Jelaskan PCR waktu nyata dari Tes amplifikasi asam nukleat

Teknik PCR waktu nyata adalah teknik reaksi berantai polimerase yang dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengukur kuantitas amplikon fragmen DNA. Deteksi dan pengukuran hanya dilakukan setelah setiap siklus terbentuk. Pengukuran flouresensi pada tabung reaksi terjadi selama proses amplifikasi fragmen DNA. Interkalasi bahan pewarna flouresensi (SYR Hijau I) pada amplikon menghasilkan flouresensi yang berkorelasi dengan jumah amplikon. Hasil yang sama diperoleh dengan menggunakan pelacak internal spesifik yang memanfaatkan efek transfer energi resonansi fluoresensi. Jenis pelacak berupa pelacak TaqMan, suar molekular, atau primer kalajengking. Semakin tinggi konsetrasi asam nukleat, semakin sedikit siklus amplikon yang diperlukan untuk mencapai batas ambang jumlah amplikon yang diinginkan dan intensitas flouresensinya. Karenanya, teknik ini dapat digunakan untuk kuantifikasi asam nukleat. Teknik ini juga cocok untuk deteksi dan kuantifikasi target spesifik DNA dan RNA. PCR transkriptase balik perlu dilakukan sebelum real-time PCR dimulai pada target spesifik RNA. PCR waktu nyata utamanya menggunakan PCR siklus cahaya untuk SYBR Hijau I. Pada pelacak Taqman yang mempunyai spesifitas tinggi digunakan siklus Taqman (ABI). Metoda PCR dengan SYBR Hijau I membutuhkan biaya operasional yang lebih murah dari pada metoda PCR waktu nyata dengan TaqMan. Kekurangannya metoda ini adalah hasil yang diperoleh kurang sepsifik. Sebaliknya, metoda PCR waktu nyata dengan TaqMan berbasis transfer energi resonansi fluoresensi memberikan hasil yang lebih spesifik, namun biaya operasionalnya lebih tinggi dibandingkan dengan metoda PCR waktu nyata dengan SYBR Hijau I.

Metode Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Metode LAMP dikembangkan pada tahun 1999 di Jepang sebagai teknik diagnostik molekuler. Pengembangannya bertujuan untuk mengatasi kendala-kendala dalam penerapan uji diagnostik molekuler. Amplifikasi DNA yang menggunakan metode LAMP hanya dilakukan pada suhu tetap, sehingga peralatan siklus termal tidak diperlukan. Pada suhu tetap, amlipfikasi dapat terjadi dengan jumlah primer yang lebih banyak. Prinsip kerja amplifikasi berdasarkan reaksi berantai polimerase tersarang atau reaksi berantai polimerase transkiptase balik.

Proses amplifikasi pada metode LAMP dapat mengalami kegagalan. Selama proses reaksi amplifikasi berlangsung, kegagalan dicegah dengan menambahkan enzim yang dapat menjadi substrat. Sistem deteksi menggunakan metode LAMP sangat sederhana karena hanya memerlukan 1 arena amplikon berbentuk endapan. Penambahan reagen pengendap dilakukan pada saat proses reaksi dimulai. Bahan ampifikasi juga dapat berupa fluoresen dengan penambahan reagen fluoresen selama proses reaksi. Kondisi ini membuat deteksi hasil akhir dapat diamati secara visual secara langsung. Prinsip amplifikasi DNA bakteri pada suhu tetap dianggap sebagai suatu keunggulan. Anggapan yang sama juga diberikan pada hasil yang terdeteksi berupa presipitasi ataupun pendar fluoresensi yang dapat dengan mudah diamati. Metode LAMP direkomendasikan oleh Organisasi Kesehatan Dunia sebagai uji diagnosis rutin dalam laboratorium rujukan mengenai tuberkulosis di sejumlah negara.

Instrumen sederhana berupa penangas air atau pelat pemanas dapat digunakan pada metode LAMP karena amplifikasi DNA dilakukan pada suhu tetap. Proses penafsiran hasil reaksi dilakukan secara sederhana, Pengamatan hanya menggunakan mata telanjang atau sinar ultraungu sederhana. Pemakaian metode LAMP sesuai pada negara-negara dengan sumber daya teknologi yang terbatas.