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pas sur une seule bactérie ou sur une seule chaîne de DNA, mais de manière statistique, comme pour une réaction chimique, c'est-à-dire sur des millions d'unités. Il ne s'agit donc pas de « microchirurgie », mais de la mise en œuvre, sur des populations de molécules ou de cellules, d'une série de processus biochimiques utilisant des enzymes spécifiques capables de reconnaître parmi les molécules présentes celles sur lesquelles agir. Il y a quatre étapes principales : - Isolement du gène à transférer ; pour cela deux méthodes sont utilisées. Faire la synthèse chimique du gène ou le recopier à partir
la synthèse chimique du gène ou le recopier à partir du RNA-messager, forme circulante du gène portant l'information génétique en dehors du noyau, vers les centres d'assemblages des protéines. - Transport du gène : on se sert d'un vecteur (transporteur moléculaire) pouvant être soit un plasmide (sorte de mini-chromosome bactérien circulaire, facilement échangé entre les cellules), soit un virus s'attaquant aux bactéries. Des enzymes spéciales servent à découper le plasmide ou le virus (enzymes de restriction), puis à recoller les morceaux en y insérant le gène précédemment isolé (ligases). - Clonage du gène : le vecteur transportant le gène à
Clonage du gène : le vecteur transportant le gène à greffer est introduit dans une population de bactéries réceptrices (hôte). Il se forme des clones (colonies de bactéries issues d'une même cellule) contenant de multiples copies du gène transféré (ce qui constitue un moyen puissant de purification d'un gène). - Caractérisation des produits du gène : il faut ensuite vérifier que certains clones fabriquent bien la nouvelle protéine codée par le gène greffé. On le détecte grâce à des méthodes analytiques puissantes (screening des clones producteurs). Les bactéries ne constituent plus aujourd'hui les seuls hôtes utilisés. On s'oriente aussi vers
plus aujourd'hui les seuls hôtes utilisés. On s'oriente aussi vers des cellules eucaryotes (possédant un noyau) telles que des levures ou des cellules de mammifères en culture (souris, singes). De telles expériences ont, on le sait, suscité l'inquiétude parmi la communauté scientifique et même dans le public. Ne risquait-on pas en transférant du matériel génétique d'une espèce à une autre de créer de nouvelles espèces contre lesquelles nous n'aurions pas de défense naturelle ? En découpant des gènes au hasard, ne prenait-on pas le risque de transplanter dans la bactérie commune de nos intestins, Escherichia coli, un fragment génétique provenant
commune de nos intestins, Escherichia coli, un fragment génétique provenant d'un virus et capable de provoquer des cancers ? De telles questions furent débattues dès 1975 à Asilomar, petite ville californienne où se réunirent 250 scientifiques du monde entier. Leur but était d'édicter des règles permettant d'éviter que les « manipulations génétiques » ne constituent un danger pour l'espèce humaine. À l'issue de cette conférence ont été précisées et mises en œuvre des règles internationales de manipulation des organismes « recombinés ». On a ainsi établi une série de confinements d'ordre physique et d'ordre biologique. Confinement physique : obligation d'utiliser
d'ordre physique et d'ordre biologique. Confinement physique : obligation d'utiliser certains types de laboratoires (Pl, P2, P3, P4) selon les catégories d'expériences réalisées. Confinement biologique : obligation d'utiliser certains vecteurs spécifiques de bactéries-hôtes ne colonisant pas l'intestin de l'homme ou ne vivant que dans les conditions particulières du laboratoire (nécessitant, pour leur croissance, des produits « artificiels » par exemple). II. LES APPLICATIONS DU GENIE GENÉTIQUE La première application venue à l'esprit des biologistes fut d'utiliser les recombinaisons génétiques pour fabriquer des médicaments indispensables, mais difficiles à obtenir par les techniques classiques d'extraction et de purification. Par exemple, l'insuline injectée
techniques classiques d'extraction et de purification. Par exemple, l'insuline injectée aux malades atteints de diabète est extraite aujourd'hui de porcs. L'insuline de porc présente certains inconvénients susceptibles d'être évités par une utilisation plus répandue d'insuline humaine. L'idée fut donc d'introduire le gène permettant la fabrication de l'insuline humaine dans une bactérie, afin de fabriquer en fermenteur des quantités importantes de la précieuse hormone. Cette production pilote a été réalisée en 1978 par la société californienne Genentech pour le compte de Eli Lilly, principal producteur mondial d'insuline. L'hormone de croissance humaine est un autre exemple de substance biologique obtenue en très
est un autre exemple de substance biologique obtenue en très petite quantité à partir d'hypophyses humaines prélevées sur des cadavres. L'hormone de croissance permet de traiter certaines déficiences de croissance et particulièrement le nanisme. Grâce au génie génétique, les chercheurs de Genentech et ceux de l'Institut Pasteur ont récemment réussi à faire fabriquer, par le colibacille, de l'hormone de croissance humaine susceptible de traiter de nombreux cas de nanisme dans le monde. Le vaccin contre l'hépatite B peut également être fabriqué à partir d'une bactérie reprogrammée. Des résultats importants ont été obtenus aux États-Unis, en Angleterre et en France à
été obtenus aux États-Unis, en Angleterre et en France à l'Institut Pasteur, par plusieurs équipes qui ont réussi à isoler le gène viral codant pour la protéine vaccinante, puis à l'introduire dans une bactérie où il s'est exprimé. Une autre technique prometteuse consiste à faire fabriquer la protéine vaccinante par des cellules de souris, dans lesquelles le gène viral a été transféré. Ces cellules, maintenues en culture, sécrètent en permanence la protéine dans le milieu environnant. Cet important succès a été obtenu cet été par le professeur Pierre Tiollais, de l'Institut Pasteur et par une équipe de l'INSERM dirigée par
l'Institut Pasteur et par une équipe de l'INSERM dirigée par le professeur Charles Chany. Enfin, l'interféron humain, protéine antivirale et immunostimulante naturelle, fait actuellement l'objet d'une vive compétition parmi les grands laboratoires pharmaceutiques, depuis qu'on sait l'obtenir par génie génétique. Les autres applications du génie génétique concernent principalement l'alimentation, l'environnement, l'énergie et la chimie. Alimentation : les microbes peuvent produire des protéines de qualité égale aux protéines animales ou aux protéines végétales. L'avantage des microorganismes est leur reproduction rapide, indépendante des conditions climatiques et conduisant, en quelques jours, à des tonnes de protéines à partir de substrats variés. Les chiffres
tonnes de protéines à partir de substrats variés. Les chiffres sont significatifs : un bœuf de 500 kg ne produit que 500 g de protéine en 24 heures, tandis que 500 kg de bactéries en produisent de 5 à 50 t dans le même temps ! Des bactéries recombinées, hyper-productrices de protéines, sont étudiées par plusieurs grandes entreprises. La firme anglaise ICI (Imperial Chemical Industry) utilise un microbe croissant sur méthanol. Grâce à des techniques de recombinaison génétique, le rendement de ce microbe a pu être récemment amélioré. Il est également possible d'accroître les stocks de nourriture présents en évitant
également possible d'accroître les stocks de nourriture présents en évitant que des prédateurs ne les détruisent. La « lutte biologique » contre les insectes prédateurs permet ainsi de préserver les récoltes. On connaît des bactéries utiles (Bacillus thuringiensis) produisant des toxines capables de détruire des larves d'insectes. Le génie génétique est actuellement utilisé pour fabriquer des bactéries hyper-productrices de ces toxines. Enfin, un des grands espoirs des biologistes est de domestiquer la fixation directe de l'azote atmosphérique pour fabriquer des biofertilisants à la place des engrais azotés coûteux en énergie. On sait en effet que les plantes légumineuses, grâce aux
On sait en effet que les plantes légumineuses, grâce aux bactéries qui vivent en symbiose dans les nodules de leurs racines, sont capables de piéger l'azote de l'air, de fabriquer de l'ammoniac et de l'utiliser dans la synthèse de leurs protéines. C'est le cas du soja, des lentilles, des pois ou de la luzerne. Les chercheurs espèrent, grâce au génie génétique, introduire les gènes permettant la fabrication des enzymes responsables de la fixation de l'azote dans des graminées telles que le maïs ou le blé. Environnement : les biologistes s'efforcent, dans ce domaine, de fabriquer des microbes capables de détruire
dans ce domaine, de fabriquer des microbes capables de détruire des déchets dangereux. Certaines bactéries du type pseudomonas, par exemple, dégradent des hydrocarbures chlorés et les transforment en substances inoffensives pour l'environnement. Les Japonais utilisent des bioréacteurs dans lesquels passent les effluents d'industries polluantes. À la sortie de ces bioréacteurs, seuls des produits simples, eau, gaz carbonique ou méthane, sont éliminés sans danger. Energie : on sait que des microbes sont à la base de nombreux processus producteurs d'énergie. Certaines bactéries dégradent la cellulose et produisent de l'alcool utilisable comme carburant. D'autres fabriquent du méthane à partir des déchets organiques.
carburant. D'autres fabriquent du méthane à partir des déchets organiques. Des algues ou des bactéries dégagent de l'hydrogène sous l'effet du rayonnement lumineux. On attend beaucoup des techniques de recombinaison génétique pour améliorer les rendements de ces bactéries, levures, algues ou champignons. Chimie : les bactéries peuvent être productrices de matières premières pour la chimie. Pendant la dernière guerre, des processus biologiques furent utilisés pour produire de l'acétone ou du butanol. En orientant préférentiellement, grâce au génie génétique, les voies de biosynthèses naturelles des microorganismes, on peut leur faire hyper-produire une substance donnée. On vient de découvrir une classe particulièrement
une substance donnée. On vient de découvrir une classe particulièrement importante de bactéries-chimistes : les bactéries méthanotrophes. Ces microbes peuvent oxyder différentes molécules et fabriquer des phénols, de l'acide benzoïque ou de l'oxyde de propylène. Le tableau I résume les principales étapes du génie génétique au cours de ces dernières années. III. LA SITUATION ACTUELLE DU GENIE GENETIQUE Les techniques de base sont aujourd'hui bien maîtrisées. Les synthèses de gènes se font aujourd'hui à raison de plusieurs dizaines de nucléotides par chimiste et par semaine. Une machine automatique à synthétiser les gènes et utilisant un ordinateur a été développée par
les gènes et utilisant un ordinateur a été développée par VEGA Laboratories en Californie. Elle permet de réduire par un facteur 6 la durée nécessaire pour la synthèse d'une séquence donnée. Les informations sont introduites dans l'ordinateur. On obtient à la sortie du synthétiseur biochimique des gènes éventuellement utilisables par les organismes vivants. Le clonage d'un gène se réalise aujourd'hui en une semaine. La fabrication de DNA complémentaire à partir de RNA-messager se fait aujourd'hui presque en routine dans les laboratoires spécialisés. Ces techniques sont déjà étudiées en travaux pratiques de biologie moléculaire dans les universités les plus avancées. On
de biologie moléculaire dans les universités les plus avancées. On s'oriente aujourd'hui vers la mise en œuvre des techniques de recombinaisons génétiques dans des cellules eucaryotes en culture. On sait maintenir, en culture, différentes lignées cellulaires susceptibles d'être reprogrammées par insertion directe de gène dans leur noyau. On a récemment obtenu des vecteurs « multi-organismes » capables de transférer des gènes dans des bactéries, des levures ou des cellules à noyau. Un des problèmes qui restent actuellement posés est celui du passage du laboratoire à l'échelle industrielle. En effet, ce qui est obtenu en tube à essai n'est pas toujours
qui est obtenu en tube à essai n'est pas toujours transférable à l'échelle d'un fermenteur de grande capacité. Les bactéries reprogrammées sont souvent déficientes. Génération après génération, ces bactéries ont tendance à perdre leurs plasmides porteurs de caractères nouveaux, ce qui réduit leur intérêt industriel. Pour résoudre les importants problèmes du développement et du transfert du laboratoire à l'usine, de grandes entreprises américaines ont passé des contrats de génie génétique avec de petites sociétés de biotechnologie. Eli Lilly développe actuellement, en collaboration avec Genentech, une méthode de production d'insuline par génie génétique. Ce produit est aujourd'hui en essais cliniques au
génie génétique. Ce produit est aujourd'hui en essais cliniques au Guy's Hospital de Londres et fait l'objet d'un examen par la Food and Drug Administration. Une usine de 40 millions de dollars est prévue pour la production en masse. De grands espoirs sont placés également dans l'hormone de croissance. Les programmes de recherche ont été financés par la société suédoise Kabi et confiés à Genentech. Le produit obtenu par génie génétique devrait prochainement entrer en essais cliniques. Les développements se réalisent donc plus vite que prévu. Comme dans les années soixante pour l'électronique, on voit actuellement se créer aux États-Unis
soixante pour l'électronique, on voit actuellement se créer aux États-Unis des compagnies de biotechnologie trouvant le financement nécessaire auprès de sociétés de venture capital. Les plus connues sont Cetus, Genentech, Biogen et Genex. La plus ancienne est Cetus, créée en 1971 par Ronald Cape et Peter Farley. Employant 200 personnes, Cetus vaut aujourd'hui 100 millions de dollars. En 1976, Herbert Boyer et Robert Swanson fondent Genentech avec quelques centaines de milliers de dollars : leur société, après avoir réussi la biosynthèse de l'insuline, de l'hormone de croissance et de l'interféron est estimée aujourd'hui à 300 millions de dollars. Quant à
est estimée aujourd'hui à 300 millions de dollars. Quant à Biogen, dès sa naissance en 1978, c'est une multinationale, employant des chercheurs de haut renom tant aux États-Unis qu'en Angleterre, en Allemagne et en Suisse. Évaluée à 50 millions de dollars, Biogen a réussi une première en 1979, l'interféron. Enfin, Genex est évaluée à 9 millions de dollars. Les succès ont inspiré d'autres entrepreneurs. De nouvelles compagnies voient le jour : Bethesda Research Labs, Enzo Biochem (New York), Biotech Research (Maryland), Molecular Genetics (Minnesota), Collaborative Genetics (Boston), Transgène en France, Kabigen en Suède, Celltech en Angleterre. Chacune a l'espoir secret
Kabigen en Suède, Celltech en Angleterre. Chacune a l'espoir secret de devenir l'IBM de la biologie. La récente décision de la Cour Suprême des États-Unis autorisant la prise de brevets sur des organismes vivants renforce cet espoir et instaure une farouche compétition entre ces jeunes entreprises. Le monde universitaire est contaminé par cette fièvre. Nombreux sont les chercheurs qui regrettent l'époque désintéressée de la biologie moléculaire. En effet, la double appartenance des nouveaux entrepreneurs au monde industriel et à celui de l'université n'est pas sans poser d'importants problèmes de relations université/industrie, tant aux États-Unis qu'en Europe. Il apparaît parfois choquant
université/industrie, tant aux États-Unis qu'en Europe. Il apparaît parfois choquant que des universitaires travaillant grâce à des fonds publics mettent leurs laboratoires à la disposition de recherches devant principalement profiter à l'industrie privée. Des aménagements ont cependant été trouvés entre certaines universités et les nouvelles bio-industries. Un des modèles les plus intéressants est celui mis en œuvre par la société Transgène : une partie de son capital a été cédée à des organismes publics comme le CNRS, l'INSERM ou semi-publics comme l'Institut Pasteur. Une fondation sera créée pour permettre aux chercheurs et à leurs laboratoires de trouver des sources de
chercheurs et à leurs laboratoires de trouver des sources de financement en fonction des succès de la société. IV. LES GRANDES ORIENTATIONS La première étape des applications du génie génétique a consisté surtout à fabriquer des produits naturels qui n'étaient jusqu'alors obtenus qu'en très petite quantité par les techniques classiques d'extraction et de purification : hormone de croissance, insuline, interféron, antigène HBs (hépatite B). Cette première approche est loin d'être abandonnée, mais elle est complétée par l'utilisation de techniques de génie génétique pour modifier la machinerie de production des cellules vivantes. En effet, comme nous l'avons dit, les bactéries reprogrammées
vivantes. En effet, comme nous l'avons dit, les bactéries reprogrammées sont fragiles et perdent parfois leurs précieux gènes. Les bactéries isolées dans la nature et qui constituent la base de la bio-industrie japonaise (aliments, antibiotiques, métabolites, enzymes) sont, par contre, beaucoup plus résistantes. Or il devient possible aujourd'hui de modifier les voies de biosynthèse internes d'un microorganisme industriel et le rendre ainsi plus efficace dans son bilan énergétique ou son utilisation optimale du carbone comme source principale pour ses synthèses. Le cas des bactéries productrices de protéines et croissant sur méthanol constitue à cet égard un bon exemple. La bactérie
méthanol constitue à cet égard un bon exemple. La bactérie utilisée jusqu'à présent par Imperial Chemical Industry obtenait l'azote servant à la fabrication des protéines, à partir d'ammoniac grâce à une enzyme, la glutamate synthétase. Or cette voie métabolique est peu efficace car elle conduit à oxyder du méthanol en gaz carbonique pour produire l'énergie nécessaire à la réaction, ce qui conduit à une perte de carbone et à un rendement faible. Par contre, d'autres microbes utilisent l'enzyme glutamate déshydrogénase, dont le rendement est nettement supérieur. L'idée des chercheurs de ICI a été d'introduire le gène codant pour cette enzyme
ICI a été d'introduire le gène codant pour cette enzyme à la place du gène déficient de leur bactérie productrice de protéine. Résultat : une économie considérable. Une des voies actuellement parmi les plus explorées est la cellulolyse pour produire de l'alcool carburant. On sait que les levures sont d'excellentes productrices d'alcool à partir de sucre. Depuis des siècles, on fabrique de l'alcool à partir de Saccharomyces cerevisiae. D'autre part, au Japon la levure productrice du saké résiste jusqu'à 16 à 18 % d'alcool. L'inconvénient majeur est que les levures ne peuvent pas transformer la cellulose en cellobiose et le
ne peuvent pas transformer la cellulose en cellobiose et le cellobiose en glucose, à partir desquels la fermentation peut commencer. On connaît, en revanche, des bactéries telles que Clostridium thermocellum, capables de traiter des déchets cellulosiques et de les transformer directement en alcool. Malheureusement, ces bactéries sont inhibées par leur propre production d'alcool et ne résistent que jusqu'à 4 à 5 % seulement. Le projet consiste donc à introduire les gènes responsables de la cellulolyse (codant pour les enzymes cellulases) dans des levures leur permettant ainsi de traiter directement la cellulose de la bagasse, de la paille ou même du
cellulose de la bagasse, de la paille ou même du papier, pour la transformer en alcool. L'opération se fait aujourd'hui en plusieurs étapes, avec des champignons de type Trichoderma, capables de transformer la cellulose en sucre. Le jus sucré obtenu étant ensuite fermenté par des méthodes classiques. Si la cellulolyse pouvait se réaliser en une étape, de nombreuses applications d'une grande importance seraient accessibles. Les bactéries sont également productrices de matière première de base pour la chimie. Une nouvelle voie est ouverte par l'utilisation du génie génétique pour modifier les voies métaboliques de production de matières premières pour la chimie
voies métaboliques de production de matières premières pour la chimie lourde. On redécouvre des familles des microorganismes dont certains avaient été utilisés pendant la dernière guerre. Il se développe donc à côté de la pétrochimie classique, dont les matières premières sont de plus en plus coûteuses, une « cellulochimie » ou une « organochimie » utilisant les microbes pour fabriquer des matières de base, servant ensuite à la fabrication de solvants, d'émulsifiants, de liants ou de matières plastiques, essentiels à l'industrie de demain. Le génie génétique n'est pas seulement un outil de production de médicaments ou de substances industrielles. C'est
outil de production de médicaments ou de substances industrielles. C'est un extraordinaire outil pour la recherche fondamentale et l'avancement des connaissances. Pour étudier la vie et l'hérédité, les biologistes moléculaires étaient obligés jusqu'à présent de procéder par mutations au hasard en utilisant, par exemple, le rayonnement ultraviolet ou des produits chimiques mutagènes. Désormais, grâce au génie génétique, ils sont en mesure d'introduire des séquences connues de gène, d'en supprimer d'autres, d'analyser des séquences de gènes inconnues. L'analyse des séquences d'acide nucléique a fait des progrès considérables. Il est aujourd'hui plus rapide d'analyser une séquence de gènes et d'en déduire la
rapide d'analyser une séquence de gènes et d'en déduire la protéine correspondante que de faire l'analyse complète de la protéine. L'informatique est venue apporter à la génétique un atout considérable. Le code génétique étant totalement déchiffré, on peut, sur l'ordinateur faire la relation entre les séquences du DNA et les séquences protéiques correspondantes, les mettre en mémoire, les comparer, comme on le fait avec des textes écrits, grâce aux programmes d'édition des textes. Une des techniques les plus prometteuses pour l'avenir est d'analyser quelques séquences seulement de la chaîne d'acides aminés d'une protéine que l'on souhaite isoler, puis de fabriquer
aminés d'une protéine que l'on souhaite isoler, puis de fabriquer une sonde comportant la séquence de nucléotides complémentaire du gène que l'on cherche et donc capable de s'hybrider avec lui. Cette sonde est « marquée » par des isotopes radioactifs ou par des enzymes : on peut ainsi « pêcher » le RNA-messager correspondant. Le gène (DNA complémentaire) sera ensuite cloné dans un hôte approprié pour fabriquer la protéine recherchée. On s'oriente également vers la fabrication d'enzymes ou de protéines semi-artificielles par l'insertion de certaines séquences modifiées à l'intérieur de protéines naturelles. On comprend ainsi les progrès que pourra réaliser
protéines naturelles. On comprend ainsi les progrès que pourra réaliser l'enzymologie fondamentale, l'étude structurale des protéines, celle du fonctionnement de base des enzymes, ce qui permettra de mieux comprendre les désordres métaboliques ou certaines maladies génétiques. Le génie génétique, en tant qu'outil de recherche fondamentale, peut aider à comprendre le fonctionnement et l'expression des gènes, comment la vie module cette expression pour déterminer le comportement d'organismes très différents. Les chercheurs tentent actuellement de cloner les gènes d'histocompatibilité, c'est-à-dire qui assurent la reconnaissance des cellules entre elles et le rejet des greffes. Si ces travaux sont couronnés de succès, c'est peut-être,
greffes. Si ces travaux sont couronnés de succès, c'est peut-être, pour la médecine de demain, la compréhension de la prédisposition de l'homme à certains types de maladies. La base des mécanismes immunitaires, la reconnaissance entre anticorps et antigènes sont également en voie d'être élucidées grâce aux techniques de recombinations génétiques et de clonage. La compréhension des défauts génétiques va faire un pas considérable. En médecine on utilise déjà les techniques de recombinations génétiques pour diagnostiquer certaines maladies comme les thalassémies. Dès que l'on veut étudier un gène et son produit, la solution du clonage apparaît aujourd'hui comme la plus évidente