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8e ANNEE SEPTEMBRE 1894 N° 9. ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR CONTRIBUTION À L'ÉTUDE DE LA DIPHTÉRIE (SÉRUM-THÉRAPIE) PAR M. E. MEURIS M. L. MARTIN Chef de service à l'Institut Pasteur. Préparateur à l'Institut Pasteur, Interne des Hôpitaux. La sérum-thérapie est restée à l'ordre du jour de la médecine, depuis que MM. Behring et Kitasato ont fait connaître les propriétés du sérum des animaux immunisés contre le tétanos et la diphtérie. Comment, en effet, ne pas donner toute son attention à ces « antitoxines », qui se présentent comme les remèdes scientifiques et spécifiques de deux maladies des plus graves, si
scientifiques et spécifiques de deux maladies des plus graves, si mal combattues, jusqu'ici, par les moyens empiriques ? L'antitoxine tétanique a été étudiée la première, parce qu'elle est plus facile à obtenir, et que son action préventive se manifeste avec une merveilleuse puissance. Dans la pratique elle n'a pas justifié toutes les espérances, et tout le monde, croyons-nous, convient aujourd'hui que si elle est toujours utile dans le tétanos, elle n'est pas un remède certain. Cela tient, sans doute, à ce que nous ne reconnaissons le tétanos qu'au moment où apparaissent les contractures, c'est-à-dire quand l'empoisonnement est fait. Lorsque le
apparaissent les contractures, c'est-à-dire quand l'empoisonnement est fait. Lorsque le traitement est entrepris, la maladie est entrée déjà dans sa phase dernière, il ne faut pas s'étonner que l'antitoxine soit si souvent inefficace. Heureusement, il n'en est pas de même pour la diphtérie. Celle-ci est également une maladie toxique, mais l'empoisonnement suit l'angine ou la laryngite, et nous sommes avertis, par la présence des fausses membranes dans la gorge ou le larynx, avant que la toxine ait fait son œuvre. Si, au lieu de siéger sur des parties du corps facilement accessibles à l'examen, et de provoquer, dès le début,
facilement accessibles à l'examen, et de provoquer, dès le début, des symptômes difficiles à méconnaître, les fausses membranes diphtériques se développaient dans l'estomac ou l'intestin, par exemple, le mal se manifesterait à nous par les signes de l'empoisonnement diphtérique, à savoir : la pâleur de la face, l'albuminurie, les troubles respiratoires et cardiaques. Il serait trop tard alors pour intervenir, et l'antitoxine diphtérique ne serait pas un remède plus sûr que l'antitoxine tétanique. C'est à cette circonstance que la diphtérie est d'abord une affection localisée, naissant pour ainsi dire sous nos yeux, que nous devons d'être mieux armés contre elle.
nos yeux, que nous devons d'être mieux armés contre elle. Dans une série de publications, M. Behring, soit seul, soit avec l'aide de MM. Wernicke, Boer, Kossel et Knorr, a expliqué comment il immunisait les animaux, comment leur sérum agissait sur la toxine et se montrait préventif et thérapeutique sur les cobayes et les lapins intoxiqués avec le poison diphtérique ou inoculés avec le bacille vivant. Ensuite, MM. Behring et Ehrlich, avec le concours de MM. Boer, Kossel et Wassermann, ont donné les premiers résultats de la sérum-thérapie chez les enfants atteints de diphtérie. Nous aussi, depuis l'année 1891, nous
enfants atteints de diphtérie. Nous aussi, depuis l'année 1891, nous avons poursuivi des expériences sur le traitement de la diphtérie par le sérum antitoxique, d'abord sur les animaux, puis sur des enfants. Avant de rien publier sur le sujet, nous avons voulu rassembler des faits en assez grand nombre pour bien juger la méthode. Aujourd'hui, nous pouvons déclarer que nos résultats confirment, dans ce qu'ils ont d'essentiel, ceux de M. Behring et de ses collaborateurs. PRÉPARATION DE LA TOXINE DIPHTÉRIQUE Les animaux fournisseurs du sérum antitoxique sont immunisés contre la diphtérie, c'est-à-dire qu'ils sont accoutumés à la toxine diphtérique. La
diphtérie, c'est-à-dire qu'ils sont accoutumés à la toxine diphtérique. La préparation de celle-ci se trouve donc à la base de la sérum-thérapie, et il est d'autant plus nécessaire d'en dire quelques mots, qu'on en consomme beaucoup pour immuniser les grands animaux et maintenir leur sérum à un degré suffisant d'activité. La toxine est produite en cultivant le bacille diphtérique virulent dans du bouillon, au contact de l'air. Dans les conditions habituelles, il faut maintenir les cultures pendant des mois à la température de 37° pour que le poison s'y accumule. Un procédé plus rapide a été recommandé par MM. Roux
Un procédé plus rapide a été recommandé par MM. Roux et Yersin ; il consiste à faire la culture dans un courant d'air humide. On se sert de vases à fond plat, munis d'une tubulure latérale (vases de Fernbach) dans lesquels on met du bouillon alcalin peptonisé à 2 %, de façon que la couche liquide ait une faible épaisseur. Après stérilisation à l'autoclave, on sème du bacille diphtérique récent, très virulent, et on porte à l'étuve à 37°. Lorsque le développement est bien commencé, la tubulure de chaque ballon est reliée par un tube de caoutchouc à un ajutage
est reliée par un tube de caoutchouc à un ajutage d'un tuyau de cuivre qui est lui-même en relation avec une trompe à eau. Au moyen de pinces à vis, placées sur les tubes de caoutchouc, il est facile de régler le courant d'air qui pénètre par le col de chacun des flasks, après avoir barboté dans un flacon laveur. Cet agencement est préférable à celui qui dispose les vases de culture les uns à la suite des autres, et les fait tous traverser par le même courant d'air. Après trois semaines, un mois au plus, la culture est suffisamment
trois semaines, un mois au plus, la culture est suffisamment riche en toxine pour être employée. Sur le fond des vases, on voit un fort dépôt de microbes, et, à la surface, un voile formé de bacilles plus jeunes. À ce moment la réaction est fortement alcaline. Tous les bacilles diphtériques, même lorsqu'ils paraissent également virulents pour les cobayes, ne donnent pas les mêmes quantités de toxine dans les cultures. L'essai de bacilles de diverses provenances fera reconnaître ceux qui fabriquent la toxine la plus active. Nous n'étonnerons aucun bactériologiste en disant que la force de la toxine n'est pas
en disant que la force de la toxine n'est pas toujours la même dans des cultures faites, en apparence, dans des conditions identiques. Aussi est-il préférable de faire une provision de toxine qui servira pendant toute une série d'expériences, afin que celles-ci soient bien comparables entre elles. Les cultures achevées sont filtrées sur une bougie Chamberland, et le liquide clair est gardé dans des vases bien remplis, bouchés et tenus à l'abri de la lumière, à la température ordinaire. Ainsi préparée, la toxine tue d'ordinaire un cobaye de 500 grammes en 48 heures à la dose de l/10e de c.
en 48 heures à la dose de l/10e de c. c. Elle perd son activité à la longue, mais lentement si on la maintient dans les conditions que nous venons de dire. IMMUNISATION DES ANIMAUX Carl Frauckel, le premier, a immunisé des cobayes contre la diphtérie en leur injectant, avec ménagement, de la toxine modifiée par le chauffage à 70°. Puis, M. Behring a recommandé les mélanges de toxine et de trichlorure d'iode. Il préfère aujourd'hui injecter de très petites doses de toxine pure, à des intervalles suffisants pour que les animaux restent bien portants. MM. Brieger et Wassermann arrivent
les animaux restent bien portants. MM. Brieger et Wassermann arrivent au même résultat en injectant une culture du bacille diphtérique dans le bouillon de thymus, après l'avoir chauffée à 63°, 70°, pendant un quart d'heure. Tous ces procédés réussissent; mais il faut bien savoir qu'immuniser solidement de petits animaux, tels que lapins et cobayes, est toujours une opération longue et délicate. La méthode à laquelle nous donnons la préférence est celle des toxines iodées qui a été mise en usage par MM. Roux et Vaillard dans leurs recherches sur le tétanos. La toxine diphtérique additionnée d'iode est beaucoup moins dangereuse
tétanos. La toxine diphtérique additionnée d'iode est beaucoup moins dangereuse que la toxine pure. On ajoute à la toxine 1/3 de son volume de liqueur de Gram, au moment même de l'employer, et après quelques instants, on injecte le mélange sous la peau. Un lapin de moyenne taille supporte d'emblée 1/2 c. c. de ce liquide; au bout de quelques jours, on renouvelle l'injection, et on continue ainsi pendant quelques semaines: alors on peut augmenter les doses de toxine iodée, ou diminuer la proportion d'iode. Plus tard on donnera de la toxine pure. Il faut peser fréquemment les animaux et
la toxine pure. Il faut peser fréquemment les animaux et interrompre les injections quand ils diminuent de poids, sans quoi on les amènerait à un état de cachexie qui se terminerait par la mort. Dans ces expériences, aller lentement c'est gagner du temps. Les chiens immunisés contre la diphtérie ont fourni à plusieurs expérimentateurs, tels que MM. Bardach et Aronson, un sérum très actif. Les moutons, et surtout les chèvres, sont très sensibles à l'action du poison diphtérique. M. Behring, qui a immunisé, le premier, un certain nombre de ces animaux; insiste sur ce point, et nous avons pu constater,
animaux; insiste sur ce point, et nous avons pu constater, dans des expériences entreprises avec M. Nocard, combien il a raison. Les chèvres qui reçoivent de la toxine diphtérique tombent, quelquefois, même longtemps après le début de l'expérience, dans un état d'amaigrissement et de faiblesse extrêmes. Cependant, le sérum de ces animaux cachectiques manifeste des propriétés préventives quand on l'injecte aux cobayes. L'immunisation des femelles qui donnent beaucoup de lait, comme les chèvres et les vaches, présente un intérêt tout particulier, parce que l'antitoxine passe dans le lait, ainsi que M. Ehrlich nous l'a appris. Une vache en lactation, et
M. Ehrlich nous l'a appris. Une vache en lactation, et bien immunisée, est une source d'antitoxine. Le lait qu'elle donne est, sans doute, bien moins actif que son sérum, mais il est possible de condenser, sous un petit volume, l'antitoxine qu'il contient; il constitue donc une bonne matière première pour la préparation de l'antitoxine. Avec le concours de M. Nocard, nous avons immunisé des vaches et nous avons appris, à nos dépens, combien elles sont sensibles au poison diphtérique. Une d'entre elles a succombé, en cours d'immunisation, à la suite de l'injection de 5 c. c. de toxine. Outre des
de l'injection de 5 c. c. de toxine. Outre des lésions locales étendues, on a trouvé, à l'autopsie, une néphrite parenchymateuse des plus prononcées. Il convient donc de procéder chez les vaches et les chèvres avec beaucoup de ménagements, de ne donner que de faibles doses de toxine iodée au début, et de n'injecter de la toxine pure qu'après avoir constaté que le sang possède un certain degré de pouvoir antitoxique. Il est prudent aussi de commencer l'immunisation assez longtemps avant la partition, car, au moment de la mise-bas, la sensibilité au poison est encore augmentée. De tous les animaux
sensibilité au poison est encore augmentée. De tous les animaux capables de fournir de grandes quantités de sérum antidiphtérique, le cheval est le plus facile à immuniser. Il supporte la toxine beaucoup mieux que toutes les espèces dont nous venons de parler. Il n'est pas rare de rencontrer des chevaux chez lesquels 2 à 5 cc de toxine forte, injectée d'emblée, sous la peau, ne provoquent qu'une fièvre passagère et un oedème local promptement dissipé. Si on admet, avec M. Behring, qu'un animal fournit un sérum d'autant plus antitoxique que sa sensibilité à la toxine est plus grande, le choix
sa sensibilité à la toxine est plus grande, le choix du cheval peut sembler mauvais. Cependant, dès l'année 1892, avec M. Nocard, nous avons entrepris d'immuniser des chevaux contre la diphtérie, parce que les expériences de MM. Roux et Vaillard, sur le tétanos, avaient montré que le sérum de cheval, même à doses considérables, est inoffensif pour les animaux de laboratoire et aussi pour l'homme. Injecté sous la peau, il est résorbé en quelques instants, sans amener de réaction locale. De plus, rien n'est aussi facile que de tirer de la jugulaire d'un cheval, aussi souvent que l'on veut, et
la jugulaire d'un cheval, aussi souvent que l'on veut, et avec pureté, de grandes quantités de sang d'où se sépare un sérum d'une limpidité parfaite. Nous avons des chevaux dans la jugulaire desquels on a puisé plus de vingt fois, au moyen d'un trocart de gros calibre, et le vaisseau est resté aussi souple et aussi perméable qu'au premier jour. Le pouvoir immunisant de leur sérum est actuellement voisin de 100.000 : il est facile de l'augmenter encore. Nos chevaux immunisés ne sont pas des animaux de prix; ce sont des chevaux de fiacre encore jeunes (6 à 9 ans)
des chevaux de fiacre encore jeunes (6 à 9 ans) se nourrissant bien, nourrissant moins bien la toxine diphtérique; un ânon de 6 mois, de taille moyenne, auquel on a injecté d'emblée 1 cc de toxine très forte, a eu, pendant quelques heures seulement, une élévation de température jusqu'à 40°, avec un oedème assez étendu. Le lendemain, la température était normale, l'appétit revenu, et le troisième jour, l'oedème disparaissait. Mais il a succombé à l'injection d'une nouvelle dose de 1 cc faite huit jours après la première. SÉRUM-THERAPIE DE LA DIPHTÉRIE. lissant bien, n'ayant aucune lésion des organes internes, surtout
DIPHTÉRIE. lissant bien, n'ayant aucune lésion des organes internes, surtout des reins, mais rendus impropres à un service actif par des tares aux membres. Avant toute chose, on s'est assuré qu'ils ne réagissent pas à la malvaude, et que, par conséquent, ils ne sont pas mors-aveugles. On trouvera, dans l'Appendice qui suit ce Mémoire, des détails sur l'immunisation de quelques-uns de ces animaux. Nous nous contenterons de donner ici un exemple de la rapidité avec laquelle on peut immuniser certains chevaux, et rendre leur sérum assez antitoxique pour le traitement des enfants diphtériques. EXP. — Cheval de 7 ans, du
des enfants diphtériques. EXP. — Cheval de 7 ans, du poids de 400 kilogrammes environ. La toxine employée est très active : elle tue un cobaye de 500 grammes en 48 heures, à la dose de 1/10 de cc. Elle est injectée sous la peau de l'encolure ou en arrière de l'épaule. 1er jour de l'expérience. Injection de 1/4 cc de Toxine iodée au 1/10. Pas de réaction ni locale ni générale. 2e — 1/2 cc de Toxine iodée, au 1/10. 4e, 6e, 8e jour — — 13e, 14e — 1 cc de Toxine pure, léger oedème, sans fièvre. 17e
1 cc de Toxine pure, léger oedème, sans fièvre. 17e jour — 1/2 cc de Toxine pure, léger oedème, sans fièvre. 22e — 1 cc de Toxine pure, léger oedème. 23e — 2 cc de Toxine pure, léger oedème. 25e — 3 cc de Toxine pure, 28e — 5 cc de Toxine pure, 30e, 32e, 36e jour — 5 cc de Toxine pure, 39e, 41e jour — 10 cc de Toxine pure, 43e, 46e, 48e, 50e jour — 30 cc de Toxine pure, Oedème assez prononcé dissipé en 24 heures. 53e jour — 60 cc de Toxine pure — 57e,
53e jour — 60 cc de Toxine pure — 57e, 63e, 65e, 67e jour — 60 cc de Toxine pure — 72e jour — 90 cc de Toxine pure — 80e — 250 cc de Toxine pure — En 2 mois et 20 jours, ce cheval a donc reçu plus de 800 cc de toxine, sans avoir présenté autre chose qu'un oedème local passager et une augmentation de température de 1° environ, le soir des jours où l'injection a été copieuse. N'est-ce pas là un remarquable exemple de la tolérance des chevaux vis-à-vis du poison diphtérique? Ils se comportent comme
des chevaux vis-à-vis du poison diphtérique? Ils se comportent comme les poules auxquelles on injecte de la toxine tétanique; celles-ci ne sont pas sensiblement affectées, même par des doses considérables, et, cependant, au bout de quelques jours, leur sang est antitoxique. Le jour même où le cheval dont nous parlons a été saigné (87e jour de l'expérience), il a supporté l'introduction dans la jugulaire de 200 cc de toxine diphtérienne sans en être incommodé. Le soir il a eu un peu de fièvre, mais son appétit était conservé. Le sérum recueilli a un pouvoir préventif supérieur à 50,000 ; c'est-à-dire
recueilli a un pouvoir préventif supérieur à 50,000 ; c'est-à-dire qu'un cobaye résiste à l'inoculation de 1/2 cc de culture diphtérienne récente et très virulente, si on lui a injecté, 12 heures avant, une quantité de sérum égale à la cinquantième millième partie de son poids. Un mélange de un dixième de cc de ce sérum et de 1 cc de toxine diphtérienne ne provoque aucun oedème chez les cobayes qui le reçoivent sous la peau. Le cheval est donc l'animal de choix pour la préparation du sérum antidiphtérique. Son indifférence au poison de la diphtérie évite à l'expérimentateur les
indifférence au poison de la diphtérie évite à l'expérimentateur les difficultés qu'il éprouve avec des espèces plus sensibles. Une fois les chevaux amenés à un degré d'immunisation suffisante, par les injections sous-cutanées, vaut-il mieux les entretenir en introduisant fréquemment des doses modérées de toxine dans le tissu cellulaire, ou faire pénétrer de temps en temps dans leurs veines de grandes quantités de toxine? Le second procédé est le plus commode; on injecte la toxine (300 c. c. à 500 c. c.) au moment même où on fait la saignée, et on laisse reposer l'animal pendant une vingtaine de jours, jusqu'à
on laisse reposer l'animal pendant une vingtaine de jours, jusqu'à la saignée suivante, mais il est moins efficace. Dans des essais sur l'immunisation des animaux contre le tétanos, MM. Vaillard et Roux ont reconnu que l'on obtient le sérum tétanique le plus actif, en multipliant les injections de doses relativement petites de toxine. Il en est de même pour la diphtérie; il semble que les cellules doivent être fréquemment excitées pour sécréter sans cesse l'antitoxine. Un cheval, ayant, toute sa vie, procuré une survie de quelques jours, sur les témoins, aux cobayes qui l'ont reçu, et qui ensuite ont été
aux cobayes qui l'ont reçu, et qui ensuite ont été éprouvés par une culture de bacilles diphtériques, ce cheval a supporté d'emblée l'injection sous-cutanée de 5 c. c. de toxine diphtérique, sans aucun mal. Un céjfe qui a duré 12 heures s'est formé au point d'injection, et la température s'est élevée le soir à 40°,5. Dans l'Appendice qui fait suite à ce travail, on trouvera l'observation d'un cheval immunisé (obs. II), chez lequel on a appris que des injections espacées, mais copieuses, de toxine. Son sérum n'est pas plus actif que celui du cheval dont nous venons de parler. Cet
que celui du cheval dont nous venons de parler. Cet animal a toujours manifesté une sensibilité un peu plus grande au poison diphtérique : chez lui les injections souscutanées provoquent un œdème plus étendu, et les injections intraveineuses de 300 c. c. à 500 c. c. de toxine ont quelquefois causé des troubles rapides, mais passagers. Immédiatement après l'opération, il est pris de crampes, il chancelle sur les membres postérieurs; pendant une minute ou deux il faut le soutenir; il sue abondamment, son pouls est petit, puis, en quelques instants, tout rentre dans l'ordre. Le soir, la température est élevée,
tout rentre dans l'ordre. Le soir, la température est élevée, l'appétit très diminué, mais le lendemain le cheval est en parfaite santé. De nos six chevaux, celui-ci est le seul qui ait présenté des symptômes semblables. Tant que la toxine a été mise sous la peau, il n'a pas éprouvé de malaise sérieux; la formation d'un œdème local était la seule chose à noter. Un autre cheval a beaucoup plus réagi sous l'influence du poison diphtérique. On a commencé à lui donner 40 c. c. de toxine chauffée à 65°, en 8 injections, pratiquées dans l'espace de 10 jours. Celles-ci
en 8 injections, pratiquées dans l'espace de 10 jours. Celles-ci n'ont produit aucun effet appréciable; alors, on lui a injecté 1 cc. de toxine pure : l'œdème a été considérable et a fait place à une plaque indurée qui était encore sensible après une semaine. L'état général était altéré; l'animal, abattu, ne mangeait pas, sa température atteignait 40°,5. Sept jours après, nouvelle injection de 1/2 cc. de toxine : mêmes phénomènes locaux et généraux, si bien qu'on renonce à lui donner de la toxine pure, et qu'on lui injecte de la toxine iodée qui ne provoque qu'une tuméfaction locale sans
la toxine iodée qui ne provoque qu'une tuméfaction locale sans symptômes généraux. Ce n'est qu'au bout d'un mois que l'on revient à la toxine pure. Alors la réaction est moins forte, mais l'abattement reparaît si on force les doses. L'histoire de ce cheval est intéressante : ce n'est pas un cheval neuf, mais bien un cheval ayant déjà servi à une autre expérience. Un avant d'être soumis à la toxine diphtérique, il avait été inoculé avec du pneumocoque de Talamoni-Freekeld, très virulent. La première inoculation avait provoqué un œdème énorme, une fièvre très forte, 40°,8, et un abattement marqué pendant
une fièvre très forte, 40°,8, et un abattement marqué pendant une semaine. 20 jours après, nouvelle inoculation de pneumocoque, température de 40°,8, gonflement étendu, malaise prononcé pendant 8 jours. Un mois après, même inoculation, même réaction générale, même œdème terminé par un abcès. Sans entrer ici dans d'autres détails, nous ferons remarquer que la troisième inoculation du pneumocoque donne lieu à des effets aussi intenses que la première. C'est à ces inoculations de pneumocoque que nous avons attribué la sensibilité particulière de ce cheval pour le poison diphtérique. Beaucoup de faits nous confirment dans cette idée. Chaque fois que l'on
faits nous confirment dans cette idée. Chaque fois que l'on injecte de la toxine diphtérique, à un animal qui a déjà subi l'action de quelque poison microbien, alors même qu'il paraît rétabli depuis longtemps, il se montre beaucoup plus sensible que les animaux neufs. Les femelles pleines, ou qui ont mis bas depuis peu, sont aussi bien moins résistantes. Il faut se rappeler ces particularités, et ne pas tenir pour neufs des animaux bien portants en apparence, mais qui ont déjà servi à quelque expérience. Les cellules de l'organisme qui ont été en contact avec des produits microbiens en gardent,
ont été en contact avec des produits microbiens en gardent, en général, longtemps le souvenir. Si quelque expérimentateur rencontre des chevaux très sensibles à la toxine diphtérique, qu'il recherche s'ils n'ont pas eu antérieurement quelque maladie infectieuse! Les chevaux supportent bien, non seulement les injections de toxine, mais aussi les inoculations de bacille diphtérique vivant et très virulent. On trouvera, dans l'Appendice, l'observation détaillée, prise par M. Nocard, d'un cheval qui a reçu depuis l'année 1892 des centaines de cc. de cultures diphtériques récentes. Pendant la première phase de l'expérience, les inoculations ont été faites sous la peau avec des