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tout d'abord été soumis à une évaluation de leur pouvoir bactériolytique spontané. Ainsi nous avons pratiqué une dilution au 1/10 et au 1/100 de chaque échantillon d'eau. On ajoute une suspension d'Escherichia coli titrant entre 1 et 5.108 germes/ml à 4,5 ml de l'échantillon non dilué et à 4,5 ml de chacune des dilutions précédemment réalisées. Les mélanges réactionnels ainsi obtenus ont été incubés à 33°C. Après 2, 4 et 6 jours d'incubation, ils ont été titrés de manière à définir quelle était la quantité d'Escherichia coli restante. À partir des résultats obtenus nous avons pu calculer le pourcentage de disparition d'Escherichia coli dans chaque tube, ce qui nous a permis de déterminer la bactériolyse spontanée dans chacun d'eux. De façon à rassembler sous un seul nombre les différentes données apportées par les diverses dilutions, nous avons finalement exprimé les résultats sous forme d'une valeur globale, caractérisant le pouvoir bactériolytique spontané global d'un échantillon d'eau, que nous avons appelé PBSG (4). Ce PBSG peut être calculé après 2, 4 ou 6 jours d'incubation, mais nous avons essentiellement tenu compte des résultats après 6 jours d'incubation, soit PBSG6. Fig. A. — Corrélations coliformes, E. coli/PBSG6 dans la Moselle. — A ---A---, coliformes; -'.-'.-., E. coli; -8-8-, PBSG6. Échelle 1 cm = 25 km. Par ailleurs, nous avons effectué des analyses bactériologiques sur les mêmes prélèvements d'eau en recherchant et déterminant le nombre des coliformes ainsi que celui d'Escherichia coli. A partir des résultats obtenus nous avons cherché à établir la correspondance entre la pollution bactérienne et l'intensité de la bactériolyse spontanée globale. Dans ce but, nous avons tracé, sur un même graphe, la courbe d'évolution du nombre de coliformes et celle d'Escherichia coli et la courbe d'évolution correspondante du PBSG6 tout au long du cours d'une même rivière pour un mois donné. Nous avons porté en abscisse les différents points de prélèvements, d'amont en aval de la rivière en respectant, à l'échelle, les distances réelles et, en ordonnée, d'une part les valeurs du PBSG6 variant de 0 à 1 000, d'autre part les taux de coliformes et d'Escherichia coli exprimés en
coliformes; -'.-'.-., E. coli; -8-8-, PBSG6. Échelle 1 cm = 25 km. Par ailleurs, nous avons effectué des analyses bactériologiques sur les mêmes prélèvements d'eau en recherchant et déterminant le nombre des coliformes ainsi que celui d'Escherichia coli. A partir des résultats obtenus nous avons cherché à établir la correspondance entre la pollution bactérienne et l'intensité de la bactériolyse spontanée globale. Dans ce but, nous avons tracé, sur un même graphe, la courbe d'évolution du nombre de coliformes et celle d'Escherichia coli et la courbe d'évolution correspondante du PBSG6 tout au long du cours d'une même rivière pour un mois donné. Nous avons porté en abscisse les différents points de prélèvements, d'amont en aval de la rivière en respectant, à l'échelle, les distances réelles et, en ordonnée, d'une part les valeurs du PBSG6 variant de 0 à 1 000, d'autre part les taux de coliformes et d'Escherichia coli exprimés en nombre de germes/100 ml, ces taux variant de 0 à 30 000. L'étude du cours de la Moselle montre qu'au mois d'août, le nombre de coliformes et d'Escherichia coli rencontrés est très élevé et on observe une évolution extrêmement synchrone entre le PBSG6 et le taux de coliformes. Cette corrélation, quoique existante, paraît moins solide entre le PBSG6 et Escherichia coli. En novembre, les courbes représentatives des taux de coliformes et d'Escherichia coli et les valeurs de PBSG6 présentent exactement les mêmes variations. On note des taux de PBSG6 très élevés aux points nos 4 et 6 en correspondance avec des taux importants de coliformes et d'Escherichia coli. En ce qui concerne le cours de la Meurthe, au mois d'août, on constate que le pouvoir bactériolytique est très intense aux points nos 10 et 11, c'est-à-dire dans la partie aval de la rivière. Par ailleurs, le taux des coliformes est lui aussi très élevé et son évolution est strictement parallèle à celle du PBSG6. Par contre, le nombre d'Escherichia coli varie dans des proportions beaucoup plus faibles. Enfin, en novembre, on remarque que le nombre de coliformes et les valeurs de PBSG6 sont relativement faibles jusqu'au point n° 10, puis
quoique existante, paraît moins solide entre le PBSG6 et Escherichia coli. En novembre, les courbes représentatives des taux de coliformes et d'Escherichia coli et les valeurs de PBSG6 présentent exactement les mêmes variations. On note des taux de PBSG6 très élevés aux points nos 4 et 6 en correspondance avec des taux importants de coliformes et d'Escherichia coli. En ce qui concerne le cours de la Meurthe, au mois d'août, on constate que le pouvoir bactériolytique est très intense aux points nos 10 et 11, c'est-à-dire dans la partie aval de la rivière. Par ailleurs, le taux des coliformes est lui aussi très élevé et son évolution est strictement parallèle à celle du PBSG6. Par contre, le nombre d'Escherichia coli varie dans des proportions beaucoup plus faibles. Enfin, en novembre, on remarque que le nombre de coliformes et les valeurs de PBSG6 sont relativement faibles jusqu'au point n° 10, puis ces deux paramètres augmentent considérablement et d'une façon strictement parallèle pour arriver à des maximums au point n° 11. Il faut noter que la corrélation entre PBSG6 et le nombre d'Escherichia coli est moins marquée, cependant la quantité maximale d'Escherichia coli se situe elle aussi au point n° 11. De l'étude d'ensemble des rapports bactériolyse spontanée/bactéries dans ces 2 rivières, il ressort très nettement qu'il existe une corrélation solide entre l'intensité de la bactériolyse spontanée globale exprimée sous forme de PBSG6 et le taux de coliformes. Entre le PBSG6 et le nombre d'Escherichia coli la corrélation, quoique indéniable, est cependant moins marquée. Laboratoire de Bactériologie et Virologie, Faculté des Sciences pharmaceutiques et biologiques, Université de Nancy 1, 5, rue Albert-Lebrun, 54000 Nancy. VIROLOGIE. — Transformation in vitro de cellules cérébrales de Hamster par le virus polyome. Note de Catherine Pagis-de Micco, Marie-France Tripier, Jacques Hassoun et Maurice Toga, présentée par M. Robert de Vernejoul. Une lignée cellulaire, dite HCxPy, a été dérivée de cultures dissociées du cortex cérébral de Hamsters syriens syngéniques, transformées in vitro par le virus polyome. Les cellules infectées étaient des primocultures âgées de 12 jours. 90 à 120 jours se sont écoulés avant que les premières
l'étude d'ensemble des rapports bactériolyse spontanée/bactéries dans ces 2 rivières, il ressort très nettement qu'il existe une corrélation solide entre l'intensité de la bactériolyse spontanée globale exprimée sous forme de PBSG6 et le taux de coliformes. Entre le PBSG6 et le nombre d'Escherichia coli la corrélation, quoique indéniable, est cependant moins marquée. Laboratoire de Bactériologie et Virologie, Faculté des Sciences pharmaceutiques et biologiques, Université de Nancy 1, 5, rue Albert-Lebrun, 54000 Nancy. VIROLOGIE. — Transformation in vitro de cellules cérébrales de Hamster par le virus polyome. Note de Catherine Pagis-de Micco, Marie-France Tripier, Jacques Hassoun et Maurice Toga, présentée par M. Robert de Vernejoul. Une lignée cellulaire, dite HCxPy, a été dérivée de cultures dissociées du cortex cérébral de Hamsters syriens syngéniques, transformées in vitro par le virus polyome. Les cellules infectées étaient des primocultures âgées de 12 jours. 90 à 120 jours se sont écoulés avant que les premières colonies transformées apparaissent. La lignée en est actuellement au 46e passage in vitro. Elle se révèle hautement tumorigène pour le Hamster syngénique. Les cellules possèdent les néoantigènes tumoraux du virus polyome. Les cellules in vitro et les tumeurs induites présentent morphologiquement des signes de différenciation gliale. A cell line called HCxPy has been obtained in vitro by transformation of dissociated Hamster brain cell cultures by polyoma virus. The first foci of transformed cells became evident 90 to 120 days after viral infection. This cell line is now at the 46th passage. The cells appear tumorigenic for Hamsters after subcutaneous and intracerebral injection. They carry the polyoma virus T and surface antigens. Good evidence for astrocytic differentiation can be found by morphological examination of the tumours and of the cultured cells. Dans le cadre d'une étude du rôle de la barrière immunologique hémato-encéphalique au cours de greffes intracérébrales de tumeurs expérimentales chez le Hamster, il nous a paru intéressant de disposer d'une souche tumorale neurogliale induite par le virus polyome. In vivo, le virus polyome de la Souris injecté au Hamster par voie intracérébrale, induit exclusivement des tumeurs mésenchymateuses. In vitro, une transformation d'astroblastes de Hamster par ce virus a été
HCxPy has been obtained in vitro by transformation of dissociated Hamster brain cell cultures by polyoma virus. The first foci of transformed cells became evident 90 to 120 days after viral infection. This cell line is now at the 46th passage. The cells appear tumorigenic for Hamsters after subcutaneous and intracerebral injection. They carry the polyoma virus T and surface antigens. Good evidence for astrocytic differentiation can be found by morphological examination of the tumours and of the cultured cells. Dans le cadre d'une étude du rôle de la barrière immunologique hémato-encéphalique au cours de greffes intracérébrales de tumeurs expérimentales chez le Hamster, il nous a paru intéressant de disposer d'une souche tumorale neurogliale induite par le virus polyome. In vivo, le virus polyome de la Souris injecté au Hamster par voie intracérébrale, induit exclusivement des tumeurs mésenchymateuses. In vitro, une transformation d'astroblastes de Hamster par ce virus a été rapportée, mais les preuves de l'origine virale de la transformation n'ont pas été réunies. Cette Note décrit la transformation par le virus polyome de cultures dissociées de cellules cérébrales de Hamster. MÉTODES. — Cultures de cellules cérébrales. — Des fragments de cortex cérébral de Hamsters syriens syngéniques âgés de 24 h ont été débarassés des méninges et des gros vaisseaux, finement dissociés puis soumis à l'action d'une solution de trypsine à 0,25 %. La suspension cellulaire obtenue a été répartie dans des flacons de culture en matière plastique « Falcon » de 250 ml dans du milieu de PUC N 16 additionné de 25 % de sérum de bovin fœtal, de 5 mg/ml de glucose et de 7,29 mM de l'arginine. Les cultures ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère comportant 5 % de CO2. Infection virale. — Le virus polyome utilisé était le mutant « small-plaques » de la souche Toronto entretenu sur primo-cultures d'embryon de Souris et titré par la méthode des plages. Les cellules infectées provenaient de primo-cultures âgées de 12 jours. L'infection a eu lieu en suspension à la multiplicité d'infection de 500 unités formant plaque par cellule. Le contact avec le virus a été
h ont été débarassés des méninges et des gros vaisseaux, finement dissociés puis soumis à l'action d'une solution de trypsine à 0,25 %. La suspension cellulaire obtenue a été répartie dans des flacons de culture en matière plastique « Falcon » de 250 ml dans du milieu de PUC N 16 additionné de 25 % de sérum de bovin fœtal, de 5 mg/ml de glucose et de 7,29 mM de l'arginine. Les cultures ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère comportant 5 % de CO2. Infection virale. — Le virus polyome utilisé était le mutant « small-plaques » de la souche Toronto entretenu sur primo-cultures d'embryon de Souris et titré par la méthode des plages. Les cellules infectées provenaient de primo-cultures âgées de 12 jours. L'infection a eu lieu en suspension à la multiplicité d'infection de 500 unités formant plaque par cellule. Le contact avec le virus a été maintenu 3 h à 37°C sous agitation continue. Après lavage, les cellules ont été réensemencées et entretenues comme auparavant. Des cultures témoins non infectées ont été entretenues parallèlement. Les milieux de culture étaient renouvelés deux fois par semaine, et les cultures confluentes dédoublées par trypsination. À partir de la 10e subculture, le milieu de PUC N 16 a été remplacé par le milieu de Eagle (MEM) avec les mêmes concentrations de sérum, glucose et glutamine. La croissance et la morphologie cellulaire ont été régulièrement suivies par des examens en microscopie à contraste de phase, optique et électronique. Les néoantigènes de membrane (Ag S), nucléaire (Ag T) et de transplantation (TSTA) spécifiques du virus polyome ont été recherchés selon les techniques habituelles (6). Inoculation des cellules à l'animal. — La tumorigénicité des cultures infectées a été recherchée à différents passages par injection sous-cutanée ou intracérébrale des cellules à des Hamsters syngéniques nouveau-nés et adultes. Les tumeurs ainsi provoquées ont fait l'objet d'examens histologiques et ultrastructuraux; après trypsination, elles ont été transmises par voie sous-cutanée ou intracérébrale à des animaux adultes afin d'obtenir une lignée tumorale transplantable. RÉSULTATS. — Dans les cultures infectées, les premières colonies de cellules transformées sont apparues entre
subculture, le milieu de PUC N 16 a été remplacé par le milieu de Eagle (MEM) avec les mêmes concentrations de sérum, glucose et glutamine. La croissance et la morphologie cellulaire ont été régulièrement suivies par des examens en microscopie à contraste de phase, optique et électronique. Les néoantigènes de membrane (Ag S), nucléaire (Ag T) et de transplantation (TSTA) spécifiques du virus polyome ont été recherchés selon les techniques habituelles (6). Inoculation des cellules à l'animal. — La tumorigénicité des cultures infectées a été recherchée à différents passages par injection sous-cutanée ou intracérébrale des cellules à des Hamsters syngéniques nouveau-nés et adultes. Les tumeurs ainsi provoquées ont fait l'objet d'examens histologiques et ultrastructuraux; après trypsination, elles ont été transmises par voie sous-cutanée ou intracérébrale à des animaux adultes afin d'obtenir une lignée tumorale transplantable. RÉSULTATS. — Dans les cultures infectées, les premières colonies de cellules transformées sont apparues entre le 90e et 120e jour après l'infection virale, au cours de la 4e subculture. Les cellules jusque-là étoilées ou polygonales, devenaient volumineuses et comportaient un cytoplasme granuleux et un noyau bourgeonnant. Simultanément, la vitesse de croissance augmentait, l'intervalle entre deux subcultures passant de 15-30 jours à 7 jours. Graduellement, le gigantisme cellulaire s'estompait laissant place à des éléments triangulaires qui se multipliaient en s'entrecroisant. À partir de la 7e subculture, le rythme de croissance s'est stabilisé. Les subcultures étaient faites toutes les 48 h dans un milieu contenant 10 % de sérum. Des cellules, très peu adhérentes, avaient tendance à se détacher du support plastique et à pousser en suspension. Pendant la même période d'observation, aucune des cultures témoins n'a présenté de telles modifications. La lignée cellulaire transformée appelée « hamster-cortex-polyome » (HCxPy) en est actuellement au 46e passage in vitro. Deux types cellulaires pouvaient être morphologiquement distingués : des éléments triangulaires ou étoilés de taille réduite envoyant de très longs et très fins prolongements qui s'anastomosaient entre eux (fig. 1) et de volumineuses cellules parfois multinucléées à cytoplasme étalé et granuleux (fig. 2). Des termes de passage entre ces deux types cellulaires étaient visibles. L'examen ultrastructural retrouvait cette dualité
gigantisme cellulaire s'estompait laissant place à des éléments triangulaires qui se multipliaient en s'entrecroisant. À partir de la 7e subculture, le rythme de croissance s'est stabilisé. Les subcultures étaient faites toutes les 48 h dans un milieu contenant 10 % de sérum. Des cellules, très peu adhérentes, avaient tendance à se détacher du support plastique et à pousser en suspension. Pendant la même période d'observation, aucune des cultures témoins n'a présenté de telles modifications. La lignée cellulaire transformée appelée « hamster-cortex-polyome » (HCxPy) en est actuellement au 46e passage in vitro. Deux types cellulaires pouvaient être morphologiquement distingués : des éléments triangulaires ou étoilés de taille réduite envoyant de très longs et très fins prolongements qui s'anastomosaient entre eux (fig. 1) et de volumineuses cellules parfois multinucléées à cytoplasme étalé et granuleux (fig. 2). Des termes de passage entre ces deux types cellulaires étaient visibles. L'examen ultrastructural retrouvait cette dualité morphologique avec : — d'une part, les cellules de taille moyenne, dont le noyau était arrondi et clair et dont le cytoplasme réduit renfermait les organelles habituelles avec de rares filaments isolés ; — d'autre part, les plasmodes géants à noyaux irréguliers, nucléolés, denses aux électrons et cytoplasme abondant, très riche en polysomes et en mitochondries, mais dépourvus de critères de différenciation. EXPLICATION DE LA PLANCHE Fig. 1. — Aspect in vitro de la souche HCxPy 34e subculture. Petites cellules étoilées à prolongements ramifiés. Contraste de phase (G x 350). Fig. 2. — Aspect in vitro de la souche HCxPy 34e subculture. Volumineuses cellules dotées de voiles cytoplasmiques. Contraste de phase (G x 350). Fig. 3. — Aspect histologique d'une tumeur sous-cutanée HCxPy (2e passage). Cellules bi-polaires groupées en faisceaux et cellules monstreuses à cytoplasme abondant de type astrocytaire (G x 350). Fig. 4. — Aspect ultrastructural de la même tumeur HCxPy. Faisceaux de gliofibrilles tourbillonants et présentant des zones de condensation (G x 58 000). PLANCHE 1 CATHERINE PAGIS-DE MICCO Selon les subcultures, l'antigène T du virus polyome a été retrouvé dans 5 à 10 % des cellules et l'antigène S dans 75 à 90 % d'entre elles. L'examen
riche en polysomes et en mitochondries, mais dépourvus de critères de différenciation. EXPLICATION DE LA PLANCHE Fig. 1. — Aspect in vitro de la souche HCxPy 34e subculture. Petites cellules étoilées à prolongements ramifiés. Contraste de phase (G x 350). Fig. 2. — Aspect in vitro de la souche HCxPy 34e subculture. Volumineuses cellules dotées de voiles cytoplasmiques. Contraste de phase (G x 350). Fig. 3. — Aspect histologique d'une tumeur sous-cutanée HCxPy (2e passage). Cellules bi-polaires groupées en faisceaux et cellules monstreuses à cytoplasme abondant de type astrocytaire (G x 350). Fig. 4. — Aspect ultrastructural de la même tumeur HCxPy. Faisceaux de gliofibrilles tourbillonants et présentant des zones de condensation (G x 58 000). PLANCHE 1 CATHERINE PAGIS-DE MICCO Selon les subcultures, l'antigène T du virus polyome a été retrouvé dans 5 à 10 % des cellules et l'antigène S dans 75 à 90 % d'entre elles. L'examen du tableau montre que les cellules HCxPy étaient porteuses de l'antigène de transplantation alors que les cellules témoins non infectées en étaient dépourvues. La tumorigénicité est apparue au stade de la 18e subculture pour des doses de 5.106 cellules injectées par voie sous-cutanée à des animaux âgés de 24 h. Les tumeurs étaient palpables au point d'inoculation au bout de 20 à 30 jours chez tous les animaux. Elles ont pu être transplantées en série à des animaux adultes, les doses cellulaires nécessaires à leur développement décroissant au fil des passages in vivo : 5.105 cellules suffisaient au 2e passage à induire des tumeurs envahissantes localement et capables de donner des métastases pulmonaires. Histologiquement, les tumeurs très monomorphes étaient constituées de cellules fusiformes à prolongements oppositopolaires, grêles, s'agençant en faisceaux entrecroisés. De nombreuses plages de nécrose étaient notées, les cellules tumorales réalisant des palissades à leur périphérie. Des signes de différenciation gliale étaient évidents au sein de tumeurs ayant évolué plus de 50 jours : cellules globuleuses de type astrocytaire protoplasmique montrant un cytoplasme abondant éosinophile et Mallory positif, des noyaux excentrés et monstrueux (fig. 3). TABLEAU Recherche du TSTA au niveau des cellules de la souche HCxPy Agent Virus
Les tumeurs étaient palpables au point d'inoculation au bout de 20 à 30 jours chez tous les animaux. Elles ont pu être transplantées en série à des animaux adultes, les doses cellulaires nécessaires à leur développement décroissant au fil des passages in vivo : 5.105 cellules suffisaient au 2e passage à induire des tumeurs envahissantes localement et capables de donner des métastases pulmonaires. Histologiquement, les tumeurs très monomorphes étaient constituées de cellules fusiformes à prolongements oppositopolaires, grêles, s'agençant en faisceaux entrecroisés. De nombreuses plages de nécrose étaient notées, les cellules tumorales réalisant des palissades à leur périphérie. Des signes de différenciation gliale étaient évidents au sein de tumeurs ayant évolué plus de 50 jours : cellules globuleuses de type astrocytaire protoplasmique montrant un cytoplasme abondant éosinophile et Mallory positif, des noyaux excentrés et monstrueux (fig. 3). TABLEAU Recherche du TSTA au niveau des cellules de la souche HCxPy Agent Virus Cellules Cellules témoins Témoins immunogène Polyome HCxPy non infectées non immunisés Nombre de tumeurs ......... 6 6 15 15 Nombre d'animaux .......... 15 15 15 15 Les animaux sont immunisés par 9 injections sous-cutanées, soit du virus polyome (témoin positif), soit des cellules à étudier à dose non tumorigène puis reçoivent par voie sous-cutanée 5 doses tumorigènes, 50 de cellules sarcomateuses transformées par le virus polyome. Le nombre des tumeurs se développant par rapport au nombre d'animaux mis en expérience est donné dans les trois séries et dans une série témoin où les animaux ne sont pas immunisés avant la charge tumorale. L'aspect de ces tumeurs en microscopie électronique répondait à une prolifération dense d'éléments tassés les uns contre les autres sans différenciation jonctionnelle; les cellules allongées comportaient dans leur cytoplasme des gliofilaments et quelques microtubules (fig. 4). On notait quelquefois une disposition particulière de l'ergastoplasme et du chondriome. Leur noyau renfermait un seul nucléole et une chromatine densifiée sous la membrane nucléaire. DISCUSSION ET CONCLUSION. — Cette note préliminaire décrit l'établissement d'une nouvelle lignée de cellules cérébrales transformées in vitro par le virus polyome, la lignée HCxPy. Les délais de transformation in vitro sont analogues à tous ceux rapportés