Jabarkan Deteksi virus dari Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik

Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik digunakan sebagai penanda molekuler lanjutan pada sampel virus yang berasal dari unggas. Pengujian ini diterapkan jika virus memiliki kemampuan melakukan aglutinasi SDM. Virus ini umumnya dalam famili Orthomyxoviridae yang menyebabkan influenza atau dalam famili Paramyxoviridae yang menyebabkan penyakit newcastle. Virus-virus tersebut diketahui ada jika hasil uji hemaglutinasi positif. Isolasi RNA virus diterapkan untuk identifikasi subtipe virus flu burung. Primer yang digunakan spesifik terhadap Hahnium dan Natrium serta metode elektroforesis.

Pada virus flu burung, hasil reaksi berantai polimerase transkripsi-balik dapat sangat bervariasi sesuai dengan jenis primer dan reagen kit yang digunakan. Prosesnya juga memerlukan periode waktu tertentu. Proses transkripsi balik dilakukan selama 60 menit dengan suhu 45oC. Tahap predenaturasi dilakukan selama 5 menit pada suhu 95oC. Siklus reaksi berlanjut ke tahap denaturasi selama 30 detik pada suhu 95oC. Lalu aniling selama 30 detik dengan suhu 55oC 30 detik, dilanjutkan dengan tahap ekstensi selama 40 detik dengan suhu 72oC dan post ekstensi selama 10 menit dengan suhu 72oC.

Setiap isolat diamplifikasi dengan primer H5 dan N1 untuk identifikasi subtipe virus. Primer spesifik hanya dilakukan pada isolat yang positif berdasarkan uji hemaglutinasi, tetapi hasil H5 dan N1 negatif. Primer ini umum digunakan pada virus penyakit newcastle. Suhu selama proses aniling mencapai 48oC. Keberadaan pita DNA spesifik hasil reaksi diidentifikasi melalui elektroforesis pada gel agarose dengan kadar 2%.

Pasangan primer H5-1 dan H5-3 serta CU-N1F dan CU-N1R digunakan sebagai alat identifikasi subtipe H5 dan N1 secara berturut-turut. Sedangkan pasangan primer NDVF dan NDVR digunakan untuk identifikasi lebih lanjut terhadap virus penyakit newcastle. Ketiga pasang primer tersebut menghasilkan produk yang relatif kecil dengan  219 pasangan basa untuk H5, 131 pasangan basa untuk N1 dan 202pasangan basa untuk NDV. Hal ini membuat deteksi lebih sensitif dan spesifik. Setiap isolat diamplifikasi dengan primer H5 dan N1 untuk identifikasi subtipe virus. Primer spesifik untuk NDV menggunakan isolat negatif H5 dan N1, sedangkan isolat yang positif berdasarkan uji hemaglutinasi menggunakan primer non spesifik. Primer lain juga dapat digunakan sesuai dengan pustaka genom virus yang tersedia di GenBank. Amplifikasi gen H5, N1 dan ND serta besaran produk PCR yang diharapkan, memerlukan sekuen basa berikut: