jeanflop/post-ocr-correction huggingface dataset:
triggering of the mitochondrial stage of apoptosis has been sought by measuring the effect of resveratrol on the liberation of cytochrome c intermembrane and on the activity of the NADH cytochrome b5 oxidoreductase which, in the presence of cytochrome c and of NADH (in excess), activates the complex IV which permits the generation of ATP which triggers the apoptosis. MATERIALS AND METHODS Reagents All the reagents used are of analytical quality and are supplied by various laboratories. The resveratrol is dissolved in a mixture of dimethylformamide and distilled water (parts equal), the mother solution is at 10-3 M. All the
equal), the mother solution is at 10-3 M. All the controls use the same solvent: the final solutions do not contain more than 0.05 % of dimethylformamide. Méthodes Isolement des mitochondries de cerveau Elles sont extraites à partir d’un homogénat de deux encéphales de Rat par centrifugations différentielles sur gradient de Percoll, selon la méthode décrite par Sims [8]. Le culot est mis en suspension dans un tampon de respiration (mannitol 300 mM, KH2PO4 10 mM, KC1 100 mM, MgCl2 5 mM, pH = 7,2 à 37° C) maintenu à 4° C. Mesures de la consommation d'oxygène par les mitochondries
4° C. Mesures de la consommation d'oxygène par les mitochondries Elles utilisent une micro-électrode de Clark. Les mitochondries sont préincubées 15 min à 4° C avec (ou sans) résveratrol puis incubées 1 min à 37° C dans le tampon de respiration (avec ou sans inhibiteurs). La respiration mitochondriale est provoquée par l’ajout de malate/glutamate, substrat du complexe I. La consommation d’oxygène est mesurée (V4). La phosphorylation oxydative est ensuite provoquée par l’ajout d’ADP et la nouvelle consommation d’oxygène est mesurée (V3). Le contrôle respiratoire est égal à V3/V4. L’oligomycine est utilisée pour inhiber le complexe V, la carbonylcyano m-chlorophénylhydrazone (CCCP)
utilisée pour inhiber le complexe V, la carbonylcyano m-chlorophénylhydrazone (CCCP) est utilisée comme découplant. L’activité de la NADH-cytochrome b5 oxydoréductase est mesurée par la méthode décrite par La Piana et coll. [9], Protocole d'anoxie-réoxygénation in vitro Les conditions d’anoxie sont obtenues en incubant les mitochondries dans une chambre close maintenue à 37° C. Le mélange malate/glutamate est utilisé comme substrat : un ajout d’ADP permet ensuite de consommer tout l’oxygène présent. Après 5 min d’anoxie, la réoxygénation est obtenue par ouverture de la chambre et addition de tampon respiratoire frais. Puis 5 min après, la chambre est à nouveau fermée
Puis 5 min après, la chambre est à nouveau fermée et le contrôle respiratoire est mesuré comme précédemment. Les témoins sont traités dans les mêmes conditions mais sans anoxie. Des concentrations croissantes de résveratrol sont introduites dans la chambre d’incubation, soit avant les deux séquences, soit au moment de la réoxygénation. La suspension mitochondriale est ensuite centrifugée, le cytochrome c est mesuré dans le surnageant par une méthode immuno-enzymatique. La production de O2°' au cours de la réoxygénation est quantifiée par la méthode du bleu de nitrotétrazolium. L’anisotropie des membranes mitochondriales est mesurée à l’aide d’une sonde, le 1,6-diphényl -
mitochondriales est mesurée à l’aide d’une sonde, le 1,6-diphényl - 1, 3, 5 hexatriène (DPH) par polarisation de fluorescence selon les méthodes décrites par Mecocci et coll. [10] et Ricchelli et coll. [11], Injection chronique de résveratrol Les rats sont anesthésiés par une injection SC de chloral (400 mg/kg). Une petite incision interscapulaire permet d’implanter une mini-pompe osmotique délivrant 1 pl/h de solution de façon continue pendant 7 jours. Le résveratrol est injecté à différentes concentrations 0,4, 2 et 10 mg/kg/j dissous dans un mélange de diméthylsulfoxyde-polyéthylène glycol (1/9), les rats témoins reçoivent le seul solvant. Le 8e jour, les
rats témoins reçoivent le seul solvant. Le 8e jour, les animaux sont sacrifiés. Les mitochondries de l’encéphale sont isolées. On les utilise pour mesurer les contrôles respiratoires avant et après les avoir soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation. Analyses statistiques Les valeurs moyennes des CR ou les pourcentages de variation sont comparés selon les méthodes d’analyse de variance et le test de Dunnett. Les EC50 sont calculées par régression non-linéaire à l’aide d’un logiciel Micropharm® [12], Résultats Les effets du résveratrol dans le protocole d'anoxie-réoxygénation Restauration partielle du contrôle respiratoire mitochondrial Après les séquences successives d’anoxie puis de réoxygénation, le CR diminue
les séquences successives d’anoxie puis de réoxygénation, le CR diminue d’environ 50 % (Fig. 1). La respiration basale (V4) augmente de 39,7 ± 1,8 à 50,4 ± 1,8 nmoles O2/min/mg de protéines. log [résveratrol] M Fig. 1. — Modifications par le résveratrol des paramètres respiratoires des mitochondries cérébrales de Rat soumises au protocole d’anoxie-réoxygénation. Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 4 déterminations. Les consommations d’oxygène correspondant à la respiration basale (V4) et à la phosphorylation oxydative (V3). Le coefficient respiratoire, CR, est égal à V3/V4. La phosphorylation oxydative (V3) diminue de 103,6 ± 4,8 à 82,8
phosphorylation oxydative (V3) diminue de 103,6 ± 4,8 à 82,8 ± 4,0 nmoles O2/min/mg de protéines. Lorsque le résveratrol est appliqué avant les deux séquences, il limite la chute de V4, restaure en partie V3 et limite ainsi partiellement mais significativement la diminution du CR. Les caractéristiques de ces effets sont qu’ils commencent à de très faibles concentrations (10-12 M), sont concentration-dépendants et ne sont que partiels. La restauration de V3 et la normalisation de V4 suivent des évolutions biphasiques dont les caractéristiques sont indiquées sur le Tableau I. Il n’existe pratiquement pas de différence d’intensité d’effet du résveratrol lorsqu’il
n’existe pratiquement pas de différence d’intensité d’effet du résveratrol lorsqu’il est administré avant les deux séquences ou seulement après l’anoxie. Son effet porte donc essentiellement sur l’étape de réoxygénation. Inhibition de la libération de cytochrome c Il existe une libération spontanée de cytochrome c par les préparations mitochondriales, évaluée à 226,4 ± 30,7 ng/mg de protéines. La séquence d’anoxie-réoxygénation augmente significativement cette libération : 425,1 ± 38,6 ng/mg de protéines. Quel que soit son temps d’application, le résveratrol inhibe la libération de cytochrome c induite et restaure totalement l’état initial à la concentration de 10 nM (Fig. 2). Ses effets
à la concentration de 10 nM (Fig. 2). Ses effets sont concentration-dépendants. Tableau 1. — Effets du résveratrol sur les paramètres respiratoires des mitochondries soumises au protocole anoxie-réoxygénation. Les conditions opératoires sont identiques à celles de la Figure 1. Les résultats sont exprimés en EC50 et en effet maximal observé, Emax en % des valeurs des témoins. Les effets du résveratrol sont biphasiques, quel que soit le moment de son application, les concentrations efficaces étant de l’ordre du picomolaire puis du nanomolaire. v3 v4 CR résveratrol avant anoxie-réoxygénation EC50 1 (pM) Emax 1 (%) 1.56 ± 0.33 10.4 ± 0.35
(pM) Emax 1 (%) 1.56 ± 0.33 10.4 ± 0.35 4.17 ± 1.46 7.99 ± 0.37 5.79 ± 1.23 11.83 ± 0.48 EC50 2 (nM) Emax 2 (%) 2.64 ± 0.68 7.57 ± 0.31 8.50 ± 1.41 12.02 ± 0.56 11.61 ± 2.64 11.51 ± 0.58 résveratrol avant réoxygénation EC50 1 (pM) Emax 1 (%) 2.93 ± 0.53 10.60 ± 0.27 2.95 ± 0.63 11.31 ± 0.47 1.47 ± 0.25 II. 39 ± 0.48 EC50 2 (nM) Emax 2 (%) 1.03 ± 0.68 51 4.26 ± 0.28 3.70 ± 1.24 11.66 ± 0.71 2.27 ± 0.38 11.33 ± 0.38 Inhibition
11.66 ± 0.71 2.27 ± 0.38 11.33 ± 0.38 Inhibition de l’augmentation de production de O2°'. Les deux séquences successives augmentent significativement la génération de O2°'. Le résveratrol, quel que soit le moment de son application, réduit cette augmentation (Fig. 3). Son effet est concentration-dépendant et commence dès 1 nM. Restauration de la fluidité membranaire mitochondriale. L’anisotropie des membranes mitochondriales est significativement augmentée par la séquence d’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol la restaure de façon identique, quel que soit le moment de son application (Fig. 4). Les effets du résveratrol sur les stades précoces de l'apoptose mitochondriale. Le stade précocce de l’apoptose
stades précoces de l'apoptose mitochondriale. Le stade précocce de l’apoptose mitochondriale est reproduit en provoquant un flux d’électrons (e') dans la matrice mitochondriale à travers les deux membranes. Celui-ci active la cytochrome c oxydase (complexe IV) qui réduit l’oxygène en eau. Il en résulte une augmentation de la consommation d’oxygène. Le résveratrol la réduit partiellement mais significativement (Fig. 5). Les effets du résveratrol sur le découplage provoqué des mitochondries. Le résveratrol réduit de façon partielle mais significative le découplage induit par le CCCP. L’effet est là aussi biphasique comme observé avec le CR des mitochondries soumises à la séquence d’anoxie-réoxygénation
avec le CR des mitochondries soumises à la séquence d’anoxie-réoxygénation (Fig. 6). 500 S .S 450 ! 400 ^ 350 bû i 300 I 250 ■a 200 Xi 150 CJ g 100 o ■S 50 Témoins en anoxie-réoxygénation + résveratrol avant anoxie + résveratrol avant réoxygénation -12 -11 -10 Log [résveratrol] M * p<0.05, ** p<0.01 Fig. 2. — Suppression par le résveratrol de l’augmentation de la libération de cytochrome induite par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation soit avant les deux séquences, soit après l’anoxie avant la réoxygénation. L'effet du pré traitement chronique par le résveratrol
la réoxygénation. L'effet du pré traitement chronique par le résveratrol sur le contrôle respiratoire mitochondrial. Le résveratrol appliqué aux mitochondries isolées des encéphales des rats traités ne modifie par leurs paramètres respiratoires. Lorsque ces mitochondries sont soumises aux deux séquences d’anoxie puis de réoxygénation, on observe que le pré traitement réduit partiellement mais significativement les altérations produites chez les témoins (Fig. 7). Le CR est significativement augmenté à la dose de 10 mg/kg (SC, une semaine). Ces résultats montrent que le résveratrol administré par voie sous-cutanée développe des effets analogues à ceux observés in vitro sur des mitochondries d’animaux non
à ceux observés in vitro sur des mitochondries d’animaux non traités. Fig. 3. — Inhibition par le résveratrol de la production d’anion superoxyde (O2°') induite par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation avant les deux séquences ou après l’anoxie avant la réoxygénation. DISCUSSION. Le protocole d’anoxie-réoxygénation utilisé provoque une augmentation de la consommation basale d’oxygène des mitochondries, une diminution de leur capacité de phosphorylation et en conséquence une chute de leur coefficient respiratoire. Le découplage des mitochondries résulte d’une diminution du potentiel de la membrane interne mitochondriale, il s’accompagne d’une augmentation de la perméabilité de celle-ci aux
il s’accompagne d’une augmentation de la perméabilité de celle-ci aux protons qui rentrent dans la matrice sans passer par le complexe V. Sur ce modèle, le résveratrol limite l’intensité des altérations induites. Ses effets sont seulement partiels sur le coefficient respiratoire (restauration de 22 % à 10-7 M) : ils s’observent aussi bien lorsque le résveratrol est appliqué avant la double séquence que lorsqu’il est introduit après l’anoxie et avant la réoxygénation. ** p<0.01 versus témoins #p<0.01 versus anoxie-réoxygénation Fig. 4. — Restauration partielle par le résveratrol de l’anisotropie membranaire mitochondriale augmentée par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à
mitochondriale augmentée par l’anoxie-réoxygénation. Le résveratrol a été ajouté à la préparation avant les deux séquences ou après l’anoxie comme précédemment. log [résveratrol] M Fig. 5. — Inhibition partielle par le résveratrol de la consommation d’oxygène induite par le cytochrome c (5 μM) et le NADH (10 μM). Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 6 expériences. Bull. Acad. Natl. de Méd., 2001,185, n° 8, 1429-1445, séance du 13 novembre 2001 Fig. 6. — Inhibition par le résveratrol de l’augmentation de la consommation d’oxygène induite par le CCCP. Les consommations d’oxygène sont comparées après ajout de CCCP
CCCP. Les consommations d’oxygène sont comparées après ajout de CCCP (10 μM) en présence de concentrations croissantes de résveratrol. Les valeurs indiquées sont les moyennes (M ± SD) de 5 expériences. La valeur basale du témoin est 162 ± 4 nmoles d’O2 / min/mg de protéines. Dans les deux cas on observe que l’effet est bimodal aussi bien dans la restauration de la phosphorylation oxydative que dans la normalisation (diminution) de la respiration basale. Le fait que l’effet soit légèrement mais significativement plus grande lorsqu’il est appliqué avant la double séquence montre que si son effet majeur porte sur la
séquence montre que si son effet majeur porte sur la réoxygénation, il est déjà actif au stade de l’anoxie. L’effet prépondérant du résveratrol sur la réoxygénation s’explique facilement par ses propriétés antioxydantes qui sont bien établies [7, 12, 14, 15]. L’effet recouplant observé sur ce modèle est confirmé par la réversion des effets découplants induits par le CCCP : le fait que ces deux résultats aient été observés à des concentrations voisines (EC50 = 5,79 pM et EC50 = 10 pM) permet d’affirmer que le résveratrol est un agent recouplant dans les états d’anoxie suivie de réoxygénation. Les mitochondries ont
dans les états d’anoxie suivie de réoxygénation. Les mitochondries ont été isolées d’encéphale de rats traités par des doses variables de resvératrol, injectées par voie sous-cutanée, pendant une semaine. La phosphorylation oxydative ne reprend qu’en partie car le flux normal d’électrons dans la chaîne respiratoire est limité par l’auto-oxydation de chaque cytochrome encore sous forme réduite. Il en résulte une flambée de radicaux libres, issus en particulier du complexe III. C’est la raison pour laquelle de nombreux auteurs ont souligné que le stade de réoxygénation était plus toxique que celui de l’anoxie car il génère des radicaux libres, en particulier
de l’anoxie car il génère des radicaux libres, en particulier O2•, H2O2 puis en l’absence de quantités suffisantes de superoxyde dismutase (Mn SOD), OH• qui en présence de NO• est transformé en peroxynitrite (ONO2) [20]. Tous ces radicaux libres de l’oxygène provoquent une oxydation sévère donc une destruction des lipides et des protéines membranaires. Ces altérations s’observent dans les accidents vasculaires cérébraux [19]. Nous avons vérifié que, dans notre modèle, sans protection, les mêmes dégradations se produisent (mise en évidence de peroxydations par la réduction du bleu de nitrotétrazolium). Le resvératrol inhibe partiellement l’augmentation d’O2•‘ de façon concentration-dépendante. L’effet s’observe
resvératrol inhibe partiellement l’augmentation d’O2•‘ de façon concentration-dépendante. L’effet s’observe lorsqu’il est appliqué à l’ensemble des séquences ou avant la seule réoxygénation. Il est plus important dans le premier cas ce qui confirme qu’un excès de RLO est déjà produit pendant la phase d’anoxie. Il s’explique par l’effet de piégeage des RLO du resvératrol, mais beaucoup plus vraisemblablement par l’inhibition de leur production par le complexe III, que nous avons décrite précédemment [7], On peut observer en effet que l'EC50 de l’inhibition de l’activité enzymatique du complexe III, 5,49 nM, est voisine du seuil d’inhibition de la production de O2•‘,
est voisine du seuil d’inhibition de la production de O2•‘, 1 nM (Fig. 4). Le modèle d’anoxie-réoxygénation provoque aussi la dissociation du cytochrome c de son ancrage à la membrane interne. Il reproduit ainsi une étape précoce des effets du stress oxydatif [21] et déclenche, par sa libération dans le tampon d’incubation, l’étape mitochondriale de l’apoptose [22], Le cytochrome c en présence de NADH, d'oxygène et de NADH-cytochrome b5 oxydo-réductase, provoque le transfert direct d’équivalents réducteurs (e-) de l’extérieur à l’intérieur de la matrice mitochondriale. Il génère ainsi un potentiel de membrane qui permet l’activation du complexe IV puis la
de membrane qui permet l’activation du complexe IV puis la synthèse d’ATP (l’activation du complexe V) nécessaire au développement de l’apoptose [22, 23], On observe que le resvératrol inhibe totalement à 10-7 M, la libération de cytochrome c induite par l’anoxie-réoxygénation. Son efficacité n’est pas différente lorsqu’il est appliqué avant la double séquence ou avant la seule réoxygénation, ce qui suggère que le phénomène apoptotique mitochondrial est déclenché par le retour de l’oxygène. En diminuant la consommation d’oxygène en présence d’un excès d’ADP, le resvératrol diminue la synthèse d’ATP qui exécute l’apoptose (à partir de 9 M). Comme il a
exécute l’apoptose (à partir de 9 M). Comme il a été déjà démontré qu’il est sans effet sur le complexe IV [7], il ne peut être que soit un inhibiteur direct de la NADH cytochrome b5 oxydoréductase, soit agir par son effet recouplant. Le fait que la diminution de synthèse d’ATP par le système bitransmembranaire ne soit que partielle est peu compatible avec une inhibition enzymatique, mais suggère que c’est l’effet recouplant du resvératrol qui est opérant. L’anoxie suivie de la réoxygénation provoque une augmentation de l’anisotropie des membranes mitochondriales, qui indique une rigidification de leur architecture et donc une
qui indique une rigidification de leur architecture et donc une diminution de leur fluidité. Elle est due principalement aux effets des RLO. Le resvératrol (10-7 M) inhibe totalement cette perte de fluidité : ses effets ne sont pas différents s’il est appliqué avant la double séquence ou avant la seule réoxygénation. Ce résultat confirme, par une méthode physique, les effets protecteurs membranaires déjà observés du resvératrol. Bull. Acad. Natle Méd., 2001,185, n° 8, 1429-1445, séance du 13 novembre 2001 CONCLUSION On peut donc conclure que le resvératrol limite in vitro les effets délétères de l’anoxie-réoxygénation sur les fonctions mitochondriales des
les effets délétères de l’anoxie-réoxygénation sur les fonctions mitochondriales des cellules cérébrales. Cette protection inclut un maintien partiel du contrôle respiratoire, une réduction de production de RLO et une inhibition totale de la libération de cytochrome c. Ces effets sont dus principalement à une action recouplante mitochondriale, à l'inhibition partielle de la génération de RLO et au piégeage de ceux qui persistent. Ils s’accompagnent d’une conservation partielle de la fluidité membranaire. Après administration chronique (SC) de resvératrol à des rats, leurs mitochondries (extraites du cerveau) présentent une résistance à l’anoxie-réoxygénation analogue à celle observée in vitro. Il en résulte que
analogue à celle observée in vitro. Il en résulte que le resvératrol limite in vivo les effets délétères de l’anoxie-réoxygénation en protégeant les fonctions mitochondriales des cellules cérébrales. Ces observations expérimentales pourraient expliquer, au moins en partie, les effets protecteurs de certaines fonctions cérébrales, en particulier cognitives, qui sont attribués à la consommation de certains vins [24], Toutefois, il n’est pas possible d’établir une relation de causalité entre les observations cliniques et expérimentales car les études épidémiologiques n’ont pas inclus de dosages sanguins de resvératrol. On ne sait donc pas si les sujets étudiés avaient reçu et résorbé cette substance.
si les sujets étudiés avaient reçu et résorbé cette substance. En revanche, chez le Rat, l’administration chronique orale de vin a montré que le resvératrol était résorbé dans la circulation générale et que sa distribution dans l’organisme était bien décrite par une distribution bi-compartimentale, avec un compartiment dit profond qui inclut vraisemblablement le cerveau [25], D’autre part, les résultats que nous avons obtenus montrent que les effets mitochondriaux du resvératrol surviennent (in vitro) à des concentrations très faibles, nano et picomolaires compatibles avec les concentrations simulées de distribution cérébrale réalisées à partir des modèles pharmacocinétiques précédents. La preuve directe de
à partir des modèles pharmacocinétiques précédents. La preuve directe de l’effet du resvératrol sur les fonctions cérébrales après administration orale reste à apporter. REMERCIEMENTS L’auteur adresse des vifs remerciements au docteur Roland Zini et à M. Christophe Morin pour leur précieuse collaboration. Bull. Acad. Natle Méd., 2001,185, n° 8, 1429-1445, séance du 13 novembre 2001 BIBLIOGRAPHIE [1] Fremont L. — Biological effects of resveratrol. Life Sci., 2000, 66, 663-673. [2] Rotondo S., Rajtar G., Manarini S., Celardo A., Rotilio D., de Gaetano G., Evangelista V. Cerletti C. — Effect of trans-resveratrol, a natural polyphenolic compound, on human polymorphonuclear leukocyte function.
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