jeanflop/post_ocr_correction2 huggingface dataset:
the presence of natural cytokinins. Some of them were identified. Les propriétés radiorestauratrices des extraits de levure [1] [2] [3] de certains tRNA qui en sont issus [4] [5] [6] et de la fraction mononucléotidique des hydrolysats de tRNA [7] sont connues. On sait aussi que les acides aminés préparés à partir des extraits de levure manifestent également une activité radiorestauratrice alors qu'un mélange réalisé à partir des mêmes acides aminés commerciaux n'en présente pas [8]. Or, l'effet radiorestaurateur de certaines cytokinines exogènes [9] [10] [11] et l'existence de cytokinines libres dans les extraits de levures [12] [13] [14] ont déjà été signalés. Il nous fallait donc préciser la nature des cytokinines contenues dans nos extraits de levure, puis mettre en évidence le fait que l'activité radiorestauratrice des solutions d'acides aminés isolés de ces extraits est en rapport avec la présence dans celles-ci d'une ou plusieurs cytokinines endogènes. MÉTODES. — 1° Extraction des cytokinines à partir d'extraits de levure les cytokinines sont isolées à partir de 100 g d'extrait de levure « Difco » selon des techniques procédant de celles de Van Staden [9]. L'extrait éthanolique ainsi préparé est divisé en 2 parties soumises à 2 chromatographies séparées sur papier W3MM (isopropanol-ammoniaque-eau 10 1 1 v/v). Les 10 bandes égales obtenues par découpage du premier chromatogramme sont utilisées directement pour un premier test biologique. Dans le second chromatogramme, la région comprise entre les Rf 0.65 et 0.8 est découpée et élutée par l'éthanol 80%; cette solution éthanolique concentrée est ensuite déposée sur une colonne de « Sephadex LH20 »; les fractions récoltées par une élustion à l'éthanol 35% [15] sont regroupées et font l'objet d'un second test biologique. Cette technique permet une meilleure séparation des deux cytokinines à Rf voisins la zeatine (Z) et son riboside (ZR). 2° Extraction des cytokinines à partir d'une solution d'acides aminés de levure la préparation du mélange d'acides aminés est réalisée à partir de 50 g d'extraits de levure selon la technique de Pawlak et Pion [20] modifiée par Cuq [10]. Le résidu obtenu est repris par 6 ml d'eau et cette solution est
W3MM (isopropanol-ammoniaque-eau 10 1 1 v/v). Les 10 bandes égales obtenues par découpage du premier chromatogramme sont utilisées directement pour un premier test biologique. Dans le second chromatogramme, la région comprise entre les Rf 0.65 et 0.8 est découpée et élutée par l'éthanol 80%; cette solution éthanolique concentrée est ensuite déposée sur une colonne de « Sephadex LH20 »; les fractions récoltées par une élustion à l'éthanol 35% [15] sont regroupées et font l'objet d'un second test biologique. Cette technique permet une meilleure séparation des deux cytokinines à Rf voisins la zeatine (Z) et son riboside (ZR). 2° Extraction des cytokinines à partir d'une solution d'acides aminés de levure la préparation du mélange d'acides aminés est réalisée à partir de 50 g d'extraits de levure selon la technique de Pawlak et Pion [20] modifiée par Cuq [10]. Le résidu obtenu est repris par 6 ml d'eau et cette solution est ajustée à pH 8. Les cytokinines sont extraites par le n-butanol saturé d'eau. Les phases butaniques réduites à sec sous vide à 40°C, sont reprises par l'éthanol 80% puis chromatographiées sur W3MM dans le mélange acétate d'éthyle-acide formique-eau 60 5 35 v/v (chromatogramme noté « phase butanique 1 »). De la phase aqueuse restante après une hydrolyse alcaline, on extrait à nouveau les cytokinines par le n-butanol. Cette phase butanique réduite à sec à 40°C, puis reprise par l'éthanol 80 est également chromatographiée (chromatogramme noté « phase butanique 2 »). La dernière fraction aqueuse restante est refroidie (-5°C), centrifugée après précipitation des sels, et le surnageant est ensuite chromatographié (chromatogramme noté « phase aqueuse »). 30 Tests biologiques l'étude préliminaire utilise comme test la production en présence de cytokinines, de phycocyanines par les plantules d'Amaranthus caudatus [(22), (23)]. Les autres tests sont tous réalisés selon la méthode de Linsmaier et Skoog [24]. Les élusats des divers chromatogrammes sont incorporés dans les milieux de culture gélosés (0,8 %) et glucosés (3 0,;&gt; contenant les solutions minérales de Linsmaier et Skoog et de l'acide naphtalène acétique (0,52 mg/1). Des tissus normaux de Tabac Wisconsin 38 sont ensuite ensemencés sur les milieux contenant
la phase aqueuse restante après une hydrolyse alcaline, on extrait à nouveau les cytokinines par le n-butanol. Cette phase butanique réduite à sec à 40°C, puis reprise par l'éthanol 80 est également chromatographiée (chromatogramme noté « phase butanique 2 »). La dernière fraction aqueuse restante est refroidie (-5°C), centrifugée après précipitation des sels, et le surnageant est ensuite chromatographié (chromatogramme noté « phase aqueuse »). 30 Tests biologiques l'étude préliminaire utilise comme test la production en présence de cytokinines, de phycocyanines par les plantules d'Amaranthus caudatus [(22), (23)]. Les autres tests sont tous réalisés selon la méthode de Linsmaier et Skoog [24]. Les élusats des divers chromatogrammes sont incorporés dans les milieux de culture gélosés (0,8 %) et glucosés (3 0,;&gt; contenant les solutions minérales de Linsmaier et Skoog et de l'acide naphtalène acétique (0,52 mg/1). Des tissus normaux de Tabac Wisconsin 38 sont ensuite ensemencés sur les milieux contenant ou non les cytokinines à identifier, et leur croissance évaluée après un mois, permet d'estimer la teneur en cytokinine du milieu. Des milieux additionnés ou non de différentes concentrations en kinétine servent de témoins de référence. RÉSULTATS. — Un test « Amantelle » préliminaire nous a permis de contrôler de manière approximative l'activité cytokinique des extraits de levure [18] jug de kinétine et des tRNA de levure partiellement hydrolysés [40] |Lig de kinétine. 1. Activité cytokinique des extraits de levure « Difco ». — Les résultats obtenus au moyen du test Tabac W 38 sont résumés dans les deux histogrammes des figures 1 et 2. Chaque pic correspond à l'accroissement des colonies tissulaires de Tabac dans des milieux contenant les élusats chromatographiques correspondant à des Rf connus. L'examen du premier histogramme (fig. 1) permet la mise en évidence de deux groupes de cytokinines : d'une part, au niveau des Rf compris entre 0,1 et 0,3, un premier groupe renfermant des substances à activités cytokiniques non identifiées, d'autre part un second groupe comprenant un mélange de zéatine et de zéatine riboside non séparées pour les Rf compris entre 0,6 et 0,8. L'examen du second histogramme (fig. 2) nous a permis, dans
manière approximative l'activité cytokinique des extraits de levure [18] jug de kinétine et des tRNA de levure partiellement hydrolysés [40] |Lig de kinétine. 1. Activité cytokinique des extraits de levure « Difco ». — Les résultats obtenus au moyen du test Tabac W 38 sont résumés dans les deux histogrammes des figures 1 et 2. Chaque pic correspond à l'accroissement des colonies tissulaires de Tabac dans des milieux contenant les élusats chromatographiques correspondant à des Rf connus. L'examen du premier histogramme (fig. 1) permet la mise en évidence de deux groupes de cytokinines : d'une part, au niveau des Rf compris entre 0,1 et 0,3, un premier groupe renfermant des substances à activités cytokiniques non identifiées, d'autre part un second groupe comprenant un mélange de zéatine et de zéatine riboside non séparées pour les Rf compris entre 0,6 et 0,8. L'examen du second histogramme (fig. 2) nous a permis, dans cette zone de Rf compris entre 0,6 et 0,8 de séparer les activités cytokiniques de ces deux dernières substances. En effet, deux pics séparés correspondent alors à la présence de zéatine riboside (fraction IV) et de zéatine (fraction VI) (19). Notons ici que la présence de 2iP et de 2iPA n'a pas été détectée dans l'histogramme de manière certaine. 2. Les activités cytokiniques du mélange d'acides aminés séparés de la levure. — Les histogrammes des figures 3,4 et 5 résumant les résultats obtenus nous indiquent qu'aucune activité cytokinique significative n'est décelable dans les extraits des phases butanoliques 1 et 2 (fig. 3 et 4). Par contre, une activité cytokinique est décelable dans la fraction phase aqueuse. Elle correspond à des activités faibles au niveau de la zéatine et de son riboside, mais surtout à celles plus importantes au niveau des 2iP et 2iPA. DISCUSSION ET CONCLUSIONS. — Les activités détectées dans les extraits de levure mettent en évidence la présence d'un groupe de cytokinines non identifiées dont les Rf sont compris entre 0,1 et 0,2 à côté de cytokinines identifiables telles que la zéatine et son riboside. Dans les mélanges d'acides aminés de levure, ces activités peuvent être dues à
n'a pas été détectée dans l'histogramme de manière certaine. 2. Les activités cytokiniques du mélange d'acides aminés séparés de la levure. — Les histogrammes des figures 3,4 et 5 résumant les résultats obtenus nous indiquent qu'aucune activité cytokinique significative n'est décelable dans les extraits des phases butanoliques 1 et 2 (fig. 3 et 4). Par contre, une activité cytokinique est décelable dans la fraction phase aqueuse. Elle correspond à des activités faibles au niveau de la zéatine et de son riboside, mais surtout à celles plus importantes au niveau des 2iP et 2iPA. DISCUSSION ET CONCLUSIONS. — Les activités détectées dans les extraits de levure mettent en évidence la présence d'un groupe de cytokinines non identifiées dont les Rf sont compris entre 0,1 et 0,2 à côté de cytokinines identifiables telles que la zéatine et son riboside. Dans les mélanges d'acides aminés de levure, ces activités peuvent être dues à des cytokinines identifiables telles que la zéatine, la 2iP et leurs ribosides qui contamineraient la solution d'acides aminés, des cytokinines étant retenues par la résine IRA 410, puis précipitées sous forme de picrates; soit encore à des substances à activité cytokinique du type N-(9-β-D ribofuranosyl) purine-6-yl carbamoyl) glycine ou threonine que Hall et puis Schweizer et coll. (26) ont identifiées à partir de tRNA de levure. Ces interprétations pourraient aussi s'appliquer, à notre avis, aux observations de Van Staden (27) sur les propriétés qu'aurait la phénylalanine, d'induire les divisions cellulaires des calluses de Soja. Si on sait que de nombreuses substances à activité cytokinique sont des radiorestaurateurs efficaces vis-à-vis des tissus tumoraux et normaux (28), ces premiers résultats nous permettent de supposer qu'une part importante des activités radiorestauratrices des extraits de levure et de leurs fractions séparées, tRNA et mélange d'acides aminés, serait due à leur richesse en cytokinines. (*) Séance du 7 février 1977. (1) R. JONARD, Comptes rendus, 251, 1960, p. 588. (2) R. JONARD, R. MARIE, B. LAIGNELET et B. FOULETIER, Extrait du Congrès national de la Société savante, Toulouse, 1971, Sect. Sci., IV, p. 547-555. (3) B. LAIGNELET, B. FOULETIER et R. JONARD, Comptes rendus, 271,
que Hall et puis Schweizer et coll. (26) ont identifiées à partir de tRNA de levure. Ces interprétations pourraient aussi s'appliquer, à notre avis, aux observations de Van Staden (27) sur les propriétés qu'aurait la phénylalanine, d'induire les divisions cellulaires des calluses de Soja. Si on sait que de nombreuses substances à activité cytokinique sont des radiorestaurateurs efficaces vis-à-vis des tissus tumoraux et normaux (28), ces premiers résultats nous permettent de supposer qu'une part importante des activités radiorestauratrices des extraits de levure et de leurs fractions séparées, tRNA et mélange d'acides aminés, serait due à leur richesse en cytokinines. (*) Séance du 7 février 1977. (1) R. JONARD, Comptes rendus, 251, 1960, p. 588. (2) R. JONARD, R. MARIE, B. LAIGNELET et B. FOULETIER, Extrait du Congrès national de la Société savante, Toulouse, 1971, Sect. Sci., IV, p. 547-555. (3) B. LAIGNELET, B. FOULETIER et R. JONARD, Comptes rendus, 271, série D, 1970, p. 1884. (4) R. JONARD et D. RAVELOMANANA, Comptes rendus, 278, série D, 1974, p. 389. (5) R. JONARD et D. RAVELOMANANA, Comptes rendus, 280, série D, 1975, p. 803. (6) J. BAYONOVE, J. N. MARIEN, D. RAVELOMANANA, A. SOLER et R. JONARD, Radiation Botany, 15, 1975, p. 349-362. (7) B. FOULETIER, T. BRUN, R. JONARD et P. PEREAU-LEROY, Comptes rendus, 274, série D, 1972, p. 1315. (8) D. RAVELOMANANA, H. OHLENBUSH et R. JONARD, Comptes rendus, 280, série D, 1975, p. 1047. (9) R. JONARD et J. BAYONOVE (en préparation). (10) R. JONARD et A. SOLER, Comptes rendus, 277, série D, 1973, p. 1305. (11) G. V. IL'INA et N. N. KUZNETSOVA, Fiziologiya Rastenii, 22, n° 2, 1975, p. 394-400. (12) J. VAN STADEN, Physiol. Plant., 30, 1974, p. 182-184. (13) F. SKOOG, D. J. ARMSTRONG, J. D. CHERAYIL, A. E. HAMPEL et R. M. BOCK, Science, 154, 1966, p. 1354-1356. (14) A. KOVOOR et C. RUCH, Comptes rendus, 259, 1964, p. 3352. (15) D. KLAMBT et A. KOVOOR, Physiologia Plantarum, 22, 1969, p. 453-457. (16) S. M. HECHT, N. J. LEONARD, J. OCCOLOWITZ, W. J. BURROWS, D. J. ARMSTRONG, F. SKOOG, R. M. BOCK, I.
p. 349-362. (7) B. FOULETIER, T. BRUN, R. JONARD et P. PEREAU-LEROY, Comptes rendus, 274, série D, 1972, p. 1315. (8) D. RAVELOMANANA, H. OHLENBUSH et R. JONARD, Comptes rendus, 280, série D, 1975, p. 1047. (9) R. JONARD et J. BAYONOVE (en préparation). (10) R. JONARD et A. SOLER, Comptes rendus, 277, série D, 1973, p. 1305. (11) G. V. IL'INA et N. N. KUZNETSOVA, Fiziologiya Rastenii, 22, n° 2, 1975, p. 394-400. (12) J. VAN STADEN, Physiol. Plant., 30, 1974, p. 182-184. (13) F. SKOOG, D. J. ARMSTRONG, J. D. CHERAYIL, A. E. HAMPEL et R. M. BOCK, Science, 154, 1966, p. 1354-1356. (14) A. KOVOOR et C. RUCH, Comptes rendus, 259, 1964, p. 3352. (15) D. KLAMBT et A. KOVOOR, Physiologia Plantarum, 22, 1969, p. 453-457. (16) S. M. HECHT, N. J. LEONARD, J. OCCOLOWITZ, W. J. BURROWS, D. J. ARMSTRONG, F. SKOOG, R. M. BOCK, I. GILLAM et G. M. TENER, Biochem. and bioph. research Comm., 35, n° 2, 1969, p. 205-209. (17) D. J. ARMSTRONG, F. SKOOG, L. H. KIRKEGAARD, A. E. HAMPEL, R. M. BOCK, I. GILLAM et G. M. TENER, Proc. Nat. Acad. Sci. US, 63, 1969, p. 504-511. (18) M. GIANNATTASIO, G. JEANNIN et A. KOVOOR, Physiologia Plantarum, 22, 1969, p. 458-461. (19) D. J. ARMSTRONG, W. J. BURROWS, P. K. EVANS et F. SKOOG, Biochimie and Biophysica Research Communications. 37, n° 3, 1969, p. 451-456. PAWLAK et PION. Proc. 7th Internat. Congr. Nutrit., Hamburg. 4. 1966. A. L. Cru. Thèse. Montpellier. 1973, 85 p. C. BIGOT, Comptes rendus, 266, série D, 1968, p. 349. N. L. BIDDINGTON et T. H. THOMAS, Planta, Berlin, 11, 1973, p. 183-186. E. M. LINSMAIER et F. SKOOG, Physiol. Plant., 18, 1965, p. 100-127. R. H. HALL, Biochem., 3, 1964, p. 769. M. P. SCHWEIZER, K. MCGRATH et L. BACZYNSKYJ, Bioch. Bioph. Reserach Comm.. 40, 1970, p. 1046-1053. J. VAN STADEN et S. E. DREWÈS, Physiol. Plant., 32, 1974, p. 347-352. R. JONARD et J. BAYONOVE, Comptes rendus, 283, série D, 1976, p. 431. R. JONARD et J. BAYONOVE, Comptes rendus, 283, série D, 1976, p.
JEANNIN et A. KOVOOR, Physiologia Plantarum, 22, 1969, p. 458-461. (19) D. J. ARMSTRONG, W. J. BURROWS, P. K. EVANS et F. SKOOG, Biochimie and Biophysica Research Communications. 37, n° 3, 1969, p. 451-456. PAWLAK et PION. Proc. 7th Internat. Congr. Nutrit., Hamburg. 4. 1966. A. L. Cru. Thèse. Montpellier. 1973, 85 p. C. BIGOT, Comptes rendus, 266, série D, 1968, p. 349. N. L. BIDDINGTON et T. H. THOMAS, Planta, Berlin, 11, 1973, p. 183-186. E. M. LINSMAIER et F. SKOOG, Physiol. Plant., 18, 1965, p. 100-127. R. H. HALL, Biochem., 3, 1964, p. 769. M. P. SCHWEIZER, K. MCGRATH et L. BACZYNSKYJ, Bioch. Bioph. Reserach Comm.. 40, 1970, p. 1046-1053. J. VAN STADEN et S. E. DREWÈS, Physiol. Plant., 32, 1974, p. 347-352. R. JONARD et J. BAYONOVE, Comptes rendus, 283, série D, 1976, p. 431. R. JONARD et J. BAYONOVE, Comptes rendus, 283, série D, 1976, p. 275. Université des Sciences et Techniques du Languedoc, Laboratoire d'Histophysiologie et Radiobiologie végétales, Place Eugène-Bataillon, 34060 Montpellier Cedex. P. B. Laboratoire de Physiologie végétale, U.E.R.S.E.N., Parc Vairy, 06034 Nice Cedex. BIOCHIMIE. — Identification du groupement glutamique essentiel de la 3-phosphoglycérate kinase de levure. Note de Gisèle Desvages, Claude Roustan, Annie Brevet et Louise-Anne Pradel, présentée par M. Jean Roche. Dans le contexte d'une étude consacrée à la modification des résidus essentiels à l'activité de la 3-phosphoglycérate kinase de levure, nous avons pu isoler et identifier un résidu glutamique dont la modification au moyen de la réaction couplée carbodiimide-nitrotyrosine. entraîne une inactivation totale de l'enzyme. The incorporation of nitrotyrosine into 3-phosphoglycerate kinase activated by carbodiimide results in the chemical modification of a single essential residue. After total proteolytic digestion, isolation of the dipeptide Glu-NO2 Tyr by immuno-affinity chromatography indicates the implication of a glutamyl residue. It is interesting to point out the applicability of the method described for the purification of peptides containing carboxyl residues. Les carbodiimides sont connus comme étant de bons réactifs pour la modification spécifique des fonctions carboxyliques dans les protéines; ils activent ces fonctions en permettant l'incorporation d'un nucléophile. Au cours de travaux antérieurs portant sur l'étude
Brevet et Louise-Anne Pradel, présentée par M. Jean Roche. Dans le contexte d'une étude consacrée à la modification des résidus essentiels à l'activité de la 3-phosphoglycérate kinase de levure, nous avons pu isoler et identifier un résidu glutamique dont la modification au moyen de la réaction couplée carbodiimide-nitrotyrosine. entraîne une inactivation totale de l'enzyme. The incorporation of nitrotyrosine into 3-phosphoglycerate kinase activated by carbodiimide results in the chemical modification of a single essential residue. After total proteolytic digestion, isolation of the dipeptide Glu-NO2 Tyr by immuno-affinity chromatography indicates the implication of a glutamyl residue. It is interesting to point out the applicability of the method described for the purification of peptides containing carboxyl residues. Les carbodiimides sont connus comme étant de bons réactifs pour la modification spécifique des fonctions carboxyliques dans les protéines; ils activent ces fonctions en permettant l'incorporation d'un nucléophile. Au cours de travaux antérieurs portant sur l'étude de la topologie du site actif de diverses kinases du système glycolytique, notamment la 3-phosphoglycérate kinase et l'hexokinase, nous avions déjà utilisé avec succès ce type de réactif (3), (4), (5). Dans le cas de la 3-phosphoglycérate kinase de levure, en faisant réagir la glycine ethyl ester en présence de carbodiimide, un groupement carboxylique essentiel peut être modifié au centre actif de cette enzyme; de plus, ainsi modifiée et complètement inactivée, la 3-phosphoglycérate kinase continue à fixer normalement ses substrats. Ces résultats nous ont amenés à attribuer un rôle catalytique à ce groupement essentiel. Cependant, la nature exacte de l'acide aminé touché (acide aspartique ou acide glutamique) restait à déterminer. Les résultats présentés ici montrent que ce groupement essentiel est un résidu d'acide glutamique. De plus, la méthode de chromatographie par immunoaffinité que nous avons utilisée est applicable plus généralement pour l'isolement de peptides contenant des groupements carboxyles. La 3-phosphoglycérate kinase de levure que nous avons utilisée est préparée selon la méthode de Scopes (6); son activité spécifique est d'au moins 1 300 unités par milligramme à 30°C et à pH 7,5. Le processus d'inactivation par le l-cyclohexyl-3 (-2-morpholino ethyl) carbodiimide méthyl-toluène sulfonate (CMC) et la nitrotyrosine ethyl ester a
carbodiimide, un groupement carboxylique essentiel peut être modifié au centre actif de cette enzyme; de plus, ainsi modifiée et complètement inactivée, la 3-phosphoglycérate kinase continue à fixer normalement ses substrats. Ces résultats nous ont amenés à attribuer un rôle catalytique à ce groupement essentiel. Cependant, la nature exacte de l'acide aminé touché (acide aspartique ou acide glutamique) restait à déterminer. Les résultats présentés ici montrent que ce groupement essentiel est un résidu d'acide glutamique. De plus, la méthode de chromatographie par immunoaffinité que nous avons utilisée est applicable plus généralement pour l'isolement de peptides contenant des groupements carboxyles. La 3-phosphoglycérate kinase de levure que nous avons utilisée est préparée selon la méthode de Scopes (6); son activité spécifique est d'au moins 1 300 unités par milligramme à 30°C et à pH 7,5. Le processus d'inactivation par le l-cyclohexyl-3 (-2-morpholino ethyl) carbodiimide méthyl-toluène sulfonate (CMC) et la nitrotyrosine ethyl ester a tout d'abord été étudié. La figure 1 montre que le CMC (0,1 M) produit une faible inactivation de l'enzyme, que la nitrotyrosine ethyl ester n'a pas d'effet sur l'activité tandis que la combinaison de ces 2 réactifs augmente fortement la vitesse d'inactivation. Ces résultats suggèrent une incorporation spécifique de la nitrotyrosine sur le groupement carboxylique essentiel de la 3-phosphoglycérate kinase d'une façon analogue à celle obtenue précédemment avec la glycine éthyl ester (2). La quantité de tyrosine nitrée incorporée sur des échantillons diversement inactivés a été déterminée sur analyseur d'acides aminés (Technicon, type TSM 1), après hydrolyse acide totale; les résultats obtenus reportés sur la figure 2 montrent qu'il existe une relation linéaire entre la perte d'activité et l'incorporation du nucléophile et qu'à une mole de tyrosine nitrée fixée par mole d'enzyme, correspond une inactivation totale. Fig. 1. — Inactivation de la 3-phosphoglycérate kinase de levure par le CMC. Tampon phosphate 0,1 M, pH 6,1, température 17°C. Concentration en enzyme 0,05 mmole/ml. (A) Concentration en ester éthylique de la nitrotyrosine 0,03 mmole/ml. (x) Concentration en CMC 0,1 mmole/ml. (0) Concentration en CMC 0,1 mmole/ml et en ester éthylique de la nitrotyrosine 0,03 mmole/ml. Fig. 2. — Effet de l'incorporation de