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même dominante ; parce qu’il y avait place pour une large documentation graphique, Rodio ayant donné un seul dessin et quelques photomicrographies peu lisibles ; enfin, nous ne nous sommes servis ni des mêmes milieux, ni des mêmes conditions de culture. J. BEAUVERLIE. Les milieux de culture, Milieux liquides : Moût de bière, eau de levure additionnée de divers sucres, jus de carotte, jus de tomates (mûres et demi-mûres). Le développement se fait bien sur ces divers milieux. Milieux solides : Moût de bière gelosé, milieu de Gorodkowa, carotte. Tous ces milieux sont favorables, même le Gorodkowa, où la végétation
ces milieux sont favorables, même le Gorodkowa, où la végétation se poursuit comme sur un milieu de culture proprement dit (et sans se montrer plus favorable qu’un autre milieu à la sporulation qui s'effectue partout avec la plus grande facilité). Fig. 1. — Dessin grandeur naturelle de culture sur moût de bière gelosé en flacon de Houx d’un demi litre (52 jours). L’aspect est assez méandriforme. Aspect des cultures. Macroscopiquement, l'aspect sur milieu solide, tel que moût de bière gelosé, est méandriforme ; mais, cependant, si le milieu est très frais, alors qu’il possède encore toute son eau, la culture
frais, alors qu’il possède encore toute son eau, la culture peut présenter de larges plaques non ou à peine ridées et la différence est très sensible entre l’aspect d’une culture sur un milieu sec et ancien et celui qu’elle présente sur un milieu frais, de telle sorte que l’importance de l’aspect microscopique des cultures pour la diagnose spécifique ne paraît pas être celle qu’on lui accorde généralement. Les colonies sont de coloration blanche. Fermentation. Nous avons fait l’expérience en cellules Van Tieghem et en flacons de Erlenmeyer en nous servant de l'eau de levure additionnée d'une pincée du sucre étudié.
de l'eau de levure additionnée d'une pincée du sucre étudié. La cellule de Van Tieghem doit être exactement remplie. Les sucres ajoutés étaient : saccharose, glucose, levulose, lactose, maltose, mannite. La levure forme bientôt un dépôt. On n’observe rien de sensible après 4 heures ; mais, après 4 ou 5 jours, on constate la présence de bulles abondantes avec saccharose et glucose ; quelques jours après, toute fermentation avait cessé. On sait que la méthode employée comporte toutes réserves pour les résultats négatifs. Fig. 2. — Dessin grandeur naturelle de culture sur moût de bière gelosé en flacon de Houx
culture sur moût de bière gelosé en flacon de Houx d’un demi litre (52 jours). L’aspect est moins méandriforme que dans le cas précédent, beaucoup de plages lisses. L’aspect macroscopique des cultures est en somme assez variable : il apparaît très méandriforme sur milieux gélosés anciens et, par suite, plus secs ; sur des milieux neufs et pour des cultures assez récentes, l’aspect peut être presque lisse. Il est différent aussi sur carotte. On observe également une fermentation avec le jus de carotte, le moût de bière, le jus de tomates mûres. Anneau et dépôt. Sur les milieux liquides que
tomates mûres. Anneau et dépôt. Sur les milieux liquides que nous venons d'indiquer, il se produit un dépôt généralement abondant et, plus tard, un anneau très faible et fragmenté. Action des températures extrêmes. À défaut de glacière, nous avons placé, au mois de janvier, des tubes de moût de bière gelosé venant d'être ensemencés, à l'extérieur du laboratoire, un témoin restant à l'intérieur. Pendant 12 jours, la température se maintint à près de 0° ; le premier jour, elle s’élève à 7°, mais n’atteint plus 5° qu’un seul jour, pour descendre plusieurs fois jusqu'à −7° (observation contrôlée à l'aide du
descendre plusieurs fois jusqu'à −7° (observation contrôlée à l'aide du thermomètre enregistreur). Nous constatons que, dans ces conditions, le développement est entièrement arrêté. La levure n'est d’ailleurs nullement tuée, car les tubes replacés dans l’intérieur du laboratoire donnent lieu à une culture développée. Par contre, la végétation continue, seulement ralentie, pour des températures atteignant 40° et au-dessus. Nous montrerons plus loin que le bourgeonnement peut alors présenter, au début, des anomalies (fig. 3) et que, surtout, la sporulation est restreinte. Cette levure rentre bien dans le cas de l’adaptation à une température élevée que Guilliermond a souligné dans le cas
une température élevée que Guilliermond a souligné dans le cas des levures de l’Afrique occidentale qu'il a étudiées. Étude microscopique. Les cellules végétatives peuvent avoir une forme ovoïde subarrondie, mais susceptible de s’allonger suivant les conditions de milieu, elles peuvent même prendre des formes allongées et subcylindriques dans les anneaux et sur carottes (fig. 7 et 12). On se rendra compte de ces diverses formes d'après les figures jointes. Le bourgeonnement. Il peut être terminal et aussi latéral (fig. 9). Il peut devenir d’une abondance anormale : la cellule mère se recouvre alors de petits bourgeons à parois très minces
se recouvre alors de petits bourgeons à parois très minces qui peuvent à leur tour engendrer de très nombreux petits bourgeons ; nous avons observé ce cas surtout dans des milieux (moût de bière gélose) placés à une très haute température. Ceux qui sont figurés (fig. 15) provenaient de tubes placés dans une boîte en bois sur un radiateur, le thermomètre y marquait des températures s'élevant jusqu’à 40° et 52°, la température tombant la nuit à une quinzaine de degrés. D’ailleurs, au bout de plusieurs jours, cette anomalie avait disparu et le bourgeonnement était redevenu normal. Cette végétation à des
et le bourgeonnement était redevenu normal. Cette végétation à des températures aussi élevées ne peut surprendre de la part d’un organisme des pays chauds, appelé à subir au moment de l’insolation, des chaleurs plus élevées encore. Le bourgeonnement que nous venons de signaler, qui se trouve sans doute en rapport avec des actions osmotiques excessives, peut s’observer à des températures plus basses (fig 3) Mais il est alors exceptionnel. Fig. 3. — Culture sur moût de bière gélosé. Conjugaison et sporulation. Conjugaison principalement hétérogame. On voit quelquefois la cellule se prolonger par une sorte de filament irrégulier et même d'aspect
prolonger par une sorte de filament irrégulier et même d'aspect tuméfié (fig. 4, sur carotte, et surtout, fig. 13, sur Gorodkowa). Il semble qu’ils soient dus, soit à un bourgeonnement anormal, soit à la déformation de becs de conjugaison. Dimensions. Nous avons noté, pour la plus grande longueur 5,70 μm. pour des cellules subarrondies et jusqu’à 8 μm. pour des cellules ovoïdes (moût de bière gélose, 25 jours, température moyenne 10°). Les spores sont de dimensions très variables suivant leur nombre dans l’asque (1 à 4) : isolées, elles peuvent avoir 2,5 x 3,75 et couplées, de 1,56 x 2,5
avoir 2,5 x 3,75 et couplées, de 1,56 x 2,5 à 1,87 x 2,74 ; 2 spores, même couplées, peuvent être inégales ; lorsqu’elles sont par 3 ou 4, leurs dimensions peuvent être encore moindres. Fig. 4. — Culture sur carotte de un mois. Formation de becs de conjugaison, dégénérant souvent en petits filaments mamelonnés. Les asques sont rares dans cette culture. Notons que ces dimensions sont, en général, sensiblement plus fortes que celles données par Roncor pour Z. Cavarae. Vacuoles, Granulations. L’observation vitale permet de reconnaître aisément une ou deux grandes vacuoles dans les cellules végétatives (fig. 4, 6,
deux grandes vacuoles dans les cellules végétatives (fig. 4, 6, 9). On aperçoit, dans les mêmes conditions, des granulations plus ou moins nombreuses dans le cytoplasme ou dans la vacuole (fig 4, 6, 9). Ces granulations peuvent exceptionnellement apparaître très finement pulvérisées et animées de mouvements browniens (fig. G). Notons que beaucoup de granulations décrites dans les préparations fixées sont post mortem. Le cas est bien connu des corpuscules métachromatiques, rarement préformés, mais résultant généralement de la précipitation de la métachromatine dissoute dans le suc vacuolaire ; mais il peut se produire un phénomène similaire pour des granulations intracytosoliques. C'est
se produire un phénomène similaire pour des granulations intracytosoliques. C'est ainsi qu’une préparation étant colorée vitalement par le rouge neutre, on peut apercevoir quelques rares granulations colorées dans la vacuole, mais, si l'on chauffe la préparation suffisamment et qu’on l’observe ensuite, on peut trouver dans le cytoplasme même des granules nombreux colorés en rouge, qui n’y étaient pas lors de l’observation vitale. La fixation par le chauffage a dû entraîner une ségégation d’éléments et la formation de granules qui n’existaient pas dans le colloïde cytoplasmique optiquement vide lors de l’observation vitale. Ces éléments s'égrègent immédiatement pour former les granules que
vitale. Ces éléments s'égrègent immédiatement pour former les granules que décèle le rouge neutre. Fig. 5. — Culture sur moût de bière gélosé. Observation vitale. Conjugaison et spores. Isogamie et hétérogamie. Les asques renferment peu de spores (1 ou 2). Dans des cultures placées plusieurs jours à une température oscillant entre 5° et -7° les cellules apparaissent très riches en granulations volumineuses ; elles ne sont pas de la nature de la métachromatine. Fig. G. — Culture sur moût de bière gélosé. Observation vitale. Dans la grosse cellule bourgeonnante se voient des granulations cytoplasmiques, noires ou hyalines suivant la mise
voient des granulations cytoplasmiques, noires ou hyalines suivant la mise au point. Dans la vacuole, sont de fines granulations subissant le mouvement brownien. Dans d’autres cellules s’observent des granulations assez volumineuses et réfringentes. Deux cellules conjuguées ont sporulé. Le Noyau. Nous avons employé, pour le mettre en évidence, la fixation au picroformol, celle au bichromate formol (beaucoup moins indiquée dans ce but, comme on sait) et la coloration à l’hématoxyline ferrique (fig. 8 : A, B et C et D). Le noyau est ainsi mis en évidence, non sans difficulté, car il n’apparaît pas toujours nettement. Il se montre sous
car il n’apparaît pas toujours nettement. Il se montre sous forme d’un corpuscule sphérique entièrement noir, se divisant par étranglement pour passer dans le bourgeon (G). Au moment de la conjugaison, on constate l'accumulation d’une substance sidérophile diffuse vers le canal, le remplissant généralement (A et D) ; à un stade plus avancé, on voit dans ce canal une sorte de filament réunissant les deux cellules, c’est la phase précédant la fusion complète des deux noyaux en une nouvelle masse sphérique. Les spores apparaissent entièrement noires (lait correspondant sans doute à une régression insuffisante à l’alun ferrique). Chondriome. Nous avons
à une régression insuffisante à l’alun ferrique). Chondriome. Nous avons mis en œuvre la méthode préconisée par Guillermond pour déceler le chondriome des levures et qui lui a donné de si beaux résultats, notamment pour le Sporobolomyces : Fig. 8. — A. Fixation par la méthode de Regaud (bichromate formol), coloration par la méthode de Heidenhain (hématoxyline ferrique) ; B. Fixation par la méthode de Regaud (bichromate formol), coloration par la méthode de Heidenhain (hématoxyline ferrique) ; C. Fixation au picroformol, coloration à l’hématoxyline ferrique ; D. Fixation au picroformol, coloration à l’hématoxyline ferrique ; E. Fixation au formol, coloration
coloration à l’hématoxyline ferrique ; E. Fixation au formol, coloration par l’hématoxyline ferrique (méthode de Guillermond, pour déceler le chondriome chez les Levures). On aperçoit des stries très fines, des granulations punctiformes ; ces granulations apparaissent parfois sur le trajet des filaments striés (chondriome ?) fixation au formol, coloration par l’hématoxyline ferrique. Nous avons obtenu dans les cellules des stries très fines avec des granulations ponctiformes apparaissant parfois sur le trajet de ces filaments. Il se peut que ces aspects répondent au chondriome, mais nous n'oserions affirmer qu'il ne s’agit pas d'arte fact (lig, 8 t .E), Sexualité, Conjugaisons et
pas d'arte fact (lig, 8 t .E), Sexualité, Conjugaisons et Sporulation. Le fait le plus intéressant et le plus caractéristique de cette levure est l’extrême abondance des conjugaisons qu’elle présente, conjugaisons qui répondent indifféremment à l'iso et à l’hétérogamie, car on les trouve toujours côte à côte. Il y a là un fait qui Fig. 9. — Culture jeune sur moût de bière (2 jours). Etude du bourgeonnement ; il est souvent latéral. Les vacuoles sont bien visibles. Il n’y a encore ni conjugaisons, ni spores (Observation vitale). différencie notre levure du Zygosaccharomyces Gamme de Rodio, qui déclare la conjugaison
levure du Zygosaccharomyces Gamme de Rodio, qui déclare la conjugaison rare et la sporulation difficile et qui ne fait mention que de l’isogamie. Il est vrai que l'on peut reconnaître aisément sur sa figure G l’hétérogamie accompagnant plu. io _ Culture, 11 jours, sur moût de bière gelosé. Iso, hétérogamie avec sporulation. Cette culture sur milieu très récemment fait et, par suite, plus riche en eau que les milieux plus anciennement préparés, était de surface remarquablement lisse, tandis que sur les derniers milieux, l’aspect est souvent très méandriforme. l'isogamie. Quoi qu’il en soit, c’est précisément sur la coexistence des deux
qu’il en soit, c’est précisément sur la coexistence des deux modes de copulation qu’il y a lieu d’insister, puisque ce Fig. 11 — Sur jus de tomates, 14 jours. Beau développement, mais surtout à l’état de dépôt. Anneau discontinu, blanc Tandis que dans le dépôt ne se trouvent que des cellules végétatives, toutes les cellules de l’anneau sont en conjugaison iso et hétérogame avec sporulation. Ce sont ces éléments que représente la figure. Fig. 12. — Culture sur jus de tomates (mûres), culture d’un mois. En t), sont représentées les cellules du dépôt. En A, cellules de l’anneau. Noter la
cellules du dépôt. En A, cellules de l’anneau. Noter la forme allongée, étroite des cellules avec ramification latérale près de l’extrémité, engendrant des rameaux à angles assez aigus. Il y a, par rapport aux cellules du dépôt, un polymorphisme très marqué. J. BEAUVERIE. fait de transition entre l’iso et l’hétérogamie, rarement signalé, présente un intérêt biologique tout spécial. Ajoutons que Rodio indique dans la légende d'une figure représentant des cas d'hétérogamie où les spores ne se sont formées que dans une des deux cellules conjuguées, que l’autre renferme un corpuscule d'épiplasma résiduelle ; il ne peut s’agir là, en réalité,
d'épiplasma résiduelle ; il ne peut s’agir là, en réalité, que d’une gouttelette huileuse ou même d’une spore mal formée et de chromophilie atténuée. Les cellules qui vont se conjuguer sont égales ou inégales ; elles émettent l’une vers l’autre un petit prolongement en forme de bec, ces becs s’affrontent, se soudent, la communication s’établit. En même temps, le cytoplasma et la substance nucléaire se portent vers le canal (fig. 8 : A et D), la fusion des Fig. 13. — Culture sur milieu de Gorodkowa en tube Incliné. Colonie blanche au sommet du biseau et, par conséquent, dans une
blanche au sommet du biseau et, par conséquent, dans une portion plus desséchée. On observe l'iso et l'hétérogamie, des pousses de conjugaison plus courts ou longs. Les spores sont en nombre variable et de taille inégale, il existe des cellules végétatives d’aspect un peu tuméfié, avec des protubérances de contour irrégulier, dilatées ou fines (en a) ; en b et au-dessus, plusieurs cellules sont conjuguées. La sporulation s’est faite abondamment. Culture de 23 jours, à 20°. Observation vitale. noyaux s’accomplit dans celui-ci. A cette fusion succède la sporulation. Les spores apparaissent soit dans les deux cellules réunies par le pont
apparaissent soit dans les deux cellules réunies par le pont de communication, soit dans une seule. Le premier cas est surtout celui de l’isogamie, mais encore les spores peuvent elles être de chaque côté en nombre ou en dimensions inégales. SUR UN ZYGOSACCHAROMYCES. 165 Dans l’hétérogamie très marquée, la plus petite des deux cellules reste le plus souvent stérile et fixée à l’asque par le canal, comme une petite masse adventive. Il faut noter d’ailleurs la grande irrégularité morphologique du phénomène chez cette levure : iso et hétérogamie associées, variation de la longueur et de la forme du canal, variation
de la longueur et de la forme du canal, variation du nombre des spores (1 à 4) et de leur taille. L'examen de nos figures permettra de s’en rendre facilement compte. La forme la plus typique du canal de copulation est en accent circonflexe et très étroit, mais il peut être également droit, plus ou moins large et relativement long. Exceptionnellement, nous avons vu accouplées plus de deux cellules (par exemple fig. 13). Des cultures sur moût de bière, déjà bien développées, ont été soumises pendant 12 jours, au mois de janvier, à la température extérieure oscillant entre 5° et
de janvier, à la température extérieure oscillant entre 5° et −7° C. Dans ces conditions, on Fig. 14. — Culture sur milieu de Gorodkowa, à 20% 23 jours. Même culture que celle figurée en 13, mais prélever opéré sur la partie de la gélose mouillée par l’eau de condensation ; le développement est plus récent, la culture est diffuse et comme « mouillée » ; presque pas de sporulation, mais des cellules à l’état végétatif et, sans doute, des spores germant, qui proviennent des colonies consistantes. Comparer avec la fig. 13, on voit de notables différences, a) semble répondre à
13, on voit de notables différences, a) semble répondre à des spores germant ; b) appendices en cornes de limace ; c et g) triades de spores germant ; d) noter la longueur du canal de conjugaison ; e) semblent être des germinations anormales de spores ; f) formes multicellulaires avec tendance à l’allongement de certaines cellules (comme en 11) ; j) vacuoles et granules intra-vacuolaires ou cytoplasmiques. Observation vitale. 16G J. BEAUVERIE. constate que les conjugaisons qui se effectuaient au moment du passage de température d’une vingtaine de degrés à ces températures flegmates, ne se sont pas achevées ;
à ces températures flegmates, ne se sont pas achevées ; on observe des ligures de conjugaisons achevées, mais sans spores formées. On constate, par ailleurs, que des cultures venant d’être ensemencées et soumises à ces conditions, ne donnent lieu à aucun développement. Les spores ne présentent pas l'acidorésistance (méthode de Ziehl-Neelsen) que nous avons vu caractériser certaines espèces de Saccharomyces (1). Nous avons indiqué plus haut les dimensions des ascospores. Ces spores germent en prenant, par hydratation, les caractères de cellules végétatives et se mettent à bourgeonner. Identification générique et spécifique. Il est facile de reconnaître dans cette levure tous
spécifique. Il est facile de reconnaître dans cette levure tous les caractères du genre Zygosaccharomyces de Barrer que Guilliermond (2) définit ainsi : « Levures de formes variables dont l'asque résulte d’une copulation isogamique ou hétérogamique ou intermédiaire entre l’isogamie et l’hétérogamie. Asques ayant de 1 à 4 ascospores, généralement rondes, à parois non pourvues d’aspérités... » Le genre Zygosaccharomyces fait lui-même partie du 2e groupe de la classification de Hansen. On connaît un assez grand nombre d’espèces appartenant à ce genre, nous les citerons d’après Guillermond. Guilliermond, le premier, a décrit un cas de conjugaison hétérogamique (3) (1911) chez
a décrit un cas de conjugaison hétérogamique (3) (1911) chez une levure constituant une espèce nouvelle rapportée par la mission A. Chevalier de l’Afrique occidentale ; il l’a appelée ultérieurement Zygosaccharomyces Chevalieri (4914) (4). Ces levures ont été isolées des fermentations pour boissons alcooliques fabriquées par les indigènes de ces contrées. D’autres ont été isolées ensuite : Z. acidisoni (1918) (b). Z. Pas (1920) Beauverie. — Quelques propriétés des ascospores de levures ; technique pour leur différenciation. C. R. de la Soc. de Biologie, 1917, t. 80, p. 5. (2) Guilliermond. -Clé dichotomique pour la détermination des levures. Lib. Le
Guilliermond. -Clé dichotomique pour la détermination des levures. Lib. Le François, Paris, 1928. (3) Guilliermond. Sur un exemple de copulation hétérogamique observé chez une levure. C. R. de la Soc. de Biologie, mars 1911. (4) Guilliermond.—Monographie des levures rapportées d’Afrique Occidentale par la mission Chevalier. Annales des Sciences Naturelles, Botanique, série 9, XIX, p. 1-34, pl, I-V, 1914. (5) Guilliermond.— Zygosaccharomyces acidisoni : nouvelle espèce de levure à conjugaison hétérogamique. Bull, de la Société mycologique de France 1918. Observation vitale. Cette hypothèse paraît s'appuyer sur l'observation suivante : nous avons placé des tubes de culture (notamment sur moût de bière
placé des tubes de culture (notamment sur moût de bière gelé, sur Gorodkowa) dans un récipient en bois, placé lui-même sur un radiateur ; pendant le jour, la température s’y maintenait à 40° et montait, à certaines heures, à plus de 50°. Dans ces conditions, la végétation est ralentie, on observe un bourgeonnement anormal, tout au début (fig. 18), mais bientôt les choses rentrent dans l'ordre. Si on observe après 4 jours, on trouve d'abondantes cellules bourgeonnantes normales tandis que les conjugaisons ou sporulations sont rarissimes à l’encontre de ce que nous observerions pour des cultures maintenues à une vingtaine
que nous observerions pour des cultures maintenues à une vingtaine de degrés. On semble autorisé à conclure que, dans les pays d'origine, la chaleur plus considérable restreint la sporulation et cette influence se manifesterait encore pour la région de Naples, tandis qu’aux températures plus basses de la région où nous travaillons, les copulations et sporulations deviendraient permanentes. Peut-être aussi avons-nous entre les mains une race particulière dont la facilité de sporulation serait un caractère ? Fig. 18. — Sur moût de bière gelé à 45° le jour et 15° à 20° la nuit. Culture de 48 heures. Les cellules sporulées
20° la nuit. Culture de 48 heures. Les cellules sporulées proviennent du matériel d’ensemencement ; les autres représentent la végétation nouvelle ; les cellules à l’état végétatif ; elles sont remarquables par le bourgeonnement intensif qu’elles affectent ; une même cellule se couvre de nombreux bourgeons sphériques, tandis qu’elle présente souvent elle-même un aspect déformé et comme flétri avec nombreuses gouttelettes réfringentes qui paraissent de l’huile de dégénérescence ; les cellules semblent subir une végétation hâtive au détriment de leur propre vitalité. Observation vitale. Cette hypothèse paraît s'appuyer sur l'observation suivante : nous avons placé des tubes de culture (notamment
suivante : nous avons placé des tubes de culture (notamment sur moût de bière gelé, sur Gorodkowa) dans un récipient en bois, placé lui-même sur un radiateur ; pendant le jour, la température s’y maintenait à 40° et montait, à certaines heures, à plus de 50°. Dans ces conditions, la végétation est ralentie, on observe un bourgeonnement anormal, tout au début (fig. 18), mais bientôt les choses rentrent dans l'ordre. Si on observe après 4 jours, on trouve d'abondantes cellules bourgeonnantes normales tandis que les conjugaisons ou sporulations sont rarissimes à l’encontre de ce que nous observerions pour des cultures
à l’encontre de ce que nous observerions pour des cultures maintenues à une vingtaine de degrés. On semble autorisé à conclure que, dans les pays d'origine, la chaleur plus considérable restreint la sporulation et cette influence se manifesterait encore pour la région de Naples, tandis qu’aux températures plus basses de la région où nous travaillons, les copulations et sporulations deviendraient permanentes. Peut-être aussi avons-nous entre les mains une race particulière dont la facilité de sporulation serait un caractère ? (1) Guilliermond. —Nouvelle espèce de levure à conjugaison hétérogamique. Bull, de la Soc. mycol. de France, 1920. Cavarae Rodio sont de