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la coagulation colloïdale et du grossissement des grains colloïdaux, cause du vieillissement. BOUTARIC et Mme Roy [14] ont observé que l'opacité du sérum croît avec le temps ce qu'ils interprètent comme un grossissement des particules colloïdales au sein de la solution physiologique. Peu d'auteurs ont cherché à résoudre objectivement le délicat problème de savoir si le protéide apparu au cours du vieillissement devait être rapproché par ses caractères chimiques de la sérine ou de la globuline. Malgré les conclusions divergentes des auteurs, on peut penser qu'il y a, dans un premier temps, changement des limites de précipitabilité, peut-être condensation. Cette
premier temps, changement des limites de précipitabilité, peut-être condensation. Cette première phase, purement physique pouvant être suivie d'une deuxième phase, plus lente, de transformation chimique de sérine en globuline. BIBLIOGRAPHIE 1 — SORENSEN (S. P. L.) : C. R. lab. Carlsberg., 1917 à 1930. 2 — PORGES et SPIRO : Die Globuline des Blutserums. Hofmeister's Beiträge, 1903, 3, 276. 3 — HOWE (P. E.) : The use of sodium sulfate as the globulin precipitant in the determination of proteins in blood. J. of biol. chem., 1921, 49, 93. 4 — JAMESON (E.) et ROBERTS (D.) : J. gen. Physiol., 1937,
JAMESON (E.) et ROBERTS (D.) : J. gen. Physiol., 1937, 20, 475. 5 — VLES (F.) : Recherches sur les propriétés physico-chimiques des tissus en relation avec l'état normal ou pathologique de l'organisme, 3me partie : recherches sur le sérum. Arch. Physiol. biol., 1926, 5, 161. 6 — TISELIUS (A.) : Biochem. J., 1937, 31, 1478. 7 — DELAGE (B.) : Recherches sur le sérum sanguin chez la génisse au cours de la maladie vaccinale. Bull. Soc. Chim. biol., 1937, 19, 1407. 8 — FISSINGER (N.), GAJDOS et PANAYOTOPOULOS : Equilibre protéidique du sérum au cours du choc histaminique. C.R.
Equilibre protéidique du sérum au cours du choc histaminique. C.R. Soc. Biol., 1936, 123, 967. 9 — MOLL (L.) : Über künstliche Umwandlung von Albumin in Globulin. Hofm. Beiträge 1904, 4, 563. 10 — ACHARD (Ch.), BARIETY (M.) et CODOUNIS : Equilibre protéique comparé dans le sang de la mère et du cordon ombilical. C. R. Soc. Biol., 1937, 102, 984. 11 — GUTMAN (Mlle C.) et LEVY (Mme G.) : Recherches biochimiques sur le rôle du placenta. Bull. Soc. Chim. biol., 1934, 16, 720. 12 — JONEScu-MIHAIESTI et DAMBOVICEANU : Modifications de certaines constantes du sérum de cheval au
: Modifications de certaines constantes du sérum de cheval au cours de l'immunisation. C. R. Soc. Biol., 1930, 104, 1357. 13 — LUMIÈRE (A) : La vie, la maladie et la mort, phénomènes colloïdaux. Paris, Masson, 1 vol. (1928). 14 — BOUTARIC (A.) et Roy (Mme M.) : Variations de la densité optique et de la viscosité des sérums par dilution dans la solution physiologique. Bull. Soc. Chim. biol., 1937, 19, 44. La mort de l'animal survient lorsque la quantité d'acides gras contenue dans l'unité de poids corporel a atteint une limite fixe, caractéristique de chaque espèce zoologique, et que
une limite fixe, caractéristique de chaque espèce zoologique, et que les biochimistes appellent élément constant. Au point de vue chimique ce sont des graisses, mais au point de vue physiologique l'organisme est incapable de les utiliser comme telles puisqu'à la mort par inanition on les retrouve intégralement. Nous n'exposerons que les grandes lignes de ce problème qui est traité en détails par M. MACHEBŒUF dans son ouvrage « Etat des lipides dans la matière vivante. Les cénapses et leur importance biologique ». 1 vol. Hennann, 1936. Ce problème a été particulièrement étudié par TERROINE [1], [2] et son école [3].
particulièrement étudié par TERROINE [1], [2] et son école [3]. Les travaux des physiologistes établissent donc qu'outre leur rôle de réserve les lipides sont des constituants fondamentaux de la matière vivante. Mais les lipides tissulaires sont dans un état spécial qui les rend inextractibles à leurs solvants habituels, comme le vit HOPPE-SEYLER [4] en 1866. Cet auteur pensa à l'existence de complexes lécithine-albumines et leur donna le nom de lécithalbumines. Il n'apporta pas de preuve directe de cette assertion, mais il montra que l'extraction des lipides exige un épuisement prolongé par l'alcool bouillant. LIEBERMANN [5] (1893) montra que ces faits
par l'alcool bouillant. LIEBERMANN [5] (1893) montra que ces faits ne sont pas isolés et se retrouvent dans toute l'échelle animale et végétale. Citons encore les noms de DORMAYER [6] (1896) et d'ERLANDSEN [7] (1907) ; ce dernier au cours de ses recherches isola du muscle cardiaque une graisse phosphorée, la cuorine. Pour ces savants, l'union entre lipides et protéides était d'ordre chimique. Pour d'autres, parmi lesquels BANG [8] (1909) une théorie physique rendrait compte de l'inextractibilité des lipides tissulaires ; les travaux de BANG étaient limités aux seuls globules rouges ce qui en restreint singulièrement la portée. TRAVAUX D'HISTOLOGIE
rouges ce qui en restreint singulièrement la portée. TRAVAUX D'HISTOLOGIE ET DE CYTOLOGIE L'anatomie microscopique a fourni aussi sa contribution au problème des complexes lipides-protéides. Certains colorants dits « vitaux » (rouge neutre, vert janus, soudan III) employés à une concentration assez faible ont la propriété de colorer les tissus vivants sans les tuer. L'apparition brusque d'une coloration foncée annoncerait la mort, celle-ci ayant pour corollaire la destruction des liens unissant protéides et lipides : ces derniers, mis en liberté, prendraient alors énergiquement le colorant. A. LUMIÈRE [9] explique le fait par sa théorie de l' « immunité du granule
fait par sa théorie de l' « immunité du granule micellaire ». Celui-ci serait protégé par sa charge électrique. La floculation traduirait la mort de la micelle ; la décharge de celle-ci permettrait aux réactions chimiques de s'effectuer. Dans certains tissus, la mise en liberté des graisses (appelée aussi lipophanérose) ne se fait pas aussi facilement. Elle nécessite l'intervention des protéidases : la pepsine et la trypsine sont de véritables révélateurs des graisses. D'où la technique de « démasquage » de CIACCIO [10] (1926). THÉORIE DES « LIPIDES VIVANTS » Pour HANSTEEN CRANNER [11] (1919) les lipides seraient chez les
Pour HANSTEEN CRANNER [11] (1919) les lipides seraient chez les êtres vivants dans un état spécial qui disparaîtrait après la mort. Certains végétaux coupés et immergés dans l'eau y laissent diffuser des lipides solubles et pas de protéides. Il s'agit en réalité de sels d'acides phosphatidiques, les acides eux-mêmes étant solubles dans l'éther. MACHEBŒUF, G. LEVY et M. FAURE [12] (1935) ont par exemple observé que, parmi les lipides du bacille tuberculeux, ceux qui sont doués du pouvoir haptène sont voisins des acides phosphatidiques et tellement hydrophiles que si on agite leur solution éthérée avec l'eau ils quittent l'éther pour
agite leur solution éthérée avec l'eau ils quittent l'éther pour passer dans l'eau. LES « LIPOPROTÉIDES ARTIFICIELS » Les auteurs précédents s'étaient attachés à l'étude analytique des complexes formés de lipides et de protéides. Mettant en œuvre des procédés de synthèse, VON PRZYLECKI et ses collaborateurs [13] essayèrent de combiner ces principes immédiats en des systèmes qu'ils appelèrent symplexes. Dans une première série de recherches (1935-1936) ils étudièrent l'affinité des constituants des protéides, en particulier des amino-acides, pour les holosides ; ils montrèrent que le groupement amidée-CONH ne joue aucun rôle dans la constitution de ces polysaccharo-protéides. Deux aminoacides seulement,
rôle dans la constitution de ces polysaccharo-protéides. Deux aminoacides seulement, l'arginine et la tyrosine, ont de l'affinité pour les holosides. L'arginine, par exemple, s'unit aux pH supérieurs à 7 avec certains composés de nature glucidique tels que l'amylose en donnant des complexes de pouvoir rotatoire inférieur à la somme de ceux des composants. S'attaquant alors aux lipides (1936), les auteurs essayèrent d'obtenir artificiellement des complexes de ces principes immédiats avec les protéides (Künstlische Lipoproteide) et d'étudier leur stabilité, la constance de leur union et leurs propriétés principales. Les résultats obtenus ne sont pas uniformes. Beaucoup de protéides donnent des précipités
ne sont pas uniformes. Beaucoup de protéides donnent des précipités avec la lécithine et surtout l'acide oléique. Avec l'huile d'olive, on obtient des résultats bien inférieurs. La formation du précipité dépend du pH et des proportions pondérales des composants. Une fois formé, on peut le soumettre à des variations d'acidité sans l'altérer. L'alcool n'extrait qu'en partie ses lipides dont la séparation totale exige l'action combinée de l'alcool et de l'éther. Les sels n'ont guère d'influence sur la stabilité de ces lipoprotéides. Ces travaux sont intéressants car ils montrent que l'on peut reproduire par synthèse des systèmes physico-chimiques ayant les propriétés
peut reproduire par synthèse des systèmes physico-chimiques ayant les propriétés essentielles des complexes lipoprotéidiques naturels. LES LIPIDES DU SERUM SANGUIN Il suffit de savoir que l'extrait lipoïdique du sérum sanguin normal chez les mammifères est généralement compris entre 1 gr. 50 et 8 gr. par litre pour comprendre que, comme dans les autres tissus, les lipides y sont dans un état tout à fait particulier. Le sérum, prélevé dans les conditions énoncées, est parfaitement limpide et presque optiquement vide (LECOMTE DU NOUY) [14]. Dans certains cas physiologiques (sérum d'anguille) ou pathologiques (sérum de néphrose lipoïdique) le taux des lipides peut
pathologiques (sérum de néphrose lipoïdique) le taux des lipides peut s'élever au chiffre énorme de 40 gr. par litre sans que le sérum cesse d'être parfaitement clair et homogène. D'ailleurs si les lipides qui sont insolubles dans l'eau se trouvaient à l'état libre dans le sérum, ils formeraient une suspension fortement opalescente, extrêmement riche en particules décelables à l'ultramicroscope. Les solvants des graisses (éther, benzène, chloroforme etc...) n'en arrachent au sérum que des quantités infimes (1 à 5 % en moyenne). MACHEBŒUF et WAHL, (1931) montrent l'extraordinaire résistance des lipides du sérum à l'extraction éthérée. Ainsi au bout de 5
du sérum à l'extraction éthérée. Ainsi au bout de 5 mois d'extractions répétées trois fois par semaine, ils n'avaient libéré que le tiers des lipides totaux ; au bout d'un an, un peu moins de la moitié. Les lipides sont entraînés avec les protéides dans les précipités réversibles que donnent avec le sérum les solutions concentrées de sulfates alcalins et alcalino-terreux. Ainsi, il existe en solution homogène dans le milieu aqueux des lipides cachés à leurs réactifs et des protéides qui réagissent avec les leurs. Tout se passe comme si les protéides du sérum augmentaient la solubilité des lipides dans
les protéides du sérum augmentaient la solubilité des lipides dans la phase aqueuse et les stabilisaient par un processus de « protection colloïdale ». NEUSCHLOSZ parle de solution d'un colloïde dans un autre ; cela ne résout pas le problème. Les travaux sur les relations entre protéides et lipides du sérum sont très nombreux mais souvent confus, cette question n'étant généralement traitée qu'accessoirement au cours de recherches sur le fractionnement des protéides ou le dosage des substances lipoïdiques. PHOSPHORE DES PROTÉIDES ARONHEIM, élève de HOPPE-SEYLER, semble être le premier auteur qui se soit attaché à l'étude du phosphore des protéides.
qui se soit attaché à l'étude du phosphore des protéides. Il montre que la globuline du sérum de cheval contient du phosphore extractible par l'alcool et l'éther. A ce protéide est donc lié un lecithide. Vers le début du siècle, le fractionnement des globulines faisait l'objet de nombreux travaux ; certains savants se demandent si les différentes fractions globuliniques ne peuvent être caractérisées par leur teneur en phosphore. Ces vues théoriques sont le point de départ des recherches de HARDY (1905) et HASLAM (1913) qui montrent que le phosphore caractérise l'euglobuline alors que la pseudoglobuline en est dépourvue. Cette constatation
l'euglobuline alors que la pseudoglobuline en est dépourvue. Cette constatation donne naissance à une théorie d'abord soutenue par HANDOWSKY et WAGNER puis par Mme Harriette CHICK qui essaie d'établir que l'euglobuline est un complexe formé par l'union de la pseudoglobuline avec un phosphoaminolipide. H. CHICK sépare l'euglobuline par le sulfate d'ammonium au tiers de saturation, puis la pseudoglobuline par ce sel à demi-saturation. Par dialyse de la pseudoglobuline il précipite un protéide ayant les caractères de l'euglobuline et contenant toujours de la lécithine. Après avoir séparé l'euglobuline ainsi formée, il reste un protéide qui ne contient plus de phosphore. Si
reste un protéide qui ne contient plus de phosphore. Si on ajoute de la lécithine au milieu, il y a néoformation d'euglobuline jusqu'à ce que toute la lécithine soit utilisée. SÉPARATION QUANTITATIVE DES SUBSTANCES LIPOIDIQUES A côté de ces recherches d'ordre théorique, il faut citer des travaux qui ont pour but le dosage des lipides et des protéides. Les méthodes de séparation précédemment employées étaient défectueuses ; l'extraction des lipides était incomplète. KUMAGAWA et SUTO (1908) instituent leur méthode de dosage des lipides sur un matériel de recherches unique : la poudre de viande desséchée. Elle comporte essentiellement une saponification
la poudre de viande desséchée. Elle comporte essentiellement une saponification aqueuse suivie d'une extraction éthérée. C'est LEATHES (1909) qui conseille l'emploi d'alcool pour permettre la dissolution des savons formés et SHIMIDZU (1910) qui met au point la méthode d'extraction continue par l'alcool bouillant dans l'appareil de KUMAGAWA, technique dont le principe est universellement adopté aujourd'hui. GRIGAUT (1912) indique deux méthodes de dosage du cholestérol. Sa méthode colorimétrique est la plus connue ; elle consiste essentiellement à rendre le cholestérol soluble dans l'éther par l'alcool en milieu alcalin. Le dosage est ensuite effectué en utilisant la réaction colorimétrique de LIEBERMANN. Le
ensuite effectué en utilisant la réaction colorimétrique de LIEBERMANN. Le cholestérol ne se trouvant pas à l'état libre dans le sérum, l'auteur suppose qu'il est engagé avec les protéides dans des complexes qu'il appelle protéocholestérides mais il ne donne aucune preuve directe de leur existence. Ce terme, d'ailleurs, non conforme aux règles actuelles de la nomenclature chimique, ne peut être conservé. EXTRACTION DES LIPIDES DU SÉRUM À BASSE TEMPÉRATURE Pour étudier le rôle des lipides sériques, la méthode la plus rigoureuse consistait à comparer au sérum intact le sérum privé, tout au moins partiellement, de ses lipides. HARDY et GARDINER
tout au moins partiellement, de ses lipides. HARDY et GARDINER montrent que cette opération est réalisable par d'autres procédés que la dénaturation par l'alcool chaud. Cette méthode, employée par les auteurs précédemment cités, modifie complètement les propriétés physiques des complexes lipoprotéidiques. W. B. HARDY et Mme S. GARDINER (1910) ont pu délipider presque totalement le sérum sans dénaturer les protéides. Leur méthode consiste à faire agir l'alcool absolu refroidi à −10° sur le sérum préalablement maintenu dans la glace fondante ; lorsque celui-ci est complètement desséché, on l'épuise par l'éther anhydre à froid dans un appareil de SOXHLET, et on
anhydre à froid dans un appareil de SOXHLET, et on chasse l'éther dans le vide sulfurique. La précipité a gardé ses propriétés caractéristiques : il est soluble dans l'eau ; de sa solution on peut précipiter la globuline par le sulfate d'ammonium à demi-saturation puis l'albumine par acidification. L'intérêt de ces recherches est considérable ; elles ont permis à SÕRENSEN puis à MACHEBŒUF d'étudier comparativement les propriétés des complexes lipoprotéidiques et des protéides délipidés. YOUNG (1922), se basant sur des mesures polarimétriques estime que la serum-albumine est liée peu énergiquement aux esters du cholestérol. Il obtient par délipidation une albumine
aux esters du cholestérol. Il obtient par délipidation une albumine purifiée avec un rendement excellent. ETUDE DES LIAISONS LIPIDES-PROTÉIDES Certains auteurs s'attachèrent à étudier avec quelles fractions protéidiques sont entraînés les lipides au cours des différents procédés de fractionnement physico-chimique. a) Précipitation fractionnée HANDOWSKY, LOHMANN et BOSSE (1925) et BOSSE (1925) étudient les liaisons lipides-protéides dans le sérum de bœuf. Ils précipitent le sérum à chaud en milieu acidulé par l'acide acétique ou bien par le sulfate d'ammonium ; la totalité des phosphatides et 70 à 80 % du cholestérol passent dans le filtrat ; la précipitation de la globuline
passent dans le filtrat ; la précipitation de la globuline seule n'entraîne que 20 à 30 % du cholestérol. Les auteurs concluent que seuls les complexes cholestérol-globuline et cholestérol-phosphatides sont bien caractérisés et que les liaisons des protéides avec les phosphatides sont lâches. Ces recherches faites dans des conditions de température qui altèrent la structure lipoprotéidique ne sont pas bien probantes. Ils extraient ensuite le sérum avec de l'éther mais dans des conditions de température et d'agitation telles qu'on peut se demander ce que devient la structure du système lipoprotéidique dans ces conditions. Les conclusions de ces expériences sont les
dans ces conditions. Les conclusions de ces expériences sont les suivantes : plus il y a d'euglobuline dans un sérum, moins on peut extraire de cholestérol par l'éther, plus il y a d'albumine, plus les complexes lipoprotéidiques sont fragiles. La présence de glucose et de sels minéraux influerait sur le phénomène. TROENSEGAARD et KOUDAHL [32] (1926) préparent les globulines et les albumines par précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium, les coagulent et les déshydratent complètement par l'alcool. L'extraction est faite à l'aide d'éther à froid à partir de ces poudres protéidiques. Les auteurs extraient des albumines une quantité notable de lipides
Les auteurs extraient des albumines une quantité notable de lipides alors que les globulines n'en livrent que des traces. Les globulines contiennent pourtant du cholestérol car leur acétylation donne des carbures d'hydrogène identiques à ceux que donne ce stérol par acétylation. Les auteurs en concluent que le cholestérol est un groupement prosthétique de la globuline. Ces recherches, faites sur des protéides dénaturés et par conséquent dans un état physico-chimique très différent de celui des protéides naturels ne peuvent nous convaincre. Les modifications qui se produisent dans le sérum au cours de processus aussi doux que le vieillissement (*) nous apprennent
de processus aussi doux que le vieillissement (*) nous apprennent qu'il faut être très circonspect en pareille matière. En 1927, GARDNER et GAINSBOROUGH [33] constatent que la précipitation des globulines par le sulfate d'ammonium à demi-saturation entraîne environ 30 % du cholestérol ; mais il reste encore 70 % dans les eaux-mères contenant les albumines, celles-ci sont parfaitement limpides, malgré leur teneur élevée en lipides. b) Fractionnement par électrophorèse FRANKENTHAL [34] (1925) puis WOLFF et FRANKENTHAL [35] (1926) fractionnent le sérum par électrodialyse et admettent aussi que la majeure partie des lipides est liée à la globuline. Dans les sérums
des lipides est liée à la globuline. Dans les sérums qui donnent une réaction de WASSERMANN positive, les lipides accompagneraient la sérine. C'est également au fractionnement électrophorétique du sérum que MELLANDER (1935) fait appel pour essayer de résoudre le problème du mode de liaison des lipides aux protéides [36]. Employant le procédé de THEORELL [37], l'auteur constate que, par cataphorèse du sérum total, le cholestérol puis la sérine se transportent à l'anode. Le compartiment cathodique au contraire s'enrichit en globuline. Le cholestérol existerait donc à l'état libre en dehors de tout complexe protéidique. TRAVAUX DE M. MACHEBÉUF : I. —
tout complexe protéidique. TRAVAUX DE M. MACHEBÉUF : I. — Isolement d'un complexe lipido-protéidique Tâchons de préciser l'état de la question après les recherches de GARDNER et GAINSBOROUGH. Les derniers travaux que nous venons de citer, dont on ne peut méconnaître le très grand intérêt, montrent que l'existence de complexes lipoprotéidiques est très probable. Leurs auteurs sont presque d'accord pour reconnaître que la globuline forme avec le cholestérol un système d'une stabilité assez grande, mais les preuves qu'ils en donnent sont toutes indirectes. D'autre part, il est admis à ce moment que ces complexes sont les seuls et qu'en particulier
moment que ces complexes sont les seuls et qu'en particulier l'albumine ne forme avec les lipides que des composés éphémères et très mal définis qui ne sauraient présenter le même intérêt que ceux de la globuline avec le cholestérol. Or c'est précisément au système albuminique que MACHEBÉUF s'attaque (1929) ; il en isole un complexe lipoprotéidique bien défini, fournissant ainsi la preuve directe de l'existence dans le sérum de cheval de liaisons protéides-lipides. L'auteur sépare les globulines du sérum par le sulfate d'ammonium à demi-saturation et montre que, si l'on ajoute un excès de sulfate d'ammonium et de l'acide sulfurique
ajoute un excès de sulfate d'ammonium et de l'acide sulfurique dilué jusqu'à pH = 3,8, la précipitation des albumines et des lipides est à très peu près quantitative. Le précipité, séparé de ses eaux-mères, se remet parfaitement en solution limpide si l'on ramène le pH aux environs de 7 à l'aide d'un peu d'ammoniaque dilué [38]. Une seconde acidification à pH = 3,8, donne un nouveau précipité, mais la teneur en sels étant plus faible, une notable partie des protéides reste en solution. A chaque opération de dissolution à pH = 7 et de précipitation à pH = 3,8 avec
= 7 et de précipitation à pH = 3,8 avec élimination des eaux-mères, il obtient une substance de plus en plus riche en lipides et de plus en plus pauvre en protéides mais dont la constitution tend à se fixer. Vers la septième précipitation elle devient constante (60 % de protéides et 40 % de lipides : stérides et phosphatides). Malgré sa teneur énorme en lipides, la substance est très soluble dans l'eau et d'une grande résistance à l'extraction éthérée. L'alcool ne précipite les protéides que très lentement et incomplètement. Ainsi, dans ce complexe, non seulement les lipides sont solubles
Ainsi, dans ce complexe, non seulement les lipides sont solubles dans l'eau et insolubles dans leurs solvants (éther, benzène...) mais les protéides eux-mêmes sont masqués à leur réactif coagulant, l'alcool. Ces propriétés particulières sont dues à leur action réciproque et non à une substance possédant propriété de solubiliser les lipides comme l'a vérifié l'auteur. Ce qui constitue l'intérêt de ces recherches c'est la constance de composition du complexe de MACHEBÉUF au cours des précipitations et dissolutions successives. On est en droit de penser que lipides et protéides sont liés entre eux non par simple adsorption comme le pense SÖRENSEN, mais
eux non par simple adsorption comme le pense SÖRENSEN, mais par des forces chimiques. MACHEBÉUF a proposé (1936) le terme de cénapse [39] pour désigner les produits biologiques résultant de l'union par des forces connues ou inconnues de deux ou plusieurs constituants de la matière vivante. Les mélanges sont évidemment exclus de ce terme qui implique la modification des propriétés des constituants. Ainsi, l'auteur appelle cénapses lipoprotéidiques les produits de l'union de lipides avec les protéides. II. — Étude de la néphrose lipoïdique : Pour connaître le rôle de chaque constituant des cénapses lipoprotéidiques, MACHEBÉUF [40] avec WAHL puis SANETUDIE