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parthenogenesis, Xenopus. Voir Version abrégée (p.409) Le centrosome est un organite cytoplasmique associé physiquement au noyau et présent à un seul exemplaire dans la cellule animale interphasique. Classiquement, le centrosome d'une cellule animale est constitué de deux cylindres centriolaires inscrits dans une matrice protéique complexe [1, 2]. Il organise le réseau microtubulaire de la cellule, en interphase et en mitose. Dans les cellules somatiques, le cycle de duplication du centrosome se déroule sur l'ensemble des quatre phases du cycle cellulaire [3]. Le mode de duplication semiconservatif [4] demeure incompris au niveau moléculaire. On distingue quatre événements structuraux distincts dans les
niveau moléculaire. On distingue quatre événements structuraux distincts dans les cellules animales : la dissociation des deux centrioles orthogonaux issus de la mitose en phase G1 précoce, le bourgeonnement orthogonal de deux procentrioles sur les deux centrioles du centrosome en G1/S, leur allongement au cours des phases S et G2, et la séparation des deux centrosomes-fils en fin de phase G2 pour former les pôles de la mitose [3]. Au cours du premier cycle de segmentation, l'oeuf d'amphibien subit une série de remaniements corticaux et cytoplasmiques dans lesquels le réseau microtubulaire est largement impliqué [5, 6]. L'ovocyte mature de xénope
microtubulaire est largement impliqué [5, 6]. L'ovocyte mature de xénope ne possède pas de centrosome fonctionnel et est incapable d'assembler de novo un centrosome. Un centrosome fonctionnel est formé après la fécondation à partir des deux structures centriolaires situées à la base du flagelle du spermatozoïde. Une piqûre de l'ovocyte ou un choc électrique provoque la remise en route du cycle cellulaire [7, 8] et un remaniement du réseau microtubulaire [5] sans aboutir à une cellularisation. Le clivage de l'ovocyte mature nécessite de manière exclusive l'injection soit d'une fraction spermatique contenant les centrioles soit d'un centrosome de cellule somatique. De
contenant les centrioles soit d'un centrosome de cellule somatique. De manière remarquable, ces fractions actives peuvent être d'origine hétérologue [1, 8, 9, 10]. Après l'injection, comme lors de la fécondation, le centrosome doit assembler les microtubules à partir de la tubuline endogène, se dupliquer en phase avec le cycle cellulaire de l'ovocyte, et interagir correctement avec les compartiments nucléaire et cytoplasmique. Dans ces conditions, des blastulas parthénogénétiques et dans quelques cas des stades de développement plus tardifs ont été obtenus [1, 8-12]. Nous montrons ici que le développement parthénogénétique peut franchir la métamorphose et permettre le développement d'une grenouille parthénogénétique.
franchir la métamorphose et permettre le développement d'une grenouille parthénogénétique. Nous montrons par ailleurs que le succès du développement dépend de la simultanéité de l'activation de l'ovocyte, conduisant à la remise en route de l'horloge cytoplasmique qui gouverne le cycle cellulaire, et de l'injection d'un centrosome. Matériel et méthodes Culture cellulaire Les cellules lymphoblastiques humaines d'origine T (lignée KE37) sont cultivées en suspension dans du RPMI (Eurobio) contenant 10 % de sérum de veau foetal à 37 °C, 5 % CO2. Isolement des centrosomes Les centrosomes sont isolés à partir des cellules KE37 asynchrones [1] ou des cellules KE37 synchronisées
des cellules KE37 asynchrones [1] ou des cellules KE37 synchronisées en phase G1 par élutriation (Beckman, rotor JE-5) [11]. Test parthénogénétique Les grenouilles femelles (Xenopus laevis) proviennent du Centre d'élevage de xénopes du CNRS (Montpellier). 100 U.l. PMSG (pregnant mare sérum gonadotropin, Intervet, Angers) sont injectées aux grenouilles 3 à 10 jours avant la ponte pour induire la maturation des ovocytes. La veille, 1 000 U.l. HCG (human sérum gonadotropin, Sigma) sont injectées par femelle. La gangue des ovocytes est éliminée par traitement avec une solution de cystéine 2 % (pH 7,8). Les ovocytes sont ensuite rinçés plusieurs fois dans
(pH 7,8). Les ovocytes sont ensuite rinçés plusieurs fois dans du tampon MMR (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM Hepes, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Essai parthénogénétique Les ovocytes sont disposés dans des boîtes plastiques (Nunc) contenant du MMR. La microinjection est effectuée à 20-22 °C. Les centrosomes sont dilués dans du Pipes 10 mM (pH 7,2 avec KOH) et injectés dans un volume constant de 50 nl par ovocyte suivant des dilutions décroissantes (0,4 ; 1 ; 10 ; 50 centrosomes dans 50 nl). 8-15 ovocytes sont injectés pour chaque dilution.
dans 50 nl). 8-15 ovocytes sont injectés pour chaque dilution. Dans les expériences où le développement a été suivi au-delà du stade blastula, le tampon MMR est remplacé une heure environ après l'injection par du 0,2 MMR puis le lendemain par de l'eau déchlorée. Décalage entre activation et injection Les ovocytes sont placés dans une boîte de plexiglass recouverte d'agarose 1 % [8] et activés par un choc électrique (2", 12 V). Les centrosomes non dupliés, isolés à partir de cellules KE37 synchronisées en G1, sont dilués dans du Pipes 10 mM (pH 7,2 avec KOH) jusqu'à une dilution voisine
10 mM (pH 7,2 avec KOH) jusqu'à une dilution voisine de 1 centrosome dans 50 nl et injectés régulièrement entre le moment de l'activation et le temps du premier clivage (100 min en moyenne). 8-15 ovocytes matures non activés sont injectés à la même dilution (temps 0). Résultats L'injection d'un centrosome hétérologue dans un ovocyte mature de xénope peut conduire au développement d'une grenouille parthénogénétique Lorsque des ovocytes matures de xénope (Fig. la) sont piqués avec une aiguille d'injection, la reprise du cycle cellulaire conduit à des remaniements cytoplasmiques que l'on peut déceler par la redistribution du pigment cortical (Fig.
l'on peut déceler par la redistribution du pigment cortical (Fig. 1b). Cependant, aucun clivage n'est observé. L'injection d'un centrosome permet la cellularisation (Fig. 1 c). Les suspensions de centrosomes sont injectées sous un même volume à des dilutions décroissantes dans les ovocytes matures (voir Matériel et méthodes). Nous avions montré que le meilleur pourcentage de blastulas était obtenu pour une dilution voisine de 1 centrosome injecté par ovocyte [10, 11]. Dans l'ensemble des expériences présentées ici, 62 % des ovocytes injectés avec un centrosome nominal se développent en blastulas (Tableau I). Des scores plus importants sont enregistrés dans des expériences
I). Des scores plus importants sont enregistrés dans des expériences individuelles : ils dépendent principalement de la qualité des pontes des femelles. Beaucoup de ces expériences ont été volontairement interrompues au stade blastula, suffisant pour décider du pouvoir parthénogénétique des centrosomes injectés. Dans six expériences indépendantes, nous avons suivi le développement des blastulas. Les résultats sont rapportés dans le Tableau I, 12% des ovocytes injectés se développent en têtards parthénogénétiques (10/80). Dans un cas, nous avons obtenu une métamorphose (Fig. 1 e-f). Dans d'autres séries d’expériences utilisant des centrosomes d’autres mammifères (rat, bovin), deux embryons parthénogénétiques se sont développés au-delà
mammifères (rat, bovin), deux embryons parthénogénétiques se sont développés au-delà de la métamorphose (résultats non publiés). n = nombre d’expériences indépendantes. La symétrie du premier clivage de segmentation dépend de la simultanéité de l'activation de l'ovocyte et de l’injection d’un centrôsome Le test parthénogénétique possède un avantage expérimental que la fécondation ne peut procurer ; il est possible de décaler l’activation de l’ovocyte et l’injection du centrôsome. Nous avons tiré parti de cet avantage pour savoir si un délai entre l’activation de l’ovocyte et l’injection du centrôsome était compatible avec un développement parthénogénétique. Pour éliminer toute variation due au choix
un développement parthénogénétique. Pour éliminer toute variation due au choix du point d’injection des centrosomes, nous les avons injectés systématiquement dans l’hémisphère animal, sous la tâche de maturation. Des centrosomes ont été isolés à partir des cellules KE37 synchronisées en phase G1 afin d’obtenir une population homogène de centrosomes n’ayant pas, d’après des critères structuraux, amorcé une duplication. Ils ont été injectés à différents temps après l’activation par choc électrique des ovocytes. Un nombre optimal de centrosomes (1 centrôsome nominal par ovocyte) a été injecté dans une dizaine d’ovocytes pour chaque point. Dans les expériences témoins, où l’activation de l’ovocyte
chaque point. Dans les expériences témoins, où l’activation de l’ovocyte est provoquée par l’injection même du centrôsome (t = 0), le premier segmentation intervient en moyenne à 100 min. Lorsque l’injection du centrôsome a lieu pendant la première moitié du premier cycle embryonnaire (activation à t = 0 et injection entre 0 et 50 min), des clivages sont observés. Toutefois, la capacité d’induire un clivage décroît en proportion du temps écoulé après l’activation, et au-delà de 60 min, l’injection de centrosomes n’entraîne aucun clivage (Fig. 2a). D’autre part, les blastulas obtenues dans ces conditions sont majoritairement des blastulas partielles (Fig.
obtenues dans ces conditions sont majoritairement des blastulas partielles (Fig. 2b) : une région de la blastule n’est pas segmentée (Fig. 2c-d). Discussion Nos résultats montrent qu’un développement parthénogénétique provoqué par l’injection d’un centrôsome hétérologue peut conduire à une métamorphose complète. Chez l’amphibien, aucun centriole maternel n’est détectable dans l’ovocyte mature. Les centrioles présents aux pôles du premier fuseau de segmentation proviennent de la duplication des centrioles apportés par le spermatozoïde. Ces derniers subissent une maturation dans le cytoplasme de l’ovocyte [13, 25] et forment un aster de microtubules qui s’étend dans l’ensemble du cytoplasme de l’œuf [6]. Cet aster
s’étend dans l’ensemble du cytoplasme de l’œuf [6]. Cet aster microtubulaire est impliqué dans la migration des pronuclei mâle et femelle au centre de l’œuf [14, 15] et dans la ségrégation de déterminants impliqués dans la mise en place de l’axe dorso-ventral [16]. La simple activation par piqûre d’un ovocyte mature est suffisante pour établir un réseau radial de microtubules centré sur le pronucleus femelle [17]. Un stock maternel de composants centrosomiques redistribués à la surface du pronucleus femelle en l’absence de centrioles pourrait permettre cette organisation [6]. Néanmoins, aucun clivage n’a lieu. L’injection d’un centrôsome, fut-il hétérologue, mime la
clivage n’a lieu. L’injection d’un centrôsome, fut-il hétérologue, mime la fécondation et permet par conséquent la cellularisation nécessaire au développement d’un embryon parthénogénétique qui se poursuit dans quelques cas jusqu’au stade têtard (Tableau II). On s’attendrait, dans les conditions expérimentales du test parthénogénétique, à obtenir des embryons haploïdes. Or, la gastrulation des embryons haploïdes est atypique et conduit à un arrêt du développement [18]. Nous avons analysé la ploïdie de deux têtards et d’une grenouille parthénogénétiques et confirmé que, dans les trois cas, les parthénogénotes étaient diploïdes : la quantité d’ADN par cellule est comparable à celle de cellules de
d’ADN par cellule est comparable à celle de cellules de têtards fécondés (résultats non montrés). Ces développements tardifs sont donc probablement le résultat d’une diploïdisation du zygote, soit par la non expulsion du deuxième globule polaire après l’activation de l’ovocyte, soit par un défaut de segmentation des deux premiers blastomères [19, 20]. Cette deuxième possibilité pourrait être favorisée par la présence de centrioles « célibataires » dans les préparations de centrosomes utilisées [21]. Un ovocyte injecté avec un centriole unique ne pourrait organiser qu’un fuseau monopolaire à l’issue du premier cycle théorique de segmentation (100 min). Un nouveau cycle de
cycle théorique de segmentation (100 min). Un nouveau cycle de duplication centrosomique serait nécessaire pour former un fuseau bipolaire fonctionnel. Deux cycles de duplication de l’ADN maternel se produiraient pendant cette période, rétablissant la diploïdie de l’embryon. Nous avons également montré qu’un décalage temporel entre l’activation de l’ovocyte et l’injection d’un centrôsome conduit à une diminution progressive du nombre de blastules, et que ce décalage entraîne des perturbations importantes dans le mode de segmentation de l’œuf. La position et l’orientation du fuseau mitotique a une influence directe sur la morphogenèse [22, 23]. Dans la plupart des espèces, en particulier chez
[22, 23]. Dans la plupart des espèces, en particulier chez le xénope, la première division de segmentation conduit à la formation de deux cellules filles de taille identique. Cette division symétrique résulte de la formation du premier fuseau mitotique au centre de l’œuf [5]. La migration jusqu’à une position centrale des deux prononcles requiert un réseau microtubulaire intact : une pression hydrostatique élevée appliquée pendant quelques minutes au cours de la migration des prononcles produit une dépolymérisation réversible des microtubules et provoque un clivage excentré au stade deux blastomères. Lorsque cet effet est prononcé et induit la formation de deux
cet effet est prononcé et induit la formation de deux blastomères de taille très différente, des blastules partielles sont observées à l’issue de la segmentation [24]. Nos résultats montrent que l’on obtient aussi des blastules partielles en retardant expérimentalement le moment de la formation de l’aster. Ces deux résultats suggèrent que les modifications cytoplasmiques et corticales de l’œuf qui résultent de son activation peuvent modifier l’organisation spatiale et la migration de l’aster formé à partir du centrôsome injecté. L’aster ne migrerait pas au centre de l’ovocyte, formant ainsi deux blastomères de taille inégale (Fig. 3), eux-mêmes à l’origine d’une succession
de taille inégale (Fig. 3), eux-mêmes à l’origine d’une succession de divisions inégales aboutissant, comme dans les expériences de Briedis et Elinson [24], à la formation d’une région de l’ovocyte non clivée (blastule partielle). Nous avions montré que les centrosomes isolés de cellules humaines en G0, G1 et G2 étaient compétents, indiquant qu’indépendamment de leur état de duplication, ils étaient capables de se coupler à l’oscillateur cytoplasmique du premier cycle embryonnaire de l’ovocyte [11]. Dans les expériences présentées ici, la mise en route de l’horloge cytoplasmique, qui provoque un remaniement de l’organisation cytoplème de l’ovocyte, modifie indû 408 C. R.
de l’organisation cytoplème de l’ovocyte, modifie indû 408 C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, 1994; 317 : 405-410 Production de blastules chez le xénope Figure 3. Schéma hypothétique concernant l’obtention de blastules partielles. A. Lorsque l’injection d’un centrôsome a lieu au moment de l’activation de l’ovocyte, le centrôsome hétérologue forme un aster de microtubules, migre au centre de la cellule et se duplique. La formation du fuseau au centre de l’ovocyte aboutit à la formation de deux blastomères égaux. B. En décalant l’activation et l’injection, le centrôsome forme un aster et se duplique mais ne migre
centrôsome forme un aster et se duplique mais ne migre pas au centre de l’ovocyte. La division asymétrique qui en résulte conduirait à une série de divisions asymétriques et à la formation d’une blastule partielle. directement le pouvoir morphogénétique des centrosomes G1 injectés après l’activation : des clivages ont lieu, mais la majorité des blastules sont partielles. L’ensemble de ces résultats montre que l’oscillateur biochimique de l’ovocyte domine l’ensemble des événements cellulaires précoces. Ce système expérimental souligne l’importance du couplage entre les événements cellulaires précoces au cours du premier cycle de segmentation : comme pour la fécondation, les remaniements cytoplasmiques
de segmentation : comme pour la fécondation, les remaniements cytoplasmiques de l’ovocyte dépendant de l’aster de microtubules sont nécessaires et suffisants pour la mise en place des axes embryonnaires au cours de la première segmentation et la mise en route du programme de développement à la transition blastuléenne. Pour atteindre cette transition, il faut évidemment que les segmentations aient lieu. Celles-ci sont elles aussi sous la dépendance du centrôsome et de son cycle de duplication. L’ensemble de ces expériences souligne le rôle potentiel du centrôsome des cellules animales comme instrument morphogénétique orchestrant la division et la polarité cellulaires. ▼ Remerciements
morphogénétique orchestrant la division et la polarité cellulaires. ▼ Remerciements : nous remercions le Dr. Roger Karess pour la relecture attentive de la version anglaise de ce manuscrit. Ce travail a été réalisé grâce au soutien financier du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) et à une subvention « Biologie du Développement » du Ministère de la Recherche et de l’Espace (MRE). ABRIDGED VERSION The centrosome is a cytoplasmic central body tightly associated with the nucleus, duplicating once during each cell cycle and acting as a nucleating center for the microtubule network in both interphase and mitosis. Centrosome duplication
the microtubule network in both interphase and mitosis. Centrosome duplication encompasses the whole cell cycle [3] through a semi-conservative process [4] but the molecular mechanism is unknown [22]. During the first segmentation cycle of amphibian eggs, modifications of microtubule behavior and consequently cytoplasmic reorganization occur with cell cycle progression [5]. The mature amphibian egg lacks a functional centrosome and no cleavage occurs after activation of the egg by pricking or an electric shock [7, 8]. Normally, a functional centrosome is provided by the sperm at fertilization. However, isolated centrosomes from various species including human promote egg cleavage when injected into
various species including human promote egg cleavage when injected into metaphase-arrested Xenopus eggs [1, 8-10]. This parthenogenetic development sometimes reached tadpole stages [1, 10]. In this paper, we first describe the complete parthenogenetic development of an adult frog following injection of centrosomes isolated from human lymphoid cells into mature eggs. We then show that the capacity to induce cleavage decreased linearly with the time elapsing between egg activation and centrosome injection. A complete parthenogenetic development obtained after injection of heterologous centrosome into mature oocyte. In Xenopus eggs activated by pricking or an electric shock, the cell cycle resumes, leading to
or an electric shock, the cell cycle resumes, leading to a cytoplasmic reorganization as shown by displacement of cortical pigment (Fig. 1 b), yet no cleavage occurs. Injection of centrosomes isolated from human lymphoid cells at the time of pricking leads to blastula formation (Fig. 1 c). For a mean number of 1 centrosome injected per oocyte, 62 % of injected oocytes developed into blastulas (Table I). In 6 experiments, the behavior of such blastulas was followed. 12 % of injected oocytes developed into parthenogenetic tadpoles (Table II). From one tadpole (Fig. 1 d) we obtained a complete metamorphosis to
tadpole (Fig. 1 d) we obtained a complete metamorphosis to adult toad (Fig. 1e, f). For two tadpoles and one frog, the ploidy was comparable to that of fertilized frogs (not shown). Thus a diploidy may occur during the first cell cycle, but no experimental data allow us to conclude if it is a necessary condition for obtaining late stages of parthenogenetic development. The centrosome is required at the time of egg activation to obtain complete blastulas. Centrosomes were isolated from KE37 cells synchronized in G1 phase. A batch of Xenopus eggs was activated by an electric shock and an
Xenopus eggs was activated by an electric shock and an average of 1 centrosome per egg was injected at different times following egg activation. During the first half of the first cell cycle (0-50 min), the capacity to induce cleavage decreased linearly with the time elapsed between egg activation and centrosome injection (Fig. 2a). Moreover, the majority of blastulas obtained in these conditions were incomplete: a more or less large area of the blastula remained uncleaved, interfering with gastrulation and blocking further development. When a centrosome was injected 10 to 25 min after egg activation, less than 30 % of
25 min after egg activation, less than 30 % of cleaving eggs produced total blastulas (Fig. 2b-d). After 25 min, cleaving eggs produced exclusively incomplete blastulas. A possible explanation for the production of incomplete blastulas might be the incorrect migration of the aster formed by the heterologous centrosome, leading to the formation of two unequal blastomeres (Fig. 3). Then, the production of eccentric cleavage furrows would yield the observed partial blastulas (see also [23]). The capacity of centrosomes to induce egg cleavage was shown to be independent of the stage of cell cycle at the time of centrosome isolation [11].
of cell cycle at the time of centrosome isolation [11]. How the nuclear and centrosome cycles are coupled is therefore a key issue [22]. These experiments thus highlight a potential role of the centrosome from animal cells as a morphogenetic determinant orchestrating cell division as well as cell polarity. RÉFÉRENCES 1. Bornens M., Paintrand M., Berges J., Marty M. C, Karsenti E. 1987. Structural and chemical characterization of isolated centrosomes. Cell Motil Cytoskeleton 8: 238-49. 2. Paintrand M., Moudjou M., Delacroix H., Bornens M. 1992. Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations. J. Cell Biol. 108: 107-28.
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