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J. Pharmacol. 67: 111-4. 456 C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, 1994; 317 : 452-6 Ç. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, 1994; 317 : 457-60 Écologie/Ecology Incidence écophysiologique de l'absorption épithéliale d'acides aminés dissous par Crassostrea gigas Ecophysiological relevance of dissolved aminoacid transepidermal uptake in Crassostrea gigas SOLANGE LE GALL, CHRISTIAN BECHENON CNRS/IFREMER, UMR 10, INSU, CREMA, BP 5, 17137 Rochefort, France. Tirés à part : S. Le Gall RÉSUMÉ L'huître filtre d'importants volumes d'eau de mer contenant de la matière organique dissoute. Lors d'un seul passage de l'eau à travers le
dissoute. Lors d'un seul passage de l'eau à travers le filtre branchial, l'huître retient 20 à 50 % de la serine dissoute aux concentrations naturelles du milieu (<5 p.M). L'absorption de serine en fonction de la concentration croissante du milieu obéit à une cinétique hyperbole de type Michaélis-Menten, caractéristique d'un processus saturable médié par un transporteur. La constante de mi-saturation Km, proche de 20 p,M traduit la forte affinité des transporteurs membranaires pour la serine et souligne les potentialités écologiques de l'absorption active d'acides aminés par l'huître aux concentrations des eaux estuariennes de Marennes-Oléron. ▲ Mots clés : absorption, acide
eaux estuariennes de Marennes-Oléron. ▲ Mots clés : absorption, acide aminé, mollusque. ABSTRACT The oyster Crassostrea gigas feeds by filtering of large volumes of seawater containing dissolved organic material. During a single passage of seawater across the gill, oyster is capable of removing 20 to 50 % of the serine dissolved in natural concentrations (<5 pM). The absorption of serine according increasing concentrations of the medium, follows a hyperbol curve, well described by Michaelis Menten kinetics, typical of a carrier-mediated saturable process. Estimation of the half-saturation constant Km to 20 pM, emphasizes the high affinity of the membrane transporters for
pM, emphasizes the high affinity of the membrane transporters for serine and supports the ecological potentiabilities of active amino acid uptake, at concentrations in the same range as in estuarine waters of Marennes-Oléron Bay. ▲ Key words : uptake, aminoacid, mollusc. See Abridged version (p. 460) L'importance du phytoplancton dans la nutrition de l'huître est bien connue. Cependant, au niveau de l'écosystème aquacole de Marennes-Oléron, les microalgues-fourrages ne suffisent pas pour rendre compte de la totalité des apports organiques dans le bilan énergétique de l'huître [11On sait par ailleurs que la production de chair des huîtres y est fortement corrélée
la production de chair des huîtres y est fortement corrélée avec la teneur en acides aminés dissous de l'eau environnante [2]. Du fait de leur comportement filtreur, les mollusques bivalves sont exposés à d'importants volumes d'eau de mer: la matière organique dissoute (MOD) pourrait alors représenter pour eux une source alternative ou complémentaire de nutriment. Cependant, la concentration en acides aminés du milieu intérieur des bivalves, de l'ordre de 0,1 à 0,5 M [3], est très supérieure à celle de l'eau de mer environnante, qui varie entre 0,5 et 20 p,M [4, 5]. L'existence d'un tel gradient (106 environ) devrait
p,M [4, 5]. L'existence d'un tel gradient (106 environ) devrait entraîner une fuite d'acides aminés par diffusion des tissus vers le milieu extérieur. Au contraire, un mécanisme de transport épithélial actif des acides aminés, dirigé contre ce gradient, a été mis en évidence chez la moule [6] et chez l'huître juvénile Ostrea edulis [7] ou adulte Crassostrea gigas [8]. La serine est un des acides aminés majoritaires des eaux côtières, où elle représente environ 20 % de la totalité des acides aminés dissous. Sa concentration varie entre 0,2 et 16 µM dans les claires ostréicoles. Afin d'évaluer l'importance du phénomène
µM dans les claires ostréicoles. Afin d'évaluer l'importance du phénomène de captation de la MOD dans les conditions du bassin de Marennes-Oléron, nous avons contrôlé chez Crassostrea gigas l'existence d'une absorption épithéliale de serine aux concentrations habituelles du milieu. L'analyse de la cinétique d'absorption pour des concentrations expérimentales croissantes d'acide aminé a ensuite permis de préciser la nature du processus membranaire impliqué dans l'absorption. Matériel et méthodes Des huîtres Crassostrea gigas d'un an (environ 5 cm et 1 g de poids sec de chair) sont stockées dans le marais expérimental du CREMA. Après brossage de la coquille, les animaux sont
du CREMA. Après brossage de la coquille, les animaux sont acclimatés 24 h au laboratoire en milieu thermiquement contrôlé, dans un bac de 150 l d'eau de mer décantée et brassée. De manière à minimiser la compétition bactérienne face au processus étudié, chaque huître filtre pendant 2 fois 15 min une eau de mer artificielle stérilisée par double passage sur membrane polycarbonate à 0,22 µm, Nucléopore SN 111 106. L'animal en expérience est placé successivement dans 6 bacs de 400 ml d'eau de mer enrichie en concentrations croissantes de serine (0/1/5/10/50/100 µM). Sans aucun ajout de serine, la mesure de
(0/1/5/10/50/100 µM). Sans aucun ajout de serine, la mesure de la concentration en acides aminés libres constitue le « blanc » expérimental, qui correspond à la concentration en acides aminés dissous présents naturellement dans l'eau de mer oligotrophe qui sert à préparer les solutions. Salinité et température sont ajustées au même niveau que dans le marais et une agitation magnétique douce assure l'homogénéité du milieu. Après entrebâillement des valves et ouverture des siphons inhalant et exhalant, 3 min de filtration suffisent pour purger la chambre branchiale de son contenu initial en eau de mer. La concentration en acides aminés de
en eau de mer. La concentration en acides aminés de l'eau du bac est suivie toutes les 15 min par prélèvement de 3 fois 500 µl de milieu. Parallèlement, des échantillons d'eau de mer filtrée par l'huître sont prélevés directement dans le siphon exhalant à l'aide d'une fine canule coudée, à une vitesse d'aspiration très inférieure à celle du courant exhalant de l'huître. Les échantillons sont ensuite stockés dans des tubes de verre et rapidement congelés à -20 °C. La verrerie a été préalablement calcinée pour éviter toute contamination organique. Le dosage global des acides aminés est réalisé par analyse
Le dosage global des acides aminés est réalisé par analyse en flux continu du complexe fluorescent acide aminé/OPA (o-phthaldialdéhyde) [9, 12]. L'excrétion de matière organique par l'huître (NH4 et urée) est suivie en analyseur à flux continu SKALAR de manière à valider le dosage à l'OPA [12]. Les données sont traitées statistiquement par un programme informatique de régression non linéaire [13]. Résultats Il apparaît en évidence d'une absorption de serine aux concentrations naturelles du milieu Influence de la filtration de l'huître sur la teneur en acides aminés du milieu L'eau de mer artificielle stérile de salinité 34 %0 utilisée pour
de mer artificielle stérile de salinité 34 %0 utilisée pour l'expérience contient des acides aminés naturels dissous à la concentration de 0,63 µM. Lorsqu'une huître filtre pendant 1 h, à 12 °C, cette eau de mer stérile non enrichie, la teneur en acides aminés naturels du milieu diminue progressivement de 0,6 µM à 0,3. Lorsque le milieu est enrichi en serine, à des concentrations faibles comparables à celles qui existent naturellement dans les eaux côtières, la concentration est globalement réduite de moitié après une heure de filtration : 1 µM à 0,3 et 5 µM à 2 (Fig. 1). À
à 0,3 et 5 µM à 2 (Fig. 1). À l'inverse, si l'huître se referme ou lorsqu'on maintient les deux valves de la coquille closes par un lien, la teneur du milieu demeure inchangée. Absorption de la serine par l'huître L'analyse des échantillons d'eau prélevés au niveau des siphons inhalant et exhalant permet de comparer à un même instant la concentration de l'eau avant et après filtration. Lors d'un seul passage à travers la chambre branchiale, 20 à 60 % de la serine dissoute dans l'eau à une concentration de 5 µM est retenue par l'huître (Fig. 1). Ponctuellement, on
5 µM est retenue par l'huître (Fig. 1). Ponctuellement, on peut observer un relargage important, mais temporaire, de matière azotée par le siphon exhalant. Ce pic correspond à une excrétion azotée de l'huître. L'analyse au SKALAR permet de préciser qu'une huître de poids sec 1 g excrète environ 0,3 µM d'urée et 2 µM de NH4 par heure dans une solution à 1 µM de serine, 1 µM d'urée et 3 µM de NH4 dans une solution à 5 µM de serine et 1 µM d'urée et 5 µM de NH4 dans une solution à 10 µM de serine. Dans
NH4 dans une solution à 10 µM de serine. Dans ces conditions, on peut considérer que l'interférence de NH4 dans le dosage des acides aminés est négligeable [12]. Analyse cinétique et performance du mécanisme d'absorption épithéliale de la serine La vitesse de captation de la serine est mesurée pour des concentrations expérimentales croissantes, pour certaines très supérieures à celles du milieu naturel (0,6/1/5/10/50 et 100 µM). Une étude cinétique menée à 12 °C et 34 %0 de salinité, montre que la vitesse de captation de la serine par l'huître demeure d'abord proportionnelle à la concentration du milieu. La courbe s'infléchit
d'abord proportionnelle à la concentration du milieu. La courbe s'infléchit ensuite pour approcher une constante, qui traduit le potentiel maximal de captation de la serine par l'huître (Fig. 2). La constante de Michaelis (Km), évaluée par régression non linéaire [13] est égale à 20 p.M dans les conditions de l'expérience. Discussion Dans une eau de mer stérile, enrichie à l'origine par de la serine à des concentrations naturelles (0,6 à 5 p.M), la filtration par Crassostrea gigas entraîne l'épuisement progressif de l'acide aminé dissous. La comparaison des concentrations au niveau des siphons exhalant et inhalant montre que lors d'un seul
des siphons exhalant et inhalant montre que lors d'un seul passage à travers la chambre branchiale, 20 à 60 % de la serine en solution est retenue (Fig. 1). La vitesse de captation de la serine par l'huître dans des solutions expérimentales de concentrations croissantes, obéit à une cinétique hyperbole de type Michaelis-Menten (Fig. 2), caractéristique d'un processus actif et saturable, médié par un transporteur membranaire. La constante de mi-saturation Km à 20 p.M calculée à 12 °C et pour une salinité de 34 %0 traduit une forte affinité entre la serine et les transporteurs membranaires de l'épithélium palléal de
la serine et les transporteurs membranaires de l'épithélium palléal de l'huître et souligne les performances du mécanisme épithélial de captation. Cette valeur du Km pour la serine, est du même ordre que celles obtenues pour l'alanine (17 p.M) et la glycine (12 p.M) chez les larves d'Ostrea edulis [7] et inférieure au Km de 34 p.M déterminé pour l'alanine chez l'huître en filtration forcée [8]. On peut se demander quelle est la spécificité des récepteurs membranaires qui assurent activement le transport des acides aminés. L'inhibition réciproque partielle de l'absorption d'alanine versus la lysine, l'aspartate et la phénylalanine chez Crassostrea gigas
versus la lysine, l'aspartate et la phénylalanine chez Crassostrea gigas [8] suggère qu'un même transporteur membranaire peut assurer le transit de plusieurs acides aminés. Dans ce cas, l'absorption de la serine seule serait bien représentative de l'absorption d'un mélange naturel d'acides aminés à concentration globale équivalente. On ignore quel est le rôle de cette absorption épithéliale d'acides aminés: contribue-t-elle de manière significative au métabolisme énergétique de l'huître? L'alanine marquée en solution 5 p.M se concentre au niveau des tissus de la branchie et du manteau de Crassostrea gigas [8]. Le fait qu'on ne la retrouve qu'en faible quantité dans l'hémolymphe
fait qu'on ne la retrouve qu'en faible quantité dans l'hémolymphe pourrait signifier qu'elle a été rapidement métabolisée. Les conditions axéniques de l'expérimentation minimisent l'éventualité d'une captation compétitive de l'acide aminé étudié par le bactérioplancton. Une étude en microscopie à balayage a montré l'absence de microflore bactérienne au niveau de l'épithélium palléal de l'huître [14]. Par ailleurs, on sait que les larves de Mytilus edulis sont capables de C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, 1994; 317: 457-60 459 S. Le Gall, C. Bechemin prélever activement la glycine face à une population de bactéries marines [15]. Dans les
face à une population de bactéries marines [15]. Dans les eaux littorales où les concentrations naturelles en acides aminés dissous varient, dans l'espace et le temps, entre 0,5 et 20 p.M [4], la serine qui représente environ 20 % de la totalité des acides aminés dissous [10] évolue donc entre 0,1 et 5 u.M. Dans les claires ostréicoles atlantiques, la concentration en serine varie entre 0,2 et 16 u.M [11]. L'évaluation du Km de la serine aux environs de 20 u.M suggère donc la pertinence d'une captation active d'acides aminés par l'huître aux concentrations existant naturellement dans l'écosystème aquacole de
par l'huître aux concentrations existant naturellement dans l'écosystème aquacole de Marennes-Oléron. T Remerciements : Françoise Mornet, technicienne IFREMER, a participé à ce travail en assurant les dosages de NH4 et d'urée. ABRIDGED VERSION Because of their filter feeding habits, oysters are exposed to large volumes of sea water containing dissolved organic material. Active transepidermal uptake of amino acids, against a 10 concentration gradient has been experimentally demonstrated in mussels and oysters. Our study supports the evidence of such a mechanism for serine uptake in Crassostrea gigas. Each oyster was placed in 400 ml artificial sea water supplemented with increasing concentrations
in 400 ml artificial sea water supplemented with increasing concentrations of serine (0.6 to 100 p.M). Medium was stérile to avoid bacterial competition. Derivatization by OPA (o-phthaldialdehyde) allowed rapid and accurate measurements of global free aminoacids by flow injection analysis. Removal of serine during a single passage of sea water across the gill screen was tested by comparing serine concentrations of samples taken from a canula inserted into the excurrent siphon versus samples at the incurrent margin. About 50 % of the 0.6 or 1 or 5 p.M free amino acid is uptaken from the filtered sea water during the
acid is uptaken from the filtered sea water during the brief transit through the mantle cavity of actively pumping Crassostrea. By using an axenic System, any contribution of prokaryote contaminant to the observed uptake must be negligible compared to that of the eukaryote bivalve under study. Uptake of serine, according to increasing concentrations of the medium (0.6 to 100 p.M) follows a hyperbolic experimental curve, well described by Michaelis-Menten kinetics, typical of a carrier-mediated saturable process. The calculation of the half-saturation constant (Km) provides an estimation of the efficiency of aminoacid uptake in a range of realistic in situ concentrations
aminoacid uptake in a range of realistic in situ concentrations and thus indicates whether the oysters are adapted to local specific concentrations. In Marennes-Oléron Bay, aminoacid concentrations are 0.5 to 20 p.M in near-shore or ponds waters. The estimation of Km for serine to 20 p.M by non linear regression emphasizes the ecological relevance of transepidermal aminoacid uptake by Crassostrea gigas at natural range of concentrations occurring in their estuarine oyster farming ecosystem. A RÉFÉRENCES 1. Heral M. 1985. Evaluation of the carrying capacity of molluscan shellfish ecosystems (éditions IFREMER). Shellfish Cult. Dev. Manag. 287-317. 2. Heral M., Deslouis-Paoli J.
Shellfish Cult. Dev. Manag. 287-317. 2. Heral M., Deslouis-Paoli J. M., Razet D., Prou J. 1984. Essai de mise en évidence in situ de paramètres biotiques et abiotiques de l'eau et de l'interface eau-sédiment intervenant dans la production de l'huître. Océanis 10 (4): 465-75. 3. Zurburg W., De Zwaan A. 1981. The role of aminoacids in aerobiosis and osmoregulation in bivalves. J. Exp. Zool. 215: 315-25. 4. Feuillet-Girard M., Heral M., Sornin J. M., Deslouis-Paoli J. M., Robert J. M., Mornet F., Razet D. 1988. Eléments azotés de la colonne d'eau et de l'interface eau-sédiment du bassin de Marennes-Oléron :
d'eau et de l'interface eau-sédiment du bassin de Marennes-Oléron : influence des cultures d'huîtres. Aquat. Living. Ressour. 1: 251 -65. 5. Poulet S. A., William R., Conway D. V. P., Videau. 1991. Co-occurrence of copepods and dissolved free amino acids in shelf sea waters. Marine Biology 108: 373. 6. Wright S. H., Pajor A. M. 1989. Mechanisms of integumental amino acid transport in marine bivalves. Am. J. Physiol. 257: R 473-83. 7. Rice M. A., Wallis K., Stephens G. C. 1980. Influx and net flux of amino acids into larval and juvenile European flounder, Ostrea edulis (L.). J. Exp. Mar.
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in Drosophila melanogaster Infection by the protobacteria Wolbachia and cytoplasmic incompatibility are widespread in Drosophila melanogaster MICHEL SOLIGNAC (1), DOMINIQUE VAUTRIN (1), FRANÇOIS ROUSSET (2) 1 Laboratoire de Biologie et Génétique évolutives, CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France. 2 Institut des Sciences de l'Évolution, Génétique et Environnement, Case postale 065, 34095 Montpellier Cedex 05, France. Tirés à part : M. Solignac Résumé La plupart des populations de Drosophila melanogaster sont polymorphes pour l'infection par la Protéobactérie Wolbachia pipientis (le taux moyen d'infection étant de 34 %), qui est responsable d'une incompatibilité cytoplasmique partielle (le pourcentage d'œufs non éclos peut atteindre 77
cytoplasmique partielle (le pourcentage d'œufs non éclos peut atteindre 77 %, avec une moyenne de 46,7 %). Des séquences partielles d'ARN ribosomique 16S de la bactérie, établies à partir de mouches provenant de localités éloignées, n'ont pas montré de différences entre elles et se sont avérées identiques à celle de la bactérie qui infecte le type R d'incompatibilité dans l'espèce voisine D. simulans. En relation avec cette observation, les résultats des croisements entre souches infectées s'interprètent par l'existence d'un seul type d'incompatibilité cytoplasmique chez D. melanogaster. En outre, les cytoplasmes infectés se retrouvent dans divers haplotypes mitochondriaux de D. melanogaster
infectés se retrouvent dans divers haplotypes mitochondriaux de D. melanogaster alors que cette lignée bactérienne n'est présente que dans une branche terminale de l'arbre mitochondrial chez D. simulans. Par conséquent, l'infection s'est probablement produite indépendamment dans les deux espèces. Elle n'est survenue qu'une seule fois chez D. melanogaster, tôt dans l'évolution de l'espèce, et le symbionte a été perdu ensuite à plusieurs reprises. Le niveau d'incompatibilité trouvé dans les diverses souches est significativement corrélé au niveau d'infection des mâles (révélé par les colorations de testicules au DAPI) mais, quel que soit le niveau d'infection de la souche, les femelles infectées
soit le niveau d'infection de la souche, les femelles infectées sont compatibles avec les mâles les plus lourdement infectés. Le pourcentage de cytoplasmes infectés ne semble pas avoir changé significativement au cours des dernières décennies et le mécanisme de maintien du polymorphisme d'infection est problématique. Mots clés : Drosophila melanogaster, Wolbachia, incompatibilité cytoplasmique, hérédité maternelle, ADNmt. Abstract Most populations of Drosophila melanogaster over the world are polymorphic for infection by the maternally inherited Proteobacteria Wolbachia pipientis (average rate of infection 34 %) responsible in the host species for partial cytoplasmic incompatibility (the percentage of unhatched eggs varies from negligible up
incompatibility (the percentage of unhatched eggs varies from negligible up to 77 %, with an average of 46,7 %). Partial 16S rDNA sequences of bacteria offlies from four populations were identical and indistinguishable from the D. simulans symbiont type R. In crosses to an infected reference strain, all infected individuals seemed to belong to the same incompatibility type. In addition, in D. melanogaster, cytoplasm infection is irrespective of mtDNA haplotypes, but not in D. simulans where this bacterial lineage is only présent in a terminal branch in the mtDNA haplotype tree. It can be inferred that the cytoplasm of D.
tree. It can be inferred that the cytoplasm of D. melanogaster was infected probably once, independently of D. simulans, early in the evolution of the species, and was subsequently lost several times. The level of incompatibility is related to the level of infection of the sperm cysts observed in young males, but infected females, whatever the strength of incompatibility determined by the males of their strains, are compatible with the most heavily infected males. The percentage of infected cytoplasms has not changed during the last decades and the maintenance of infection polymorphism is problematic. Key words : Drosophila melanogaster, Wolbachia,
infection polymorphism is problematic. Key words : Drosophila melanogaster, Wolbachia, cytoplasmic incompatibility, maternal inheritance, mtDNA. Voir Version abrégée (p.468) The existence of incompatible crosses between strains of the mosquito Culex pipiens was originally reported by Ghelelovitch in 1952 [1]. Although a rickettsia-like micro-organism, Wolbachia pipientis, was described in the cells of C. pipiens a long time ago [2], the relationships between Wolbachia and cytoplasmic incompatibility was established only in 1971 [3]. Cytoplasmic incompatibility, is now known in several orders of insects and in terrestrial isopods. In crosses between infected males and uninfected females, the sperm enters the egg but fails