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depuis, lorsque le tube est envahi et le milieu de culture épuisé, ces cellules prolifèrent toujours dans le laboratoire de l’inventeur de la technique. Les progrès considérables réalisés en matière d’hormonologie, de physiologie et de biochimie végétales durant ces quarante-cinq dernières années ont fait de cette découverte un modèle remarquable pour la recherche fondamentale en biologie générale et un outil qui est en train de devenir particulièrement performant au service de la santé, de l'alimentation, du confort et de la joie de vivre de l’homme. Il est évident qu’il est impossible ici de faire un exposé exhaustif en la matière
impossible ici de faire un exposé exhaustif en la matière ; nous présenterons donc quelques exemples des potentialités et des réalisations actuelles de la culture in vitro des cellules et tissus végétaux. L'article a été subdivisé très arbitrairement (car tout est lié en biologie), en deux grands chapitres : — le premier donne une plus grande importance à la cellule ; — le second est plus spécialement axé sur la culture in vitro d’organismes végétaux. MOTS CÉDÉS : APPLICATION, BIOTECHNOLOGIE, CULTURE, VEGETAL SUPÉRIEUR. Fig. 1. — La mise au point des milieux de culture exige des recherches en biochimie et
des milieux de culture exige des recherches en biochimie et hormonologie végétales : on voit ci-contre que la cafeylputrescine (un composé naturel des ovules) a un net effet en présence d’une hormone, l’acide indol-3-acétique (AIA), sur la production des racines à partir de fragments de limbe de tabac en culture in vitro. En présence d’une autre hormone, la benzylamide (BA) ou de BA + AIA on a une abondante production de bourgeons. CE QU’APPORTENT ET PEUT APPORTER LA CULTURE IN VITRO DE CELLULES VEGETALES On sait aujourd’hui que chaque cellule d’une plante, qu’elle provienne d’une racine, d’une tige, d’une feuille
d’une plante, qu’elle provienne d’une racine, d’une tige, d’une feuille ou d’une fleur, renferme toutes les informations génétiques exprimées soit dans différents organes de cette plante, soit à différents moments de la vie de la même plante : pour être plus clair, l’odeur des racines d’un rosier ou d’un jasmin n’a rien de commun avec celle des fleurs de ces plantes, car elles ne fabriquent pas les principes odorants qui sont un de leurs agréments ; chaque cellule de ces racines est cependant capable de le faire, renferme toutes les informations nécessaires à la synthèse de l’essence qui flatte notre
informations nécessaires à la synthèse de l’essence qui flatte notre sens olfactif : il suffit (il faut) trouver les conditions qui permettent à ces cellules de réaliser, lorsqu’elles sont cultivées in vitro, le programme de biosynthèse en cause. L’acquisition de cette notion ouvre des perspectives d’applications très importantes. a) Culture in vitro de cellules végétales et production de molécules Plus de 40 % des principes actifs des médicaments utilisés à ce jour pour préserver la santé de l’homme proviennent d’organismes vivants et plus de 25 % des plantes supérieures ; on peut citer quelques exemples frappants : — les agents
on peut citer quelques exemples frappants : — les agents antitumoraux produits en particulier par la pervenche de Madagascar, plante aux jolies fleurs roses ou blanches ; — les analgésiques (morphine, codéine, ...) extraits du pavot connu de tous ; — les cardio-régulateurs que synthétise la digitalis qui pousse à l’orée des bois, au bord des fossés ; — les nombreux agents de régulation de la circulation sanguine et de la fragilité capillaire (extraits de marron d’Inde, myrtille, ...) ; — la production de stéroïdes par l’igname, par exemple, un des féculents des pays tropicaux. On peut certes extraire les
des féculents des pays tropicaux. On peut certes extraire les principes actifs des plantes qui les produisent : cela coûte souvent très cher et il faut suffisamment de matériel, l’accroissement de la demande aboutissant parfois à une diminution inquiétante des populations naturelles de ces plantes ; on a aussi, bien sûr, réalisé la synthèse chimique des molécules intéressantes, mais cela coûte encore souvent beaucoup plus cher. La culture de cellules végétales in vitro, en fermenteurs pour la production industrielle, ouvre ici des perspectives extrêmement séduisantes dont certaines sont en cours de réalisation ; quand on a isolé la meilleure souche
de réalisation ; quand on a isolé la meilleure souche de cellules productrices de principes actifs, trouvé les meilleures conditions de culture de ces cellules, on est assuré d’avoir une production continue et contrôlable, mais surtout économique, la puissance de biosynthèse de la cellule végétale étant à ce jour sans commune mesure avec celle des cornues des meilleurs chimistes. L'intérêt de la technique ne se limite pas à la production de produits pharmaceutiques : il est actuellement éprouvé pour l'obtention de principes odorants, de cosmétiques, d'édulcorants, etc. De plus, on s'est aperçu que les cellules végétales en culture in vitro
s'est aperçu que les cellules végétales en culture in vitro sont capables ou de produire de nouvelles molécules ou de transformer des molécules introduites dans le milieu de culture : cela ouvre, on l'imagine aisément, des horizons prometteurs. Signalons enfin que l'inventaire des molécules qu'offrent les plantes au service de l'homme est très loin d'être achevé. Il est scientifiquement sage d'écrire qu'il reste encore beaucoup à faire dans tous ces domaines. b) Culture de cellules et amélioration des plantes Nous venons de voir quelques exemples d'utilisation directe par l'homme des potentialités de la cellule végétale grâce à l'industrialisation de la
potentialités de la cellule végétale grâce à l'industrialisation de la culture in vitro ; en restant plus près de la nature, cette technique est en train de bouleverser la génétique des plantes cultivées ou cultivables donc d'augmenter considérablement leur diversité et par voie de conséquence leur intérêt économique. On s'est en effet aperçu que des cellules banales cultivées en dehors de la plante manifestent une extrême variabilité de leurs potentialités génétiques et parallèlement le nombre de leurs chromosomes est également très variable ; toute substance (souvent à caractère hormonal) qui stimule puissamment la multiplication in vitro des cellules entraîne de
stimule puissamment la multiplication in vitro des cellules entraîne de nombreuses variations du nombre de chromosomes et parallèlement la variabilité génétique. Or, on sait aujourd'hui reconstituer in vitro à partir d'une seule cellule, grâce à un jeu subtil d'équilibrés hormonaux, une plante entière avec des racines, tige, feuilles, fleurs, cultivable dans les conditions naturelles. On voit de suite ce que peut apporter le laboratoire à l'agriculture. Dans ce domaine particulier la culture de cellules végétales a abouti à une découverte extrêmement intéressante. On sait que le gamète femelle, c'est-à-dire l'ovule, de certains animaux ou de nombreuses plantes est capable, soumis
de certains animaux ou de nombreuses plantes est capable, soumis à des traitements appropriés, de proliférer et de donner un embryon qui se transforme en un nouvel organisme. Comme l'a dit Gautheret, lors d'une récente (10 décembre 1979) séance solennelle de l'Académie des Sciences : « On obtient ainsi des enfants sans père » C'est scientifiquement parlant la parthénogenèse. Or, avec les végétaux, on sait aujourd'hui faire « des enfants sans mère », on peut en effet partant du grain de pollen, qui fournit le gamète mâle équivalent au spermatozoïde des mammifères, obtenir par une succession de cultures sur des
des mammifères, obtenir par une succession de cultures sur des milieux différents une plante entière qui ne renferme qu'un stock chromosomique : l'utilisation de ces plantes en génétique traditionnelle a conduit à l'obtention de nouvelles espèces, en particulier de céréales, beaucoup plus performantes. Mais on est allé plus loin. Il y a déjà relativement longtemps (une vingtaine d'années) que les biologistes animaux ont réussi en culture in vitro à fusionner des cellules d'espèces très différentes : souris + moustique, homme + souris, etc. Cette technique présente un intérêt considérable en génétique fondamentale des animaux. Pour les végétaux, certains ont pensé
génétique fondamentale des animaux. Pour les végétaux, certains ont pensé qu'on pouvait aller plus loin puisque, comme on l'a vu plus haut, on peut partant d'une seule cellule obtenir de nouveau une plante entière. On pouvait donc espérer obtenir de cette façon des hybrides irréalisables par la voie de l'hybridation naturelle sexuelle. C'est ce qui a en effet déjà été obtenu, dans quelques cas rares, quand on a su sortir toute la matière vivante de la cellule végétale, le protoplaste, de sa paroi pecto-cellulosique ; on a pu ainsi, en faisant fusionner un protoplaste de pomme de terre avec un
faisant fusionner un protoplaste de pomme de terre avec un protoplaste de tomate, obtenir un hybride irréalisable par hybridation sexuelle : il a été appelé « pomate ». Enfin les manipulations génétiques permettent d'entrer dans le domaine du rêve ; on entend par « manipulation génétique » l'introduction dans une cellule (souvent une bactérie mais pourquoi pas une cellule végétale) d'une « information » totalement étrangère à cette cellule, sous forme d'un fragment d'acide nucléique : une fois cette information introduite dans la cellule, elle peut dans certains cas et sous certaines conditions programmer des processus biochimiques qui aboutissent à
sous certaines conditions programmer des processus biochimiques qui aboutissent à une production contrôlable d'une substance particulièrement précieuse. Tout homme curieux d'informations scientifiques a entendu parler des espoirs qu'on place en cette technique pour l'obtention en grande quantité par des bactéries de l'interféron, l'une des voies fructueuses de la lutte contre le cancer. En matière de végétaux et d'agronomie, on rêve donc d'introduire dans les végétaux cultivés l'information génétique (appelée « plasmide » ou gène NIF), responsable de la fixation de l'azote atmosphérique que possèdent certaines bactéries (Rhizobium). Jusqu'à présent, seules les légumineuses (pois, haricot, luzerne, ...) sont capables de métaboliser
les légumineuses (pois, haricot, luzerne, ...) sont capables de métaboliser l'azote atmosphérique pour fabriquer de précieuses protéines sans apport d'engrais azotés, grâce à l'association du végétal supérieur avec la bactérie, le Rhizobium. Puisqu'on sait isoler le fragment d'acide nucléique responsable de cette fonction, on espère l'introduire dans tous les végétaux cultivés : blé, betterave, etc. Les intérêts sont évidents : économie considérable d'énergie puisque suppression des engrais azotés, production contrôlée de protéines, diminution importante des pollutions, etc. Même si pour diverses raisons, qu'il serait trop fastidieux de présenter ici, on atteint les frontières de ce qui est actuellement possible, on
atteint les frontières de ce qui est actuellement possible, on frôle donc la science-fiction, il faut donner aux chercheurs qui tentent cet exploit les moyens de le faire, à condition de ne pas réduire les autres secteurs de recherche à la portion congrue. CE QU'APPORTENT ET PEUT APPORTER LA CULTURE IN VITRO D'ORGANISMES VEGETAUX Rapprochons-nous encore un peu plus de la nature et voyons maintenant l'apport de la culture in vitro d'organismes végétaux dans la guérison et la multiplication des végétaux cultivés. Les biotechnologies mises en œuvre ici ont pour origine « la culture de méristèmes ». Le méristème, c'est
origine « la culture de méristèmes ». Le méristème, c'est la partie terminale de toute plante ; c'est un petit massif (semi-sphérique) d'1/10 de mm de diamètre, composé de quelques centaines de cellules et situé à l'extrémité du bourgeon apical de la plante ; c'est à partir de lui que s'organise toute la plante : tige, feuilles, fleurs. Or ce méristème présente une caractéristique intéressante : dans une plante totalement envahie par un virus, c'est la seule partie qui n'est jamais contaminée. On a donc pensé, dans les années cinquante à l'isoler aseptiquement et à le placer dans un tube
à l'isoler aseptiquement et à le placer dans un tube sur un milieu de culture permettant l'expression de ses potentialités, à savoir la reconstitution d'une plante entière ; après quelques années de recherche, cet objectif fut atteint et on obtint ainsi des plantes guéries à partir de souches malades. Ce premier résultat était déjà intéressant en soi : en effet les maladies à virus sont responsables chez les végétaux cultivés d'un manque à produire considérable puisqu'il varie, selon les cas, de 20 à 80 % quand la plante ne meurt pas. Cette technique, française de conception, est mondialement utilisée. Mais
pas. Cette technique, française de conception, est mondialement utilisée. Mais elle a eu de plus un prolongement spectaculaire qui est en train de bouleverser la production de certaines plantes : on s'est en effet aperçu que ces microplantes, qui mesurent au maximum 5 cm mais qui comportent de 6 à 10 « noeuds » c'est-à-dire de 6 à 10 bourgeons, sont bouturables in vitro : chaque bourgeon isolé et repiqué sur un milieu neuf fournit en 4 semaines une nouvelle microplante qui peut être à nouveau divisée et ce indéfiniment : c'est ce que l'on appelle « la multiplication végétative
: c'est ce que l'on appelle « la multiplication végétative in vitro ». On voit de suite la puissance de l'outil; mais quelques chiffres, obtenus en collaboration avec des producteurs, dans leur exploitation, la feront mieux percevoir : — 1 pied de framboisier fournit, par les techniques classiques, 50 descendants par an ; par culture in vitro, on en obtient 50 000 parfaitement sains à partir d'un méristème ; — la multiplication d'une nouvelle variété de rosier est totalement dépendante du nombre de greffons qu'on peut prélever sur chaque pied (compris entre 20 et 50 par an) ; avec une
(compris entre 20 et 50 par an) ; avec une microplante en tube, on en fabrique 400 000 par an ; — le pêcher-amandier, remarquable porte-greffe pour le pêcher, et le merisier, l'un des fleurons de nos forêts, sont très difficilement multipliables par les techniques classiques ; avec un seul tube, on peut en produire 1 million par an. Mais l'intérêt de la technique ne se limite pas à ce coefficient de multiplication qui est comme on le voit d'au moins 1 000, comparé à celui des techniques classiques. La multiplication végétative in vitro est une source d'économie a) En
multiplication végétative in vitro est une source d'économie a) En main-d'œuvre et en temps On sait que la grande majorité des arbres fruitiers et de nombreuses plantes horticoles doivent être greffées sur ce que l'on appelle un porte-greffe, parce qu'en particulier on ne peut pas les bouturer ni les semer. Cette opération est longue et onéreuse puisqu'il faut d'abord multiplier le porte-greffe, puis faire le greffage, et attendre le développement du greffon avant de mettre le produit sur le marché ; on est en train de montrer que la multiplication végétative in vitro permet d'obtenir des plantes commercialisables en six
végétative in vitro permet d'obtenir des plantes commercialisables en six mois : en effet les plantes obtenues par culture in vitro sont capables de vivre sur leurs propres racines qui ont commencé à se développer dans le tube de culture : on supprime donc le porte-greffe et le greffage. Il faut ici préciser qu'il reste encore beaucoup à faire, à éprouver, à expérimenter avant de généraliser la méthode, mais les premiers résultats sont très encourageants. b) En énergie Dans de nombreuses branches de l'horticulture, l'entretien et la conservation de pieds-mères (ainsi appelés parce qu'ils fournissent les plantes filles commercialisées) exigent
(ainsi appelés parce qu'ils fournissent les plantes filles commercialisées) exigent d'importantes surfaces couvertes qu'il faut chauffer l'hiver, quelquefois refroidir l'été. Les chiffres qui suivent ont été obtenus dans deux exploitations d'importance très différente. — Premier exemple : retenus par un producteur audacieux d'œillets, la culture de méristèmes et la multiplication végétative in vitro lui ont permis de devenir le premier producteur mondial et d'exporter annuellement 40 % de sa production en particulier vers les Etats-Unis ; mais surtout, alors qu'il lui fallait autrefois quatre ans pour obtenir, à partir d'un stock nécessairement limité de pieds-mères, les millions de plantes qu'il
stock nécessairement limité de pieds-mères, les millions de plantes qu'il commercialise chaque année, il ne lui en faut plus aujourd'hui que deux, ce qui représente une économie considérable puisqu'elle correspond à deux ans de chauffage de plusieurs hectares de serres (l'entreprise emploie par ailleurs 600 personnes). — Deuxième exemple : pris dans une exploitation plus modeste : on a montré qu'un local climatisé pour cultures in vitro de 9 m2, consommant de l'ordre de 5 kWh/jour, remplace au minimum 2 500 m2 de serres chauffées ou refroidies, selon la saison. Il faut ajouter que, pour ce faire, le producteur ou
Il faut ajouter que, pour ce faire, le producteur ou ses employés, qui a échangé son bleu de travail contre une blouse blanche, œuvre à l'abri des intempéries, à n'importe quelle époque de l'année, puisqu'on peut pour chaque tube de culture trouver des conditions de conservation en chambre froide qui permettent de placer les plantes dans leur milieu naturel à l'époque la plus favorable. De nombreuses plantes cultivées peuvent déjà être guéries puis multipliées par culture de méristèmes suivie de la multiplication végétative in vitro et on peut affirmer aujourd'hui, sans risque de se tromper, que cette technique sera applicable
sans risque de se tromper, que cette technique sera applicable à tous les végétaux qui intéressent l'homme avant la fin du siècle, y compris à certains arbres de nos forêts. Il faudra pour cela des hommes et des moyens ; or bien que ces découvertes et leurs prolongements techniques aient pour origine des cerveaux et des mains français, la part réservée dans le budget de la recherche française à la biologie végétale et à la recherche agronomique est vraiment la part du pauvre. Et pourtant, qu'on le veuille ou non, et en toute amitié avec mes amis médecins : Pour
et en toute amitié avec mes amis médecins : Pour être malade, il faut vivre. Pour survivre, même malade, il faut manger. Or l'alimentation de l'homme dépend totalement du végétal, en même ses besoins en oxygène. BIBLIOGRAPHIE [1] R.J. GAUTHERET Recherches sur la culture des tissus végétaux, essais de culture de quelques tissus méristématiques. Thèse Sciences, 279 p., Paris — 1935. [2] R.J. GAUTHERET La culture des tissus. Gallimard — Paris 1945. [3] J.P. BOURGIN et J.P. NITSCH Obtention de Nicotiana haploïdes à partir d'étamines cultivées in vitro. Ann. Physiol. Vég. 9, 377-382 (1968). [4] G. MOREL et C. MARTIN
Vég. 9, 377-382 (1968). [4] G. MOREL et C. MARTIN Guérison de Dahlia atteints de maladies à virus. C.R. Acad. Sci. 235, 1324-1325 — 1952. [5] C. MARTIN La multiplication végétative in vitro : une technique de pointe au service de l'agriculture. Séance spéciale de l'Académie d'Agriculture — 9 mai 1980 — p. 11 à 19. Les limites de la voie microbiologique pour la production des grands intermédiaires chimiques industriels Consultation par Louis BOBICHON sur place Rhône-Poulenc Industries L'accès aux grands intermédiaires chimiques par la voie de la biosynthèse est aujourd'hui limité par le coût de la matière première qui
aujourd'hui limité par le coût de la matière première qui entre dans les procédés. Deux exemples, pris dans le domaine de la production de l'éthanol et de celle du butanol, en comparant sur le plan économique les voies chimiques et biochimiques, le montrent clairement. Il est donc important, à côté de tous les travaux qui sont effectués pour améliorer ces techniques biochimiques, de ne pas oublier cet aspect du problème et la recherche de sources d'hydrate de carbone bon marché reste encore aujourd'hui un objectif prioritaire pour l'avenir de ces procédés. Une masse considérable d'informations sur les mécanismes biologiques qui
procédés. Une masse considérable d'informations sur les mécanismes biologiques qui régissent le développement des microorganismes a été acquise au cours des trente dernières années. Et plus récemment, de nouvelles et très importantes connaissances dans le domaine de la génétique laissent maintenant entrevoir la possibilité de construire et savoir exploiter industriellement de nouveaux microorganismes capables de toutes sortes de performances. De là à croire que tout est dorénavant possible et que l'on va pouvoir s'affranchir très vite des technologies pétrochimiques actuelles, par exemple, pour accéder aux grands intermédiaires industriels, il n'y a qu'un pas que l'on risque, si l'on n'y prend
a qu'un pas que l'on risque, si l'on n'y prend garde, de franchir trop allègrement. Une contrainte importante limite en effet cette possibilité : c'est la disponibilité d'une source d'hydrate de carbone très bon marché. Deux exemples vont nous le montrer : l'un, avec la production de l'alcool éthylique ; l'autre, avec la production de l'alcool butylique. PRODUCTION D'ALCOOL ETHYLIQUE La fermentation alcoolique est connue depuis les temps les plus anciens, avec l'obtention du vin ou de la bière, et l'on en a pour preuve une description de cette technologie sur un temple de Thèbes, datant de plusieurs millénaires avant
sur un temple de Thèbes, datant de plusieurs millénaires avant le Christ. La distillation des moûts fermentés pour en retirer l'alcool est, en revanche, plus récente, et c'est vraisemblablement au Moyen-Âge que cette technique s'est développée en Europe, tout particulièrement dans les monastères, pour la production des liqueurs alcoolisées. Mais ce n'est que depuis une centaine d'années environ que la production de l'alcool éthylique (de fermentation donc) s'est industrialisée, avec, comme premier exemple en France, le démarrage d'une unité industrielle, en 1895, sur le site de Melle, dans les Deux-Sèvres. Dans le même temps, la technologie s'est diffusée dans le
Dans le même temps, la technologie s'est diffusée dans le monde industriel et y a prospéré à grande échelle, jusque vers la fin de la deuxième guerre mondiale. C'est à peu près vers cette période que la voie de synthèse, à partir de produits pétroliers à très bas prix, a commencé à se répandre, et a peu à peu conduit à l'arrêt d'un grand nombre d'unités de fermentation. Un mouvement en sens inverse, dû précisément à la remontée du prix des produits pétroliers, semble actuellement se dessiner dans le monde, notamment au Brésil, et il n'est donc pas sans intérêt
notamment au Brésil, et il n'est donc pas sans intérêt d'essayer de comparer aujourd'hui les deux techniques sur le plan de l'économie du procédé, afin d'évaluer à nouveau les mérites d'un procédé par fermentation et surtout ses limites. Le tableau 1 rassemble comparativement les principaux paramètres économiques du procédé par synthèse et du procédé par fermentation. Il est établi sur les bases suivantes : — schémas des réactions : — valorisation des sous-produits : — synthèse : les résidus sont brûlés et les calories sont récupérées en crédit sur les utilités, — fermentation : les eaux résiduaires chargées en levure
utilités, — fermentation : les eaux résiduaires chargées en levure (riches en protéines et en vitamines) sont concentrées et valorisées en alimentation animale ; ici, le crédit apporté par les ventes annule le débit nécessité par le traitement. — prix des matières premières : — synthèse : l'éthylène est compté à son prix de marché actuel en France, soit 2 900 F/t, — fermentation : dans l'hypothèse considérée, on est parti de saccharose compté au prix actuel du saccharose dans les mélasses de betterave, soit 1 400 F/t. — échelle des unités industrielles considérées : — synthèse : 100 000