jeanflop/post-ocr-correction huggingface dataset:
ce qui confirme nos résultats antérieurs (3). — Chez L. neritoides et L. saxatilis, espèces situées aux niveaux les plus hauts de la zone intertidale, la valeur du rapport N-urique/N-total est moins élevée que chez L. littorea et L. littoralis qui vivent à des niveaux plus bas. Acides aminés (tableau II) : En ce qui concerne la composition en acides aminés des tissus de Littorines étudiés, nous pouvons retenir les faits suivants : — La composition en acides aminés présents dans les tissus montre, tout d'abord, une certaine homogénéité au sein de la famille des Littorinidae. — Quelle que soit
sein de la famille des Littorinidae. — Quelle que soit l'espèce considérée, les acides aminés les plus importants quantitativement sont : l'acide aspartique, l'acide glutamique et la glycine, résultats très proches de ceux enregistrés par Duchateau, Florkin et Sarlet (8) sur Buccinum undatum, Patella vulgata et Haliotis tuberculata. — Chaque espèce de Littorine possède quatre acides aminés en quantité importante : pour L. neritoides : acide aspartique, acide glutamique, glycine et alanine ; pour L. saxatilis : acide glutamique, acide aspartique, glycine et alanine; pour L. littorea : proline, acide glutamique, lysine et acide aspartique ; pour L. littoralis :
glutamique, lysine et acide aspartique ; pour L. littoralis : acide aspartique, acide glutamique, glycine et leucine. TABLEAU II Composition en acides aminés des Littorinidae de la Pointe rocheuse de Penvins (Morbihan) (exprimée en moles pour cent moles d'acides aminés totaux). Il a été tenu compte des cinétiques de libération et de dégradation des divers acides aminés en fonction de la durée de l'hydrolyse. Acides aminés L. neritoides L. saxatilis L. littorea L. littoralis Acide aspartique 10,69 8,88 8,24 10,87 Théonine 5,52 5,74 5,61 6,22 Sérine 5,86 6,57 5,85 6,44 Acide glutamique 10,00 10,43 9,27 9,32 Proline 4,83 4,96 9,33
Acide glutamique 10,00 10,43 9,27 9,32 Proline 4,83 4,96 9,33 5,99 Glycine 10,00 8,24 8,05 7,44 Alanine 7,59 7,82 7,56 6,91 Valine 5,85 6,51 6,35 6,49 Cystine 1,01 1,29 0,63 0,51 Méthionine 2,16 2,32 0,81 2,41 Isoleucine 4,64 5,13 5,12 5,32 Leucine 7,25 7,56 6,86 7,24 Tyrosine 4,43 4,07 4,14 4,08 Phénylalanine 4,83 4,98 4,85 5,03 Lysine 6,26 6,25 8,51 6,64 Histidine 2,82 3,15 3,02 3,06 Arginine 6,26 6,00 5,80 6,03 — L'acide glutamique tient une place importante chez L. neritoides et L. saxatilis, tandis que l'acide aspartique est prépondérant chez L. neritoides et L. littoralis. — Seul, le bigorneau
chez L. neritoides et L. littoralis. — Seul, le bigorneau comestible L. littorea montre une certaine originalité par rapport aux autres espèces, la proline y étant abondante et la méthionine, par contre, s'y trouvant en quantité très faible. — Enfin, chez L. neritoides et L. saxatilis, espèces situées aux niveaux les plus hauts de la zone intertidale, le taux de cystine est beaucoup plus important que chez L. littorea et L. littoralis, espèces vivant à des niveaux inférieurs. Ce phénomène est peut-être à mettre en relation avec la dessiccation à laquelle sont soumis les individus des hauts niveaux lors de
laquelle sont soumis les individus des hauts niveaux lors de leur exondation, leurs téguments devant être alors plus résistants, donc peut-être plus riches en cystine. En conclusion, nous pouvons dire que les Littorinidae montrent des adaptations plus ou moins importantes à la vie terrestre et que ces dernières se retrouvent même au niveau de la teneur en azote total qui est plus élevée chez Littorina neritoides, espèce supralittorale, que chez les espèces médiolittorales (L. saxatilis, L. littorea et L. littoralis). De plus, la composition en acides aminés des tissus des individus des diverses espèces semble homogène, mais présente cependant des
individus des diverses espèces semble homogène, mais présente cependant des caractères en relation peut-être avec l'écologie des animaux, telle la teneur en cystine plus élevée chez les littorines inféodées aux niveaux les plus élevés de la zone intertidale. (*) Séance du 21 février 1977. (1) Avec la collaboration technique de Mlle LE PIVER, aide-biologiste C.N.R.S., M. le professeur J. Joly, directeur du laboratoire « Biologie de la reproduction » de l'Université de Rennes et M. P. Jego, Maître-Assistant, ont bien voulu nous accueillir et nous initier aux techniques de l'analyseur automatique d'acides aminés « Technicon ». (3) J. DAGUZAN, Thèse
automatique d'acides aminés « Technicon ». (3) J. DAGUZAN, Thèse Doct-ès-Sc. Nat., Rennes 1975. (3) G. A. KERKUT et G. A. COTTRELL, Comp. Biochem. Physiol., 5, 1962, p. 227-230. G. DUCHATEAU et M. FLORKIN, in M. FLORKIN et S. BRICTEUX-GREGOIRE, Chemical Zoology, 7, 1972, p. 307. J. W. CAMPBELL et K. V. SPEEG, Comp. Biochem. Physiol., 25, 1968, p. 3-32. F. E. FRIEDL, J. Parasitol., 47, 1961, p. 773-776. D. E. GILBERTSON et L. S. SCHMID, Comp. Biochem. Physiol., 51 B, 1975, p. 201-203. G. DUCHATEAU, M. FLORKIN et M. SARLET, Arch. Intern. Physiol., 62, 1954, p. 512. G. DUCHATEAU
SARLET, Arch. Intern. Physiol., 62, 1954, p. 512. G. DUCHATEAU et M. FLORKIN, in M. FLORKIN et S. BRICTEUX-GREGOIRE, Chemical Zoology, 7, 1972, p. 304-305. A. C. GIESSE, Physiol. Rev. 46, 1966, p. 244-298. L. MASSE, C.R. Acad. Sci. Paris 263, 1966, n. 781-784. J. CITHAREL, Thèse Doct-ès-Sc. Nat., Rennes, 1971. Laboratoire de Zoologie générale et d'Ecophysiologie, Faculté des Sciences biologiques. Université de Rennes, avenue du Général-Leclerc. 35000 Rennes. BIOCHIMIE. Mise en évidence d'un récepteur du 5α-androstane-3β, 17β-diol dans le cytosol de l'hypophyse antérieure du rat mâle prépubère. Note de Marie-Lise Thieulant, Suzanne Sampérez et Pierre Jouan, présentée par M.
Marie-Lise Thieulant, Suzanne Sampérez et Pierre Jouan, présentée par M. Jean Roche. Le cytosol de l'hypophyse antérieure du rat mâle prépubère renferme un récepteur spécifique du 5α-androstane-3β, 17β-diol. Ses principales caractéristiques sont les suivantes: KA = 5.2 x 10⁷ M-1, Kd = 1.9 x 10-8 M, nombre de sites = 8.7 x 10¹⁴ molles par mg de protéines. Sa constante de sédimentation est d'environ 3 S. Seuls le 3β-diol et les œstrogènes sont compétitifs aux sites du 3β-diol. Les androgènes, y compris le 5α-androstane-3α, 17β-diol, n'ont aucun effet de compétition. Ce récepteur est présent dans l'hypophyse mais absent dans l'hypothalamus
Ce récepteur est présent dans l'hypophyse mais absent dans l'hypothalamus et le cerveau. Cette localisation particulière semble indiquer que cet androgène joue un rôle spécifique dans cette glande. The presence of a specific receptor for 5α-androstan-3β, 17β-diol (3β-diol) in the pituitary cytosol from prepubertal male rats was demonstrated. Its characteristics were: KA = 5.2 10⁷ M, KD = 1.9 x 10-8 M, number of specific binding sites = 8.7 10¹⁴ molles per mg of proteins. Its sedimentation constant was 3 S. Competition assays showed that only 3β-diol itself and estrogens were able to compete for the binding sites for 3β-diol.
were able to compete for the binding sites for 3β-diol. Androgens, including 3α-diol, were inefficient. This receptor was found only in pituitary cytosol. It was missing from hypothalamic or cortical cytosols. This special localization seemed to foreshadow a specific role for 3β-diol in the anterior hypophysis. INTRODUCTION. — Dans l'hypophyse antérieure du rat mâle, la testostérone est métabolisée principalement en dihydrotestostérone (DHT) et en 5α-androstane-3α, 17β-diol (3α-diol) [e)-C')]. Outre ces métabolites, on trouve aussi de petites quantités de 5α-androstane-3β, 17β-diol (3β-diol) [b]. Après avoir mis en évidence la présence de récepteurs de la testostérone et de la DHT [C)-())]. puis
récepteurs de la testostérone et de la DHT [C)-())]. puis l'absence de liaison spécifique du 3α-diol (9) dans l'hypophyse antérieure du rat mâle, nous avons recherché la présence éventuelle d'un récepteur du 3β-diol dans le cytosol de cette glande. Les résultats obtenus démontrent l'existence d'un récepteur spécifique du 3β-diol dans le cytosol d'hypophyses antérieures de rats prépubères. PARTIE EXPÉRIMENTALE. Nous avons utilisé des rats mâles prépubères (36-38 jours) de souche Wistar (Elevage Janvier, Le Genest). Après sacrifice par décapitation sans anesthésie, les hypophyses antérieures ont été rapidement prélevées et homogénéisées dans une solution tampon phosphate 0,05 M, à pH 7,4.
dans une solution tampon phosphate 0,05 M, à pH 7,4. Après centrifugation de l'homogénat à 600 x g, le surnageant est soumis à une centrifugation à 105 000 x g pendant 1 h. Le cytosol obtenu est ensuite dilué avec une quantité appropriée de tampon phosphate 0,05 M afin d'obtenir une concentration en protéines de 2.9 mg par ml de cytosol. Des parties aliquotes de cytosol sont incubées à 0°C et à l'équilibre (3 h) en présence de 5α-androstane-3β, 17β-diol-3H] (Act. spécifique = 46 Ci/mmole). A la fin de la période d'incubation, le récepteur et son ligand sont précipités par
période d'incubation, le récepteur et son ligand sont précipités par addition au cytosol d'un volume égal d'une solution de sulfate de protamine à 1.5 mg par ml d'eau. Le mélange est agité puis maintenu à 0°C pendant 15 mn. Les différents échantillons sont ensuite déposés sur des filtres en fibre de verre. « Whatman GF/C » de 2,5 cm de diamètre. Les filtres sont lavés, sous un vide léger, quatre fois par addition de 10 ml de solution tampon phosphate 0,05 M (4 x 10 ml). La radioactivité adsorbée par le filtre est mesurée par comptage en scintillation liquide. Des
le filtre est mesurée par comptage en scintillation liquide. Des expériences témoins sont effectuées dans les mêmes conditions en utilisant de l'hormone tritiée en solution dans le tampon phosphate 0,05 M. La nature du stéroïde lié au récepteur cytosolique est déterminée, après extraction de la radioactivité adsorbée sur le filtre par un mélange chloroforme-méthanol (2 : 1 v/v), par chromatographie sur papier Whatman n° 2 dans le système de solvants de Kochakian et Stidworthy ("). La constante de sédimentation du récepteur du 3β-diol a été déterminée par ultracentrifugation dans un gradient de saccharose de 5 à 20 %. Pour ces
gradient de saccharose de 5 à 20 %. Pour ces expériences, des lots de 24 hypophyses antérieures sont homogénéisées dans une solution tampon Tris HCl 0,01 M, EDTA 0,0015 M, dithiothréitol 0,001 M, à pH 7,5. La concentration en protéines du cytosol obtenu est de 10 mg par ml. Des fractions de 400 μl de cytosol sont incubées pendant 3 h à 0°C en présence de 3β-diol-3H à la concentration de 5 x 10-8 M ou 1 x 10-9 M. Après incubation, l'hormone libre est éliminée par addition de charbon-dextran. 0,5 g de charbon et 0,05 g de dextran sont
0,5 g de charbon et 0,05 g de dextran sont mis en suspension dans 100 ml de tampon Tris — HCl. Des fractions de 400 μl de cette suspension sont centrifugées à 2 000 x g pendant 15 mn. Le cytosol (400 μl) est ensuite mélangé avec le culot charbon-dextran et maintenu à 0°C pendant 15 mn. Après centrifugation à 2 000 x g pendant 15 mn, des fractions de 200 μl du surnageant à 2 000 x g sont ensuite déposées sur le gradient de saccharose. La solution de saccharose est préparée dans le tampon Tris - HCl décrit
saccharose est préparée dans le tampon Tris - HCl décrit ci-dessus et renfermant 10 % de glycérol. Les gradients sont centrifugés à 200 000 x g, pendant 15 à 17 h dans un rotor « SW 65 ». Des fractions du gradient (6 gouttes) sont collectées au moyen d'un fractionneur de gradient (ISCO) et les protéines sont analysées à 280 nm au moyen d'un analyseur UV (ISCO). Les protéines sont déterminées par la méthode de Lowry et al. (n). La radioactivité des chromatogrammes est mesurée comme il a été précédemment indiqué (12). Celle des filtres GF/C est dosée dans du
indiqué (12). Celle des filtres GF/C est dosée dans du liquide de Bray (10 ml) et celle des gradients après addition d'« Instagel » (10 ml). Les comptages de la radioactivité sont effectués au moyen d'un compteur à scintillation liquide, « ISOCAP 300 ». RÉSULTATS. — Après incubation du cytosol à 0°C, en présence de 3P-diol-3H à la concentration de 2 x 10-8 M, on constate que le taux de liaison de ce stéroïde aux protéines cytosoliques est maximum au bout d'une heure et reste constant pendant 24 h. L'analyse chromatographique du stéroïde lié, à l'équilibre, démontre l'absence de métabolisme
chromatographique du stéroïde lié, à l'équilibre, démontre l'absence de métabolisme du ligand. L'incubation à 0°C et à l'équilibre des fractions de cytosols en présence de 3p-diol-3H à des concentrations allant de 1 x 10-9 M à 3 x 10-7 M montre l'existence d'un récepteur saturable. La constante d'association déterminée selon la méthode de Scatchard (4) est de 5,2 x 107 M-1, la constante de dissociation de 1,9 x 10-8 M et le nombre de sites de 8,7 x 10-14 moles par mg de protéines. Le degré de spécificité de la liaison a été mesuré par incubation de fractions de cytosol
liaison a été mesuré par incubation de fractions de cytosol en présence du 3β-diol-3H à la concentration de 1,2 x 10-8 M, et de stéroïdes non radioactifs à des concentrations allant de 5 x 10-9 M à 5 x 10-7 M. Seuls le 3β-diol, le 17β-œstradiol, l'œstrone et le diéthylstilbœstrol (DES) sont compétitifs. Pour diminuer de 50 % le taux de liaison du 3P-diol, il faut une concentration de 4 x 10-8 M en 17β-œstradiol, 7 x 10-8 M en 3β-diol et 3,5 x 10-7 M en DES. Par contre, la testostérone, la DHT, le 3α-diol et la progestérone n'ont
la testostérone, la DHT, le 3α-diol et la progestérone n'ont aucune efficacité de compétition. L'analyse des gradients d'ultracentrifugation montre l'existence de deux pics radioactifs. Le plus important a une constante de sédimentation voisine de 3 S, le second, beaucoup plus faible, a une constante d'environ 8,7 S. En présence de 3P-diol non radioactif, ces deux fractions radioactives disparaissent. DISCUSSION DES RÉSULTATS. — Les résultats obtenus démontrent l'existence d'un récepteur spécifique du 3P-diol dans le cytosol de l'hypophyse antérieure du rat mâle prépubère. Une éventuelle contamination du cytosol par des protéines sériques liant le 3P-diol-3H est exclue, car celles-ci ne sont
sériques liant le 3P-diol-3H est exclue, car celles-ci ne sont pas précipitées par le sulfate de protamine. L'un des caractères essentiels de ce récepteur est sa spécificité. En effet, seuls le 3P-diol et les œstrogènes sont compétitifs aux sites de ce récepteur. Les androgènes n'ont aucun effet compétiteur. Ces constatations laisseraient à penser à une identité entre le récepteur du 3P-diol et celui du 17β-œstradiol. En réalité, deux récepteurs distincts, l'un du 3P-diol, l'autre du 17β-œstradiol semblent coexister dans l'hypophyse du rat mâle. Ces deux récepteurs spécifiques diffèrent, en effet, par leurs constantes d'association, leur nombre de sites et leurs
par leurs constantes d'association, leur nombre de sites et leurs constantes de sédimentation. Un autre argument en faveur de leur différentiation réside dans leur localisation tissulaire puisque le récepteur du 3P-diol semble absent du cerveau et de l'hypothalamus alors que le récepteur du 17P-œstradiol est présent dans ce dernier (recherches en cours). La présence d'un récepteur spécifique du 3P-diol dans l'hypophyse antérieure du rat mâle, son absence dans les centres nerveux supérieurs dont l'hypothalamus semblerait indiquer que cet androgène joue un rôle particulier au niveau de cette glande. M. le Docteur P. Robel nous a aidé de ses conseils pour
Docteur P. Robel nous a aidé de ses conseils pour l'utilisation de la méthode de précipitation au sulfate de protamine. Séance du 14 mars 1977. (1) R. B. JAFFE, Steroids, 14, 1969, p. 483. (2) F. F. G. ROMMETS et H. J. VAN DER MOLEN, Biochem. Biophys. Acta, 248, 1971, p. 489. (3) C. DENEF, C. MAGNUS et B. S. McEWEN, J. Endocr., 59, 1973, p. 605. (4) NGUYEN CONG THIEN, J. DUVAL, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, Biochimie, 56, 1974, p. 899. (5) NGUYEN CONG THIEN, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1165. (6)
P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1165. (6) A. GENOT, B. LORAS, M. MONBON et J. BERTRAND, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1247. (7) S. SAMPEREZ, M. L. THIEULANT, L. MERCIER et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 5, 1974, p. 911. (8) M. L. THIEULANT, L. MERCIER, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 6, 1975, p. 1257. (9) L. MERCIER, C. LE GUELLEC, M. L. THIEULANT, S. SAMPEREZ et P. JOUAN, J. Steroid Biochem., 7, 1976, p. 779. (10) Ch. KOCHAKIAN et G. STIDWORTHY, J. Biol. Chem., 119, 1952, p. 607. (11) O. H. LOWRY,
Biol. Chem., 119, 1952, p. 607. (11) O. H. LOWRY, N. J. ROSEBROUGH, A. L. FARR et R. J. RANDALL, J. Biol. Chem., 193, 1951, p. 265. (12) P. JOUAN, S. SAMPEREZ et M. L. THIEULANT, J. Steroid Biochem., 4, 1973, p. 65. (13) G. BRAY, Anal. Biochem., 1, 1960, p. 279. (14) G. SCATCHARD, Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 1949, p. 660. Laboratoire de Neurologie moléculaire, Équipe de Recherche associée au C.N.R.S. n° 567, Faculté des Sciences biologiques, avenue du Général-Leclerc, 35031 Rennes Cedex. Une valeur absolue des pi beaucoup plus significative est obtenue en électrofocalisation en veine
pi beaucoup plus significative est obtenue en électrofocalisation en veine liquide, la technique en gel de polyacrylamide doit donc être réservée uniquement pour des mesures comparatives. Analytical isoelectric focusing in polyacrylamide gels and preparative electrofocusing in density gradients may give very different pi determination for the same β-lactamase. This difference seems due to a lack of enzyme migration in some parts of the cross-linked polyacrylamide gel. This migration appears easier in density gradient isoelectric focusing, and thus this technique yields more significant absolute pi values. Analytical isoelectric focusing should only be used for comparison studies. Les points isoélectriques (pi) des
be used for comparison studies. Les points isoélectriques (pi) des enzymes et, en particulier, des β-lactamases peuvent être déterminés par électrofocalisation en veine liquide sur colonne ou en gel de polyacrylamide en couche mince. Cette dernière technique est souvent considérée comme « analytique » puisque la révélation in situ selon la technique des zymogrammes permet de comparer diverses préparations de β-lactamases et de mettre en évidence de très faibles différences de pl. Utilisateurs, depuis quelques années, de l'électrofocalisation en veine liquide sur colonne, nous avons adapté plus récemment la électrofocalisation analytique en gel de polyacrylamide selon un protocole qui ne
analytique en gel de polyacrylamide selon un protocole qui ne diffère de celui de Matthew et coll. que dans le système révélateur de l'activité β-lactamase. TABLEAU pi Souches bactériennes 1 2 3 E. coli P 111 (TEM 1) 5.4 5.4 5.4 (1) p.a. E. coli RP 4 (TEM 2) 5.6 5,6 5,6 (2) p.a. E. coli P 453 (type 2) 7,7 7,1 7,7 (3) V.L. P. morganii NCTC 235 8,3 7,3 7,3 (4) p.a. Ps aeruginosa NCTC 8203 8.7 7.5 7.5 (5) p.a. 7.7 (4) p.a. pi déterminés 1, en veine liquide: 2. en gel de polyacrylamide; 3. références de
veine liquide: 2. en gel de polyacrylamide; 3. références de la littérature, (p.a. polyacrylamide; V.L. veine liquide). Vis-à-vis de quelques β-lactamases, nous avons constaté que les pl déterminés par électrofocalisation en veine liquide ou en gel de polyacrylamide sont en bon accord. Par contre, vis-à-vis de certaines enzymes, des différences très grandes de pl apparaissent entre les 2 techniques. Nous nous sommes proposés d'éclairer ce point. MÉTODES. — Souches bactériennes. — Nous avons utilisé 2 souches de collection : Proteus morganii NCTC 235 et Pseudomonas aeruginosa 8203, ainsi que les E. coli K 12, P 111 et P 453 respectivement
E. coli K 12, P 111 et P 453 respectivement producteurs de β-lactamases extrachromosomiques type 1 et type 2 (Pr. Pitton de Genève) et le E. coli RP 4 producteur de β-lactamase extrachromosomique TEM 2 (Pr. Chabbert, Institut Pasteur). Cultures bactériennes des β-lactamases. — Un protocole précédemment décrit a été respecté. Cependant, dans le cas des Proteus et Pseudomonas dont les β-lactamases sont inductibles, la pénicilline G a été introduite dans le bouillon de culture, en milieu de phase exponentielle de croissance 3 h avant la récolte, aux concentrations finales de 500 et 5 000 µg/ml respectivement. Électrofocalisation en veine
de 500 et 5 000 µg/ml respectivement. Électrofocalisation en veine liquide sur colonne. — Nous avons respecté le protocole décrit antérieurement. La durée de la focalisation est de 72 h. Cliché 1. — Électrofocalisation de la β-lactamase du E. coli P 111, l'enzyme est déposé sous forme de gouttes selon une diagonale du gel matérialisée par la ligne en pointillée. Du côté acide, une activité résiduelle reste visible aux dépôts. Électrofocalisation analytique sur gel de polyacrylamide. — La technique que nous utilisons a été décrite récemment dans cette revue. La durée de focalisation est d'environ 18 h, sous un potentiel
durée de focalisation est d'environ 18 h, sous un potentiel limité à 700 V (atteint après 3 h de focalisation) et une puissance limitée à 5 W. RÉSULTATS ET DISCUSSION. — En respectant les protocoles expérimentaux proposés, nous avons obtenu les pl relatés dans le tableau. On constate que dans le cas des β-lactamases TEM 1 (6) ou type 1 de Pitton C) et TEM 2 (6), les 2 techniques sont en bon accord, et nous retrouvons les résultats de la littérature. Cependant, la variabilité de ces déterminations est systématiquement plus grande en gel qu'en veine liquide. Par contre, une
plus grande en gel qu'en veine liquide. Par contre, une différence importante, très supérieure aux erreurs expérimentales, apparaît dans le cas des 2 souches de la NCTC et le E. coli P 453. En électrofocalisation analytique, nous avons cependant reproduit les résultats de la littérature. Un problème se pose donc au niveau de l'une des deux techniques. Quelques constatations expérimentales fortuites nous ont amené à vérifier si la position initiale du dépôt de la préparation enzymatique sur le gel de polyacrylamide pouvait influer sur la migration ultérieure de l'enzyme. Or, Matthew et coll. (1) ont écrit que les pl déterminés
Matthew et coll. (1) ont écrit que les pl déterminés par cette technique sont indépendants de la position du dépôt initial, sans toutefois préciser dans quels cas ceci a été vérifié. Afin d'élucider cet aspect, nous avons déposé chaque enzyme le long d'une diagonale du gel, sous la forme de gouttes de 5 µl, déposées tous les 10 mm; l'activité de la préparation enzymatique étant préalablement ajustée à 10 U/ml. Cliché 2. — Électrofocalisation de la céphalosporinase du Ps. aeruginosa NCTC 8203; les dépôts sont réalisés comme dans le cliché 1. Le gel n'a été révélé que partiellement. Dans le
1. Le gel n'a été révélé que partiellement. Dans le cas des β-lactamases TEM 1 et TEM 2, les enzymes focalisent selon une courbe, sensiblement droite iso-pH à pH 5,4 et 5,6 respectivement. Le cliché 1 représente le cas de la β-lactamase TEM 1. Par contre, dans le cas de la β-lactamase type 2 et des β-lactamases de Proteus et de Pseudomonas, le résultat de l'électrofocalisation est tout à fait différent. L'enzyme focalise selon une courbe d'allure sigmoïde, et le cliché 2 représente le cas du Ps. aeruginosa NCTC 8203. Ces phénomènes sont reproductibles et assez indépendants des conditions expérimentales
Ces phénomènes sont reproductibles et assez indépendants des conditions expérimentales utilisées. Diverses expériences, non relatées ici, montrent que la position finale de l'enzyme ne dépend que de la position initiale du dépôt sur le gel. En outre, la pureté des préparations permet d'exclure une hétérogénéité des β-lactamases. L'influence d'un possible problème redox a été éliminé à l'aide d'une électrofocalisation en présence, au niveau de l'anode, de mercapto-éthanol qui prévient la diffusion de toute substance oxydante. Enfin, les enzymes utilisées dans ce travail sont toutes monomères, ce qui permet d'exclure un problème d'équilibre monomère-dimère qui serait fonction du pH. L'artefact se