Provvedimenti sanitari per la prevenzione della brucellosi bovina

Materia: Animali

N. 01800/2020 REG.PROV.COLL.
N. 00350/2020 REG.RIC.


REPUBBLICA ITALIANA
IN NOME DEL POPOLO ITALIANO
Il Tribunale Amministrativo Regionale della Campania
sezione staccata di Salerno (Sezione Seconda)
ha pronunciato la presente
SENTENZA
sul ricorso numero di registro generale 350 del 2020, proposto da Michele Lisa, rappresentato e difeso dagli avvocati Umberto Casale, Federico Maggio, Dario Gioia, con domicilio digitale come da PEC da Registri di Giustizia e domicilio eletto presso lo studio di quest’ultimo, in Salerno, via SS. Martiri Salernitani, n. 31; 

contro
Azienda Sanitaria Locale Salerno, in persona del legale rappresentante pro tempore, rappresentata e difesa dall'avvocato Rosa Russo, con domicilio digitale come da PEC da Registri di Giustizia; 

nei confronti
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, in persona del legale rappresentante pro tempore, rappresentato e difeso dall'avvocato Faustino De Palma, con domicilio digitale come da PEC da Registri di Giustizia; 

per l'annullamento
del provvedimento del 3 marzo 2020, prot. n. 318, recante l’ordine di abbattimento di capi di bestiame risultati positivi ai test sierologici per la brucellosi bovina.

Visti il ricorso e i relativi allegati;
Visti gli atti di costituzione in giudizio dell’Azienda Sanitaria Locale Salerno e dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno;
Visti tutti gli atti della causa;
Relatore nell'udienza pubblica del giorno 28 ottobre 2020 il dott. Olindo Di Popolo e uditi per le parti i difensori come specificato nel verbale;
Ritenuto e considerato in fatto e diritto quanto segue.

FATTO e DIRITTO
1.	Col ricorso in epigrafe, Lisa Michele (in appresso, L. M.) impugnava, chiedendone l’annullamento: - il provvedimento del 3 marzo 2020, prot. n. 318, col quale il Responsabile dell’Unità Operativa Semplice Dipartimentale (UOSD) di Sala Consilina dell’ASL Salerno, a seguito di accertamento di infezione da brucellosi bovina, aveva disposto l’isolamento, il sequestro e l’abbattimento di n. 59 (rectius, n. 55) capi di bestiame bufalino presso l’allevamento ubicato in Sassano, via Ponte Fabbriche (codice aziendale n. 136SA265); - il rapporto di prova (RdP) ematica prot. n. 38340 del 2 marzo 2020, a cura dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (in appresso IZSM).
2.	Nell’avversare l’impugnata misura demolitoria sanitaria, lamentava, in estrema sintesi, che l’infezione da brucellosi bovina sarebbe stata contestata sulla scorta di riscontri analitici dubbi e controvertibili (a causa di possibili fenomeni di “cross-reattività” col batterio della Yersinia enterocolitica O9), senza i necessari approfondimenti istruttori, e cioè, segnatamente, senza aver interpellato il Centro di Referenza Nazionale per le Brucellosi (individuato dal d.m. 4 ottobre 1999 nell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale per l’Abruzzo e il Molise, in appresso, IZSAM), nonostante gli animali presenti in allevamento non manifestassero evidenze sintomatiche della malattia e nonostante, in precedenza, il RdP prot. n. 139239 del 24 settembre 2019, assunto a fondamento della soppressione (disposta con provvedimento in pari data, prot. n. 1574/SV) di 9 capi risultati positivi agli effettuati test in vivo (SAR Ag-RB: sieroagglutinazione rapida con antigene Rosa Bengala, in appresso, SAR, e FdC-mi: fissazione del complemento, in appresso, FdC), fosse stato smentito dagli esiti dei test batteriologici post mortem.
A suffragio delle proprie tesi, depositava in giudizio una relazione medico-veterinaria a cura del tecnico all’uopo incaricato.
3.	Costituitasi l’intimata ASL Salerno, eccepiva l’infondatezza del gravame esperito ex adverso, deducendo, in particolare, che l’invocata controanalisi a cura del competente Centro di Referenza Nazionale per le Brucellosi sarebbe prevista nelle ipotesi di allevamenti non infetti, e non anche nelle ipotesi – come, appunto, quella in esame – di allevamenti già colpiti da brucellosi.
Si costituiva, altresì, in resistenza l’IZSM, il quale, nell’eccepire pure l’infondatezza del ricorso, si richiamava al principio generale di precauzione contro i rischi potenziali per la sanità pubblica ed opponeva, segnatamente, la sufficienza delle acquisite evidenze sierologiche indirette e, quindi, l’insussistenza delle condizioni oggettive per interpellare il menzionato Centro di Referenza Nazionale per le Brucellosi, nonché, per converso, la minore attendibilità sia dei metodi di prova diretti (PCR e test batteriologico), a causa della frequenza delle false negatività da questi generate, sia delle cennate controanalisi, a causa del sopravvenire di fattori di c.d. eclisse immunologica.
A supporto delle proprie eccezioni, l’IZSM versava in atti anche una perizia di parte a cura del tecnico all’uopo incaricato.
4.	In esito alla camera di consiglio del 6 maggio 2020, la proposta domanda cautelare era accolta con ord. n. 270/2020, in parte confermata e in parte riformata in appello dal Consiglio di Stato, sez. III, con ord. n. 3777/2020, n. 3778/2020 e n. 3790/2020.
5.	Successivamente, all’udienza pubblica del 28 ottobre 2020, la causa era trattenuta in decisione.
6.	Venendo ora a scrutinare il ricorso, giova previamente richiamare la normativa di settore.
6.1.	Direttiva 64/432/CEE (relativa a problemi di polizia sanitaria in materia di scambi intracomunitari di animali delle specie bovina e suina), come modificata dalla direttova 97/12/CE.
6.1.1.	Il paragrafo II dell’Allegato A così definisce gli allevamenti indenni da brucellosi bovina ovvero rimasti privi di tale qualifica:
«1. Un allevamento bovino è ufficialmente indenne da brucellosi se: a) non contiene bovini vaccinati contro la brucellosi, salvo qualora si tratti di femmine vaccinate almeno tre anni prima; b) tutti i bovini sono immuni da sintomi clinici di brucellosi da almeno sei mesi; c) tutti i bovini di età superiore ai 12 mesi sono stati sottoposti, con esito negativo, ad una delle seguenti serie di prove, eseguite conformemente all'allegato C: i) due sieroagglutinazioni, praticate ad un intervallo superiore a tre mesi e inferiore a dodici mesi; ii) tre prove dell'anello ( ring test), effettuate a tre mesi di intervallo e seguite, non meno di sei settimane dopo, da una sieroagglutinazione; iii) due prove all'antigene di Brucella tamponato, ad un intervallo superiore a tre mesi ed inferiore a dodici mesi; iv) due prove di microagglutinazione, ad un intervallo superiore a tre mesi e inferiore a dodici mesi.
2. Un allevamento bovino mantiene la qualifica di ufficialmente indenne da brucellosi se … viene effettuata annualmente, con esito negativo, una delle seguenti serie di prove, conformemente alle disposizioni dell'allegato C: i) tre prove dell'anello, effettuate ad intervalli di almeno tre mesi; ii) tre saggi ELISA sul latte, effettuati ad intervalli di almeno tre mesi; iii) due prove dell'anello, effettuate ad un intervallo di almeno tre mesi e seguite, non meno di sei settimane dopo, da una prova sierologica; iv) due saggi ELISA sul latte effettuati ad un intervallo di almeno tre mesi e seguiti, non meno di sei settimane dopo, da una prova sierologica; v) due prove sierologiche, effettuate ad un intervallo non inferiore a tre mesi e non superiore a sei mesi. (…).
3. La qualifica di ufficialmente indenne da brucellosi di un allevamento è sospesa o ritirata se … si sospetta, in base a prove di laboratorio o per motivi clinici, che uno o più animali siano malati di brucellosi.
Se si sospetta che uno o più animali di un allevamento ufficialmente indenne da brucellosi siano malati di brucellosi, la qualifica dell'allevamento può essere sospesa piuttosto che ritirata, purché l'animale o gli animali vengano immediatamente distrutti o isolati.
Se l'animale è stato distrutto, la sospensione può essere revocata purché tutti i bovini dell'allevamento con un'età superiore a 12 mesi, sottoposti a due sieroagglutinazioni effettuate conformemente alle disposizioni dell'allegato C presentino un tasso brucellare inferiore a 30 UI agglutinanti per millilitro. La prima prova è effettuata non prima di 30 giorni dopo la rimozione dell'animale e la seconda perlomeno 60 giorni dopo.
Se l'animale è stato isolato, esso può essere reintrodotto nell'allevamento con il ripristino della qualifica dell'allevamento, purché presenti, ad una successiva sieroagglutinazione, un tasso brucellare inferiore a 30 UI agglutinanti per millilitro ed abbia reagito negativamente alla prova di fissazione del complemento; le prove debbono essere eseguite secondo le disposizioni dell'allegato C.
Se, in seguito a prove di laboratorio o a indagini epidemiologiche, è confermata la presenza di brucellosi in un allevamento, la qualifica di tale allevamento non sarà ripristinata fin quando tutte le bovine gravide al momento della comparsa della malattia non abbiano reagito negativamente alle prove summenzionate, l'ultima delle quali eseguita non prima di 21 giorni dopo il parto. Un allevamento bovino è considerato indenne da brucellosi se soddisfa le condizioni di cui al paragrafo 1, lettere a, b e c, tranne per il fatto che: i) le femmine possono essere vaccinate: - entro i primi sei mesi d'età con vaccino vivo (ceppo 19) o con altri vaccini autorizzati secondo la procedura di cui all'articolo 17 oppure entro i primi 15 mesi di età, con vaccino ucciso con adiuvante 45/20, controllato e riconosciuto ufficialmente; ii) i bovini di età inferiore a 30 mesi che sono stati vaccinati con vaccino vivo (ceppo 19) possono presentare, alla sieroagglutinazione, un tasso brucellare superiore a 30 UI agglutinanti per millilitro, ma inferiore a 80 UI agglutinanti per millilitro, sempreché presentino, alla reazione di fissazione del complemento, un tasso inferiore a 30 unità CEE, se si tratta di femmine vaccinate da meno di 12 mesi, o un tasso inferiore a 20 unità CEE in tutti gli altri casi; iii) oltre alle prove elencate al paragrafo 1, lettera c, sono autorizzate anche le seguenti serie di prove, al fine di conseguire la qualifica di “indenne da brucellosi”: a) due prove all'antigene di Brucella tamponato eseguite ad un intervallo superiore a tre mesi e inferiore a 12 mesi; b) due prove di microagglutinazione eseguite ad un intervallo superiore a tre mesi e inferiore a 12 mesi, secondo le disposizioni dell'allegato C.
5. Un allevamento bovino mantiene la qualifica di indenne da brucellosi se: i) è sottoposto a una delle serie di prove elencate al precedente paragrafo 2, lettera a; ii) i bovini che arrivano nell'allevamento soddisfano ai requisiti elencati al precedente paragrafo 2, lettera b, oppure provengono da allevamenti indenni da brucellosi e, se si tratta di bovini di età superiore a 12 mesi, presentano, nei 30 giorni precedenti l'introduzione nell'allevamento, un tasso brucellare inferiore a 30 UI agglutinanti per millilitro alla sieroagglutinazione e una reazione negativa di fissazione del complemento, conformemente alle disposizioni dell'allegato C oppure provengono da allevamenti indenni da brucellosi, hanno un'età inferiore a 30 mesi e sono stati vaccinati con vaccino vivo (ceppo 19); essi possono presentare un tasso brucellare superiore a 30 UI agglutinanti per millilitro, ma inferiore a 80 UI agglutinanti per millilitro, sempreché presentino, alla reazione di fissazione del complemento, un tasso inferiore a 30 unità CEE se si tratta di femmine vaccinate da meno di 12 mesi ed un tasso inferiore a 20 unità CEE in tutti gli altri casi.
6. La qualifica di allevamento indenne da brucellosi può essere sospesa o ritirata se … si sospetta, in seguito a prove di laboratorio o per motivi clinici, che uno o più bovini di età superiore ai 30 mesi siano malati di brucellosi.
Se, in un allevamento qualificato indenne da brucellosi, si sospetta che uno o più bovini di età superiore ai 30 mesi siano malati di brucellosi, la qualifica dell'allevamento può essere sospesa, invece che ritirata, purché l'animale o gli animali siano immediatamente distrutti o isolati.
Nel caso in cui l'animale sia stato distrutto, la sospensione può essere revocata se tutti i bovini dell'azienda di età superiore ai 12 mesi, sottoposti a due sieroagglutinazioni secondo le disposizioni dell'allegato C, presentano un tasso brucellare inferiore a 30 UI agglutinanti per millilitro. La prima prova dev'essere eseguita non prima di 30 giorni dopo la rimozione dell'animale e la seconda ad almeno 60 giorni di distanza.
Nel caso in cui l'animale sia stato isolato, esso può essere reintrodotto nell'allevamento, con il ripristino della qualifica dell'allevamento, purché ad una successiva sieroagglutinazione presenti un tasso brucellare inferiore a 30 UI agglutinanti per millilitro e reagisca negativamente ad una prova di fissazione del complemento; le prove debbono essere eseguite conformemente alle disposizioni dell'allegato C.
Se, in seguito a prove di laboratorio o a indagini epidemiologiche, viene confermata la brucellosi in un allevamento, la qualifica di tale allevamento non sarà ripristinata sin quando tutte le bovine gravide al momento della comparsa della malattia abbiano reagito negativamente alle prove suddette, l'ultima delle quali eseguita non prima di 21 giorni dopo il parto». 6.1.2.	L’Allegato C annovera le seguenti prove immunologiche idonee all’accertamento della presenza o meno dell’agente patogeno brucellare negli organismi animali bovini: - sieroagglutinazione; - reazione fissa di complemento; - prova dell’anello (ring test); - prova all’antigene di brucella tamponato; - prova dell’anello di latte, effettuata su plasma sanguigno; - agglutinazione del plasma sanguigno; - prova di microagglutinazione; - saggio di immunoassorbimento ensimatico (ELISA).
6.2.	D.lgs. n. 196/1999 (Attuazione della direttiva 97/12/CE che modifica e aggiorna la direttiva 64/432/CEE relativa ai problemi di polizia sanitaria in materia di scambi intracomunitari di animali delle specie bovina e suina).
6.3.	D.m. 27 agosto 1994, n. 651 (Regolamento concernente il piano nazionale per la eradicazione della brucellosi negli allevamenti bovini).
L’art. 5, comma 1, identifica le prove ufficiali per la diagnosi della brucellosi bovina con quelle descritte nell’Allegato 1.
A sua volta, quest’ultimo, così come modificato dall’art. 4 del d.m. 12 agosto 1997, n. 429, stabilisce che: «Le prove sierologiche per la diagnosi della brucellosi dei bovini sono rappresentate dalle reazioni di siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala e di fissazione del complemento, e sono utilizzate per il controllo degli allevamenti bovini secondo quanto disposto nella parte B del presente allegato. (…). Parte B. Applicazioni pratiche. Fissazione del complemento (FdC). Dotata di ottima sensibilità e specificità, è da considerare il saggio di base e di riferimento e come tale può trovare applicazione in tutti i casi in cui, nel presente regolamento, si fa menzione di ''esame(i) sierologico(i) ufficiale(i)''. In particolare, il suo impiego si impone per il riconoscimento di ''allevamento indenne da brucellosi'' (articolo 16, comma A, lettere b e c, e comma C, punto 3, lettera c), e per il riaccreditamento degli allevamenti indenni sospetti di reinfezione (articolo 19, punto 1, lettere a e b). Per le bovine vaccinate con Buck-19 e di età inferiore a 18 mesi è tollerato un titolo di positività, a questa  prova, fino a 30 UIFC/ml)". Sieroagglutinazione rapida con antigene al rosa bengala (SAR-Ag: RB).  Per la sua elevata sensibilità, può trovare impiego in ogni situazione prevista dal presente regolamento, ad esclusione dei casi  specifici più sopra indicati nei quali deve preferirsi il ricorso al FdC. Tutti i sieri positivi alla SAR-Ag: RB devono essere saggiati con la FdC per la conferma. Criteri interpretativi. Poiché ai fini del risanamento dalla brucellosi bovina, FdC e SAR-Ag: RB rappresentano i test di scelta per la identificazione  degli animali infetti, in soggetti non sottoposti a vaccinazione sono da prevedere le seguenti eventualità: SAR-Ag: RB negativa e FdC negativa = animale indenne; SAR-Ag:RB positiva e FdC negativa = animale sospetto [controllo da ripetere]; SAR-Ag:RB negativa e FdC positiva = animale infetto; SAR-Ag: RB positiva e FdC positiva = animale infetto».
A norma, poi, dell’art. 7, comma 1, «un bovino è considerato infetto da brucellosi quando è possibile ritenerlo tale in base agli esami sierologici ufficiali indicati nell'allegato al presente regolamento o ad un accertamento batteriologico».
Ancora, il successivo art. 8, comma 1, stabilisce che: «I bovini nei quali la brucellosi è stata ufficialmente constatata devono essere subito isolati e macellati, sotto controllo ufficiale, al più presto e comunque non oltre trenta giorni dalla notifica ufficiale al proprietario o al detentore. La macellazione di quelli che hanno presentato manifestazioni cliniche della malattia comportanti eliminazione di brucelle deve avvenire non oltre sette giorni dalla notifica di cui sopra. Nessun intervento terapeutico o manualità clinica è permessa su tali animali».
Infine, ai sensi dell’art. 10, «un allevamento bovino è considerato infetto da brucellosi in seguito all'isolamento dell'agente eziologico e/o quando uno o più capi che lo costituiscono hanno reagito positivamente alle prove sierologiche ufficiali».
6.4.	O.m. 28 maggio 2015 (Misure straordinarie di polizia veterinaria in materia di
tubercolosi, brucellosi bovina e bufalina, brucellosi ovi-caprina, leucosi bovina enzootica).
L’art. 4, comma 1, prevede che: «Le prove ufficiali per la diagnosi della brucellosi nei territori non U.I. [ufficialmente indenni] sono descritte nell’allegato 1 alla presente ordinanza. Le prove ufficiali per la diagnosi di tubercolosi, brucellosi bovina nei territori U.I. e leucosi sono quelle descritte nel decreto legislativo 22 maggio 1999, n. 196 e nell’allegato B della direttiva 64/432 del Consiglio, come sostituito dall’allegato del regolamento (CE) 1226/2002 dell’8 luglio 2002 e nel decreto legislativo 19 agosto 2005, n. 193, recante attuazione della direttiva 2003/50/CE per le prove per la ricerca della brucellosi da Brucella melitensis nei territori U.I.»
L’Allegato 1 così disciplina le prove sierologiche ufficiali per il controllo della brucellosi nei territori non U.I.:
«Le prove sierologiche ufficiali sono: a) la prova della sieroagglutinazione rapida con antigene Rosa Bengala (SAR) da eseguirsi su tutti i campioni ematici prelevati; b. la prova della fissazione del complemento (FdC) da eseguirsi su tutti i campioni positivi alla SAR e su tutti gli animali dell’allevamento nel caso di allevamenti non indenni o non ufficialmente indenni e sottoposti a controllo per l’acquisizione della qualifica … La prova della FdC è considerata positiva ad un titolo uguale o maggiore a 20 UIFC/ml. Per le bovine o bufaline vaccinate con Buck 19 e di età inferiore a 18 mesi è tollerato un titolo di positività in FdC fino a 30 UIFC/ml.
Interpretazione dei risultati delle due prove: a) Nel caso in cui il siero di un animale esaminato fornisca esito negativo alla SAR ed alla FdC, l’animale è da considerare non infetto. b) Nel caso il siero di un animale esaminato fornisca esito positivo alla FdC (maggiore o uguale a 20 UIFC/ml) e negativo o positivo alla SAR l’animale è da considerare infetto. c) Nel caso in cui il siero di un animale esaminato fornisca esito positivo alla SAR e negativo alla FdC, l’esito è da considerare dubbio e l’animale sospetto d’infezione. Nel caso in cui tale risultato sia ottenuto su sieri di animali presenti in allevamenti infetti, i capi con SAR positiva e FdC negativa sono considerati in ogni caso infetti. Per gli allevamenti non infetti nei quali si ripetono esiti dubbi durante i controlli successivi, la Regione può richiedere l’intervento dell’IZS competente per territorio e del Centro di referenza nazionale per le brucellosi per eventuali approfondimenti diagnostici».
7.	Tanto premesso in ordine al quadro normativo di riferimento, occorre rimarcare, in punto di fatto, che:
- come documentato dall’amministrazione resistente e illustrato nella perizia tecnica da quest’ultima depositata in giudizio, in data 24 settembre 2019 (RdP in pari data, prot. n. 139239), presso l’azienda gestita dal L., dei capi di bestiame campionati, n. 53 si sono rivelati positivi alla SAR e n. 9 di questi si sono rivelati positivi anche alla FdC;
- ai sensi dell’art. 10 del d.m. 27 agosto 1994, n. 651 (secondo cui «un allevamento bovino è considerato infetto da brucellosi in seguito all'isolamento dell'agente eziologico e/o quando uno o più capi che lo costituiscono hanno reagito positivamente alle prove sierologiche ufficiali»), detto allevamento è risultato infetto;
- all’esito delle successive verifiche condotte dall’ASL Salerno, sono emersi i seguenti dati epidemiologici all’interno dell’allevamento ispezionato: -- intervento del 21 ottobre 2019 – RdP prot. n. 158221 del 28 ottobre 2019: n. 14 capi positivi alla SAR, di cui n. 12 positivi anche alla FdC; -- intervento del 18 novembre 2019 – RdP prot. n. 171594 del 21 novembre 2019: n. 2 capi positivi alla SAR, entrambi positivi alla FdC; -- intervento del 16 dicembre 2019 – RdP prot. n. 191221 del 19 dicembre 2019: n. 2 capi positivi alla SAR, di cui n. 1 positivo alla FdC; -- intervento del 14 gennaio 2020 – RdP prot. n. 12244 del 21 gennaio 2020: n. 16 capi positivi alla SAR, di cui n. 7 positivi alla FdC; -- intervento del 25 febbraio 2020 – RdP prot. n. 38340 del 2 marzo 2020: n. 55 capi positivi alla SAR, di cui n. 31 positivi alla FdC;
- i RdP prot. n. 154004-154005-154006 del 21 ottobre 2019, prot. n. 173105-173106-173107 del 25 novembre 2019, prot. n. 11378-11379-11380 del 20 gennaio 2020, riproducono gli esiti negativi dei test batteriologici post mortem sui bovini risultati positivi all’esito dei test sierologici in vivo SAR e FdC (cfr. RdP n. 139239 del 24 settembre 2019 e n. 158221 del 28 ottobre 2019) e, conseguentemente, abbattuti in forza dei provvedimenti del 24 settembre 2019, prot. n. 1574/SU, e del 28 ottobre 2019, prot. n. 1692/SU;
- in altri termini, i test batteriologici post mortem hanno elargito risultati contrastanti con quelli dei test sierologici in vivo (SAR e FdC).
8.	Sull’attendibilità dei metodi sierologici di accertamento della brucellosi bovina in confronto a quella propria dei metodi batteriologici sono stati sviluppati approfondimenti tecnico-scientifici che hanno trovato eco anche in giurisprudenza.
8.1.	In particolare, TAR Campania, Napoli, sez. V, 3 marzo 2010, n. 1284; 18 maggio 2010, n. 6586; 14 luglio 2011, n. 3825, 1° dicembre 2011, n. 5625, sulla scorta degli elementi valutativi forniti in sede di apposita verificazione, hanno avuto modo di enunciare che:
«La diagnosi della brucellosi animale (e umana) si basa sull'uso di metodi sierologici, batteriologici o molecolari. I metodi sierologici (nelle diverse forme del test di agglutinazione, fissazione del complemento od ELISA) si basano tutti sulla ricerca egli anticorpi contro le brucelle presenti nel sangue dell'animale. Il metodo batteriologico è unico e si basa sull'isolamento delle brucelle dal latte o dai tessuti dell'animale. Il metodo molecolare più usato è indicato con l'acronimo PCR (reazione a catena della polimerasi) e si basa sulla ricerca del DNA di brucelle – vive o morte – nel latte o (più raramente) nei tessuti dell'animale. La diagnosi della brucellosi animale purtroppo si basa quasi sempre sui metodi sierologici. Secondo un lavoro abbastanza recente (Godfroid et al. 2005), l'elevato numero di false reazioni sierologiche positive (cioè l'elevato numero di animali diagnosticati infetti in base al test sierologico, ma che in realtà non sono infetti) rappresenta uno dei problemi più seri che le autorità sanitarie dovrebbero decidersi a governare. Le false reazioni positive derivano dalla presenza nel sangue da testare di anticorpi diretti, non contro le brucelle, ma contro batteri che somigliano alle brucelle. Inoltre gli animali sieropositivi possono essere animali infetti che hanno contrastato l'infezione od animali resistenti e semplicemente esposti alle brucelle (Dobson and Meagher 1996). Dunque la presenza di anticorpi contro le brucelle non implica necessariamente che l'animale sia infetto (Blasco et a. 1994). Il test batteriologico è da sempre considerato il test diagnostico di riferimento (il gold standard della sierologia della brucellosi (d.m. 651/94, a.7). Sostanzialmente a questa conclusione arriva anche l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Portici in una recentissima pubblicazione (Marianelli et al. 2008) dove scrivono che: "Le prove sierologiche indicano la presenza di anticorpi anti brucella, ma è possibile identificare un animale come infetto solo se dai tessuti dell'animale è possibile isolare le brucelle". Diversi lavori indipendenti stimano che il numero degli animali sieropositivi è circa 2-3- volte il numero degli animali positivi al test batteriologico. In altre parole, due su tre degli animali dichiarati infetti in base al test sierologico in realtà non sono infetti. La PCR non è sovrapponibile al metodo batteriologico perché, oltre al DNA delle brucelle vive, identifica anche il DNA delle brucelle morte eventualmente presenti nel campione da testare. In conclusione, l'adozione del test batteriologico, come previsto dal DM 651/1994, a.7, consente di individuare gli animali infetti con un'accuratezza 2-3- volte superiore rispetto ai metodi sierologici. Nei casi dubbi (come suggerito da Marianelli et al., 2008) al test batteriologico si potrebbe affiancare quello basato sulla PRC …».
8.2.	Al riguardo, giova riportare in appresso alcuni passaggi rilevanti dell’esibito rapporto dell’Istituto Superiore di Sanità (ISS) n. 05/21 “Brucellosi animali: rassegna sul fenomeno delle aspecificità e delle discordanze tra sieroagglutinazione rapida con antigene al rosa bengala e fissazione del complemento”.
«La specificità di un test diagnostico – recita l’elaborato tecnico-scientifico in parola – è la capacità di individuare unicamente gli animali non infetti ed è rappresentata come probabilità di identificare gli animali sani da un punto di vista clinico, con un risultato sierologico negativo: in altre parole, nel nostro caso è la capacità di identificare correttamente i veri siero-negativi evitando i falsi siero-positivi.
La sensibilità di un test diagnostico è, al contrario, la capacità di individuare unicamente gli animali infetti ed è rappresentata come probabilità di identificare gli animali infetti con un risultato sierologico positivo: in altre parole è la capacità di identificare correttamente tutti i veri positivi evitando i falsi negativi.
In generale si può affermare che non esiste test diagnostico che abbia una sensibilità capace di svelare il 100% degli animali infetti e nello stesso tempo una specificità capace di riconoscere correttamente il 100% degli animali sani.
Di solito una percentuale intorno al 99%, di ambedue gli aspetti, è considerata di altissimo significato statistico. È noto che all’aumento della sensibilità diminuisce la specificità e viceversa: privilegiare l’una o l’altra dipende dalla funzione del test. (…).
La reazione di fissazione del complemento è considerata il test sierodiagnostico per la brucellosi più affidabile proprio perché sensibilità e specificità si avvicinano dello stesso livello nel rilevare la presenza di anticorpi specifici, con una concordanza intorno al 99% rispetto all’isolamento batterico da animali infetti sperimentalmente. (…).
Per quanto riguarda la reazione SAR-Ag:RB e la FdC-mi, utilizzate ufficialmente nel nostro Paese per la sorveglianza siero-epidemiologica nei piani di eradicazione delle brucellosi animali, Garin-Bastuji (1995) riporta una sensibilità per SAR-Ag:RB su bovini naturalmente infetti, positivi all’esame batteriologico, del 74,9%-91,8% e una sensibilità per FdC-mi, sugli stessi animali, del 79,0-98,2%. Su bovini sperimentalmente infetti, lo stesso autore riporta una sensibilità del 77,8% per SAR-Ag:RB e del 81,5% per FdC-mi. (…).
Gli ultimi dati di valutazione della sensibilità, specificità e indice di performance, relativi alla SAR-Ag:RB sono stati riportati da Nielsen (2002), con le rispettive fonti bibliografiche come riportato in Tabella 1.
Tabella 1. Fonti bibliografiche della sensibilità e della specificità.
Test: RBPT; Sensibilità: 21,0-98,3; Specificità: 68,8-100; Indice performance: 121,0-193,9.
Test: CF; Sensibilità: 23,0-97,1; Specificità: 30,6-100; Indice performance: 23,0-197,5. (…).
La sensibilità e la specificità delle reazioni siero-diagnostiche (SAR-Ag:RB e FdC-mi) possono influire sul successo di qualsiasi programma di eradicazione della brucellosi: infatti la scarsa specificità di reazione determina l’eliminazione di una certa percentuale di animali sani, mentre una scarsa sensibilità determina il mantenimento nell’allevamento di una certa percentuale di animali infetti.
Sono eventi tuttavia di bassa incidenza, in quanto il giudizio diagnostico viene espresso sulla base della complementarietà delle due reazioni e, nel caso di valori discordanti, un giudizio dubbio impone una ripetizione delle reazioni dopo un breve intervallo, al fine di elevare il livello di certezza diagnostica.
Sono eventi tuttavia di bassa incidenza, in quanto il giudizio diagnostico viene espresso sulla base della complementarietà delle due reazioni e, nel caso di valori discordanti, un giudizio dubbio impone una ripetizione delle reazioni dopo un breve intervallo, al fine di elevare il livello di certezza diagnostica.
In merito alla SAR-Ag:RB e alla FdC-mi, previste dai piani nazionali di eradicazione nei bovini, ovini, caprini e bufalini, le cause che possono determinare risposte aspecifiche sono diverse, a seconda che trattasi di risultati falsamente positivi e/o falsamente negativi.
In letteratura, come cause di aspecificità siero-diagnostiche si fa riferimento quasi esclusivamente alle cross-reattività sierologiche dovute a microrganismi che presentano affinità antigeniche, con particolare riguardo a Yersinia enterocolitica O9. Questo perché si reputa scontato che le reazioni diagnostiche abbiano un alto livello di standardizzazione, costante nel tempo, con un indice di accuratezza assoluto (100%) del tutto irrealizzabile. (…).
Altro problema concatenato alle aspecificità riguarda le discordanze tra le due reazioni sierodiagnostiche ufficiali: SAR-Ag:RB e FdC-mi. Gli effetti sono dello stesso ordine, basti ricordare che i piani nazionali prevedono severe misure restrittive in presenza di sieropositività anche della sola SAR-Ag:RB, pertanto anche in tal caso è importante discriminare le discordanze legate a false positività o a false negatività, o se invece trattasi di vere discordanze legate alla diversa sensibilità e specificità della SAR-Ag:RB rispetto alla FdC-mi in funzione anche della specie animale di origine del siero. Come è stato detto in precedenza, infatti, le due reazioni possono differire di sensibilità anche di 2-3 punti percentuali nei bovini a favore della FdC-mi, mentre negli ovini sembrerebbe l’inverso, a parità invece di specificità (100%)».
Il menzionato rapporto spiega, tra l’altro, le cennate discordanze tra le reazioni SAR e FdC con la differente tempistica propria dell’utilizzo dell’uno o dell’altro metodo di prova: «Questo fenomeno è legato alle diversa sensibilità della SAR-Ag:RB e della FdC-mi alle variazioni quantitative delle varie immunoglobuline nell’evoluzione della malattia. Secondo Garin-Bastuji, la SAR-Ag:RB reagisce molto bene con le IgG1 e le IgM, (IgG1 +, IgG2–, IgM +, IgA–); mentre la FdC-mi reagisce bene con le IgG1, meno bene con le IgM (IgG1+, IgG2–, IgM +/–,IgA– Nel corso dell’evoluzione della malattia a seguito di infezione naturale o sperimentale, le prime immunoglobuline a comparire sono le IgM, che caratterizzano un’infezione recente, ma ben presto predominano le IgG1 e in piccola parte le IgG2, mentre il tasso delle IgM si abbassa. In questo caso, poiché la SAR-Ag:RB svela maggiormente le IgM rispetto alle IgG1, si può osservare SAR-Ag:RB positiva e FdC-mi negativa. La SAR-Ag:RB possiede anche il pregio di svelare molto bene anche le IgG1 e quindi gli animali con infezione cronica. La FdC-mi è considerata la reazione Ag/Ac più sensibile e specifica tra quelle tradizionali, e in qualche Paese avanzato ha sostituito del tutto le reazioni basate sul principio dell’agglutinazione – SAR:Ag:RB, SAL in tubi, MRT (Milk Ring Test), card test. La FdC-mi mette in evidenza sia le IgM che le IgG1 e le IgG2, ma soprattutto le IgG1; per questa ragione svela molto bene le infezioni croniche ed entro certi limiti riesce a differenziare gli animali infetti da quelli vaccinati, come in precedenza è stato detto (Farina e Scatozza, 1998). Inoltre può svelare anche anticorpi incompleti, tanto che possono verificarsi situazioni FdC-mi positive a fronte di SAR-Ag:RB negative. Questa situazione trova un effettivo riscontro effettuando il test di Coomb o test dell’agglutinazione indiretta sui sieri che hanno manifestato tali discordanze».
Onde ovviare alle impasses ingenerate dagli illustrati fenomeni di aspecificità e di discordanza, l’elaborato tecnico-scientifico in parola suggerisce l’espletamento di adeguati supplementi di indagine, segnatamente, sia mediante ripetizione della diagnosi convenzionale (SAR – FdC) nell’ambito della rete degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali sia mediante esecuzione di prove diagnostiche complementari, con caratteristiche e principi di reazione diversi, più sensibili e/o più specifiche della SAR e della FdC, in combinazione tra loro.
Queste ultime – precisa il rapporto ISS n. 05/21 – possono essere di tipo immuno-umorale (antigene/anticorpo), ormai considerate classiche, come l’MRT o prova dell’anello sul latte, la gel-immunoprecipitazione, la SAL (SieroAgglutinazione Lenta in provetta), il test di Coombs o degli anticorpi incompleti (Ciuchini et al., 2002) e l’ELISA indiretta (Nielsen et al., 1989; Ferriera et al., 2003; Erdenebaatar et al., 2003; Bajani Ari et al., 2004) o competitiva (Nielsen et al., 1995; Marìn et al., 1999), che svelano differenti classi di immunoglobuline e spesso risultano più sensibili o più specifiche, oppure prove come la flurescence polarization assay (FPA), (Gall et al., 2000; Nielsen et al., 2000; Nielsen & Gall, 2001, McGiven et al., 2003 Nielsen et al., 2004) o il western blotting (Kittelberger et al.,1998; Corrente et al., 2004). Per eliminare eventuali discordanze legate alle false positività dell’ELISA si possono trattare i sieri con chelanti del tipo EDTA: trattamenti che fanno diminuire i falsi positivi legati principalmente a Ig M (Nielsen et al., 1994; Pouillot et al., 1999).
Prove di tipo cellulo-mediato possono essere il gamma interferon test (γ-IFN) (Weynants et al., 1995; Kittelberger et al., 1997; Ciuchini et al., 1998, 2000; Adone et al., 2000; Duran-Ferrer et al., 2004), il dosaggio di alcune importanti citochine (Pasquali et al., 2001 ) e la prova allergica di intradermoreazione (Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 1999), che permettono invece una valutazione della reattività cellulo-mediata indotta da brucella.
Queste tecniche immunologiche complementari, combinate con le convenzionali adottate in Italia (SAR-Ag:RB e FdC-mi), da effettuarsi su latte, siero e sangue, con un nuovo campionamento sul “soggetto problema”, consentono nel loro insieme un aumento della sensibilità e specificità diagnostica e quindi della capacità di discriminare diagnosi falsamente positive o falsamente negative.
Bisogna ricordare che in un contesto di reazioni sierologiche falsamente positive, nella brucellosi bovina o ovi-caprina, è impossibile formulare una diagnosi di certezza sulla base dei risultati dei test convenzionali, anche se ripetuti, effettuati su un solo prelievo (Pouillot et al., 1999); meglio quindi adottare la strategia di una combinazione di test da valutare in relazione a studi epidemiologici ad hoc (Ferroni, 2004).
Per aumentare la specificità diagnostica si possono adottare in parallelo le classiche tecniche di diagnosi diretta come l’isolamento batterico, molto specifica ma di bassa sensibilità (Alton et al., 1988; Adone et al., 1998;) oppure tecniche biomolecolari altamente sensibili e specifiche come la PCR su latte, sangue, sperma, secreti vaginali, reperti abortivi od organi interni dei soggetti inviati al macello per l’eliminazione (Bricker & Halling, 1994, 1995; Paganico et al., 1996; Pouillot et al., 1999; Adone et al., 2001b; Bricker, 2002; Bricker et al., 2003, Elfaki et al., 2004), oppure PCR-ELISA (Morata et al., 2003; Vrioni et al., 2004), Real-time multiplex PCR (Probert et al., 2004). Queste due ultime prove, se positive, consentono di discriminare e valutare in maniera assoluta diagnosi aspecifiche e tutte le discordanze possibili tra SAR-Ag:RB ed FdC-mi».
9.	Ora, alla luce delle superiori direttive tecnico-ermeneutico-applicative, denotanti una generale propensione per l’approfondimento istruttorio dei dati diagnostici incerti e controvertibili, gli esiti negativi rivenienti dagli esperiti, e più attendibili, metodi prova diretti – quali, appunto, i test batteriologici di cui ai RdP prot. n. 154004-154005-154006 del 21 ottobre 2019, prot. n. 173105-173106-173107 del 25 novembre 2019, prot. n. 11378-11379-11380 del 20 gennaio 2020 – avrebbero dovuto ragionevolmente indurre l’amministrazione non già ad accontentarsi, bensì a dubitare di quelli positivi rivenienti dai parimenti esperiti, e meno attendibili, metodi di prova indiretti – quali, appunto, i test sierologici SAR e FdC di cui ai RdP prot. n. 158221 del 28 ottobre 2019, prot. n. 171594 del 21 novembre 2019, prot. n. 191221 del 19 dicembre 2019, prot. n. 12244 del 21 gennaio 2020 e prot. n. 38340 del 2 marzo 2020 – siccome dai primi interamente sconfessati, ed a svolgere, quindi, adeguate indagini supplementari. Indagini, queste, che ben avrebbero potuto e dovuto incanalarsi nell’alveo procedimentale codificato nel secondo capoverso, lett. c, dell’Allegato 1 all’o.m. 28 maggio 2015, che prevede il coinvolgimento del Centro di referenza nazionale per le brucellosi (individuato dal d.m. 4 ottobre 1999 nell’IZSAM).
10.	Tanto, vieppiù, tenuto conto dei possibili fenomeni di “cross-reattività” col batterio della Yersinia enterocolitica O9, adombrati da parte ricorrente.
In argomento, soccorre, ancora una volta, il rapporto ISS n. 05/21.
«Sono queste [i.e. le cross-reattività sierologiche] – vi si legge – le principali cause di reazioni falsamente positive, sia in bovini che ovi-caprini, dovute a correlazioni antigeniche tra brucelle in fase S e altri microrganismi Gram negativi come Yersinia enterocolitica O9, Salmonella del gruppo N(O30) di Kaufmann-White, Escherichia coli O116 e O157.H7, Escherichia hermannii, Campylobacter jejuni, Francisella tularensis, Pateurella multocida, Pseudomonas maltophila, Vibrio cholerae O1, Erlichia canis, Afipia clevelandensis, Leptospirosi hardjo, Stenotrophomonis maltophila, Leishmania, (Corbel et al., 1975; Stuart & Corbel, 1982; Corbel et al., 1984; Corbel, 1985; Alton, 1988; Mac Millan, 1990; Reynaud et al.,1993; Johnson et al., 1994; Farina & Scatozza, 1995; Corrente et al., 1996; Drancourt et al., 1996; Lillini et al., 1998; Garin-Bastuji et al., 1999; Gourdon et al., 2000; Staak et al., 2000; Emmerzaal et al., 2002; Nielsen et al., 2004b, Munoz et al., 2005; Kohanteb & Ardehali, 2005).
Cross-reattività dello stesso tipo si possono avere con altri batteri non patogeni per l’uomo e animali, appartenenti ai generi Agrobacterium, Sinorhizobium e Ochrobactrum del gruppo alpha-proteobacteria (Delpino et al., 2004).
Yersinia enterocolitica O9 è il microrganismo che presenta maggiore affinità antigenica con le brucelle, avendo in comune la catena O dell’LPS e ingenerando quindi notevoli confusioni, in quanto la risposta anticorpale è persistente (a volte oltre 6 mesi) con alti titoli spesso sovrapponibili a quelli antibrucellari. Y. enterocolitica O9 evoca principalmente anticorpi della classe IgM ma può produrre anche IgG. Sieri monospecifici anti A Brucella cross-agglutinano fortemente Y. enterocolitica O9 mentre sembra che non reagiscono i sieri specifici anti M Brucella (Mac Millan, 1990). Nessun test sierologico attualmente disponibile permette di distinguere in modo certo una reazione sierologica falsamente positiva dovuta a Y. enterocolitica O9 da una reazione sierologica legata a vera infezione brucellare. Le procedure usuali per la differenziazione sierologica sono fondate principalmente sulla rapida sieronegativizzazione anche dei titoli elevati (Kittelberger et al., 1995b; Pouillot et al., 1999).
Nella pratica possono verificarsi anche infezioni associate, che ovviamente vanno a sommare i titoli anticorpali: solo prove sierologiche del tipo western-blotting effettuate con antigeni specifici per Yersinia, come le YOPs (Kittelberger et al., 1995a, 1995b) oppure per Brucella come OMP (55kDa) (Cloeckaert et al., 1992; Baldi et al., 1996; Correnti et al., 1996 e 2004), possono discriminare relativamente le due risposte.
Per una diagnosi sierologica differenziale è stata anche utilizzata l’ELISA, indiretta o competitiva, allestita con YOPs o altri antigeni: di membrana, ricombinanti, solubili (Weynants et al., 1996; Erdenebaatar et al., 2003) oppure utilizzando la prova del γ-IFN su sangue (Weynants et al., 1995, Kittelberger et al., 1997; Adone et al., 2000; Munoz et al., 2005).
Per gli altri microrganismi, le cross-reattività si esprimono con titoli molto più bassi, rispetto all’antigene omologo, che quasi sempre decadono molto più rapidamente, di solito entro 1 mese gli anticorpi agglutinanti per E.coli O157.
In generale per questi microrganismi una diagnosi differenziale si basa sull’uso di test complementari più sensibili e specifici delle due prove convenzionali, come l’ELISA (Nielsen & Gall, 1994; Erdenebaatar et al., 2003), l’ELISA competitiva (Nielsen et al.,1995; Silva et al., 2000), Western-blotting (Kittelberger et al., 1998; Corrente et al., 2004), oppure test da applicare sul latte, come il milk ring test o in vivo come la prova allergica (Skin test) (Pouillot et al., 1997; Saegerman et al., 1999) affiancati da prove di isolamento batterico.
Recentemente sono state utilizzate, in alternativa, prove di immunità cellulo-mediata, come il γ-IFN test (Kittelberger et al., 1997; Adone et al., 2000), o prove altamente sensibili come FPA (Fluorescence polarization assay), (Gall et al., 2000; Nielsen et al., 2000; Nielsen & Gall, 2001, McGiven et al., 2003 Nielsen et al., 2004a).
Tali prove, che tracciano profili immunologici di allevamento più che individuali, dovrebbero essere affiancate comunque dall’isolamento e l’identificazione dell’agente etiologico, oppure da tecniche di rilevamento biomolecolare (PCR o real-time multiplex PCR) del microrganismo da sangue, siero, latte e/o reperti anatomo-patologici (Bricker & Halling 1994, 1995; Gallien et al., 1998; Adone et al., 2001b; Bricker, 2002, Bricker et al., 2003; Lubeck et al., 2003; Elfaki et al., 2004; Probert et al., 2004).
Una diagnosi differenziale possibile è basata su di una combinazione di prove che implicano meccanismi diversi della risposta umorale o cellulo-mediata, oppure una diagnosi basata sulla ripetitività dei prelievi nel tempo.
Sarebbe importante anche avvalersi di una chiave di lettura diagnostica che tenga in considerazione studi epidemiologici ad hoc collegati all’età dell’animale, alle dimensioni dell’allevamento all’effetto stagionale.
È noto infatti che nella stagione primaverile più favorevole alla yersiniosi, risultati falsi positivi per cross-reazione con tale microrganismi possono essere più frequenti».
11.	Le impasses ingenerate dagli illustrati fenomeni di aspecificità e di discordanza ed i correlativi rimedi di controanalisi supplementari sono da intendersi, beninteso, configurabili limitatamente ai capi di bestiame risultati negativi alla FdC e positivi alla SAR, ossia alle ipotesi cui la disciplina di settore circoscrive il margine di opinabilità giustificativo dell’espletamento di controanalisi supplementari (cfr. art. 4 del d.m. 27 agosto 1994, n. 651: «SAR-Ag:RB positiva e FdC negativa = animale sospetto [controllo da ripetere]»; secondo capoverso, lett. c, dell’Allegato 1 all’o.m. 28 maggio 2015: «Nel caso in cui il siero di un animale esaminato fornisca esito positivo alla SAR e negativo alla FdC, l’esito è da considerare dubbio e l’animale sospetto d’infezione»), e con esclusione dei capi di bestiame risultati positivi alla FdC e positivi o negativi alla SAR (cfr. art. 4 del d.m. 27 agosto 1994, n. 651: «SAR-Ag: RB negativa e FdC positiva = animale infetto; SAR-Ag:RB positiva e FdC positiva = animale infetto»; secondo capoverso, lett. c, dell’Allegato 1 all’o.m. 28 maggio 2015: «Nel caso il siero di un animale esaminato fornisca esito positivo alla FdC (maggiore o uguale a 20 UIFC/ml) e negativo o positivo alla SAR l’animale è da considerare infetto»).
Si tratta, pertanto, con riferimento alla fattispecie dedotta nel presente giudizio, dei n. 28 bovini (identificati con i codici anagrafici IT065990238154, IT065990245713, IT065990279918, IT065990313196, IT065990313200, IT065990327228, IT065990327241, IT065990327247, IT065990368348, IT065990398803, IT065990425793, IT065990428746, IT065990428780, IT065990452580, IT065990535683, IT065990535693, IT065990549071, IT065990549084, IT065990549085, IT065990549107, IT065990549151, IT065990549160, IT065990568111, IT065990568125, IT065990588938, IT065990588939, IT065990588979, IT065990609250) risultati positivi alla SAR e negativi alla FdC (ossia con UI/ml uguale o superiore a 20).
In relazione a tali capi di bestiame, gli esiti dubbi dei test sierologici effettuati in vivo, unitamente al dato macroscopico dei precedenti rapporti di prova negativi dei test batteriologici post mortem effettuati su numerosi altri capi di bestiame soppressi (cfr. RdP prot. n. 154004-154005-154006 del 21 ottobre 2019, prot. n. 173105-173106-173107 del 25 novembre 2019, prot. n. 11378-11379-11380 del 20 gennaio 2020), avrebbero dovuto indurre l’amministrazione sanitaria a svolgere ulteriori verifiche istruttorie onde confermarli ovvero ribaltarli.
12.	Ciò posto, il Collegio non ignora che – come eccepito sia dall’ASL Salerno sia dall’IZSM – il secondo capoverso, lett. c, dell’Allegato 1 all’o.m. 28 maggio 2015 àncora la possibilità di approfondimenti diagnostici, anche mediante coinvolgimento del Centro di referenza nazionale per le brucellosi, ai soli casi di positività alla SAR e negatività alla FdC rilevati in «allevamenti non infetti»; laddove, invece, l’azienda in titolarità del L., in conseguenza dell’adozione degli inoppugnati provvedimenti di isolamento, sequestro e abbattimento del 24 settembre 2019, prot. n. 1574/SV, del 29 ottobre 2019, prot. n. 1692/SV, del 22 novembre 2019, prot. n. 1774/SV, del 22 dicembre 2019, prot. n. 1917/SV, del 22 gennaio 2020, prot. n. 72/SV, ha perduto la qualifica di “ufficialmente indenne” dalla brucellosi bovina (cfr. attestato dell’ASL Salerno, prot. n. 175 del 20 marzo 2020) e, quindi, non avrebbe potuto più considerarsi “non infetto”.
Ed è pure plausibile che – come eccepito dall’IZSM – «i metodi diretti hanno una sensibilità inferiore a quella dei metodi indiretti, ovvero hanno una capacità inferiore di rilevare gli animali infetti … pertanto, nella diagnosi della brucellosi, tali metodi sono utilizzati solo per approfondimenti diagnostici, ma non possono essere usati come test di screening, perché a causa della loro bassa sensibilità forniscono frequentemente risposte false negative … un esito negativo alla ricerca batteriologica della brucella o con metodo PCR, quindi, non solo non indica che l’animale è sano, ma è un evento frequentemente atteso in animali infetti che abbiano reagito positivamente alle prove sierologiche».
Così come è plausibile, quanto alla paventata cross-reattività tra Yersinia enterocolitica O9 e Brucella abortus, che – come illustrato nella perizia tecnica esibita in giudizio dal medesimo IZSM – «tutta la letteratura scientifica internazionale, pur riconoscendo questa possibilità, descrive un bassissimo livello di espressione in termini di risposta sierologica verso Brucella spp, quand’anche la diffusione di Yersinia enterocolitica dovesse essere imponente, ossia un bassissimo livello di animali cross reattivi e con risposta sierologica transitoria … peraltro alcuni lavori scientifici riportano che molti animali infettati sperimentalmente con Yersinia enterocolitica non risultano neanche cross reattivi a Brucella spp (Saegerman et al. 1997; Pouillot et al 1998; Garin-Bstuji et al 1999) … In uno studio di epidemiologia comparata (Pouillot et al., 1997) viene confermato che in un allevamento le reazioni aspecifiche falsamente positive sono sporadiche. Tali reazioni aspecifiche includono solo 1 o 2 animali nell’80% circa dei casi, e meno di 5 nel 97% dei casi … gli allevamenti con più di 2 animali falsamente positivi sono in genere grossi allevamenti … pertanto un numero di animali sieropositivi maggiore di 2 deve far pensare ad una brucellosi quando si tratta di allevamenti con più di 50 animali saggiati. In quelli con più di 50 animali saggiati, la prevalenza intra-allevamento resta tuttavia inferiore al 5% nel 91% dei casi e al 10% nel 99% dei casi».
Nemmeno, infine, il Collegio può ignorare l’operatività, in subiecta materia, del principio di precauzione sanitaria (cfr. Cons. Stato, sez. V, 8 gennaio 2009, n. 30; TAR Lazio, Roma, sez. I, 20 marzo 2013, n. 2895).
In argomento, TAR Campania, Napoli, sez. V, 14 febbraio 2018, n. 1012, attraverso una puntuale rassegna giurisprudenziale ha ricordato che: «… l'operato di parte resistente risulta pienamente conforme al principio di precauzione, costituente uno dei canoni fondamentali del diritto dell'ambiente e alla salute (Cons. Stato, n. 30 del 2009) ... che … trova attuazione facendo prevalere le esigenze connesse alla protezione di tali valori sugli interessi economici (TAR Lombardia, Brescia, n. 304 del 2005 nonché, da ultimo, TAR Trentino Alto Adige, Trento, 8 luglio 2010 n. 171) ... Peraltro, virtuose prassi di profilassi possono essere utilmente applicate solo a monte del fenomeno, in via preventiva, e non ove la positività o la stessa patologia si sia già manifestata in quanto conclamata. Non appare, infatti, ultroneo sottolineare, ad abundantiam, che "il d.m. n. 84 del 1991 – regolamento per la bonifica sanitaria degli allevamenti bufalini dalla brucellosi – agli artt. 3, 4 e 5 impone la macellazione obbligatoria degli animali infetti mentre la vaccinazione non costituisce una misura alternativa all'abbattimento, ma è, invece, prevista esclusivamente per finalità preventive ed, in particolare, per evitare il contagio del bestiame sano" (TAR Campania, Napoli, sez. V, 17 gennaio 2006 n. 681)».
13.	Tutto ciò non vale, però, ad escludere tout court che, a fronte di discordanze rilevanti tra test diagnostici sierologici ed a fronte di macroscopici riscontri confliggenti in sede prove colturali – le quali, a tenore della stessa perizia tecnica di parte, costituiscono «il gold standard delle diagnosi delle malattie infettive, brucellosi inclusa» – eseguite in relazione a bovini già soppressi nell’ambito del medesimo allevamento, le sieropositività scaturite unicamente dall’applicazione del metodo SAR meritassero adeguati approfondimenti diagnostici, anche mediante interpello del competente Centro di referenza nazionale per le brucellosi.
Un simile approccio riviene dalla doverosa dei basici canoni euro-unitari e nazionali di ragionevolezza e proporzionalità dell’agere amministrativo, in omaggio ai quali il disposto abbattimento dei cennati capi di bestiame risultati sieropositivi (soltanto) alla SAR si presenta a guisa di misura abnorme e ingiustificata, ove non suffragata da riscontri certi e oggettivi.
Ed invero, esso rimane insuscettibile di scalfire sostanzialmente l’evocato principio di precauzione sanitaria, stante l’adeguatezza della disposta misura dell’isolamento, «utilizzabile anche per seguire la eventuale evoluzione sintomatica dei capi bovini, e poi eventualmente trarre le valutazioni definitive» (Cons. Stato, sez. III, ord. n. 3777/2020).
Nel contempo, non arriva a vanificare le risultanze delle eseguite prove sierologiche, limitandosi ad esigere unicamente una rigorosa attività di controanalisi attraverso l’impiego di uno o più dei metodi diagnostici supplementari declinati nel citato rapporto ISS n. 05/21, nonché attraverso l’eventuale coinvolgimento del competente Centro di referenza nazionale per le brucellosi (ove dette controanalisi non fossero direttamente espletabili dall’IZSM).
Infine, non è da reputarsi in radice precluso dal disposto del secondo capoverso, lett. c, dell’Allegato 1 all’o.m. 28 maggio 2015, che àncora l’esperimento di supplementi diagnostici, anche mediante coinvolgimento del Centro di referenza nazionale per le brucellosi, ai soli casi di positività alla SAR e negatività alla FdC rilevati in «allevamenti non infetti».
Una interpretazione estensiva della norma richiamata (anche alle ipotesi di allevamenti infetti), che sia ispirata ai cennati principi di ragionevolezza e proporzionalità e volta a contemperare le primarie e indefettibili esigenze di precauzione sanitaria con le pur apprezzabili esigenze di tutela degli interessi economico-imprenditoriali dell’allevatore, non risulta, infatti, infrangersi irrimediabilmente contro il suo tenore letterale. 
D’altronde, alla stregua dell’orientamento giurisprudenziale improntato all’operatività del principio di gerarchia delle fonti (cfr., ex multis, Cons. Stato, sez. VI, 29 aprile 2005, n. 2034; 2 marzo 2009, n. 1169; sez. IV, 16 febbraio 2012, n. 812; sez. V, 28 settembre 2016, n. 4009; sez. VI, 24 ottobre 2017, n. 4894; sez. IV, 7 dicembre 2017, n. 5753; TAR Campania, Napoli, sez. VII, 18 luglio 2017, n. 3838), la previsione subprimaria in parola, ove interpretata nel senso di imporre all’allevatore, attraverso la misura immediata dell’abbattimento, senza il ricorso ad opportuni approfondimenti istruttori, un sacrificio patrimoniale abnorme rispetto alla controvertibilità delle evidenze epidemiologiche acquisite, andrebbe disapplicata dall’adito giudice amministrativo, in quanto confliggente con i fondamentali principi di buon andamento dell’attività amministrativa.
14.	In conclusione, stante la sua ravvisata fondatezza con riguardo all’impugnazione della sola disposizione di abbattimento dei bovini risultati sieropositivi alla SAR e sieronegativi alla FdC, il ricorso in epigrafe va accolto limitatamente ad essa, con conseguente annullamento in parte qua del provvedimento con esso impugnato.
15.	Quanto alle spese di lite, i profili di reciproca soccombenza ne giustificano l’integrale compensazione tra le parti.
P.Q.M.
Il Tribunale Amministrativo Regionale della Campania, Sezione staccata di Salerno (Sezione Seconda), definitivamente pronunciando, accoglie il ricorso in epigrafe nei limiti di cui in motivazione e, per l’effetto, annulla in parte qua il provvedimento del 3 marzo 2020, prot. n. 318.
Spese compensate.
Ordina che la presente sentenza sia eseguita dall'autorità amministrativa.
Così deciso in Salerno nella camera di consiglio del giorno 28 ottobre 2020 con l'intervento dei magistrati:


Nicola Durante,	Presidente
Olindo Di Popolo,	Consigliere, Estensore
Igor Nobile,	Referendario

Nicola Durante,	Presidente
Olindo Di Popolo,	Consigliere, Estensore
Igor Nobile,	Referendario



IL SEGRETARIO


Massima:
Animali  - Brucellosi – Prevenzione - Discordanze rilevanti fra test sierologici eseguiti in vivo – Conseguenza. 
 
         In materia di prevenzione delle infezioni da brucellosi bovina, a fronte di discordanze rilevanti fra test sierologici eseguiti in vivo (SAR Ag-RB, sieroagglutinazione rapida con antigene Rosa Bengala, e FdC-mi, fissazione del complemento), nonché a fronte di macroscopici riscontri confliggenti forniti dai test batteriologici eseguiti post mortem, le sieropositività scaturite dall’applicazione di uno soltanto dei previsti metodi diagnostici in vivo (SAR Ag-RB, considerato recessivo dalla o.m. 28 maggio 2015 rispetto a quello FdC-mi) sono, di per sé sole, insuscettibili di legittimare l’automatica soppressione dei capi di bestiame sospetti, ma richiedono, piuttosto, l’espletamento di adeguati approfondimenti istruttori, anche mediante interpello del competente Centro di referenza nazionale per le brucellosi, pur allorquando l’allevamento sia risultato interessato da precedenti casi di sieropositività (smentiti però dai menzionati test batteriologici post mortem). Un simile approccio riviene dalla doverosa conformazione dell’agere amministrativo ai basici canoni euro-unitari e nazionali di ragionevolezza e proporzionalità, in rapporto ai quali l’abbattimento dei bovini risultati sieropositivi alla sola SAR Ag-RB si presenta a guisa di misura abnorme e ingiustificata, ove non suffragata da riscontri certi e oggettivi; né è in grado di scalfire sostanzialmente il principio di precauzione sanitaria, stante l’adeguatezza delle misure temporanee di isolamento dei capi di bestiame sospetti di infezione (1). 
 
(1) Ha chiarito la Sezione che il disposto abbattimento dei cennati capi di bestiame risultati sieropositivi (soltanto) alla SAR si presenta a guisa di misura abnorme e ingiustificata, ove non suffragata da riscontri certi e oggettivi. Ed invero, esso rimane insuscettibile di scalfire sostanzialmente l’evocato principio di precauzione sanitaria, stante l’adeguatezza della disposta misura dell’isolamento, «utilizzabile anche per seguire la eventuale evoluzione sintomatica dei capi bovini, e poi eventualmente trarre le valutazioni definitive» (Cons. Stato, sez. III, ord. n. 3777 del 2020).
Nel contempo, non arriva a vanificare le risultanze delle eseguite prove sierologiche, limitandosi ad esigere unicamente una rigorosa attività di controanalisi attraverso l’impiego di uno o più dei metodi diagnostici supplementari declinati nel citato rapporto ISS n. 05/21, nonché attraverso l’eventuale coinvolgimento del competente Centro di referenza nazionale per le brucellosi (ove dette controanalisi non fossero direttamente espletabili dall’IZSM). 
Infine, non è da reputarsi in radice precluso dal disposto del secondo capoverso, lett. c, dell’Allegato 1 all’o.m. 28 maggio 2015, che àncora l’esperimento di supplementi diagnostici, anche mediante coinvolgimento del Centro di referenza nazionale per le brucellosi, ai soli casi di positività alla SAR e negatività alla FdC rilevati in «allevamenti non infetti». 
Una interpretazione estensiva della norma richiamata (anche alle ipotesi di allevamenti infetti), che sia ispirata ai cennati principi di ragionevolezza e proporzionalità e volta a contemperare le primarie e indefettibili esigenze di precauzione sanitaria con le pur apprezzabili esigenze di tutela degli interessi economico-imprenditoriali dell’allevatore, non risulta, infatti, infrangersi irrimediabilmente contro il suo tenore letterale. 
D’altronde, alla stregua dell’orientamento giurisprudenziale improntato all’operatività del principio di gerarchia delle fonti (Cons. Stato, sez. VI, 29 aprile 2005, n. 2034; 2 marzo 2009, n. 1169; sez. IV, 16 febbraio 2012, n. 812; sez. V, 28 settembre 2016, n. 4009; sez. VI, 24 ottobre 2017, n. 4894; sez. IV, 7 dicembre 2017, n. 5753; Tar Napoli, sez. VII, 18 luglio 2017, n. 3838), la previsione subprimaria in parola, ove interpretata nel senso di imporre all’allevatore, attraverso la misura immediata dell’abbattimento, senza il ricorso ad opportuni approfondimenti istruttori, un sacrificio patrimoniale abnorme rispetto alla controvertibilità delle evidenze epidemiologiche acquisite, andrebbe disapplicata dall’adito giudice amministrativo, in quanto confliggente con i fondamentali principi di buon andamento dell’attività amministrativa. ​​​​​​​