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la jeune pousse à la fin du séjour sur le milieu B. La pousse ainsi obtenue est prête à être repiquée sur un milieu de rhizogenèse. Fig. 4. — Plantules à la fin d'un séjour sur le milieu C. Obtention de plantules viables à partir de cultures de bourgeons de Douglas issus de sujets de 2 ans. Fig. 5. — Plante obtenue in vitro, repiquée en godet « Fertil » 3 x 5. Fig. 6. — Stimulation de bourgeons adventifs le long du jeune axe du bourgeon, débarrassé de ses écailles, après suppression de l'apex caulinaire et des ébauches foliaires. PLANCHE 1 MICHEL BOULAY Pour l'autre type d'explant (jeune axe du bourgeon débarrassé à la fois du méristème apical et des ébauches foliaires), en 2 mois et demi, 3 à 10 bourgeons adventifs se développent le long du jeune axe. Ils sont repiqués sur un milieu d'allongement (B). 1 mois plus tard environ, les tiges de 20 à 30 mm sont plantées sur le milieu C. Avec ce type d'explant, nous en sommes à ce stade de l'expérimentation. Outre le fait d'obtenir au minimum 3 bourgeons par explant, on peut noter dès à présent que le temps nécessaire à obtenir du matériel âgé à enraciner (sur le milieu C) avec cette technique est de 4 mois environ. Il est notablement plus court qu'avec une culture de bourgeons classiques : 6 mois dans le meilleur des cas. La phase C d'enracinement n'a pu être obtenue qu'avec des bourgeons ou apex caulinaires prélevés sur des sujets âgés de moins de 2 ans. Avec des pieds-mères plus âgés, il se développe un callus à la base qui peut être volumineux mais aucune formation de racines. III. CONCLUSION. — Il est possible d'obtenir des plantules viables de Douglas à partir de la culture aseptique de bourgeons débarrassés de leurs écailles ou d'apex caulinaires. La réussite semble liée à l'âge du pied-mère. Des études en cours nous montreront si la croissance lente et l'inaptitude à l'enracinement actuellement observées pour les bourgeons venant de pieds-mères âgés, peuvent être corrigées par l'amélioration des conditions de culture et
du matériel âgé à enraciner (sur le milieu C) avec cette technique est de 4 mois environ. Il est notablement plus court qu'avec une culture de bourgeons classiques : 6 mois dans le meilleur des cas. La phase C d'enracinement n'a pu être obtenue qu'avec des bourgeons ou apex caulinaires prélevés sur des sujets âgés de moins de 2 ans. Avec des pieds-mères plus âgés, il se développe un callus à la base qui peut être volumineux mais aucune formation de racines. III. CONCLUSION. — Il est possible d'obtenir des plantules viables de Douglas à partir de la culture aseptique de bourgeons débarrassés de leurs écailles ou d'apex caulinaires. La réussite semble liée à l'âge du pied-mère. Des études en cours nous montreront si la croissance lente et l'inaptitude à l'enracinement actuellement observées pour les bourgeons venant de pieds-mères âgés, peuvent être corrigées par l'amélioration des conditions de culture et par la recherche de tissus plus réactifs préexistants ou produits artificiellement. Séance du 24 janvier 1977. K. H. AL TALIB et J. G. TORREY, Plant physiol., 34, 1959, p. 630-637. V. CHALUPA et J. DURZAN, Can. J. For. Res., 3, 1973, p. 196-208. T. MURASHIGE et F. SKOOG, Physiol. Plant., 15, 1962, p. 473-497. A. E. HARVEY et J. L. GRASHAM. Can. J. Bot., 47, 1969, p. 547-549. M. QUOIRIN, P. BOISSE et T. GASPAR, Physiol. Veg., 12, 1974, p. 165-174. C. JACQUIOT, cité in « la culture des tissus ligneux » de R. Gautheret, 1959, p. 23, Masson éd., 863 p. M. QUOIRIN, Communication personnelle. Laboratoire de Physiologie végétale, A.F.O.C.E.L., Domaine de l’Étançon, 77370 Nangis. PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Influence de l'auxine sur les activités P 1 → 3 endoglucanasiques de segments d'hypocotyles de Phaseolus aureus. Note de Renée Goldberg, présentée par M. René Wurmser. Les activités P 1 → endoglucanases des fractions particulaires obtenues à partir de segments d'hypocotyles de Phaseolus aureus préalablement traités pendant 3 h par une solution tampon 10-3 M additionnée ou non d'acide (3 indolyl-acétique, représentent plus de 80 % de l'activité glucanasique totale de la cellule. L'auxine provoque l'augmentation des activités des fractions solubles
15, 1962, p. 473-497. A. E. HARVEY et J. L. GRASHAM. Can. J. Bot., 47, 1969, p. 547-549. M. QUOIRIN, P. BOISSE et T. GASPAR, Physiol. Veg., 12, 1974, p. 165-174. C. JACQUIOT, cité in « la culture des tissus ligneux » de R. Gautheret, 1959, p. 23, Masson éd., 863 p. M. QUOIRIN, Communication personnelle. Laboratoire de Physiologie végétale, A.F.O.C.E.L., Domaine de l’Étançon, 77370 Nangis. PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Influence de l'auxine sur les activités P 1 → 3 endoglucanasiques de segments d'hypocotyles de Phaseolus aureus. Note de Renée Goldberg, présentée par M. René Wurmser. Les activités P 1 → endoglucanases des fractions particulaires obtenues à partir de segments d'hypocotyles de Phaseolus aureus préalablement traités pendant 3 h par une solution tampon 10-3 M additionnée ou non d'acide (3 indolyl-acétique, représentent plus de 80 % de l'activité glucanasique totale de la cellule. L'auxine provoque l'augmentation des activités des fractions solubles et particulaires. Plusieurs schémas sont proposés pour rendre compte de cet effet de l'auxine. Dans les hypocotyles de Phaseolus aureus, plus de 80 % de l'activité endoglucanase P 1 3 est localisée dans des fractions particulières. L'incubation de segments d'hypocotyles dans une solution d'IAA (5 x 10-6 M) induit un accroissement des activités des fractions solubles et particulières comparées aux activités de segments incubés dans un tampon millimolaire sans IAA. Les dernières hypothèses avancées pour expliquer le mécanisme de l'action de l'auxine sur l'élongation impliquent l'excrétion d'ions H+ hors du cytoplasme; l'acidification de l'espace périplasmique qui s'ensuit permet alors une élévation de l'activité d'hydrolases pariétales entraînant une modification de la structure des polysaccharides constitutifs des parois, qui s'exprime par une augmentation de la plasticité du cadre cellulaire. Effectivement, nous avons pu constater que l'activité P 1 3 endoglucanase pariétale des hypocotyles de Phaseolus aureus augmentait d'environ 50 % lorsque le pH de la solution d'incubation passe de 6,8 à 5,5. Par ailleurs, il a été montré depuis quelques années déjà que l'acide 3 indolyl-acétique provoque une augmentation des activités cellulaires et glucanasiques intracellulaires. Dans le présent travail, nous avons voulu chercher si une manifestation morphologique déterminée (ici la stimulation de
accroissement des activités des fractions solubles et particulières comparées aux activités de segments incubés dans un tampon millimolaire sans IAA. Les dernières hypothèses avancées pour expliquer le mécanisme de l'action de l'auxine sur l'élongation impliquent l'excrétion d'ions H+ hors du cytoplasme; l'acidification de l'espace périplasmique qui s'ensuit permet alors une élévation de l'activité d'hydrolases pariétales entraînant une modification de la structure des polysaccharides constitutifs des parois, qui s'exprime par une augmentation de la plasticité du cadre cellulaire. Effectivement, nous avons pu constater que l'activité P 1 3 endoglucanase pariétale des hypocotyles de Phaseolus aureus augmentait d'environ 50 % lorsque le pH de la solution d'incubation passe de 6,8 à 5,5. Par ailleurs, il a été montré depuis quelques années déjà que l'acide 3 indolyl-acétique provoque une augmentation des activités cellulaires et glucanasiques intracellulaires. Dans le présent travail, nous avons voulu chercher si une manifestation morphologique déterminée (ici la stimulation de la croissance de segments d'hypocotyles de Phaseolus aureus par l'auxine) ne résultait pas en réalité de plusieurs phénomènes différents. Après avoir constaté d'une part, que des segments d'hypocotyles incubés dans une solution d'auxine rejetaient des protons dans le milieu extérieur et, d'autre part, que les parois isolées à partir de segments d'hypocotyles possédaient une activité P 1 3 endoglucanase dont l'optimum se situait aux alentours de pH 5,6, nous avons comparé les activités P 1 3 endoglucanasiques de parois obtenues à partir de segments d'hypocotyles ayant séjourné dans une solution tampon 10-3 M additionnée ou non d'acide (3 indolyl-acétique. TABLEAU Répartition des activités P 1 3 endoglucanases dans la cellule Activité P 1 3 endoglucanase Exp. 1 Exp. 2 A B A B Fraction p (parois) 1,30 1,60 1,45 1,72 Fraction S, 0,145 0,185 0,14 0,18 Fraction S2 0,11 0,17 0,15 0,26 Les segments d'hypocotyles sont agités 3 h dans du tampon 10-3 M pH 6,3 additionné (B) ou non (A) d'auxine (5.10-6 M). Le mode d'obtention des 3 fractions cellulaires étudiées (p, S, et S2) est décrit dans Matériel et méthodes. Les activités sont exprimées en micromoles d'oligosides réducteurs apparus par heure et par gramme frais d'hypocotyle. MATÉRIEL ET
segments d'hypocotyles possédaient une activité P 1 3 endoglucanase dont l'optimum se situait aux alentours de pH 5,6, nous avons comparé les activités P 1 3 endoglucanasiques de parois obtenues à partir de segments d'hypocotyles ayant séjourné dans une solution tampon 10-3 M additionnée ou non d'acide (3 indolyl-acétique. TABLEAU Répartition des activités P 1 3 endoglucanases dans la cellule Activité P 1 3 endoglucanase Exp. 1 Exp. 2 A B A B Fraction p (parois) 1,30 1,60 1,45 1,72 Fraction S, 0,145 0,185 0,14 0,18 Fraction S2 0,11 0,17 0,15 0,26 Les segments d'hypocotyles sont agités 3 h dans du tampon 10-3 M pH 6,3 additionné (B) ou non (A) d'auxine (5.10-6 M). Le mode d'obtention des 3 fractions cellulaires étudiées (p, S, et S2) est décrit dans Matériel et méthodes. Les activités sont exprimées en micromoles d'oligosides réducteurs apparus par heure et par gramme frais d'hypocotyle. MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les conditions de culture et le mode d'obtention des parois ont été décrits précédemment. Dans les expériences ayant pour but de comparer les activités pariétales et cytoplasmiques, les tissus ont été broyés dans du tampon citrate 10-3 M de pH 5,6 (dans ces conditions, aucune solubilisation, même partielle, des activités 3 endoglucanases pariétales ne peut être observée). 2 centrifugations successives de 15 mn à 1 000 g sont alors effectuées et les culots obtenus, lavés sur une toile à l'intérail (vide de mailles : 30 Jl) puis tenus en suspension dans de l'eau distillée (fraction p). Les surnageants des 2 premières centrifugations sont réunis et subissent une nouvelle centrifugation de 30 mn à 40 000 g; le culot ainsi obtenu est remis en suspension dans du tampon citrate 10-3 M pH 5,6 (fraction S,). Du sulfate d'ammonium (662 g/1) est ajouté au nouveau surnageant, le précipité qui se forme alors est récupéré après centrifugation et remis en suspension dans du tampon citrate 10-3 M et dialysé contre ce même tampon (fraction S2). Fig. 1. — Représentation graphique selon Lineweaver et Burk de la vitesse d'hydrolyse (V) de la laminarine en fonction de la concentration du substrat (S) dans
des activités 3 endoglucanases pariétales ne peut être observée). 2 centrifugations successives de 15 mn à 1 000 g sont alors effectuées et les culots obtenus, lavés sur une toile à l'intérail (vide de mailles : 30 Jl) puis tenus en suspension dans de l'eau distillée (fraction p). Les surnageants des 2 premières centrifugations sont réunis et subissent une nouvelle centrifugation de 30 mn à 40 000 g; le culot ainsi obtenu est remis en suspension dans du tampon citrate 10-3 M pH 5,6 (fraction S,). Du sulfate d'ammonium (662 g/1) est ajouté au nouveau surnageant, le précipité qui se forme alors est récupéré après centrifugation et remis en suspension dans du tampon citrate 10-3 M et dialysé contre ce même tampon (fraction S2). Fig. 1. — Représentation graphique selon Lineweaver et Burk de la vitesse d'hydrolyse (V) de la laminarine en fonction de la concentration du substrat (S) dans le milieu d'incubation. V, exprimée en micromoles d'oligosides réducteurs formés par heure par milligramme de matière sèche de parois. S en 10-3 M. A, parois provenant de segments traités 3 h par du tampon 10-3 M. B, parois provenant de segments traités 3 h par une solution tampon 10-3 M additionnée d'IAA (5.10-6 M). L'activité P 1 3 endoglucanase est estimée par la vitesse d'hydrolyse de la laminarine dans des conditions décrites par ailleurs. Les glucanases pariétales ont été éluées en incubant des parois dans du tampon citrate 0,5 M à pH 5,6 pendant 1 h; après filtration et lavage des parois, la solution obtenue est dialysée contre de l'eau distillée. RÉSULTATS. — 1. Comportement cinétique des activités pariétales. — Certaines activités pariétales présentent un comportement cinétique atypique. Il était donc important, avant de procéder à des estimations de niveau d'activité, de déterminer si l’activité de la P1-3 endoglucanase pariétale pouvait être caractérisée par les paramètres Vm et KM de la cinétique michaelienne. Comme le montre la figure 1, le comportement cinétique de cette enzyme (à la différence de celui de la phosphatase acide) est apparemment classique et présente une affinité relativement faible pour son substrat (fig. 1). 2. Influence
additionnée d'IAA (5.10-6 M). L'activité P 1 3 endoglucanase est estimée par la vitesse d'hydrolyse de la laminarine dans des conditions décrites par ailleurs. Les glucanases pariétales ont été éluées en incubant des parois dans du tampon citrate 0,5 M à pH 5,6 pendant 1 h; après filtration et lavage des parois, la solution obtenue est dialysée contre de l'eau distillée. RÉSULTATS. — 1. Comportement cinétique des activités pariétales. — Certaines activités pariétales présentent un comportement cinétique atypique. Il était donc important, avant de procéder à des estimations de niveau d'activité, de déterminer si l’activité de la P1-3 endoglucanase pariétale pouvait être caractérisée par les paramètres Vm et KM de la cinétique michaelienne. Comme le montre la figure 1, le comportement cinétique de cette enzyme (à la différence de celui de la phosphatase acide) est apparemment classique et présente une affinité relativement faible pour son substrat (fig. 1). 2. Influence d’un traitement préalable par l’auxine sur les activités P1-3 endoglucanases pariétales. — 6 expériences consécutives ont montré que les parois provenant de segments traités par l’auxine possèdent toujours une activité P1-3 endoglucanase plus élevée que les parois provenant de segments traités simplement par du tampon : la vitesse initiale d’hydrolyse de la laminarine est augmentée d’environ 20 %. 3. Répartition des activités P1-3 endoglucanases dans la cellule. — L’examen des résultats rapportés dans le tableau met en évidence 2 faits intéressants. 80 % de l’activité P1-3 endoglucanase est localisée au niveau des parois (fraction p); la fraction S, pourrait également contenir des débris de parois extrêmement petits. Le traitement des segments d’hippocotyles par l’auxine provoque l’augmentation des activités des fractions solubles et particulaires. Cette augmentation peut provenir soit d’une modification de la structure des parois (hypothèse 1), soit de l’augmentation de la quantité totale d’enzymes actives dans la cellule (hypothèse 2). Dans le premier cas, l’effet primaire de l’auxine correspond à une stimulation de l’exsorption de protons, l’acidification entraînant secondairement des modifications dans la composition chimique des parois [Jacobs et Ray (6), Nevins (7)]. Ces modifications pourraient provoquer, d’une part, la libération dans le cytoplasme d’enzymes fixées sur les parois
de la laminarine est augmentée d’environ 20 %. 3. Répartition des activités P1-3 endoglucanases dans la cellule. — L’examen des résultats rapportés dans le tableau met en évidence 2 faits intéressants. 80 % de l’activité P1-3 endoglucanase est localisée au niveau des parois (fraction p); la fraction S, pourrait également contenir des débris de parois extrêmement petits. Le traitement des segments d’hippocotyles par l’auxine provoque l’augmentation des activités des fractions solubles et particulaires. Cette augmentation peut provenir soit d’une modification de la structure des parois (hypothèse 1), soit de l’augmentation de la quantité totale d’enzymes actives dans la cellule (hypothèse 2). Dans le premier cas, l’effet primaire de l’auxine correspond à une stimulation de l’exsorption de protons, l’acidification entraînant secondairement des modifications dans la composition chimique des parois [Jacobs et Ray (6), Nevins (7)]. Ces modifications pourraient provoquer, d’une part, la libération dans le cytoplasme d’enzymes fixées sur les parois et une augmentation des activités enzymatiques des fractions solubles (fraction S2), d’autre part une plus grande affinité de l’enzyme pariétale pour son substrat ou des variations dans l’accessibilité du substrat (8), donc une augmentation de l’activité des enzymes fixées sur les parois (fraction p). Nous avons effectivement constaté que l’affinité de la P1-3 endoglucanase pour la laminarine est fortement influencée par les structures environnantes : le KM de l’enzyme pariétale in situ (fixée sur les parois) est 10 fois plus élevé que celui de cette même enzyme en solution (après élution par une solution saline) (fig. 2). L’examen du comportement cinétique des P1-3 endoglucanases de parois provenant de segments traités, les uns par l’auxine, les autres par le tampon (fig. 1), ne permet cependant pas de mettre en évidence une modification de conformation à l’intérieur de la paroi. En effet, pour obtenir, à la concentration en substrat utilisée, une augmentation de 20 % de la vitesse d’hydrolyse de la laminarine, il suffirait que la valeur du KV1 passe de 4.0 à 3.5.10-3 M ; or, un aussi faible déplacement ne peut être apprécié graphiquement (fig. 1). Par ailleurs, Davies et Maclachlan (9) ont montré que l’acide indolylacétique stimulait la synthèse
de la P1-3 endoglucanase pour la laminarine est fortement influencée par les structures environnantes : le KM de l’enzyme pariétale in situ (fixée sur les parois) est 10 fois plus élevé que celui de cette même enzyme en solution (après élution par une solution saline) (fig. 2). L’examen du comportement cinétique des P1-3 endoglucanases de parois provenant de segments traités, les uns par l’auxine, les autres par le tampon (fig. 1), ne permet cependant pas de mettre en évidence une modification de conformation à l’intérieur de la paroi. En effet, pour obtenir, à la concentration en substrat utilisée, une augmentation de 20 % de la vitesse d’hydrolyse de la laminarine, il suffirait que la valeur du KV1 passe de 4.0 à 3.5.10-3 M ; or, un aussi faible déplacement ne peut être apprécié graphiquement (fig. 1). Par ailleurs, Davies et Maclachlan (9) ont montré que l’acide indolylacétique stimulait la synthèse des cellulases ; il se pourrait donc que l’augmentation des activités P1-3 glucanasiques résulte d’une stimulation par l’auxine de la synthèse de ces enzymes (hypothèse 2). Dans ce cas, l’acide indolyl-acétique agirait sur la croissance par deux mécanismes différents : d’une part, en provoquant l’acidification de l’espace périplasmique, il entraînerait l’augmentation de l’activité des glucanases pariétales (1), d’autre part, en stimulant les synthèses protéiques, il conduirait à l’augmentation des activités des fractions solubles, puis à celle des fractions particulières. Un tel schéma est en accord avec les derniers résultats de Vanderhoef et coll. (10, 11) qui ont mis en évidence 2 réponses à l’auxine, espacées dans le temps et différemment affectées par certains inhibiteurs. La première réponse correspondrait alors à l’exsorption de protons et la seconde à l’augmentation des activités glucanasiques des fractions solubles, ce qui entraînerait ultérieurement une augmentation des activités localisées sur les parois. M. B. — Les concentrations en laminarine indiquées dans les légendes des figures 1 et 2 ont été calculées en prenant arbitrairement une masse moléculaire égale à 180 g. Séance du 31 janvier 1977. (1) R. GOLDBERG, Plant Sc. Letters (sous presse). (2) E. DAVIES et G. A. MACLACHLAN, Arch. Biochem. Biophys., 128, 1968,
l’augmentation de l’activité des glucanases pariétales (1), d’autre part, en stimulant les synthèses protéiques, il conduirait à l’augmentation des activités des fractions solubles, puis à celle des fractions particulières. Un tel schéma est en accord avec les derniers résultats de Vanderhoef et coll. (10, 11) qui ont mis en évidence 2 réponses à l’auxine, espacées dans le temps et différemment affectées par certains inhibiteurs. La première réponse correspondrait alors à l’exsorption de protons et la seconde à l’augmentation des activités glucanasiques des fractions solubles, ce qui entraînerait ultérieurement une augmentation des activités localisées sur les parois. M. B. — Les concentrations en laminarine indiquées dans les légendes des figures 1 et 2 ont été calculées en prenant arbitrairement une masse moléculaire égale à 180 g. Séance du 31 janvier 1977. (1) R. GOLDBERG, Plant Sc. Letters (sous presse). (2) E. DAVIES et G. A. MACLACHLAN, Arch. Biochem. Biophys., 128, 1968, 595. (3) E. DAVIES et G. A. MACLACHLAN, Arch. Biochem. Biophys., 129, 1969, 581. (4) H. BYRNE, N. V. CHRISTOU, D. P. S. VERMA et G. A. MACLACHLAN, J. Biol. Chem., 250, 1975, 1012. (5) M. LUGON, R. GOLDBERG et J. GUERN, Comptes rendus, 278, série D, 1974, 1221. (6) M. JACOBS et P. M. RAY, Plant Physiol., 56, 1975, 373. (7) D. J. NEVINS, Plant and Cell Physiol., 16, 1975, 347. (8) E. SELEGNY, G. BROWN et D. THOMAS, Comptes rendus, 269, série D, 1969, 1330. (9) L. N. VANDERHOEF et C. A. STAHL, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 72, 1975, 1822. (10) L. N. VANDERHOEF, C. A. STAHL et T. S. Lu, Plant Physiol., 58, 1976, 402. Service des Hormones végétales, Université Paris VI, 4, place Jussieu, 75230 Paris Cedex 05. PHYSIOLOGIE VÉGÉTALE. — Inhibition de la floraison par la zeatine chez Anagallis arvensis L. soumis au traitement photopériodique inductif. Note de Denise Fontaine, Nicole Dugué et Émile Miginiac, présentée par M. Lucien Plantefol. L'application d’une solution de zeatine sur la région apicale des plantes au cours des phases d’induction et d’expression florales, modifie de manière significative la réponse des plantes traitées par rapport à celle des témoins.