Jabarkan Uji aktivitas enzim dari Kinetika enzim

Uji aktivitas enzim adalah suatu prosedur di laboratorium yang mengukur laju reaksi enzimatik. Karena enzim tidak dikonsumsi dalam reaksi yang ia katalisis, uji aktivitas enzim biasanya melihat perubahan konsentrasi substrat atau produk untuk mengukur laju reaksinya. Ada berbagai metode pengukuran yang dapat dilakukan. Uji Spektrometri mengamati perubahan absorbansi cahaya antara produk dan reaktan; uji radiometri melibatkan inkorporasi atau pelepasan radioaktivitas untuk mengukur jumlah produk dihasilkan sepanjang waktu. Uji spektrometri dipandang paling memudahkan karena ia dapat mengukur laju reaksi secara kontinyu. Meskipun uji radiometri membutuhkan pemindahan dan penghitungan sampel (dengan kata lain ia adalah uji diskontinyu), uji ini sangat sensitif dan dapat mengukur tingkat aktivitas enzim yang sangat rendah. Pendekatan analog dari metode ini adalah menggunakan spektrometri massa untuk memonitor penggabungan atau pelepasan isotop stabil akibat perubahan substrat menjadi produk. Terkadang, pengujian yang dilakukan gagal dan pendekatan-pendekatan perlu dilakukan untuk menyelamatkan kembali pengujian tersebut.

Uji aktivitas enzim yang paling sensitif menggunakan laser yang difokuskan melalu suatu mikroskop untuk mengamati perubahan molekul enzim tunggal selama ia mengkatalisis suatu reaksi. Pengukuran ini menggunakan perubahan fluoresensi dari kofaktor pada mekanisme reaksi enzim, atau zat warna fluoresen yang ditambahkan pada posisi tertentu di protein tersebut untuk menunjukkan pergerakan yang terjadi selama katalisis. Kajian ini memberikan pandangan baru pada kinetika dan dinamika enzim tunggal, yang mana berlawanan dengan kinetika enzim tradisional yang mengamati perilaku rerata dari jutaan populasi molekul enzim.

Contoh kurva pergerakan dari uji aktivitas enzim ditunjukkan di atas. Enzim menghasilkan produk pada laju awal yang kurang lebih linear untuk sesaat setelah reaksi dimulai.  Seiring berjalannya reaksi dan substrat digunakan, laju reaksi berangsur melambat (selama substrat tidak berada pada tingkat penjenuhan). Untuk mengukur laju awal (dan maksimum), uji aktivitas enzim biasanya dilakukan ketika reaksi baru berjalan beberapa persen menuju penyelesaian total.  Panjang rentang laju awal bergantung pada kondisi pengujian dan dapat terentang dari beberapa milisekon hingga berjam-jam.  Biarpun begitu, alat untuk mencampur larutan dengan cepat dapat membantu pengukuran kinetika pada laju awal kurang dari satu detik. Pengujian yang luar biasa cepat ini sangat penting untuk mengukur kinetika pra-keadaan-tunak, yang akan dibahas di bawah.

Kebanyakan studi kinetika enzim berkonsentrasi pada bagian awal ini, kurang lebih pada bagian linear dari reaksi enzimatik. Tetapi, pengukuran kurva reaksi lengkap dan penyesuaian data-data tersebut pada persamaan laju non-linear juga dimungkinkan. Cara pengukurang reaksi enzimatik ini disebut analisis kurva-progres. Pendekatan ini berguna sebagai alternatif dari kinetika sesaat ketika laju awal terlalu cepat untuk diukur secara akurat.