Jabarkan Pemukiman Eropa dari Celah Darién

Vasco Núñez de Balboa dan Alonso de Ojeda menjelajahi pantai Kolombia pada tahun 1500 dan 1501. Mereka menghabiskan sebagian besar waktu di Teluk Urabá, di mana mereka melakukan kontak dengan Gunas. Perbatasan regional awalnya dibuat pada tahun 1508 setelah dekrit kerajaan untuk memisahkan pemerintahan kolonial Castilla de Oro dan Nueva Andalucía, menggunakan Sungai Atrato sebagai batas antara dua gubernur.[

Pada tahun 1519, kota Panama didirikan di dekat pemukiman pribumi kecil di pantai Pasifik. Setelah penemuan Peru, kemudian berkembang menjadi pelabuhan transshipment penting serta pusat administrasi.

Pada tahun 1671, bajak laut Welsh Henry Morgan melintasi Tanah Genting Panama dari sisi Karibia dan menghancurkan kota; kota itu kemudian dipindahkan beberapa kilometer ke barat di semenanjung kecil. Reruntuhan kota tua, Panamá Viejo, dilestarikan dan dinyatakan sebagai Situs Warisan Dunia UNESCO pada tahun 1997.

Perak dan emas dari raja muda Peru diangkut melalui darat melintasi tanah genting dengan Kereta Perak Spanyol ke Porto Bello, di mana armada harta Spanyol mengirimkannya ke Seville dan Cádiz dari tahun 1707. Lionel Wafer menghabiskan empat tahun antara tahun 1680 dan 1684 di antara suku Guna.