Jabarkan Pemeran dari Spider-Man: Into the Spider-Verse

Shameik Moore sebagai Miles Morales / Spider-Man:

Jake Johnson sebagai Peter B. Parker / Spider-Man:

Hailee Steinfeld sebagai Gwen Stacy / Spider-Woman: Gwen Stacy versi semesta alternatif dengan berbagai kelebihan seperti laba-laba yang memakai nama samaran "Gwanda".

Mahershala Ali sebagai Aaron Davis / Prowler: Paman Miles yang menjadi tangan kanan Wilson Fisk.

Brian Tyree Henry sebagai Jefferson Davis:

Lily Tomlin sebagai May Parker: Bibi Peter yang meninggal di semesta Peter B. Parker dan menjadi mentor Miles di semestanya.

Luna Lauren Velez sebagai Rio Morales: Ibu Miles, seorang perawat.

John Mulaney sebagai Peter Porker / Spider-Ham: Spider-Man versi hewan lucu dari semesta antropomorfis yang dulunya merupakan laba-laba, lalu digigit oleh babi radioaktif.

Kimiko Glenn sebagai Peni Parker / SP//dr: Gadis Jepang-Amerika berusia 14 tahun dari semesta alternatif anime yang mengendalikan baju biomekanik dengan laba-laba radioaktif. Ia bisa berkomunikasi dengan laba-laba tersebut lewat telepati.

Nicolas Cage sebagai Peter Parker / Spider-Man Noir:

Liev Schreiber sebagai Wilson Fisk / The Kingpin: Otak kriminal dan investor Alchemax di dimensi Miles.

Pengisi suara lainnya meliputi Zoë Kravitz sebagai Mary Jane Watson, Kathryn Hahn sebagai Olivia "Liv" Octavius / Doctor Octopus, Lake Bell sebagai Vanessa Fisk, Jorma Taccone sebagai Norman Osborn / Green Goblin, Krondon sebagai Tombstone, Joaquín Cosío sebagai Scorpion, dan Post Malone (kontributor musik film ini) sebagai pejalan kaki di Brooklyn. Rekaman arsip Cliff Robertson dari film Spider-Man (2002) digunakan dalam adegan kilas balik yang melibatkan tokoh Ben Parker. Pencipta Spider-Man, Stan Lee, tampil sebagai pemeran kameo Stan, tokoh yang menjual kostum Spider-Man kepada Morales.

Pemeran kameo yang muncul dalam adegan pascakredit meliputi Oscar Isaac sebagai Miguel O'Hara / Spider-Man 2099, Spider-Man versi alternatif dari semesta futuristik pada akhir abad ke-21; Greta Lee sebagai asisten cerdas O'Hara bernama Lyla (keduanya dicantumkan di kredit sebagai Interesting Person #1 dan Interesting Person #2); dan Jorma Taccone sebagai Earth-67 Peter Parker / Spider-Man (menggantikan Paul Soles, tokohnya dicantumkan di kredit sebagai Last Dude). Stan Lee juga mengisi suara bos Peter Parker, J. Jonah Jameson, versi Earth-67 dalam adegan yang sama (menggantikan mendiang Paul Kligman). Lee ingin memerankan tokoh tersebut sejak 1980-an karena tokoh Jameson terinspirasi dari Lee sendiri. Ini adalah kali kedua dan terakhir kalinya Lee memerankan tokoh yang diciptakannya sendiri setelah tampil sebagai Willie Lumpkin di film Fantastic Four (2005). Donald Glover juga tampil di layar televisi sebagai Troy Barnes berpakaian piyama Spider-Man. Sahabat dan teman sekamar Miles Morales, Ganke Lee, muncul dalam film ini, tetapi tidak diberi nama dan dialog. Namanya disebutkan di majalah khusus promosi Spider-Man: Into the Spider-Verse The Official Movie Special dan naskah film.