) : le taux de protéines de la suspension est d'environ 5 mg/ml. La solubilisation par le déoxycholate est réalisée selon la méthode d'Ottolenghi, de façon à obtenir trois concentrations en DOCA 1,5, 2, 3 mg/ml. Après addition de glycérol et de KCl (ou NaCl), on obtient des mélanges ayant une concentration finale de 25 % (v/v) en glycérol et de 0,2 M en ions monovalents. Après centrifugation à 5 000 x g pendant 20 min à 4°C, on détermine sur le culot et le surnageant l'activité ATPasique (Na+-K+) exprimée en gM de Pi libéré par heure et par milligramme de protéines [technique]. RÉSULTATS. — Activités ATPasiques : gM Pi/h/mg protéines. TABLEAU I DOCA 0 DOCA : 1,5 mg/ml DOCA 2 mg/ml DOCA 3 mg/ml Témoin 0,32 ± 0,05 0,2 ± 0,04 0,14 ± 0,02 0,1 Surnageant 0,38 + 0,016 0,54 + 0,08 0,3 Culot 0,15 ± 0,01 Pas d'activités Pas d'activités C. Essai de purification. — Le surnageant précédent ramené à 18°C est centrifugé 90 min à 100 000 x g. TABLEAU II DOCA : 1,5 mg/ml DOCA 2 mg/ml DOCA 3 mg/ml Surnageant Pas d'activités 0,88 Pas d'activités Culot 0,93 ± 0,2 Pas d'activités Pas d'activités Une activité importante est retrouvée dans le culot 100 000 x g en présence de DOCA 1,5 mg/ml. Mais, étant donné la faible quantité de protéines extraites
min à 4°C, on détermine sur le culot et le surnageant l'activité ATPasique (Na+-K+) exprimée en gM de Pi libéré par heure et par milligramme de protéines [technique]. RÉSULTATS. — Activités ATPasiques : gM Pi/h/mg protéines. TABLEAU I DOCA 0 DOCA : 1,5 mg/ml DOCA 2 mg/ml DOCA 3 mg/ml Témoin 0,32 ± 0,05 0,2 ± 0,04 0,14 ± 0,02 0,1 Surnageant 0,38 + 0,016 0,54 + 0,08 0,3 Culot 0,15 ± 0,01 Pas d'activités Pas d'activités C. Essai de purification. — Le surnageant précédent ramené à 18°C est centrifugé 90 min à 100 000 x g. TABLEAU II DOCA : 1,5 mg/ml DOCA 2 mg/ml DOCA 3 mg/ml Surnageant Pas d'activités 0,88 Pas d'activités Culot 0,93 ± 0,2 Pas d'activités Pas d'activités Une activité importante est retrouvée dans le culot 100 000 x g en présence de DOCA 1,5 mg/ml. Mais, étant donné la faible quantité de protéines extraites : 7 % des protéines totales, le rendement de purification est peu important : 22 % de l'activité liée aux membranes. Élution des protéines (absorbant à 280 nm) et des phospholipides durant la chromatographie du surnageant contenant la préparation purifiée de l'ATPase (Na+-K+). L'élution est réalisée à 4°C en présence de tampon histidine-imidazole (pH 8,1) contenant le glycérol (25 %), le KCl (0,2 M) et le déoxycholate de Na+ (2 mg/ml). Volume des fractions 1 ml. VM, représente le volume mort de la colonne. F, volume d'élution de la ferritine; ASB, volume d'élution de l'albumine du sérum de Bœuf éluées lors de chromatographie parallèle et utilisées comme référence. D. O. — protéines absorption à 280 nm, à nM de phosphate inorganique méthode de dosage des phospholipides selon Bartlett. natives. Tandis qu'en présence de DOCA 2 mg/ml le surnageant à 100 000 x g contient près de 60 % de l'activité ATPasique liée aux membranes natives. De plus, ce résultat est obtenu malgré l'action inhibitrice du DOCA à cette concentration. Cela est d'ailleurs prouvé par un rendement augmenté si ce sel biliaire est éliminé par dialyse. 3. CHROMATOGRAPHIE. — Essai d'interprétation. — Le surnageant 100 000 x g est chromatographié sur
de tampon histidine-imidazole (pH 8,1) contenant le glycérol (25 %), le KCl (0,2 M) et le déoxycholate de Na+ (2 mg/ml). Volume des fractions 1 ml. VM, représente le volume mort de la colonne. F, volume d'élution de la ferritine; ASB, volume d'élution de l'albumine du sérum de Bœuf éluées lors de chromatographie parallèle et utilisées comme référence. D. O. — protéines absorption à 280 nm, à nM de phosphate inorganique méthode de dosage des phospholipides selon Bartlett. natives. Tandis qu'en présence de DOCA 2 mg/ml le surnageant à 100 000 x g contient près de 60 % de l'activité ATPasique liée aux membranes natives. De plus, ce résultat est obtenu malgré l'action inhibitrice du DOCA à cette concentration. Cela est d'ailleurs prouvé par un rendement augmenté si ce sel biliaire est éliminé par dialyse. 3. CHROMATOGRAPHIE. — Essai d'interprétation. — Le surnageant 100 000 x g est chromatographié sur colonne de 35 x 1,5 cm contenant du « Sepharose 4 B » (Pharmacia). La chromatographie est réalisée à 4°C après équilibre du gel avec la même solution utilisée pour l'élution : tampon histidine-imidazole (pH 8,1) contenant le glycérol (25 %), le KCl (0,2 M) et le déoxycholate de sodium 2 mg/ml. La chromatographie (fig.) révèle deux pics lipoprotéiques : l'un est élué dans le volume exclu, donc de poids moléculaire voisin de 107; ce qui pourrait suggérer que le DOCA agit en solubilisant des lipoprotéines qui restent en partie associées à des fragments de membrane [C), (8)]. Le glycérol formant un gradient de concentration ne permet pas la sédimentation de ces complexes. Ces fractions ne contiennent pas d'activités ATPasiques (Na+-K+). Le deuxième pic est élué après la ferritine (poids moléculaire 540 000); une faible activité ATPasique (Na+-K+) est liée à ces fractions. Le document apparaît donc un excellent agent qui, en solubilisant les membranes de globules rouges, permet la purification des préparations ATPasiques et suggère quelques conclusions concernant leur structure. Séance du 17 janvier 1977. R. L. Post, C. R. Merritt, G. R. Kinsolving, et C. O. Albright, J. Biol. Chem., 235, 1960, p. 1976. O. H. Lowry, N.
2 mg/ml. La chromatographie (fig.) révèle deux pics lipoprotéiques : l'un est élué dans le volume exclu, donc de poids moléculaire voisin de 107; ce qui pourrait suggérer que le DOCA agit en solubilisant des lipoprotéines qui restent en partie associées à des fragments de membrane [C), (8)]. Le glycérol formant un gradient de concentration ne permet pas la sédimentation de ces complexes. Ces fractions ne contiennent pas d'activités ATPasiques (Na+-K+). Le deuxième pic est élué après la ferritine (poids moléculaire 540 000); une faible activité ATPasique (Na+-K+) est liée à ces fractions. Le document apparaît donc un excellent agent qui, en solubilisant les membranes de globules rouges, permet la purification des préparations ATPasiques et suggère quelques conclusions concernant leur structure. Séance du 17 janvier 1977. R. L. Post, C. R. Merritt, G. R. Kinsolving, et C. O. Albright, J. Biol. Chem., 235, 1960, p. 1976. O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, et R. J. Randall, J. Biol. Chem., 193, 1951, p. 205. G. R. Bartlett, J. Biol. Chem., 234, 1959, p. 466. H. F. Bradford, P. D. Swanson, et D. B. Gammack, Biochem. J., 92, 1964, p. 254. P. Ottoleenghi, Biochem. J., 151, 1975, p. 61-66. J. Philippot et M. H. Authier, Biochem. Biophys. Acta, 298, 1973, p. 887-900. P. L. Jorgensen, Quart. Rev. Biophys., 7, n° 2, 1975, p. 239-274. D. W. Towle et J. H. Coppenhaver, Biochim. Biophys. Acta, 203, 1970, p. 124. Laboratoire de Physique biologique, Institut de Biologie, boulevard Henri-IV, 34000 Montpellier. BIOCHIMIE. — Activité phospholipasique A spontanée de l’homogénat de pancréas de Rat. Note de Suzanne Durand, François Clemente, Jacques Lloveras, Jean-Paul Thouvenot, et Louis Douste-Blazy, présentée par M. Jean Roche. Le pancréas de Rat présente une activité phospholipasique A spontanée qui apparaît avant activation trypsique et qui a un pH optimal de 6,5. L’enzyme responsable est indépendante de la pro-phospholipase A pancréatique comme le prouvent les expériences réalisées en présence d'inhibiteurs trypsiques. Elle est d'autre part distincte de la phospholipase excrétoire qui est plus active et dont le pH optimal est 8,8. La thermostabilité et l'insensibilité au DFP de la
J. Philippot et M. H. Authier, Biochem. Biophys. Acta, 298, 1973, p. 887-900. P. L. Jorgensen, Quart. Rev. Biophys., 7, n° 2, 1975, p. 239-274. D. W. Towle et J. H. Coppenhaver, Biochim. Biophys. Acta, 203, 1970, p. 124. Laboratoire de Physique biologique, Institut de Biologie, boulevard Henri-IV, 34000 Montpellier. BIOCHIMIE. — Activité phospholipasique A spontanée de l’homogénat de pancréas de Rat. Note de Suzanne Durand, François Clemente, Jacques Lloveras, Jean-Paul Thouvenot, et Louis Douste-Blazy, présentée par M. Jean Roche. Le pancréas de Rat présente une activité phospholipasique A spontanée qui apparaît avant activation trypsique et qui a un pH optimal de 6,5. L’enzyme responsable est indépendante de la pro-phospholipase A pancréatique comme le prouvent les expériences réalisées en présence d'inhibiteurs trypsiques. Elle est d'autre part distincte de la phospholipase excrétoire qui est plus active et dont le pH optimal est 8,8. La thermostabilité et l'insensibilité au DFP de la phospholipase A active spontanément la différencient respectivement de la lipase, de la carboxyl-ester-hydrolase et de la lysophospholipase. Rat pancreas presents a spontaneous phospholipase A activity which appears before trypsin activation at optimal pH 6.5. The responsible enzyme is independent of pancreatic prophospholipase A, as can be seen through experiments done in the presence of trypsin inhibitors. On the other hand, this enzyme is distinct from excretory phospholipase which is more active and whose optimal pH is 8.8. Thermostability and insensibility of spontaneously active phospholipase A to DFP differentiate it from lipase, carboxyl-ester-hydrolase and lysophospholipase, respectively. Les phospholipases pancréatiques sont sécrétées essentiellement sous forme de zymogènes dont la structure et les propriétés sont bien établies pour le pancréas de Bœuf. Une activité phospholipasique spontanée à pH 7,5 a été observée dans le pancréas de Cobaye. Le pancréas de Rat présenterait aussi à pH 9 une activité phospholipasique non dissociée de l’activité lipasique et pour laquelle l’intervention du zymogène n’est pas exclue. Ces résultats posent le problème de la dualité des phospholipases A dans le tissu pancréatique. En déterminant le pH optimal d'action et en ajoutant différents effecteurs, nous avons cherché à distinguer, dans l’homogénat de pancréas de Rat, une phospholipase A
in the presence of trypsin inhibitors. On the other hand, this enzyme is distinct from excretory phospholipase which is more active and whose optimal pH is 8.8. Thermostability and insensibility of spontaneously active phospholipase A to DFP differentiate it from lipase, carboxyl-ester-hydrolase and lysophospholipase, respectively. Les phospholipases pancréatiques sont sécrétées essentiellement sous forme de zymogènes dont la structure et les propriétés sont bien établies pour le pancréas de Bœuf. Une activité phospholipasique spontanée à pH 7,5 a été observée dans le pancréas de Cobaye. Le pancréas de Rat présenterait aussi à pH 9 une activité phospholipasique non dissociée de l’activité lipasique et pour laquelle l’intervention du zymogène n’est pas exclue. Ces résultats posent le problème de la dualité des phospholipases A dans le tissu pancréatique. En déterminant le pH optimal d'action et en ajoutant différents effecteurs, nous avons cherché à distinguer, dans l’homogénat de pancréas de Rat, une phospholipase A active spontanément, de la prophospholipase et des autres estérases pancréatiques. Fig. 1. — Activités phospholipasiques A en fonction du pH. O-O-O-O — activité phospholipasique A spontanée; — activité phospholipasique A due à l’activation. Le milieu réactionnel contient pour un volume final de 1 ml 3,22 (imoles de 32P-phosphatidylcholines, 1 mg de protéines, Désoxycholate de sodium (DOC) 6,5 mM. Tampon citrate 0.5 M pour les pH 6 et 6.5. Tampon Tris-HCl 0.5 M pour les pH 7, 7.5, 8; 8.8. Tampon glycocolle NaOH pour le pH 9,6. Activité spécifique (A.S.) nanomoles de lysophosphatidylcholines formées par minutes par milligramme de protéines. MÉTHODES. — Les animaux utilisés sont des Rats de souche Wistar mâles, pesant 200 ± 20 g. Pour chaque expérience, deux pancréas sont prélevés, homogénéisés à 0°C dans 9 fois leur poids de saccharose 0,3 M, à pH 7,3, avec ou sans inhibiteurs trypsiques (benzamidine 2mM ou diisopropyl-fluorophosphate (DFP) 4 mM). Les protéines de l’homogénat, dosées par la méthode de Lowry et coll. (5) sont incubées à 37°C sous agitation en présence de 32P-phosphatidylcholines ou de phosphatidyl-14C-éthanolamines purifiées (6), ultrasonnées dans un tampon et éventuellement additionnées d’activateurs ou d’inhibiteurs. Les protocoles expérimentaux sont détaillés dans les légendes des figures. Les produits
de protéines, Désoxycholate de sodium (DOC) 6,5 mM. Tampon citrate 0.5 M pour les pH 6 et 6.5. Tampon Tris-HCl 0.5 M pour les pH 7, 7.5, 8; 8.8. Tampon glycocolle NaOH pour le pH 9,6. Activité spécifique (A.S.) nanomoles de lysophosphatidylcholines formées par minutes par milligramme de protéines. MÉTHODES. — Les animaux utilisés sont des Rats de souche Wistar mâles, pesant 200 ± 20 g. Pour chaque expérience, deux pancréas sont prélevés, homogénéisés à 0°C dans 9 fois leur poids de saccharose 0,3 M, à pH 7,3, avec ou sans inhibiteurs trypsiques (benzamidine 2mM ou diisopropyl-fluorophosphate (DFP) 4 mM). Les protéines de l’homogénat, dosées par la méthode de Lowry et coll. (5) sont incubées à 37°C sous agitation en présence de 32P-phosphatidylcholines ou de phosphatidyl-14C-éthanolamines purifiées (6), ultrasonnées dans un tampon et éventuellement additionnées d’activateurs ou d’inhibiteurs. Les protocoles expérimentaux sont détaillés dans les légendes des figures. Les produits de la réaction sont séparés par chromatographie sur couche mince C) et leur radioactivité est mesurée par scintillation en milieu liquide. L’activité phospholipasique est définie en nanomoles de lysodérivés formés par minute et par milligramme de protéines. TABLEAU Hydrolyse comparative des phosphatidylcholines et des phosphatidyl-éthanolamines par un homogénat de pancréas de Rat PhosphatidylPhosphatidylcholines éthanolamines Activité phospholipastique A spontanée 21 84 Activité phospholipasique A après activation trypsique 276 448 Le milieu réactionnel (tampon Tris-HCl 500 m M pH 8,8; DOC 6,5 mM) contient 3,2 nmoles de phospholipides et 1 mg de protéines pour un volume final de 1 ml. Incubation 3 mn à 37°C. Les résultats sont exprimés en nanomoles de lyso dérivés formés par minute par milligramme de protéines. Afin d’étudier le rôle de certains effecteurs, l’activité phospholipasique A a été aussi déterminée par la méthode potentiométrique (8), à pH 8. Le substrat est alors préparé par homogénéisation à 1'« ultra-turrax » de deux jaunes d’œufs dans 150 ml de tampon Tris pH 8 (concentration finale Tris 0,625 mM, NaCl 1,25 mM). L’activité phospholipasique est exprimée en micromoles d’acides gras libérés par minute et par milligramme de protéines. Le dosage de la chymotrypsine est effectué après activation trypsique par spectrophotométrie
de Rat PhosphatidylPhosphatidylcholines éthanolamines Activité phospholipastique A spontanée 21 84 Activité phospholipasique A après activation trypsique 276 448 Le milieu réactionnel (tampon Tris-HCl 500 m M pH 8,8; DOC 6,5 mM) contient 3,2 nmoles de phospholipides et 1 mg de protéines pour un volume final de 1 ml. Incubation 3 mn à 37°C. Les résultats sont exprimés en nanomoles de lyso dérivés formés par minute par milligramme de protéines. Afin d’étudier le rôle de certains effecteurs, l’activité phospholipasique A a été aussi déterminée par la méthode potentiométrique (8), à pH 8. Le substrat est alors préparé par homogénéisation à 1'« ultra-turrax » de deux jaunes d’œufs dans 150 ml de tampon Tris pH 8 (concentration finale Tris 0,625 mM, NaCl 1,25 mM). L’activité phospholipasique est exprimée en micromoles d’acides gras libérés par minute et par milligramme de protéines. Le dosage de la chymotrypsine est effectué après activation trypsique par spectrophotométrie selon Hummel (9). L’activité de la carboxyl-ester-hydrolase est dosée d’après la technique de Erlanson (10). Fig. 3. — Effet de l’EDTA et du CaCl2 sur l’activité phospholipasique A spontanée du pancréas de Rat. Technique potentiométrique pH 8. A effet de l’EDTA. (DOC = 10.10-3 M). B effet de CaCl2 (DOC = 10.10-3 M). Activité spécifique (A.S.) micromoles de NaOH par minute par milligramme de protéines. RÉSULTATS. L'homogénéité de pancréas de Rat, préparé en présence d'inhibiteurs trypsiques (benzamidine ou DFP), possède des enzymes qui hydrolysent les phosphatidyl-14C-éthanolamines et les phosphatidyl-14C-cholines. La détermination du pH optimal de la réaction et ses conditions expérimentales sont rapportées dans la figure 1. À pH 6,5, l'activité spécifique est de 55 nmoles/mn/mg de protéines correspondant à une hydrolyse de 5 % de phosphatidylcholines. Nous avons comparé l'activité spontanée à celle du zymogène activé par la trypsine. Cette dernière présente un maximum à pH 8,8 (276 nmoles/mn/mg correspondant à une hydrolyse de 25 % de phosphatidylcholines) et est nulle à pH 6,5. L'activité spontanée n'est pas due à une éventuelle activation de la prophospholipase A par la trypsine endogène, car l'activité chymotryptique de l'homogène de pancréas de Rat n'est pas décelable. Par ailleurs, l'activité phospholipasique A spontanée
= 10.10-3 M). Activité spécifique (A.S.) micromoles de NaOH par minute par milligramme de protéines. RÉSULTATS. L'homogénéité de pancréas de Rat, préparé en présence d'inhibiteurs trypsiques (benzamidine ou DFP), possède des enzymes qui hydrolysent les phosphatidyl-14C-éthanolamines et les phosphatidyl-14C-cholines. La détermination du pH optimal de la réaction et ses conditions expérimentales sont rapportées dans la figure 1. À pH 6,5, l'activité spécifique est de 55 nmoles/mn/mg de protéines correspondant à une hydrolyse de 5 % de phosphatidylcholines. Nous avons comparé l'activité spontanée à celle du zymogène activé par la trypsine. Cette dernière présente un maximum à pH 8,8 (276 nmoles/mn/mg correspondant à une hydrolyse de 25 % de phosphatidylcholines) et est nulle à pH 6,5. L'activité spontanée n'est pas due à une éventuelle activation de la prophospholipase A par la trypsine endogène, car l'activité chymotryptique de l'homogène de pancréas de Rat n'est pas décelable. Par ailleurs, l'activité phospholipasique A spontanée en présence de benzamidine a été étudiée en fonction du temps à 0° (entre 1 et 12 h) et à 37° (de 3 à 15 mn). Dans les deux cas, l'activité phospholipasique spontanée est inchangée et l'activité chymotryptique n'apparait pas. À pH 8,8, l'hydrolyse des phosphatidylcholines est plus faible que celle des phosphatidyl-éthanolamines (tableau). La thermostabilité ainsi que l'effet activateur du désoxycholate et du calcium étant des propriétés caractéristiques des phospholipases pancréatiques, nous avons étudié l'action de la chaleur, du désoxycholate et du calcium sur l'activité phospholipasique à pH alcalin. L'homogène amené à pH 4,6 avec du tampon acétate 0,5 M, chauffé à 70°C pendant 5 mn puis incubé dans les conditions habituelles de dosage conserve les deux activités phospholipasiques A. De plus, nous avons vérifié que la carboxyl-ester-hydrolase n'est plus active. La phospholipase A spontanée se différencie ainsi de la lipase, de la lysophospholipase qui sont thermolabiles. D'autre part, le DFP, à la concentration finale de 4 et 10 mM, n'inhibe pas l'activité spontanée. Le désoxycholate de sodium est nécessaire à l'apparition de l'activité phospholipasique A spontanée (fig. 2). En l'absence d'ions Ca2+, l'activité phospholipasique A spontanée persiste (fig. 3 B), elle se maintient en présence d'EDTA (fig. 3