Tolong jelaskan mengenai Tahapan dari Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik

Deteksi ekspresi gen pada reaksi berantai polimerase transkripsi-balik terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama isolasi RNA total, kemudian dilanjutkan dengan sintesis DNA komplemen, dan diakhiri dengan amplifikasi daerah transkip gen target. Tahpan-tahapannya secara rinci sebagai berikut:

Tahap pertama adalah isolasi RNA. Sampel klinis pada tahap ini berasal dari jaringan tubuh, seperti darah, spesimen biopsi jaringan, dan kultur sel atau kultur jaringan. Tujuan isolasi RNA adalah untuk mendapatkan mRNA yang terkandung dalam sel. Isolasi RNA dimulai dengan melisiskan sel dan inti sel, lalu dilanjutkan dengan pemisahan DNA/RNA dan protein dengan metoda presipitasi protein, pemisahan RNA dan DNA dengan enzim DNase dan terakhir melakukan penyimpanan RNA dalam ddH2O bebas enzim nukleasi. Larutan RNA yang diperoleh langsung dianalisis dan dapat pula disimpan dalam jangka waktu lama pada suhu -80°C.

Tahap kedua adalah sintesis DNA komplemen, yaitu mengubah RNA khususnya mRNA gen target menjadi DNA komplemen. Enzim yang digunakan ialah enzim transkriptase balik dan Oligo (dT) 15 primer . Larutan DNA komplemen yang akan digunakan secepatnya harus disimpan pada suhu 2-8 °C bila selama 1-2 jam.  Sedangkan suhu -15 °C hingga  -25 °C diterapkan pada penyimpanan dalam jangka waktu lama.

Tahap ketiga adalah amplifikasi daerah transkrip gen target. Proses amplifikasi menggunakan primer oligonukleotida yang spesifik. Amplikon DNA komplemen akan dihasilkan jika reaksi berantai polimerase dilakukan dengan metode dua langkah. Kegunaan amplikon ini sebagai ekspresi transkrip gen target yang dapat divisualisasi secara biokimia dengan elektroforesis pada gel agarose. Penerapan klinis dari reaksi berantai polimerase transkripsi-balik ialah visualisasi ekspresi mRNA BRLF1 EBV pada penderita kanker nasofaring.